Вакцины против fmdv на основе рекомбинантного аденовирусного вектора и их применение

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для вызова иммунного ответа у животного против FMDV, включающая эффективное количество рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего антиген вируса ящура (FMDV), причем антиген FMDV содержит полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант, или наполнитель охватывает вакцины или композиции против FMDV. Кроме того, описан способ вакцинации указанной композицией. Изобретение может быть использовано для защиты животных, в частности овец, коров, коз или свиней, от FMDV. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 табл., 8 пр., 15 ил.

 

Это изобретение было осуществлено при государственной поддержке. Правительство имеет определенные права на это изобретение.

Перекрестная ссылка на связанные заявки

Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки США 62/288540, поданной 29 января 2016 года

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с инфекцией вируса ящура (FMDV) у животных. Настоящее раскрытие содержит фармацевтические композиции, содержащие антиген FMDV, способы вакцинации против FMDV и наборы для применения с такими способами и композициями.

Предшествующий уровень техники

Ящур (FMD) является одним из самых опасных и заразных заболеваний, влияющих на сельскохозяйственных животных. Эта болезнь является эндемичной во многих странах мира, особенно в Африке, Азии и Южной Америке. Кроме того, эпидемические вспышки могут происходить периодически. Наличие этого заболевания в стране может иметь очень серьезные экономические последствия в результате потери производительности, потери массы и выработки молока у инфицированных стад, и от торговых эмбарго, введенных в отношении этих стран. Меры, принимаемые в отношении этого заболевания, включают строгое применение ограничений на импорт, контроль гигиены и карантин, убой больных животных и программы вакцинации с применением вакцин либо в качестве профилактической меры на национальном или региональном уровне, либо периодически, когда происходит эпидемическая вспышка.

FMD характеризуется коротким периодом инкубации, чрезвычайно заразной природой, образованием язв во рту и на ногах, а иногда и смертью молодых животных. FMD поражает ряд видов животных, в частности, крупный рогатый скот, свиней, овец и коз. Агент, ответственный за это заболевание, представляет собой вирус на основе рибонуклеиновой кислоты (РНК), принадлежащий к роду Aphthovirus семейства Picornaviridae (Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). В настоящее время известно как минимум семь типов вируса ящура (FMDV): европейские типы (A, O и C), африканские типы (SAT1, SAT2 и SAT3) и азиатский тип (Asia 1), Также различают многочисленные подтипы (Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).

FMDV представляет собой безоболочечный икосаэдрический вирус диаметром около 25 нм, содержащий одноцепочечную молекулу РНК, состоящую из около 8500 нуклеотидов, с положительной полярностью. Эта молекула РНК содержит единственную открытую рамку считывания (ORF), кодирующую один полипротеин, содержащий, среди прочего, предшественник капсида, также известный как белок P1 или P88. Белок Р1 миристилирован на его аминоконце. Во время процесса созревания белок P1 расщепляется протеазой 3C на три белка, известные как VP0, VP1 и VP3 (или 1AB, 1D и 1C соответственно, Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). В вирионе белок VP0 затем расщепляется на два белка: VP4 и VP2 (или 1A и 1B, соответственно). Механизм конверсии белков VP0 в VP4 и VP2 и для образования зрелых вирионов неизвестен. Протеины VP1, VP2 и VP3 имеют молекулярную массу около 26000 Да, тогда как белок VP4 меньше, около 8000 Да.

Простая комбинация капсидных белков образует молекулу протомера или 5S, которая является элементарной составляющей капсида FMDV. Этот протомер затем объединяется в пентамер с образованием молекулы 12S. Вирион является результатом инкапсулирования молекулы геномной РНК путем сборки двенадцати пентамеров 12S, с образованием, таким образом, частицы 146S. Вирусный капсид также может образовываться без присутствия внутри него молекулы РНК (далее «пустой капсид»). Пустой капсид также обозначается как частица 70S. Образование пустых капсидов может происходить естественным образом во время репликации вируса или может быть произведено искусственно путем химической обработкой.

Некоторые исследования были проведены на естественных пустых капсидах. В частности, Rowlands et al. (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238) показали, что вирионы ящура A10 включают в основном четыре белка VP1, VP2, VP3 и VP4. Для сравнения, натуральные пустые капсиды (не полученные рекомбинацией, но очищенные из культур вируса ящура A10) по существу содержат нерасщепленный белок VP0; идентичные результаты с вирусом ящура A-Pando описаны Rweyemamu (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79). Искусственные пустые капсиды, полученные после диализа в присутствии Tris-EDTA и после центрифугирования, не содержат белка VP4. Эти искусственные капсиды слегка иммуногенны в соответствии с Rowlands et al., а естественные пустые капсиды иммуногенны только после обработки формальдегидом для их стабилизации, при этом антительный ответ, вызванный естественными пустыми капсидами у морской свинки тем не менее непостоянен, как отмечено автором. Кроме того, Rowlands et al. и Rweyemamu et al. не согласны с необходимостью стабилизации естественных пустых капсидов. У Rweyemamu et al. отсутствие обработки формальдегидом не наносит ущерба уровню антигенности естественных пустых капсидов. Иммуногенность тестировалась только путем индукции нейтрализующих антител у морской свинки.

Экспрессию гена, кодирующего предшественник Р1 капсидных белков с помощью рекомбинантного бакуловируса в клетках насекомых сравнивали с экспрессией гена, кодирующего Р1, связанный с протеазой 3C в E. coli (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829, Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580). Совместная экспрессия P1 и 3C в E. coli приводит к сборке пустых капсидов 70S. Продукт экспрессии этих двух конструкций продуцирует нейтрализующие антитела у морских свинок и свиней. Титры, полученные с конструкцией P1/бакуловирус, являются низкими. Эти же продукты экспрессии индуцируют частичную защиту у свиней. Однако некоторые свиньи, защищенные от этого заболевания, не защищены от репликации вируса провокационной пробы. Однако система экспрессии E. coli не миристилирует белки, а протеаза 3C токсична для этой клетки. Lewis et al. пришли к выводу, что фундаментальные вопросы, связанные с составом вируса и структурой капсида, необходимые для получения максимальной защиты у животного, не получили ответа. Кроме того, Grubman et al. утверждают, что необходимо было стабилизировать пустые капсиды до создания вакцины; на этом этапе они согласны с наличием проблем, возникающих с пустыми капсидами, полученных экстракцией из вирусных культур (см. выше).

Слитые белки, содержащие часть или весь белок Р1, также были получены с помощью вирусных векторов, а именно вируса герпеса или вируса осповакцины. CA-A-2,047,585, в частности, описывает вирус герпеса крупного рогатого скота, используемый для получения слитых белков, содержащих пептидную последовательность вируса ящура (аминокислоты с 141 по 158 из P1, связанные с аминокислотами с 200 по 213 из P1), слитую с гликопротеином gpIII этого вируса герпеса крупного рогатого скота. Аденовирусный вектор использовался для экспрессии пустого вирусного капсида FMDV (US8323663). Вирусные векторы также использовались для экспрессии стабилизированного пустого капсида FMDV (US 7531182, USSN14/863,181). Недавно в качестве источника для выработки антигенов FMDV были исследованы растительные клетки и клетки насекомых (US 2011/0236416, USSN14/863181).

Сообщалось, что антитела, полученные от матери (MDA), способны ингибировать ответные реакции телят (до 2 лет) на вакцинацию против ящура (Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256; Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122).

Сущность изобретения

Предлагаются композиции или вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы, экспрессирующие полипептид FMDV и их фрагменты и варианты. Антигены и фрагменты FMDV и их варианты обладают иммуногенными и защитными свойствами. Рекомбинантные вирусные векторы могут быть аденовирусными векторами, экспрессирующими антигены FMDV.

Рекомбинантные вирусные векторы могут быть составлены в виде вакцин и/или фармацевтических композиций. Такие вакцины или композиции могут быть использованы для вакцинации животного и обеспечения защиты от гомологичных и гетерологичных штаммов FMDV. Вакцины или составы, составленные с применением фармацевтически или ветеринарно приемлемых носителя, эксципиента, адъюванта или несущей среды обеспечивают улучшения термостабильности и способность преодолевать температурные отклонения.

Предусмотрены способы усиления защиты у обычных животных и животных, положительных по антителам, полученным от матери (MDA-положительным) против инфекций, вызванных FMDV. Также предусмотрены наборы, содержащие, по меньшей мере, один антигенный полипептид или его фрагмент или вариант, и инструкции для применения.

Краткое описание чертежей

Нижеследующее подробное описание, приведенное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения раскрытия исключительно конкретными описанными воплощениями, лучше всего понимать в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых:

на фиг. 1 показана таблица, обобщающая последовательности ДНК и белка;

на фиг. 2 показаны гены штамма FMDV A24 и гены A24 (p1-2AB’), используемые в химерной конструкции A24-A12;

на фиг. 3 показаны гены штамма FMDV A12 и гены A12 (3B'/ 3C), используемые в химерной конструкции A24-A12;

на фиг. 4 показан проведенный с помощью ПЦР анализ генетической структурной идентичности вакцины против A24-A12 FMDV на основе рекомбинантного адвенивируса;

на фиг. 5 показан вестерн-блоттинг вакцины против A24-A12 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора;

на фиг. 6 показаны гены штамма FMDV O1M, используемые в вакцине против FMDV O1M на основе рекомбинантного аденовирусного вектора;

на фиг. 7 показаны гены штамма FMDV Irn, используемые в вакцине против FMDV Irn на основе рекомбинантного аденовирусного вектора;

на фиг. 8 показаны гены штамма FMDV Asia, используемые в вакцине против FMDV Asia на основе рекомбинантного аденовирусного вектора;

на фиг. 9 показана процентная защита вакциной против FMDV О-серотипа в разных дозах;

на фиг. 10 показана серология вакцины FMDV O-серотипа в разных дозах;

на фиг. 11 показана вироцидная активность FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора + адъюванты при 25°C;

на фиг. 12 показана вироцидная активность FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора + адъюванты при 4°C;

на фиг. 13 показано среднее геометрическое титра FMDV VN;

на фиг. 14 показано среднее геометрическое титра SAV;

на фиг. 15 показано среднее геометрическое титра FMDV VN.

Подробное описание

Предлагаются композиции или вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы, экспрессирующие антиген FMDV, которые вызывают иммуногенный ответ у животного. Рекомбинантные вирусные векторы могут быть аденовирусными векторами, экспрессирующими антигены FMDV. Рекомбинантные вирусные векторы, экспрессирующие антигены, могут быть составлены в виде вакцин или фармацевтических композиций и использованы для вызова или стимуляции защитного ответа у животного. В одном воплощении полипептидный антиген представляет собой структурный белок FMDV, P1 (VP4-VP2-Vp3-VP1), неструктурный белок P2 (2A, 2B и 2C) или неструктурный белок P3 (3A, 3B, 3C и 3D) или их активный фрагмент или вариант.

Предполагается, что антигенные полипептиды раскрытия могут представлять собой полноразмерные полипептиды или активные фрагменты или их варианты. Под «активными фрагментами» или «активными вариантами» подразумевается, что фрагменты или варианты сохраняют антигенную природу полипептида. Таким образом, настоящее раскрытие охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, который вызывает иммуногенный ответ у животного. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV может быть любым полипептидом, антигеном, эпитопом или иммуногеном FMDV, таким как белок, пептид или его фрагмент или его вариант, без ограничения указанным, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья.

Простая комбинация капсидных белков образует молекулу протомера или 5S, которая является элементарной составляющей капсида FMDV. Этот протомер затем объединяется в пентамер с образованием молекулы 12S. Вирион является результатом инкапсулирования молекулы геномной РНК путем сборки двенадцати пентамеров 12S, образуя тем самым 146S-частицы. Вирусный капсид также может образовываться без присутствия внутри него молекулы РНК (далее «пустой капсид»). Пустой капсид также обозначается как частица 70S. Образование пустых капсидов может происходить естественным образом во время репликации вируса или может быть произведено искусственно путем химической обработки.

Настоящее раскрытие относится к вакцинам или композициям для коров, овец, коз или свиней, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена FMDV или рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего антиген FMDV, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

В некоторых воплощениях вакцины дополнительно содержат адъюванты, такие как эмульсии масло-в-воде (O/W), описанные в патенте США 7371395.

В других воплощениях адъюванты включают эмульсии TS6, TS7, TS8 и TS9, эмульсии LR3, LR4 и LR6, эмульсию LF2, адъювант CARBIGEN™, адъювант ENABL®, полиакриловую кислоту, гидроксид алюминия или фосфат алюминия, сапонин, CpG, эмульсии вода-в-масле и эмульсии масло-в-воде, или их комбинаций.

В некоторых воплощениях ответ у животного представляет собой защитный иммунный ответ.

Под «животным» подразумевают млекопитающие, птицы и тому подобное. Животное или хозяин включают млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), собачьих (например, собака, волк, лисица, койот, шакал), кошачьих (например, лев, тигр, домашняя кошка, дикая кошка, другие крупные кошки, в том числе гепарды и рыси), овечьих (например, овца), бычьих (например, крупный рогатый скот, корова), свиней (свинья), птичьих (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, зяблик, ястреб, ворона, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяны, долгопяты, обезьяны, гиббоны, человекообразные обезьяны) и рыб. Термин «животное» также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональную и фетальную стадии.

Если иное не указано, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит данное описание. В тексте на английском языке термины в единственном числе с артиклями «a», «an» и «the» включают множественное число, если контекст явно не указывает иное. Точно так же, слово «или» предназначено для включения «и», если контекст явно не указывает иное.

Антигенные полипептиды по изобретению способны защищать от FMDV. То есть они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Под термином «антиген» или «иммуноген» понимается вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способных индуцировать иммунный ответ при представлении животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен, или любые их комбинации. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.

Термин «иммуногенный или антигенный полипептид», используемый в данном документе, включает полипептиды, которые иммунологически активны в том смысле, что, как только их вводят хозяину, они способны вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против белка. В воплощениях фрагмент белка имеет, по существу, ту же иммунологическую активность, что и общий белок. Таким образом, фрагмент белка согласно изобретению содержит или состоит по существу или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный» белок или полипептид, при использовании в данном документе, включает полноразмерную последовательность белка, их аналоги, или их иммуногенные фрагменты. Под термином «иммуногенный фрагмент» понимается фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов, и, таким образом, вызывает иммунологический ответ, как описано выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с применением любого количества методов картирования эпитопов. Например, линейные эпитопы могут быть определены параллельным синтезом большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующим частям белковой молекулы, и взаимодействием пептидов с антителами, где пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в патенте США 4708871; Geysen et al., 1984, PNAS USA, 81 (13): 3998-400; Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82 (1): 178-82. Точно так же, конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот, например, путем рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Способы, особенно применимые к белкам T. parva, описаны в PCT/US2004/022605.

Как обсуждалось, раскрытие включает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Термин «иммуногенный белок или пептид» дополнительно предполагает делеции, добавления и замены последовательности, при условии, что полипептид функционирует при получении иммунологического ответа, как определено в данном документе. Термин «консервативная вариация» означает замену аминокислотного остатка на другой биологически аналогичный остаток, или замены нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, чтобы закодированный остаток аминокислоты не изменялся или являлся другим биологически сходным остатком. В связи с этим, в частности, предпочтительные замены, как правило, консервативны по своей природе, то есть, являются заменами внутри семейства аминокислот. Так, например, аминокислоты, как правило, делятся на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой гидрофобный остаток, или замены одного полярного остатка на другой полярный остаток, например замены лизина на аргинин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, и тому подобное; или подобная консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет иметь большое влияние на биологическую активность. Белки, имеющие по существу одну и ту же аминокислотную последовательность, в качестве исходной молекулы, но имеющие незначительные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на иммуногенность белка, таким образом, находятся в пределах определения эталонного полипептида. Все полипептиды, полученные этими изменениями, включены в данный документ. Термин «консервативная вариация» также включает применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты при условии, что антитела, индуцированные полипептидом с заменой, также иммунореагируют с незамещенным полипептидом.

Термин «эпитоп» относится к участку на антигене или к гаптену, на который отвечают специфические В-клетки и/или Т-клетки. Термин также используется взаимозаменяемо с термином «антигенная детерминанта» или «участок антигенной детерминанты». Антитела, которые распознают тот же эпитоп, могут быть идентифицированы простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Обычно «иммунологический ответ» включает, без ограничения указанным, один или несколько следующих эффектов: продуцирование антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных конкретно на антиген или антигены, включенные в состав или вакцину, представляющие интерес. Предпочтительно, хозяин будет демонстрировать либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ, в результате чего повышается устойчивость к новой инфекции и/или уменьшается клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением, либо отсутствием симптомов, обычно демонстрируемых зараженным хозяином, более быстрым временем восстановления и/или пониженным титром вируса в зараженном хозяине.

Синтетические антигены также включены в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. Иммуногенные фрагменты для целей раскрытия обычно включают, по меньшей мере, около 3 аминокислот, по меньшей мере, около 5 аминокислот, по меньшей мере, около 10-15 аминокислот или около 15-25 аминокислот или более аминокислот молекулы. Не существует критического верхнего предела длины фрагмента, который может содержать почти полную длину белковой последовательности или даже слитый белок, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп белка.

Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, экспрессирующего эпитоп, определяется тем, что полинуклеотид содержит или состоит по существу из или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту полипептида FMDV. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида FMDV, может содержать или состоять в основном из 15 нуклеотидов или около 30-45 нуклеотидов, около 45-75 или, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или смежных нуклеотидов последовательности, кодирующей полипептид.

Термин «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относится к РНК или ДНК, которая является линейной или разветвленной, одно- или двухцепочечной, или их гибридом. Термин также включает гибриды РНК/ДНК. Ниже приведены не ограничивающие примеры полинуклеотидов: ген, или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, нуклеотидные зонды и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиолат и нуклеотидные ветви. Нуклеотидная последовательность может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификаций, которые включены в данное определение, являются кэпы, замена одного или нескольких естественных нуклеотидов на аналог, введение средств для прикрепления полинуклеотида к белкам, металлические ионы, метящие компоненты, другие полинуклеотиды или твердая подложка. Полинуклеотиды могут быть получены путем химического синтеза или получены из микроорганизма.

Термин «ген» используется в широком смысле для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК и/или регуляторных последовательностях, требуемых для их экспрессии. Например, ген также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК, или кодирует специфический белок, и который включает регуляторные последовательности.

Далее раскрытие включает комплементарную цепь к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген FMDV. Дополнительная цепь может быть полимерной и любой длины и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой их комбинации.

Термины «белок», «пептид», «полипептид» и «полипептидный фрагмент» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот, и он может быть прерван химическими группами, отличными от аминокислот. Термины также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями или модификациями, такими как конъюгация с меченым или биоактивным компонентом.

«Выделенный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который был, по существу, отделен или очищен от других биологических компонентов клетки организма, из которой естественно происходит компонент, например, другие хромосомные и экстра-хромосомные ДНК и РНК, белки и органеллы. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были «выделены», включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными способами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантной технологии, а также химического синтеза.

Используемый в данном документе термин «очищенный» не требует абсолютной чистоты; скорее, он предполагается как относительный термин. Так, например, состав очищенного полипептида представляет собой препарат, в котором полипептид более обогащен, чем полипептид в его естественной среде. В некоторых случаях полипептид отделяют от клеточных компонентов. Под «по существу очищенным» подразумевается, что полипептид представляет несколько воплощений в которых, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% или более клеточных компонентов или материалов удалены. Аналогично, полипептид может быть частично очищен. Под «частичной очисткой» подразумевается удаление менее 60% клеточных компонентов или материала. То же самое относится к полинуклеотидам. Полипептиды, описанные в данном документе, могут быть очищены любым из способов, известных в данной области.

Как отмечено выше, антигенные полипептиды или их фрагменты или их варианты представляют собой антигенные полипептиды FMDV, которые продуцируются вирусным вектором in vivo. Фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими, также охватываются настоящим раскрытием. Под «фрагментом» подразумевается часть полинуклеотида или часть кодированной им антигенной аминокислотной последовательности. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность нативного белка и, следовательно, обладают иммуногенной активностью, как указано в любом другом месте в данном документе. Фрагменты полипептидной последовательности сохраняют способность индуцировать защитный иммунный ответ у животного.

«Варианты» предназначены для обозначения существенно сходных последовательностей. Для полинуклеотидов вариант включает делецию и/или добавление одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких сайтах внутри нативного полинуклеотида и/или замещение одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких сайтах нативного полинуклеотида. Используемый в данном документе термин «нативный» полинуклеотид или полипептид содержит природную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно. Варианты конкретного полинуклеотида раскрытия (например, эталонного полинуклеотида) также могут быть оценены путем сравнения процентной идентичности последовательности между полипептидом, кодируемым вариантным полинуклеотидом и полипептидом, кодируемым эталонным полинуклеотидом. «Вариантный» белок предназначен для обозначения белка, полученного из нативного белка, путем делеции или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких местах в нативном белке и/или замещении одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких местах в нативном белке. Вариантные белки, охватываемые настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть обладают способностью вызывать иммунный ответ.

В одном аспекте настоящее раскрытие представляет полипептиды FMDV из овечьих, коровьих, козьих и свиных изолятов FMDV. В другом аспекте настоящее раскрытие представляет собой полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и его вариант или фрагмент.

Более того, гомологи полипептидов FMDV из овец, коров, коз и свиней предполагаются охваченными настоящим раскрытием. Используемый в данном документе термин «гомологи» включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковую или сходную функцию, но которые развиваются отдельно у неродственных организмов. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от разных видов, эволюционировавших из общего предкового гена при видообразовании. Обычно ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые родственны из-за дублирования в геноме. Паралоги обычно имеют разные функции, но эти функции могут быть родственными. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида дикого типа FMDV могут отличаться от полипептида FMDV дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями аминокислотных последовательностей или и тем, и другим. В частности, гомологи раскрытия, как правило, демонстрируют, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательностей со всей или частью полипептидной или полинуклеотидной последовательности FMDV дикого типа, и будут иметь аналогичную функцию. Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизм, который приводит к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и который существует в пределах естественной популяции (например, видов или разновидностей вируса). Такие естественные аллельные вариации обычно могут приводить к 1-5% дисперсии в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы путем секвенирования представляющей интерес нуклеотидной последовательности в ряде различных видов, которые могут быть легко осуществлены с применением гибридизационных зондов для идентификации того же генетического локуса генов у этих видов. Любые и все такие вариации нуклеиновой кислоты и полученные аминокислотные полиморфизмы или вариации, которые являются результатом естественных аллельных вариаций и которые не изменяют функциональную активность представляющего интерес гена, подразумеваются охваченными раскрытием.

Используемый в данном документе термин «производное» или «вариант» относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, которые имеют одну или несколько консервативных вариаций аминокислот или другие незначительные модификации, поэтому (1) соответствующий полипептид имеет существенно эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитело, продуцируемое против полипептида, является иммунореактивным с полипептидом дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды, имеющие незначительные модификации первичных аминокислотных последовательностей полипептида FMDV, которые могут приводить к образованию пептидов, которые по существу эквивалентны по сравнению с немодифицированным эквивалентным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин «вариант» дополнительно рассматривает делеции, добавления и замены последовательности, при условии, что полипептид функционирует для получения иммунологического ответа, как определено в данном документе.

Термин «консервативная вариация» означает замену аминокислотного остатка на другой биологически сходный остаток, или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, чтобы закодированный остаток аминокислоты не изменялся или являлся другим биологически сходным остатком. В связи с этим, в частности, предпочтительные замены, как правило, консервативны по своей природе, как описано выше.

Полинуклеотиды раскрытия включают последовательности, которые являются вырожденными в результате генетического кода, например, в случае оптимизированного использования кодонов для конкретного хозяина. Используемый в данном документе термин «оптимизированный» относится к полинуклеотиду, который генетически модифицирован, чтобы увеличить его экспрессию у данного вида. Для обеспечения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды FMDV, последовательность ДНК гена белка FMDV может быть модифицирована для того, чтобы 1) включать кодоны, предпочтительные для высоко экспрессированных генов у конкретного вида; 2) включать содержание A + T или G + C в композиции нуклеотидных оснований как по существу найдено у указанных видов; 3) формировать инициирующую последовательность указанных видов; или 4) устранять последовательности, которые вызывают дестабилизацию, ненадлежащее полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК, или которые образуют шпильки вторичной структуры или сайты сплайсинга РНК. Повышенная экспрессия белка FMDV у указанных видов может быть достигнута за счет использования частоты распределения использования кодонов у эукариот и прокариот, или у конкретного вида. Термин «частота предпочтительного использования кодонов» относится к предпочтению, проявляемому конкретной клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов, для указания данной аминокислоты. Есть 20 природных аминокислот, большинство из которых указаны более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в раскрытие, пока аминокислотная последовательность полипептида FMDV, кодируемого нуклеотидной последовательностью, функционально не изменяется.

Идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена попарным BLAST от NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) и матрицы blosum62 с применением стандартных параметров (см., например, алгоритм BLAST или BLASTX, доступные в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэрилэнд, США).

«Идентичность» по отношению к последовательностям может относиться к числу положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на количество нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, где выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствии с алгоритмом Уилбура и Липмана (1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 80, pp726-730). Идентичность последовательности или сходство последовательностей двух аминокислотных последовательностей или идентичность последовательности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью программного пакета Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Карлсбад, Калифорния). Когда упоминают, что последовательности РНК являются сходными или имеют степень идентичности последовательности или гомологию с последовательностями ДНК, то тимидин (Т) в последовательности ДНК считают равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК попадают в рамки изобретения и могут быть получены из последовательностей ДНК, причем тимидин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательностях РНК.

Реакции гибридизации могут быть выполнены в условиях различной «жесткости». См., например, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 4-е издание (Sambrook et al., 2014).

Далее раскрытие включает полинуклеотиды FMDV, содержащиеся в векторной молекуле или экспрессирующем векторе, и функционально связанные с промоторным элементом и, необязательно, с энхансером.

«Вектор» относится к рекомбинантной ДНК или РНК-плазмиде, бактериофагу или вирусу, который содержит гетерологичный полинуклеотид, который должен быть доставлен в клетку-мишень либо in vitro, либо in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может содержать последовательность, представляющую интерес для целей профилактики или терапии, и необязательно может быть представлен в виде экспрессирующей кассеты. При использовании в данном документе, вектор не должен быть способен к репликации в конечной целевой клетке или объекте. Термин включает клонирующие векторы и вирусные векторы.

Термин «рекомбинантный» означает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который либо не встречается в природе, либо связан с другим полинуклеотидом в компоновке, не встречающейся в природе.

«Гетерологичный» означает полученный из сущности, которая генетически изолирована от остальной части сущности, с которой осуществляется сравнение. Например, полинуклеотид может быть помещен с помощью методов генной инженерии в плазмиду или вектор, полученный из другого источника, и представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от нативной последовательности, является гетерологичным промотором.

Настоящее раскрытие относится к вакцинам для овец, коров, коз и свиней, а также к фармацевтическим или иммунологическим композициям, которые могут содержать эффективное количество рекомбинантных антигенов FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, эксципиент или несущую среду.

Объект изобретения, описанный в данном документе, частично направлен на композиции и способы, связанные с антигеном FMDV, полученным в экспрессирующей системе клеток бакуловируса/насекомых, который является высокоиммуногенным и защищает животных от заражения гомологичными и гетерологичными штаммами FMDV.

Композиции

Настоящее раскрытие относится к вакцинам или композициям против FMDV, которые могут содержать эффективное количество рекомбинантного антигена FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду. В одном воплощении вакцина или композиция против FMDV включает рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антигены FMDV.

Одно из воплощений изобретения относится к вакцине или композиции, содержащей вирусный вектор, экспрессирующий антигены FMDV. Антигены FMDV получают путем экспрессии кДНК областей P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B'/3B' и 3C или P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B/2C и 3A/3B/3C/3D. Структурная область P1 и неструктурные области P2 или P3 могут быть получены из того же серотипа FMDV или из другого серотипа (химерные антигены).

Настоящее раскрытие охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, который вызывает иммуногенную реакцию у животного, такого как овца, корова, коза или свинья. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, такой как, без ограничения указанным, белок, пептид или его фрагмент, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья.

В воплощении, в котором иммунологическая композиция или вакцина против FMDV представляет собой рекомбинантную иммунологическую композицию или вакцину, композиция или вакцина включает рекомбинантный вектор и фармацевтический или ветеринарный приемлемый эксципиент, носитель, адъювант или несущую среду; рекомбинантный вектор представляет собой бакуловирусный экспрессирующий вектор, который может включать полинуклеотид, кодирующий полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, может представлять собой VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C или 3D или любую их комбинацию.

В одном воплощении полипептиды P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A/частичный 2B/частичный 3B и 3C могут быть экспрессированы в вирусном векторе, и экспрессия может регулироваться одной или несколькими промоторными последовательностями. В другом воплощении антиген FMDV может представлять собой химерный антиген, содержащий P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A-частичный 2B из FMDV серотипа A24 и частичный 3B из FMDV серотипа A12 и антиген 3C из FMDV серотипа A24. В еще одном воплощении антиген FMDV может представлять собой P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A-2B-частичный 2C-частичный 3A-3B-3C.

В другом воплощении антиген FMDV может быть получен из FMDV O1 Manisa, O1 BFS или Campos, A24 Cruzeiro, A12, Asia 1 Shamir, A Iran'96, Asia/IRN/05, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

Настоящее раскрытие относится к вакцине против FMDV, которая может содержать эффективное количество рекомбинантного антигена FMDV или рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего антиген FMDV, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

В другом воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущая среда может представлять собой эмульсию вода-в-масле. В еще одном воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущая среда может представлять собой эмульсию «масло-в-воде».

Далее раскрытие включает полинуклеотиды FMDV, содержащиеся в векторной молекуле или экспрессирующем векторе, и функционально связанные с промоторным элементом и, необязательно, с энхансером.

В одном аспекте настоящее раскрытие представляет полипептиды FMDV, в частности овечьи, коровьи, козьи или свиные полипептиды, имеющие последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и их варианты или фрагменты.

В другом аспекте настоящее описание обеспечивает полипептид, идентичные по последовательности, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с антигенным полипептидом, в частности, с полипептидами, имеющими последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8.

В еще одном аспекте настоящее раскрытие представляет фрагменты и варианты идентифицированных выше полипептидов FMDV (SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8), которые могут быть легко получены специалистом в данной области с применением методов молекулярной биологии.

Вариантами являются гомологичные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8.

Иммуногенный фрагмент полипептида FMDV включает, по меньшей мере, 8, 10, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере, 21 аминокислоту, по меньшей мере, 23 аминокислоты, по меньшей мере, 25 аминокислот или, по меньшей мере, 30 аминокислот из полипептида FMDV, имеющего последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или их вариантах. В другом воплощении фрагмент полипептида FMDV включает специфический антигенный эпитоп, обнаруженный на полноразмерном полипептиде FMDV.

В другом аспекте настоящее раскрытие представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид FMDV, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. В еще одном аспекте настоящее раскрытие представляет полинуклеотид, кодирующий полипептид, идентичный по последовательности, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или консервативным вариантом, аллельным вариантом, гомологом или иммуногенным фрагментом, содержащим, по меньшей мере, восемь или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из этих полипептидов, или комбинации этих полипептидов.

В другом аспекте настоящее раскрытие представляет собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7 или ее варианте. В еще одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает полинуклеотид, идентичный по последовательности, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 95%, 96% 97%, 98% или 99% с одним из полинуклеотидов, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7 или их варианте.

Полинуклеотиды по изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как дополнительные кодирующие последовательности в пределах одной транскрипционной единицы, контролирующие элементы, такие как промоторы, сайты связывания рибосом, 5'-UTR, 3'-UTR, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные единицы транскрипции под контролем того же или другого промотора, последовательности, которые позволяют осуществить клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию, а также трансформацию клетки-хозяина, и любую такую конструкцию, которая может быть необходима для обеспечения воплощения настоящего изобретения.

Элементы для экспрессии полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена FMDV предпочтительно присутствуют в векторе изобретения. В минимальном варианте он состоит, по существу, состоит из кодона инициации (ATG), стоп-кодона и промотора и необязательно также последовательности полиаденилирования для определенных векторов, таких как плазмида и некоторые вирусные векторы, например, вирусные векторы, отличные от поксвирусов. Когда полинуклеотид кодирует полипептидный фрагмент, например, PRRSV-пептид, преимущественно в векторе, ATG помещают на 5' относительно рамки считывания, а стоп-кодон помещают на 3'. Могут присутствовать другие элементы для контроля экспрессии, такие как энхансерные последовательности, стабилизирующие последовательности, такие как интронные и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка.

Настоящее раскрытие также относится к составам, содержащим векторы, такие как экспрессирующие векторы, например, терапевтическим композициям. Составы могут содержать один или несколько векторов, например, экспрессирующие векторы, такие как in vivo экспрессирующие векторы, содержащие и экспрессирующие один или несколько полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов FMDV. В одном воплощении вектор содержит и экспрессирует полинуклеотид, который включает, по существу состоит из или состоит из полинуклеотида, кодирующего (и преимущественно экспрессирующего) антиген, эпитоп или иммуноген FMDV в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, эксципиенте или несущей среде. Таким образом, согласно воплощению изобретения другой вектор или векторы в составе включают, по существу состоят из или состоят из полинуклеотида, который кодирует, и в соответствующих обстоятельствах вектор экспрессирует один или несколько других белков полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена FMDV или их фрагмента.

Согласно другому воплощению вектор или векторы в составе содержат или состоят по существу из или состоят из полинуклеотида(ов), кодирующего один или несколько белков или их фрагментов полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена FMDV, эти вектор или векторы экспрессируют полинуклеотид(ы). В другом воплощении состав содержит один, два или более векторов, содержащих полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие, преимущественно in vivo, полипептид, антиген, слитый белок FMDV или их эпитоп. Раскрытие изобретения также направлено на смеси векторов, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие различные полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногены FMDV, например, полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV из разных видов животных, таких как, без ограничения указанным, овцы, коровы, козы или свиньи.

Согласно еще одному воплощению изобретения экспрессирующий вектор представляет собой плазмидный вектор или ДНК-плазмидный вектор, в частности, вектор для экспрессии in vivo. В конкретном неограничивающем примере плазмиды pVR1020 или 1012 (VICAL, Inc, Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7 (10): 1205-17, см., например, пат. США: 5846946 и 6451769) могут быть использованы в качестве вектора для введения полинуклеотидной последовательности. Плазмида pVR1020 получена из pVR1012 и содержит сигнальную последовательность tPA человека. В одном воплощении сигнал tPA человека включает последовательность Genbank с учетным номером HUMTPA14 от аминокислоты M (1) по аминокислоту S (23). В другом конкретном неограничивающем примере плазмида, используемая в качестве вектора для введения полинуклеотидной последовательности, может включать сигнальную пептидную последовательность IGF1 лошади с аминокислоты M (24) по аминокислоту A (48) в последовательности Genbank с учетным номером U28070. Дополнительная информация о ДНК-плазмидах, которые можно учитывать или использовать в практике, можно найти, например, в патентах США 6852705; 6818628; 6586412; 6576243; 6558674; 6464984; 6451770; 6376473; и 6221362.

Термин «плазмида» охватывает любую единицу транскрипции ДНК, содержащую полинуклеотид согласно раскрытию, и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или клетках желаемого хозяина или мишени; и в этой связи следует отметить, что суперскрученная или несуперскрученная кольцевая плазмида, а также линейная форма включены в объем раскрытия.

Плазмида может включать или содержать или состоять в основном из полинуклеотида, кодирующего антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, необязательно слитого с гетерологичной пептидной последовательностью, вариантом, аналогом или фрагментом, функционально связанным с промотором или под контролем промотора или в зависимости от промотора. Как правило, в эукариотических клетках выгодно использовать сильный промоторный функционал. Сильным промотором может быть, без ограничения указанным, предранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или, необязательно, другого происхождения, такого как крыса или морская свинка, Супер-промотор (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.). Промотор CMV-IE может содержать сегмент промотора как таковой, который может быть связан или не связан с сегментом энхансера. Ссылка может быть дана на ЕР-А-260 148, ЕР-А-323 597, Пат. США № 5168062, 5385839 и 4968615, а также заявку РСТ № WO87/03905. В воплощениях промотор CMV-IE представляет собой CMV-IE человека (Boshart et al., 1985, Cell, 41 (2): 521-30) или CMV-IE мыши.

В более общих условиях промотор имеет вирусное, растительное или клеточное происхождение. Сильным вирусным промотором, отличным от CMV-IE, который может быть с пользой использован при практическом осуществлении данного изобретения, является ранний/поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. Сильным клеточным промотором, который может быть с пользой применен при практическом осуществлении раскрытия, является промотор гена цитоскелета, такой как, например, промотор десмина (Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18 (22): 2337- 44) или промотор актина (Miyazaki et al., 1989, Gene, 79 (2): 269-77).

Плазмиды могут содержать другие элементы управления экспрессией. Особенно предпочтительно включать стабилизирующую последовательность (последовательности), например, последовательность(и) интрона, например, интрон алкогольдегидрогеназы кукурузы (Callis et al. Genes & Dev.1 (10): 1183-1200, Dec. 1987), первый интрон из HCMV-IE (Заявка РСТ № WO1989/01036), интрон II из гена β-глобина кролика (van Ooyen at al., 1979, Science, 206 (4416): 337-44). В другом воплощении плазмиды могут содержать 3' UTR. 3' UTR может быть, без ограничения указанным, 3' UTR нопалин-синтазы агробактерий (Nos) (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).

Что касается сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, отличных от поксвирусов, то можно использовать сигнал поли(А) гена бычьего гормона роста (bGH) (см. пат. США № 5122458) или сигнал поли(А) гена β-глобина кролика или сигнал поли(А) вируса SV40.

«Клетка-хозяин» обозначает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или способна генетически изменяться путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. Когда речь идет о генетически измененных клетках, термин относится как к первоначально измененной клетке, так и к ее потомству.

В одном воплощении рекомбинантный антиген FMDV экспрессируется в клетках насекомых.

Способы применения

В одном воплощении раскрытый в данном документе объект изобретения направлен на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овцам, коровам, козам и свиньям эффективного количества вакцины, которая может содержать рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антигена FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

В одном воплощении настоящего изобретения способ включает однократное введение вакцинной композиции, составленной с эмульсией согласно раскрытию. Например, в одном воплощении иммунологическая или вакцинная композиция содержит рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антиген FMDV.

В другом воплощении настоящего изобретения способ включает однократное введение двух гетерологичных вакцинных композиций. Гетерологичными вакцинами или композициями могут быть различные типы вакцин, такие как вакцина против FMDV VLP или вакцины на основе вектора с вирусом FMDV. Гетерологичные вакцины могут также представлять собой вакцины того же типа, экспрессирующие капсиды различных серотипов FMDV, таких как штаммы A24, A12, O1 Manisa, Asia или Iraq.

В одном воплощении раскрытый в данном документе объект изобретения направлен на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овечьей, коровьей, козьей или свиной вакцины, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антиген FMDV in vivo.

В воплощении раскрытый в данном документе объект изобретения направлен на способ вызова иммунного ответа, включающий введение овечьей, коровьей, козьей или свиной вакцины, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антиген FMDV in vivo.

Для проверки эффективности вакцины в контрольном заражении использовались как гомологичные, так и гетерологичные штаммы FMDV. Введение может быть подкожным или внутримышечным. Введение может быть безыгольным (например, Pigjet или Bioject).

В одном воплощении изобретения может быть применен режим «прайм-буст», который состоит, по меньшей мере, из одного первичного введения и, по меньшей мере, одного бустерного введения с применением, по меньшей мере, одного общего белка, полепептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Иммунологическая композиция или вакцина, используемая в первичном введении, отличается по своему характеру от той, которая используются в качестве бустера. Однако следует отметить, что один и тот же состав можно использовать в качестве первичного введения и бустерного введения. Этот протокол введения называется «прайм-буст».

«Прайм-буст» согласно настоящему изобретению может включать рекомбинантный вирусный вектор, который используется для экспрессии кодирующей последовательности FMDV или ее фрагментов, кодирующих антигенный полипептид или его фрагмент или вариант. В частности, вирусный вектор может экспрессировать ген FMDV или его фрагмент, который кодирует антигенный полипептид. Предлагаемый в данном документе вирусный вектор включает, без ограничения указанным, поксвирус (например, вирус коровьей оспы или аттенуированный вирус коровьей оспы, авипоксвирус или аттенуированный авипоксвирус (например, оспы канареек, оспы кур, оспы голубей, оспы голубей, оспы перепелов, ALVAC, TROVAC, см., например, патенты США: 5505941 и 5494807), вирус оспы енота, вирус свиной оспы и т.д.], аденовирус (например, аденовирус человека, аденовирус собак), вирус герпеса (например, вирусный герпес, герпес индейки, вирус болезни Марека, вирус инфекционного ларинготрахеита, кошачий герпес вируса, вирус ларинготрахеита (ILTV), вирус герпеса крупного рогатого скота, вирус герпеса свиней), бакуловирус, ретровирус и т.д. В другом воплощении экспрессирующий вектор на основе вируса оспы птиц может быть вектором на основе оспы канареек, таким как ALVAC. В еще одном воплощении экспрессирующий вектор на основе вируса оспы птиц может быть вектором на основе оспы кур, такой как TROVAC. Подлежащий экспрессии антиген FMDV раскрытия вводится под контролем специфического промотора поксвируса, например 42K промотора энтомопоксвируса Amsacta moorei (Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81 (4): 1073- 85), 7,5 кДа промотора вируса осповакцины (Cochran et al ., 1985, J Virol, 54 (1): 30-7), промотора I3L вируса осповакцины (Riviere et al., 1992, J Virol, 66 (6): 3424 -34), промотора HA вируса осповакцины (Shida, 1986, Virology, 150 (2): 451-62), промотора ATI вируса коровьей оспы (Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47), промотора H6 вируса осповакцины (Taylor et al., 1988, Vaccine, 6 (6): 504-8, Guo et al., 1989, J Virol, 63 (10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63 (9): 3829-36.), среди прочего.

В другом воплощении экспрессирующим вектором на основе птичьей оспы может быть вектор на основе вируса оспы канареек, такой как ALVAC. Антигеном, эпитопом или иммуногеном FMDV может быть FMDV P1-3C. Вирусный вектор FMDV может быть вирусом оспы канареек, таким как vCP2186, vCP2181 или vCP2176, или вирусом оспы кур, таким как vFP2215 (см. пат. США 7527960). В еще одном воплощении антиген, эпитоп или иммуноген FMDV может быть получен в ряске (опубликованная патентная заявка США 2011/0236416).

В другом аспекте протокола «прайм-буст» раскрытия, композицию, включающую антиген FMDV раскрытия, вводят с последующим введением вакцины или композиции, включающей субъединичную вакцину, содержащую VLP FMDV, экспрессированную бакуловирусом в клетках насекомых (см. USSN14/863181), или инактивированную вирусную вакцину или композицию, содержащую антиген FMDV, или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген FMDV. Аналогично, протокол «прайм-буст» может включать введение вакцины или композиции, включающей субъединичную вакцину, содержащую VLP FMDV, экспрессированную бакуловирусом в клетках насекомых, или инактивированную вирусную вакцину или композицию, содержащую антиген FMDV, или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген FMDV, с последующим введением композиции, содержащей антиген FMDV по данному изобретению. Кроме того, следует отметить, что как первичное, так и вторичное введение может включать композицию, содержащую антиген FMDV раскрытия.

Режим «прайм-буст» включает, по меньшей мере, одно прайм-введение и, по меньшей мере, одно буст-введение с применением по меньшей мере, одного обыкновенного полипептида и/или его вариантов или фрагментов. Вакцина, используемая в прайм-введении, может быть отлична по своей природе, от той, что используется позже в качестве бустерной вакцины. Прайм-введение может включать одно или несколько введений. Аналогичным образом, буст-введение может включать одно или несколько введений.

Дозовый объем композиций для целевых видов, которые представляют собой млекопитающих, например, объем дозы композиции для овцы, коровы, козы или свиньи, на основе вирусных векторов, например композиций на основе не-поксвирусного вирусного вектора, обычно составляет от около 0,1 до около 5,0 мл, от около 0,1 до около 3,0 мл и от около 0,5 мл до около 2,5 мл.

Эффективность вакцин может быть протестирована через около 2-4 недели после последней иммунизации путем контрольного заражения животных, таких как овца, корова, коза или свинья, вирулентным штаммом FMDV, таким как штаммы FMDV O1 Manisa, O1 BFS или Campos, A24 Cruzeiro, A12, Asia 1 Shamir, A Iran'96, Asia/IRN/05, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

Другие штаммы могут включать штаммы FMDV A10-61, A5, A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, O1, C1-Santa Pau, C1-C5, A22/550/Azerbaijan/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05, A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/1, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, Азия 1/HNK/CHA/05 (учетный номер GenBank EF149010, включенный в настоящее описание ссылкой), Asia I/XJ (Li, ZhiYong et al .Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51 (17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002, O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holland, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IN D210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/India/17/77.

Дальнейшие подробности этих штаммов FMDV можно найти на веб-страницах Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI), и все связанные с ними нуклеотидные последовательности включены в настоящее описание ссылкой. Авторы считают, что все штаммы FMDV, как перечисленные в данном документе, так и те, которые еще предстоит идентифицировать, могут быть экспрессированы в соответствии с положениями настоящего раскрытия для получения, например, эффективных вакцинных композиций. Как гомологичные, так и гетерологичные штаммы используются для заражения для проверки эффективности вакцин. Животное может быть заражено внутрикожно, подкожно, спреем, интраназальным, внутриглазным, внутритрахеальным путем и/или перорально.

Введения «прайм-буст» могут быть преимущественно проведены с интервалом от 1 до 6 недель друг от друга, например, с интервалом около 3 недель друг от друга. Согласно одному воплощению также предусматривается полугодичный бустер или годовой бустер, преимущественно использующий вакцину на основе вирусного вектора. Животные предпочтительно имеют возраст, по меньшей мере, 6-8 недель или около 6 месяцев во время первого введения.

Композиции, содержащие рекомбинантные антигенные полипептиды раскрытия, используемые в протоколах «прайм-буст», содержатся в фармацевтическом или ветеринарном приемлемом носителе, разбавителе, адъюванте или эксципиенте. Протоколы раскрытия защищают животное от FMDV овец, коров, коз или свиней и/или предотвращают прогрессирование заболевания у инфицированного животного.

Специалистом в этой области, должно быть понятно, что раскрытие в данном документе предоставляется для примера, и настоящее раскрытие не ограничивается им. Из данного описания и информации в данной области, специалист может определить количество введений, пути введения, и дозы, которые будут использоваться для каждого протокола инъекции без проведения излишних экспериментов.

Настоящее раскрытие рассматривает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, приготовленной согласно раскрытию. Животное может быть самцом, самкой, беременной самкой и новорожденным. Это введение может осуществляться различными путями, включая, без ограничения указанным, внутримышечную (IM), внутрикожную (ID) или подкожную (SC) инъекцию или через интраназальное или пероральное введение. Терапевтическую композицию согласно раскрытию можно также вводить с помощью безыгольного устройства например, с помощью Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, Джорджия, США), устройства Vetjet или Vitajet (Bioject, Орегон, США)). Другим подходом к назначению плазмидных композиций является применение электропорации (см., например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002, заявка PCT № WO99/01158). В другом воплощении терапевтическая композиция доставляется животному с помощью генной пушки или бомбардировки частицами золота.

В одном воплощении раскрытие предусматривает введение терапевтически эффективного количества композиции для доставки и экспрессии пептида или эпитопа FMDV в клетке-мишени. Определение терапевтически эффективного количества представляет собой обычные экспериментальные работы для специалиста в данной области. В одном воплощении композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, который экспрессирует антиген или эпитоп FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, несущую среду или эксципиент. В другом воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, носитель или эксципиент облегчает трансфекцию или другие способы передачи полинуклеотидов животному-хозяину и/или улучшает сохранение вектора или белка в хозяине.

В одном воплощении раскрытый в данном документе объект изобретения обеспечивает способ обнаружения для дифференциации между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA).

В данном документе раскрыто, что применение вакцины или композиции по настоящему изобретению позволяет обнаруживать инфекцию FMDV у животного. В данном документе раскрыто, что применение вакцины или композиции по настоящему изобретению позволяет выявлять инфекцию у животных путем дифференциации между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA). Способы, раскрытые в данном документе для диагностики инфекции FMDV у животного, используют неструктурный белок FMDV (например, FMDV 3ABC или 3D-специфический ELISA).

Изделие

В одном воплощении раскрытый в данном документе объект относится к набору для осуществления способа вызова или индукции иммунного ответа, который может включать любую из рекомбинантных иммунных композиций или вакцин FMDV или инактивированных FMDV-иммунологических композиций или вакцин, рекомбинантных FMDV-вирусных композиций или вакцин и инструкции для выполнения этого способа.

Другим воплощением изобретения является набор для осуществления способа индукции иммунологического или защитного ответа против FMDV у животного, включающего композицию или вакцину, содержащую антиген FMDV, и рекомбинантный иммунологический состав или вакцину против FMDV, и инструкции по выполнению способа доставки в эффективном количестве для выявления иммунного ответа у животного.

Другим воплощением изобретения является набор для осуществления способа индукции иммунологического или защитного ответа против FMDV у животного, включающий композицию или вакцину, содержащую антиген FMDV, и инактивированную иммунологическую композицию или вакцину против FMDV, а также инструкции по выполнению способа доставки в эффективном количестве для выявления иммунного ответа у животного.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к набору для вакцинации с преимущественным повышением в соответствии с настоящим раскрытием, как описано выше. Набор может включать, по меньшей мере, два флакона: первый флакон, содержащий вакцину или композицию для прайм-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, и второй флакон, содержащий вакцину или композицию для буст-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением. Набор может включать дополнительные первые или вторые флаконы для дополнительных прайм-вакцинаций или дополнительных буст-вакцинаций.

В одном воплощении раскрыта композиция, содержащая антиген FMDV или его фрагмент или вариант, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду. В другом воплощении раскрыта композиция, содержащая рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий антигены FMDV, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду. В другом воплощении раскрыта описанная выше композиция, в которой антиген FMDV или его фрагмент или вариант, включает иммуногенный фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 15 аминокислот антигена FMDV овец, коров, коз или свиней. В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых антиген FMDV или его фрагмент или вариант частично очищены. В одном воплощении раскрыты вышеописанные композиции, в которых антиген FMDV или его фрагмент или вариант, по существу, очищены.

В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых антиген FMDV или его фрагмент или его вариант представляют собой полипептид FMDV овец, коров, коз или свиней. В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых полипептид FMDV представляет собой полипептид P1, полипептид VP0, полипептид VP1, полипептид VP3, полипептид VP2, полипептид VP4, полипептид 2A, полипептид 2B, полипептид 2C, полипептид 3А, полипептид 3B, полипептид 3C или полипептид 3D. В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых антиген FMDV или его фрагмент или его вариант идентичны по последовательности, по меньшей мере, на 80% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых антиген FMDV кодируют полинуклеотидом, идентичным по последовательности, по меньшей мере, на 70% последовательности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7. В одном воплощении раскрыты вышеуказанные композиции, в которых фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущая среда представляют собой эмульсию вода-в-масле или эмульсию масло-в-воде. В другом воплощении раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к FMDV овец, коров, коз или свиней, включающий введение вышеуказанных композиций животному. В одном из воплощений раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к FMDV овец, коров, коз или свиней, включающий режим «прайм-буст». В одном воплощении раскрыт по существу очищенный антигенный полипептид, экспрессируемый в клетках насекомых, где полипептид включает: аминокислотную последовательность, идентичную по последовательности, по меньшей мере, на 80% с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, или 8. В любом воплощении животное предпочтительно представляет собой овцу, корову, свинью или козу. В одном воплощении раскрыт способ диагностики инфекции FMDV у животного. В еще одном воплощении раскрыт набор для «прайм-буст» вакцинации, включающий, по меньшей мере, два флакона, в котором первый флакон, включает композицию, содержащую антиген FMDV или его фрагмент или вариант, и второй флакон, включает рекомбинантный вирусный вектор, который содержит или экспрессирует антиген FMDV.

Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или основы или адъювант или эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или несущая среда или наполнитель может представлять собой 0,9% раствор NaCl (например, физиологический раствор) или фосфатный буфер. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или несущая среда или наполнитель, которые могут быть использованы в способах данного раскрытия, включают, без ограничения указанным, поли (L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или несущая среда или адъювант или эксципиенты могут представлять собой любое соединение или комбинацию соединений, способствующих введению вектора (или белка, экспрессированного с вектора изобретения in vitro); преимущественно носитель, несущая среда или адъювант или эксципиент могут способствовать трансфекции и/или улучшать сохранение вектора (или белка). Дозы и дозовые объемы в данном документе обсуждаются в общем описании, и могут также быть определены специалистами в данной области из этого описания в сочетании с информацией в данной области, без проведения излишних экспериментов.

Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, которые преимущественно, но не исключительно пригодны для плазмид, являются преимущественно липидами, которые имеют следующую формулу:

в которой R1 представляет собой насыщенный или ненасыщенный алифатический радикал с прямой цепью, содержащий от 12 до 18 атомов углерода, R2 представляет собой другой алифатический радикал, содержащий 2 или 3 атома углерода, и X представляет собой амин или гидроксильную группу, например DMRIE. В другом воплощении катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например DOPE.

Среди этих катионных липидов предпочтение отдается DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропан-аммонию, WO 96/34109), преимущественно связанному с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE (диолеоил-фосфатидилэтаноламин, Behr, 1994), с образованием DMRIE-DOPE.

Плазмидную смесь с адъювантом формируют для немедленного применения и/или одновременно с введением препарата или незадолго до введения препарата; например, незадолго перед или до введения, получают смесь плазмида-адъювант, преимущественно, чтобы дать достаточно времени до введения смеси для образования комплекса, например, от около 10 до около 60 минут перед введением, например, за около 30 минут до введения.

Когда присутствует DOPE, молярное соотношение DMRIE:DOPE составляет около от около 95: около 5 до около 5: около 95, более предпочтительно около 1: около 1, например, 1:1.

Массовое соотношение адъюванта DMRIE или DMRIE-DOPE:плазмида может составлять от около 50: около 1 до около 1: около 10, например от около 10: около 1 и около от 1: около 5, и предпочтительно около 1: около 1 и около 1: около 2, например, 1:1 и 1:2.

В другом воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущая среда может представлять собой эмульсию вода-в-масле. Примеры подходящих эмульсий типа вода-в-масле включают вакцинные эмульсии масло-в-воде на основе масла, которые являются стабильными и текучими при 4°С, содержащими от 6 до 50 об.% антигенсодержащей водной фазы, предпочтительно от 12 до 25 об./об.%, от 50 до 94 об./об.% масляной фазы, содержащей в общем или частично неметаболизируемое масло (например, минеральное масло, такое как парафиновое масло) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло, или жирные кислоты, полиольные или спиртовые эфиры) от 0,2 до 20 p/v% поверхностно-активных веществ, предпочтительно от 3 до 8 p/v%, причем последние находятся полностью или частично или в смеси либо с полиглицериновыми эфирами, где указанные полиглицериновые эфиры предпочтительно представляют собой полиглицериновые (поли) рицинолеаты или масла полиоксиэтиленрицина или еще масла гидрированного полиоксиэтиленрицина. Примеры поверхностно-активных веществ, которые могут быть использованы в эмульсии вода-в-масле, включают этоксилированные сложные эфиры сорбитана (например, полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат (TWEEN 80®), доступный у AppliChem, Inc., Чешир, Коннектикут) и сорбитановые эфиры (например, сорбитанмоноолеат (SPAN 80®), доступный у Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Кроме того, что касается эмульсии вода-в-масле, см. Также пат. США № 6919084, например, пример 8, включенный в данный документ ссылкой. В некоторых воплощениях антигенсодержащая водная фаза содержит солевой раствор, содержащий один или несколько буферных агентов. Примером подходящего буферного раствора является забуференный фосфатом физиологический раствор. В предпочтительном варианте эмульсия вода-в-масле может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W) (патент США 6358500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США № 7371395.

Иммунологические композиции и вакцины в соответствии с изобретением могут включать или состоять по существу из одного или нескольких адъювантов. Подходящими адъювантами для практического применения настоящего изобретения являются (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеинового ангидрида и алкенильных производных полимеров, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, имеющие один или несколько неметилированных CpG (Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93 (7): 2879-83, WO 98/16247), (3) эмульсия масло в воде, такая как эмульсия SPT, описанная на стр. 147 “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, 6:147, 183, и эмульсия MF59, описанной на стр. 183 той же работы, (4) катионные липиды, содержащие четвертичную аммониевую соль, например, DDA (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом документе, приведенном и включенном путем ссылки в текущую заявку, или (9) любых их комбинаций или смесей.

Эмульсия масло в воде (3), которая особенно подходит для вирусных векторов, может быть основана на: легком жидком парафиновом масле (европейский тип фармакопеи), изопреноидном масле, таком как сквалан, сквален, масле, полученном в результате олигомеризации алкенов, например, изобутен или децен, сложных эфирах кислот или спиртов, имеющих алкильную группу с прямой цепью, такую как растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль, ди(каприлат/капрат), глицеринтри(каприлат/капрат) и диолеат пропиленгликоль или сложные эфиры разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно сложные эфиры изостеариновой кислоты.

Масло используют в сочетании с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы могут быть неионогенными поверхностно-активными веществами, такими как: сложные эфиры, с одной стороны, сорбитана, маннида (например, олеата ангидроманнитола), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислот, причем указанные сложные эфиры необязательно этоксилированы, или полиоксипропилен-полиоксиэтиленовые блоки, такие как плюроник, например, L121.

Среди адъювантных полимеров типа (1) предпочтительны полимеры перекрестносшитой акриловой или метакриловой кислоты, особенно перекрестносшитые полиалкенильные эфиры сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Pharmeuropa, vol.8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области может также сослаться на патент США № 2990962, который обеспечивает такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксильным соединением, имеющим, по меньшей мере, три гидроксильные группы, предпочтительно не более восьми таких групп, атомы водорода, по меньшей мере, трех гидроксильных групп заменяются ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими, по меньшей мере, два атома углерода. Предпочтительными радикалами являются те, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые под названием CARBOPOL® (BF Goodrich, Огайо, США). Они перекрестно связаны аллилсахарозой или аллилпентаэритритом. Среди них стоит упомянуть CARBOPOL®l 974P, 934P и 971P.

Что касается сополимеров малеинового ангидрида-алкенильного производного, предпочтение отдается EMA (Monsanto), которые представляют собой неразветвленные или сшитые сополимеры этилен-малеинового ангидрида, и они, например, сшиваются с помощью дивинилового эфира.

Что касается структуры, то полимеры акриловой или метакриловой кислоты и EMA предпочтительно образуют основные единицы, имеющие следующую формулу:

в которой:

R1 и R2, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой H или CH3

x = 0 или 1, предпочтительно x = 1

y = 1 или 2, с x + y = 2.

Для EMA®, x = 0 и y = 2, а для карбомеров x = y = 1.

Эти полимеры растворимы в воде или физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl), и их рН можно довести до 7,3-7,4, например, гидроксидом натрия (NaOH), для получения адъювантного раствора, в который могут быть включены экспрессирующий(ие) вектор(ы). Концентрация полимера в конечной иммунологической или вакцинной композиции может находиться в диапазоне от около 0,01 до около 1,5% мас./об., от около 0,05 до около 1% мас./об. и от около 0,1 до около 0,4% мас./об.

Цитокин или цитокины (5) могут быть в белковой форме в иммунологической или вакцинной композиции или могут быть совместно экспрессированы в хозяине с иммуногеном или иммуногенами или его эпитопом (эпитопами). Предпочтение отдается совместной экспрессии цитокина или цитокинов либо в том же векторе, что и экспрессируемый иммуноген или иммуногены, или эпитоп(ы), либо в отдельном векторе.

Изобретение охватывает получение таких комбинированных композиций; например, путем смешивания активных компонентов, преимущественно вместе с адъювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.

Цитокины, которые могут быть использованы в настоящем раскрытии, включают, без ограничения перечисленным, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α (IFNα), интерферон β (IFN β), интерферон γ, (IFN γ), интерлейкин-1α (IL-1α), интерлейкин-1 β (IL-1 β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей α (TNFα), фактор некроза опухоли β (TNF β), полиинозиновая и полицитидиловая кислота, цитидин-фосфат-гуанозин-олигодезоксинуклеотиды (CpG ODN) и трансформирующий фактор роста β (TGF β). Понятно, что цитокины можно вводить совместно и/или можно вводить последовательно с помощью иммунологической или вакцинной композиции по настоящему раскрытию. Так, например, вакцина по настоящему раскрытию может также содержать молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, например, цитокин, соответствующий вакцинируемому хозяину или хозяину, в котором должен быть получен иммунологический ответ (например, коровий цитокин для составов, которые нужно вводить крупному рогатому скоту).

В конкретном воплощении адъювант может включать эмульсии TS6, TS7, TS8 и TS9 (патент США 7371395); LR3 и LR4 (US 699368); TSAP (опубликованная патентная заявка США 20110129494); TRIGEN™ (Newport Labs); синтетические дцРНК (например, поли-IC, поли-ICLC [HILTONOL®]); Адъювант CARBIGEN™ (MVP Laboratories, Inc.); адъювант ENABL® (VaxLiant); и адъюванты MONTANIDE™ (W/O, W/O/W, O/W, IMS и Gel) (SEPPIC). Концентрация адъюванта в конечном иммунологическом составе или состав вакцины может составлять от 5 до 80% об./об.

В случае иммунологического состава и/или вакцины на основе полипептидов, экспрессированных в бакуловирусе/клетках насекомых, доза может составлять от около 1 мкг до около 2000 мкг, от около 50 мкг до около 1000 мкг и от около 100 мкг до около 500 мкг антигена, эпитопа или иммуногена FMDV. Доза может составлять от около 10² до около 10²⁰, от около 10³ до около 10¹⁸, от около 10⁴ до около 10¹⁶, от около 10⁵ до около 10¹² VLP (вирусо-подобных частиц). В случае иммунологического состава и/или вакцины на основе вирусного вектора, экспрессирующего антигены FMDV, доза может включать около 10³ вирусных частиц около до 10¹⁵ вирусных частиц, около 10³ вирусных частиц до около 10¹⁴ вирусных частиц, около 10³ до около 10¹³ вирусных частиц, около 10³ вирусных частиц до около 10¹² вирусных частиц. Вирусные частицы могут быть рассчитаны на основе любых способов титрования вирусов, включая, без ограничения указанным, FFA (анализ образования фокусов) или FFU (фокусобразующая единица), TCID₅₀ (50%-ная инфекционная доза для тканевой культуры), PFU (бляшкообразующая единица), и FAID₅₀ (50% -ная инфекционная доза флуоресцентного антитела). Объем доз может составлять от около 0,1 до около 10 мл, от около 0,2 до около 5 мл.

Далее раскрытие будет описано далее посредством следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Конструирование ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных векторов проводили с применением стандартных методов молекулярной биологии, описанных J. Sambrook et al. (Молекулярное клонирование: лабораторное пособие, 4-е издание, Cold Cold Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 2014).

Пример 1. Конструирование антигенов FMDV в составе вектора рекомбинантного аденовируса человека 5

Пример 1.2. Конструирование химерного A24-A12-антигена FMDV в составе вектора рекомбинантного аденовируса человека 5

Химерный антиген A24-A12 FMDV

Вектор на основе аденовируса человека С, серотип 5 (Ad5) (аденовирусный вектор) с делециями в областях генома El, E3 и E4 (каркас GV11, см. патент США 8323663) использовали для конструирования рекомбинантной вакцины против FMDV, экспрессирующей химерный белок FMDV. Химерный белок FMDV содержит структурный капсидный ген FMDV серотипа A24 (A24 Pl) FMDV и неструктурные гены A24 (2A-частичный 2B), неструктурный частичный ген 3B и ген протеиназы FMDV серотипа A12 (частичный 3B-C3) (SEQ ID NO: 2).

Химерный полинуклеотид, кодирующий FMDV A24 (P1-2A-частичный 2B)-A12 (частичный 3B-3C), вводили в челночную плазмиду (см. фиг. 2 и 3). После совместной трансформации линеаризованной плазмиды с каркасом GV11 (которая несет ген устойчивости к канамицину) и линеаризованной челночной плазмиды, содержащей химерный полинуклеотид FMDV, в клетки BJDE3 E.coli, отбирали клоны E. coli, устойчивые к канамицину. Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, подтверждали RFLP. Отобрали один клон, плазмиду линеаризовали и трансфицировали в клетки M2A. Лизат из трансфекции клеток M2A подвергали последовательному пассированию с получением стока с высоким титром химерной вакцины против FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора.

Место введения донорного гена находится между промотором CMV и SV40 PolyA в экспрессирующей кассете Ad5 E1, а экспрессирующая кассета вставляется в BBA в области El. Экспрессирующая кассета A24-A12, расположенная в делеционном соединении области E1, читается слева направо с учетом транскрипции вирусной геномной РНК. Во фланкирующей нуклеотидной последовательности вставляемой кассеты нет известных регуляторных сигналов. Энхансер/промотор CMV контролирует инициализацию транскрипции. Внутри этой последовательности находятся последовательности CAAT-бокса вирусного энхансера, TATA-бокса, сайта начала транскрипции и 5' сайт сплайсинга.

За последовательностями CMV расположена искусственная нетранслируемая область (UTR), содержащая донорную последовательность сплайсинга. Открытая рамка считывания гена, подлежащего экспрессии, следует за последовательностями 3'-сайта сплайсинга, а сигнал раннего полиаденилирования вируса обезьян 40 (SV40) расположен на 3' относительно открытой рамки считывания для терминации транскрипции.

Праймерные пары были разработаны для анализа генетической структурной идентичности (GSI) RBA. Анализ GSI использует ПЦР для идентификации основного биологического агента и кассеты экспрессии. GSI-блот (см. фиг. 4) показал правильный каркас и кассету экспрессии A24-A12 FMDV. Анализ последовательности экспрессирующей кассеты A24-A12 также подтвердил идентичность нуклеотидной последовательности между челночной плазмидой и ДНК, экстрагированной из химерной вакцины против A24-A12 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора.

С помощью вестерн-блот-анализа было подтверждено, что химерная вакцина против A24-A12 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора экспрессирует белок A24 in vitro в клетках 293, что дало реактивный белок, который мигрировал в положение приблизительно 28 кДа (см. фиг. 5). Антитело, используемое для обнаружения в вестерн-блот-анализе, представляет собой моноклональное антитело. Молекулярная масса белка A24, экспрессированного химерной вакциной против A24-A12 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора, была неотличима от наблюдаемой после трансфекции клеток 293 положительной контрольной челночной плазмидой (см. фиг. 5).

Пример 1.2. Конструирование антигена FMDV O1M в составе вектора на основе рекомбинантного аденовируса человека 5

Для конструирования рекомбинантной вакцины FMDV, экспрессирующей белок FMDV, использовали вектор на основе аденовируса C, серотипа 5 (Ad5) (аденовирусный вектор) с делециями в областях генома E1, E3 и E4 (каркас GV11, см. пат. США 8323663). Белок FMDV содержит структурный капсид Pl (VP4-VP2-VP3-VP1) и неструктурные белки 2ABC и 3ABC, включая полноразмерную протеазу 3C (SEQ ID NO: 4) из штамма FMDV O1/Man/87.

Синтетический полинуклеотид (SEQ ID NO: 3), кодирующий FMDV O1M Pl (VP4-VP2-VP3-VP1-2ABC'3A'BC), вводили в челночную плазмиду (см. фиг. 6). Вакцину O1M FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора сконструировали в соответствии с процедурой, описанной в примере 1.2.

Экспрессирующая кассета O1M87 FMDV, расположенная в делеционном соединении области E1, читается справа налево относительно транскрипции вирусной геномной РНК. Во фланкирующей нуклеотидной последовательности вставляемой кассеты нет известных регуляторных сигналов. Энхансер/промотор CMV контролирует инициализацию транскрипции. Внутри этой последовательности находятся последовательности CAAT-бокса вирусного энхансера, TATA-бокса, сайта начала транскрипции и 5' сайт сплайсинга.

За последовательностями CMV расположена искусственная нетранслируемая область (UTR), содержащая донорную последовательность сплайсинга. Открытая рамка считывания гена, подлежащего экспрессии, следует за последовательностями 3'-сайта сплайсинга, а сигнал раннего полиаденилирования вируса обезьян 40 (SV40) расположен на 3' относительно открытой рамки считывания для терминации транскрипции.

GSI-блот показал правильный каркас и кассету экспрессии O1M87 FMDV. Последовательный анализ экспрессирующей кассеты O1M87 FMDV также подтвердил идентичность нуклеотидной последовательности между челночной плазмидой и ДНК, экстрагированной из вакцины, выделенной из вакцины O1M87 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора. Методом вестерн-блоттинга было подтверждено, что вакцина O1M87 FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора экспрессирует в клетках 293 белок O1M87 in vitro.

Пример 1.3. Конструирование антигена FMDV Irn в составе вектора на основе рекомбинантного аденовируса человека 5

Для конструирования рекомбинантной вакцины против FMDV, экспрессирующей белок FMDV, использовали вектор аденовируса C человека, серотипа 5 (Ad5) (аденовирусный вектор) с делециями в областях генома E1, E3 и E4 (каркас GV11, см. пат. США 8323663). Синтетическую кодирующую последовательность капсида FMDV P1 и неструктурные гены 2A, 2B, частичный 2C (2C'), частичный 3A (3A'), 3B и последовательность, кодирующая протеазу 3C серотипа A/Irn/05 FMDV, вводили в челночную плазмиду (см. фиг. 7). Вакцину против Irn FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора была сконструирована в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1.2.

Экспрессирующая кассета Irn FMDV, расположенная в делеционном соединении участка E1, читается справа налево относительно транскрипции вирусной геномной РНК. Во фланкирующей нуклеотидной последовательности вставляемой кассеты нет известных регуляторных сигналов. Энхансер/промотор CMV контролирует инициализацию транскрипции. Внутри этой последовательности находятся последовательности CAAT-бокса вирусного энхансера, TATA-бокса, сайта начала транскрипции и 5' сайт сплайсинга.

За последовательностями CMV расположена искусственная нетранслируемая область (UTR), содержащая донорную последовательность сплайсинга. Открытая рамка считывания гена, подлежащего экспрессии, следует за последовательностями 3'-сайта сплайсинга, а сигнал раннего полиаденилирования вируса обезьян 40 (SV40) расположен на 3' относительно открытой рамки считывания для терминации транскрипции.

Вакцина против Irn FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора был идентифицирован с применением ПЦР-анализа на основе генетической структурной идентификации (GSI) и подтверждена методом вестерн-блоттинга по экспрессии белка.

Пример 1.4. Антиген FMDV Asia в составе вектора на основе рекомбинантного аденовируса человека 5

Для конструирования рекомбинантной вакцины против FMDV, экспрессирующей белок FMDV, использовали вектор аденовируса C человека, серотипа 5 (Ad5) (аденовирусный вектор) с делециями в областях генома E1, E3 и E4 (каркас GV11, см. пат. США 8323663). Синтетическую кодирующую последовательность капсида FMDV P1 и неструктурные гены 2A, 2B, частичный 2C (2C'), частичный 3A (3A'), 3B и последовательность, кодирующую протеазу 3C из штамма FMDV Asia/Leb/89, вводили в челночную плазмиду (см. фиг. 8). Вакцину против Asia FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора сконструировали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1.2.

Экспрессирующая кассета Asia FMDV, расположенная в делеционном соединении области E1, читается справа налево относительно транскрипции вирусной геномной РНК. В фланкирующей нуклеотидной последовательности вставляемой кассеты нет известных регуляторных сигналов. Энхансер/промотор CMV контролирует инициализацию транскрипции. Внутри этой последовательности находятся последовательности CAAT-бокса вирусного энхансера, TATA-бокса, сайта начала транскрипции и 5' сайт сплайсинга.

Последовательности CMV сопровождаются искусственной непереведенной областью (UTR), содержащей донорную последовательность сплайсинга. Открытая рамка считывания гена, подлежащего экспрессии, следует за последовательностями 3'-сайта сплайсинга, а сигнал раннего полиаденилирования вируса обезьян 40 (SV40) расположен 3' относительно открытой рамки считывания для терминации транскрипции.

С помощью вестерн-блот-анализа было подтверждено, что химерная вакцина против Asia FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора экспрессирует белок Asia in vitro в клетках 293, что дает реактивный белок, который мигрировал в положение приблизительно 38 кДа. Антитело, используемое для обнаружения в вестерн-блот-анализе, представляет собой поликлональное антитело FMD VP2. Молекулярная масса экспрессированного белка AsiaSS.2B, была неотличима от наблюдаемой после трансфекции положительной контрольной плазмидой клеток 293.

Пример 2. Исследование контрольным заражением на коровах и свиньях

Коров и свиней вакцинировали вакциной против FMDV A24-A12 или вакциной против O1M87 FMDV один раз в 0-й день в.м. и заражали на 14-й день многими серотипами FMDV, такими как штаммы A24, A12, O1, Asia, Irn и Iraq.

На фиг. 9 показана защита вакцины O1 FMDV у животных против заражения FMDV при трех разных дозах и контроль. В этом исследовании титрования дозы вакцина против O1M FMDV на основе аденовирусного вектора оценивалась на способность оказывать защиту против генерализованного заболевания FMD (поражения конечностей) после прямого гомологичного заражения IDL через 14 дней после вакцинации (dpv). Здоровых 6-месячных коров породы Голштейн случайным образом распределяли в одну из четырех групп обработки. Контрольных, наивных коров (T01; n = 4) иммунизировали внутримышечно одной 2 мл дозой буферного раствора, используемого для приготовления конечного лекарственного состава (FFB). Коров в T02-T04 (n = 7/группа) вакцинировали уменьшающимися дозами [фокусобразующие единицы (FFU) анти-аденовирусного гексона или анализ образования фокусов (FFA); log₁₀] активного ингредиента, приготовленного из исходного вакцинного вируса, полученного на 2 пассаже (MSV + 2), приготовленного в адъюванте ENABL™ C1. T02-T04 получили 2,38x10⁵, 5,94x10⁴ FFU или 1,49 x10⁴ общей дозы FFU, соответственно. Через 2 недели после вакцинации (день заражения) 100% вакцинированных животных T02 и T03 имели сывороточные титры нейтрализации вируса (SVN) FMNV O1 Manisa, против 43% в группе, обработанной самой низкой дозой вакцины (T04). После интрадермального лингвального заражения 1 × 10⁴ бычьей инфекционной дозой 50% (BID₅₀) FMDV O1 Manisa, 100% контроля T01 (интактные коровы) продемонстрировали генерализованное заболевание (поражения конечностей). Напротив, уровень защиты от генерализованного заболевания в вакцинированных группах варьировал от 86% (T04) до 100% (T02 и T03). Все четыре контрольных коровы (T01) были положительными по FMDV в плазме, собранной в течение 1-3 дней после заражения (dpc), тогда как ни одно из 21 вакцинированного животного не обнаруживало виремию плазмы на 1-5 dpc. В T01 88% назальных образцов, собранных 2-5 dpc, были положительными по вирусу, по сравнению с 25% (T03), 27% (T02) и 36% (T04) протестированных образцов 2-5 dpc. На фиг. 10 показана серология вакцины O1 FMDV при трех дозах и контроля.

Эти результаты показывают, что активный ингредиент вакцины против O1M FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора, приготовленной в адъюванте ENABL C1, обладает высокой иммуногенностью и эффективностью против IDL, гомологичного контрольного заражения FMDV крупного рогатого скота и дает данные о предполагаемой минимальной защитной дозе.

Обе вакцины против A24-A12 и O1M87 были проверены на предмет безопасности на телятах и мышах.

Пример 3. Адъювантная серологическая иммуногенность и соответствующее исследование вироцидности/стабильности

Применение адъюванта с вакциной может уменьшить минимальную защитную дозу (MPD) и дать более эффективную вакцину. Уменьшенная MPD может быть сбалансирована стоимостью адъюванта и гарантией поставок. Однако некоторые адъюванты могут снизить эффективность вакцины. Адъювант может подтолкнуть иммунную систему к нежелательному ответу, или адъювант может нанести ущерб иммунизирующему агенту (например, из-за утраты стабильности).

Целью исследования было оценить эффективность серологии адъюванта. Исследование эффективности серологии было проведено у крупного рогатого скота, и параллельно было проведено исследование вироцидности/стабильности для того, чтобы определить, оказывают ли какие-либо из пяти адъювантов пагубные последствия на аденовирусные вакцины FMDV. Каждая доза состоит из 200 мкл конечного AI (активного ингредиента) на дозу при дозе 2 мл с каждым из адъювантов. Адъювантами являются полиакриловая кислота, эмульсия LF2, эмульсия LR6, CARBIGEN™ M и ENABL® C1 (см. таблицу 1.1 ниже).

Таблица 1.1. Получение аденовирусных вакцин против FMDV

Группа	Адъювант	Вакцинный состав
G1	Нет адъюванта	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + FFB (буферный раствор, используемый для приготовления конечного лекарственного состава) (50% об./об.)
G2	Полиакриловая кислота	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + полимер полиакриловой кислоты (доза 4 мг/2 мл)
G3	Эмульсия LF2	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + TS6* при 20% об./об.
G4	Эмульсия LR6	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + LR4** при 25% об./об.
G5	CARBIGEN™ M	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + CARBIGEN™ M до 10% об./об. конечного серийного разведения
G6	ENABL® C1	Вакцина против FMDV (105,7 на мл) + ENABL® C1 (20% конечном серийном разведении)

TS6^*: адъювант TS6/эмульсия, как описано в US 7608279 и US 7371395

LR4^**: адъювант LR4/эмульсия, как описано в US 7691368

CARBIGEN™: суспензия адъюванта на основе карбомера (Carbopol 934P), продукт MVP Laboratories, Inc.

ENABL® C1: адъювантный продукт для крупного рогатого скота, коммерчески приобретенный у VaxLiant

Таблица 1.2. Эмульсия TS6 (премутация, описанная в US 7608279 и US 7371395)

Масляная фаза (120 мл)
Сорбитан моноолеат (SPAN 80®)	1,8% мас./об.
Сорбитан триолеат (20OE) (TWEEN 85®)	10,2% мас./об.
Парафиновое масло (MARCOL 82®)	об./об.
Водная фаза (120 мл)
20% (мас./об.) Раствора сорбитан моноолеата (20 OE) (TWEEN 80®)	11,25% мас./об.
0,02 М изотонический буфер динатрий и монокалий фосфата (рН 7,8)	85,75% об./об.
1% меркуротиолат натрия (Thionersal®) в воде	1,5% об./об.

Таблица 1.3. Эмульсия LR4 (первичная эмульсия, описанная в US 7691368)

Масляная фаза (72 мл)
Oleth-2 (BRIJ® 92)	1,8% мас./об.
Oleth-5 (VOLPO® N5)	8,2% мас./об.
Парафиновое масло (MARCOL 82®)	87,5% об./об.
Консервант	2,5% об./об.
Водная фаза (108 мл)
Полоксамер 407 (LUTROL® F127)	0,58% мас./об.
0,02 М изотонический буфер, содержащий динатрий и монокалий фосфат (рН 7,8)	QS до 100,0% об./об.

Вакцины хранили при 4°C и 25°C и тестировали с течением времени. Вирусы в каждой вакцине титровали в соответствии со стандартным анализом титрования по формированию фокусов, в котором количество обнаруженного вируса определяли с помощью специфических антиаденовирусных антител на клеточном монослое. Соответствующие титры сравнивали. Данные первых 3 месяцев представлены ниже, в таблице 2 и на фиг. 11 (25°C) и 12 (4°C). При 4°C большинство антигенов или вирусов, присутствующих в готовых вакцинах, стабильны до 3 месяцев. При 25°C антигены или вирусы, приготовленные с помощью адъювантов, полиакриловой кислоты, LF2 и Carbigen M относительно стабильны до 7 недель. Стабильность этих трех составов показала небольшое снижение при 25°С в 3-месячной точке. Однако это снижение меньше, когда рекомбинантный вирус объединяли с адъювантом, что подтверждает защитный эффект адъюванта. Антигены или вирусы, включенные в состав вместе с адъювантом LR6, испытывали некоторую интерференцию при тестировании адъюванта, о чем свидетельствует представленный ниже уровень обнаружения при 4°C и 25°C. Однако композиция, дополненная адъювантом LR6, давала специфический титр вируса через 3 месяца и была стабильной при 25°C.

Таблица 2 Исследование вироцидности и стабильности пяти адъювантов вплоть до 3 месяцев

адъювант	T=0	Т = 24 часа	T = 1 неделя	T = 2 недели	T=4 неделя	T=7 неделя	T = 3 месяца
G1 - 4ºC	6,94	6,61	6,88	6,90	6,89	6,80	7,21
G1 - 25ºC	7,10	6,70	6,76	6,34	5,59	4,24	Ниже уровня обнаружения
G2 - 4ºC	6,97	6,51	7,04	6,96	6,97	6,90	7,07
G2 - 25ºC	6,91	6,40	6,94	6,93	6,69	6,56	5,85
G3 - 4oC	6,68	6,25	6,74	6,80	6,74	6,93	6,92
G3 - 25ºC	6,42	6,40	6,71	6,69	6,67	6,63	5,85
G4 - 4ºC	6,51	Ниже уровня обнаружения*	6,69	5,36	Ниже уровня обнаружения*	Ниже уровня обнаружения*	6,78
G4 - 25ºC	6,52	Ниже уровня обнаружения*	6,69	5,44	Ниже уровня обнаружения*	Ниже уровня обнаружения*	6,21
G5 - 4ºC	6,82	6,81	6,91	6,80	6,96	7,17	7,13
G5 - 25ºC	6,87	6,83	6,92	6,51	6,61	6,42	5,85
G6 - 4ºC	6,84	6,79	6,95	6,77	6,73	7,11	7,16
G6 - 25ºC	6,84	6,84	6,81	6,72	Ниже уровня обнаружения	Ниже уровня обнаружения	Ниже уровня обнаружения

Ниже уровня обнаружения*: интерференция при тестировании адъюванта

Соответствующее серологическое исследование проводилось на крупном рогатом скоте. Каждая группа содержала 10 животных на одну экспериментальную группу (5 в контроле), которым вводили одну 2 мл дозу в 0 день с последующим буст-введением на 21 день. В нескольких временных точках на протяжении всего исследования забирали образцы крови и анализировали образцы сыворотки. Проводили серологию по титру нейтализации вируса. Первоначальные данные свидетельствуют о серологических ответах в нескольких группах на 14 день после первой вакцинации. В совокупности данные показывают, что вакцины против FMD на основе аденовирусного вектора, включенные в составы с некоторыми адъювантами, могут обеспечить улучшение термостабильности и способность преодолевать температурные отклонения. В сочетании с этими исходными данными иммунологический ответ либо сохраняется, либо потенциально улучшается.

Пример 4. Серологическая иммуногенность у крупного рогатого скота двухдозовой вакцинации многоцелевым антигеном FMDV O1M в составе вектора на основе рекомбинантного аденовируса человека

Цель исследования - оценить серологическую антительную реакцию у крупного рогатого скота после введения FMDV O1Manisa в составе аденовирусного вектора, включенного в состав с различными адъювантами и без них.

Пятьдесят пять стандартно выращенных телят (около 5 месяцев) случайно распределяли в одну из шести групп обработки, как показано в таблице 4 ниже.

Таблица 4

Группа	Вакцина	Адъювант	Путь введения	Частота введения	Количество животных
1	Adt.O1/Manisa	ENABL® C1	IM	Дважды с интервалом 21 день	10
2	Adt.O1/Manisa	LF	IM	Дважды с интервалом 21 день	10
3	Adt.O1/Manisa	Полиакриловая кислота	IM	Дважды с интервалом 21 день	10
4	Adt.O1/Manisa	Carbigen M	IM	Дважды с интервалом 21 день	10
5	Adt.O1/Manisa	Нет	IM	Дважды с интервалом 21 день	10
6	FFB Placebo	Нет	IM	Дважды с интервалом 21 день	5

Все телята, кроме животных из группы 6 (индикаторные животные), были вакцинированы конструкцией O1/Manisa на основе аденовирусного вектора с адъювантом (группы 1-4) или без адъюванта (группа 5), дважды с 21-дневным интервалом 2 мл тестируемой вакцины. Все инъекции вводились внутримышечным путем (IM) через плечо попеременно с правой и левой сторон. В таблице 4 выше содержится краткое описание обработки для каждой группы.

Телята периодически наблюдались в течение, по меньшей мере, 1 часа после каждой вакцинации на предмет клинических признаков острых системных побочных эффектов. Образцы крови собирали у всех животных в дни -1 (до вакцинации), 7, 15, 21 (до вакцинации), 28 и 35. Образцы сыворотки от всех животных протестировали на антитела против FMDV нейтрализацией вируса сывороткой (SVN). Кроме того, ответы на антитела к аденовирусу (SAV) определяли у всех животных из всех групп в образцах, собранных в дни -1 и 35. Результаты для SVN и SAV были представлены в Log_10, а значение ≤ 0,6 log₁₀ считалось отрицательным для сывороточного антитела.

Оценка безопасности после вакцинации включала ректальную температуру, визуальный осмотр и пальпацию мест инъекции в течение как минимум 3 дней после каждой вакцинации. Коровы с локальными побочными эффектами в месте инъекции наблюдались периодически до разрешения аномалии. Исследование было прекращено на D35 после окончательного сбора крови.

Результаты серологического ответа на FMDV с применением антител к FMDV с помощью log₁₀ нейтрализации вируса сывороткой (SVN) описаны ниже.

Все телята из всех групп показали отрицательный результат для антител к FMDV до начала исследования. Все индикаторные животные были отрицательными по антителам к FMDV на протяжении всего исследования.

Сероконверсия после вакцинации определялась как увеличение log₁₀ титра > 0,9.

К 14-му дню (через 2 недели после первой вакцинации) 5/10 телят (50%) в группе ENABL® C1 (группа 1) были сероконвертированы. У оставшихся вакцинированных групп (2-5) было 20-40% сероконвертированных телят. Кроме того, средний титр антител на группу был несколько выше в группе 1 (ENABL® C1), за которой следуют группы 2 (LF) и 3 (полиакриловая кислота) (фиг. 13).

К 35-му дню (через 2 недели после 2-й вакцинации) все вакцинированные животные групп 1 [ENABL®], 2 [LF] и 5 [без адъюванта]) имели сероконверсию, а за ними следовали группы 3 (Полиакриловая кислота) и 4 (карбиген М) с девяносто и восемьдесят процентов, соответственно.

Животные, вакцинированные с адъювантом LF, вакцинированные без адъюванта (группа 5) и вакцинированные с адъювантом ENABL® C1 (группа 1) имели более высокий ответ на антитела после двухдозового режима вакцинации (см. фиг. 13).

Результаты серологического ответа на FMDV с применением аденовирусных антител по Log10 нейтрализации вируса сывороткой (SVN) описаны ниже.

Все индикаторные и вакцинированные телята были отрицательными по аденовирусу согласно титрам SN-антител в день -1 ( ≤ 0,6 log₁₀). На 35 день все, кроме одного из вакцинированных телят (ID: 134, группа 5), сероконвертировали с общим высшим геометрическим средним титром по группам в группах, вакцинированных вакциной, содержащей адъювант (группы 1-4) (см. фиг. 14).

Результаты показали серологические ответы на 14 день в нескольких группах после первой вакцинации. Через две недели после второй вакцинации более высокий антительный ответ наблюдался у вакцинированных телят с адъювантом LF, а затем у вакцинированных без адъюванта и с адъювантом Enable C1.

Результаты показывают, что антительный ответ после одной вакцинации, независимо от наличия или отсутствия адъюванта, является небольшим. Однако при использовании режима из двух вакцинаций («прайм-буст»), антительный ответ в целом выше. Не наблюдалось никаких системных побочных явлений, при двухкратном внутримышечном введении вакцинной конструкции (с интервалом 3 недели).

Пример 5. Оценка у свиней серологии вакцин против FMDV после вакцинации

Цель исследования - оценить антительный ответ у поросят после введения моновалентных вакцинных составов, содержащих FMDV O1Manisa в составе вектора на основе аденовируса 5) и/или рекомбинантные вирусоподобные частицы (VLP), включающие бакуловирус-экспрессируемый FMDV O1Manisa.

Двадцать обычно выращенных поросят (в возрасте приблизительно 5 недель) случайно распределяли на две группы обработки, каждая из которых включала 10 поросят. Состав групп представлен в таблице 5 ниже.

Таблица 5

Группа	Вакцины	Доза на одного поросенка; Аденовирусные конструкции (FAID50 /мл (log10)	Частота	Количество животных
1	Аденовирус O1M без адъюванта / Bac O1M+ адъювант TS6	108	Аденовирус X + 5 O1M (день 0) и Bac O1M адъювант TS6 (День 21)	10
2	индикаторное животное (N/A)	не применимо к данному случаю	не применимо к данному случаю	10

Поросят в группе 1 вакцинировали 2 мл вакцины. Все инъекции вводили внутримышечно (в/м) через плечо попеременно с правой и левой сторон. Перед каждой вакцинацией проводили осмотр поросят для определения их общего состояния здоровья. Образцы крови собирали у всех поросят в дни 0 (до вакцинации), 7, 14, 21 (до вакцинации), 28 и 35. Образцы сыворотки в день 35 из всех поросят тестировали на антитела к FMDV с помощью нейтрализации вируса сывороткой (SVN). Образцы от этих поросят в группе 1 подвергались SVN-анализу во все дни сбора, так как у них был наиболее высокий общий антительный ответ до 35-го дня. Результаты были представлены в log_10, и значение ≤ 0,75 log₁₀ считалось отрицательным для сывороточного антитела. Поствакцинационные оценки безопасности, включающие ректальную температуру, визуальный осмотр и пальпацию места инъекции проводили в течение 3 дней после каждой вакцинации.

Результаты серологического ответа на FMDV с применением антител к FMDV с помощью log 10 нейтрализации вируса сывороткой (SVN) описаны ниже.

Все индикаторные животные были отрицательными по антителам к FMDV до и в конце исследования.

К 28-му дню (через 1 неделю после 2-й вакцинации) все поросята из первой группы были сероконвертированы (титры ≥ 1,20 log₁₀) (см. фиг. 15). Связанных с вакцинацией системных и/или локальных побочных эффектов не наблюдалось. Результаты ясно показали, что даже несмотря на то, что вакцинированная группа имела небольшой ответ на антитела после первой вакцинации, ответ на антитела после второй («прайм-буст») вакцинации был высоким к концу исследования.

Пример 6. Путь введения

Целью исследования является оценка серологического ответа на двухдозовую вакцинацию у коров или свиней, при которой используются две вакцины против FMDV на основе с рекомбинантного аденовирусного вектора, одна вакцина против FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора и одна вакцина с вирусоподобными частицами (VLP) с бакуловирус-экспрессированным рекомбинантным FMDV или две FMDV VLP-вакцины, и при которой используются различные пути введения (трансдермальный, подкожный или внутрикожный путь введения). Исследование также нацелено на решение проблемы интерференции при введении нескольких вакцин.

Адъювантами являются полиакриловая кислота, эмульсия LF2, эмульсия LR6, CARBIGEN™ M и ENABL® C1. Группы обработки представлены в таблице 6 ниже.

Таблица 6

Группа	Вакцины	Путь введения	Частота введения
1	Адено FMDV	IM или IM/TD или IM/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
2	Адено FMDV	TD или TD/IM или TD/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
3	Адено FMDV	SQ или SQ/TD или SQ/IM	Дважды, с интервалом 21 день
4	Бакуло FMDV VLP	IM или IM/TD или IM/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
5	Бакуло FMDV VLP	TD или TD/IM или TD/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
6	Бакуло FMDV VLP	SQ или SQ/TD или SQ/IM	Дважды, с интервалом 21 день
7	Адено FMDV/Beculo FMDV VLP	IM или IM/TD или IM/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
8	Адено FMDV/Beculo FMDV VLP	TD или TD/IM или TD/SQ	Дважды, с интервалом 21 день
9	Адено FMDV/Beculo FMDV VLP	SQ или SQ/TD или SQ/IM	Дважды, с интервалом 21 день

Телята периодически наблюдались в течение, по меньшей мере, 1 часа после каждой вакцинации на предмет клинических признаков острых системных побочных эффектов. Образцы крови собирали всех животных в дни -1 (до вакцинации), 7, 15, 21 (до вакцинации), 28 и 35. Образцы сыворотки от всех животных протестировали на антитела против FMDV по нейтрализации вируса сывороткой (SVN). Кроме того, антительные ответы к аденовирусу (SAV) определяли у всех животных из всех групп в образцах, собранных в день -1 и 35.

Поствакцинационные оценки безопасности, включающие ректальную температуру, визуальный осмотр и пальпацию мест инъекции проводили в течение 3 дней после каждой вакцинации. Коровы с локальными побочными эффектами в месте инъекции наблюдались периодически до разрешения аномалии.

Результаты показывают эффект «прайм-буст» для всех групп, но эффект «прайм-буст» больше у животных, которые получили прайм-вакцинацию аденовирусной вакциной, а затем буст-вакцинацию бакуловирус-FMD конструктом. Кроме того, на серологический ответ и защиту, а также на продолжительность иммунитета влияет путь введения. Конкретные пути введения и/или специфическая комбинация путей введения TD, IM и SQ, по-видимому, усиливают иммунный ответ, дополнительно повышают защиту, преодолевают интерференцию и защищают животных, положительных по антителам, полученным от матери (MDA-положительных).

Пример 7. Эффективность у свиней

Свиней вакцинировали против FMDV (против нескольких серотипов) дважды с 21-дневным интервалом в режиме «прайм-буст», который может быть гетерологичным протоколом «прайм-буст» (адено-прайм с последующим бакуло-буст), и гомологичным «прайм-буст» (адено-адено; бакуло-бакуло), и заражали 14 dpv многими серотипами FMDV, такими как штаммы A24, A12, O1, Asia, Irn и Iraq.

В исследовании титрования дозы вакцина против FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора оценивалась на предмет способности защищать от генерализованного заболевания FMD (поражения конечностей) после гомологичных и гетерологических контрольных заражений на 14 день после вакцинации (dpv). Процедура, описанная в примере 2, используется в этом исследовании для определения минимальной защитной дозы в режиме введения «прайм-буст».

Результаты показывают, что вакцина против FMDV на основе аденовирусного вектора, используемая в протоколе «прайм-буст», является высокоиммуногенной и эффективной против гомологичных и гетерологичных контрольных заражений FMDV у свиней, преодолевает интерференцию и защищает животных, положительных по антителам, полученным от матери (MDA-положительных).

Пример 8. Эффективность у коров

Коров вакцинировали сначала с помощью вакцины против FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора и бустировали обычной убитой вакциной против FMD или вакциной на основе бакуловирус-экспрессированных FMDV VLP с интервалом 21 день, а на 14-й день после второй вакцинации контрольно заражали множеством серотипов FMDV, таких как штаммы A24, A12, O1, Asia, Irn и Iraq.

В исследовании титрования дозы вакцина против FMDV на основе рекомбинантного аденовирусного вектора оценивалась на предмет способности защищать от генерализованного заболевания FMD (поражения конечностей) после гомологичных и гетерологических контрольных заражений на 14 день после вакцинации (dpv). Процедура, описанная в примере 2, использовалась в этом исследовании для определения минимальной защитной дозы в режиме введения «прайм-буст».

Результаты показывают, что режим введения «прайм-буст» является высокоиммуногенным и эффективным против контрольного заражения гомологичным и гетерологичным FMDV у крупного рогатого скота и обеспечивает защиту животных от инфекции FMDV, преодолевает интерференцию и защищает животных, положительных по антителам, полученным от матери (MDA-положительных).

Опираясь, таким образом, на подробные воплощения настоящего раскрытия, следует понимать, что раскрытие, определенное вышеприведенными примерами, не должно ограничиваться конкретными деталями, изложенными в вышеприведенном описании, поскольку многие его возможные варианты возможны без отступления от духа или объема настоящего раскрытия.

Все процитированные или упоминаемые в данном документе документы («документы, процитированные в данном документе») и все документы, цитируемые или упоминаемые в процитированных документах, вместе с инструкциями изготовителя, описаниями, спецификациями продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном ссылкой в данный документ, включены в данный документ ссылкой и могут быть использованы при практическом применении данного изобретения.

1. Композиция для вызова иммунного ответа у животного против FMDV, включающая эффективное количество рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего антиген вируса ящура (FMDV), причем антиген FMDV содержит полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант, или наполнитель.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вирусным вектором является аденовирус.

3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что антиген содержит структурный белок FMDV и неструктурные белки FMDV.

4. Композиция по любому из пп. 1, 2 или 3, отличающаяся тем, что антиген FMDV кодируется полинуклеотидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что стабильна вплоть до 3 месяцев, когда храниться при 4°C.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду выбирают из группы, состоящей из полиакриловой кислоты, эмульсии LF2, эмульсии LR6, эмульсии TS6, эмульсии LR4, карбомера, гидроксида алюминия, фосфата алюминия, сапонина, CpG, эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде и основанного на карбомере адъюванте.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что является вакциной.

8. Способ вакцинации животного, восприимчивого к инфекции FMDV, или вызова иммунного ответа у животного против FMDV, включающий по меньшей мере одно введение эффективного количества композиции по любому из пп. 1-7.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что способ включает режим введения «прайм-буст».

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что режим «прайм-буст» включает прайм-введение композиции по любому из пп. 1-7, и буст-введение композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, содержащий полинуклеотид для экспрессии in vivo антигена FMDV, или композиции, включающей антиген FMDV, или композиции с инактивированным вирусом, включающей антиген FMDV, для защиты животного от FMDV и/или для предотвращения прогрессирования заболевания у инфицированного животного.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что режим «прайм-буст» включает прайм-введение композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, содержащий полинуклеотид для экспрессии in vivo антигена FMDV, или композиции, включающей антиген FMDV, или композиции с инактивированным вирусом, включающей антиген FMDV, и буст-введение композиции по любому из пп. 1-7 для защиты животного от FMDV и/или для предотвращения прогрессирования заболевания у инфицированного животного.

12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что способ защищает животных, положительных по антителам, полученным от матери (MDA-положительным), против инфекции FMDV.