Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью



Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью

Владельцы патента RU 2716504:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) (RU)

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии. Раскрыто применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, со среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, в качестве средства стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа путем регулирования баланса активации провоспалительных свойств макрофагов, секретирующих цитокины ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α, и противовоспалительных свойств макрофагов, которые продуцируют ИЛ-10 цитокинов. Изобретение обеспечивает иммуномодулирующее средство природного происхождения, обладающее низкой токсичностью и способностью избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-1 бета, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма. 2 ил., 8 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Пелоидотерапия (грязелечение природными органоминеральными коллоидальными образованиями (иловыми, торфяными, сопочными), обладающими высокой пластичностью, теплоемкостью и теплоотдачей, содержащими активные биологические вещества (соли, газы, витамины, ферменты, гормоны и др.) и живые микроорганизмы) является одним из наиболее древних методов лечения хронических заболеваний, о чем упоминается в трактатах ученых древнего Китая, Египта, Греции, Индии, датированных еще 4-5 веком до н.э. Во 2 веке в трудах Клавдия Галена содержатся рекомендации об использовании ила для лечения воспаления, отеков и болей, в 15 веке Парацельс указал на 5 главных воздействий грязей на системы организма. Пелоидотерапия и в наше время широко используется для лечения заболеваний кожи, опорно-двигательного аппарата, эндокринной и мочеполовой системы, спаечной болезни, ревматоидного артрита [1, 2, 3].

Изучение состава природных высокомолекулярных биологически активных соединений (торфа, сапропеля, мумие, угля), образовавшихся в результате распада и гумификации биологических объектов, показало, что их органическая часть состоит из гуминовых веществ, лигнина, полисахаридов, липидов, пектинов, гемицеллюлозы и целлюлозы. Гуминовые вещества - группа природных биополимеров, содержащихся главным образом в объектах растительного происхождения (каустобиолитах) - торфе, буром угле, придонных осадках (сапропелях, пелоидах), состоят на 80-90% из гуминовых и фульвовых кислот. Биологические свойства гуминовых кислот (ГК) изучены достаточно широко, показано, что гуминовые и фульвовые кислоты используются для повышения сопротивляемости организма человека действию различных неблагоприятных факторов, в том числе, в качестве вспомогательной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов [4]. Гуминовые вещества подавляют реакцию гиперчувствительности замедленного типа, реакцию трансплантат против хозяина, снижают контактную гиперчувствительность и отек лапы крыс, уровень С-реактивного белка у пациентов, страдающих остеоартрозом, сенной лихорадкой, а также обладают кардиозащитными и проангиогенными свойствами [5]. Доказано, что ГК торфа проявляют выраженную провоспалительную активность, стимулируя пролиферацию макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов (Т-киллеров) [6, 7] и секрецию ИФН-α и -γ, ФНО-α в культуре лимфоцитов человека и ИФН-β и ФНО-α перитонеальных макрофагов мышей [8, 9]. В Польше на основе ГК выпускается иммуномодулятор, обладающий интерфероногенным эффектом и являющийся индуктором фактора некроза опухолей [10]. При этом ГК не проявляют токсических эффектов в широкой линейке доз у экспериментальных животных при пероральном или накожном применении, а гумат калия безопасен для человека в суточной дозе до 1 г/кг [5, 11].

Известно, что эффективный иммунный ответ зависит от координированного функционирования различных клеток иннатного и/или адаптивного иммунитета, в котором макрофаги, как антигенпрезентирующие клетки, занимают особенное место [12]. Популяция макрофагов характеризуется значительной функциональной и фенотипической гетерогенностью и пластичностью, которая регулируются окружающей микросредой. Макрофаги, чаще всего, представлены двумя различными типами: 1) провоспалительные -классически активированные макрофаги (M1), которые поляризованы липополисахаридом (ЛПС) или в комплексе с Th1-цитокинами, такими как интерферон гамма (ИФН-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и продуцируют, соответственно, провоспалительные цитокины; и 2) противовоспалительные и иммунорегуляторные - альтернативно активированные макрофаги (М2), поляризованные Th2-цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-13), продуцируют противовоспалительные цитокины. Макрофаги M1 и М2 имеют противоположные функции и транскрипционные профили, обладают уникальными способностями, уничтожая патогенные микроорганизмы - M1 или восстанавливая травму, связанную с воспалением - М2. Поляризация баланса макрофагов М1/М2 определяет направленность иммунного ответа при воспалении или травме. При массированной инфекции или воспалении макрофаги поляризуются в фенотип M1, секретируют интерлейкин-β (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-23 и фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), активируя противомикробную защиту. Однако затягивание фазы M1, способное привести к истощению и патологическому изменению тканей и органов, вызывает усиление активности М2, секретирующих большие количества ИЛ-10 и трансформирующего фактора роста бета (ТФР-β) для подавления воспаления и способствующих восстановлению тканей, ремоделированию, васкулогенезу и сохранению гомеостаза [12]. Таким образом, вещества способные подавлять чрезмерную активацию как M1, так и М2, регулировать баланс M1 (ИЛ-12 и ФНО-α) и М2 (ИЛ-10) опосредованных цитокинов, представляют значительный интерес в качестве фармакологических регуляторов для восстановления гомеостаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания). [13, 14].

В предыдущих исследованиях нами показано, что ГК, выделенные раствором натрий пирофосфата из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар, усиливают продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей, не содержат примеси эндотоксина, подавляют активность аргиназы, что предполагает наличие у них потенциальной иммуномодулирующей активности [15].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств природного происхождения, обладающих низкой токсичностью и способностью избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-1 бета, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых гуминовых кислот, выделенных раствором натрий пирофосфата из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар, обладающих высокой избирательной способностью стимулировать секрецию ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ, для коррекции нарушений системы иммунитета при патологических состояниях, требующих активации Th1-зависимого типа иммунного ответа, т.е. хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания.

Принципиально новое в предлагаемом авторами изобретении использование для эффективной иммуномодуляции водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Томской области, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, и описание этого свойства не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных фигур 1 и 2. На фиг. 1 представлен электронный спектр гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота. На фиг. 2 представлен инфракрасный (ИК) спектр гуминовых кислот из верхового магелланикум торфа.

Представительный средний образец торфа, максимально отражающий неоднородность химического состава всей партии анализируемого материала, отбирали буром ТБГ-1 в генетическом центре гряды грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Бакчарского района Томской области, из середины однородного по ботаническому составу горизонта с глубины 100-120 см, в летний период (июнь-август) согласно ГОСТ 17644-83 «Торф. Методы отбора проб из залежи и обработки их для лабораторных испытаний». В скважине с указанной глубины каждую пробу (массой не менее 600 г, количество скважин - не менее 50) отбирали только один раз, средняя масса образца торфа составляла более 30 кг. Согласно общетехнологическим характеристикам, ботаническому и гравиметрическому анализу отобранный торф охарактеризован как верховой магелланикум торф, степень разложения растительных остатков 10-15%, содержание минеральной примеси (общей золы) - не более 2,7%, содержание биологически активных гуминовых кислот не менее 4,2 мас.%.

Полученный образец торфа высушивали при комнатной температуре на воздухе в хорошо проветриваемом помещении, периодически перемешивая, до воздушно-сухого состояния (влажность 15-20%), измельчали в роторно-ножевой мельнице и просеивали через сито с диаметром отверстий 1-3 мм, обрабатывали 0,1 моль/л раствором натрий пирофосфата (Na4Р2О7) в массовом соотношении 1:100 в течение 8 часов при постоянном перемешивании в реакторе Р-100 при температуре 25-27°С, отделяли жидкую фазу (экстракт гуминовых кислот) от осадка (остатка торфа) фильтрованием при помощи системы вакуумной фильтрации (нутч-фильтр), далее для осаждения гуминовых кислот из экстракта жидкую фазу обрабатывали 10% раствором водород хлорида до рН 1-2, выделившиеся гуминовые кислоты (ГК) разделяли центрифугированием, отмывали холодной водой очищенной на воронке Бюхнера до рН 7 и высушивали при комнатной температуре.

Полученные вышеописанным способом ГК из верхового магелланикум торфа были охарактеризованы по физико-химическим параметрам молекулярной структуры: элементному (С, Н, N, О) составу, электронным и молекулярным спектральным свойствам, молекулярно-массовому распределению.

1. Элементный состав ГК определяли методом сожжения на C, H, N - анализаторе «EuroEA 300» (производство Италия), содержание кислорода определяли по разности. Массовые доли элементов (% mass) рассчитывали по градуировочным зависимостям, построенным с использованием Sulphanilamide Reference standard material. Атомные доли элементов (% atom), атомные отношения и отношение ароматического и алифатического углерода (Caromatic/Caliphatic) вычисляли по общепринятым методам [16].

Элементный состав ГК верхового магелланикум торфа, представленный в таблице 1, показывает распределение основных конституционных элементов молекулярной структуры вещества и является диагностическим показателем для характеристики активной фармацевтической субстанции. Атомное отношение элементов углерода и водорода (Н/С=1,11) указывает на ароматический характер молекулы ГК, т.к. содержание водорода всего на 11% выше углерода, следовательно, алифатическая часть молекулы выражена незначительно и/или является замещенной различными кислород и азотсодержащими функциональными группами. Соотношение содержания кислорода в ГК относительно углерода порядка 44% свидетельствует о большом количестве кислородсодержащих функциональных групп их молекулярной структуры, в основном фенольных, карбонильных и карбоксильных групп. Содержание азота в структуре гуминовых кислот относительно количества углерода незначительно (около 6%).

2. Регистрацию электронных спектров поглощения 0,001% водных растворов ГК проводили на спектрофотометре Unico 2800 (производство США) в диапазоне длин волн 190-800 нм в кварцевой кювете толщиной 1 см. В полученных спектрах определяли максимумы поглощения и коэффициенты экстинкции (Е 0,001% С), которые характеризуют оптическую плотность растворов гуминовых кислот при их концентрации 0,01 мг/мл для слоя 1 см при длинах волн 465 нм (А465) и 650 нм (А650) и вычисляли коэффициент цветности Q4/6 по Е. Вельте [16] как отношение оптических плотностей при длинах волн 465 и 650 нм (А465650).

Согласно электронному спектру ГК верхового магелланикум торфа (фиг. 1) в видимой области (400-800 нм) спектр не имеет четко выраженных максимумов поглощения, и выглядит как пологая кривая, характеризующая сплошное поглощение с постепенным уменьшением оптической плотности по мере увеличения длины волны. В ультрафиолетовой области спектра (200-400 нм) наблюдается резко возрастающее в коротковолновую сторону поглощение света, при этом, в области 255-275 нм отмечается плечо характерное для фенольных, карбонильных, карбоксильных групп и полиеновых цепей. Более высокая интенсивность поглощения в данной области (255-275 нм) вероятнее всего соответствует π→π*- и n→π*-переходам, характерным для ароматических альдегидов, кетонов, карбоновых кислот, их функциональных и гетерофункциональньгх производных, ката-конденсированных и периконденсированных ароматических систем типа «аценов», «фенов», пиренов, периленов и др. Кроме того, поглощение света ГК в видимой и ультрафиолетовой областях имеет некоторую специфичность: помимо наклона кривой светопоглощения относительно оси абсцисс, относятся величины оптических плотностей при определенных длинах волн и рассчитанные на их основании коэффициенты экстинкции и цветности, зависящие от числа и расположения электронов в поглощающих молекулах и ионах.

Наиболее объективным показателем, характеризующим гуминовые кислоты как вещество в целом, является коэффициент экстинкции при А465 - обобщенный показатель - некий условный коэффициент поглощения, вычисленный по отношению к условной единице молекулярной массы [16]. Еще одним важным показателем, характеризующим оптические свойства гуминовых кислот, является коэффициент цветности Q4/6 по Е. Вельте (А465/A650). Величина Q4/6 показывает крутизну падения оптической плотности при увеличении длины волны, обусловленную особенностями химического строения ГК, и является количественной величиной ароматичности макромолекул ГК, показывающей относительное содержание ароматических фрагментов их молекулярной структуры к алифатическим заместителям.

Полученные ГК, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, характеризуются невысокими значениями коэффициентов экстинкции и цветности (табл. 2), что свидетельствует об их сложном молекулярном строении, большом содержании более объемной циклической части молекулы, где преобладают поликонденсированные ароматические структуры, а также высокой устойчивости их молекул.

3. Исследование молекулярных параметров структуры ГК проводили методом инфракрасной (ИК) спектроскопии на ИК - Фурье - спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек») в таблетках с KBr (в соотношении 1:100 соответственно), в интервале значений частоты от 500 до 4000 см-1. В полученных спектрах определяли максимумы поглощения. Относительную количественную оценку параметров структуры молекул гуминовых кислот по данным ИК-спектроскопии давали на основании отношений оптических плотностей полос поглощения (ОППП) кислородсодержащих функциональных групп (υОН3400 см-1, υC=O1720 см-1, υC-O, С-О-С1225 см-1, υС-О1035 см-1) к ОППП, соответствующим ароматическим (υC=C1610 см-1) и алифатическим (υAliphatic2920 см-1) фрагментам.

Инфракрасный спектр ГК верхового магелланикум торфа (фиг. 2), выявил широкую интенсивную полосу поглощения с максимумом при 3500-3300 см-1, обусловленную переменными валентными колебаниями гидроксильных групп (ион) алифатического и ароматического характера, связанных преимущественно водородными связями, наличие которых проявляется максимумом поглощения в интервале 1270-1220 и 1170-1040 см-1. На длинноволновом крыле главной полосы при 3250-3200 см-1 обнаружено поглощение средней интенсивности, имеющее вид уступа (перегиба) и отвечающее колебаниям N-H (υNH) в структуре амида, аминов, связанных водородными связями. Полосы средней интенсивности хорошо видны при 2928-2921 см-1 и 2855-2842 см-1 за счет переменных валентных колебаний -СН3 и -СН2 групп боковых цепей в молекулах гуминовых кислот, в том числе связанных с ароматическими фрагментами, судя по наличию полосы поглощения в области 1385 см-1. Отмечается слабое поглощение при 2700-2400 см-1, присущее димерам карбоновых кислот. Отчетливый максимум сильной интенсивности выявлен в интервале 1725 см-1-1710 см-1, свойственном для валентных колебаний карбонильных групп (υС=О), которые могут быть представлены кетонами, альдегидами, карбоновыми кислотами и их функциональными производными. В ИК-спектре ГК обнаружена сильная полоса в области 1650-1600 см-1, обусловленная плоскостными валентными колебаниями сопряженных углерод-углеродных (ароматические, υС=С) и углерод-кислородных связей (карбонилы, связанные водородными связями, карбоксилат-ионы, υC=O) в ароматическом скелете и хинонах. Полоса поглощения около 1513 см-1С-С) указывает на наличие неконденсированных моноароматических структур. В данной области наблюдаются также колебания связей полипептидов в составе гуминовых кислот, связанных с атомами азота и кислорода (N-H, N-C=O): первичной (1580-1632 см-1) и вторичной (1512-1560 см-1) аминогрупп. Колебания в области 1264-1225 см-1 определяются в основном валентными (υС-О) и деформационными колебаниями (δO-C) связей недиссоциированных карбоновых кислот и их функциональных производных (в основном сложных эфиров как арильного, так и алкильного типов). За поглощение излучения в коротковолновой части спектра в области 1175-1000 см-1 ответственны валентные колебания гидроксильных групп (υOH) спиртов и углеводов. В интервале около 1075-1013 см-1 υC-O) поглощают излучение первичные спирты, при 1125-1100 см-1С-О) - вторичные спирты и при 1175-1150 см-1С-О) - третичные спирты. Поглощение в данной области (1175-1000 см-1) может быть также обусловлено валентными колебаниями (υС-О-С) гликозидных связей углеводов, лактонов, С-О-С-связями циклических и алифатических простых эфиров, при этом присутствие С-O связей полисахаридов также подтверждается колебаниями в области 830-1100 см-1. В области волновых чисел от 800 до 600 см-1 наблюдаются слабые полосы поглощения, возможно обусловленные внеплоскостными деформационными колебаниями (δС-Н) в ароматических кольцах, имеющих два и более незамещенных атомов водорода, и в том числе присутствием конденсированных многоядерных аренов (755-760 см-1).

При исследовании ИК-спектров ГК в качестве диагностических параметров обычно используют спектральные коэффициенты, увеличение интенсивность полос поглощения которых указывает на большое содержание определенных функциональных групп или фрагментов. В описании полиморфных и высокомолекулярных соединений нестехиометрического состава для количественной оценки интенсивности полос поглощения и содержания функциональных групп, помимо метода базовых линий, также используют метод отношений оптических плотностей полос поглощения (ОППП), который позволяет получить информацию об относительных пропорциях ароматических и алифатических фрагментов молекулы, структурной организации кислородсодержащих функциональных групп, наличии белковых и углеводных компонентов.

Относительная количественная оценка содержания функциональных групп в молекулах ГК по данным ИК-спектроскопии на основании ОППП указывает на то, что одними из основных кислородсодержащих функциональных групп в молекуле гуминовых кислот верхового магелланикум торфа являются: гидроксильные (υOH 3400-3300 см-1, υС-О 1150-1000 см-1) группы, карбоксильные группы и их функциональные производные (υС=О 1725-1700 см-1, υС-О 1260-1225 см-1), а также простые эфирные группы (υС-О-С 1050-1035 см-1). Рассматривая отношения ОППП ароматических фрагментов структуры к алифатических (АС=С 1610/AAlif2920), выявлено преобладание ароматических структур над алкильными заместителями и над кислородсодержащими функциональными группами. Также наблюдается обратная зависимость в отношениях ОППП кислородсодержащих функциональных групп к алифатическим фрагментам структуры, где в основном преобладают группы карбоновых кислот и сложных эфиров (табл. 3).

4. Молекулярную массу определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ на приборе Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США) с использованием колонки Ultrahydrogel 250, 300×7,8 мм, подвижная фаза - 0,1 М NaNO3, 0,01% NaN3 в воде, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование спектрофотометрическое при длине волны 200 нм. Расчет молекулярной массы проводили по калибровочному графику log Mw=f(tR) построенному по стандартам PSS (polystyrene sulfonate) 891 - 976000 Da (Polymer Standarts Service Service GmbH, Германия). Среднечисленная молекулярная масса гуминовых кислот составила 4871,2 Да; среднемассовая молекулярная масса составила 18755,3; полидисперсность - 3,9; медиана - 9558,3 Да.

Иммуномодулирующие свойства гуминовых кислот изучали на линейных мышах C57BL/6 [17]. Животные (самцы/самки) в возрасте 8-10 недель были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ РАН. Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными».

Для выделения макрофагов (МФ) и спленоцитов животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника. Спленоциты получали из дважды отмытого физиологическим раствором (ФР) клеточного гомогената селезенки мышей, МФ фракционировали, культивируя в пластиковых чашках Петри клетки перитонеального эксудата (1,5-2,0×106/мл) при 37°С (в атмосфере 5% СО2 и абсолютной влажности) в полной культуральной среде (RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Нусlcone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma»), 2 мМ L-глютамин («Sigma»)) и через 2 ч собирая прилипшую к пластику фракцию. Мононуклеары (Мн) выделяли из периферической крови здоровых доноров, наслаивая гепаринизированную кровь (10 ЕД/мл) на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 мг/мл, центрифугируя 15 минут при 400 g, собирая клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности. Все виды клеток ресуспендировали в культуральной среде, оценивали жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим (использовали клеточные суспензии с жизнеспособностью не менее 95%). МФ (2,5-3,0×106 клеток/мл), спленоциты (2,5-3,0×106 клеток/мл) или Мн (2,5-3,0×106 клеток/мл) инкубировали в 96-луночных планшетах в указанных выше условиях в присутствии ГК (10 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 4 мкг/мл конканавалина A («Sigma») или 5 мкг/мл митогена лаконоса («Sigma»). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом на автоматическом анализаторе ChemWell®Combo при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: цитокины мыши ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ («eBioscience», «InVitroGen»), цитокины человека ИЛ-12 и ИФН-γ («R@D Systems»), ФНО-α («Вектор-Бэст»).

Показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у мышей оценивали по окончании внутрибрюшинного введения ГК в течение 10 дней в дозе 1 мг/кг/сут, в качестве контрольного препарата использовали аналог ЛПС - пирогенал (Филиал «Медгамал» ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) - 5 мкг/кг сут в 0,1 мл ФР, животным контрольной группы вводили аналогичный объем ФР. Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа через 5 дней от начала введения ГК животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (5×107) в 0,1 мл ФР. Для оценки действия ГК на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл ФР («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап. Влияние ГК на гуморальное звено иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титру антител в сыворотке крови в реакции гемагглютинации (РГА), выраженному величиной log2. Для чего животных, получавших курс ПС, забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (на пике IgM-AOK и IgG-AOK), выделяли селезенку и собирали сыворотку крови [17].

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0, проверяя нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка, вычисляя для каждой выборки среднее арифметическое (X), ошибку среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Сравнение выборочных средних осуществляли по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной.

Пример 1.

ГК, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Бакчарского района Томской области, значительно усиливали секрецию основных для поляризации Th1-типа иммунного ответа цитокинов: в 16,7 раза ИЛ-12 и 168 раз ФНО-α относительно спонтанного контроля (табл. 4). Инкубация клеток с ГК приводила также к увеличению продукции ИЛ-1β макрофагами и ИФН-γ лимфоцитами в 10,9 и 32,8 раза, соответственно. При этом секреция цитокинов макрофагами под влиянием ГК была достоверно выше ЛПС-стимулированного контроля в 154 (ИЛ-12), 118 (ФНО-α) и 6,5 (ИЛ-1β) раза. Стимулирующее действие митогена и ГК на продукцию ИФН-γ спленоцитами мышей было относительно равнозначным и в 26,6-32,7 раза превышало контрольные значения под воздействием, как Кон А, так и ГК.

Добавление гуминовых кислот к митоген-активированным клеткам (модель воспаления in vitro) выявило значительный взлет секреторной активности макрофагами ИЛ-1β в 2,1 раза и лимфоцитами ИФН-γ в 6,7 раз относительно соответствующего ЛПС- и КонА-стимулированного контроля (табл. 5).

На фоне выявленного повышения концентрации цитокинов Th1-типа гуминовых кислот из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива угнетали в 1,8 раза митоген-стимулированную продукцию ИЛ-10 - ключевого монокина Тh2-типа и не влияли на секрецию ИЛ-4 (табл. 6).

На другой модели - мононуклеарах периферической крови человека - показано, что исследуемые ГК также значительно усиливали секрецию основных для поляризации Th1-типа иммунного ответа цитокинов (табл. 7). Продукция ИЛ-12 возрастала в 8,3 раза, ФНО-α в 93,6 раза, ИФН-γ в 170 раз относительно интактного контроля. При этом концентрация ИЛ-12 значительно в 2,7 раза превышала значения ЛПС-активированной продукции монокина, а количество ФНО-α и ИФН-γ было достоверно в 1,4 и 167 раз ниже секреции цитокинов при инкубации с соответствующим митогеном.

Пример 2.

Курсовое введение ГК, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, мышам линии C57/BL6 на фоне развития Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, приводило к подавлению маркерной реакции клеточного Th1 иммунного ответа реакции ГЗТ (табл. 8). Величина отека при применении пирогенала и ГК снижалась в 1,6 и в 1,9 относительно контроля.

Влияние гуминовых кислот на гуморальное звено Th1-зависимого иммунного ответа оценивали по количеству АОК и РГА. Выявлено, что курсовое введение ГК, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, приводило к достоверному увеличению числа АОК в 3,8 раза и в 2,5 раза у мышей, получавших пирогенал. При этом титр гемагглютининов увеличивался в 1,6 раза только у мышей, получавших гуминовые кислоты.

Таким образом, экспериментально установлено, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива с среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, при прямом воздействии снижают продукцию ИЛ-10 и не влияют на секрецию ИЛ-4 на фоне значительной стимуляции выработки антигенпрезентирующими клетками ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ-12, ФНО-α, ИЛ-1β и ИФН-γ как у мышей, так и ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ у человека. Курсовое введение мышам гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, усиливает показатели гуморального звена иммунитета, увеличивая число антителообразующих клеток в селезенке и титр антител в сыворотке крови в реакции гемагтлютинации. Полученные данные свидетельствуют о том, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, обладающие способностью регулировать баланс провоспалительных (ИЛ-12 и ФНО-α) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов, представляют значительный интерес в качестве основы для создания фармакологических регуляторов для восстановления гомео стаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Список литературы

1. Биккулова, Р.В. Влияние пелоидотерапии на клинико-иммунологические параметры больных ревматоидным артритом: авторефер… дис. канд. мед. наук - Москва, 2007. - 23 с.

2. Пат. 2499613 Российская Федерация МПК А61М 35/00 А61K 35/10 А61Р 41/00 Способ консервативного лечения спаечной болезни брюшины // В.П. Быков, Е.В. Рыбакова, А.В. Сидоров / заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Северный Государственный медицинский университет». - 2012134865/14. - заявл. 14.08.2012. - опубл. Бюлл. №33. - 27.11.2013.

3. Ortega, Е. Anti-inflammatory effect as a mechanism of effectiveness underlying the clinical benefits of pelotherapy in osteoarthritis patients: regulation of the altered inflammatory and stress feedback response / E. Ortega [et al.] // Int. J. Biometeorol. 2017. - V. 61. - Is. 10. - P. 1777-1785.

4. Investigation of the immunostimulatory properties of oxihumate / G.K. J. Dekker, C.E. van Rensburg // Z. Naturforsch. C. - 2003. - V. 58. - Is.3-4. - P. 263-267.

5. van Rensburg C.E. The Antiinflammatory Properties of Humic Substances: A Mini Review / C.E. van Rensburg // Phytother. Res. - 2015. - V. 29. - Is.6. - P. 791-795.

6. Riede, U.N. Humate induced activation of human granulocytes / U.N. Riede [et al.] // Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. - 1991. - V. 60. - Is. 1. - P. 27-34.

7. van Rensburg C.E. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro / C.E. van Rensburg, PJ. // Naude. Inflammation. -2009. - V. 32. - Is.4. - P. 270-276.

8. Blach-Olszewska, Z. Production of cytokines by mouse peritoneal cells treated with Tolpa Peat Preparation (TPP): dependence on age and strain of the mice / Z. Blach-Olszewska [et al] // Arch. Immun Ther. Exp. - 1993. - V. 41. - P.81-85.

9. Junek, R. Bimodal effect of humic acids on the LPS-induced TNF-α release from differentiated U937 cells / R .Junek [et al.] // Phytomedicine. - 2009. - V. 16. - Is.5. - P. 470-476.

10. Inglot, A.D. A method to assess the immunomodulating effects of the Tolpa Torf Preparation (TTP) by measuring the hyporeactivity to interferon induction and tumor necrosis factor response / A.D. Inglot, J. -Jenczylik, A. Sypula // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. - 1993. - V. 41. - Is. 1. - P. 87-93.

11. Van Rensburg, С.E. Topical application of oxifulvic acid suppresses the cutaneous immune response in mice / С.E. J. Van Rensburg, S. С.K. Malfeld, J. Dekker // Chemotherapy. - 2002.- V. 48. - P. 138-143.

12. Shapouri- Moghaddam, A. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease / A. Shapouri- Moghaddam [et al.] // J. Cell Physiol. - 2018. - V. 233. - Is.9. - P. 6425-6440.

13. Ma, X. TNF-α and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. // Microbes and Infection. -2001. - Vol.3. - P. 121-129.

14. Iwanowycz, S. Emodin Bidirectionally Modulates Macrophage Polarization and Epigenetically Regulates Macrophage Memory / S. Iwanowycz [et al.] // The J. of Biol. Chemistry. - 2016. - 291. - P. 11491-11503.

15. Трофимова, E.C. Влияние гуминовых кислот торфа различного генеза на продукцию оксида азота in vitro (скрининговое исследование) / Е.С. Трофимова [и др.] // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2016. - №5. - С. 626-636.

16. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации / Д.С. Орлов. - Москва: МГУ, 1990. - 325 с.]

17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1. - М.: Гриф и К. 2013. - С.64-79.

Применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, со среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, в качестве средства, стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа путем регулирования баланса активации провоспалительных свойств макрофагов, секретирующих цитокины ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α, и противовоспалительных свойств макрофагов, которые продуцируют ИЛ-10 цитокины.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биологии и медицины. Предложено применение кристаллического аскорбата лития общей формулы LiС6Н7О6 в качестве средства, индуцирующего продукцию интерлейкина-8.

Группа изобретений относится к медицине и фармации. Предложено применение бензола, в котором не менее 4 атомов Н замещены, и заместители R1 и R2 независимо представляют собой H, F или OH; заместитель A - (CH2)mCOOH, W(CH2)mCOOH или Y-CH(COOH)-(CH2)p-CH3, когда заместитель B - H; или B - (CH2)mCOOH, W(CH2)mCOOH или Y- CH(COOH)-(CH2)p-CH3, когда A - H; или A и B ковалентно связаны с образованием пяти- (5), шести- (6) или семи (7)-членного циклоалкила, замещенного COOH; где: Y - O, S, NH или CH2; W - О, S или NH; m = 0-2; и p = 3-7; заместитель D - CO(CH2)nCH3 или CHOH(CH2)nCH3, или О(CH2)nCH3, когда n = 2-6; и заместитель E - H или F, или его соли для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения остеопороза, применение для получения лекарственного средства для стимуляции образования костной ткани и применение для получения лекарственного средства для стимуляции образования или ремоделирования костной ткани.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему иммуномодулирующей активностью и способу его получения. Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, заключается в том, что высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчают, трижды экстрагируют спиртом этиловым, фильтруют, концентрируют, очищают подходящим органическим растворителем, сушат, при определенных условиях.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным пептидам, и может быть использовано для понижения или блокирования иммунного ответа к антигену, входящему в состав иммуногенного пептида.

Настоящее изобретение относится к соединению, представленному формулой I, или к его фармацевтически приемлемой соли, которое способно к медленному высвобождению 2-трет-бутил-4-метоксифенола in vivo и способно поддерживать стабильную концентрацию 2-трет-бутил-4-метоксифенола в плазме крови. формула IВ формуле I X и Y выбраны из любого из следующих 1) или 2): 1) X представляет собой C=O, Y представляет собой NH; 2) X представляет собой C=O, Y отсутствует;R выбран из любой из следующих групп: С1-С25 алкильной группы, незамещенной или замещенной галогеном, сложноэфирной группой, производными аминокислот; незамещенной С3-С25 циклоалкильной группы; фенильного кольца, незамещенного или замещенного сложноэфирной группой, галогеном; незамещенного нафталинового кольца; пиридинового кольца, незамещенного или замещенного галогеном; пиридазинового кольца, замещенного галогеном; незамещенного индольного кольца; незамещенной С2-С25 алкенильной или алкинильной группы.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для иммунотерапии. Для этого применяют комбинацию производных децитабина и антитела анти-CTLA4.
Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ профилактики и лечения нодулярного дерматита у крупного рогатого скота, включающий применение вирусвакцины против оспы овец и заразного узелкового дерматита КРС культуральной сухой “ШипПокс-ЛСД вак”, отличающийся тем, что дополнительно одновременно с вакциной подкожно или внутримышечно применяют трансфер-фактор в дозе 1,4-1,6 мл на голову для животных до 12-месячного возраста и в дозе 5,9-6,1 мл для животных старше 12 месяцев.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенное антитело к RGMa и его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к синтетическим иммуномодуляторам. Предложено применение циклического производного барбитуровой кислоты (1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровая кислота) - галонала в качестве иммуномодулятора.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, где R1 представляет собой C1-7-алкил или C1-7-алкокси-C1-7-алкил; R2 выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C1-7-алкоксикарбонил-C1-7-алкила и C1-7-алкоксикарбонил-C2-7-алкенила; R3 представляет собой водород; R4 выбран из группы, состоящей из -O-(CH2)m-NHR5 и -O-(CO)-(CH2)n-NHR6, где m представляет собой 2, n представляет собой 1, R5 представляет собой водород и R6 представляет собой водород.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения выделенной фракции сыворотки из обогащенного тромбоцитами фибрина (ОТФ).
Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения артрита и остеохондроза. Указанное средство содержит 55-75 мас.% измельченного янтаря и морскую воду.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противовирусному средству. Противовирусное средство, содержащее водный раствор водорастворимой фракции гуминовых кислот (ВФГК), полученных из окисленного бурого угля, обработанных ферментом трипсином в соотношении ВФГК и трипсин в буферном растворе с последующим осаждением ВФГК путем закисления с содержанием ВФГК в водном растворе в концентрации от 1,5 до 150 мкг/мл, при определенных условиях.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения препарата, обладающего гепатопротекторной активностью. Способ получения препарата, обладающего гепатопротекторной активностью, включает добавление к гиматомелановым кислотам, выделенным из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, раствора натрия гидроксида; термостатирование на водяной бане; фильтрование через бумажный фильтр, нейтрализацию полученного раствора раствором хлороводородной кислоты; доведение объема дистиллированной водой; готовый раствор гиматомелановых кислот расфасовывают в склянки темного стекла, плотно укупоривают и стерилизуют УФ-лучами с помощью бактерицидной лампы.

Изобретение относится к косметологии, в частности к косметическому средству, обладающему комплексным противовоспалительным, антибактериальным, регенерирующим, иммуномодулирующим, липотропным и очищающим действием.
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и физиотерапии, и может быть использовано при лечении диабетической ангиопатии нижних конечностей у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа.

Изобретение относится к области почвоведения, агрохимии и фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения фракции бурых гуминовых кислот. Способ выделения фракции бурых гуминовых кислот из образца почвы, включающий сушку, измельчение, удаление органических остатков и просеивание образца почвы, проведение щелочной экстракции навески почвы раствором 0,1н.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для лечения хронического воспаления нижних отделов женских половых органов. Композиция для интравагинального введения при лечении хронического воспаления нижних отделов женских половых органов на основе сульфидно-иловой грязи, фитоэкстракта и антибактериального компонента, отличается тем, что она включает в качестве сульфидно-иловой грязи гомогенизированную лечебную грязь месторождения «Озеро «Лечебное», в качестве фитоэкстракта - густой экстракт солодки, в качестве антибактериального компонента - колифаг, стафилококковый бактериофаг и энтерококковый бактериофаг при определенном содержании.

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакологии, и раскрывает Средство для заживления ожоговых ран, включающее линимент бальзамический (по Вишневскому) и оксид цинка (ZnO).

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии. Раскрыто применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, со среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, в качестве средства стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа путем регулирования баланса активации провоспалительных свойств макрофагов, секретирующих цитокины ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α, и противовоспалительных свойств макрофагов, которые продуцируют ИЛ-10 цитокинов. Изобретение обеспечивает иммуномодулирующее средство природного происхождения, обладающее низкой токсичностью и способностью избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-1 бета, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма. 2 ил., 8 табл., 2 пр.

Наверх