Способ стерилизации зеленых растительных эксплантов перед вводом в культуру in vitro
Владельцы патента RU 2720916:
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ФЕДЕРАЛЬНЫЙ РОСТОВСКИЙ АГРАРНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации зеленых растительных эксплантов перед вводом в культуру in vitro, включает заготовку и стерилизацию. При заготовке растительного материала используют верхушки побегов 10-15 см активно вегетирующих растений, а стерилизацию эксплантов осуществляют последовательно в два этапа: вначале 70-75% водным раствором этанола в течение 30 секунд, а затем - 20-30% водным раствором препарата «Дезавид+» с экспозицией 10 мин и промывкой 3-4 раза стерильной дистиллированной водой в течение 5 мин. Изобретение обеспечивает повышение приживаемости и регенерации меристем из верхушек молодых зеленых побегов за счет снижения их контаминации и некроза. Способствует повышению безопасности и эффективности микроразмножения растений in vitro. 3 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала с помощью методов клонального микроразмножения.
Известен способ стерилизации растительных эксплантов путем обработки их 96%-ным этанолом. После чего в течение 30-60 мин выдерживают в 0,1-1,0% растворе беномила и дополнительно обрабатывают 6-10% раствором тексанита в течение 15-30 мин. (а.с. 1790350).
Недостатками такого способа стерилизации являются низкая надежность, так по данным авторов, в зависимости от загрязненности эксплантов микрофлорой (в разное время года), инфицированность может достигать до 30% и более. А также сложность и продолжительность процесса стерилизации.
Известен способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой (патент RU №2675510).
К недостаткам данного способа следует отнести то, что способ его применения отработан на крупных конгломератах - зеленых черенках, а не на предельно малых апикальных меристемах в качестве эксплантов для ввода в культуру in vitro. При этом, как известно из инструкции препарат «Аламинол», как и средство «Domestos» опасны для здоровья при попадании на кожу и слизистые покровы человека, а также способны повреждать нежные поверхностные ткани растений во время стерилизации.
Также известен способ стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» в соответствии с которым проводят обработку 0,5% спиртовым раствором хлоргексидина в течение 5 минут и промывают 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 часа (патент RU №2490871).
Недостатком данного способа является невысокая эффективность стерилизации и длительный многократный цикл промывки дистиллированной водой, что в условиях помещения стерильного бокса, где необходимо осуществлять подобные операции затруднительно и трудоемко.
Технической задачей настоящего изобретения, является разработка способа стерилизации зеленых растительных эксплантов перед вводом в культуру in vitro, позволяющего повысить надежность стерилизации активно растущих зеленых верхушек побегов без повреждения растительных тканей и снизить трудоемкость операции.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа стерилизации зеленых растительных эксплантов перед вводом в культуру in vitro, включающего заготовку и стерилизацию. При этом используют при заготовке растительного материала верхушки побегов 10-15 см активно вегетирующих растений, а стерилизация эксплантов осуществляется последовательно в два этапа: в начале 70-75% водным раствором этанола в течение 30 секунд, а затем - 20-30% водным раствором препарата «Дезавид+» с экспозицией 10 мин и промывкой 3-4 раза стерильной дистиллированной водой в течение 5 мин.
Новым в предложенном способе является то, что стерилизация осуществляется в два этапа: в начале предварительная 70% водным раствором этанола в течении 30 сек., а затем - основная 20-30% водным раствором препарата «Дезавид+»с экспозицией 10 мин., который впервые применяется как стерилизующий агент в культуре тканей растений. Затем растительные экспланты промывают 3-4 раза стерильной дистиллированной водой в течении 5-6 минут, и приступают к манипуляциям с ними в стерильных условиях ламинарного бокса. Известно, что «Дезавид+» применяется для дезинфекции помещений, поверхностей, мебели, а также инструментов, предметов, оборудования медицинского назначения при инфекциях бактериальной, вирусной, грибковой этиологии. Однако случаи использования «Дезавид+» для стерилизации растительных эксплантов перед вводом их для культивирования in vitro неизвестны. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".
Технический результат, заключающийся в повышении надежности стерилизации активно растущих зеленых верхушек побегов без повреждения растительных тканей и снижении трудоемкости операции, достигается за счет предварительной заготовки растительного материала - верхушек побегов с активно вегетирующих растений и использования в качестве основного стерилизатора средства «Дезавид+», действующими веществами которого являются полигексаметиленгуанидин гидрохлорид и алкилдиметилбензи-ламмоний хлорид - низкотоксичные соединения, относящееся к IV классу малоопасных веществ, что позволяет сократить длительный многократный цикл промывки.
Заявленное решение обладает «изобретательским уровнем», так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности авторов изобретения.
Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - «промышленному применению», что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.
Пример осуществления способа
С активно вегетирующих растений заготавливается растительный материал - верхушки побегов 10-15 см, у которых во избежание потери жизненно необходимой влаги при транспортировке к лаборатории сразу удаляют все листья и помещают в герметичные емкости. В лаборатории при необходимости данные экспланты предварительно промывают в чистой проточной воде, затем нарезают на удобные для стерилизации и дальнейших манипуляций отрезки и помещают в специальные емкости с герметично закрывающимися крышками. Далее экспланты в емкостях переносят в условия стерильного бокса, где подвергают вначале обработке 70-75% водным раствором этанола с экспозицией 30 секунд, а затем сразу же обрабатывают 20-30% раствором препарата «Дезавид+» с экспозицией 10 минут. После этой обработки экспланты прополаскивают 3-4 раза в течение 5-6 минут и переносят в ламинарный шкаф для вычленения меристем и высадки их на стерильные питательные среды.
Испытание данного способа стерилизации показало эффективность его применения более чем на 40 сортах винограда, учувствовавших в эксперименте, результаты которого представлены в таблицах 1,2,3:
Табл. 1 - Влияние различных концентраций препарата «Дезавид+», на эффективность стерилизации зеленых растительных эксплантов при вводе меристем винограда в культуру in vitro;
Табл. 2 - Влияние различных экспозиций при применении препарата «Дезавид+», на эффективность стерилизации зеленых растительных эксплантов при вводе меристем винограда в культуру in vitro;
Табл. 3 - Влияние водного раствора этанола при применении препарата «Дезавид+», на эффективность стерилизации зеленых растительных эксплантов при вводе меристем винограда в культуру in vitro.
Как видно из представленных в таблицах данных, в вариантах, где для стерилизации эксплантов применяли данный способ, снижалось количество инфицированных и погибших из-за некроза меристем, соответственно улучшалось число меристем, развившихся в конгломераты.
Как показали испытания, наилучшего эффекта стерилизации можно достичь, применяя предварительную стерилизацию этанолом - 70% с экспозицией 30 сек и последующей обработкой эксплантов препаратом «Дезавид+» 20,0÷30,0% концентрации с экспозицией 10 минут.
Использование предложенного способа стерилизации по сравнению с существующими схемами имеет следующие преимущества:
1. Уменьшается количество инфицированных меристем винограда высаженных на стерильную питательную среду in vitro, в среднем на 20,0-50,0% по сравнению с аналогичными способами стерилизации.
2. Заметно снижается количество эксплантов, отбракованных из-за некроза и отсутствия развития.
3. Значительно сокращается процесс стерилизации (в 2-3 раза), в том числе благодаря отсутствию необходимости тщательно промывать экспланты от стерилизующего вещества, т.к. «Дезавид+» в низких остаточных концентрациях не представляет опасности для тканей растений.
4. Процесс стерилизации становиться более безопасным для оператора, т.к. используемые вещества в качестве стерилизаторов являются низкотоксичными для человека.
Способ стерилизации зеленых растительных эксплантов перед вводом в культуру in vitro, включающий заготовку и стерилизацию, отличающийся тем, что при заготовке растительного материала используют верхушки побегов 10-15 см активно вегетирующих растений, а стерилизация эксплантов осуществляется последовательно в два этапа: вначале 70-75% водным раствором этанола в течение 30 секунд, а затем - 20-30% водным раствором препарата «Дезавид+» с экспозицией 10 мин и промывкой 3-4 раза стерильной дистиллированной водой в течение 5 мин.
