Кристаллическая форма (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида гидросульфата

Авторы патента:

ШАХ Халид (US)

ЭРРИГО Алиша Б. (US)

ДЖУЭНГСТ Деррик (US)

C07D487/04 - орто-конденсированные системы (карбапенамы, например тиенамицины C07D477/00)

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61P29/00 - Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС)

A61K31/519 - орто- или пери-конденсированные с гетероциклическими кольцами

Владельцы патента RU 2723990:

ЭРРЭЙ БИОФАРМА, ИНК. (US)

Изобретение относится к новой кристаллической форме соли (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида, соответствующей формуле (I-HS). Соединение может найти применение для лечения злокачественной опухоли, опосредованной Trk-киназой. Кристаллическая форма (I-HS) имеет основные дифракционные пики XRPD (градусы 2θ) при 18,4±0,2, 29,7±9,2, 23,1±9,2 и 24,9±0,2 и теплоту плавления по показателям DSC-термограммы около 2,415 мВт. Форма является негигроскопичной и демонстрирует менее 2% прироста массы при 25°С и 89% относительной влажности через 24-48 часов при определении методом динамической сорбции пара. Изобретение также относится к вариантам способа получения кристаллической формы I-HS и вариантам способа лечения злокачественной опухоли, описанным в формуле изобретения. Кристаллическая форма (I-HS) обладает стабильностью при хранении и использовании, негигроскопичностью, улучшенными показателями сыпучести, улучшенным профилем наличия примесей, что позволяет обеспечить безопасность при лечении. 11 н. и 16 з.п. ф-лы, 47 ил., 29 табл., 11 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамиду (формула I) и его фармацевтически приемлемым солям, например гидросульфатной соли, и, кроме того, к новой кристаллической форме гидросульфатной соли, которая демонстрирует ингибирование транскрипции тирозинкиназы семейства Trk, фармацевтическим композициям, содержащих указанное, способам получения кристаллической формы и применению соединения и кристаллической формы для лечения боли, воспаления, злокачественных опухолей и некоторых инфекционных заболеваний.

Описание предшествующего уровня техники

Trk - это рецепторные тирозинкиназы с высокой аффинностью, активируемые группой растворимых факторов роста, называемых нейротрофинами (NT). Семейство рецепторов Trk состоит из трех членов - TrkA, TrkB и TrkC. Среди нейротрофинов - (i) фактор роста нервов (NGF), который активирует TrkA, (ii) нейротрофический фактор мозга (BDNF) и NT-4/5, которые активируют TrkB и (iii) NT3, который активирует TrkC. Trk широко экспрессируются в нейрональной ткани и участвуют в поддержании, передаче сигналов и выживании нейрональных клеток (Patapoutian, A. et al., Current Opinion in Neurobiology, 2001, 11, 272-280).

Недавние литературные источники показали, что сверхэкспрессия, активация, амплификация и/или мутация Trk ассоциируются со многими видами злокачественных опухолей, включая нейробластому (Brodeur, GM, Nat.Rev. Cancer 2003, 3, 203-216), рак яичника (Davidson., B. Et al., Clin. Cancer Res. 2003, 9, 2248-2259), рак молочной железы (Kruettgen et al., Brain Pathology 2006, 16: 304-310), рак предстательной железы (Dionne et al., Clin. Cancer Res. 1998, 4 (8): 1887-1898), рак поджелудочной железы (Dang et al ., Journal of Gastroenterology and Hepatology 2006, 21 (5): 850-858), множественную миелому (Hu et al., Cancer Genetics and Cytogenetics 2007, 178: 1-10), астроцитому и медуллобластому (Kruettgen et al., Brain Pathology 2006, 16: 304-310), глиому (Hansen et al., Journal of Neurochemistry 2007, 103: 259-275), меланому²⁵, (Brzezianska et al., Neuroendocrinology Letters 2007, 28 (3), 221-229), аденокарциному легкого (Perez-Pinera et al., Molecular and Cellular Biochemistry 2007, 295 (1 & 2), 19-26), крупноклеточные нейроэндокринные опухоли¹⁹ (Marchetti et al., Human Mutation 2008, 29 (5), 609-616) и колоректальный рак (Bardelli, A., Science 2003, 300, 949). В доклинических моделях злокачественной опухоли ингибиторы Trk эффективны как при ингибировании роста опухоли, так и при прекращении метастазирования опухоли. В частности, неселективные низкомолекулярные ингибиторы TrkA, TrkB, TrkC и Trk/Fc-химеры были эффективны как в ингибировании роста опухоли, так и в прекращении метастазирования опухоли²⁵ (Nakagawara, A. (2001) Cancer Letters 169:107-114; Meyer, J. et al. (2007) Leukemia, 1-10; Pierottia, M.A. and Greco A., (2006) Cancer Letters 232:90-98; Eric Adriaenssens, E. et al. Cancer Res (2008) 68:(2) 346-351). Таким образом, ингибитор семейства Trk-киназ, как ожидается, будет полезен при лечении злокачественных опухолей.

Кроме того, было продемонстрировано, что ингибиторы пути Trk/нейротрофина эффективны в многочисленных доклинических моделях боли у животных. Например, показано, что антагонистические NGF и TrkA-антитела (например, RN-624) эффективны при воспалительных и невропатических болевых моделях боли и в клинических испытаниях человека (Woolf, CJ et al. (1994) Neuroscience 62,327-331; Zahn, P.K. et al. (2004) J. Pain 5, 157-163; McMahon, S. B. et al., (1995) Nat. Med. 1, 774-780; Ma, Q. P. and Woolf, C. J. (1997) Neuroreport 8, 807-810; Shelton, D. L. et al. (2005) Pain 116, 8-16; Delafoy, L. et al. (2003) Pain 105, 489-497; Lamb, K. et al. (2003) Neurogastroenterol. Motil. 15, 355-361; Jaggar, S. I. et al. (1999) Br. J. Anaesth. 83, 442-448). Кроме того, недавние литературные источники указывают на то, что после воспаления уровни BDNF и передача сигналов TrkB увеличены в спинномозговом ганглии (Cho, L. et al. Brain Research, 1997, 749, 358), а в нескольких исследованиях показано, что антитела, которые снижают передачу сигналов по пути BDNF/TrkB, ингибируют гиперчувствительность нейронов и связанную с ними боль (Chang-Qi, L et al. Molecular Pain 2008, 4:27).

Было показано, что NGF, секретируемый опухолевыми клетками и инвазионными макрофагами, непосредственно стимулирует TrkA, расположенный на периферических болевых волокнах. Используя различные модели опухолей у мышей и крыс, было показано, что нейтрализация NGF моноклональным антителом ингибирует боль, связанную со злокачественной опухолью, до степени, близкой или превосходящей максимально переносимую дозу морфина. Кроме того, активация пути BDNF/TrkB участвовала в многочисленных исследованиях в качестве модулятора различных типов боли, включая воспалительную боль (Matayoshi S., J. Physiol., 2005, 569: 685-95), нейропатическую боль (Thompson, SW, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:7714-18) и хирургическую боль (Li, C.-Q. et al., Molecular Pain, 2008, 4(28), 1-11). Поскольку киназы TrkA и TrkB могут служить в качестве медиатора возбуждаемых NGF биологических реакций, ингибиторы TrkA и/или других Trk-киназ могут обеспечить эффективное лечение хронических болевых состояний.

В современных режимах лечения болевых состояний используется несколько классов соединений. Опиоиды (такие как морфин) имеют несколько недостатков, включая рвотные, запорные и отрицательные респираторные эффекты, а также вероятность зависимости. Нестероидные противовоспалительные анальгетики (NSAID, например, COX-1- или COX-2-типа) также имеют недостатки, в том числе недостаточную эффективность при лечении сильной боли. Кроме того, ингибиторы СОХ-1 могут вызывать язвы слизистой оболочки. Соответственно, существует постоянная потребность в новых и более эффективных способах лечения боли, особенно хронической боли.

Кроме того, было показано, что ингибирование пути нейротрофина/Trk эффективно при обработке доклинических моделей воспалительных заболеваний. Например, ингибирование пути нейротрофина/Trk было вовлечено в доклинические модели воспалительных заболеваний легкого, включая астму (Freund-Michel, V. Frossard, N, Pharmacology & Therapeutics (2008), 117 (1), 52-76), интерстициальный цистит (Hu Vivian Y, et al. Journal of Urology (2005), 173 (3), 1016-21), воспалительные заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь Крона (Di Mola F. F. et al., Gut (2000), 46 (5), 670-678) и воспалительные кожные заболевания, такие как атопический дерматит (Dou, Y.-C., et al. Archives of Dermatological Research (2006), 298(1), 31-37), экзему и псориаз (Raychaudhuri, S. P.; et. al. Journal of Investigative Dermatology (2004), 122(3), 812-819).

Путь нейротрофина/Trk, особенно BDNF/TrkB, также был вовлечен в этиологию нейродегенеративных заболеваний, включая рассеянный склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера (Sohrabji, Farida, Lewis, Danielle K. Frontiers in Neuroendocrinology (2006), 27 (4), 404-414). Модуляция пути нейтрофина/Trk может быть полезной при лечении этих и связанных с ними заболеваний.

TrkA-рецептор также считается критическим для процесса болезни при инфекции паразитарной инфекцией Trypanosoma cruzi (болезнь Шагаса) у человеческих хозяев (de Melo-Jorge, M. et al. Cell Host & Microbe (2007), 1(4), 251-261). Таким образом, ингибирование TrkA может быть полезным при лечении болезни Шагаса и связанных с ней протозойных инфекций.

Ингибиторы Trk могут также найти применение при лечении заболеваний, связанных с дисбалансом регуляции ремоделирования кости, таких как остеопороз, ревматоидный артрит и метастазы в кости. Метастазы в кости являются частыми осложнениями при злокачественных опухолях, встречающиеся вплоть до 70% пациентов с прогрессирующим раком молочной железы или предстательной железы (1), а также у 15-30% пациентов с карциномой легкого, толстой кишки, желудка, мочевого пузыря, матки, прямой кишки, щитовидной железы или почки. Остеолитические метастазы могут вызывать сильную боль, патологические переломы, опасную для жизни гиперкальциемию, компрессию спинного мозга и другие нервно-компрессионные синдромы. По этим причинам костный метастаз является серьезным и дорогостоящим осложнением злокачественной опухоли. Следовательно, агенты, которые могут индуцировать апоптоз пролиферирующих остеобластов, были бы очень полезными. Экспрессия рецепторов TrkA и TrkC наблюдалась в области формирования кости в мышиных моделях перелома костей (K. Asaumi, et al., Bone (2000) 26 (6) 625-633). Кроме того, локализация NGF наблюдалась почти во всех костно-образующих клетках (K. Asaumi, et al.). Недавно было показано, что ингибитор пан-Trk ингибирует сигнальный путь тирозина, активированный нейротрофинами, связывающиеся со всеми тремя Trk-рецепторами в человеческих остеобластах hFOB (J. Pinski, et al., (2002) 62, 986-989). Эти данные подтверждают обоснованность использования ингибиторов Trk для лечения заболеваний костного ремоделирования, таких как метастазы в кости у онкологических больных.

Известны несколько классов ингибиторов малых молекул Trk-киназ, которые, как считается, полезны для лечения боли или злокачественных опухолей (Expert Opin.Ther. Patents (2009) 19(3)).

В публикациях международной заявки WO 2006/115452 и WO 2006/087538 описано несколько классов малых молекул, которые, как известно, являются ингибиторами Trk-киназ, которые могут быть полезны для лечения боли или злокачественной опухоли.

Известны соединения пиразоло[1,5-а]пиримидина. Например, в публикации международной патентной заявки WO 2008/037477 раскрыты соединения пиразоло[1,5-a]пиримидина, несущие алкильную, арильную или гетероциклическую группу в 3-положении. Эти соединения, как утверждается, являются ингибиторами PI3K и/или mTOR липидкиназы.

В публикации WO 2008/058126 раскрыты соединения пиразоло[1,5-a]пиримидина с фенильной группой в 3-положении. Эти соединения являются ингибиторами Pim-киназы.

В патенте US № 2006/0094699 раскрыты соединения пиразоло[1,5-a]пиримидина, несущие -C(=O) NH-фенил, -C(=O) (4-метилпиперидинил) или -C(=O) NMe (CH₂-триметилпиразолил) группу в 3-положении для использования в комбинированной терапии с агонистом глюкокортикоидных рецепторов.

В публикациях WO 2010/033941, WO 2010/048314, WO 2011/006074 и WO 2011/14633636 раскрыты соединения, которые проявляют ингибирование протеинтирозинкиназы Trk-семейства и которые применимы для лечения боли, злокачественных опухолей, воспаления, нейродегенеративных заболеваний и некоторых инфекционных заболеваний.

WO 2010/048314 раскрывает в примере 14А гидросульфатную соль (S)-N-(5 -((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида. В WO 2010/048314 не раскрывается конкретная форма соли гидросульфата, описанная в данном документе, когда ее получают в соответствии со способом Примера 14А в этом документе. В частности, в WO 2010/048314 не раскрывается кристаллическая форма (I-HS), как описано ниже.

Все документы, в том числе научные статьи, патентные публикации и заявки и т.п., на которые дается ссылка в настоящем раскрытии, настоящим включены ссылкой во всей полноте.

Раскрытие изобретения

Настоящее раскрытие относится к (S)-N-(5 -((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамиду (формула I) и его фармацевтически приемлемым солям, например, гидросульфатной соли, и, кроме того, к новой кристаллической форме гидросульфатной соли, которая демонстрирует ингибирование транскрипции протеинтирозинкиназы Trk-семейства, фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанное, способам изготовления кристаллической формы, и применение соединения и кристаллической формы при лечении боли, воспаления, злокачественной опухоли и некоторых инфекционных заболеваний.

Приведенная в данном документе новая кристаллическая форма соединения формулы I:

также известная как (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид. В частности, новая кристаллическая форма включает гидросульфатную соль соединения формулы I в стабильной полиморфной форме, далее называемая кристаллической формой (I-HS) и LOXO-101, которая может быть охарактеризована, например, по ее паттерну рентгеновской дифракции - кристаллическая форма (I-HS), имеющая формулу:

I-HS.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 18,4 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 23,1 ± 0,2 и 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 23,1 ± 0,2 и 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 19,2 ± 0,2, 20,2 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 23,1 ± 0,2 и 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 15,3 ± 0,2, 16,5 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 19,2 ± 0,2, 19,9 ± 0,2, 20,2 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,1 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, 24,0 ± 0,2. 24,4±0,2, 25,6±0,2, 26,5±0.2, 27,6±0.2, 28,2±0,2, 28,7±0,2, 30,8±0,2 и 38,5±0,2.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет структуру XRPD по существу, как показано на фиг. 29.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма демонстрирует начало до максимума от около 193 до около 205°С, согласно измерению дифференциальной сканирующей калориметрией. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) демонстрирует теплоту плавления около 2,415 мВт, согласно измерению дифференциальной сканирующей калориметрией. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет DSC-термограмму, представленную на фиг. 26. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) является негигроскопичной.

Некоторые воплощения включают фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и кристаллическую форму (I-HS). Некоторые воплощения включают фармацевтическую композицию, полученную смешиванием кристаллической формы (I-HS) и фармацевтически приемлемого носителя. Некоторые воплощения включают способ приготовления фармацевтической композиции, включающий смешивание кристаллической формы (I-HS) и фармацевтически приемлемого носителя.

Настоящее раскрытие также относится к способам лечения злокачественной опухоли, боли, воспаления и некоторых инфекционных заболеваний, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS). Некоторые воплощения включают применение кристаллической формы (I-HS) при получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, боли, воспаления и некоторых инфекционных заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом.

Также в данном документе представлен способ лечения злокачественной опухоли, опосредуемого Trk-киназой, у нуждающегося в этом субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS). В некоторых воплощениях злокачественная опухоль опосредуется Trk; TrkB; или TrkA и TrkB. В некоторых воплощениях пациент диагностируется или идентифицируется как имеющий Trk-ассоциированная злокачественная опухоль.

Далее в настоящем документе предлагается способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий: (а) определение того, ассоциирована ли злокачественная опухоль с одной или несколькими из числа сверхэкспрессии, активации, амплификации и мутации Trk-киназы; и (b) если определено, что злокачественная опухоль ассоциировано с одной или несколькими из числа сверхэкспрессии, активации, амплификации и мутации Trk-киназы, введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS). В некоторых воплощениях предоставляется способ лечения злокачественной опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий: (а) определение, опосредуется ли злокачественная опухоль Trk-киназой; и (b) если определено, что злокачественная опухоль опосредуется Trk-киназой, введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS). Также в данном документе предлагается способ лечения субъекта, включающий: (a) проведение анализа на образце, полученном у субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или уровня; и (b) введение субъекту, определенному как имеющему нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS).

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или уровня представляет собой трансляцию хромосом, которая приводит к трансляции химерного белка Trk. Например, химерный белок Trk выбирают из группы, состоящей из: TP53-TrkA, LMNA-TrkA, CD74-TrkA, TFG-TrkA, TPM3-TrkA, NFASC-TrkA, BCAN-TrkA, MPRIP-TrkA, TPR-TrkA, RFWD2-TrkA, IRF2BP2-TrkA, SQSTM1-TrkA, SSBP2-TrkA, RABGAP1L-TrkA, C18ORF8-TrkA, RNF213-TrkA, TBC1D22A-TrkA, C20ORF112-TrkA, DNER-TrkA, ARHGEF2-TrkA, CHTOP-TrkA, PPL -TrkA, PLEKHA6-TrkA, PEAR1-TrkA, MRPL24-TrkA, MDM4-TrkA, LRRC71-TrkA, GRIPAP1-TrkA, EPS15-TrkA, DYNC2H1-TrkA, CEL-TrkA, EPHB2-TrkA, TGF-TrkA, NACC2-TrkB, QKI-TrkB, AFAP1-TrkB, PAN3-TrkB, SQSTM1-TrkB, TRIM24-TrkB, VCL-TrkB, AGBL4-TrkB, DAB2IP-TrkB, ETV6-TrkC, BTBD1-TrkC, LYN-TrkC, RBPMS-TrkC, EML4 -TrkC, HOMER2-TrkC, TFG-TrkC, FAT1-TrkC и TEL-TrkC.

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности представляет собой одну или несколько точечных мутаций в гене. Например, ген NTRK представляет собой ген NTRK1, и одна или несколько точечных мутаций в гене NTRK1 приводят к трансляции белка TrkA, имеющего замены, которые представляют собой одно или несколько следующих положений аминокислот: 33, 336, 337, 324, 420, 444, 517, 538, 649, 682, 683, 702 и 1879. В некоторых воплощениях одна или несколько точечных мутаций в гене NTRK1 приводят к трансляции белка TrkA, имеющего одну или несколько из следующих аминокислотных замен: R33W, A336E, A337T, R324Q, R324W, V420M, R444Q, R444W, G517R, G517V, K538A, R649W, R649L, R682S, V683G, R702C и C1879T.

Особенности и преимущества, описанные в этом резюме и последующем подробном описании, не являются всеобъемлющими. Многие дополнительные признаки и преимущества будут понятны любому специалисту в данной области техники с учетом чертежей, описания и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует рентгенограмму порошковой дифракции (XRPD) кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2, в соответствии с одним из воплощений.

Фиг. 2 иллюстрирует одновременный профиль термогравиметрического/дифференциального термического анализатора (TG/DTA) кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2, согласно одному воплощению.

Фиг. 3 иллюстрирует профиль дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2, в соответствии с одним из воплощений.

Фиг. 4А и 4В иллюстрируют изображения микроскопии в поляризованном свете (PLM) кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2 в (А) неполяризованном и (B) поляризованном свете, в соответствии с некоторыми воплощениями.

Фиг. 5 иллюстрирует изотермический профиль динамической паровой сорбции (DVS) кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2, в соответствии с одним из воплощений.

Фиг. 6 иллюстрирует профиль инфракрасной (ИК) спектроскопии кристаллической формы (I-HS), полученной в соответствии с Примером 2, в соответствии с одним из воплощений.

Фиг. 7 иллюстрирует рентгенограмму аморфной формы свободного основания соединения формулы I согласно одному воплощению.

Фиг. 8 представляет собой диаграмму, демонстрирующую зависящее от дозы ингибирование пролиферации клеток аденокарциномы легкого CUTO-3, содержащих химерный белок MPRIP-NTRK1, с использованием кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 9 представляет собой диаграмму, демонстрирующую зависящее от дозы ингибирование пролиферации клеток колоректального рака KM12, содержащих гибридный белок TPM3-NTRK1, с использованием кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 10 представляет собой диаграмму, демонстрирующую зависимое от дозы ингибирование пролиферации клеток острого миелолейкоза MO-91, содержащих гибридный белок ETV6-NTRK3 с использованием кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 11 представляет собой иммуноблот, демонстрирующий, что кристаллическая форма (I-HS) ингибирует активацию киназы MPRIP-TRKA, ERK1/2 в клетках CUTO-3F и активность AKT в клетках KM12. Клетки обрабатывали в течение 2 часов кристаллической формой (I-HS) в указанных дозах.

Фиг. 12 представляет собой иммуноблот, демонстрирующий, что кристаллическая форма (I-HS) ингибирует активацию TPM3-TRKA-киназы, а также активность ERK1/2 и AKT в клетках KM12. Клетки обрабатывали в течение 2 часов кристаллической формой (I-HS) в указанных дозах.

Фиг. 13 представляет собой иммуноблот, демонстрирующий, что кристаллическая форма (I-HS) ингибирует активность TEL-TRKC-киназы и ERK1/2 и AKT в клетках MO-91. Клетки обрабатывали в течение 2 часов кристаллической формой (I-HS) в указанных дозах.

Фиг. 14 представляет собой схематическое изображение химерного гена LMNA-NTRK1, идентифицированного в образце опухоли пациента: соединение первых двух экзонов LMNA (NM_170707) с экзоном 11-17 NTRK1 (NM_002529).

Фиг. 15 представляет собой флуоресцентную микрофотографию анализа перестроек гена NTRK1 методом флюоресцентной гибридизации in situ с зондом «Break Apart», которая демонстрирует как парные зеленые (5 'NTRK1), так и красные (3' NTRK1) сигналы, соответствующие нормальному гену (желтая стрелка), и изолированные красные сигналы (красные стрелки) наблюдаемые в ядрах опухолей (окрашенных в синий цвет с помощью DAPI), что указывает на хромосомную делецию, которая приводит к слиянию гена NTRK1.

Фиг. 16 представляет собой хроматограмму секвенирования ДНК продукта ОТ-ПЦР с использованием праймеров LMNA (5') и NTRK1 (3'), демонстрирующую точку слияния между экзоном 2 LMNA и экзоном 11 NTRK1.

Фиг. 17 представляет собой схему метода близкого лигирования TRK-SHC1 (PLA). Эта фигура демонстрирует обнаружение проксимального (<40 нМ) TRK и белков SHC1 в опухолевых клетках. Используемое TRK-антитело (кролик) может детектировать c-конец белков TRKA (кодируемого NTRK1), TRKB (NTRK2) или TRKC (NTRK3). SHC1 детектируется с помощью антитела к SHC1 (мышь). Связывание видоспецифических вторичных антител с ковалентно присоединенными комплементарными нуклеотидными последовательностями позволяет in situ ПЦР-реакции генерировать ДНК, которая может быть обнаружена флуоресцентной in situ гибридизацией, визуализированной в этом способе в виде красных точек. Этот анализ обладает потенциалом для обнаружения активированного TRK вне зависимости от механизма активации (слияния генов, мутации или аутокринной/паракринной активации дикого типа) члена семейства TRK-рецепторов (TRKA/B/C).

Фиг. 18 представляет собой набор данных, которые подтверждают TRA-SHC1 PLA. (A) Клеточную линию CUTO-3, полученную из злокачественного плеврального выпота у пациента с аденокарциномой легкого IV степени, несущую гибрид гена MPRIP-NTRK1, трансфицировали ненаправленными контрольными (NTC) siRNA, siRNA, нацеленными на NTRK1, или не обрабатывались (контроль) и анализировали на экспрессию белка TRKA. Вестерн-блот-анализ демонстрирует заметное снижение уровней белка TRKA и соответствует слитому белку MPRIP-TRKA, который мигрирует с кажущейся молекулярной массой 170 кДа. TRK-SHC1 PLA осуществляли на клетках, обработанных как в (A), демонстрирующих устойчивый положительный сигнал, в контрольных siRNA (B), но показал пропорциональное снижение в случае NTRK1 siRNA (C). Клетки CUTO-3 обрабатывали DMSO (D) или кристаллической формой (I-HS) в концентрации 100 нМ (E) в течение 2 часов, демонстрируя нарушение разрушения комплексов TRKA-SHC1 в образце, обработанном кристаллической формой (I-HS), по сравнению с контролем. CULC001 представляет собой полученный из пациента ксенотрансплантат опухоли (PDX), полученный из той же опухоли, что и линия клеток CUTO-3, и содержащий химерный ген MPRIP-NTRK1 (не показано). CULC002 представляет собой PDX из пациента с NSCLC без известного драйвера (ALK, ROS1, EGFR, KRAS и отрицательный BRAF) и отрицательного по химерному гену NTRK1 гена согласно FISH-тесту NTRK1 с зондом «Break Apart» (не показано). Анализ TRK PLA демонстрирует надежный сигнал в CULC001 (F), и отсутствие сигнала в ядрах опухолей CULC002 (G). Панели (H) и (I) демонстрируют нервный пучок из CULC001 PDX. TRK-SHC1 PLA является положительным только в этой области образца опухоли CULC002, что наводит на мысль о аутокринной передаче сигнала в TRKA, TRKB или TRKC-рецепторе, поскольку это семейство экспрессируется в нервной ткани и служит внутренним положительным контролем для этого, в ином случае, отрицательного образца опухоли.

Фиг. 19 представляет собой изображение метода близкого лигирования TRK SHC1 и контроля. (A) Метод близкого лигирования TRK-SHC1 показал надежный сигнал в ядрах опухолей, но слабый сигнал в толстостенном кровеносном сосуде. Ядра окрашивали DAPI (синий), а красные сигналы представляли положительный PLA, указывающий на белковые комплексы TRKA-SHC1. Кровеносный сосуд показан в частичном эллипсе (пунктирная белая линия). (B) Прилегающий участок опухолевой ткани, окрашенный гематоксилином и эозином, демонстрирует толстостенный кровеносный сосуд (в пределах частичного эллипса, обозначенного пунктирной белой линией) и фланкирующие ядра опухоли.

Фиг. 20 представляют собой набор изображений, показывающих TRK и ALK PLA в образце опухоли ALK+. Образец опухоли FFPE от пациента ALK + (образец аутопсии) анализировали с использованием PLK (A) TRK-SHC1, демонстрируя отсутствие сигнала или ALK-GRB2 PLA (B), демонстрируя надежный сигнал ALK.

Фиг. 21 представляет собой набор из трех изображений компьютерной томографии у субъекта, имеющего недифференцированную саркому. Изображения КТ получали после предоперационной химиотерапии и первичной резекции опухоли со стрелкой, указывающей на наличие 18 мм узла в правом легком (А), базовую визуализацию непосредственно перед введением дозы кристаллической формы (I-HS) при исследовании (c), и после 1 цикла (28 дней) введения дозы кристаллической формы (I-HS) (C). У пациента наблюдалось метастатическое заболевание только в легком, и поэтому на изображениях компьютерной томографии показаны осевые (верхние) и корональные (нижние) изображения, фокусирующиеся на грудной полости. Изображения демонстрируют начальную быструю прогрессию болезни (AB, 13-недельный интервал), сопровождаемую выраженным опухолевым ответом с уменьшенным размером и/или разрешением многочисленных легочных метастазов (B-C, интервал 4 недели).

Фиг. 22 представляет собой диаграмму, демонстрирующую сывороточные уровни СА125 у пациента, имеющего недифференцированную саркому, обработанную кристаллической формой (I-HS) относительно времени. Было выявлено, что уровни СА125 в сыворотке повышены у этого пациента, и впоследствии он стал потенциальным индикатором активности. Сывороточный СА125 была отмечен на исходном уровне (день -8) до введения дозы и в указанные моменты времени после начала введения дозы в день -3 - день 56, демонстрируя зависящее от времени снижение этого маркера опухоли. Красная пунктирная линия указывает верхний предел нормы (35 Ед./мл) этого лабораторного теста.

Фиг. 23 представляет собой диаграмму, демонстрирующую дозозависимое ингибирование пролиферации клеток HCC78, содержащих химерный белок SLC34A2-ROS1, посредством кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 24 представляет собой диаграмму, демонстрирующую термографические данные для AM(HS)1. Верхняя линия диаграммы представляет собой график термогравиметрического анализа (TGA) для соединения, а нижняя строка представляет собой график дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Фиг. 25 представляет собой диаграмму, демонстрирующую термографические данные для AM(HS)2. Верхняя строка диаграммы представляет собой график термогравиметрического анализа (TGA) для соединения, а нижняя строка представляет собой график дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Фиг. 26 представляет собой диаграмму, демонстрирующую термографические данные для кристаллической формы (I-HS). Верхняя строка диаграммы представляет собой график термогравиметрического анализа (TGA) для соединения, а нижняя строка представляет собой график дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Фиг. 27 иллюстрирует наложение паттернов порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) AM(HS)1, AM(HS)2 и кристаллической формы (I-HS). AM(HS)1 и AM(HS)2 представлены широкими линиями в нижней части фигуры, а кристаллическая форма (I-HS) демонстрирует резкие пики.

Фиг. 28 иллюстрирует паттерн порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) для AM(HS)1 и AM(HS)2.

Фиг. 29 иллюстрирует паттерн порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 30 представляет собой изображение образца AM(HS)1 в поляризованной световой микроскопии при увеличении 20X.

Фиг. 31 представляет собой изображение образца AM(HS)2 в поляризованной световой микроскопии при увеличении 20Х.

Фиг. 32 представляет собой изображение образца кристаллической формы (I-HS) в поляризованной световой микроскопии при увеличении 20Х.

Фиг. 33 представляет график гигроскопичности AM(HS)1 с использованием динамической паровой сорбции (DVS).

Фиг. 34 иллюстрирует паттерн порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) AM(HS)1 перед DVS (верхняя линия) и после DVS (нижняя линия).

Фиг. 35 представляет собой график гигроскопичности AM(HS)2 с использованием динамической паровой сорбции (DVS).

Фиг. 36 иллюстрирует картину дифракции рентгеновской порошковой дифракции (XRPD) AM(HS)2 перед DVS (верхняя линия) и после DVS (нижняя линия).

Фиг. 37 представляет собой график гигроскопичности кристаллической формы (I-HS) с использованием динамической паровой сорбции (DVS).

Фиг. 38 иллюстрирует паттерн порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) кристаллической формы (I-HS) перед DVS (верхняя линия) и после DVS (нижняя линия).

Фиг. 39 представляет график зависимости прочности при растяжении от давления сжатия для различных 200 мг прессовок смесей прямой компрессии, содержащих кристаллическую форму (I-HS) или AM(HS)2. График (1) представляет собой смесь MCC: лактоза 2:1 с AM(HS)2; (2) представляет собой смесь MCC: лактоза 2:1 с кристаллической формой (I-HS); (3) представляет собой МСС 1:1: смесь крахмала с AM(HS)2; (4) представляет собой МСС 1: 1: смесь крахмала с кристаллической формой (I-HS).

Фиг. 40 представляет собой наложение DSC термограммы AM(HS)1 при T0 (нижняя строка) и через 5 недель при 40°C/75% относительной влажности (верхняя строка).

Фиг. 41 представляет собой наложение термограмм DSC кристаллической формы (I-HS) при T0 (нижняя строка) и через 5 недель при 40°C/75% относительной влажности (верхняя строка).

Фиг. 42 иллюстрирует наложение паттернов порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) AM(HS)1 при T0 (широкая линия) и через 5 недель при 40°C/75% относительной влажности (острые пики).

Фиг. 43 иллюстрирует наложение паттернов порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) кристаллической формы (I-HS) при T0 (внизу) и через 5 недель при 40°C/75% относительной влажности (сверху).

Фиг. 44 иллюстрирует наложение паттернов порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) кристаллической формы (I-HS) (внизу) и AM(HS)1 (верх) через 5 недель при 40°C/75% относительной влажности.

Фиг. 45 представляет собой диаграмму, демонстрирующую процент изменения объема опухоли ксенотрансплантата (человеческого), полученной из клеточной линии CUTO-3F аденокарциномы легкого (CUTO-3.29), в зависимости от времени у мышей, которых обрабатывали носителем (треугольники) или перорально вводили ежедневно дозу 60 мг/кг (кружки) или 200 мг/кг (квадраты) кристаллической формы (I-HS) после имплантации ксенотрансплантата в мышей.

Фиг. 46 представляет собой диаграмму, демонстрирующую процент изменения объема опухоли ксенотрансплантата (человеческого), происходящего из клеточной линии КМ12 колоректального рака с течением времени у мышей, которые были обработаны носителем (треугольники) или которым перорально вводили суточную дозу 60 мг/кг (кружки) или 200 мг/кг (квадраты) кристаллической формы (I-HS) после имплантации ксенотрансплантата в мышей.

Фиг. 47 представляет собой диаграмму, демонстрирующую процент изменения объема опухоли ксенотрансплантата (человеческого), происходящей из клеточной линии острого миелоидного лейкоза MO-91 в зависимости от времени у мышей, которые были обработаны носителем (треугольники) или которым перорально вводили суточную дозу 60 мг/кг (кружки) или 200 мг/кг (квадраты) кристаллической формы (I-HS) после имплантации ксенотрансплантата в мышей.

На фигурах показаны различные воплощения настоящего изобретения только с целью иллюстрации. Специалист в данной области легко поймет из нижеследующего обсуждения, что альтернативные воплощения структур и способов, проиллюстрированные в данном документе, могут быть использованы без отклонения от принципов изобретения, описанных в данном документе.

Осуществление изобретения

Настоящее раскрытие относится к (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамиду (формула I) и к его фармацевтически приемлемым солям, например гидросульфатной соли, и, кроме того, к новой кристаллической форме гидросульфатной соли, которая демонстрирует ингибирование транскрипции протеинтирозинкиназы семейства Trk, фармацевтическим композициям, содержащим указанное, и способам изготовления кристаллической формы.

Приведенная в данном документе новая кристаллическая форма соединения формулы I:

В частности, новая кристаллическая форма включает гидросульфатную соль соединения формулы I в стабильной полиморфной форме, далее называемой кристаллической формой (I-HS), которая может быть охарактеризована, например, посредством ее паттерна рентгеновской дифракции.

Как показано на фиг. 1, в некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) может быть охарактеризована по ее паттерну порошковой рентгеновской дифракции (XRPD). XRPD проводили на рентгеновском дифрактометре D5000 с CuKα1 0,1540562 нм длиной, тонкофокусным запаянным трубчатым источником от Siemens путем сканирования образцов от 3 до 40° 2-тета с шагом 0,200° 2-тета и временем на шаг 1 секунда. Эффективная скорость сканирования составляла 0.0200°/с при напряжении прибора 40 кВ и токе 40 мА. Образцы анализировали, используя дивергентную щель размером 2 мм в режиме отражения в следующих экспериментальных условиях.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 20 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), как указано в таблице 1.

Таблица 1. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение [2-θ]	FWHM [2-θ]	d-интервал [Å]	Относительная Интенсивность [%]
10,63	0,12	8,32	27,44
15,25	0,14	5,81	12,24
16,39	0,13	5,40	13,92
18,37	0,13	4,82	43,65
19,08	0,14	4,65	19,60
19,79	0,11	4,48	9,83
20,15	0,25	4,40	25,09
20,61	0,13	4,31	100,00
21,47	0,21	4,14	24,71
22,01	0,12	4,03	14,45
23,04	0,15	3,86	33,01
23,97	0,12	3,71	38,52
24,35	0,21	3,65	10,05
25,58	0,13	3,48	8,11
26,48	0,17	3,36	9,76
27,50	0,14	3,24	7,70
28,17	0,17	3,16	11,60
28,58	0,19	3,12	10,85
30,77	0,29	2,90	8,48
38,47	0,21	2,34	10,97

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 8 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), которая содержит пики, имеющие относительную интенсивность, большую или равную около 15%, как указано в таблице 2.

Таблица 2. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение [2-θ]	FWHM [2-θ]	d-интервал [Å]	Относительная Интенсивность [%]
10,63	0,12	8,32	27,44
18,37	0,13	4,82	43,65
19,08	0,14	4,65	19,60
20,15	0,25	4,40	25,09
20,61	0,13	4,31	100,00
21,47	0,21	4,14	24,71
23,04	0,15	3,86	33,01
23,97	0,12	3,71	38,52

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 5 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), которая содержит пики, имеющие относительную интенсивность, большую или равную около 25%, как указано в таблице 3.

Таблица 3. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение [2-θ]	FWHM [2-θ]	d-интервал [Å]	Относительная Интенсивность [%]
10,63	0,12	8,32	27,44
18,37	0,13	4,82	43,65
20,61	0,13	4,31	100,00
23,04	0,15	3,86	33,01
23,97	0,12	3,71	38,52

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 4 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), которая содержит пики, имеющие относительную интенсивность, большую или равную около 30%, как указано в таблице 4.

Таблица 4. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение [2-θ]	FWHM [2-θ]	d-интервал [Å]	Относительная Интенсивность [%]
18,37	0,13	4,82	43,65
20,61	0,13	4,31	100,00
23,04	0,15	3,86	33,01
23,97	0,12	3,71	38,52

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, который является по существу тем же самым паттерном XRPD, как показано на фиг. 1.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 18,4, 20,6, 23,0 и 24,0. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,6, 18,4, 20,6, 23,0 и 24,0. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,6, 18,4, 19,1, 20,2, 20,6, 21,5, 23,0 и 24,0. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,6, 15,3, 16,4, 18,4, 19,1, 19,8, 20,2, 20,6, 21,5, 22,0, 23,0, 24,0, 24,4, 25,6, 26,5, 27,5, 28,2, 28,6, 30,8 и 38,5.

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, который по существу является тем же самым XRPD-паттерном, как показано на фиг. 29.

Таблица 5. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение (2θ)	Относительная интенсивность (%)
10,76	29,85
15,38	13,22
16,52	16,46
18,50	48,07
19,22	22,92
19,92	16,05
20,26	30,80
20,74	100,00
21,56	23,78
22,16	15,51
23,16	32,52
24,10	33,89
24,50	12,14
25,72	8,89
26,50	10,88
27,62	8,61
28,32	11,44
28,74	10,73
30,92	8,23
38,60	8,88

Таблица 6. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение (2θ)	Относительная интенсивность (%)
10,76	29,85
18,50	48,07
19,22	22,92
20,26	30,80
20,74	100,00
21,56	23,78
23,16	32,52
24,10	33,89

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 5 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), который содержит пики с относительной интенсивностью, большей или равной около 25%, как указано в таблице 7.

Таблица 7. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение (2θ)	Относительная интенсивность (%)
10,76	29,85
18,50	48,07
20,74	100,00
23,16	32,52
24,10	33,89

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет XRPD-паттерн, по меньшей мере, с 4 характеристическими пиками (градусы 2θ ± 0,3), который содержит пики, имеющие относительную интенсивность, большую или равную около 30%, как указано в таблице 8.

Таблица 8. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Положение (2θ)	Относительная интенсивность (%)
18,50	48,07
20,74	100,00
23,16	32,52
24,10	33,89

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 18,5, 20,7, 23,2 и 24,1. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,8, 18,5, 20,7, 23,2 и 24,1. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,8, 18,5, 19,2, 20,3, 20,7, 21,6, 23,2 и 24,1. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при около 10,8, 15,4, 16,5, 18,5, 19,2, 19,9, 20,3, 20,7, 21,6, 22,2, 23,2, 24,1, 24,5, 25,7, 26,5, 27,6, 28,3, 28,7, 30,9 и 38,6.

В некоторых воплощениях, учитывая XRPD-паттерны, представленные на фиг. 1 и 29, кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием пиков XRPD (градусы 2θ), как показано в таблице 9.

Таблица 9. Пики XRPD кристаллической формы (I-HS)

Фиг. 1.	Фиг. 29.	Разница	Среднее	Округленное значение
10,76	10,63	0,13	10,70	10,7±0,2
15,38	15,25	0,13	15,32	15,3
16,52	16,39	0,13	16,46	16,5
18,50	18,37	0,13	18,44	18,4
19,22	19,08	0,14	19,15	19,2
19,92	19,79	0,13	19,86	19,9
20,26	20,15	0,11	20,21	20,2
20,74	20,61	0,13	20,68	20,7
21,56	21,47	0,09	21,52	21,5
22,16	22,01	0,15	22,09	22,1
23,16	23,04	0,12	23,10	23,1
24,10	23,97	0,13	24,04	24,0
24,50	24,35	0,15	24,43	24,4
25,72	25,58	0,14	25,65	25,6
26,50	26,48	0,02	26,49	26,5
27,62	27,50	0,12	27,56	27,6
28,32	28,17	0,15	28,25	28,2
28,74	28,58	0,16	28,66	28,7
30,92	30,77	0,15	30,85	30,8
38,60	38,47	0,13	38,54	38,5

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 18,4 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 23,1 ± 0,2 и 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 23,1 ± 0,2 и 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 19,2 ± 0,2, 20,2 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, И 24,0 ± 0,2. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) характеризуется наличием дифракционных пиков XRPD (градусы 2θ) при 10,7 ± 0,2, 15,3 ± 0,2, 16,5 ± 0,2, 18,4 ± 0,2, 19,2 ± 0,2, 19,9 ± 0,2, 20,2 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,1 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, 24,0 ± 0,2. 24,4±0,2, 25,6±0,2, 26,5±0,2, 27,6±0,2, 28,2±0,2, 28,7±0,2, 30,8±0,2 и 38,5±0,2.

Понятно, что 2-тета-значения паттернов порошковой рентгеновской дифракции для кристаллической формы (I-HS) могут незначительно отличаться от одного прибора к другому, а также зависеть от изменений в подготовке образца и от партии к партии, и поэтому приведенные значения не должны истолковываться как абсолютные. Также будет понятно, что относительные интенсивности пиков могут варьировать в зависимости от эффектов ориентации, так что интенсивности, показанные в кривой XRPD, включенной в данный документ, являются иллюстративными и не предназначены для применения для абсолютного сравнения. Соответственно, следует понимать, что выражение «по существу тот же паттерн XRPD, что и показанный на фиг. 1 или фиг. 29» означает, что для целей сравнения присутствует, по меньшей мере, 90% пиков, показанных на фиг. 1 или фиг. 29. Должно быть понятно, что относительные положения пиков могут меняться ± 0,3 градуса от положений пиков, показанных на фиг. 1 или фиг. 29. Следует также понимать, что для целей сравнения допускается некоторая изменчивость в интенсивности пиков по сравнению с показателями, представленными на фиг. 1 и фиг. 29.

Фиг. 2 иллюстрирует одновременный профиль термогравиметрического/дифференциального термического анализа (TG/DTA) кристаллической формы (I-HS) согласно одному воплощению. Для анализа около 5 мг кристаллической формы (I-HS) взвешивали в открытой алюминиевой чаше и загружали в термогравиметрический/дифференциальный термический анализатор (TG/DTA) и выдерживали при комнатной температуре. Затем образец нагревали со скоростью 10°С/мин от 25°С до 300°С, в течении времени которого записывали изменение массы образца вместе с любыми дифференциальными тепловыми событиями. Азот использовали в качестве продувочного газа при расходе 100 см³/мин. Профиль TG/DAT кристаллической формы (I-HS) показывает начальную потерю массы 0,8% между 27,4°С и 182,4°С, за которой следует потеря массы 4,9% на кривой TG между 182,4°С и 225,0°С, также рассматриваемая как эндотерма в кривой DTA. Эти потери массы могут быть разложением материала.

Фиг. 3 иллюстрирует профиль дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) кристаллической формы (I-HS) согласно одному воплощению. DSC-анализ образца проводился с использованием дифференциального сканирующего калориметра Seiko DSC6200 (оснащенного кулером). Около 5 мг кристаллической формы (I-HS) взвешивали в алюминиевой чашке DSC и герметично закрывали алюминиевой крышкой с отверстием. Затем чашу для образцов загружали в Seiko DSC6200 (оснащенный кулером), охлаждали и выдерживали при 25°С. Как только был получен стабильный отклик на теплоотдачу, образец и эталон нагревали до 270°С со скоростью сканирования 10°С/мин, контролируя результирующий отклик теплового потока. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) имеет термограмму DSC, по существу, как показано на фиг. 3. Используемый в данном документе термин «по существу, как показано на фиг. 3» означает, что температуры эндотермического события, показанного на фиг. 3, могут изменяться на около ± 5°С.

Как показано на фиг. 3, DSC-термограмма кристаллической формы (I-HS) указывает на небольшое эндотермическое изменение в исходном состоянии между 122,9°С и 152,8°С с последующей резкой эндотермой, которая соответствует плавлению кристаллической формы (I-HS) при начальной температуре плавления 190,8°С, пиковой температуре плавления 197,9°С и теплоте плавления 2,415 мВт. Переход, следующий за эндотермой плавления, может быть вызван разложением расплавленной кристаллической формы (I-HS).

Фиг. 4А и 4В иллюстрируют микроскопические изображения в поляризованном свете (PLM) кристаллической формы (I-HS) в (A) неполяризованном и (B) неполяризованном свете в соответствии с некоторыми воплощениями. Наличие кристалличности (двойного лучепреломления) определяли с помощью поляризационного микроскопа Olympus BX50, оснащенного камерой Motic и программным обеспечением для захвата изображений (Motic Images Plus 2.0). Все изображения были записаны с использованием объектива 20x. Кристаллическая форма (I-HS) проявляет двойное лучепреломление при исследовании в поляризованном свете без проявления определенной морфологии или агломератов.

Фиг. 5 иллюстрирует изотермический профиль динамической паровой сорбции (DVS) кристаллической формы (I-HS) согласно одному воплощению. Для измерения DVS образец кристаллической формы (I-HS) подвергали циклическому изменению посредством изменения условий влажности для определения его гигроскопичности. Образец анализировали, с помощью системы измерения поверхности DVS-1 Системы динамической паровой сорбции. Около 10 мг кристаллической формы (I-HS) помещали в сетчатую чашку весов для сорбции паров и загружали в весы для динамической паровой сорбции как часть системы измерения поверхности. Данные собирались с интервалом в 1 минуту. В качестве газа-носителя использовали азот. Отобранные пробные кристаллические формы (I-HS) подвергали линейному профилю изменения относительной влажности 20-90% (RH) с шагом 10%, поддерживая образец на каждой стадии до достижения стабильной массы (99,5% завершения стадии). После завершения цикла сорбции образец сушили, используя ту же самую процедуру, но вплоть до 0% RH и, наконец, возвращали в начальную точку 20% RH. Изменение массы в течение циклов сорбции/десорбции было нанесено на график, что позволило определить гигроскопичность образца.

Как показано на фиг. 5, кристаллическая форма (I-HS) представляется негигроскопичной. Небольшое увеличение массы около 1,7% наблюдалось между 0% и 90% относительной влажности в течение цикла сорбции. Кроме того, наблюдался очень небольшой гистерезис между циклами сорбции и десорбции. Кривая XRPD анализа кристаллической формы (I-HS) пост-DVS-анализа (не показано) аналогична его паттерну пре-DVS XRPD, показанному на фиг. 1 или фиг. 29, демонстрирует, что при DVS никаких изменений кристаллической формы (I-HS) не происходило.

Фиг. 6 иллюстрирует инфракрасный (ИК) профиль спектроскопии кристаллической формы (I-HS) для соединения формулы I согласно одному воплощению. ИК-спектроскопия проводилась на спектрометре Bruker ALPHA P. Достаточный материал кристаллической формы (I-HS) помещался в центр пластины спектрометра с получением спектра пропускания с использованием разрешения 4 см^-1, время фонового сканирования 16 сканов, время сканирования образца 16 сканов, и сбор данных с 4000 см^-1 до 400 см^-1. Наблюдаемый ИК-спектр кристаллической формы (I-HS) представлен на фиг. 6.

Кристаллическая форма (I-HS) обладает рядом свойств, которые делают ее на удивление лучше аморфной формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (AM(HS)). Например, кристаллическая форма (I-HS) обладает свойствами, которые способствуют ее технологичности и производству коммерческого продукта. Как показано в примере 8, кристаллическая форма (I-HS) обладает лучшими свойствами сыпучести по сравнению с аморфным API (AM(HS)), о чем свидетельствует индекс Карра и отношение Хауснера. Например, кристаллическая форма (I-HS) демонстрирует значение показателя Карра более 20%. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) демонстрирует отношение Хауснера, составляющее менее 1,35 (например, значение от около 1,26 до около 1,34). Различия в свойствах потока могут затруднить разработку твердой пероральной лекарственной формы для аморфного API по сравнению с кристаллическим API.

Кристаллическая форма (I-HS) также продемонстрировала лучшую стабильность при ускоренном исследовании стабильности, проведенного в мешке LDPE при 40°С/75% относительной влажности в течение пяти недель. Хотя ни AM(HS), ни кристаллическая форма (I-HS) не проявили значительных изменений в уровнях химических примесей в течение исследования, исследование показало, что кристаллическая форма (I-HS) обладает стабильными физико-химическими свойствами. Аморфный API, с другой стороны, превращается в кристаллическую форму, по существу аналогичную кристаллической форме (I-HS) согласно XRPD, DSC, TGA, KF и поляризованной световой микроскопии. Кроме того, аморфный API заменяется агломерированным порошком со ухудшенными свойствами сыпучести в течение испытания на стабильность. Такие изменения физических свойств соединения, в том числе переход от аморфного порошка к кристаллическому материалу и/или агломерированному порошку со ухудшенной сыпучестью при хранении делают практически невозможным изготовление твердой пероральной лекарственной формы для использования пациентом на основе аморфного соединения. Свойства, наблюдаемые для кристаллической формы (I-HS), однако, согласуются со свойствами, желательными для коммерческого продукта, включая наличие как стабильной физической, так и химической структуры.

Кристаллическая форма (I-HS), как отмечалось ранее, является негигроскопичной. Используемый в данном документе термин «негигроскопичный» относится к соединению, демонстрирующему менее 2% прироста массы при 25°С и 80% относительной влажности через 24-48 часов (см., например, пример 10). Однако соединение AM(HS), как было установлено, разжижается при воздействии влажности. Учитывая эту тенденцию, использование соединения AM(HS) потребует значительных мер предосторожности при хранении и изготовлении для предотвращения такого изменения формы, тогда как кристаллическая форма (I-HS) не требует таких мер предосторожности при производстве API. Ожидается, что эта устойчивость к влажности также перенесется на любой твердый пероральный дозированный продукт, полученный с использованием кристаллической формы (I-HS).

Наконец, кристаллическая форма (I-HS) обеспечивает значительно улучшенный профиль примесей по сравнению с аморфным API. Возможность контролировать профиль примесей важна для безопасности пациентов, разработки повторяемого производственного процесса и соответствия требованиям регулирующих органов перед использованием на людях.

Представленные в данном документе соединения, включая (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид (формула I) и его фармацевтически приемлемые соли, например, гидросульфатная соль, а также новая кристаллическая форма гидросульфатной соли (кристаллическая форма (I-HS)), демонстрируют ингибирование протеинтирозинкиназ Trk-семейства, а соединение, гидросульфатная соль и его кристаллическая форма могут быть использованы для лечения боли, воспаления, злокачественной опухоли и некоторых инфекционных заболеваний.

Некоторые воплощения включают применение кристаллической формы (I-HS) для лечения расстройств и заболеваний, которые можно лечить путем ингибирования TrkA, TrkB и/или TrkC-киназ, таких как TrkA, TrkB и/или TrkC-опосредованное состояние, таких как одно или несколько состояний, описанных в данном документе, включая Trk-ассоциированную злокачественную опухоль. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) может быть также полезна при лечении боли, включая хроническую и острую боль. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) может быть полезна при лечении множественных типов боли, включая воспалительную боль, невропатическую боль, хирургическую боль и боль, связанную со злокачественной опухолью, хирургическим вмешательством и переломом костей. Кроме того, кристаллическая форма (I-HS) может быть применима для лечения воспаления, активных и хронических нейродегенеративных заболеваний и некоторых инфекционных заболеваний. Настоящее раскрытие дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим кристаллическую форму (I-HS). В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает кристаллическую форму (I-HS) и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.

Способность кристаллической формы (I-HS) действовать в качестве ингибиторов TrkA, TrkB и/или TrkC может быть продемонстрирована с помощью анализов, описанных в примерах A и B, как описано в патенте США № 8,513,263, выданном 20 августа 2013 г., который включен в данный документ ссылкой.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен способ лечения пациента с диагнозом злокачественная опухоль, ассоциированная с TRK, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, например в виде гидросульфатной соли (например, см. Пример 14А патента США № 853263). Trk-семейство рецепторов нейротрофинов, TrkA, TrkB и TrkC (кодируемых генами NTRK1, NTRK2 и NTRK3, соответственно) и их нейротрофиновые лиганды регулируют рост, дифференцировку и выживание нейронов. Нарушение регуляции в гене NTRK, белке Trk или их экспрессии или активности или уровне, такое как транслокация с участием киназного домена NTRK, мутация с участием лиганд-связывающего сайта TRK, амплификация гена NTRK, варианты сплайсинга мРНК Trk, и аутокринная/паракринная сигнализация Trk описаны в разнообразном числе типов опухолей и могут способствовать опухолегенезу. Недавно слияния NTRK1 были описаны в подгруппе онкологических больных с аденокарциномой легкого². Транслокации в NTRK1, NTRK2 и NTRK3, которые приводят к выработке конститутивно-активных химерных белков TrkA, TrkB и TrkC, являются онкогенными и распространены в широком спектре типов опухолей, включая аденокарциному легкого, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, глиобластому и другие.

В некоторых воплощениях нарушение регуляции в гене NTRK, белке Trk или их экспрессии или активности или уровне, включает сверхэкспрессию TrkA, TrkB или TrkC дикого типа (например, приводящую к аутокринной активации). В некоторых воплощениях нарушение регуляции в гене NTRK, белке Trk или в их экспрессии или активности или уровне включает сверхэкспрессию, активацию, амплификацию или мутацию в хромосомном сегменте, содержащем ген NTRK1, NTRK2 или NTKR3, или часть его. В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает одну или несколько транслокаций или инверсий хромосом, приводящих к слияниям гена NTRK1, NTRK2 или NTRK3, соответственно. В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня является результатом генетических транслокаций, в которых экспрессированный белок представляет собой химерный белок, содержащий остатки из белка не-TrkA-партнера и TrkA, белка не-TrkB-партнера и TrkB, или белка не-TrkС-партнера и TrkC, и включают минимум функционального киназного домена TrkA, TrkB или TrkC, соответственно.

В некоторых воплощениях химерный белок TrkA представляет собой один из химерных белков TrkA, представленных в таблице 10, где:

Таблица 10. Примерные химерные белки TrkA и злокачественные опухоли

Химерный Белок	не-TrkA химерный партнер	Неограничивающие примерные Trk-ассоциированные злокачественные опухоли и синонимы
TP53-TrkA^1,11	Опухолевый белок Р53	Меланома Spitzoid, опухоли Шпиц
LMNA-TrkA^1,12	Ламин A/C	Меланома Spitzoid, опухоли Шпиц, недифференцированная саркома, саркома мягких тканей взрослых (например, метастаз саркомы мягких тканей в легкое), фибросаркома мягких тканей
CD74-TrkA²	Инвариантная цепь MHC класса II	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) Аденокарцинома легкого
TFG-TrkA (TRK-T3)³	TRK-слитый ген	Папиллярная карцинома щитовидной железы (PTC), доброкачественная мезотелиома мягких тканей
TPM3-TrkA³	Тропомиозин 3	Рак легкого, папиллярная карцинома щитовидной железы (PTC), острый миелоидный лейкоз (AML), саркома, детские глиомы, колоректальный рак (CRC), шванома мягких тканей
NFASC-TrkA⁴	нейрофасцин	мультиформная глиобластома (GBM); глиобластома
BCAN-TrkA⁴	Бревикан	мультиформная глиобластома (GBM)
MPRIP-TrkA⁵	миозин фосфатаза Rho, белок, взаимодействующий с Rho, или белок, взаимодействующий с Rho, 3	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарцинома легкого
TPR-TrkA (TRK-T1 или TRK-T2)³	транслоцированный промотерный участок, белок ядерной корзины	Папиллярная карцинома щитовидной железы (PTC), колоректальный рак (CRC)^A, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
RFWD2-TrkA⁶	Ring Finger и WD Repeat Domain 2	Крупноклеточный нейроэндрокальный рак (LCNEC); NSCLC
IRF2BP2-TrkA⁷	белок 2, связывающий фактор 2 контроля интерферона	Рак щитовидной железы; карцинома щитовидной железы
SQSTM1-TrkA⁷	секвестосома 1	Рак щитовидной железы (например, папиллярный рак щитовидной железы), карцинома щитовидной железы, фибросаркома мягких тканей
SSBP2-TrkA⁷	Белок 2, связывающий одноцепочечную ДНК	Рак щитовидной железы (например, папиллярный рак щитовидной железы); Карцинома щитовидной железы
RABGAP1L-TrkA⁸	подобный белку 1, активирующему RAB ГТФазу	Внутрипеченочная холангиарцинома (ICC)
C18ORF8-TrkA⁹	Хромосома 18, открытая рамка считывания 8	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
RNF213-TrkA⁹	белок 213 с Ring Finger	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
TBC1D22A-TrkA⁹	Семейство домена TBC1, представитель 22A	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
C20ORF112-TrkA⁹	Хромосома 20, открытая рамка считывания 112	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
DNER-TrkA⁹	Delta/Notch-подобный, EGF-повтор содержащий	немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)
ARHGEF2-TrkA¹³	Фактор 2 обмена нуклеотида гуанина в Rho	глиобластома
CHTOP-TrkA¹³	Хроматиновая мишень PRMT1	глиобластома
PPL-TrkA ¹³	периплакин	Рак щитовидной железы
PLEKHA6-TrkA	Семейство А содержащих домен гомологии плекстрина, представитель 6
PEAR1-TrkA	эндотелиальный рецептор агрегирования тромбоцитов 1
MRPL24-TrkA	39S Рибосомальный белок L24, митохондриальный
MDM4-TrkA	Человеческий гомолог Mouse Double Minute 4
LRRC71-TrkA	содержащий лейцин-богатые повторы, 71
GRIPAP1-TrkA	GRIP1 ассоциированный протеин 1
EPS15-TrkA	Субстрат 15 рецептора эпидермального фактора роста
DYNC2H1-TrkA^B	Динеин, Цитоплазматический 2, Тяжелая цепь 1	саркома
CEL-TrkA	липаза эфира карбоновой кислоты	Образец аденокарциномы поджелудочной железы ^D
EPHB2-TrkA^B	EPH-рецептор B2	глиома низкой степени злокачественности
TGF-TrkA^C	Трансформирующий фактор роста	Папиллярный рак щитовидной железы

^A et al., Cancer Lett. 365(1):107-111, 2015.

^B Публикация патентной заявки США №2015/0315657.

^C публикация патентной заявки США №2015/0283132.

^D Egren et al., Cancer Res. 75(15 Supplement): 4793, 2015.

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает одну или более делеций, вставок или точечных мутаций в белке TrkA. В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает делецию одного или нескольких остатков из белка TrkA, что приводит к конститутивной активности домена TrkA-киназы. В некоторых воплощениях делеция включает делецию аминокислот 303-377 в изоформе 2 TrkA.

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает, по меньшей мере, одну точечную мутацию в гене NTRK1, которая приводит к продуцированию белка TrkA, который имеет одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком TrkA дикого типа (см., например, точечные мутации, перечисленные в таблице 11.

Таблица 11. Активирующие точечные мутации TrkA

Точечная мутация	Обоснование
R33W¹
A336E	Около сайта связывания NGF
A337T	Около сайта связывания NGF
R324Q или R324W	Около сайта связывания NGF
V420M	Близко к Мембране
R444Q или R444W	Близко к Мембране
G517R или G517V	Р-петля
K538A	Активация
R649W или R649L	Аргинин может стабилизировать автоингибирующую конформацию
R682S	Активационная петля
V683G	Активационная петля
R702C	Экспонированный, может образовывать дисульфид-связанный димер "face-to-face"
C1879T²

¹ Zhang et al., Blood 124(21):1682, 2014. Mutation found in T-cell prolymphocytic leukemia.

² Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112(40):12492-12497, 2015. Mutation found in colorectal cancer.

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает сплайсинговое изменение в мРНК TrkA, которое приводит к экспрессируемому белку, который является альтернативно сплайсированным вариантом TrkA, имеющим, по меньшей мере, один удаленный остаток (по сравнению с белком TrkA дикого типа), что приводит к конститутивной активности домена TrkA-киназы. В некоторых воплощениях альтернативно сплайсированная форма TrkA с конститутивной активностью имеет делеции экзонов 8, 9 и 11, приводящие к отсутствию в экспрессированном белке остатков 192-284 и 393-398 относительно TrkA изоформы 2, имеет делецию экзона 10 в TrkA, или имеет делецию в гене NTRK1, который кодирует белок TrkA с делецией 75 аминокислот в трансмембранном домене (Reuther et al., Mol. Cell Biol. 20:8655-8666, 2000).

Злокачественные опухоли, идентифицированные как имеющие нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (см. источники, приведенные в настоящем документе, а также на сайтах www.cancer.gov и www.nccn.org), включают:

(A) Злокачественные опухоли, у которых нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или их уровня включает одну или несколько транслокаций или инверсий хромосом, приводящих к химерным белкам TrkA, например, включающим:

Злокачественная опухоль	Стандарт лечения
Немелкоклеточный рак легкого ²	Лучевая терапия (например, терапия с радиоактивным йодом, облучение внешним лучом или терапия радием 223), химиотерапевтические средства в качестве отдельных агентов (например, афатиниб дималеат, бевацизумаб, карбоплатин, цетуксимаб, цисплатин, кризотиниб, эрлотиниб, гефитиниб, гемцитабин, метотрексат, паклитаксел или пеметрексед) или комбинации (например, карбоплатин-паклитаксел, гемцитабин-паклитаксел или химиолучевое лечение)
Папиллярная карцинома щитовидной железы ¹⁴	Лучевая терапия (например, терапия с радиоактивным йодом или облучение внешним лучом) и химиотерапевтические средства (например, сорафениб, сунитиниб или пазопаниб)
Мультиформная глиобластома ¹⁵	Химиотерапевтические средства (например, бевацизумаб, эверолимус, ломустин или темозоломид)
Колоректальная карцинома ¹⁶	Химиотерапевтические средства в качестве отдельных агентов (например, афлиберцепт, бевацизумаб, капецитабин, цетуксимаб, фторурацил, иринотекан, лейковорин, оксалиплатин, панитумумаб или регорафениб) или комбинации (например, фолфокс, фолфири, капокс, фолфири-бевацизумаб, фолфири-цетуксимаб или ксилокс)
Меланома ¹²	Химиотерапевтические средства (например, альдеслейкин, дабрафениб, дакарбазин, интерферон альфа-2b, ипилимумаб, пегинтерферон альфа-2b, траметиниб или вемурафениб)

(B) Злокачественные опухоли, у которых нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включают одну или более делеций, вставок или мутаций в белке TrkA, например, включающим:

Злокачественная опухоль	Стандарт лечения
Острый миелоидный лейкоз ^{17, 18}	Химиотерапевтические средства в виде отдельных агентов (например, триоксид мышьяка, циклофосфамид, цитарабин, даунорубицин, доксорубицин или винкристин) или комбинации (например, ADE)
Большая клеточная нейроэндокринная карцинома ¹⁹	Лучевая терапия (например, терапия с радиоактивным йодом, облучение внешним лучом или терапия радием 223) и/или химиотерапевтические средства (например, цисплатин, карбоплатин или этопозид)
Нейробластома ²⁰	Химиотерапевтические средства (например, циклофосфамид, доксорубицин или винкристин)

(C) Злокачественные опухоли, в которых нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает сверхэкспрессию TrkA дикого типа (аутокринная активация), например, включающим:

Злокачественная опухоль	Стандарт лечения
Карцинома предстательной железы ^{21, 22}	Лучевая терапия (например, терапия радием 223) или химиотерапия (например, абиратерон, кабазитаксел, дегареликс, деносумаб, доцетаксел, энзалутамид, лейпролид, преднизон или сипулеуцел-Т)
Нейробластома ²³	Химиотерапевтические средства (например, циклофосфамид, доксорубицин или винкристин)
Панкреатическая карцинома ²⁴	Химиотерапевтические средства в виде отдельных агентов (например, эрлотиниб, фторурацил, гемцитабин или митомицин С) или их комбинации (например, гемцитабин-оксалиплатин)
Меланома ²⁵	Химиотерапевтические средства (например, альдеслейкин, дабрафениб, дакарбазин, интерферон альфа-2b, ипилимумаб, пегинтерферон альфа-2b, траметиниб или вемурафениб)
Плоскоклеточная карцинома головы и шеи ²⁶	Лучевая терапия и/или химиотерапия (например, блеомицин, цетуксимаб, цисплатин, доцетаксел, фторурацил или метотрексат)
Рак желудка ²⁷	Химиотерапевтические средства (например, доцетаксел, доксорубицин, фторурацил, митомицин C или трастузумаб)

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает транслокацию, которая приводит к экспрессии химерного белка TrkB, например, одного из химерных белков TrkB, показанных в таблице 12.

Таблица 12. Примерные химерные белки TrkB и злокачественные опухоли

Химерный Белок	не-TrkB Химерный Партнер	Неограничивающие примеры Trk-ассоциированных злокачественных опухолей и синонимы
NACC2-TrkB¹⁰	представитель 2 семейства NACC, содержащий домен BEN и BTB (POZ)	Пилоцитарная астроцитома
QKI-TrkB¹⁰	QKI, содержащий домен KH, РНК-связывающий	Пилоцитарная астроцитома
AFAP1-TrkB⁷	белок 1, ассоциированный с актиновым филаментом	глиома низкой степени злокачественности
PAN3-TrkB⁷	PAN3 Поли (A) специфическая субъединица рибонуклеазы	Плоскоклеточная карцинома головы и шеи
SQSTM1-TrkB⁷	Секвестосома 1	глиома низкой степени злокачественности
TRIM24-TrkB⁷	содержащий трехкомпонентный мотив, 24	Аденокарцинома легкого
VCL-TrkB¹¹	винкулин	Педиатрические глиомы
AGBL4-TrkB¹¹	ATP/GTP связывающий белок-подобный 4	Педиатрические глиомы
DAB2IP-TrkB	Белок, взаимодействующий с гомологом 2 Disabled

В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает транслокацию, которая приводит к экспрессии химерного белка TrkC, например, одного из химерных белков TrkC, показанных в таблице 13.

Таблица 13. Примерные химерные белки TrkC и злокачественные опухоли

Химерный Белок	не-TrkB химерный партнер	Неограничивающие примеры Trk-ассоциированных злокачественных опухолей и синонимы
ETV6-TrkC¹¹	Вариант ETS 6	Рак слюнной железы, секреторная карцинома молочной железы, острый миелоидный лейкоз, фибросаркома, нефрома, меланома, рак толстой кишки (CRC), рак молочной железы, педиатрические глиомы, рак щитовидной железы (например, папиллярный рак щитовидной железы), инфантильная фибросаркома, мягкая тканевая гемангиома, гастроинтестинальная стромальная опухоль (GIST) (например, c-kit-negative GIST), карцинома молочной железы (например, аналога секреторной карциномы молочной железы)
BTBD1-TrkC¹¹	Содержащий домен BTB (POZ), 1	Педиатрические глиомы
LYN-TrkC⁷	V-Yes-1 вирусный гомолог онкогена саркома Ямагучи (также известный как Lck/Yes-связанная новая протеинтирозинкиназа)	Плоскоклеточная карцинома головы и шеи
RBPMS-TrkC⁷	РНК связывающий белок с множественным сплайсингом	Рак щитовидной железы (например, папиллярный рак щитовидной железы)
EML4-TrkC^B	подобный белку, ассоцированному с микротрубочками иглокожих, 4	фибросаркома
HOMER2-TrkC	гомолог белка Homer, 2	Саркома мягких тканей
TFG-TrkC	TRK-химерный ген	Одиночная фиброзная опухоль мягкой ткани
FAT1-TrkC		Цервикальная плоскоклеточная карцинома ^C
TEL-TrkC		Врожденная фибросаркома, острый миелолейкоз

^B Tannenbaum et al., Cold Spring Harb. Mol. Case Stud. 1:a000471, 2015.

^C публикация патентной заявки США № 2015/0315657.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен способ лечения пациента с диагнозом Trk-ассоциированная злокачественная опухоль, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, например, в виде гидросульфатной соли (например, см. Пример 14А в патенте US 853263). Например, Trk-ассоциированная злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, включающей: немелкоклеточный рак легкого, папиллярную карциному щитовидной железы, мультиформную глиобластому, острый миелоидный лейкоз, колоректальную карциному, крупноклеточную нейроэндокринную карциному, рак предстательной железы, нейробластому, карциному поджелудочной железы, меланому, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак желудка, опухоль Шпиц, рак щитовидной железы сосочковой железы, рак толстой кишки, острый миелоидный лейкоз, саркому, педиатрическую глиому, внутрипеченочную холангикарциному, пилоцитарную астроцитому, глиому низкой степени злокачественности, аденокарциному легкого, рак слюнных желез, секреторный рак молочной железы, фибросаркому, нефрому и рак молочной железы.

В некоторых воплощениях Trk-ассоциированная злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей: неограничивающие примеры TRK-ассоциированных злокачественных опухолей, включающие: меланому Spitzoid, опухоли Шпиц (например, метастатические опухоли Шпиц), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), карциному щитовидной железы (например, папиллярная карцинома щитовидной железы (РТС)), острый миелоидный лейкоз (AML), саркому (например, недифференцированная саркома или саркома мягких тканей взрослых), педиатрические глиомы, колоректальный рак (CRC), мультиформную глиобластому (GBM), нейроэндокринный рак (LCNEC), рак щитовидной железы, внутрипеченочную холангиарциному (ICC), пилоцитарную астроцитому, глиому низкой степени злокачественности, плоскоклеточную карциному головы и шеи, аденокарциному (например, аденокарциному легкого), рак слюнных желез, секреторную карциному молочной железы, рак молочной железы, острый миелоидный лейкоз, фибросаркому, нефрому, меланому, бронхогенную карциному, В-клеточный рак, рак бронхов, рак полости рта или глотки, злокачественные опухоли гематологических тканей, рак шейки матки, рак желудка, рак почки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак слюнной железы, рак тонкой кишки или придатка, рак яичка, рак мочевого пузыря, рак матки или эндометрия, воспалительные миофибробластические опухоли, гастроинтестинальную стромальную опухоль, неходжкинскую лимфому, нейробластому, мелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак, рак пищевода-желудка, рак кожи, неоплазию (например, меланоцистозное новообразование), невусы Шпиц, астроцитому, медуллобластому, глиому, большие клеточные нейроэндокринные опухоли, рак кости и карциному прямой кишки.

В некоторых воплощениях предлагаемые соединения полезны для лечения Trk-ассоциированных злокачественных опухолей у педиатрических пациентов. Например, соединения, представленные в данном документе, могут быть использованы для лечения детской саркомы, нейробластомы, врожденной мезобластической нефромы, глиомы, глиомы низкой степени злокачественности и понтинной глиомы.

В некоторых воплощениях предлагаемые в данном документе соединения полезны для лечения Trk-ассоциированной злокачественной опухоли в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами или терапиями, которые работают по тому же или другому механизму действия.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбирают из группы: терапевтических агентов, нацеленных на рецепторную тирозинкиназу, включая кабозаниниб, кризотиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, пазопаниб, пертузумаб, регорафениб, сунитиниб и трастузумаб.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбирают из ингибиторов пути передачи сигнала, включая, например, ингибиторы пути Ras-Raf-MEK-ERK (например, сорафениб, траметиниб или вемурафениб), ингибиторы пути PI3K-Akt-mTOR-S6K (например, эверолимус, рапамицин, перифозин или темсиролимус) и модуляторы пути апоптоза (например, обатаклакс).

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбран из группы: цитотоксических химиотерапевтических средств, включая, например, триоксид мышьяка, блеомицин, кабазитаксел, капецитабин, карбоплатин, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, этопозид, фторурацил, гемцитабин, иринотекан, ломустин, метотрексат, митомицин С, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, темозоломид и винкристин.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбран(ы) из группы терапий, нацеленных на ангиогенез, включая, например, афлиберцепт и бевацизумаб.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбран(ы) из группы иммуноцелевых агентов, например, включая альдеслейкин, ипилимумаб, ламбролизумаб, ниволумаб и сипулеуцел-Т.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) выбран(ы) из агентов, активных в отношении нисходящего Trk-пути, включая, например, NGF-нацеленные биофармацевтические средства, такие как NGF-антитела и ингибиторы пан-Trk.

В некоторых воплощениях дополнительным терапевтическим агентом или терапией является лучевая терапия, включая, например, терапию с радиоактивным йодом, облучение внешним лучом и терапию радием 223.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент (агенты) включает любые из перечисленных выше терапий или терапевтических агентов, которые являются стандартами лечения при онкологических заболеваниях, в случае, если злокачественная опухоль имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня.

Способы обнаружения нарушению регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включают, например, обнаружение транслокаций гена NTRK, например, с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (например, как описано в Международных заявках PCT/US 2013/061211 PCT/US 2013/057495, которые включены в данный документ ссылкой).

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен способ лечения злокачественной опухоли (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk) у пациента, включающий введение указанному пациенту кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14А в патенте US 853263) в комбинации, по меньшей мере, с одной дополнительной терапией или терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна дополнительная терапия или терапевтический агент выбраны из лучевой терапии (например, терапия радиоактивным йодом, облучение внешним лучом или терапия радием 223) цитотоксических химиотерапевтических агентов (например, триоксид мышьяка, блеомицин, кабазитаксел, капецитабин, карбоплатин, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, этопозид, фторурацил, гемцитабин, иринотеканны, ломустин, метотрексат, митомицин С, оксалиплатинами, паклитаксел, пеметрексед, темозоломид или винкристины), терапевтических агентов, нацеленных на тирозинкиназы (например, афатиниб, кабозантиниб, цетуксимаб, кризотиниб, дабрафениб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, пазопаниб, панитумумаб, пертузумаб, регорафениб, сунитиниб, или трастузумаб), модуляторов апоптоза и ингибиторов сигнальной трансдукции (например, эверолимус, перифосин, рапамицин, сорафениб, темсиролимус, траметиниб или вемурафениб), иммуноцелевых терапий (например, Алдеслейкин, интерферон альфа-2b, лпилимумаб, ламбролизумаб, ниволумаб, преднизон, или сипулейцел-Т) и терапий, нацеленных на ангиогенез (например, афлиберцепт или бевацизумаб), где количество соединения, предлагаемого в данном документе, или фармацевтически приемлемой соли, в сочетании с дополнительной терапией или терапевтическим агентом, эффективно при лечении указанной злокачественной опухоли.

В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент представляет собой другой ингибитор Trk. Неограничивающие примеры других ингибиторов Trk включают (R)-2-фенилпирролидинзамещенный идазопиридазин, AZD6918, GNF-4256, GTx-186, GNF-5837, AZ623, AG-879, альтиратиниб, CT327, AR-772, AR- 523, AR-786, AR-256, AR-618, AZ-23, AZD7451, кабозаниниб, CEP-701, CEP-751, PHA-739358, довитиниб, энтретиниб, PLX7486, 6976, GW441756, MGCD516, ONO-5390556, PHA-848125AC, регорафениб, сорафениб, сунитиниб, TSR-011, VM-902A, K252a, 4-аминопиразолилпиримидин и замещенное пиразоло[1,5-a]пиримидиновое соединение.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дополнительные терапевтические агенты включают: терапевтические агенты, нацеленные на рецепторные тирозинкиназы, такие как афатиниб, кабозантиниб, цетуксимаб, кризотиниб, дабрафениб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нилотиниб, пазопаниб, панитумумаб, пертузумаб, сунитиниб, трастузумаб, AG 879, AZ-23, AZ623, 6976, GNF-5837, GTx-186, GW 441756, MGCD516, RPI-1, RXDX101 и TSR-011; терапевтические агенты, нацеленные на RET, такие как алектиниб, апатиниб, кабозантиниб, довитиниб, ленватиниб, мотесаниб, нинтеданиб, понатиниб, регорафениб, сунитиниб, сорафениб, ваталаниб, вандетаниб, AUY-922, BLU6864, DCC-2157, MGCD516, невирапин-AST487, PZ-1, RXDX105, SPP86, TG101209 и XL-184; сигнальные ингибиторы трансдукции, такие как ингибиторы Ras-Raf-MEK-ERK пути (например, бинитметиниб, селуметиниб, енкорафиниб, сорафениб, траметиниб и вемурафениб), ингибиторы пути PI3K-Akt-MTOR-S6K (например, эверолимус, рапамицин, перифосин, темсиролимус), другие ингибиторы киназ, такие как барицитиниб, бригатиниб, капматиниб, данусертиб, ибрутиниб, милцицлиб, милциклиб, кверцетин, регорафениб, руксолитиниб, семаксаниб, AP32788, BLU285, BLU554, INCB39110, INCB40093, INCB50465, INCB52793, INCB54828, MGCD265, НМС-088, NMS-1286937, PF477736, PLX3397, PLX7486, PLX8394, PLX9486, PRN1008, PRN1371, RXDX103, RXDX106, RXDX108 и TG101209; ингибиторы чекпоинта, такие как лпилимумаб, тремелимумаб, ниволумаб, пидилизумаб, MPDL3208A, MEDI4736, MSB0010718C, BMS-936559, BMS-956559, BMS-935559 (MDX-1105), АМР-224, и пембролизумаб; модуляторы пути апоптоза (например, обатаклакс); цитотоксические химиотерапевтические агенты, такие как триоксид мышьяка, блеомицин, кабазитаксел, капецитабин, карбоплатин, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, этопозид, фторурацил, гемцитабин, иринотекан, ломустин, метотрексат, митомицин C, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрекседом, темозоломид и винкристин; направленные на ангиогенез терапии, такие как афлиберцепт и бевацизумаб; иммуноцелевые агенты, такие как альдеслейкин, интерферон альфа-2b, ипиломумаб, ламбролизумаб, ниволумаб, преднизон, сипулеуцел-Т; Лучевая терапия, такая как терапия с радиоактивным йодом, облучение внешним лучом и терапия радием 223.

Другие дополнительные терапевтические агенты включают ингибиторы RET, такие как описанные, например, в патентах US 8,299,057; 8399442; 8937071; 9006256; и 9036063; публикации US 2014/0121239; 2011/0053934; 2011/0301157; 2010/0324065; 2009/0227556; 2009/0130229; 2009/0099167; 2005/0209195; международных публикациях WO 2014/184069; WO 2014/072220; WO 2012/053606; WO 2009/017838; WO 2008/031551; WO 2007/136103; WO 2007/087245; WO 2007/057399; WO 2005/051366; и WO 2005/044835; And J. Med. Chem. 2012, 55 (10), 4872-4876.

Эти дополнительные терапевтические агенты могут быть введены с одним или несколькими соединениями, представленными в данном документе, как часть тех же или отдельных дозированных форм, с использованием тех же самых или разных путей введения и в тех же самых или разных графиках введения согласно стандартной фармацевтической практике, известной специалисту в данной области техники.

Также в данном документе предлагается (i) фармацевтическая комбинация для лечения злокачественной опухоли (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk) у пациента, нуждающегося в этом, который включает (а) кристаллическую форму (I-HS) или соединение формулы I или соль, такую как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14А в патенте US 8,513,263), (b) дополнительный терапевтический агент и (с) необязательно, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения опухолевого заболевания, где количества соединения или его соли и дополнительного терапевтического агента вместе эффективны при лечении указанной злокачественной опухоли; (ii) фармацевтическая композиция, содержащая такую комбинацию; (iii) применение такой комбинации для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk); и (iv) коммерческая упаковка или продукт, включающий такую комбинацию, как комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения; и к способу лечения злокачественной опухоли (например, Trk-ассоциированной злокачественной опухоли) у пациента, нуждающегося в этом.

Также предлагаются способы лечения субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль (например, субъект, который был идентифицирован или диагностирован как имеющий Trk-ассоциированную злокачественную опухоль с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренным FDA, набора для идентификации нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня у субъекта или образца биопсии из субъекта) (например, любой из Trk-ассоциированных злокачественных опухолей, описанных в настоящем документе, или которые включают введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8513263). Также предлагается кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для применения при лечении Trk-ассоциированного рака у субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющего злокачественная опухоль, ассоциированную с Trk (например, субъект, который был идентифицирован или диагностирован как имеющий злокачественную опухоль, связанную с Trk, с использованием одобренного регулирующим агентством, например, одобренного FDA, набора для идентификации нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или экспрессии или активности или уровня этого же у субъекта или образца биопсии из субъекта) (например, любой из ассоциированных с Trk злокачественных опухолей, описанных в данном документе или известных в данной области). Также предусматривается применение кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для изготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, у субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль (например, субъект, который был идентифицирован или диагностирован как имеющий Trk-ассоциированную злокачественная опухоль с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора для идентификации нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня у субъекта или в образце биопсии из субъекта) (например, в любой из описанных Trk-ассоциированных злокачественных опухолей, описанных в данном документе или известных в данной области техники).

Также предлагаются способы лечения субъекта (например, субъекта, подозреваемого в наличии злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, субъекта, имеющего один или несколько симптомов Trk-ассоциированной злокачественной опухоли, или субъекта, имеющего повышенный риск развития Trk-ассоциированной злокачественной опухоли), которые включают проведение анализа (например, анализа, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или анализ FISH с зондом «Break Apart») (например, с использованием одобренного регулирующим агентством, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном из субъекта, для определения имеется ли субъекта нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, и введение (например, специфического или избирательного введения) терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 853263) субъекту, определенному как имеющему нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровней. Дополнительные анализы, неограничивающие анализы, которые могут быть использованы в этих способах, описаны в данном документе. Дополнительные анализы также известны в данной области. Также предусматривается применение кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для использования при лечении Trk-ассоциированной злокачественной опухоли у субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющий Trk-ассоциированную злокачественную опухоль на стадии проведения анализа (например, анализ in vitro) (например, анализа, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или FISH-анализ с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим агентством, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном у субъекта для того, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня, где наличие нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня указывает на то, что у субъекта имеется Trk-ассоциированная злокачественная опухоль. Также предусматривается применение кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для изготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, у субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль, на стадии выполнения анализа (например, анализа in vitro) (например, анализа, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или анализ FISH с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим агентством, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном от субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, когда наличие нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня указывает на то, что у субъекта имеется Trk-ассоциированная злокачественная опухоль. Некоторые воплощения любого из способов или применений, описанных в данном документе, дополнительно включают запись в истории болезни субъекта (например, на машиночитаемом носителе), что субъекту, определенному как имеющему нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, посредством осуществления анализа, необходимо ввести кристаллическую форму (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8513263).

В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, субъект был идентифицирован или диагностирован как имеющий злокачественную опухоль с нарушением регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (например, как определено с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, анализа или набора). В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, у субъекта имеется опухоль, которая является положительной по нарушению регуляции гена NTRK, белка Trk или экспрессии или активности, или уровня их (например, как определено с использованием одобренного регулирующим органом анализа или набора). В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, субъектом может быть субъект с опухолью (опухолями), которая является положительной по нарушению регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии или активности, или уровня (например, идентифицированной как положительная с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, анализа или набора). В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, субъект может быть субъектом, опухоли которого имеют нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня (например, где опухоль идентифицирована как таковая с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора или анализа). В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, субъект подозревается в наличии злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk. В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, у субъекта имеется история болезни, указывающая, что у субъекта имеется опухоль, которая имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (и необязательно история болезни указывает, что субъект должен лечиться любой из композиций, представленных в настоящем документе).

Также предлагаются способы лечения субъекта, которые включают введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8, 513, 263) субъекту, имеющему историю болезни, которая указывает, что у субъекта имеется нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня. Также предусматривается применение кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для изготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, у субъекта, имеющего историю болезни, которая указывает, что у субъекта имеется нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня. Также предусматривается применение кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 853263 для изготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, у субъекта, имеющего историю болезни, которая указывает на то, что у субъекта наблюдается нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня. Некоторые воплощения этих способов и применений могут дополнительно включать стадию проведения анализа (например, анализ in vitro) (например, анализ, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или FISH-анализ с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном у субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня, и записи информации в историю болезни субъекта (например, машиночитаемый носитель), что у субъекта было обнаружено нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня.

Также предлагаются способы (например, in vitro) выбора лечения субъекта, которые включают выбор лечения, включающего введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, например в виде соли гидросульфата (например, см. Пример 14A в патенте US 853263) субъекту, идентифицированному или диагностированному как имеющему злокачественную опухоль, ассоциированную с Trk, (например, субъект, который был идентифицирован или диагностирован как имеющий Trk-ассоциированную злокачественную опухоль с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора для идентификации нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня у субъекта или в образце биопсии у субъекта) (например, любой из Trk-ассоциированных злокачественных опухолей, описанных в данном документе или известных в данной области). Некоторые воплощения могут дополнительно включать введение выбранного лечения субъекту, идентифицированному или диагностированному как имеющему Trk-ассоциированную злокачественную опухоль. Некоторые воплощения могут дополнительно включать стадию проведения анализа (например, анализа in vitro) (например, анализа, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или FISH-анализ с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном от субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, а также идентификации или диагностики субъекта, который, как установлено, имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии или активности или уровня, а также наличия Trk-ассоциированной злокачественной опухоли.

Также предлагаются способы выбора лечения субъекта, которые включают введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263), где способы включают стадию проведения анализа (например, анализа in vitro) (например, анализ, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или FISH-анализ с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном от субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, а также идентификации или диагностирования субъекта, который, как установлено, имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, а также наличия Trk-ассоциированной злокачественной опухоли и выбора терапевтического лечения, включая введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) для субъекта, идентифицированного или диагностированного как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль. Некоторые воплощения дополнительно включают введение выбранного лечения субъекту, идентифицированному или диагностированному как имеющему Trk-ассоциированную злокачественную опухоль.

Также предлагаются способы выбора субъекта для лечения, включающего введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 853263), которые включают выбор, идентификацию или диагностику субъекта, имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль, и отбор субъекта для лечения, включающего введение терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14А в патенте US 853263). В некоторых воплощениях идентификация или диагностирование субъекта как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль может включать стадию выполнения анализа (например, анализа in vitro) (например, анализа, который использует секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию или FISH-анализ с зондом «break apart») (например, с использованием одобренного регулирующим агентством, например, одобренного FDA, набора) на образце, полученном у субъекта, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или его экспрессии или активности, или уровня, и идентифицировать или диагностировать у субъекта, который, как установлено, имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль. В некоторых воплощениях выбор лечения может быть использован как часть клинического исследования, которое включает введение различных типов лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с Alk.

В некоторых воплощениях любого из способов или применений, описанных в данном документе, используемый анализ определяет, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, используя образец (например, биологический образец или образец биопсии (например, образец биопсии, залитый парафином) от субъекта (например, субъекта, подозреваемого в наличии злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, субъекта, имеющего один или несколько симптомов злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, и/или субъекта, который имеет повышенный риск развития злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk), может включать, например, секвенирование следующего поколения, иммуногистохимию, флуоресцентную микроскопию, FISH-анализ с зондом «break apart», Саузерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, FACS-анализ, Нозерн-блоттинг и амплификацию на основе ПЦР (например, ОТ-ПЦР). Как хорошо известно в данной области, анализы обычно выполняют, например, с использованием, по меньшей мере, одного меченого зонда нуклеиновой кислоты или, по меньшей мере, одного меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Анализы могут использовать другие способы обнаружения, известные в данной области техники для детектирования нарушению регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии или активности или уровней (см., например, ссылки, приведенные в данном документе).

В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соль, такая как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263), применимы для лечения хронической и острой боли, включая боль, связанную со злокачественной опухолью, хирургическим вмешательством и переломом костей. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) могут быть полезны при лечении множественных типов боли, включая воспалительную боль, невропатическая боль и боль, связанную со злокачественную опухоль, хирургическим вмешательством и переломом костей. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 853263) также применимы для лечения злокачественных опухолей, включая нейробластому, рак яичников, поджелудочной железы и колоректальный рак. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) также применимы для лечения воспаления и некоторых инфекционных заболеваний. Кроме того, кристаллическую форму (I-HS) или соединение формулы I или его соль, такую как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263), также можно использовать для лечения интерстициального цистита (IC), болезненного синдрома мочевого пузыря (PBS), недержание мочи, астмы, анорексии, атопического дерматита и псориаза. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) также могут быть использованы для лечения демиелинизации и дисмиелинизации путем стимуляции миелинизации, выживания нейронов и дифференцировки олигодендроцитов посредством блокирования взаимодействия Sp35-TrkA. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) могут быть полезны при лечении множественных типов боли, включая воспалительные боль, невропатическая боль, хирургическая боль и боль, связанная со злокачественной опухолью. Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) могут быть полезны при лечении заболеваний, связанных с костями (например, как заболевания, включающие резорбцию кости). Примерами болезней, связанных с костями, являются метастатическая болезнь кости, вызванная лечением потеря костной массы, остеопороз, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Педжета и периодонтальная болезнь. Остеопороз может быть связан с (1) менопаузой у женщин, (2) старением у мужчин или женщин, (3) субоптимальным ростом костей в детском и подростковом возрасте, что приводит к неспособности достичь пиковой массы кости и/или (4) потерей костной ткани, вторичной по отношению к другим болезненным состояниям, расстройствам пищевого поведения, лекарствам и/или медицинским процедурам. Другие остеолитические заболевания, которые можно лечить в соответствии со способами, представленными в данном документе, являются более локализованными. Конкретным примером является метастатический опухоль-индуцированный остеолиз. В этом состоянии рак кости или метастазы в кости индуцируют локализованный остеолиз, который вызывает боль, слабость кости и переломы. Такой локализованный остеолиз также позволяет опухолям расти больше, создавая больше пространства для них в кости и высвобождая факторы роста из костного матрикса. В настоящее время известно, что злокачественные опухоли, вызывающие индуцированный опухолью остеолиз, включают гематологические злокачественные опухоли (например, миелому и лимфому) и солидные опухоли (например, молочной железы, предстательной железы, легкого, почки и щитовидной железы), лечение всех из которых предусматривает настоящее изобретение. Используемый в данном документе термин «лечение» включает профилактику, а также лечение существующего состояния.

Соответственно, в данном документе также предлагается способ лечения заболеваний или медицинских состояний у нуждающегося в этом субъекта, при котором указанное заболевание или состояние поддается лечению с помощью ингибитора TrkA и/или TrkB (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk), включающее введение (I-HS) или соединения формулы I или его соли, такой как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патент US 8532663 в количестве, эффективном для лечения или профилактики указанного расстройства. В конкретном воплощении настоящего изобретения предлагается способ лечения боли, злокачественной опухоли, воспаления, нейродегенеративного заболевания или инфекции Trypanosoma cruzi у млекопитающего, который включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулу I или ее соль, такую как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14А в патенте US 853263). В другом воплощении настоящего изобретения предлагается способ лечения остеолитического заболевания у млекопитающего, включающий введение указанному субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы (I-HS) или соединения формулы I или его соли, например в виде гидросульфатной соли (например, см. Пример 14А в патенте US 853263).

Кристаллическая форма (I-HS) или соединение формулы I или его соли, такие как гидросульфатная соль (например, см. Пример 14A в патенте US 8,513,263) можно использовать в сочетании с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, которые работают по тому же или другому механизму действия. Такое совместное лечение может быть достигнуто путем одновременного, последовательного или раздельного введения отдельных компонентов лечения. Примеры включают противовоспалительные соединения, стероиды (например, дексаметазон, кортизон и флутиказон), анальгетики, такие как NSAID (например, аспирин, ибупрофен, индометацин и кетопрофен), и опиоиды (такие как морфин) и химиотерапевтические агенты.

В области медицинской онкологии обычной практикой является использование комбинации различных форм лечения для лечения каждого пациента с онкологическими заболеваниями. В медицинской онкологии другим компонентом(ами) такого совместного лечения в дополнение к композициям, представленным в настоящем документе, могут быть, например, хирургия, лучевая терапия, химиотерапия, ингибиторы сигнальной трансдукции и/или моноклональные антитела.

Соответственно, кристаллическую форму (I-HS) можно вводить в комбинации с одним или несколькими агентами, выбранными из митотических ингибиторов, алкилирующих агентов, антиметаболитов, антисмысловой ДНК или РНК, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов фактора роста, ингибиторов сигнальной трансдукции, ингибиторов клеточного цикла, ингибиторов ферментов, модуляторов ретиноидных рецепторов, ингибиторов протеасомы, ингибиторов топоизомеразы, модификаторов биологического ответа, антигормонов, ингибиторов ангиогенеза, цитостатиков, антигирогенов, таргетных антител, ингибиторов HMG-CoA-редуктазы и ингибиторов пренил-протеин-трансферазы.

Если раскрытое в данном документе соединение имеет, по меньшей мере, один хиральный центр, соединения могут соответственно существовать в виде энантиомеров. Когда соединения обладают двумя хиральными центрами, соединения могут дополнительно существовать в виде диастереомеров. То есть соединение формулы I в дополнение к желаемой конфигурации, обозначенной номенклатурой «(S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло-[1,5-a]-пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид гидросульфат» (далее обозначаемого как (S,R) -изомер), соединение также может присутствовать в небольших количествах в виде изомера (R)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло-[1,5-a] пиримидин-3-ил)-3-(S)-N-(5-((S)-2-(2(S)-N-(2-гидроксипропил-1-карбоксамид гидросульфата (далее обозначаемого как (R, R)-изомер) и/или также может присутствовать в небольших количествах в виде (S)-N-(5-((S)-2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]-пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид гидросульфата (далее обозначаемого как (S,S) -изомер) и/или может присутствовать в малых количествах в виде изомера (R)-N-(5-((S)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло-[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид гидросульфата» (в дальнейшем обозначаемого как (R,S)-изомер). Следует понимать, что все такие изомеры и их смеси охватываются рамками настоящего изобретения. Предпочтительно, когда соединение присутствует в виде (S,R)-изомера, изомер (S,R) присутствует в избытке, большем или равном около 80%, более предпочтительно при избытке, большем или равном около 90%, более предпочтительно все еще при избытке, большем или равном около 95%, более предпочтительно еще при избытке, большем или равном около 98%, более предпочтительно при избытке, большем или равном около 99%.

Понятно, что кристаллическая форма (I-HS) содержит два центра асимметрии и поэтому может быть получена и выделена в смеси изомеров, таких как рацемическая или диастереомерная смесь, или в энантиомерно чистой форме. Там, где стереохимия определена непрерывной или пунктирной линией, представляющей конкретную конфигурацию, то таким образом уточняется и определяется стереоизомер.

Используемый в данном документе термин «выделенная форма», если не указано иное, означает, что соединение присутствует в форме, которая отделена от любой твердой смеси другого соединения (соединений), системы растворителей или биологической среды. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) присутствует в виде выделенной формы.

Используемый в данном документе термин «по существу чистая форма», если не указано иное, означает, что молярный процент примесей в выделенном соединении или кристаллической форме составляет менее чем около 5 мол.%, предпочтительно менее чем около 2 мол.%, более предпочтительно менее чем около 0,5 мол.%, наиболее предпочтительно менее чем около 0,1 мол.%. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) присутствует в виде по существу чистой формы.

Используемый в данном описании термин «по существу свободный от других аморфных, полиморфных или кристаллических форм», когда он используется для описанной кристаллической формы (I-HS), если не оговорено особо, означает, что молярный процент другой аморфной, полиморфной или кристаллической формы (форм) выделенного основания кристаллической формы (I-HS) составляет менее чем около 5 мол.%, предпочтительно менее чем около 2 мол.%, Более предпочтительно менее чем около 0,5 мол.%, наиболее предпочтительно менее чем около 0,1 мол.%. В некоторых воплощениях кристаллическая форма (I-HS) присутствует в форме, по существу свободной от другой аморфной, полиморфной или кристаллической формы (форм).

Термины «полиморф» и «полиморфная форма» относятся к различным кристаллическим формам одного соединения. То есть полиморфы представляют собой различные твердые вещества, имеющие одну и ту же молекулярную формулу, но каждый полиморф может иметь различные физические свойства твердого состояния. Таким образом, одно соединение может давать различные полиморфные формы, где каждая форма имеет различные и отличные физические свойства в твердом состоянии, такие как различные профили растворимости, скорости растворения, температуры точки плавления, сыпучесть и/или разные пики рентгеновской дифракции. Различия в физических свойствах могут влиять на такие фармацевтические параметры, как стабильность при хранении, сжимаемость и плотность (что может быть важно при приготовлении рецептур и производстве продукта) и скорость растворения (что может быть важным фактором биодоступности). Способы для описания характеристик полиморфных форм включают, без ограничения указанным, рентгеновскую порошковую дифрактометрию (XRPD), дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC), термогравиметрический анализ (TGA), монокристаллическую рентгеновскую дифрактометрию (XRD), колебательную спектроскопию, например, инфракрасную (ИК) и рамановскую спектроскопию, спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в твердом состоянии и состоянии раствора, оптическую микроскопию, оптическую микроскопию с горячей стадией, сканирующую электронную микроскопию (SEM), электронную кристаллографию и количественный анализ, анализ размера частиц (PSA), анализ площади поверхности, измерения растворимости, измерения растворения, элементный анализ и анализ Карла Фишера.

Термин «аморфный» означает твердое вещество в твердом состоянии, которое находится в некристаллическом состоянии. Аморфные твердые тела представляют собой неупорядоченные расположения молекул и, следовательно, не имеют различимой кристаллической решетки или элементарной ячейки и, следовательно, не имеют определяемого дальнего порядка. Твердотельную форму твердого вещества можно определить с помощью поляризованной световой микроскопии, порошковой рентгеновской дифракции («XRPD»), дифференциальной сканирующей калориметрии («DSC») или других стандартных методик, известных специалистам в данной области.

При использовании в данном документе, если не указано иное, термины «лечить», «лечение» и т.п. должны включать оказание медицинской помощи и лечение субъекта или пациента (предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека) в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и включают введение раскрытого соединения для облегчения симптомов или осложнений или снижения скорости прогрессирования заболевания, состояния или расстройства.

Используемый в данном документе термин «предотвращение», если не указано иное, включает (а) уменьшение частоты одного или нескольких симптомов; (b) снижение тяжести одного или нескольких симптомов; (с) задержку или избежание развития дополнительных симптомов; и/или (d) задержку или избежание развития расстройства или состояния.

Используемый в данном документе термин «Trk-ассоциированная злокачественная опухоль» должен быть определен как включающий злокачественные опухоли, связанные с или нарушающие регуляцию гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (например, любой из типов нарушений регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, описанных в данном документе). Неограничивающие примеры злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, описаны в заявке.

Используемый в данном документе термин «боль» определяется как включающий острые, хронические, воспалительные и нейропатические боли, включая диабетическую невропатию. Кроме того, боль может быть централизованно опосредованной, периферически опосредованной, вызванной структурным повреждением ткани, вызванной повреждением мягких тканей или вызванной прогрессирующим заболеванием. Любое центральное опосредованное, периферически опосредованное, структурное повреждение тканей, повреждение мягких тканей или боль, связанная с прогрессирующим заболеванием, может быть острым или хроническим.

При использовании в данном документе, если не указано иное, боль должна включать воспалительную боль, центрально опосредованную боль, периферическую боль, висцеральную боль, структурную боль, боль от злокачественной опухоли, боль, связанную с травмой мягких тканей, боль при прогрессирующей болезни, невропатию, острую боль при острой травме, острую боль от травмы, острую боль от операции, головную боль, зубную боль, боль в спине (предпочтительно боль в нижнем отделе спины), хроническую боль от невропатических состояний и хроническую боль от постинсультных состояний.

Некоторые воплощения включают способы лечения боли, причем боль представляет собой острую боль. Некоторые воплощения включают способы лечения боли, причем боль представляет собой хроническую боль. Некоторые воплощения включают способы лечения боли, в которых боль представляет собой невропатическую боль, включая диабетическую невропатию. Некоторые воплощения включают способы лечения боли, причем боль представляет собой воспалительную боль.

В некоторых воплощениях боль выбирается из группы, которая включает остеоартрит, ревматоидный артрит, фибромиалгию, головную боль, зубную боль, ожог, солнечные ожоги, укусы животных (например, укус собаки, укус кошки, укус змеи, укус паука, укус насекомого и т.п.) нейрогенный мочевой пузырь, доброкачественную гипертрофию простаты, интерстициальный цистит, ринит, контактный дерматит/гиперчувствительность, зуд, экзему, фарингит, мукозит, энтерит, целлюлит, каузалгию, седалищный неврит, невралгию челюстного сустава, периферический неврит, полиневрит, боль культи, фантомную боль в конечностях, послеоперационную непроходимость кишечника, холецистит, синдром постмастэктомии, невропатическую боль в полости рта, боль Шарко, рефлекторную симпатическую дистрофию, синдром Гийена-Барре, паралитическую боль в полости рта, синдром горения рта, постгерпетическую невралгию, невралгию тройничного нерва, периферическую невропатию, двустороннюю периферическую невропатию, диабетическую невропатию, постгерпетическую невралгию, невралгию тройничного нерва, неврит зрительного нерва, постфебрильный неврит, мигрирующий неврит, сегментарный неврит, невралгию гомбо, нейронит, невралгию шейного отдела позвоночника, невралгию коленного сустава, невралгию коленного сустава, краниальную невралгию, мигренальную невралгию, идиопатическую невралгию, межреберную невралгию, невралгию грудной клетки, невралгию Мортона, невралгию носоглотки, затылочную невралгию, красную невралгию, невралгию Сладера, невралгию крылонебного узла, супраорбитальную невралгию, невралгию Видиана, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженной толстой кишки, роды, менструальные боли, злокачественную опухоль, боли в спине, боли в пояснице и боль при кистевом туннельном синдроме.

Острая боль включает боль, вызванную острым поражением, травмой, болезнью или хирургическим вмешательством (например, операции на открытом суставе (включая операции на открытом сердце или шунтирование)). Острая боль также включает, без ограничения указанным, головную боль, послеоперационную боль, боль при камне в почке, боль в желчном пузыре, боль при желчном камне, акушерскую боль, ревматологическую боль, зубную боль или боль, вызванные травмами спортивной медицины, синдром запястного канала, ожоги, скелетно-мышечные растяжения и деформации, мышечно-суставные деформации, синдромы боли в шейном отделе, диспепсию, язву желудка, язву двенадцатиперстной кишки, дисменорею или эндометриоз.

Хроническая боль включает боль, вызванную воспалительным состоянием, остеоартритом, ревматоидным артритом или является следствием заболевания, острого поражения или травмы. Хроническая боль также включает, без ограничения указанным, головную боль, боль в верхней части спины или боль в нижней части спины (выбирается из болей в спине, являющихся следствием систематического, регионального или первичного заболевания позвоночника (выбранного из радикулопатии)), боли в костях (выбираются из боли в костях из-за остеоартрита, остеопороза, метастазов в кости или неизвестных причин), боль в тазовом отделе, боль в спинном мозге, боль в груди, несердечная боль в грудной клетке, центральная послеинсультационная боль, миофасциальная боль, боль при злокачественной опухоли, боль в спине, гериатрическая боль или боль, вызванная головной болью, мигренью, невралгией тройничного нерва, синдромом височно-нижнечелюстного сустава, синдромом фибромиалгии, остеоартритом, ревматоидным артритом, синдромом подагры, фиброзитом или грудным синдромом.

Нейропатическая боль включает боль, вызванную хроническими или ослабляющими состояниями или нарушениями. Хронические или ослабляющие состояния или расстройства, которые могут приводить к невропатической боли, включают, без ограничения указанным, болезненную диабетическую периферическую невропатию, постгерпетическую невралгию, невралгию тройничного нерва, боль после перенесенного удара, боль, связанную с рассеянным склерозом, боль, связанную с нейропатией, такую как при идиопатической или посттравматической невропатии и мононеврите, нейропатическую боль при ВИЧ-инфекции, невропатическую боль, связанную с злокачественной опухолью, нейропатическую боль, связанную с запястным каналом, боль, связанную с травмой спинного мозга, сложный региональный болевой синдром, связанную с фибромиалгией невропатическую боль, поясничную и шейную боли, рефлекторную симпатическую дистрофию, синдром фантомных конечностей и другие болевые синдромы хронических и ослабляющих состояний.

«Острые нейродегенеративные расстройства или заболевания» включают, без ограничения указанным, различные типы острых нейродегенеративных расстройств, связанных с гибелью или повреждением нейронов, включая цереброваскулярную недостаточность, очаговую травму головного мозга, диффузное повреждение головного мозга и повреждение спинного мозга, т.е. ишемию головного мозга или инфаркт, включающий эмболическую окклюзию и тромботическую окклюзию, реперфузию после острой ишемии, перинатальное гипоксически-ишемическое повреждение, остановку сердца, а также внутричерепное кровоизлияние любого типа (включая, без ограничения указанным, эпидуральное, субдуральное, субарахноидальное и внутримозговое) и внутричерепное и внутрипозвоночных поражение (включая, без ограничения указанным, ушиб, проникновение, сдвиг, сжатие и разрывы) и синдром тряски младенца. В некоторых воплощениях острое нейродегенеративное расстройство является результатом инсульта, острого ишемического повреждения, травмы головы или повреждения позвоночника.

«Хронические нейродегенеративные расстройства или заболевания» включают, без ограничения указанным, болезнь Альцгеймера, болезнь Пика, диффузное заболевание Леви, прогрессирующий надъядерный паралич (синдром Стали-Ричардсона), мультисистемную дегенерацию (синдром Шей-Драгера), хронические эпилептические состояния, связанные с нейродегенерацией, заболевания моторных нейронов, включая боковой амиотрофический склероз, дегенеративные атаксии, кортикальную базальную дегенерацию, комплекс ALS-сочетание паркинсонизма и деменции (комплекс Гуама), подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, синуклеинопатии (включая множественную системную атрофию), первичную прогрессирующую афазию, стриатонигральную дегенерацию, Болезнь Мачадо-Джозефа/спиноцеребеллярную атаксию типа 3 и оливопонтоцебеллярные дегенерации, синдром Жиля Де Ла Туретта, бульбарный и псевдобульбарный паралич, спинномозговую и спинобулярную мышечную атрофию (болезнь Кеннеди), рассеянный склероз, первичный боковой склероз, семейную спастическую параплегию, болезнь Верднига-Гофмана, Кугельберг - болезнь Веландера, болезнь Тай-Сака, болезнь Сандхоффа, наследственную спастическую болезнь, болезнь Уолфарта-Кугельберга-Веландера, спастический парапарез, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию, семейную дисуавтомию (синдром Райли-Дэй) и прионные болезни (включая, без ограничения указанным, болезнь Крейтцфельдт-Якоба, болезнь Герстманна-Страуссера-Шейнкера, Куру и фатальную семейную бессонницу). В некоторых воплощениях хроническое нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянного склероза или церебрального паралича.

Используемый в данном документе термин «объект» относится к животному, предпочтительно к млекопитающему, наиболее предпочтительно к человеку, который был субъектом лечения, наблюдения или эксперимента. В некоторых воплощениях субъект испытал и/или продемонстрировал, по меньшей мере, один симптом заболевания или расстройства, подлежащего лечению и/или профилактике. В некоторых воплощениях пациентом является педиатрический пациент (т.е. пациент в возрасте до 21 года на момент постановки диагноза или лечения). Термин «педиатрический» может быть далее разделен на различные субпопуляции, включая: новорожденных (от рождения до первых 28 дней жизни); младенцев (от 29 дней до возраста менее двух лет); детей (от двух лет до 12 лет); и подростков (от 12 лет до 21 года (до, но не включая, двадцать второй день рождения)).

В некоторых воплощениях субъект был идентифицирован или диагностирован как имеющий злокачественную опухоль с нарушением регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (например, как определено с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, анализа или набора). В некоторых воплощениях субъект имеет опухоль, которая является положительной по нарушенияю регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня (например, как определено с использованием одобренного регулирующим органом анализа или набора). субъект может быть субъектом с опухолью (опухолями), которая положительна по нарушению регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (например, идентифицирована как положительная с использованием одобренного регулирующим органом, например, одобренного FDA, анализа или набора). Субъект может быть субъектом, опухоли которого имеют нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня (например, когда опухоль идентифицирована как таковая с использованием одобренного регулирующим органом, например одобренного FDA, набора или анализа). В некоторых воплощениях субъект подозревается в наличии злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk. В некоторых воплощениях субъект имеет историю болезни, указывающую, что у субъекта имеется опухоль, которая имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности, или уровня (и, возможно, история болезни указывает, что субъект может быть обработан любой из представленных в данном документе композиций).

Термин «Trk» или «белок Trk» включает любой из белков Trk, описанных в данном документе (например, белок TrkA, TrkB или TrkC).

Термин «ген NTRK» включает любой из описанных в данном документе генов NTRK (например, ген NTRK1, NTRK2 или NTRK3).

Термин «дикий тип» описывает нуклеиновую кислоту (например, ген NTRK или мРНК Trk) или белок (например, белок Trk), который обнаруживается у субъекта, который не имеет Trk-ассоциированного рака (и, необязательно, также не имеет повышенного риска развития злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, или состояния и/или не подозревается в наличии злокачественной опухоли или состояния, связанного с Trk) или обнаруживается в клетке или ткани у субъекта, который не имеет ассоциированной с Trk злокачественной опухоли или состояния (и, необязательно, также не имеет повышенного риска развития злокачественной опухоли, ассоциированной с Trk, или состояния и/или не подозревается в наличии злокачественной опухоли или состояния, ассоциированных с Trk).

Термин «регулирующий орган» является государственным агентством, для утверждения медицинского использования фармацевтических агентов в стране. Например, неограничивающим примером регулирующего органа является Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA).

Фраза «нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня» обозначает генетическую мутацию (например, транслокацию гена NTRK, которая приводит к экспрессии химерного белка, делецию в гене NTRK, которая приводит к экспрессии белка Trk, который включает делецию, по меньшей мере, одной аминокислоты, по сравнению с белком Trk дикого типа, или мутацию в гене NTRK, которая приводит к экспрессии белка Trk с одним или несколькими точечными мутациями, альтернативного сплайсированного варианта мРНК Trk, который дает белок Trk, с делецией, по меньшей мере, одной аминокислоты в белке Trk по сравнению с белком Trk дикого типа) или удвоение гена NTRK, что приводит к сверхэкспрессии белка Trk) или аутокринную активность, являющуюся следствием сверхэкспрессии гена NTRK, клетку, которая приводит к патогенному увеличению активности киназного домена белка Trk (например, конститутивно активного киназного домена белка Trk) в клетке. Например, нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может быть мутацией в гене NTRK1, NTRK2 или NTRK3, который кодирует белок Trk, который является конститутивно активным или имеет повышенную активность по сравнению с белком, кодируемым геном NTRK1, NTRK2 или NTRK3, который не имеет мутации. Например, нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может быть результатом транслокации гена, что приводит к экспрессии химерного белка, который содержит первую часть TrkA, TrkB или TrkC, которая включает функциональный домен киназы, и вторую часть партнерского белка (т.е. не TrkA, TrkB или TrkC). Ген, кодирующий химерный белок, может включать, например, следующие экзоны гена NTRK1 дикого типа: экзоны 10-19, экзоны 12-19, экзоны 12-19, экзоны 13-19, экзоны 14-19 или экзоны 15 -19. Ген, кодирующий химерный белок, может включать, например, следующие экзоны гена NTRK2 дикого типа: экзоны 12-21, экзоны 13-21, экзоны 15-21, экзоны 16-21 или экзоны 17-21. Ген, кодирующий химерный белок, может включать, например, следующие экзоны гена NTRK3 дикого типа: экзоны 17-22 или экзоны 16-22. Неограничивающие примеры химерных белков, которые являются результатом транслокации гена NTRK, описаны в таблицах 1, 3 и 4.

Нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может, например, включать мутацию (гены) в генах NTRK1, NTRK2 или NTRK3, что приводит к образованию TrkA, TrkB или TrkC, содержащих, по меньшей мере, одну (например, две, три, четыре или пять) точечную мутацию (например, одну из нескольких точечных мутаций, перечисленных в таблице 6). Нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может, например, включать мутацию в гене NTRK2, который приводит к белку TrkB, включающему точечную мутацию V673M. Нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может, например, включать мутацию в гене NTRK3, который приводит к белку TrkC, включающему точечную мутацию H677Y.

Нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может быть мутацией в гене NTRK1, NTRK2 или NTRK3, что приводит к делеции одной или более смежных аминокислот (например, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 7, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 60, по меньшей мере, 70, по меньшей мере, 80, по меньшей мере, 90, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 110, по меньшей мере, 120, по меньшей мере, 130, по меньшей мере, 140, по меньшей мере, 150, по меньшей мере, 160, по меньшей мере, 170, по меньшей мере, 180, по меньшей мере, 190, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 210, по меньшей мере, 220, по меньшей мере, 230, по меньшей мере, 240, по меньшей мере, 250, по меньшей мере, 260, по меньшей мере, 270, по меньшей мере, 280, по меньшей мере, 290, по меньшей мере, 300, по меньшей мере, 310, по меньшей мере, 320, по меньшей мере, 330, по меньшей мере, 340, по меньшей мере, 350, по меньшей мере, 360, по меньшей мере, 370, по меньшей мере, 380, по меньшей мере, 390 или, по меньшей мере, 400 аминокислот) в белке TrkA, TrkB или TrkC (за исключением делеций аминокислот в киназном домене TrkA, TrkB или TrkC, которые приводят к инактивации киназного домена). В некоторых воплощениях нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может включать делецию в гене NTRK1, приводящей к белку TrkA, в котором отсутствует NGF-связывающий сайт или экзон 10, который включает NGF-связывающий сайт, при том, что последний связан с острым миелоидным лейкозом.

В некоторых примерах нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня может включать альтернативную сплайсированную форму мРНК Trk, например, сплайсированный вариант TrkAIII или альтернативную сплайсированную форму TrkA, которая приводит к продуцированию белка TrkA, в котором отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзоном 10. В некоторых примерах нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня включает амплификацию гена NTRK (например, одну, две, три или четыре дополнительные копии гена NTRK), что может привести, например, к аутокринной экспрессии гена NTRK в клетке.

Термин «ассоциированная с Trk злокачественная опухоль или опухоль» представляет собой злокачественную опухоль, которая связана с нарушением регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня (например, злокачественная опухоль, связанная, по меньшей мере, с одним примером (например, двумя, тремя, четырьмя или пятью примерами) нарушения регуляции гена NTRK, белка Trk или их экспрессии или активности или уровня, описанных в данном документе).

Термин «млекопитающее» в контексте настоящего описания относится к теплокровному животному, которое имеет или может подвергаться риску развития заболевания, описанного в данном документе, и включает, без ограничения указанным, морских свинок, собак, кошек, крыс, мышей, хомяков и приматов, включая людей.

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает биологическую или лекарственную реакцию в тканевой системе, животном или человеке, которую ищут исследователи, ветеринары, врачи по лечебному делу или другие доктора, который включает облегчение симптомов болезни или расстройства, подвергаемого лечению. В частности, терапевтически эффективное количество при введении субъекту, нуждающемуся в таком лечении, является достаточным для (i) лечения или предотвращения определенного заболевания, состояния или расстройства, которое может быть обработано ингибитором TrkA и/или TrkB, (ii) ослабления, улучшения или устранения одного или нескольких симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства или (iii) предотвращения или замедления возникновения одного или нескольких симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, описанных в данном документе. Количество кристаллической формы (I-HS), которое будет соответствовать такому терапевтически эффективному количеству, будет варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние заболевания и его тяжесть, идентификационные характеристики (например, масса) млекопитающего, нуждающегося в лечении, но тем не менее может быть определено специалистом в данной области техники.

При использовании в данном документе термин «композиция» предназначен для охвата продукта, содержащего указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который прямо или косвенно приводит к комбинациям указанных ингредиентов в указанных количествах.

Для обеспечения более краткого описания, некоторые количественные выражения, приведенные в настоящем документе, не ограничиваются термином «около». Понятно, что, независимо от того, используется ли термин «около» явно или нет, каждая приведенная в данном документе величина предназначена для ссылки на фактическое заданное значение, и она также относится к приближению к такому заданному значению, которое разумно было бы вывести на основании обычного опыта в данной области, включая приближения, обусловленные экспериментальными и/или измерительными условиями для такого заданного значения.

В некоторых воплощениях термин «около» используется в данном документе для обозначения приблизительно, в области, примерно, или вокруг. Когда термин «около» используется в сочетании с численным интервалом, то он модифицирует этот интервал путем расширения границ выше и ниже указанных числовых значений. В общем, термин «около» используется в данном документе для изменения числового значения выше и ниже указанного значения посредством варьирования на 10%.

Термин «около», предшествующий одному или нескольким положениям пиков на паттерне порошковой рентгеновской дифракции, означает, что все пики группы, которым она предшествует, сообщаются в угловых положениях (два тета) с допустимой вариабельностью ± 0,3°. Вариабельность ± 0,3° предназначена для использования при сравнении двух паттернов порошковой рентгеновской дифракции. На практике, если пик дифракционной картины от одного паттерна назначен диапазону угловых положений (два тета), который является измеренным положением пика ± 0,3° и если эти диапазоны пиковых положений перекрываются, то оба пика считаются имеющими одинаковое угловое положение. Например, если определено, что пик одного паттерна имеет положение 11,0°, для целей сравнения допустимая изменчивость позволяет присвоить пику положение в диапазоне от 10,7 до 11,3°.

Термин «около», предшествующий значению для DSC, TGA, TG или DTA, которые сообщаются как градусы Цельсия, имеет допустимую вариабельность ± 5°С.

Чтобы обеспечить более краткое описание, некоторые количественные выражения в настоящем документе описываются в виде диапазона от около X до количества Y. Понятно, что там, где указан диапазон, диапазон не ограничивается приведенными верхними и нижними пределами, а скорее включает полный диапазон от около значения Х до около значения Y или любого диапазона между ними.

Далее в данном документе представлены фармацевтические композиции, содержащие кристаллическую форму (I-HS) с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции, содержащие кристаллическую форму (I-HS) в качестве активного ингредиента, могут быть получены путем тщательного смешивания кристаллической формы (I-HS) с фармацевтическим носителем в соответствии с обычными способами фармацевтического компаундирования. Носитель может принимать самые разнообразные формы в зависимости от желаемого пути введения (например, перорального, парентерального). Таким образом, для жидких пероральных препаратов, таких как суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители и добавки включают воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, красители и т.п.; для твердых пероральных препаратов, таких как порошки, капсулы и таблетки, подходящие носители и добавки включают крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие агенты, смазки, связующие, разрыхляющие агенты и т.п.. Твердые пероральные препараты также могут быть покрыты такими веществами, как сахара или покрыты энтеросолюбильной оболочкой для того, чтобы модулировать главный участок поглощения. Для парентерального введения носитель обычно состоит из стерильной воды, и могут быть добавлены другие ингредиенты для повышения растворимости или консервации. Инъецируемые суспензии или растворы также могут быть получены с использованием водных носителей с подходящими добавками.

Кристаллическую форму (I-HS) можно вводить любым удобным способом, например, в желудочно-кишечный тракт (например, ректально или перорально), нос, легкие, мускулатуру или сосудистую сеть или трансдермально или дермально. Кристаллическую форму (I-HS) можно вводить в любой удобной форме введения, например в виде таблеток, порошков, капсул, растворов, дисперсий, суспензий, сиропов, спреев, суппозиториев, гелей, эмульсий, пластырей и т.д. Такие композиции могут содержать компоненты, которые общеприняты в фармацевтических препаратах, например, разбавители, носители, модификаторы рН, подсластители, наполнители и другие активные агенты. При необходимости парентерального введения, композиции должны быть стерильными и быть в форме раствора или суспензии, подходящей для инъекции или инфузии. Такие композиции составляли дополнительный аспект изобретения.

Также в данном документе представлены фармацевтические композиции, содержащие кристаллическую форму (I-HS). Для получения предлагаемых в данном документе фармацевтических композиций кристаллическую форму (I-HS) в качестве активного ингредиента тщательно смешивают с фармацевтическим носителем в соответствии с традиционными способами фармацевтического компаундирования, причем этот носитель может принимать самые различные формы в зависимости от формы препарата, требуемой для введения, например, перорального или парентерального, такого как внутримышечное. При получении композиций в пероральной лекарственной форме можно использовать любую обычную фармацевтическую среду. Таким образом, для жидких пероральных препаратов, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители и добавки включают воду, гликоли, глицерины, масла, циклодекстрины, спирты, например этанол, ароматизаторы, консерванты, красители и т.п.; для твердых пероральных препаратов, таких как, например, порошки, капсулы, капсулы, гелевые капсулы и таблетки, подходящие носители и добавки включают крахмалы, сахара, разбавители, грануляторы, смазки, связующие, дезинтегрирующие агенты и т.п. Подходящие связующие включают, без ограничения указанным, крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, кукурузные подсластители, природные и синтетические смолы, такие как акация, трагакант или олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. Разрыхлители включают, без ограничения указанным, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

Из-за их легкости в применении таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительную пероральную дозированную единичную форму, и в этом случае очевидно используются твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут быть покрыты сахаром или покрыты энтеросолюбильным покрытием стандартными способами. Для парентерального введения носитель, как правило, включает стерильную воду при посредстве ингредиентов, например, для других целей, таких как способствование растворимости или консервация. Также могут быть приготовлены инъекционные суспензии, в этом случае могут быть использованы подходящие жидкие носители, суспендирующие агенты и т.п. Фармацевтические композиции в данном документе будут содержать на единицу дозировки, например таблетку, капсулу, порошок, инъекцию, чайную ложку и т.п., количество активного ингредиента, необходимое для доставки эффективной дозы, как описано выше.

Фармацевтические композиции, приведенные в настоящем описании, будут содержать единичную дозированную единицу, например таблетку, капсулу, суспензию, раствор, саше для восстановления, порошок, инъекцию, в.в., суппозиторий, сублингвальную/буккальную пленку, чайную ложку с верхом и т.п., от около 0,1 до 1000 мг или в любом диапазоне вышеуказанного, и может назначаться в дозе около 0,01-300 мг/кг/день или в любом диапазоне вышеуказанного, предпочтительно от 0,5 до 50 мг/кг/день или в любом диапазоне вышеуказанного. В некоторых воплощениях предлагаемые в данном документе фармацевтические композиции содержат в расчете на единичную единицу дозировки около 25-500 мг соединения, представленного в данном документе (например, от около 25 мг до около 400 мг, от около 25 мг до около 300 мг, около 25 мг до около 250 мг, от около 25 мг до около 200 мг, от около 25 до около 150 мг, от около 25 мг до около 100 мг, от около 25 мг до около 75 мг, от около 50 до около 500 мг, от около 100 до около 500 мг, от около 150 до около 500 мг, от около 200 до около 500 мг, от около 250 до около 500 мг, от около 300 до около 500 мг, от около 400 до около 500 мг, от около 50 до около 200 мг, от около 100 до около 250 мг, от около 50 до около 150 мг). В некоторых воплощениях предлагаемые в данном документе фармацевтические композиции содержат на единицу дозированной единицы около 25 мг, около 50 мг, около 100 мг, около 150 мг, около 200 мг, около 250 мг, около 300 мг, около 400 мг или около 500 мг соединения, представленного в данном документе. Дозы, однако, могут варьировать в зависимости от потребностей пациентов, тяжести состояния, подвергаемого лечению, и используемого соединения. В некоторых воплощениях дозы вводятся один раз в день (QD) или два раза в день (BID).

Предпочтительно эти композиции находятся в стандартных дозированных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии, дозированные аэрозоли или жидкие аэрозоли, капли, ампулы, автоинжекторные устройства или суппозитории; для перорального парентерального, интраназального, подъязычного или ректального введения или для введения ингаляцией или инсуффляцией. В ином случае, композиция может быть представлена в форме, подходящей для введения один раз в неделю или один раз в месяц; например, нерастворимая соль активного соединения, такая как соль деканоата, может быть адаптирована для предоставления депо-препарата для внутримышечной инъекции. Для приготовления твердых композиций, таких как таблетки, кристаллическая форма (I-HS) смешивается с фармацевтическим носителем, например обычными ингредиентами для таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальций фосфат или камеди, и другими фармацевтическими разбавителями, например водой, с образованием твердой композиции предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь кристаллической формы (I-HS). При упоминании этих композиций до придания им лекарственной формы в качестве гомогенных означает, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции, так что композиция может быть легко подразделена на одинаково эффективные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Затем эту твердую композицию до придания ей лекарственной формы подразделяют на стандартные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до 1000 мг или любое количество или диапазон активного ингредиента, представленного в данном документе. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты или иным образом смешаны с получением лекарственной формы, обеспечивающей преимущество длительного действия. Например, таблетка или пилюля могут содержать внутреннюю дозу и внешний дозировочный компонент, причем последний находится в форме оболочки по сравнению с первой. Эти два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для противодействия расщеплению в желудке и позволяет внутреннему компоненту проходить нетронутым в двенадцатиперстную кишку или задерживаться при высвобождении. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий можно использовать разнообразные материалы, в том числе ряд полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Жидкие формы, в которых новые композиции, представленные в данном документе, могут быть введены для перорального введения или путем инъекции, включают водные растворы, циклодекстрины, подходящие ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с пищевыми маслами, такими как хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а также эликсиры и аналогичные фармацевтические носители. Подходящие диспергирующие или суспендирующие агенты для водных суспензий включают синтетические и природные смолы, такие как трагакант, аравийскую камедь, альгинат, декстран, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон или желатин. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. Изотонические препараты, которые обычно содержат подходящие консерванты, применяются при желательном внутривенном введении.

Кристаллическую форму (I-HS) можно вводить в интраназальной форме посредством местного применения подходящих интраназальных носителей или через чрескожные пластыри кожи, хорошо известные специалистам в данной области техники. Для введения в форме трансдермальной системы доставки введение дозы будет, конечно, непрерывным, а не прерывистым в течение всего режима дозирования.

Для получения предлагаемых в данном документе фармацевтических композиций кристаллическую форму (I-HS) в качестве активного ингредиента тщательно смешивают с фармацевтическим носителем в соответствии с традиционными способами фармацевтического компаундирования, причем этот носитель может принимать самые различные формы в зависимости от формы препарата, желательного для введения (например, перорального или парентерального). Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области. Описания некоторых из этих фармацевтически приемлемых носителей можно найти в «Справочнике фармацевтических наполнителей», опубликованном Американской фармацевтической ассоциацией и Фармацевтическим обществом Великобритании.

Способы составления фармацевтических композиций описаны в многочисленных публикациях, таких как Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Second Edition, Revised and Expanded, Volumes 1-3, edited by Lieberman et al; Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Volumes 1-2, edited by Avis et al; и Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Volumes 1-2, edited by Lieberman et al; published by Marcel Dekker, Inc.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в любой из вышеуказанных композиций и в соответствии с режимами дозировки, установленными в данной области, когда требуется лечение злокачественной опухоли, боли, воспаления, нейродегенеративных заболеваний или инфекции Trypanosoma cruzi.

Суточная доза кристаллической формы (I-HS) может варьировать в широких пределах от 1,0 до 10000 мг на взрослого человека в день или выше или в любом диапазоне указанного. Для перорального введения композиции предпочтительно поставляются в виде таблеток, содержащих 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250 и 500 миллиграммов активного ингредиента для симптоматической корректировки дозы для пациента, подлежащего лечению. Эффективное количество лекарственного средства обычно доставляется при уровне дозировки от около 0,1 мг/кг до около 1000 мг/кг массы тела в сутки или в любом диапазоне указанного. Предпочтительно диапазон составляет от около 0,5 до около 500 мг/кг массы тела в день или любой диапазон указанного. Более предпочтительно от около 1,0 до около 250 мг/кг массы тела в день или любой диапазон указанного. Более предпочтительно от около 0,1 до около 100 мг/кг массы тела в день или любой диапазон указанного. Например, диапазон может составлять от около 0,1 до около 50,0 мг/кг массы тела в день или любое количество или диапазон указанного. В другом примере диапазон может составлять от около 0,1 до около 15,0 мг/кг массы тела в день или любой диапазон указанного. В еще одном примере диапазон может составлять от около 0,5 до около 7,5 мг/кг массы тела в день или любое количество в указанном диапазоне. Кристаллическую форму (I-HS) можно вводить по схеме 1 - 4 раза в день или в виде одной дневной дозы.

Оптимальные дозы, которые следует вводить, могут быть легко определены специалистами в данной области и будут варьировать в зависимости от способа введения, прочности состава, способа введения и улучшения состояния болезни. Кроме того, факторы, связанные с конкретным пациентом, подвергающимся лечению, включая возраст пациента, массу, диету и время введения, приведут к необходимости корректировки дозировок.

Специалист в данной области поймет, что как испытания in vivo, так и in vitro с использованием подходящих, известных и общепринятых моделей клеток и/или животных являются прогностическими критериями способности тестируемого соединения лечить или предотвращать данное нарушение.

Специалист в данной области далее признает, что клинические испытания на людях, включая испытания впервые на людях, диапазона доз и эффективности, у здоровых пациентов и/или пациентов, страдающих данным заболеванием, могут быть завершены в соответствии со способами, хорошо известными в клинике и медицине.

Акронимы, найденные в описании, имеют следующие значения:

ATP	Аденозинтрифосфат
DI	деионизированная
EtOH	Этанол
GC	газовая хроматография
MOPS	3-(N-морфолино)-пропансульфокислота
MTBE	метил-трет-бутиловый эфир
PDA	Фотодиодная матрица
RRT	Относительное время удерживания
RT	комнатная температура
THF	тетрагидрофуран
TMB	3,3', 5,5'-тетраметилбензидин

Следующие примеры иллюстрируют изобретение и изложены для облегчения понимания изобретения и не предназначены и не должны истолковываться таким образом, чтобы каким-либо образом ограничивать изобретение, изложенное в формуле изобретения, которая приведена ниже.

В примерах, описанных ниже, если не указано иное, все температуры приведены в градусах Цельсия. Реагенты были приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Sigma-Aldrich Chemical Company, EMD, JT Baker или Pharco-Aaper, и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное. Тетрагидрофуран (THF), гептан и другие органические растворители были приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Sigma-Aldrich Chemical Company, ACROS, Alfa-Aesar, Lancaster, TCI или Maybridge и использованы в том виде, в котором они были получены.

Специалист в данной области поймет, что, если не указано иное, стадию (стадии) реакции проводят в подходящих условиях в соответствии с известными способами для получения желаемого продукта. Специалист в данной области также поймет, что, где описанная в данном документе реакционная стадия может быть проведена в различных растворителях или системах растворителей, указанная реакционная стадия может также проводиться в смеси подходящих растворителей или систем растворителей. Специалист в данной области поймет, что в описании и формуле изобретения, которые представлены в данном документе, где реагент или класс/тип реагента (например, основание, растворитель и т.д.) перечисляют более чем на одной стадии процесса, отдельные реагенты независимо выбирают для каждой стадии реакции, и могут быть одинаковыми или отличающимися друг от друга. Например, когда две стадии процесса повторяют органическое или неорганическое основание в качестве реагента, органическое или неорганическое основание, выбранное для первой стадии, может быть таким же или отличаться от органического или неорганического основания второй стадии.

Реакции, описанные ниже, проводили обычно при положительном давлении азота (если не указано иное) в растворителях «ACS grade», а в реакционных колбах обычно устанавливались резиновые перегородки для введения субстратов и реагентов через шприц или капельную воронку.

Для контроля и анализа в процессе использовались две системы высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ) с использованием ацетонитрила и воды/трифторуксусной кислоты в качестве подвижных фаз. В одной системе использовали колонку Agilent Zorbax Extend C18 при 264 нм, в то время как другая система (в дальнейшем «TRK1PM1 HPLC») включала фенильную колонку Waters Xbridge при 268 нм. Если не указано иное, используется прежняя система. Двуокись кремния для обеих систем перемешивали в колбе с соединением, а затем фильтровали через полипропиленовую ткань перед анализом.

Аморфная форма соединения в виде свободного основания формулы I: около 1 г (S)-N-(5 -((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида растворяли в минимальном количестве воды и охлаждали до температуры около -26°С с последующим высушиванием в сублимационной сушилке в течение 24 часов. Около 20 мг аморфного материала, полученного из сублимационной сушилки, взвешивали во флаконе, к которому добавляли 5 объемных аликвот соответствующей системы растворителей. Смесь проверяли на растворение и, если не было обнаружено никакого растворения, смесь нагревали до около 40°С и снова проверяли. Эту процедуру продолжали до тех пор, пока наблюдали растворение или до тех пор, пока не добавляли 100 объемов растворителя. Паттерн XRPD аморфного материала, полученного в эксперименте сублимационной сушки, показан на фиг. 7.

Аморфную гидросульфатную соль соединения формулы I получали, как описано в примере 14A в WO 2010/048314 (см. Пример 3). Паттерны XRPD двух разных партий аморфного материала, полученного этим способом, показаны на фиг. 28.

Также в данном документе предлагается способ получения кристаллической формы (I-HS). В некоторых воплощениях способ включает стадии, показанные на Схеме 1.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу получения кристаллической формы (I-HS), включающему:

(а) добавление концентрированной серной кислоты к раствору (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидина-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида в EtOH с образованием гидросульфатной соли (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(b) добавление гептана к раствору стадии (а) для образования суспензии;

(с) фильтрование суспензии с целью выделения гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(d) смешивание указанного гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида с 5:95 масс./масс. раствором воды/2-бутанона;

(e) нагревание смеси стадии (d) при 65-70°С при перемешивании до тех пор, пока массовый процент этанола не будет составлять около 0,5%, для образования суспензии кристаллической формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида; и

(f) выделение кристаллической формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида путем фильтрования.

В некоторых воплощениях вышеописанный способ дополнительно включает: (b1) затравку раствора стадии (а) гидросульфатом (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамидом при комнатной температуре и перемешивание раствора до образования суспензии.

(a) взаимодействие 5-хлор-3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидина с (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин (R)-2-гидроксисукцината в присутствии основания с образованием (R)-5-(2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-3-нитропиразоло[1,5-а]пиримидина;

(b) обработку указанного (R)-5-(2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидина Zn и хлористоводородной кислотой с образованием (R)-5-(2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил) пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-амина;

(с) обработку указанного (R)-5-(2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-амина основанием и фенилхлорформиатом с образованием фенил R)-(5-(2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил) карбамата;

(d) взаимодействие указанного фенил (R)-(5-(2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил) пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил) карбамата с (S)-пирролидином-3-ола с образованием (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(e) добавление серной кислоты к указанному (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамиду с образованием гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил) пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида; и

(f) выделение кристаллической формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-Ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида.

В некоторых воплощениях вышеуказанной стадии (а) основание представляет собой аминооснование, такое как триэтиламин.

В некоторых воплощениях вышеуказанной стадии (с) основание представляет собой основание щелочного металла, такое как карбонат щелочного металла, такой как карбонат калия.

Препарат A

Получение 5-хлор-3-нитропиразоло[1,5-а]пиримидина

Стадия А. Получение пиразоло[1,5-а]пиримидин-5-олата натрия: Раствор 1Н-пиразол-5-амина и 1,3-диметилпиримидин-2,4 (1Н, 3Н)-диона (1,05 экв.) загружали в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, паровым горшком, обратным холодильником, датчиком температуры J-Kem и адаптером N₂ для положительного контроля давления N₂. При механическом перемешивании твердые частицы суспендировали с 4 об. (4 мл/г) абсолютного этанола в атмосфере азота, затем загружали 2,1 эквивалента NaOEt (21% масс. раствор в EtOH) и затем промывали водой 1 об. (1 мл/г) абсолютного этанола. Суспензию нагревали до около 75°С и перемешивали при осторожном кипячении с обратным холодильником до тех пор, пока с помощью TRLC1PM1 ВЭЖХ не наблюдали менее 1,5% по площади 1Н-пиразол-5-амина, чтобы следить за ходом реакции с использованием 20 мкл суспензии, разбавленной в 4 мл деионизированной воды и 5 мкл инъекции при 220 нм.

Через 1 час смесь загружали 2,5 об. (2,5 мл/г) гептана и затем кипятили с обратным холодильником при 70°С в течение 1 часа. Суспензию затем охлаждали до комнатной температуры в течение ночи. Твердое вещество собирали фильтрованием через воронку на столе и полипропиленовую фильтровальную ткань. Реактор промывали и загружали на фильтровальную лепешку с 4 об. (4 мл/г) гептана с отжатым осадком, и твердые вещества переносили в тарированные сушильные лотки и сушили в печи при 45°С в условиях высокого вакуума до тех пор, пока их масса не стала постоянной. Бледно-желтый твердый пиразолопиро[1,5-a]-пиримидин-5-олат получали с выходом 93-96% (с поправкой) и более 99,5% по площади, наблюдаемой с помощью ВЭЖХ (разбавление 1 мг/мл в деионизированной воде, TRK1PM1 при 220 нм).

Стадия B - Получение 3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидин-5(4H)-она: В круглодонную круглодонную колбу загружали пиразоло[1,5-а]пиримидин-5-олат натрия, которую растворяли при 40-45°С в 3,0 об. (3,0 мл/г) деионизированной воды и затем концентрировали в высоком вакууме при 65°С на водяной бане на роторном испарителе до тех пор, пока не наблюдали 2,4 × массы исходного материала (1,4 об./1,4 мл/г содержания деионизированной воды). Проводили газовую хроматографию (GC) для остаточного EtOH (30 мкл раствора, растворенного в ~ 1 мл MeOH), которая продемонстрировала менее 100 м.д. со следами паров этилнитрата, наблюдаемыми ниже при последующем добавлении HNO₃. В некоторых случаях исходный раствор был загружен еще 1,5 об. (1,5 мл/г) дистиллированной воды, затем концентрировали в высоком вакууме при 65°С на водяной бане на роторном испарителе до тех пор, пока не наблюдали 2,4 × массы исходного материала (1,4 об./1,4 мл/г содержания воды в дистиллированной воде). Была проведена газовая хроматография остаточного EtOH (30 мкл раствора, растворенного в приблизительно 1 мл MeOH), которая показала << 100 м.д. остаточного EtOH, без наблюдения каких-либо паров этилнитрата менее при последующем добавлении HNO₃.

В сосуд с круглым дном, снабженный механической мешалкой, паровым баком, обратным холодильником, датчиком температуры J-Kem и адаптером N₂ для положительного контроля давления N₂, загружали 3 об. (3 мл/г, 10 экв.) > 90 масс.% HNO₃ и охлаждали до около 10°С в атмосфере азота с использованием внешней охлаждающей воды и воды в атмосфере азота. С помощью воронки для уравнивания давления в растворе HNO₃ загружали 1,75-1,95 объема деионизированного водного раствора пиразоло[1,5-a]пиримидин-5-олата натрия (1,16-1,4 мл деионизованной воды/г натрия Пиразоло[1,5-a]пиримидин-5-олата) со скоростью, необходимой для поддержания внутренней температуры 35-40°С при охлаждении. Два азеотропа наблюдались без паров этилнитрата. Азеотропную колбу, передаточную линию (если применимо) и капельную воронку промывали 2×0,1 об. (2×0,1 мл/г) деионизированной воды, добавляемой к реакционной смеси. По завершении добавления температуру постепенно повышали около до 45-50°С в течение около 3 часов, при этом ВЭЖХ показывала> 99,5% площади конверсии пиразоло[1,5-a]пиримидин-5-олата натрия в 3-нитропиразоло[ 1,5-а]пиримидин-5 (4Н)-он.

Стадия C - Получение 5-хлор-3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидина: 3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидин-5 (4H)-он загружали в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, нагревательной рубашкой, обратным холодильником, температурным зондом J-Kem и адаптером N₂ для положительного контроля давления N₂. При механическом перемешивании твердые частицы суспендировали в 8 объемах (8 мл/г) CH₃CN и затем загружали 2,6-лутитином (1,05 экв.). С последующим нагреванием суспензии до около 50°С. С помощью капельной воронки для выравнивания давления смесь по каплям загружали 0,33 эквивалентами POCl₃. Эта загрузка дает густую бежевую суспензию тримера, которую гомогенизируют при перемешивании до тех пор, пока не наблюдается полумобильная масса. Дополнительно к смеси добавляли 1,67 эквивалента POCl₃, давая стабилизироваться температуре, с последующим нагреванием реакционной смеси до щадящей дефлегмации (78°С). При нагревании смеси наблюдалось резкое вспучивание, которое позднее ослабевало по мере того, как густая суспензия становилась тоньше.

Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником до полного растворения в темном растворе и ВЭЖХ (20 мкл, разбавленный в 5 мл CH₃CN, TRK1PM 1 ВЭЖХ, 5 мкл инъекции, 268 нм) не подтвердило, что присутствие тримера (RRT 0,92) не наблюдается в количестве менее чем 0,5% площади 3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидин-5 (4H)-она (RRT 0,79), путем ручного удаления любых интерферирующих и ранних пиков элюирования, связанных с лутидином, из области интеграции. В масштабе 1,9 кг, 0% площади тримера, 0,25% площади 3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидин-5 (4H)-она и 99,5% площади 5-хлор-3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидина наблюдали после 19 часов щадящей дефлегмации с использованием ВЭЖХ TRK1PM1 при 268 нм.

Препарат В

Получение (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина (R)-2-гидроксисукцината

Стадия А. Получение трет -бутил (4-(2,5-дифторфенил)-4-оксобутил) карбамата: 2-бром-1,4-дифторбензол (1,5 экв.) растворяли в 4 объемах THF (в расчете на массу трет -бутил-2-оксопирролидин-1-карбоксилата) и охлаждали до около 5°С. К смеси добавляли раствор 2,0 М iPrMgCl в THF (1,4 экв.) в течение 2 часов при поддержании температуры реакции ниже 25°С. Раствору давали охладиться до около 5°С и перемешивали в течение 1 часа (анализ GC подтвердил образование Гриньяра). Раствор трет-бутил 2-оксопирролидин-1-карбоксилата (1,0 экв.) в 1 объеме THF добавляли в течение около 30 мин. при поддержании температуры реакции ниже 25°С. Реакционную смесь перемешивали при температуре около 5°С в течение 90 минут (было подтверждено, что трет-бутил-2-оксопирролидин-1-карбоксилат имел площадь менее 0,5%). Реакцию гасили 5 объемами 2 М водного раствора HCl при поддержании температуры реакции ниже 45°С. Затем реакционную смесь переносили в делительную воронку, добавляя 10 объемов гептана и удаляя водный слой. Органический слой промывали 4 объемами насыщенного водного раствора NaCl с последующим добавлением 2×1 объема насыщенного водного раствора NaCl. В органическом слое заменяли растворитель на гептан (<1% по массе THF, подтвержденный GC) при температуре дистилляции 35-55°С и давлении дистилляции 100-200 мм рт.ст. Для 2×4 объемов гептана добавляли минимальный объем дистилляции около 7 объемов. Смесь затем разбавляли до 10 объемов гептаном при нагревании до около 55°С и получали более плотное твердое вещество, и смесь оставляли остывать до комнатной температуры в течение ночи. Суспензию охлаждали до температуры ниже 5°С и фильтровали через полипропиленовую фильтровальную ткань. Влажный осадок промывали 2 х 2 объема гептана. Твердые вещества сушили в вакууме при 55°С до тех пор, пока масса не будет постоянной, что дает трет-бутил (4-(2,5-дифторфенил)-4-оксобутил) карбамат в виде белого твердого вещества с теоретическим выходом около 75-85%.

Стадия В. Получение 5-(2,5-дифторфенил)-3,4-дигидро-2Н-пиррола: Трет-бутил (4-(2,5-дифторфенил)-4-оксобутил)-карбамат растворяли в 5 объемах толуола с 2,2 экв. 12 М HCl, наблюдая умеренную экзотерму и выделение газа. Реакционную смесь нагревали до 65°С в течение 12-24 часов и контролировали с помощью ВЭЖХ. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали до температуры ниже 15°С с помощью ледяной/водяной бани. pН доводили до около 14 с помощью 3 экв. 2 М водного NaOH (4,7 об.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Смесь переносили в делительную воронку с толуолом. Водный слой удаляли и органический слой промывали 3 объемами насыщенного водного раствора NaCl. Органический слой концентрировали до масла и повторно растворяли в 1,5 объемах гептана. Полученную суспензию фильтровали через фильтровальную бумагу GF/F и концентрировали до светло-желтого масла 5-(2,5-дифторфенил)-3,4-дигидро- 2H- пиррола с теоретическим выходом 90-100%.

Стадия C - Получение (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина: Хлор-1,5-циклооктадиеновый иридиевый димер (0,2 мол.%) И (R)-2-(2-(дифенилфосфино) фенил)-4-изопропил-4,5-дигидрооксазол (0,4 мол.%) Суспендировали в 5 объемах МТВЕ (на основе 5-(2,5-дифторфенил)-3,4-дигидро- 2Н- пиррола) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 1 часа, и большая часть твердых веществ, растворенных в растворе, становилась темно-красной. Образование катализатора контролировали с использованием детектора HPLC/PDA. Реакционную смесь охлаждали до температуры ниже 5°С и добавляли 5-(2,5-дифторфенил)-3,4-дигидро-2Н-пиррола (1,0 экв.) С использованием 0,5 объемов промывки MTBE. Дифенилсилан (1,5 экв.) добавляли в течение около 20 мин. при поддержании температуры реакции ниже 10°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при температуре ниже 10°С и затем оставляли нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Завершение реакции подтверждали ВЭЖХ и затем охлаждали до температуры ниже 5°С. Реакцию гасили 5 объемами 2 М водного раствора HCl, поддерживая температуру ниже 20°С. Спустя 10 минут баню лед/вода удаляли, и реакционной температуре давали вырасти до комнатной температуры при перемешивании в течение 2 часов. Смесь переносили в делительную воронку с 3 объемами MTBE. Водный слой промывали 3,5 объемами MTBE с последующим добавлением 5 объемов MTBE к водному слою с одновременным доведением рН до около 14 путем добавления 0,75 объемов водного 50% NaOH. Органический слой промывали 5 объемами насыщенного водного раствора NaCl, затем концентрировали до масла и разбавляли 3 объемами MTBE. Раствор фильтровали через полипропиленовую фильтровальную ткань и промывали 1 объемом MTBE. Фильтрат концентрировали до масла (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина с 95%-100% теоретического выхода и с 75-85% ее.

Стадия D - Получение (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина (R)-2-гидроксисукцината: (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин (1,0 экв.) переносили в круглодонную колбу, загруженную 15 объемами (с поправкой на эффективность) EtOH (200 prf). Добавляли D-яблочную кислоту (1,05 экв.) и нагревали смесь до 65°С. Все твердые вещества растворяли при температуре около 64°С. Раствору давали охладиться до комнатной температуры. При температуре около 55°С в раствор вносили затравку (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина (R)-2-гидроксисукцината (около 50 мг, > 97%ee) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем суспензию фильтровали через полипропиленовую фильтровальную ткань и промывали 2 х 1 объема EtOH (200 prf). Твердые вещества сушили в вакууме при 55°С, получая (R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин (R)-2-гидроксисукцинат с теоретическим выходом 75-90% и с > 96% ее.

В соответствии с схемой 1, подходящие основания включают основания третичного амина, такие как триэтиламин и K₂CO₃. Подходящие растворители включают этанол, гептан и тетрагидрофуран (THF). Реакцию удобно проводить при температурах от 5°С до 50°С. Ход реакции в целом контролировали с помощью ВЭЖХ TRK1PM1.

Схема 1

Соединения II (5-хлор-3-нитропиразоло[1,5-a]пиримидин) и III ((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин (R)-2-гидроксисукцинат, 1,05 экв.) загружали в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, термодатчиком J-Kem и адаптером N₂ для положительного контроля давления N₂. Добавляли раствор 4: 1 EtOH: THF (10 мл/г соединения II) с последующим добавлением триэтиламина (NEt₃, 3,50 экв.) через капельную воронку с температурой, достигающей около 40°C в процессе добавления. По завершении добавления реакционную смесь нагревали до 50°С и перемешивали в течение 0,5-3 часов, получая соединение IV.

В круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, температурным зондом J-Kem и соединением IV для входа N₂, добавляли тетрагидрофуран (10 мл/г соединения IV). Раствор охлаждали до температуры ниже 5°С на ледяной бане и добавляли Zn (9-10 экв.). Затем добавляли по каплям 6М раствор HCl (9-10 экв.) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру ниже 30°С (для прибавления в масштабе 1 кг потребовалось около 1,5 ч). После того, как экзотермическая активность уменьшилась, реакции давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 30-60 мин. до тех пор, пока соединение IV перестало обнаруживаться с помощью ВЭЖХ. В это время сразу добавляли раствор карбоната калия (K₂CO₃, 2,0 экв.) в воде (5 мл/г соединения IV) с последующим быстрым по каплям добавлением фенилхлорформиата (PhOCOCl, 1,2 экв.). Выделение газа (CO₂) наблюдалось во время обоих вышеуказанных добавок, и температура повышалась до около 30°С после добавления фенилхлорформиата. Образование карбамата перемешивали при комнатной температуре в течение 30-90 мин. Анализ ВЭЖХ проводили сразу же после этого для того, чтобы удостоверится в наличии менее 1% площади для присутствующего амина и высокого выхода соединения VI в растворе.

К вышеуказанному раствору добавляли амин VII ((S)-пирролидин-3-ол, 1,1 экв., исходя из теоретического выхода для соединения VI) и EtOH (10 мл/г соединения VI).Соединение VII добавляли до или одновременно с EtOH для того, чтобы избежать образования этилкарбаматных примесей. Вышеуказанный раствор этанола концентрировали до минимального объема (4-5 мл/г), используя концентратор периодического действия при пониженном давлении (уровни THF должны составлять <5% по GC) и добавляли EtOH (10 мл/г соединения VI), чтобы получить в общей сложности 10 мл/г. Затем реакционную смесь нагревали при 50°С в течение 9-19 часов или до тех пор, пока ВЭЖХ не покажет, что соединение VI составляет менее 0,5% площади. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и серную кислоту (H₂SO₄, 1,0 экв. к соединению VI) добавляли через капельную воронку для получения соединения I-HS с температурой, обычно выделяющейся при температуре около 30°С.

Пример 1

Получение кристаллической формы (I-HS) (способ 1)

(S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид (0,500 г, 1,17 ммоль) растворяли в EtOH (2,5 мл) и охлаждали до около 5°С. Концентрированную серную кислоту (0,0636 мл, 1,17 ммоль) добавляли к охлажденному раствору и перемешивали в течение около 10 мин. при нагревании до комнатной температуры. К смеси медленно добавляли метил-трет-бутиловый эфир (MTBE) (2 мл), в результате чего продукт осмаливался. Затем к смеси добавляли EtOH (2,5 мл) и нагревали до температуры кипения с обратным холодильником до тех пор, пока все твердые вещества не растворялись. После охлаждения до комнатной температуры и перемешивания в течение приблизительно 1 ч образовывались некоторые твердые вещества. После охлаждения до около 5°С твердые частицы фильтровали и промывали МТВЕ. После фильтрования и высушивания на воздухе в течение около 15 минут гидросульфат (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида выделяли в виде твердого вещества.

Пример 2

Получение кристаллической формы (I-HS) (способ 2)

Концентрированную серную кислоту (392 мл) добавляли к раствору 3031 г (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида в 18322 мл EtOH с образованием гидросульфатной соли. Раствор затравливали с помощью 2 г гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 2 часов, получая суспензию гидросульфатной соли. Добавляли гептан (20888 г) и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 60 мин. Суспензию фильтровали и осадок на фильтре промывали смесью гептан/EtOH 1:1. Затем твердые вещества сушили в вакууме при температуре окружающей среды (температура в печи установлена равной 15°С).

Высушенную гидросульфатная соль (6389 г из 4 комбинированных партий) добавляли к 5:95 масс./масс. раствору воды/2-бутанона (общий вес 41652 г). Смесь нагревали при около 68°С при перемешивании до тех пор, пока массовый процент этанола не составил около 0,5%, при этом образовывалась суспензия. Суспензию фильтровали и осадок на фильтре промывали 5/95 масс./масс. раствором воды/2-бутанона. Твердые вещества затем сушили в вакууме при температуре окружающей среды (температура в печи устанавливается при 15°С), чтобы получить кристаллическую форму гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидина-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида.

Пример 3

Получение аморфной формы AM(HS)

К раствору (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (9,40 г, 21,94 ммоль) в MeOH (220 мл) медленно при перемешивании при комнатной температуре медленно добавляли серную кислоту (0,1 М в МеОН, 219,4 мл, 21,94 ммоль). Через 30 минут реакционную смесь сначала концентрировали на роторном испарителе до почти сухости, затем в высоком вакууме в течение 48 ч, чтобы получить аморфную форму гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (11,37 г, 21,59 ммоль, выход 98,43%). LCMS (apci m/z 429,1, М + Н).

Пример 4

Получение кристаллической соли HCl формулы I

Смесь (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидина -1-карбоксамида (0,554 г, 1,29 ммоль) в EtOH (6 мл, 200 доказательств) и MTBE (10 мл) нагревали до 50°С при перемешивании с получением раствора с последующим добавлением хлористого водорода (конц.) (0,108 мл, 1,29 ммоль) одной порцией. Затем реакционной смеси давали сначала охладиться до температуры окружающей среды, затем охлаждали до около 5°С на бане с ледяной водой при перемешивании, чтобы вызвать кристаллизацию. Суспензию перемешивали в течение 4 часов на бане со льдом и водой до ее вакуумной фильтрации, после чего фильтровальную лепешку промывали MTBE и высушивали под вакуумом при 55°С до постоянной массы, получая кристаллический гидрохлорид (S)-N-(5-(R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (0,534 г, выход 89%). LCMS (apci m/z 429,2, М + Н).

Получение кристаллической соли HBr формулы I

Смесь (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидина-1-карбоксамида (0,505 г, 1,18 ммоль) в EtOH (6 мл, 200 доказательств) и MTBE (10 мл) нагревали до 50°С при перемешивании с получением раствора с последующим добавлением бромистого водорода (33% водн.) (0,213 мл, 1,18 ммоль) на одну порцию. Реакционную смесь нагревали до кипения с обратным холодильником с получением в основном прозрачного раствора с небольшим количеством маслянистого остатка на стеклянной стенке реакционного сосуда. При охлаждении до температуры окружающей среды появлялся осадок, а маслянистый остаток затвердевал. Смесь снова нагревали до 50°С, затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Суспензию фильтровали под вакуумом, фильтровальную лепешку промывали МТВЕ и сушили в вакууме при 55°С до постоянной массы, получая кристаллический гидробромид (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (0,51 г, выход 85%). LCMS (apci m/z 429,3, М + Н).

Получение кристаллической мезилатной соли формулы I

Смесь (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидина -1-карбоксамида (0,532 г, 1,24 ммоль) в EtOH (2,7 мл, 200 доказательств) и МТВЕ (5,3 мл) нагревали до 50°С при перемешивании с получением раствора с последующим добавлением метансульфоновой кислоты (0,076 мл, 1,24 Ммоль) одной порцией. Реакционную смесь нагревали до кипения с обратным холодильником, получая в основном прозрачный раствор с небольшим количеством частиц. При охлаждении до температуры окружающей среды происходит осаждение вместе с некоторым маслянистым остатком. Для получения раствора добавляли дополнительный EtOH (0,5 мл, с классом выдержки 200 ч) и метансульфокислоту (0,010 мл). Реакционную смесь снова нагревали до 50°С, затем охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Суспензию фильтровали под вакуумом, фильтровальную лепешку промывали МТВЕ и сушили в вакууме при 55°С до постоянной массы, получая кристаллический метансульфонат (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида (0,51 г, выход 78%). LCMS (apci m/z 429,4, М + Н).

Получение кристаллической камзилатной соли формулы I

Смесь (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидина-1-карбоксамида (0,500 г, 1,17 ммоль) и S-(+)-камфорсульфоновой кислоты (0,271 г, 1,17 ммоль) в EtOH (3 мл, 200 доказательств) и МТВЕ (5 мл) нагревали до кипения с обратным холодильником при перемешивании для получения раствора. При охлаждении до температуры окружающей среды появлялся осадок. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем фильтровали под вакуумом, фильтровальную лепешку промывали МТВЕ и сушили в вакууме при 55°С до постоянной массы, получая кристаллический (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамид ((1S, 4R)-7,7- 2-оксобицикло [2.2.1] гептан-1-ил) метансульфонат.

Пример 5

Сравнение солей (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида

Другие солевые формы (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида, например, хлорводородную, бромводородную, мезилатную и камзилатную соли (см. Пример 4) сравнивали с кристаллической формой (I-HS) путем определения их температуры плавления дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC), прироста массы и стабильности на алюминиевом слайде при 40°С и относительной влажности 75% (RH) с помощью динамической паровой сорбции (DVS).Измерения DSC и DVS проводились, как описано выше, результаты суммированы в таблице 14.

Таблица 14. Физико-химические свойства кристаллических солей (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида

Кристаллическая соль	Точка плавления DSC Начало до максимума	Увеличение массы DVS (Результат)	Стабильность при 40°С/75% относительной влажности (алюминиевый слайд)
гидросульфат (I-HS)	186-206° Цельсия	~ 1% прирост при 80% относительной влажности 2% прироста при 95% относительной влажности без изменений	10 дней Без изменения формы
HCl	124-134° Цельсия	~ 1% усиления при относительной влажности 50% При относительной влажности 50-60% произошло изменение формы	Через 1 час произошла смена формы
HBr	177-185° Цельсия	~ 3,9% прирост при 80% относительной влажности ~ 25% прирост при относительной влажности 90% (разжиженный)	Через 2 недели аморфный
Мезилат	183-186° Цельсия	~ 9% прирост при 80% относительной влажности ~ 50% прирост при относительной влажности 90% (Кристаллический)	разжижается при поглощении влаги из атмосферы за ночь
Камсилат	170-183° Цельсия	Не испытано	Не испытано

Пример 6

Анализ фермента TrkA и TrkB

Аффинность связывания соединения с Trk-киназой измеряли с использованием технологии Invitrogen LanthaScreen™ Eu Kinase Binding. Вкратце, His-меченный рекомбинантный цитоплазматический домен Trk человека от Invitrogen (5 нМ TRK A - № PV3144 или 10 нМ TRK B - № PV3616) инкубировали с 5 нМ Alexa-Fluor® Tracer 236 (PR9078A), 2 нМ биотинилированного анти-His (кат.№ M4408) и 2 нМ меченного европием стрептавидина (кат. № PV5899) вместе с тестируемым соединением в буфере, состоящем из 25 мМ MOPS, pH 7,5, 5 мМ MgCl₂, 0,005% Triton X-100 и 2% DMSO. Соединение обычно получали в трехкратном серийном разбавлении в DMSO и добавляли в анализ с получением соответствующей конечной концентрации. После 60-минутной инкубации при 22°С реакцию измеряли с использованием многорежимного планшетного ридера PerkinElmer EnVision через двухволновое детектирование TR-FRET и процента контроля (POC), рассчитанного с использованием коэффициента относительной эмиссии. 100 POC определяли с помощью тестового соединения, и 0 POC определяли с помощью концентрации контрольного соединения, которая полностью ингибирует фермент. Значения POC соответствуют логистической кривой с 4 параметрами, а значение IC₅₀ представляет собой точку, где кривая пересекает 50 POC. Кристаллическая форма (I-HS) имела усредненную IC₅₀ 8,4 нМ при тестировании в этом анализе на TrkA и усредненную IC₅₀ 4,2 при тестировании в этом анализе на TrkB.

Пример 7

Химерные белки TRK приводят к онкогенезу и ингибируются кристаллической формой (I-HS)

Был проведен ряд экспериментов для определения того, будет ли кристаллическая форма (I-HS) ингибировать клеточную пролиферацию в трех различных моделях злокачественных опухолевых клеток, содержащих разные генные химеры Trk: клеточная линия CUTO-3F, клеточная линия KM12 и клетка MO-91 линия. Клетку CUTO-3F получили от пациента с аденокарциномой легкого, несущей генную химеру MPRIP-NTRK1. Клеточная линия KM12 представляет собой клеточную линию колоректального рака, несущую химеру TPM3-NTRK1 (Vaishnavi et al., Nature Med. 19: 1469-1472, 2013). Клеточная линия MO-91 получена от пациента с острым миелоидным лейкозом, несущего химеру ETV6-NTRK3 (Taipale et al., Nature Biotech. 31:630-637, 2013). Измерение пролиферации клеток после обработки кристаллической формой (I-HS) продемонстрировало дозозависимое ингибирование пролиферации клеток во всех трех тестируемых клеточных линиях (фиг. 8-10). IC₅₀ составляла менее 100 нМ для клеток CUTO-3F (фиг. 8) и менее 10 нМ для клеток KM12 и клеток MO-91 (фиг. 9 и 10 соответственно).

В соответствии с ингибированием клеточной пролиферации, в клетках CUTO-3F ингибировалось фосфорилирование онкопротеина MPRIP-TRKA и ERK1/2 с использованием низких доз кристаллической формы (I-HS) (фиг. 11), ингибированием фосфорилирования TPM3-TRKA, pAKT и pERK1/2 в клетках KM12 с использованием низких доз кристаллической формы (I-HS) (фиг. 12) и ингибирования фосфорилирования онкобелка TEL-TRKC (кодируемого ETV6-NTRK3), PAKT и pERK1/2 в клетках MO-91 с использованием низких доз кристаллической формы (I-HS) (фиг. 13). Вместе эти данные показывают, что слитые белки Trk являются конститутивно активными и регулируют критические нисходящие сигнальные пути, такие как MAPK и AKT, и ингибируются кристаллической формой (I-HS). Эти данные также показывают, что кристаллическая форма (I-HS) может использоваться для лечения различных видов злокачественных опухолей, которые экспрессируют Trk с нарушенной регуляцией (например, конститутивно активную форму белка Trk (например, химерный белок Trk или точечная мутация в Trk)).

Пример 8

Кристаллическая форма (I-HS) успешно лечила субъект, страдающий от недифференцированной саркомы

У 41-летней женщины обнаружилась твердая масса в левом части паха. Первоначальная визуализация использовалась для подтверждения массы 10 см в мускулатуре ее передней части бедра. Открытая биопсия показала недифференцированную саркому. Начальное сканирование показало множественные двусторонние 4-13 мм легочные узелки, соответствующие метастатическому заболеванию. Женщина была зачислена на исследование фазы 2 сорафениба с химиотерапией, предоперационной лучевой терапией и хирургией с сохранением конечности (номер ClinicalTrials.gov NCT02050919). После двух недель сорафениба, вводимого по 400 мг в день, пациент получал эпирубицин по 30 мг/м² ежедневно и ифосфамид при 2500 мг/м² ежедневно с месной в течение трех последовательных дней с продолжением ежедневного сорафениба. В течение этих пяти недель системной терапии опухоль становилась все более болезненной. Во время моделирования для предоперационного облучения было отмечено расширение опухоли краниально внутри поясничной мышцы, что исключало безопасное введение эффективных доз облучения из-за прогнозируемой токсичности в отношении кишечника. Поэтому пациент вышел из протокола и приступил к хирургической резекции.

Резекция первичной опухоли достигла отрицательных границ, и обзор патологического образца подтвердил 90% некроза опухоли. КТ грудной клетки с целью проведение повторных исследований (показана на фиг. 21А) была получена через 9 недель после того, как исходные сканы показали ухудшающееся метастатическое заболевание, причем наибольший узел теперь имел размеры 18 мм. Послеоперационный курс пациента осложнялся инфекцией полимикробной раны, требующей повторной хирургической обработки раны и длительной антибактериальной терапии. Повторная КТ грудной клетки была получена до возобновления химиотерапии и продемонстрировала резкое прогрессирование в течение предшествующих 9 недель с множественными легочными узлами более 3 см, наибольшим почти 7 см и большим левым плевральным выпотом. После размещения туннельного плеврального стока и инициации дополнительного домашнего кислорода пациент получал доксорубицин в дозе 75 мг/м² один раз, в ожидании регистрации на лечение кристаллической формой (I-HS).

Диагностическая открытая биопсия опухоли была протестирована с использованием панели FoundationOneHeme (Foundation Medicine, Cambridge, MA). Этот многоцелевой комплексный анализ геномного профилирования (CGP) с использованием секвенирования ДНК и РНК сотен генов, связанных со злокачественными опухолями, показал наличие слияния генов, кодирующего экзоны 1-2 гена ламина A/C (LMNA) и экзоны 11-17 гена NTRK1, приводящего к слитому гену LMNA-NTRK1 (фиг. 14). CGP также показал потерю опухолевого супрессора CDKN2A/B (не показан), но без других известных онкогенных мутаций.

Затем в анализе флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), выполненной на образце опухоли пациента, было выявлен преимущественно одиночный 3' NTRK1 (сигнал красной флуоресценции) в 64% ядер опухоли, что согласуется с геномными изменениями, связанными с локусом гена NTRK1, скорее всего, вторичными по отношению к геномной делеции между двумя генами, учитывая расположение и ориентацию LMNA и NTRK1 на большом плече хромосомы 1 (фиг. 15). Экспрессия мРНК нового химерного транскрипта химерного гена была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования (фиг. 16).

Был проведен новый анализ лигирования проксимального участка (PLA) с использованием опухолевого образца пациента для оценки экспрессии белка и функциональной активности химерного онкобелка. PLA уникальны тем, что они могут обнаруживать функциональные сигнальные комплексы между киназой и одним из ее адаптеров in situ. В этом анализе TRKA образовал комплекс с его предпочтительным адаптером, SHC1, который связывается с Y496 в киназном домене TRKA (фиг. 17). Этот анализ был подтвержден как в клеточных линиях человека, так и в образцах фиксированных формалином опухолевых ксенотрансплантатов, полученных из пациента (PDX) (фиг. 18). Было обнаружено, что нокаутирование с помощью RNAi NTRK1 нарушает TRKA-SHC1 комплексы в клеточной линии CUTO-3, содержащей ген слияния MPRIP-NTRK1 (фиг. 18A-C), также как и ингибирование кристаллической формой (I-HS) (фиг. 18D и 18E). TRK PLA обнаруживает функциональные сигнальные комплексы в образце опухоли FFPE из ксенотрансплантата пациента (PDX), CULC001, несущего генные химеры MPRIP-NTRK1, но не в PDX CULC002, который не несет известной онкогенной драйверной мутации (фиг. 18F и 18G). TRK-SHC PLA может также обнаруживать неонкогенные сигнальные комплексы, что продемонстрировано положительным сигналом в области периферической нервной ткани CULC001 PDX, где семейство рецепторов TRK обладает высокой экспрессией активности, опосредованной нейротрофинами. Применение этого анализа к образцу опухоли пациента показало надежную сигнализацию, связанную с ядрами опухолей, но только со слабым сигналом в кровеносном сосуде (человеческие эндотелиальные клетки экспрессируют TRKA, что согласуется с онкогенной сигнализацией онкобелком LMNA-TRKA (фиг. 19A и B). TRK-SHC1 PLA продемонстрировал отрицательный результат в образце опухоли у пациентов с ALK + NSCLC, тогда как ALK-GRB2 PLA был положительным (фиг. 20), что еще раз продемонстрировало способность этого анализа обнаруживать онкогенную сигнализацию в образцах опухолей человека.

Присутствие химеры LMNA-NTRK1, обнаруженной анализом FoundationOneHeme, а затем подтвержденного FISH и ОТ-ПЦР в сочетании с доказательствами экспрессии белка TRKA и функциональной активности TRK-пути в образце опухоли пациента, предполагает, что у пациента имеется TRK-обусловленная злокачественная опухоль, подходящая для лечения TRK-специфическим ингибитором.

На основании множественных линий генетических и функциональных данных биомаркеров, предполагающих присутствие драйверного онкогена TRK, пациента направили на рассмотрение регистрации в исследование фазы 1 кристаллической формы (I-HS). Спустя месяц пациент был найден подходящим для испытания и предоставил письменное информированное согласие. Базовое сканирование КТ показало продолжение прогрессирования опухоли с множественными большими легочными метастазами в обоих легких, хотя плевральный выпот разрешился после размещения плеврального стока (фиг. 21С). В клинической картине у пациента была значительная одышка при физической нагрузке и потребовалось 5 л дополнительного кислорода для поддержания насыщения кислородом 90%. Исходные лабораторные показатели отличались повышенным уровнем маркеров опухоли CA125 (фиг. 22). Пациент получил начальную дозу 100 мг кристаллической формы (I-HS) за три дня до начала непрерывного дозирования, а затем такую же дозу приблизительно через 12 часов в тот же день, с 48 часами фармакокинетики и оценкой безопасности согласно протоколу исследования. Пациент начал 1 день 1 цикла через три дня. Пациент наблюдался еженедельно для фармакокинетики и анализа безопасности. Не было отмечено побочных эффектов, связанных с лекарственным средством, и у пациента наблюдалось еженедельное улучшение ее одышки при физической нагрузке в течение этого 4-недельного периода. Уровни CA125 нормализовались за цикл 1. КТ проводили до начала 1-го дня второго цикла, которая продемонстрировала заметное улучшение в множественных легочных метастазах и был признан частичный ответ RECIST 1.1. Повторная КТ выполнялась до 1 дня 3 цикла и демонстрировала непрерывный ответ и, таким образом, подтверждала частичный ответ RECIST 1.1 (фиг. 21С). Клинически пациент значительно улучшил одышку при физической нагрузке и больше не нуждался в дополнительном кислороде с насыщением кислородом 97% при комнатном воздухе. После четырех месяцев дозирования у пациента не было никаких неблагоприятных событий, которые были приписаны кристаллической форме (I-HS). Эти данные показывают, что кристаллическая форма (I-HS) способна лечить недифференцированную саркому у субъекта, а также другие виды злокачественных опухолей, у которых есть белок Trk с нарушенной регуляцией (например, конститутивно активная форма белка Trk, например, химерные белки Trk или точечные мутации Trk).

Генная химера LMNA-NTRK1 ранее сообщалась в невусах Шпиц и конститутивно активируется при экспрессии в клетках, что приводит к активации ERK1/2, AKT и PLCγ, что демонстрирует ее онкогенность (Taipale et al., Nature Biotech. 31:630-637, 2013). Foundation Medicine (FM) ранее протестировала 1272 саркомы мягких тканей с помощью теста FoundationOneHeme CGP, результатом чего стало обнаружение 8 химер NTRK1 или NTRK3, включая пациента, описанного в этом случае (таблица 15). Примечательно, что 6 из 8 пациентов с саркомами с химерами NTRK моложе 25 лет (точный критерий Фишера, значение Р = 4×10^-4) и 4 из 8 моложе 5 лет (точный критерий Фишера, значение P = 2×10^-5), что указывает на увеличение частоты выявления химер NTRK среди педиатрических больных (4,1%, 95% CI 1,8%-9,3%) и особенно детей в возрасте до 5 лет (14,3%, 95% ДИ 5,7% -31,5%). Интересно также, что один из обнаруженных химерных генов объединяет большую часть гена NTRK3 (экзон 1-17) с 3'-концом гена HOMER2 (экзоны 2-9), который содержит домен димеризации (суперспиральный домен), и поэтому представляет собой 3'-генную химеру, которая была описана для множества других генов RTK-кодирования, таких как EGFR, AXL и FGFR3 (Sleijfer et al., Eur. J. Cancer 46:72-83, 2010; Linch et al., Clin. Oncol. 11:187-202, 2014; Rutkowski et al., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 25:264-270, 2011).

Таблица 15. Клинические характеристики и подробности химерного гена NTRK пациентов с саркомой мягких тканей

Гистология	5' Ген	5' последний экзон	3' Ген	3' Первый экзон	Пол	Возраст
Саркома мягких тканей (nos) (n=179)	LMNA	2	NTRK1	11	F	41
Саркома мягких тканей (nos) (n=179)	LMNA	20	NTRK1	11	м	22
Фибросаркома мягких тканей (n=28)	LMNA	10	NTRK1	12	м	До 5
Фибросаркома мягких тканей (n=28)	SQSTM1	2	NTRK1	10	ж	До 5
Шваннома мягких тканей (n=3)	TPM3	7	NTRK1	10	м	До 5
Шваннома мягких тканей (n=4)	ETV6	5	NTRK3	15	ж	До 5
доброкачественная мезотелиома мягких тканей(n=28)	TFG	6	NTRK3	14	м	17
Саркома мягких тканей (nos) (n=l 79)	NTRK3	17	HOMER2	2	ж	68

Далее был проведен эксперимент, чтобы показать, что кристаллическая форма (I-HS) специфически ингибирует активность Trk-киназы. Например, кристаллическая форма (I-HS) не ингибирует клеточную пролиферацию клеточной линии HCC78, полученную из немелкоклеточного рака легкого, которая экспрессирует химерный белок SLC34A2-ROS1 (фиг. 23) (Vaishnavi et al., Nat Med., 19, 1469-72, 2013).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клиническое испытание

NCT02122913 - это продолжающееся многоцентровое исследование фазы 1 с эскалацией дозы, оценивающее безопасность и фармакокинетику кристаллической формы (I-HS), селективного пан-TRK, у неотобранных пациентов с метастатическими или продвинутыми солидными опухолями без стандартных вариантов терапии. Это исследование было одобрено комиссиями по биомедицинской этике во всех учреждениях, которые регистрируют пациентов, а имеющие на это право пациенты предоставляли письменное информированное согласие на участие. Кристаллическая форма (I-HS) предоставлялась в капсулах по 100 мг. Зарегистрированные пациенты получали эскалационные дозы кристаллической формы (I-HS) в соответствии с модифицированным дизайном 3 + 3 и получали кристаллическую форму (I-HS) ежедневно или дважды в день до недопустимой токсичности, прогрессии заболевания или отказа от согласия. У пациентов с измеримым заболеванием эффективность оценивается по критериям RECIST 1.1.

Секвенирование следующего поколения (NGS)

ДНК и РНК были извлечены, и библиотеки секвенирования с лигированными адапторами были захвачены путем гибридизации раствора с использованием пользовательских наборов-«приманок», нацеленных на 405 связанных со злокачественными опухолями генов и на 31 часто перестраиваемых генов с помощью ДНК-seq, и на 265 часто перегруппируемых генов с помощью РНК-seq (FoundationOne Heme). Все захваченные библиотеки были секвенированы с высокой глубиной (Illumina HiSeq) в CLIA-сертифицированной лаборатории с сертификатом CAP (Foundation Medicine), в среднем > 500х для ДНК и > 6M уникальных пар для РНК. Данные о последовательности из гДНК и кДНК были сопоставлены с эталонным геномом человека (hg19) и проанализированы с помощью конвейера вычислительного анализа для того, чтобы выявить геномные изменения, присутствующие в образце, включая замены, короткие вставки и делеции, перестановки и варианты числа копий.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

FISH с зондом «break-apart» по NTRK1 выполняли на 4-микронных слайдах с образцами опухолей, фиксированных формалином и покрытых парафином (FFPE), как описано выше, с использованием Vysis LSI NTRK1 (Cen) SpectrumGreen (Cat # 08N43-030) и Vysis LSI NTRK1 (Тел) SpectrumRed (Abbott Molecular, № 08N43-030 и 08N43-020, соответственно) (Vaishnavi et al., Cancer Discov. 5: 25-34, 2015).

ОТ-ПЦР и секвенирование ДНК

Полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) проводили, как описано ранее, с использованием прямого праймера к LMNA (LMNA F1, 5'gagggggagggatgat3', SEQ ID NO: 1) (Weisner et al., Nat Comm 5: 3116, 2014) и обратным праймером к NTRK1 (NTRK1 Y490rev, 5'cggcgcttgatgtggtggtgaac3', SEQ ID NO: 2). Секвенирование ДНК продукта ОТ-ПЦР проводили с использованием секвенирования ДНК по Сенгеру в центре патологии университета Колорадо.

Клеточные линии

Информированное согласие было получено для получения бессмертных клеточных линий из пациента. Клеточная линия CUTO-3 и ее производные были инициированы из злокачественного плеврального выпота у пациентки с аденокарциномой легкого IV стадии, несущей гибрид гена MPRIP-NTRK1, как описано ранее (Vaishnavi et al., Cancer Discov. 5: 25-34, 2015; Davies Et al., PLoS One 8: e82236, 2013). Ранее были описаны KM12 и MO-91 (Vaishnavi et al., Nature Med. 19: 1469-1472, 2013; Taipale et al., Nat. Biotech. 31:630-637, 2013).

Получение ксенотрансплантатов из пациентов

Информированное согласие было получено от пациента с целью получения ксенотрансплантатов из пациентов на мышах. Опухолевая ткань от онкоген-отрицательного пациента с аденокарциномой легкого (CULC001) разрезали на 3 х 3 х 3 мм кусочки, которые переносили в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 200 единиц/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина. Опухолевые кусочки погружали в матригель (Corning) и вставляли в разрезы на каждом боку 5 голых мышей. Плевральную жидкость (CULC002) от пациента с аденокарциномой легкого, содержащую генную химеру MRPIP-NTRK1, центрифугировали и полученный осадок клеток суспендировали в 5 мл ACK-буфера (Lonza) в течение 2 мин., что обеспечивало полный лизис эритроцитов. Лизис останавливали добавлением 20 мл PBS и центрифугированием образцов. Осадок промывали дважды PBS перед суспендированием в среде, дополненной DMEM, как описано выше. 100 мкл клеток (1×10⁶ на бок), суспендированных в смеси DMEM и матригеля (BD) в соотношении 1: 1, подкожно вводили в бока 5 голых мышей. Развитие и поддержание полученных ксенотрансплантатов были описаны ранее (Keysar et al., Mol. Oncol. 7:776-790, 2013).

Анализы близкого лигирования

Клетки высевали на стеклянные покровные стекла (в 48-луночном планшете) или на стекла с камерами с размерами 25-75 тыс. клеток/лунку. Клетки обрабатывали указанными дозами и затем фиксировали в течение 15 минут при встряхивании при комнатной температуре в 4% параформальдегиде. Клетки дважды промывали в PBS, а затем использовали набор Duolink® in situ PLA® от SigmaAldrich для мышей/кроликов (красный) в соответствии с протоколом производителя (каталог # DUO92101). Концентрации антител были оптимизированы с использованием иммунофлюоресценции перед экспериментами PLA. PLA на FFPE-тканях из мышей или пациентов были подготовлены, как описано в гистологии. Кроме того, образцы обрабатывали 300 мМ глицином в течение 15 минут до стадии блокирования, в ином случае анализ проводили в соответствии с протоколом производителя. Клетки закрепляли с помощью реагента Prolong® gold, препятствующего выгоранию флуоресценции (с DAPI) и давали затвердеть в течение ночи до получения изображений. Изображения были либо получены на стандартном инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon с 40x, либо на конфокальном микроскопе 3I Marianas spinning disc в отделе передовой световой микроскопии медицинского кампуса Anschutz в университете Колорадо при 40x или 100x. Использовали следующие антитела: TRK (C17F1) и ALK (D5F3) от Cell Signaling, SHC1 от Novus и Grb2 (610111) от BD.

Анализы пролиферации

Все анализы пролиферации выполняли в среде, дополненной 5% FBS, как описано ранее, с использованием Cell Titer 96 MTS (Promega) (Bouhana et al., EORTC-NCI-AACR 26^th Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Barcelona, Spain 2014). Клетки высевали 500-2000 клеток/лунку и обрабатывали в течение 72 часов при концентрациях лекарственного средства, описанных на каждом графике. Каждый анализ проводили трижды, по меньшей мере, в трех независимых биологических повторах. Данные были построены и значения IC50 были рассчитаны с использованием программного обеспечения GraphPad.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг выполняли, как описано ранее (Vaishnavi et al., Nature Med. 19: 1469-1472, 2013). Вкратце, клетки лизировали в буфере RIPA с помощью коктейля ингибиторов протеаз и фосфатаз «Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail» (Thermo Scientific) и разводили в загрузочном буфере (LI-COR Biosciences). Мембраны сканировали и анализировали с использованием системы визуализации Odyssey и программного обеспечения (LI-COR). Следующие антитела от Cell Signaling были использованы: pTRK Y490 (кроличьи поликлональные, # 9141), pERK1/2 XP T202/Y204 (# 9101), общая ERK1/2, pAKT S473 (кроличьи мАТ, # 4060) и мышиные на общий AKT Клон D3A7 (# 2920). TRK (C-14) кроличье поликлональное антитело было приобретено у Santa Cruz Biotechnology. GAPDH (MAB374) и pTYR (4G10) получены от Millipore. Статистический анализ

Доверительные интервалы для определения скорости слияния NTRK в образцах пациентов с саркомой рассчитывали с использованием теста для пропорций на одной выборке. Классификация болезни была основана на онтологии болезней Foundation Medicine. Обогащение химер NTRK в более молодых группах пациентов было протестировано с помощью точного критерия Фишера. Все статистические испытания проводились в R v 3.1.3.

Пример 9

Клиническая безопасность и активность из исследования фазы 1 кристаллической формы (I-HS), селективного ингибитора TRKA/B/C, у пациентов с твердой опухолью с химерами гена NTRK.

Способы

В этом текущем открытом многоцентровом исследовании фазы I с эскалацией 3+3 дозы кристаллической формы (I-HS) было зарегистрировано 23 пациента с солидными опухолями, не поддающимися стандартной терапии, нормальной кроветворной и основной функцией органов. Кристаллическую форму (I-HS) вводили перорально в виде разовой дозы, затем дозу QD или BID для непрерывных 28-дневных циклов. Ответ оценивается по критериям RECIST, версия 1.1. Сыворотку собирали для фармакокинетического анализа в 1 цикле 1 дня и 8 дня. Информация о безопасности берется у всех пациентов, и определение дозирующей токсичности применяется к побочным эффектам независимо от отношения к исследуемому продукту.

Результаты

На сегодняшний день 23 пациента получали лечение в каждой из первых пяти доз, начиная с 50 мг QD-150 мг BID. Кристаллическая форма (I-HS) хорошо переносится; MTD не было достигнуто, и наиболее распространенными побочными эффектами являются утомляемость 1 и 2 степени (35%), головокружение (26%) и анемия (22%). У двух пациентов была токсичность, ограничивающая дозу (повышенный АСТ, категория 3 (уровень дозы 150 мг 2 раза в сутки) и делирий, не относящийся к 3 категории (уровень дозы 100 мг BID)).

PK-анализ показал, что максимальные концентрации в плазме кристаллической формы (I-HS) достигались через 30-60 минут после введения дозы и экспозиция возрастала приблизительно пропорционально с дозой. Несвязанные уровни лекарственного средства в кристаллической форме (I-HS) оказываются достаточными для приблизительно 98%-ного ингибирования TRKA/B/C в пиковых концентрациях при всех уровнях дозы.

Три из 23 пациентов несли NTRK-химеры и получали лечение по 100 или 150 мг BID. Эти пациенты достигли частичного ответа: недифференцированная саркома с LMNA-NTRK1 химерой (59% снижение, 7 циклов +), c-kit- отрицательная стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) с химерой ETV6-NTRK3 (30%), и секреторной карциномой молочной железы с химерой ETV6-NTRK3 (уменьшение на 64%; 2 цикла +). Эти данные подтверждаются ингибированием in vivo роста опухоли и регрессией в моделях ксенотрансплантата в мышей TRK-химер.

Выводы

Кристаллическая форма (I-HS) хорошо переносится и обладает достаточным системным воздействием на устойчивое ингибирование NTRK-химер, что подтверждается уровнями фармакокинетических лекарственных средств, и постоянными клиническими ответами, наблюдаемыми у 3 пациентов с NTRK-химерами, включенными в это исследование. Эти данные дополнительно подтверждают эту молекулярную мишень в качестве онкогенного драйвера среди различных гистологий опухолей.

Пример 10

Сравнение кристаллической формы (I-HS) и аморфной сульфатной соли

Для сравнения свойств аморфного гидросульфата (S)-N-(5 -((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин- 3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида и кристаллической формы (I-HS). Эти исследования включают профили примесей, стабильность, свойства сыпучести и гигроскопичность. В следующих исследованиях две партии аморфного материала (AM(HS)1 и AM(HS)2) сравнивались с одной партией кристаллической формы (I-HS). AM(HS)1 и AM(HS)2 получали, как описано в Примере 3. Кристаллическую форму (I-HS) получали, как описано в Примере 2.

Способы

Остаточные растворители

Растворы AM(HS)1, AM(HS)2 и кристаллической формы (I-HS) анализировали с использованием парофазного анализа GC-MS.

Термогравиметрический анализ (TGA)

Образцы помещали на платиновые контейнеры и подвергали воздействию температуры 10°С/мин до 300°С.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC)

Образцы помещали в гофрированные алюминиевые тигли со штифтовым отверстием в крышке и выдерживали при температуре 10°С/мин до 250°С в атмосфере азота.

Рентгеновская дифракция (XRD)

Cu Kα излучение при 44 кВ, 40 мА через Ni-фильтр с дивергентной щелью 2/3°, расщепление HL-щели 10 мм, щель рассеивания, установленную на «Авто» (рассеивающая щель определяется компьютером/прибором), приемная щель 0,3 мм. Непрерывное сканирование от 3° до 40° 2θ со скоростью 2°/мин; Ширина выборки (размер шага) 0,02°/с, время шага 0,4 пункта/сек. Образцы вращают в плоскости, параллельной поверхности образца, со скоростью 60 об./мин.

Поляризационная световая микроскопия (PLM)

Образцы помещали на стеклянное предметное стекло, заливали маслом с низкой вязкостью и покрывали стеклянным покровным стеклом. Рассматривали с помощью 20x объектива с кросс-поляризованными линзами и фильтром отсечки 530 нм. Изображения получали с помощью камеры PAX-It и обрабатывали с помощью программного обеспечения PAX-It.

Динамическая паровая сорбция (DVS)

1. Гигроскопичность исследовали при 25°С с использованием анализатора IGAsorp.

2. Около 15 мг образца помещали в тарированный сетчатый держатель образца при начальной влажности окружающей среды в помещении ~ 35%.

3. Во всем исследовании используется общий расход воды/сухого азота 250 см³/мин.

4. Твердые вещества изучали, выполняя один полный цикл следующей программы: 60 минут сушки при 40°С в сухом N2 с последующими настройками 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 95% относительной влажности, с временем экспозиции при каждом заданном значении влажности, зависящей от 99,5% достоверности подобранной модели F1 или 60 минут. Максимально допустимое время при любой заданном значении влажности составляло 120 мин. Образец выдерживали в сухом азоте после завершения цикла.

Процент прироста массы рассчитывали на основе сухой массы.

Часть первая: Физические характеристики кристаллической формы (I-HS)

AM(HS)1, AM(HS)2 и кристаллическая форма (I-HS) характеризовались по внешнему виду, остаточными растворителями, термогравиметрическим анализом (TGA), содержанием воды Карла Фишера (KF), дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC) Рентгеновская дифракция (XRD), поляризованная световая микроскопия (PLM) и гигроскопичность методом динамической паровой сорбции (DVS). Данные для физической характеристики трех партий можно найти в таблицах 16-19 и на фиг. 24-38.

Таблица 16. Внешний вид

Соединение	Внешний вид	Munsell #
AM(HS)1	Желтый порошок без агрегатов	7,5Y 9/10
AM(HS)2	Желтый порошок без агрегатов	7,5Y 9/10
Кристаллическая I-HS	Оранжевый порошок без агрегатов	2,5YR 7/10

Таблица 17. Остаточные растворители

Соединение	Растворители (м.д.)
Этанол	метанол	Метил трет-бутиловый эфир	Гептан	Тетрагидрофуран	Метилэтил-кетон
AM(HS)1	не детектируется	1075	не тестировалось	не тестировалось	не тестировалось	не тестировалось
AM(HS)2	174	7369	не тестировалось	не тестировалось	не тестировалось	не тестировалось
Кристаллическая I-HS	4783	не тестировалось	не детектируется	не детектируется	не детектируется	3046

Таблица 18. Анализ тепловой гравиметрии и анализ Карла Фишера (содержание воды)

Соединение	Термогравиметрический анализ	KF (масс./масс.%)
Старт (°С)	Стоп (°С)	Изменение (%)
AM(HS)1	24,78	111,94	3,78	2,00
111,94	186,94	3,09
AM(HS)2	31,53	100,21	1,94	0,88
100,21	174,86	3,07
Кристаллическая I-HS	23,77	218,58	6,01	0,28

Таблица 19. Дифференциальный сканирующий калориметрический анализ

Соединение	Дифференциальная сканирующая калориметрия
Тип	Старт (°С)	Начало (°С)	Максимум (°С)	Стоп (°С)	ΔH (J/g)
AM(HS)1	эндотерм	28,7	29,9	68,3	115,8	153,7
AM(HS)1	эндотерм	124,1	126,1	152,8	191,0	58,3
эндотерм	204,7	205,6	211,2	220,1	7,5
AM(HS)2	эндотерм	29,6	29,8	70,7	107,2	70,0
AM(HS)2	эндотерм	113,7	116,0	140,3	167,0	32,7
эндотерм	205,6	207,2	213,8	221,3	4,8
Кристаллическая I-HS	эндотерм	181,9	193,7	204,6	213,8	98,9

Заключение по физическим характеристикам

Формы API AM(HS)1 и AM(HS)2 являются аморфными без двойного лучепреломления согласно поляризованной световой микроскопии, и паттерн XRPD также является отчетливо аморфным для обеих партий без видимых пиков рентгеновской дифракции. TGA для аморфных соединений показало пошаговую потерю массы, соответствующую эндотермическим событиям, наблюдаемым при дифференциальной сканирующей калориметрии. Первые два эндотермических события достаточно широки и могут указывать на испарение и/или десольватацию. Последнее эндотермическое событие происходит при приблизительной температуре расплава, наблюдаемой в кристаллическом материале. Оба аморфных участка довольно гигроскопичны со значительным гистерезисом при десорбции. AM(HS)1 получила более 13% от исходной массы при относительной влажности 80%. Аналогично, AM(HS)2 получила почти 12% своей исходной массы при 80% относительной влажности. Пост-DVS XRPD демонстрирует, что во время динамической паровой сорбции не было изменения формы, однако было обнаружено, что порошок, разжиженный в держателе образца, затрудняет удаление разжиженного порошка из держателя образца.

Кристаллическая форма (I-HS) является кристаллической по природе со многими дифракционными пиками согласно рентгеновской дифракции и истинного двулучепреломления согласно поляризованной световой микроскопии в ее агломератоподобной морфологии. Кристаллическая форма (I-HS) показывает термогравиметрическую потерю массы 6%, соответствующую началу эндотермического начала расплава, при температуре 193,7°С. Кристаллическая форма (I-HS) не является гигроскопичной, и она получила только 1% от ее исходной массы при относительной влажности 80%.

Часть вторая: Порошковые свойства кристаллической формы (I-HS)

В следующих исследованиях сравнивалась кристаллическая гидросульфатная соль с порошком аморфной сульфатной соли, включая исследование свойств сыпучести каждой формы, которые важны для изготовления твердой пероральной лекарственной формы, такой как таблетка или капсула. Выполняемая работа включает объемную плотность, насыпную плотность при утряске, угол естественного откоса и профили сжатия.

Смеси

Смеси были созданы в соответствии с составами, представленными в таблицах 20 и 21. Эти смеси являются типичными для рецептур таблеток, которые могут быть изготовлены в виде таблетки на основе прямого прессования или таблетирования на валках или в капсуле, изготовленной согласно рецептуре. Первый API (т.е. AM(HS) или кристаллическая форма (I-HS)), микрокристаллическую целлюлозу (MCC) и либо крахмал, либо лактозу, добавляли в стеклянную бутылку объемом 30 куб. см и смешивали с помощью шейкерного смесителя TURBULA® при 25 Об./мин. в течение 3 минут. Затем оставшиеся наполнители добавляли в бутылку и смешивали с TURBUL® при 25 об./мин. еще в течение 3 минут.

Таблица 20. Подбор состава таблетки с 2: 1 MCC: лактоза, 50% лекарственная нагрузка

Компонент	Класс	Цель	Процент	Масса мишени (г)	кристаллический	аморфный
Фактическая масса (г)	Фактическая масса (г)
API	НД	Лекарственное вещество	50,00	2,500	2,5004	2,5009
MCC	PH102 NF	разбавитель	30,30	1,515	1,5152	1,5153
Лактоза	Fast-Flo 316	разбавитель	15,20	0,760	0,7603	0,7602
Натрий кроскарме-лоза	Ac-Di-Sol	разрыхлитель	3,00	0,150	0,1503	0,1498
Диоксид кремния	Cabosil	агент, способствующий скольжению	1,00	0,050	0,0502	0,0497
Mg. Стеарат	USP-NF	смазка	0,50	0,025	0,0248	0,0254
		Всего	100,00	5,000	5,0012	5,0013

Таблица 21. Подбор состава таблетки с 1: 1 MCC: крахмал, 50% лекарственная нагрузка

Компонент	класс	Цель	Процент	Масса мишени (г)	Кристаллический	аморфный
Фактическая масса (г)	Фактическая масса (г)
API	НД	Лекарственное вещество	50,00	2,500	2,4994	2,4998
MCC	PH102 NF	разбавитель	22,75	1,138	1,1385	1,1387
Предварительно желатинизированный крахмал	StarCap 1500	разбавитель	22,75	1,138	1,1385	1,1376
Натрий кроскармелоза	Ac-Di-Sol	разрыхлитель	3,00	0,150	0,1507	0,1503
Диоксид кремния	Cabosil	агент, способствующий скольжению	1,00	0,050	0,0500	0,0498
40 мг Стеарат	USP-NF	смазка	0,50	0,025	0,0252	0,0250
		Всего	100,00	5,000	5,0023	5,0012

Угол естественного откоса

Угол естественного откоса представляет собой угол, образованный горизонтальным основанием поверхности и краем конусообразной кучи гранул. Он рассчитывается по следующему уравнению:

Угол естественного откоса измеряли путем медленного высыпания приблизительно 1 г образца через воронку с внутренним диаметром 3/16 дюйма на выходе. Порошок затем падал 1 11/16", приземляясь на поверхность опрокинутой кристаллизационной чашки, на которой образовалась куча порошка. После добавления всего материала была сделана фотография. Угол между поверхностью тарелки и поверхностью кучи измеряли с помощью транспортира на изображениях. Была предпринята попытка воспроизвести одинаковые позиции и расстояния падения в системе между различными образцами.

Объемная плотность и насыпная плотность после утряски

Порошок добавляли в предварительно взвешенный 10 мл градуированный цилиндр через воронку, которая не находилась в прямом контакте с градуированным цилиндром, чтобы избежать переноса колебаний. Добавляли порошок до достижения объема 10 мл и затем взвешивали градуированный цилиндр с порошком. Объемную плотность рассчитывали по формуле Этот же образец в градуированном цилиндре встряхивали в следующей последовательности: 100, 150, 250, 250 встряхиваний. Объем измерялся после каждого интервала. Вычисленную насыпную плотность после утряски вычисляли по формуле

Индекс Карра рассчитывался по следующему уравнению:

Коэффициент Хауснера рассчитывался по следующему уравнению:

Профили сжатия

Профили сжатия создавались путем создания круглых таблеток диаметром 5/16 дюйма при пяти различных давлениях сжатия для каждой смеси. Установки пресса были следующими: 1 секунда времени задержки и 15% скорости насоса. Таблетки были созданы для всех четырех порошковых смесей с использованием сил сжатия 700 кг, 1000 кг, 1500 кг и 2000 кг. Наибольшая сила сжатия была выбрана на основе результатов предыдущих таблеток. Затем измеряли массу, размеры и разрывную нагрузку таблетки. Эти данные были построены с использованием шаблона, что позволило построить диаграмму давления сжатия относительно разрывной прочности (фиг. 39).

Результаты

Таблица 22. Эталонные значения

Характер сыпучести	Угол естественного откоса	Отношение Хауснера	Индекс прессуемости (%)
Превосходно	25-30°	1.00-1.11	≤10
Хорошо	31-35°	1.12-1.18	11-15
Неплохо	36-40°	1.19-1.25	16-20
Приемлемо	41-45°	1.26-1.34	21-25
Плохо	46-55°	1.35-1.45	26-31
Очень плохо	56-65°	1.46-1.59	32-27
Очень, очень плохо	≥66°	≥60	≥38

Результаты представлены в таблицах 23 и 24 и на фиг. 39. Согласно фармакопейной конвенции США (USP), все образцы попадают в приемлемую и очень низкую категорию сыпучести, измеряемую по углу естественного откоса. Большие углы указывают на ухудшение сыпучести. Индекс Карра (Индекс сжимаемости) и отношение Хауснера находятся в пределах между приемлемыми и очень низкими в соответствии с USP. Кристаллический API заметно отличается от аморфного API, и эти различия присутствуют во всех смесях для составов независимо от содержания аморфного или кристаллического API. Для кристаллического API, Отношение Хауснера и Индекс Карра указывают, что свойства сыпучести являются «приемлемыми». Аморфный API имеет значительно худшие свойства сыпучести, будучи отнесенным к категории «очень плохо» как для соотношения Хауснера, так и для Индекса Карра. См. таблицу 22 для соответствующих таблиц USP.

При создании таблеток для профилей прессования из кристаллических смесей API получили несколько таблеток, которые имели дефекты после выталкивания из инструмента. Смеси аморфного API, по-видимому, давали визуально лучшие таблетки, т.е. либо имели незначительные дефекты, либо не разрушались.

Таблица 23. Угол естественного откоса

Образец	θ(°)	ϕ (°)	Среднее (°)
L-ARR10-118	50,28	50,28	50,28
AR00457470-33	47,79	43,6	45,70
2:1 MCC:Лактоза L-ARR10-118	45,21	41,81	43,51
2:1 MCC:Лактоза AR00457470-33	41,01	42,64	41,83
1:1 MCC:Крахмал L-ARR10-118	39,52	41,01	40,27
1: 1 MCC: Крахмал AR00457470-33	40,44	48,59	44,52

* θ и ϕ - углы по обе стороны пирамиды (2D).

Таблица 24. Объемная плотность и насыпная плотность после утряски

Образец	Объемная Плотность (мг/мл)	Насыпная Плотность после утряски (мг/мл)	Карра Индекс	Отношение Хауснера
L-ARR10-118	594,8	762,6	22%	1,28
AR00457470-33	423,6	622,9	32%	1,47
2:1 MCC:Лактоза L-ARR10-118	435,3	621,9	30%	1,43
2:1 MCC:Лактоза AR00457470-33	408,1	583,0	30%	1,43
1:1 MCC:Крахмал L-ARR10-118	437,9	625,5	30%	1,43
1:1 MCC:Крахмал AR00457470-33	411,4	605,0	32%	1,47

Заключение по порошковым свойствам

По углу естественного откоса смеси композиций кристаллической формы (I-HS), аморфные API и аморфные составы рецептур API имеют «очень плохие» характеристики сыпучести. Однако по индексу Карра и отношению Хауснера кристаллический API, кристаллическая форма (I-HS), обладает «приемлемыми» характеристиками сыпучести. Значительно лучшие свойства сыпучести являются преимуществом при разработке и изготовлении твердой пероральной лекарственной формы. Также не было большой разницы в профиле сжатия обеих смесей с обоими партиями порошка. Это указывает на то, что гидросульфат (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)-пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида, будь то аморфный или кристаллический, не оказывает положительного или отрицательного влияния на сыпучесть смесей при 50% -ной нагрузке лекарственного средства.

Часть третья: стабильность AM(HS)1 и кристаллической формы (I-HS)

Аликвоты порошка АМ(HS)1 и кристаллической формы (I-HS) помещали в незакрытые (открытые) 20 мл сцинтилляционные флаконы и помещали в мешок LDPE, помещенный в камеру стабильности, поддерживаемую при 40°С/75 % RH в течение пяти недель. После удаления из камеры образцы были физически охарактеризованы по внешнему виду, KF, TGA, DSC, XRD и PLM. Образцы также анализировали с помощью HPLC для хроматографической чистоты, хиральной целостности и активности. В соответствующих случаях данные, представленные в части стабильности, также включают исходные данные T = 0 для целей сравнения. Данные можно увидеть в таблицах 25-29 и на фиг. 40-44.

Таблица 25. Внешний вид образцов, исследуемых на стабильность

Соединение	Состояние	Временная точка (недели)	Внешний вид	Munsell #
AM(HS)1	НД	0	Желтый порошок без агрегатов	7.5Y 9/10
AM(HS)1	40°C/75% RH	5	Оранжевый порошок некоторых агрегатов	2.5YR 7/10
Кристаллическая форма (I-HS)	НД	0	Оранжевый порошок без агрегатов	2.5YR 7/10
Кристаллическая форма (I-HS)	40°C/75% RH	5	Оранжевый порошок без агрегатов	2.5YR 7/10

Таблица 26. TGA и KF образцов, исследуемых на стабильность

Соединение	Состояние	Временные точки (недели)	Термогравиметрический анализ	KF (масс./масс.%)
Старт (°С)	Стоп (°С)	Изменение (%)
AM(HS)1	НД	0	24,78	111,94	3,78	2,00
111,94	186,94	3,09
AM(HS)1	40°C/75% RH	5	36,27	217,16	5,32	0,56
Кристаллическая форма (I-HS)	НД	0	23,77	218,58	6,01	0,28
Кристаллическая форма (I-HS)	40°C/75% RH	5	36,66	217,87	6,00	0,21

Таблица 27. DSC образцов, исследуемых на стабильность

Cmpd	Состояние	Временные точки (недели)	Дифференциальная сканирующая калориметрия
Тип	Старт (°С)	Начало (°С)	Максимум (°С)	Стоп (°С)	ΔH (Дж/г)
AM(HS)1	НД	0	эндотерм	28,7	29,9	68,3	115,8	153,7
AM(HS)1	НД	0	эндотерм	124,1	126,1	152,8	191,0	58,3
эндотерм	204,7	205,6	211,2	220,1	7,5
AM(HS)1	40°C/75% RH	5	эндотерм	182,7	196,7	206,3	217,7	95,9
Кристаллическая форма (I-HS)	НД	0	эндотерм	181,9	193,7	204,6	213,8	98,9
Кристаллическая форма (I-HS)	40°C/75% RH	5	эндотерм	181,3	193,4	204,1	214,1	99,4

Таблица 28. Данные ВЭЖХ образцов, исследуемых на стабильность

Соединение	Состояние	Временные точки (недели)	Всего примесей (%)	Анализ (%)	Хиральная активность (%)
AM(HS)1	НД	0	1,10	79,5	99,6
AM(HS)1	40°C/75% RH	5	1,16	80,3	99,6
Кристаллическая форма (I-HS)	НД	0	0,14	79,4	99,6
Кристаллическая форма (I-HS)	40°C/75% RH	5	0,07	79,6	99,6

Таблица 29. Данные ВЭЖХ: процентное содержание пиковой площади по RRT образцов, исследуемых на стабильность

Образец	Состояние	Временные точки (недели)	RRT
0,793	0,863	0,981	1,000	1,535
AM(HS)1	НД	0	1,10	79,5	99,6	0	1,10
40°C/75% RH	5	1,16	80,3	99,6	5	1,16
Кристаллическая форма (I-HS)	НД	0	0,14	79,4	99,6	0	0,14
40°C/75% RH	5	0,07	79,6	99,6	5	0,07

Выводы о стабильности

Аморфное соединение AM(HS)1 не было стабильным в условиях увлажнения и имело тенденцию к кристаллизации в течение определенного периода времени. Об этом свидетельствует разжижение образцов, оставшихся в камерах влажности, и измененный внешний вид как на глаз, так и при поляризованной световой микроскопии (данные не показаны). Аморфный материал переходит от свободно сыпучего желтого порошка к оранжевому агломерированному несыпучему порошку. Поляризованная световая микроскопия, XRPD, DSC, TGA и KF аморфного API также значительно изменились в ходе исследования ускоренной стабильности, чтобы стать той же полиморфной формой, что и кристаллическая форма (I-HS). Паттерн XRPD аморфного соединения AM(HS)1 трансформируется в паттерн XRPD кристаллической формы (I-HS) в ходе ускоренного исследования стабильности. Поляризованная световая микроскопия идет от не двулучепреломляющей до двулучепреломляющей при кросс-поляризованном свете, что свидетельствует об изменении от аморфного к кристаллическому API. DSC при t = 0 имеет два эндотермических события с максимумами расплава при 68,3°C и 152,8°C, которые исчезают в момент времени t = 5 недель. Остается только одно эндотермическое событие для аморфного материала с максимумом расплава при 206°C. Этот максимум расплава соответствует термографическому профилю кристаллического API. Профиль TGA аморфного материала при t = 5 недель также изменялся в соответствии с профилем и потерей массы кристаллического API. Кристаллическая форма (I-HS) не демонстрировала гигроскопичности и не меняла цвет, морфологию или кристалличность после хранения в ускоренных условиях.

Химическая чистота API не претерпела существенных изменений в ходе исследования стабильности AM(HS)1 или кристаллической формы (I-HS). Однако профили примесей аморфной и кристаллической формы (I-HS) существенно различаются. Аморфный материал содержит значительно более высокие уровни примесей (таблицы 22 и 23) в сравнении с кристаллической формой (I-HS). Считается, что сниженное количество примесей в кристаллической форме (I-HS) в сравнении с аморфным AM(HS)1 при относительном времени удерживания (RRT) 0,863 (0,00% по сравнению с 0,98%) и 1,535 (0,00% против 0,12%), как предполагается, обусловлено выделением кристаллической формы (I-HS) посредством процесса кристаллизации, который устраняет эти примеси и превосходит способ выделения аморфного AM(HS)1. Аморфный процесс выделения AM(HS)1, по-видимому, не эффективно устраняет эти примеси.

Общий обзор исследования

1. Кристаллическая форма (1-HS) обладает лучшими свойствами сыпучести в сравнении с аморфной формой AM(HS). Различия в свойствах сыпучести улучшают разработку кристаллической формы (I-HS) в виде твердой пероральной лекарственной формы относительно AM(HS).

2. Исследование стабильности в мешке LDPE при 40°С/75% относительной влажности в течение пяти недель не показало существенных изменений в уровнях химических примесей для обеих форм соединения. Однако оно показало, что кристаллическая форма (I-HS) не имела существенного изменения в своих физико-химических свойствах в ходе исследования. Напротив, AM(HS), преобразованная в кристаллическую форму, по существу похожа на кристаллическую форму (I-HS) согласно XRPD, DSC, TGA, KF и поляризованной световой микроскопии. Кроме того, AM(HS) превращался в агломерированный порошок с ухудшенными свойствами сыпучести в течение испытания на стабильность. Изменение свойств аморфного АМ (HS) в кристаллический материал и/или агломерированный порошок с ухудшенной сыпучестью при хранении AM(HS) сделало бы невозможным изготовление твердой пероральной лекарственной формы для применения пациента на основе аморфного соединения.

3. AM(HS) разжижается при воздействии влажности. Это потребует значительных мер предосторожности при хранении и изготовлении для предотвращения этого явления, в то время как кристаллическая форма (I-HS) не требует таких предосторожностей при изготовлении кристаллической формы (I-HS) и любого твердого перорального дозированного продукта, полученного в кристаллической форме (I-HS).

4. Кристаллическая форма (I-HS) обеспечивает значительно улучшенный профиль примесей по сравнению с AM(HS). Возможность контроля профиля примесей важна для безопасности пациентов и требуется регулирующими органами.

Пример 11

Кристаллическая форма (I-HS) уменьшает рост опухолей, характеризуемых экспрессией химерного белка Trk

Был проведен ряд экспериментов для определения того, будет ли кристаллическая форма (I-HS) ингибировать рост трех различных опухолевых ксенотрансплантатов (человеческих) у мышей, при этом каждая опухоль ксенотрансплантата получена из линии злокачественных опухолевых клеток. Три различные линии злокачественных опухолевых клеток, клеточная линия CUTO-3F, клеточная линия KM12 и клеточная линия MO-91, каждая из которых экспрессирует различные химеры гена Trk. Как описано в примере 7, клеточная линия CUTO-3F получена у пациента с аденокарциномой легкого, несущей генную химеру MPRIP-NTRK1, клеточная линия KM12 представляет собой клеточную линию колоректального рака, несущую химеру TPM3-NTRK1 (Vaishnavi et al., Nature Med. 19: 1469-1472, 2013), и клеточная линия MO-91 получена у пациента с острым миелоидным лейкозом, несущим химеру ETV6-NTRK3 (Taipale et al., Nature Biotech. 31:630-637, 2013). После имплантации одного из этих трех различных (человеческих) опухолевых ксенотрансплантатов в мышей наблюдалось изменение объема каждой опухоли. Полученных мышей обрабатывали носителем или им перорально вводили суточную дозу 60 мг/кг или 200 мг/кг кристаллической формы (I-HS) (фиг. 45-47, соответственно) после имплантации ксенотрансплантата.

Эти данные показывают, что введение кристаллической формы (I-HS) способно эффективно останавливать рост или уменьшать скорость роста опухолей человека, характеризующихся экспрессией онкогенного химерного белка Trk у млекопитающего.

Несмотря на то, что вышеприведенное описание раскрывает принципы настоящего изобретения с примерами, представленными с целью иллюстрации, будет понятно, что практическое осуществление изобретения охватывает все обычные варианты, адаптации и/или модификации, которые входят в сферу действия представленной ниже формулы изобретения и ее эквивалентов.

Список литературы:

1. Wiesner et al., Nature Comm. 5:3116, 2014.

2. Vaishnavi et al., Nature Med. 19:1469-1472, 2013.

3. Greco et al., Mol. Cell. Endocrinol. 28:321, 2010.

4. Kim et al., PloS ONE 9(3):e91940, 2014.

5. Vaishnavi et al., Nature Med. 19:1469-1472, 2013.

6. Fernandez-Cuesta et al., “Cross-entity mutation analysis of lung neuroendocrine tumors sheds light into their molecular origin and identifies new therapeutic targets,” AACR Annual Meeting 2014, Abstract, April 2014.

7. Stransky et al., Nature Comm. 5:4846, 2014.

8. Ross et al., Oncologist 19:235-242, 2014.

9. Doebele et al., J. Clin. Oncol. 32:5s, 2014.

10. Jones et al., Nature Genetics 45:927-932, 2013.

11. Wu et al., Nature Genetics 46:444-450, 2014.

12. WO 2013/059740

13. Zheng et al., “Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing,” Nature Med., published online on November 10, 2014.

14. Caria et al., Cancer Genet. Cytogenet. 203:21-29, 2010.

15. Frattini et al., Nature Genet. 45:1141-1149, 2013.

16. Martin-Zanca et al., Nature 319:743, 1986.

17. Meyer et al., Leukemia 21: 2171-2180, 2007.

18. Reuther et al., Mol. Cell. Biol. 20:8655-8666, 2000.

19. Marchetti et al., Human Mutation 29(5):609-616, 2008.

20. Tacconelli et al., Cancer Cell 6:347, 2004.

21. Walch et al., Clin. Exp. Metastasis 17: 307-314, 1999.

22. Papatsoris et al., Expert Opin. Invest. Drugs 16(3):303-309, 2007.

23. Van Noesel et al., Gene 325: 1-15, 2004.

24. Zhang et al., Oncology Reports 14: 161-171, 2005.

25. Truzzi et al., J. Invest. Dermatol. 128(8):2031, 2008.

26. Kolokythas et al., J. Oral Maxillofacial Surgery 68(6):1290-1295, 2010.

27. Ni et al., Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 13:1511, 2012.

1. Кристаллическая форма (I-HS), имеющая формулу:

которая имеет дифракционные пики XRPD (градусы 2θ) при 18,4±0,2, 29,7±0,2, 23,1±0,2 и 24,9±0,2.

2. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет дифракционные пики XRPD (градусы 2θ) при 19,7±0,2, 18,4±0,2, 29,7±0,2, 23,1±0,2 и 24,9±0,2.

3. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет дифракционные пики XRPD (градусы 2θ) при 10,7±0,2, 18,4±0,2, 19,2±0,2, 29,2±0,2, 20,7±0,2, 21,5±0,2, 23,1±0,2 и 24,0±0,2.

4. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет дифракционные пики XRPD (градусы 2θ) при 19,7±0,2, 15,3±0,2, 16,5±0,2, 18,4±0,2, 19,2±0,2, 19,9±0,2, 29,2±0,2, 29,7±0,2, 21,5±0,2, 22,1±0,2, 23,1±0,2, 24,9±0,2, 24,4±0,2, 25,6±0,2, 26,5±0,2, 27,6±0,2, 28,2±0,2, 28,7±0,2, 39,8±0,2 и 38,5±0,2.

5. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет спектр XRPD по существу, как показано на фиг. 29.

6. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет теплоту плавления около 2,415 мВт, что измеряется дифференциальной сканирующей калориметрией.

7. Кристаллическая форма по п. 1, которая имеет DSC-термограмму по существу, как показано на фиг. 26.

8. Кристаллическая форма по п. 1, которая является негигроскопичной, демонстрирует менее 2% прироста массы при 25°С и 89% относительной влажности через 24-48 часов при определении методом динамической сорбции пара.

9. Фармацевтическая композиция для ингибирования Trk, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, полученная смешиванием кристаллической формы по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемого носителя.

11. Способ получения фармацевтической композиции для ингибирования Trk, включающий смешивание терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемого носителя.

12. Способ лечения Trk-ассоциированной злокачественной опухоли, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

13. Способ лечения злокачественной опухоли, опосредованной Trk-киназой у нуждающегося в этом субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

14. Способ по п. 13, где злокачественная опухоль опосредуется TrkA.

15. Способ по п. 13, где злокачественная опухоль опосредуется TrkB.

16. Способ по п. 13, где злокачественная опухоль опосредуется TrkA и TrkB.

17. Способ лечения пациента, диагностированного или идентифицированного как имеющего Trk-ассоциированную злокачественную опухоль, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

18. Способ лечения злокачественной опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий:

(a) определение, связана ли злокачественная опухоль с одной или несколькими из числа сверхэкспрессии, активации, амплификации и мутации Trk-киназы; и

(b) если определено, что злокачественная опухоль ассоциирована с одной или несколькими из числа сверхэкспрессии, активации, амплификации и мутации Trk-киназы, введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

19. Способ лечения злокачественной опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий:

(a) определение, опосредуется ли злокачественная опухоль Trk-киназой; и

(b) если определено, что злокачественная опухоль опосредуется Trk-киназой, введение субъекту терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

20. Способ лечения субъекта, включающий:

(a) проведение анализа на образце, полученном у субъекта для того, чтобы определить, имеет ли субъект нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk, или его экспрессии, или уровня; и

(b) введение субъекту, который, как определено, имеет нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии, или активности, или уровня, терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пп. 1-8.

21. Способ по п. 18 или 20, в котором нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии, или уровня является трансляцией хромосомы, которая приводит к трансляции химерного белка Trk.

22. Способ по п. 21, в котором химерный белок Trk выбирают из группы, включающей TP53-TrkA, LMNA-TrkA, CD74-TrkA, TFG-TrkA, ТРМ3-TrkA, NFASC-TrkA, ВСAN-TrkA, MPRIP-TrkA, TPR-TrkA, RFWD2-TrkA, IRF2BP2-TrkA, SQSTM1-TrkA, SSBP2-TrkA, RABGAP1L-TrkA, C18ORF8-TrkA, RNF213-TrkA, TBC1D22A-TrkA, C20ORF112-TrkA, DNER-TrkA, ARHGEF2-TrkA, CHTOP-TrkA, PPL-TrkA, PLEKHA6-TrkA, PEAR1-TrkA, MRRL24-TrkA, MDM4-TrkA, LRRC71-TrkA, GRIPAP1-TrkA, EPS15-TrkA, DYNC2H1-TrkA, CEL-TrkA, EPHB2-TrkA, TGF-TrkA, NACC2-TrkB, QKI-TrkB, AFAPl-TrkB, PAN3-TrkB, SQSTM1-TrkB, TRIM24-TrkB, VCL-TrkB, AGBL4-TrkB, DAB2IP-TrkB, ETV6-TrkC, BTBD1-TrkC, LYN-TrkC, RBPMS-TrkC, EML4-TrkC, HOMER2-TrkC, TFG-TrkC, FAT1-TrkC и TEL-TrkC.

23. Способ по п. 18 или 21, в котором нарушение регуляции гена NTRK, белка Trk, или их экспрессии, или активности представляет собой одну или несколько точечных мутаций в гене.

24. Способ по п. 23, в котором ген NTRK представляет собой ген NTRK1, и одна или несколько точечных мутаций в гене NTRK1 приводят к трансляции белка TrkA, имеющего замены, которые представляют собой одно или несколько из следующих положений аминокислот: 33, 336, 337, 324, 420, 444, 517, 538, 649, 682, 683, 702 и 1879.

25. Способ по п. 24, в котором одна или несколько точечных мутаций в гене NTRK1 приводят к трансляции белка TrkA, имеющего одну или несколько из следующих аминокислотных замен: R33W, А336Е, А337Т, R324Q, R324W, V420M, R444Q, R444W, G517R, G517V, К538А, R649W, R649L, R682S, V683G, R702C и С1879Т.

26. Способ получения кристаллической формы (I-HS) по п. 1, включающий:

(а) добавление концентрированной серной кислоты к раствору (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидина-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида в EtOH с образованием гидросульфатной соли (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[l,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(b1) внесение затравки в раствор со стадии (а) с использованием гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида при комнатной температуре и перемешивание раствора до образования суспензии;

(b) добавление гептана к раствору со стадии (b1);

(c) фильтрование суспензии с целью выделения гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(d) смешивание указанного гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида с 5:95 масс./масс. раствором воды/2-бутанона;

(e) нагревание смеси со стадии (d) при 65-70°С при перемешивании до тех пор, пока массовый процент этанола не будет составлять около 0,5%, для образования суспензии кристаллической формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида; и

(f) выделение кристаллической формы гидросульфата (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида путем фильтрования.

27. Способ получения кристаллической формы (I-HS) по п. 1, включающий:

(a) добавление концентрированной серной кислоты к раствору (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)-пиразоло[1,5-а]пиримидина-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида в EtOH с образованием гидросульфатной соли (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида;

(b) добавление метил трет-бутилового эфира (МТВЕ) к раствору со стадии (а) до образования твердого вещества;

(d) кипячение раствора со стадии (с) с обратным холодильником до тех пор, пока твердое вещество не растворится;

(e) охлаждение раствора со стадии (d) до комнатной температуры до образования твердого вещества с последующим охлаждением до около 5°С; и

Настоящее изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли и стереоизомеру, где R1, R2, X, Y, Р, W и Ar являются такими, как определено в формуле изобретения.

Кристалл (6s,9as)-n-бензил-8-({ 6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил} метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2h-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6h)-карбоксамида // 2723551

Изобретение относится к кристаллическому (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамиду, который характеризуется дифракционными пиками при угле дифракции (2θ±0,2°) 5,8°, 6,4°, 8,0°, 10,1°, 12,8°, 14,2°, 16,0°, 18,9°, 19,7° и 23,1° согласно измерению с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

Производные хромена в качестве ингибиторов фосфоинозитид-3-киназ // 2722383

Изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. В формуле (I) R1 и R2 оба представляют собой Н или объединены с образованием оксогруппы (=O); R3 и R4, одинаковые или разные, в каждом случае независимо выбраны из группы, состоящей из Н и (С1-С6)алкила; R5 выбран из группы, состоящей из фенила и гетероарила с 5 кольцевыми атомами, в котором один кольцевой атом представляет собой гетероатом S, где гетероарил замещен одной группой, выбранной из (C1-C6)гидроксиалкила, диметиламинометила, (4-метилпиперазин-1-ил)метила; Z отсутствует или представляет собой NH; Су представляет собой моно- или бициклический гетероарил с 5-9 кольцевыми атомами, в котором два-четыре кольцевых атома представляют собой гетероатом N, где этот гетероарил возможно замещен двумя группами, выбранными независимо из -CN, NR10R11, фенила и гетероарила, представляющего собой пиридинил; где указанные фенил и гетероарил в свою очередь дополнительно возможно и независимо замещены одной или двумя группами, выбранными из галогена, -OH, -CN; и где указанный гетероарил дополнительно возможно замещен группой 2,2,2-трифторэтан-1-ол; где R10, R11 выбраны из группы, состоящей из H.

Модифицированные цитотоксины и их терапевтическое применение // 2721949

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) где A2 представляет собой фрагмент паклитаксела; -X2-X1-A1 представляет собой -C(=O)-(CH2)n1-C(=O)-OH, где n1 представляет собой целое число от 12 до 24; или -X2-X1-A1 представляет собой -C(=O)-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-C(=O)-OH.

Производные хинолона как ингибиторы рецептора фактора роста фибробластов // 2721723

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (III) и/или к его фармацевтически приемлемой соли, где J представляет собой N; J’ представляет собой CR1, где R1 представляет собой водород; Ar представляет собой фенил, замещенный тремя или четырьмя заместителями, независимо выбранными из С1-С6 алкокси и галогена; R2 представляет собой С1-С6 алкил, С2-С6 алкинил, галоген-С1-С6 алкил, С3-С6 циклоалкил, необязательно замещенный гидрокси-группой; С3-С6 циклоалкил-С1 алкил, гидрокси-С1-С6 алкил, С1-С6 алкокси-С1-С6 алкил, С4-С6 гетероциклил, содержащий один гетероатом, выбранный из O; или С5-С6 гетероциклил-С1-С2 алкил, содержащий один или два гетероатома, выбранных из N или O; Q представляет собой С1-С3 алкилен или С1-С3 алкилен замещенный двумя метилами; и X представляет собой группу формулы (a), где R3 представляет собой водород или С1-С6 алкил; и R4 представляет собой водород или С1-С6 алкил; Y представляет собой –CO-; Rc представляет собой водород или С1-С6 алкил; и Rd представляет собой водород.

Метил 2,3,8-триоксо-4-фенилтетрагидро-6н-пиразоло[1,2-а]пирроло[2,3-c]пиразол-9а(1н)-карбоксилаты // 2721684

Изобретение относится к области органической химии и фармакологии. Предложены новые биологически активные индивидуальные соединения класса пиразоло[1,2-а]пирроло[2,3-с]пиразолов, а именно метил 2,3,8-триоксо-4-фенилтетрагидро-6H-пиразоло[1,2-а]пирроло[2,3-с]пиразол-9а(1H)-карбоксилаты, которые получают взаимодействием 1H-пиррол-2,3-дионов (I) с азометинимином (II) в соотношении 1:1 в среде растворителя при комнатной температуре, с последующим выделением целевых продуктов.

Зонды визуализации белка гентингтина // 2721419

Изобретение относится к радиофармацевтическому средству, включающему соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль. В формуле I: m равно 0, 1 или 2; n равно 1 или 2; J представляет C(=O) или -CH2-; X представляет собой S или N; Y представляет CH или N; Z представляет CH; W представляет N или S; каждый R1 независимо выбран из галогена, С1-6 алкокси, гидроксильной группы, С6-12 арила, 5-10-членного гетероарила, содержащего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, С3-10 циклоалкокси или С1-6 алкила, где каждый С1-6 алкокси, С3-10 циклоалкокси, С1-6 алкил, С6-12 арил или 5-10-членный гетероарил является необязательно замещенным одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С1-6 алкокси, С2-6 алкенила, -NR4R5, галогена или 5-10-членного гетероарила, содержащего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, необязательно замещенного одним - тремя С1-6 алкокси; R2 представляет водород или С1-6 алкил; и R3 представляет С1-6 алкил, С6-12 арил, аралкил, 3-10-членный гетероциклоалкил, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, 3-10-членный гетероциклоалкенил, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, 5-10-членный гетероарил или гетероаралкил, каждый из которых является необязательно замещенным одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из гидроксильной группы, С1-6 алкокси, необязательно замещенного С1-6 алкокси или галогеном, С1-6 алкила, необязательно замещенного галогеном, галогена, 5-10-членного гетероарила, содержащего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, -(CH2)tNR4R5, оксо, циано или -C(O)-NR4R5, или R2 и R3 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-10-членное гетероциклоалкильное кольцо, необязательно замещенное одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из гидроксильной группы, С1-6 алкокси, С1-6 алкила, галогена или -C(O)-NR4R5; t равно 0, 1 или 2; R4 независимо выбран из водорода или С1-6 алкила; R5 независимо выбран из водорода или С1-6 алкила.

Содержащее оксимную группу конденсированное гетероциклическое соединение или его соль, сельскохозяйственный и садовый инсектицид, содержащий данное соединение, и способ применения данного инсектицида // 2721119

Изобретение относится к конденсированному гетероциклическому соединению, представленному общей формулой (1) и к его применимой в сельском хозяйстве соли. В общей формуле (1) R1 представляет собой (C1-C6) алкильную группу; R2 представляет собой атом водорода, (C1-C6) алкильную группу, галоген (C1-C6) алкильную группу, аминогруппу, цианогруппу, (C1-C6) алкоксикарбонильную группу, аминокарбонильную группу, моно-(C1-C6) алкиламинокарбонильную группу или ди-(C1-C6) алкиламинокарбонильную группу; R3 представляет собой атом водорода, (C1-C6) алкильную группу, (C2-C6) алкенильную группу, (C2-C6) алкинильную группу, (C3-C6) циклоалкильную группу, (C3-C6) циклоалкил (C1-C6) алкильную группу, (C1-C6) алкокси (C1-C6) алкильную группу, галоген (C1-C6) алкильную группу, галоген (C2-C6) алкенильную группу, фенильную группу, фенил (C1-C6) алкильную группу, (C1-C6) алкилкарбонильную группу, (C3-C6) циклоалкилкарбонильную группу, цианоалкильную группу, (C1-C6) алкилтио (C1-C6) алкильную группу, (C1-C6) алкилсульфинил (C1-C6) алкильную группу, (C1-C6) алкилсульфонил (C1-C6) алкильную группу, галоген (C1-C6) алкилтио (C1-C6) алкильную группу, галоген (C1-C6) алкилсульфинил (C1-C6) алкильную группу или галоген (C1-C6) алкилсульфонил (C1-C6) алкильную группу; R4 представляет собой галоген (C1-C6) алкильную группу, галоген (C1-C6) алкоксигруппу, (C1-C6) алкилтиогруппу, (C1-C6) алкилсульфинильную группу, (C1-C6) алкилсульфонильную группу, галоген (C1-C6) алкилтиогруппу, галоген (C1-C6) алкилсульфинильную группу или галоген (C1-C6) алкилсульфонильную группу; A представляет собой атом азота, конденсированный гетероциклический кольцевой фрагмент, представленный следующей формулой (1C): представлен следующими формулами (1c1), (1c2), (1c3), (1c4), (1c5) или (1c6): где R5 представляет собой (C1-C6) алкильную группу, m представляет собой 0, 1 или 2 и n представляет собой 1.

Замещенные амино шестичленные насыщенные гетероалициклы в качестве ингибиторов dpp-iv длительного действия // 2720488

Изобретение относится к соединениям формулы (V), фармацевтической композиции, а также к применению в лечении заболевания и/или предупреждению заболеваний и нарушений, при которых полезно ингибирование DPP-IV.

Способ получения ингибиторов atr киназы (варианты) // 2720408

Изобретение относится к способу получения соединения формулы I-1, включающему стадии: a) взаимодействия соединения формулы 6a* с соединением формулы 27 при соответствующих условиях образования амидной связи, где соответствующие условия для образования амидной связи включают взаимодействие соединения формулы 6a* с соединением формулы 27 в апротонном растворителе при нагреве, с образованием соединения формулы 28; b) очистки соединения формулы 28 с использованием соответствующего хелатирующего агента для палладия, выбранного из пропан-1,2-диамина; этан-1,2-диамина; этан-1,2-диамина; пропан-1,3-диамина; тетраметилэтилендиамина; этиленгликоля; 1,3-бис(дифенилфосфанил)пропана; 1,4-бис(дифенилфосфанил)бутана и 1,2-бис(дифенилфосфанил)этан/Pr-1,2-диамина; c) взаимодействия соединения формулы 28 при соответствующих условиях снятия защиты, где соответствующие условия снятия защиты включают взаимодействие соединения формулы 28 с кислотой в присутствии растворителя, с образованием соединения формулы 30; d) взаимодействия соединения формулы 30 с соединением формулы 25 при соответствующих условиях образования амидной связи, где соответствующие условия для образования амидной связи включают взаимодействие соединения формулы 30 с соединением формулы 25 в присутствии партнера для образования амидной связи, апротонного растворителя и основания, с образованием соединения формулы I-1.

Соединение-ингибитор мультикиназ и его кристаллическая форма и применение // 2723985