Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета

Авторы патента:

Пономаренко Дмитрий Григорьевич (RU)

Куличенко Александр Николаевич (RU)

Курчева Светлана Александровна (RU)

Тюменцева Ирина Степановна (RU)

Катунина Людмила Семёновна (RU)

Логвиненко Ольга Васильевна (RU)

Гостищева Светлана Евгеньевна (RU)

Афанасьев Евгений Николаевич (RU)

Костюченко Марина Владимировна (RU)

Ракитина Екатерина Львовна (RU)

Абзаева Наталья Вячеславовна (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Владельцы патента RU 2725872:

Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при проведении оценки уровня противочумного иммунитета. Для этого применяют комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии в качестве активатора лимфоцитов. Использование комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба в концентрации белка 4,5 мг/мл обладает наибольшим стимулирующим потенциалом in vitro в отношении лимфоцитов, экспрессирующих рецептр CD25. 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано при проведении оценки уровня противочумного иммунитета.

Для большинства инфекций, в том числе и чумы, где основную роль играет клеточный иммунитет, защитные уровни клеточных реакций у людей не определены, что обуславливает продолжающийся поиск биомаркеров, свидетельствующих о напряженности противочумного иммунитета.

В этой связи важным критерием эффективности, отражающим клеточное звено противочумного иммунитета, является перераспределение в соотношении Т- и В-лимфоцитов и регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, имеющих маркеры: CD3 (общий для всех Т-лимфоцитов), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цитотоксические), CD19 (В-лимфоциты) [Богачева Н.В., Дармов И.В., 2013; Богачева Н.В., Крючков А.В., 2013], маркер ранней активации клеток CD25; CD69 [Фирстова В.В. и др., 2010], спонтанная и индуцированная продукция маркерных Th1- и Th2-цитокинов [Щуковская Т.Н. и др., 2011].

Известен способ диагностики иммунного статуса путем активации базофилов антраксином для диагностики сибирской язвы [Использование теста активации базофилов с антраксином для лабораторной (IN VITRO) диагностики сибирской язвы / А.Н. Куличенко, Е.Л. Ракитина, Д.Г. Пономаренко, О.В. Логвиненко, А.Г. Рязанова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - №3 (113). - С. 86-88. - Библиогр.: 6-рус; 2-ин.].

Недостатком способа является возможность использования его только при конкретной инфекции - сибирской язве.

Наиболее близким является способ оценки бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном на примере больных бруцеллезом. [Патент РФ 2582395, опубл. 27.04.16, Бюл. №12].

Недостатком способа является узкоспецифичность метода, позволяющая использовать его только при бруцеллезной инфекции.

Цель изобретения - применение комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба (ВрАг) в качестве активатора лимфоцитов в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии.

Любой вакцинный препарат должен обладать иммуногенными свойствами - вызывать достаточный по напряженности и длительности иммунитет. Использование антиген-стимулированных клеточных тестов in vitro перспективно для оценки иммунологической эффективности вакцинации. При этом диагностически информативным показателем клеточной антигенреактивности выступает маркер (рецептор) активации лимфоцитов CD25 - высокоаффинный рецептор интерлейкина 2 (IL-2Ra), экспрессирующийся активированными Т-лимфоцитами.

Технический результат изобретения достигается тем, что для оценки динамики субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD25, в качестве специфического антигена использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба. Объектом исследования служили добровольцы, иммунизированные против чумы по эпидемическим показаниям. Взятие биоматериала (крови) у обследуемых осуществляли до вакцинации и на 21 сутки после иммунизации (пик иммуногенеза).

Оценку у вакцинированного контингента уровня Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CD25 на 21 сутки после вакцинации, проводили методом проточной цитометрии после стимуляции в условиях in vitro комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с разными концентрациями белка.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием пакета компьютерных программ Microsoft Excel. Достоверность различия средних рассчитывали по t-критерию, уровень значимости р выбран менее 0,05.

Все обследуемые дали добровольное информированное согласие на участие в настоящих исследованиях (согласно Федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» от 21.11.2011 №323-ФЗ, ред. от 03.08.2018).

Методика приготовления проб

Для проведения исследования полученного клинического материала используют две пластиковые пробирки, объем 5 мл. Пробирки маркируют соответственно №1 и №2. В каждую пробирку вносят по 300 мкл питательной среды RPMI-1640 с пенициллином, из расчета 20 ед/мл и добавляют по 100 мкл стабилизированной крови обследуемого. Для выявления уровня спонтанной активации использовали стерильный изотонический раствор NaCl.

В пробирку №1 вносят 50 мкл стерильного изотонического раствора NaCl. В пробирку №2 - 50 мкл комплекса ВрАг. Пробирки инкубируют 20 часов при температуре (37±1)°С, в условиях повышенного содержания СО₂ (8±2) %. Удаляют надосадочную жидкость. Осадок в количестве 50 мкл переносят в пробирки Falcon для проточного цитометра. В каждую пробирку добавляют 2 мкл моноклональных антител против CD25. Образцы выдерживают 20 мин при температуре (21±1)°С без доступа света. Затем в каждую пробирку вносят по 450 мкл рабочего раствора для лизиса эритроцитов. После 15 минутной экспозиции при температуре (21±1)°С (контроль лизиса эритроцитов), пробы центрифугируют при 250 g 5 минут. Полученный осадок ресуспендируют в 400 мкл Cell Wach (жидкость для разведения клеточной суспензии).

Учет результатов проводят с помощью проточного цитометра FACS Calibur с программным обеспечением Cell Quest Pro.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1.

Обследовали 17 добровольцев иммунизированных против чумы вакциной чумной живой из штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (производство ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Для активации лимфоцитов использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 2,5 мг/мл.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается. К 21 суткам при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 2,5 мг/мл отмечается незначительная активация лимфоцитов - до 16,31±0,52%, что говорит о недостаточном количестве специфического агента в ВрАг.

Пример 2.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается. На 21 сутки при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл отмечается статистически достоверное повышение интенсивности экспрессии лимфоцитами рецептора CD25, исследуемый показатель имел двукратное увеличение, по сравнению со значением до вакцинации, составив в среднем 27,92±1,82% (р≤0,05). Спонтанной активации лимфоцитов при воздействии стерильного изотонического раствора NaCl (контроль) не зафиксировано. Результаты исследования представлены в таблице.

Пример 3.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается.

На 21 сутки при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 9,0 мг/мл наблюдается незначительная активация лимфоцитов - до 14,22±0,31%, что говорит о блокировке рецепторов большим количеством белка в комплексе водорастворимых антигенов.

Таким образом, комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл обладает наибольшим стимулирующим потенциалом in vitro в отношении иммунных лимфоцитов по маркеру CD25.

Заявленная возможность применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл в качестве активатора лимфоцитов в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии (пример №2) показывает оптимальную специфичность реакции при оценке противочумного иммунитета.

Применение комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл для оценки уровня противочумного иммунитета в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии в качестве активатора лимфоцитов.

Изобретение относится к области ревматологии, нефрологии, а именно к области диагностики хронического повреждения тубулоинтерстициальной ткани почек у пациентов с анкилозирующим спондилитом.

Способ окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов // 2725765

Изобретение относится к медицине, а именно к способу окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов. Способ окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов, заключающийся в том, что используют свежезамороженные срезы, переносят их на стекла с адгезивным покрытием, подвергают процессу инкубации в 2%-ном растворе формалина, сушат на воздухе при температуре 20-26°С в течение часа; на этапе регидратации стекла с фиксированными срезами помещают в ёмкость с солевым фосфатным буфером PBS на 15 минут, после чего производят отмывку в солевом фосфатном буфере два раза по 5 минут; следом на этапе демаскировки инкубируют препараты поочередно в 1%-ном додецилсульфате натрия и в солевом фосфатном буфере в течение 15 минут, далее промывают в солевом фосфатном буфере 3 раза по 5 минут; далее на этапе блокировки на мокрые срезы наносят 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, проводят блокировку в течение 30 минут и отмывают один раз 5 минут в солевом фосфатном буфере с добавлением детергента; следом проводят этап инкубации с первичными антителами, во влажной камере при температуре 20-26°С в течение 1 часа, далее промывают срезы в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут; далее следует этап инкубации с вторичными антителами во влажной камере в течение 1 часа, после проводят отмывку 3 раза по 5 минут; далее происходит окрашивание ядер: на стекло наносят реагент Prolong DAPI, закрывают покровным стеклом, закрепляют прозрачным лаком.

Платформа для обнаружения и анализа терапевтических агентов // 2724998

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации потенциальных агентов, включающий: (a) предоставление библиотеки потенциальных агентов, в которой каждый потенциальный агент присоединен к уникальному маркеру-нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность маркера, где потенциальные агенты выбраны из группы, состоящей из белков, нуклеиновых кислот, клеток и небольших молекул, где небольшие молекулы выбраны из группы, состоящей из потенциальных ингибиторов ферментов, потенциальных антибиотиков, потенциальных противовирусных агентов, потенциальных пестицидов, потенциальных гормонов, потенциальных активаторов клеточной сигнализации, потенциальных ингибиторов клеточной сигнализации и потенциальных активаторов ферментов; (b) присоединение библиотеки потенциальных агентов к твердой подложке, включающей праймеры нуклеиновых кислот, посредством гибридизации маркеров-нуклеиновых кислот с праймерами нуклеиновых кислот с образованием массива потенциальных агентов; (c) приведение массива потенциальных агентов в контакт с агентом для скрининга, при котором один или более из потенциальных агентов массива реагирует с агентом для скрининга, где агент для скрининга реагирует с одним или более потенциальными агентами посредством связывания с одним или более потенциальными агентами или блокировки связывания между потенциальным агентом и аналитом, имеющим сродство к потенциальному агенту; (d) исследование массива во время или после контакта массива с агентом для скрининга для установления того, что по меньшей мере один потенциальный агент, находящийся в массиве, реагирует с агентом для скрининга, где исследование массива включает обнаружение агента для скрининга, который связан с одним или более потенциальными агентами, где агент для скрининга является люминесцентным, а обнаружение представляет собой обнаружение люминесценции от массива; (e) секвенирование маркеров-нуклеиновых кислот в массиве для определения последовательности маркера, который присоединен к каждому из потенциальных агентов; и (f) идентификацию по меньшей мере одного потенциального агента в массиве, который реагирует с агентом для скрининга, на основании определенной последовательности маркера.

Способ оценки имплантационной состоятельности эндометрия при пролиферативно-воспалительных нарушениях в эндометрии при эндометриозе, ассоциированном с эндометриальным фактором бесплодия // 2724384

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для оценки имплантационной состоятельности эндометрия при пролиферативно-воспалительных нарушениях в эндометрии при эндометриозе, ассоциированном с эндометриальным фактором бесплодия.

Способ оценки рецептивности эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии // 2724381

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для оценки рецептивности эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии.

Способы диагностики неоплазий женских репродуктивных органов // 2723531

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для анализа наличия неоплазии женских репродуктивных органов или озлокачествления неоплазии женских репродуктивных органов с учетом гиперметилирования одного или нескольких маркерных генов.

Способ прогнозирования возникновения неонатальных судорог у новорожденных из группы высокого перинатального риска // 2722022

Изобретение относится к медицине, а именно к детской неврологии, и может быть использовано для прогнозирования возникновения судорог у доношенных новорожденных в позднем неонатальном периоде.

Способ прогнозирования почечного ответа на противомиеломную терапию у пациентов с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе // 2721947

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, а именно к прогнозированию почечного ответа на противомиеломную терапию при миеломной каст-нефропатии с острым почечным повреждением с потребностью в диализе.

Устройство экспресс-диагностирования сердечной деятельности // 2721726

Настоящее изобретение относится к иммуноанализу для выявления кардиомаркеров на ранних стадиях кардиального события, такого как инфаркт миокарда. Изобретение касается устройства для обнаружения маркеров острого инфаркта миокарда (ОИМ) в образце крови человека, включающего иммобилизованную в полосе иммуноанализа смесь по меньшей мере двух антител или конъюгатов антител, одновременно вступающую в реакцию по меньшей мере с сердечным тропонином (СТ) и с сердечной формой белка, связывающего жирные кислоты (HFBP), объединенные реакции обеспечивают визуальный сигнал, если концентрация каждого из указанных маркеров превышает определенное заданное пороговое значение, составляющее 0,5 нг/мл для СТ и 5 нг/мл для HFBP, указанный визуальный сигнал быстро и достоверно указывает на событие ОИМ в критический период от 1 до 4 часов с момента его возникновения.

Способ оценки риска развития атеросклероза на основании определения сывороточного уровня интерлейкина-33 // 2721689

Изобретение относится к области медицины, в частности кардиологии, лучевой диагностике, и может быть применено для прогнозирования риска развития атеросклеротических изменений сосудов.