Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека brcch4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и молекулярной биологии. Предложена новая рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген (PSMA). Клеточная линия BrCCh4e-134 получена путем трансдукции клеточной линии BrCCh4e лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием кальций-фосфатной трансфекции клеточной линии HEK293T рекомбинантной лентивирусной плазмидой pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo. Предлагаемая клеточная линия предназначена для тестирования активности противоопухолевых и антиметастатических PSMA-таргетных препаратов. Изобретение позволяет расширить арсенал PSMA-положительных клеточных линий, обладающих туморогенностью и способностью метастазировать. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новой клеточной линии рака молочной железы человека BrCCh4e-134, обладающей стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и экспрессирующей простат-специфический мембранный антиген (PSMA) в качестве трансгена. Данная клеточная линия предназначена для лабораторных и доклинических исследований с целью оценки эффективности противоопухолевых препаратов, особенно обладающих таргетным действием по отношению к PSMA-положительным опухолям.

Рак простаты (РП) является вторым по частоте встречаемости онкологическим заболеванием у мужчин в развитых странах и находится на третьем месте по частоте смертельных исходов у онкобольных мужчин [1]. После хирургической резекции раннедиагностированного рака простаты необходимо проведение химио- и/или радиотерапии для предотвращения рецидивов и метастазов. В случае метастатических форм РП химио- и радиотерапия являются недостаточными мерами для предотвращения рецидивов. Дополнительные преимущества таким больным может обеспечить таргетная терапия, направленная на специфические мишени рака простаты. Важным аспектом для исследования таргетных препаратов является наличие негативной клеточной модели, в идеале отличающейся только наличием таргетной молекулы. Простат-специфический мембранный антиген (PSMA) является молекулой, характерной для большинства раков простаты, а уровень экспрессии PSMA коррелирует со степенью тяжести заболевания, в том числе с метастатическими формами заболевания [2].

Известна клеточная линия аденокарциномы простаты человека 22Rv1 (№ CRL-2505 в коллекции АТСС), полученная из аденокарциномы человека, выращенной на мышах-ксенографтах. Для стабильной экспрессии PSMA клетки культивируют в присутствии дигидрокситестостерона. Помимо PSMA клетки 22Rv1 экспрессируют андрогеновые рецепторы. Клетки 22Rv1 туморогенны в мышах nude. С использованием линии 22Rv1 было проведено исследование противоопухолевого потенциала препаратов, направленных к PSMA.

Известна клеточная линия метастатической аденокарциномы простаты человека LNCaP (№ CRL-1740 в коллекции АТСС), полученная из материала биопсии метастаза лимфатического узла пациента с аденокарциномой простаты. Также как и клетки 22Rv1, LNCaP помимо PSMA, экспрессируют андрогеновые рецепторы. При трансплантации на мышей опухоль развивается лишь в 50% случаев и характеризуется медленным ростом [3].

Другой возможностью получения PSMA-положительных клеточных моделей является трансдукция PSMA-негативных клеток конструкциями, обеспечивающими экспрессию PSMA в качестве трансгена. Такие трансгенные PSMA-положительные линии также широко востребованы и успешно применяются, например, сконструированные на основе PSMA-негативных клеток карциномы простаты Du145 и РС3, а также на основе нормальных фибробластов 3Т3 [4]. Указанные трансгенные клеточные линии удобны для исследования таргетных препаратов, имеющих специфичность к PSMA антигену in vitro и в опухолевых моделях на животных. Кроме того, наличие PSMA-негативных родительских линий позволяет оценивать вклад цитотоксической и таргетной компоненты.

Тем не менее, трансгенные линии рака простаты, как правило, сохраняют локализацию преимущественного метастазирования при создании метастатических опухолевых моделей на животных. Наиболее характерным сайтом метастазирования аденокарциномы простаты (более 90% случаев) является костная локализация, и такая особенность сохраняется для внутривенно перевиваемых клеточных линий рака простаты, в том линий РС-3, VCaP, DU145 и LNCaP. Известно, что подкожная имплантация мышам клеток рака простаты редко ведет к появлению метастазов, и только ортотопическая имплантация опухолевых клеток в простату позволяет получать модели спонтанного метастазирования [5]. Стоит отметить, что вероятность формирования опухолевых узлов при ортотопической трансплантации на 25% ниже, чем при подкожной. Суммируя сказанное, ортотопическое введение опухолевых клеток в простату позволяет получить модели, метастазирующие в лимфоузлы, однако такой способ введения опухолевых клеток более трудоемкий и требует специальных медицинских навыков, поскольку осуществляется в процессе открытой операции на брюшной полости. Такая особенность клеточных линий рака простаты создает трудности при анализе антиметастатического потенциала препаратов на модельных животных, поскольку не воспроизводит метастазы в лимфоузлах [6, 7].

Известны PSMA-позитивные метастатические клеточные модели РП, полученные с помощью внутрисердечной имплантации иммунодефицитным животным клеток аденокарциномы простаты. При такой трансплантации эффективно формируются метастазы в костях и других отдаленных органах [8]. По аналогии с ортотопической трансплантацией, внутрисердечная трансплантация клеток РП является трудоемкой и травматичной для экспериментальных животных.

Таким образом, существующие PSMA-позитивные клеточные модели РП человека имеют ограничения в области метастатических моделей на животных.

В то же время, последние исследования показали, что в тканях рака молочной железы человека (РМЖ), а также в клетках кровеносных сосудов, инфильтрирующих эти опухоли, встречаются клетки, экспрессирующие PSMA [9]. При этом экспрессия белка PSMA в отдаленных метастазах рака молочной железы была гораздо выше, чем в первичных опухолевых узлах. Поэтому, расширение арсенала охарактеризованных опухолевых клеточных линий, экспрессирующих белок PSMA, для разработки PSMA-направленных таргетных препаратов остается актуальной задачей.

Наиболее близкой к заявляемой клеточной линии - прототипом, является рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека LMD-MDA-MB-231-PSMA, экспрессирующая белок PSMA человека в качестве трансгена. Эта линия была сконструирована на основе линии клеток LMD-MDA-MB-231, полученных из легочного метастаза мышей линии NOD-SCID, с трансплантированными клетками аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 (№ CRM-HTB-26 в АТСС). Для экспрессии PSMA клетки LMD-MDA-MB-231 трансдуцировали лентивирусными частицами LV-PSMA, представляющими собой частицы, псевдотипированные белком вируса везикулярного стоматита VSV-G и кодирующими последовательность мРНК гена PSMA человека [10].

Недостатками известной линии является то, что при значительных размерах первичного опухолевого узла (200 мм³), формируемого в иммунодефицитных животных, не продемонстрирована способность опухоли LMD-MDA-MB-231-PSMA к метастазированию. Кроме этого, известная рекомбинантная клеточная линия не предназначена для тестирования активности антиметастатических препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.

Задачей изобретения является расширение арсенала PSMA-положительных клеточных линий, используемых для исследования таргетных противоопухолевых препаратов и изучения особенностей карциногенеза, и обеспечение возможности эффективно оценивать антиметастатический потенциал препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.

Технический результат: получение новой рекомбинантной

клеточной линии, экспрессирующей простат-специфический мембранный антиген человека (белок PSMA человека), обладающей туморогенностью и способностью метастазировать, которая может быть использована для тестирования активности антиметастатических препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.

Указанный технический результат достигается новой рекомбинантной клеточной линией рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующей белок PSMA человека и обладающей туморогенностью и способностью метастазировать.

Рекомбинантную клеточную линию рака молочной железы человека BrCCh4e-134 получают на основе культуры клеток рака молочной железы BrCCh4e [хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 799Д] путем лентивирусной трансдукции. Рекомбинантную клеточную линию BrCCh4e-134 получали следующим образом. Для интеграции кДНК кассеты, кодирующей PSMA, клетки BrCCh4e обрабатывали соответствующими лентивирусными частицами. Сборку вирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), проводили в клетках линии HEK293T, используя стандартный протокол кальций-фосфатной трансфекции [11]. В качестве векторной плазмиды использовали рекомбинантную лентивирусную плазмиду pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo, кодирующую полноразмерный белок человека PSMA, с использованием вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2 [12].

Сконструированная рекомбинантная лентивирусная плазмида pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo имеет следующие характеристики:

- имеет размер 9671 п. о.;

- кодирует человеческий белок PSMA;

- состоит из следующих элементов:

а) фрагмента ДНК размером 2253 п. о., кодирующего человеческий белок PSMA;

б) гибридного конститутивного промотора человеческого фактора элонгации трансляции альфа (EF1a) и Т-лимфотропного вируса человека (HTLV), обеспечивающего конститутивную и сильную экспрессию целевого белка PSMA в клетках млекопитающих;

в) генетических маркеров:

AMPr - ген ампициллин-резистентности (bla), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;

zeo - селективный ген устойчивости к зеоцину (ген ble Streptoalloteichus hindustanus);

г) гибридного RSV-5'LTR промотора, состоящего из последовательностей вируса саркомы Раусса (RSV) и ВИЧ-1, обеспечивающего ТАТ-независимый синтез вирусных транскриптов в клетках-паковщицах лентивирусных частиц;

д) модифицированных генетических элементов ВИЧ-1 (сРРТ, gag, env, RRE), необходимых для корректного процессинга вирусной РНК и сборки лентивирусных частиц;

е) 5'LTR и 3'dLTR-последовательностей ВИЧ-1, обеспечивающих стабильную интеграцию заключенных между ними последовательностей в геном клеток млекопитающих без возможности их дальнейшей повторной мобилизации;

ж) последовательности WPRE - регуляторного элемента вируса гепатита сурков, обеспечивающего увеличение стабильности и трансляции транскриптов;

з) элемента IRES - внутреннего сайта посадки рибосомы кардиовируса А, обеспечивающего кэп-независимую инициацию трансляции сцепленного маркеа zeo.

Графическая карта рекомбинантной лентивирусной плазмиды pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo представлена на Фиг. 1, а ее нуклеотидная последовательность представлена на Фиг. 2.

Трансдукцию проводили методом спинокуляции [13] с различными MOI (multiplicity of infection, множественность инфекции) в присутствии 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Через 48 часов после трансдукции клетки подвергали селекции на среде с добавлением зеоцина (400 мкг/мл) в течение 7 дней. Клетки BrCCh4e-134 окрашивали антителами к PSMA (ThermoFisher, США), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ). Далее, для получения гомогенной PSMA-эксперессирующей линии, клетки клонировали на сортере Sony SH800 (Sony, Япония).

Полученная клеточная линия BrCCh4e-134 обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Морфологические признаки PSMA-экспрессирующей клеточной линии рака молочной железы человека BrCCh4e-134 характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками округлой формы, иногда с двумя-тремя длинными отростками. Более 80% клеток окрашиваются антителами против Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии BrCCh4e-134 следующие:

Поверхностная экспрессия белка PSMA человека.

Культуральные свойства клеточной линии BrCCh4e-134 характеризуются следующим образом.

Клеточная линия BrCCh4e-134 культивируется в питательной среде IMDM (GIBCO, США) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки телят (FBS) (SigmaAldrich, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (GIBCO, США) в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. При субкультивировании клетки пересаживают каждые 2-3 дня, кратность рассева - 1:3-1:4 при использовании раствора TripLE (Gibco BRL Co., Invitrogen)

Условия криоконсервации следующие.

Среда IMDM, 50%, FBS, 40%, DMSO, 10%. Стандартный режим замораживания, хранение в жидком азоте, 2×10⁶ клеток/ампулу. Размораживание быстрое, при 37°С. 1 мл клеточной суспензии разводят в 10 мл среды DMEM, осаждают центрифугированием, 800 об/мин, клетки ресуспендируют в 4 мл IMDM с 20% FBS во флакон с площадью поверхности 25 см². Жизнеспособность после криоконсервации ≥ 70% (окраска трипановым синим).

Анализ контаминации.

При длительном культивировании бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Анализ уреаплазмы и микоплазмы выполнен методом ОТ ПЦР в режиме реального времени с использованием пары праймеров: 5'GGCGAATGGGTAAGTAACACG3' и 5'CGATAACGCTTGCGACCTAT3', позволяющих выявлять Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma salivarium и Ureaplasma urealyticum. Тест на микоплазму и уреаплазму отрицательный.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение рекомбинантной клеточной линии BrCCh4e-134.

Клеточную линию BrCCh4e-134 получали на основе клеточной линии BrCCh4e (per. номер РККК(II) 799Д) путем ее трансдукции (заражения) лентивирусными частицами. Для получения лентивирусных частиц, ДНК рекомбинантной лентивирусной плазмиды pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo смешивали с ДНК вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц, в молярном соотношении 4:1:3 и трансформировали клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293T методом кальций-фосфатной трансфекции, после чего выращивали 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяли на новую и инкубировали клетки 48 часов. Затем супернатанты кондиционированной среды фильтровали через 0.45 мкм PES-фильтры и использовали для заражения клеточной линии BrCCh4e методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/ мл). Через 48 часов после заражения проводили селекцию трансдуктантов на среде с добавлением зеоцина (400 мкг/мл) в течение 7 дней. Наконец, клетки BrCCh4e-134 окрашивали антителами к PSMA (ThermoFisher, США), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ) и для получения гомогенной PSMA-экспрессирующей линии клетки клонировали на сортере Sony SH800 (Sony, Япония).

Пример 2. Использование клеточной линии BrCCh4e-134 как модельной системы для оценки цитотоксического потенциала таргетного клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact.

Анализ цитотоксической активности клеток CAR-NK клеточной линии YT - Cyto-CAR-YT-Lact, - проводили в режиме реального времени на приборе iCELLigence RTCA (ACEA Bioscience). Клетки Cyto-CAR-YT-Lact представляют собой генно-инженерно модифицированные "усиленные" NK-клетки линии YT, экспрессирующие CAR к PSMA, проапоптотический белок лактаптин для усиления неспецифической цитотоксической активности и имеют нокаут гена shp-2 для ослабления ингибирующего сигналинга. В качестве PSMA-негативного контроля использовали PSMA-негативную родительскую линию BrCCh4e. Клетки BrCCH4e и BrCCh4e-134 в количестве 3×10⁴ высевали в 500 мкл полной среды IMDM в лунки 8-ми луночных планшетов (ACEA Bioscience, Корея) с интегрированными микроэлектронными сенсорами, позволяющими регистрировать изменение сопротивления электрического тока. Величина сопротивления зависит от размера и количества прикрепленных клеток и позволяет рассчитать относительное число жизнеспособных клеток (клеточный индекс, CI). Через 24 ч среду заменяли на порцию свежей среды, содержащей 1×10⁵ клеток-эффекторов и инкубировали не менее 48 ч.

На Фиг. 3 и 4 представлены кривые жизнеспособности клеток BrCCh4e (Фиг. 3) и BrCCh4e-134 (Фиг. 4), обработанных эффекторными клетками. Анализ цитотоксической активности в режиме реального времени показал, что эффекторные клетки Cyto-CAR-YT-Lact (Cyto-CAR на Фиг. 3 и 4) высокоэффективно (практически на 100%) индуцируют гибель клеток-мишеней BrCCh4e-134 (Фиг. 4) и менее эффективностью гибель клеток без PSMA-антигена - клеток BrCCh4e (Фиг. 3). Клетки BrCCh4e-134 были резистентны к NK клеткам линии YT дикого типа (Фиг. 4). Таким образом, опухолевые клетки BrCCh4e-134 являются чувствительной моделью для исследования цитотоксической активности таргетных препаратов, нацеленных на PSMA- положительные опухоли человека.

Пример 3. Использование клеточной линии BrCCh4e-134 для оценки антиметастатического потенциала клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact.

Для оценки антиметастатической активности клеток Cyto-CAR-YT-Lact использовали обе модели метастазирования опухолевых клеток BrCCh4e-134 - трансплантацией опухолевых клеток в венозный кровоток или в режиме спонтанного метастазирования солидных опухолей, сформированных трансплантированными опухолевыми клетками. Модель спонтанного метастазирования позволяет также оценивать и противоопухолевое действие исследуемого препарата.

Эксперименты на мышах проводили согласно рекомендациям по использованию лабораторных животных (ЕСС Directive 86/609/ЕЕС). Для моделирования метастазирования самкам мышей SCID (SHO-PRKDC SCID HR/HR1EW 43375) в хвостовую латеральную вену вводили суспензию опухолевых клеток BrCCH4e-134 (2×10⁴ кл/мл) в объеме 300 мкл. Мышей с трансплантированными внутривенно опухолевыми клетками сразу делили на экспериментальные группы. Через 24 дня животным внутривенно вводили эффекторные клетки Cyto-CAR-YT-Lact (6×10⁶ кл/мл) в объеме 500 мкл и физиологический раствор животным контрольной группы. При вскрытии животных через 14 дней после введения Cyto-CAR-YT-Lact клеток было обнаружено, что у 100% животных контрольной группы присутствовали метастазы, преимущественно в лимфоузлах средостения, а также печени и почках. В группе животных, получавших лечение препаратом клеток Cyto-CAR-YT-Lact, метастазов обнаружено не было (Табл. 1).

Для моделирования спонтанного метастазирования самкам мышей NOD/SCID (NOD. SCID CB17Prkdcscid/NcrCr1) подкожно вводили суспензию клеток BrCCH4e-134 (4×10⁷ кл/мл) в смеси PBS:Matrigel™ (BD Bioscience, (2:1) в объеме 100 мкл. Размеры опухолей дважды в неделю измеряли штангенциркулем и по достижении в среднем размера 0.03 см³ животных рандомизированно разделяли на группы и вводили внутривенно эффекторные клетки (6×10⁶ кл/мл) в объеме 500 мкл или 500 мкл раствора PBS животным контрольной группы. По окончании эксперимента животные подвергались эвтаназии, проводился полный патоморфологический осмотр внутренних органов, выявленные метастатические узлы измеряли, извлекали и фиксировали для последующего гистологического анализа. При вскрытии животных у 4х из 8 ми животных контрольной группы были обнаружены крупные метастазы в лимфоузлах средостения и небольшие очаги в печени, тогда как у животных, получавших лечение Cyto-CAR-YT-Lact клетками метастазов обнаружено не было (Табл. 1).

Таким образом показано, что введение клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact оказывает стойкий антиметастатический эффект как в модели внутривенной трансплантации опухолевых клеток, так и в модели спонтанного метастазирования клеток BrCCh4e-134. Следовательно, клетки линии BrCCh4e-134 могут быть использованы для формирования модели метастазирования на мышах и оценки антиметастатической активности PSMA-нацеленных препаратов.

Использование предлагаемой клеточной линии BrCCh4e-134 позволит более эффективно оценивать антиметастатический потенциал препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.

Источники информации.

1. Damber J.-E., Aus G. Prostate cancer // The Lancet. - 2008. - V. 371. - №9625. - P. 1710-1721.

2. Mannweiler S., Amersdorfer P., Trajanoski S., et al. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis // Pathol. Oncol. Res. - 2009. - V. 15. - №2. - P. 167-172.

3. Sobel R.E., Sadar M.D. Cell lines used in prostate cancer research: A Compendium of old and new lines -Part 1 // Journal of Urology. - 2005. - V. 173. - №2. - P. 342-359.

4. Gade T.P.F., Hassen W., Santos E., et al. Targeted elimination of prostate cancer by genetically directed human T lymphocytes // Cancer Res. - 2005. - V. 65. - №19. - P. 9080-9088.

5. Bastide C, Bagnis C, Mannoni P., et al. A Nod Scid mouse model to study human prostate cancer // Prostate Cancer Prostatic Dis. - 2002. - V. 5. - №4. - P. 311-315.

6. Bubendorf L., Schopfer A., Wagner U., et al. Metastatic patterns of prostate cancer: An autopsy study of 1,589 patients // Human Pathology. - 2000. - V. 31. - №5. - P. 578-583.

7. Ren D., Yang Q., Dai Y., et al. Oncogenic miR-210-3р promotes prostate cancer cell EMT and bone metastasis via NF-κВ signaling pathway // Mol. Cancer. - 2017. - V. 16. - №1. - P. 117.

8. Padalecki S.S., Weldon K.S., Reveles X.T., el al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases // Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. - 2003. - V. 21. - №5. - P. 366-373.

9. Kasoha M., Unger C, Solomayer E.-F., et al. Prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in breast cancer and its metastases // Clin. Exp. Metastasis. - 2017. - V. 34. - №8. - P. 479-490.

10. Neuman B.P., Eifler J.B., Castanares M., et al. Real-time, near-infrared fluorescence imaging with an optimized dye/light source/camera combination for surgical guidance of prostate cancer // Clinical Cancer Research. - 2015. - V. 21. - №4. - P. 771-780.

11. Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium phosphate transfection // Current Protocols in Molecular Biology. - 2003. - V. 63. - №1. - P. 9.1.1-9.1.11.

12. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 1997; 15:871-5.

13. O'Doherty U., Swiggard W.J., Malim M.H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding // Journal of Virology. - 2000. - V. 74. - №21. - P. 10074-10080.

--->

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)

<120> Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека

<160> 1

<210> 1

<211>9671

<212> DNA

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480

cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540

ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600

agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660

ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720

ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780

ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840

aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900

agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960

ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020

agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080

agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140

gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200

gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260

ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320

gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380

taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440

caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500

tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560

aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620

aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680

gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740

aggtggagag agagacagag acagatccat tcgatcggtt aacttttaaa agaaaagggg 1800

ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa 1860

ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt atcgatacta gtggatctgc 1920

gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg 1980

gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa 2040

agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt 2100

gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag 2160

cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca 2220

cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc 2280

gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc 2340

ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc 2400

tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc gcctactcta 2460

gagctagcga attcgaattt aaatcggatc tgccaccatg tggaatctcc ttcacgaaac 2520

cgactcggct gtggccaccg cgcgccgccc gcgctggctg tgcgctgggg cgctggtgct 2580

ggcgggtggc ttctttctcc tcggcttcct cttcgggtgg tttataaaat cctccaatga 2640

agctactaac attactccaa agcataatat gaaagcattt ttggatgaat tgaaagctga 2700

gaacatcaag aagttcttat ataattttac acagatacca catttagcag gaacagaaca 2760

aaactttcag cttgcaaagc aaattcaatc ccagtggaaa gaatttggcc tggattctgt 2820

tgagctagca cattatgatg tcctgttgtc ctacccaaat aagactcatc ccaactacat 2880

ctcaataatt aatgaagatg gaaatgagat tttcaacaca tcattatttg aaccacctcc 2940

tccaggatat gaaaatgttt cggatattgt accacctttc agtgctttct ctcctcaagg 3000

aatgccagag ggcgatctag tgtatgttaa ctatgcacga actgaagact tctttaaatt 3060

ggaacgggac atgaaaatca attgctctgg gaaaattgta attgccagat atgggaaagt 3120

tttcagagga aataaggtta aaaatgccca gctggcaggg gccaaaggag tcattctcta 3180

ctccgaccct gctgactact ttgctcctgg ggtgaagtcc tatccagatg gttggaatct 3240

tcctggaggt ggtgtccagc gtggaaatat cctaaatctg aatggtgcag gagaccctct 3300

cacaccaggt tacccagcaa atgaatatgc ttataggcgt ggaattgcag aggctgttgg 3360

tcttccaagt attcctgttc atccaattgg atactatgat gcacagaagc tcctagaaaa 3420

aatgggtggc tcagcaccac cagatagcag ctggagagga agtctcaaag tgccctacaa 3480

tgttggacct ggctttactg gaaacttttc tacacaaaaa gtcaagatgc acatccactc 3540

taccaatgaa gtgacaagaa tttacaatgt gataggtact ctcagaggag cagtggaacc 3600

agacagatat gtcattctgg gaggtcaccg ggactcatgg gtgtttggtg gtattgaccc 3660

tcagagtgga gcagctgttg ttcatgaaat tgtgaggagc tttggaacac tgaaaaagga 3720

agggtggaga cctagaagaa caattttgtt tgcaagctgg gatgcagaag aatttggtct 3780

tcttggttct actgagtggg cagaggagaa ttcaagactc cttcaagagc gtggcgtggc 3840

ttatattaat gctgactcat ctatagaagg aaactacact ctgagagttg attgtacacc 3900

gctgatgtac agcttggtac acaacctaac aaaagagctg aaaagccctg atgaaggctt 3960

tgaaggcaaa tctctttatg aaagttggac taaaaaaagt ccttccccag agttcagtgg 4020

catgcccagg ataagcaaat tgggatctgg aaatgatttt gaggtgttct tccaacgact 4080

tggaattgct tcaggcagag cacggtatac taaaaattgg gaaacaaaca aattcagcgg 4140

ctatccactg tatcacagtg tctatgaaac atatgagttg gtggaaaagt tttatgatcc 4200

aatgtttaaa tatcacctca ctgtggccca ggttcgagga gggatggtgt ttgagctagc 4260

caattccata gtgctccctt ttgattgtcg agattatgct gtagttttaa gaaagtatgc 4320

tgacaaaatc tacagtattt ctatgaaaca tccacaggaa atgaagacat acagtgtatc 4380

atttgattca cttttttctg cagtaaagaa ttttacagaa attgcttcca agttcagtga 4440

gagactccag gactttgaca aaagcaaccc aatagtatta agaatgatga atgatcaact 4500

catgtttctg gaaagagcat ttattgatcc attagggtta ccagacaggc ctttttatag 4560

gcatgtcatc tatgctccaa gcagccacaa caagtatgca ggggagtcat tcccaggaat 4620

ttatgatgct ctgtttgata ttgaaagcaa agtggaccct tccaaggcct ggggagaagt 4680

gaagagacag atttatgttg cagccttcac agtgcaggca gctgcagaga ctttgagtga 4740

agtagcctag atccgcggcc gcgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga 4800

agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg 4860

tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg 4920

ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt 4980

cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac 5040

cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca 5100

aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg 5160

ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg 5220

ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa 5280

cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat 5340

ggccacaacc atggcgtccg gagccaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct 5400

caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg 5460

ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag 5520

cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct 5580

ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg 5640

gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc 5700

ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgagtcgaca atcaacctct 5760

ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 5820

atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat 5880

tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 5940

caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat 6000

tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc 6060

ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga 6120

caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc 6180

cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga 6240

ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc 6300

tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga 6360

cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 6420

taattcactc ccaacgaaga taagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag 6480

accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 6540

aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact 6600

agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc 6660

atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact 6720

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 6780

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 6840

atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag 6900

ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc 6960

cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt 7020

ttgcagagac caaattcgta atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 7080

tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 7140

gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 7200

tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 7260

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 7320

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 7380

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 7440

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 7500

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 7560

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 7620

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 7680

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 7740

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 7800

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 7860

ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 7920

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 7980

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 8040

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 8100

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 8160

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 8220

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 8280

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 8340

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 8400

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 8460

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 8520

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 8580

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 8640

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 8700

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 8760

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 8820

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 8880

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 8940

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 9000

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 9060

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 9120

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 9180

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 9240

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 9300

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 9360

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 9420

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 9480

taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 9540

ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 9600

ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca 9660

gtgccaagct g 9671

<---

Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека, полученная путем трансдукции клеточной линии BrCCh4e лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием кальций-фосфатной трансфекции клеточной линии НЕК293Т рекомбинантной лентивирусной плазмидой pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo, характеризующейся в соответствии с графической картой, представленной на фиг. 1, следующими признаками: имеет размер 9671 п.о., кодирует человеческий белок PSMA, состоит из следующих элементов: фрагмента ДНК размером 2253 п.о., кодирующего человеческий белок PSMA; гибридного конститутивного промотора человеческого фактора элонгации трансляции альфа (EF1a) и Т-лимфотропного вируса человека (HTLV); генетических маркеров: AMPr - ген ампициллин-резистентности (bla) и zeo - селективный ген устойчивости к зеоцину; гибридного RSV-5'LTR промотора, состоящего из последовательностей вируса саркомы Раусса (RSV) и ВИЧ-1; модифицированных генетических элементов ВИЧ-1 (сРРТ, gag, env, RRE); 5'LTR и 3'dLTR-последовательностей ВИЧ-1; последовательности WPRE - регуляторного элемента вируса гепатита сурков; элемента IRES - внутреннего сайта посадки рибосомы кардиовируса А.