Генетически кодируемые индикаторы ионов калия

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным калиевым сенсорам, и может быть использовано для детекции положительно заряженных ионов калия. Конструируют полипептид, содержащий по меньшей мере один сигнальный домен и калиевый сенсор, который может связываться с K⁺. При этом первый сигнальный домен может генерировать детектируемый сигнал после связывания K⁺ с калиевым сенсором. Изобретение обеспечивает эффективную детекцию K⁺ в образце. 7 н. и 18 з.п. ф-лы, 7 табл., 12 пр., 7 ил.

 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ионы калия (K⁺) необходимы для правильного функционирования всех типов клеток. Электрохимические градиенты K⁺ в плазматической мембране и мембранах органелл клетки регулируют потоки K⁺, контролируя множество функций клеток. Хорошо известно, что колебания вне- и внутриклеточной концентрации K⁺ контролируют сокращения мышц, высвобождение нейромедиаторов и гормонов, возбудимость нейронов, объем клетки, пролиферацию и гибель клеток. Таким образом, неудивительно, что дисбаланс гомеостаза K⁺ имеет далеко идущие последствия на клеточном и организменном уровне и ассоциирован с множеством патологических состояний, включая неврологические, сердечно-сосудистые, почечные, иммунологические, мышечные нарушения и нарушения обмена веществ, а также злокачественные новообразования. Поток K⁺ и его транспорт через биологические мембраны происходит с помощью многочисленных селективных K⁺-каналов, обменников и насосов, которые оказались перспективными мишенями для терапевтических лекарственных средств для лечения различных заболеваний. Однако, существующее понимание колебаний вне- и внутриклеточного K⁺ очень ограничено по причине отсутствия подходящих зондов для исследования динамики K⁺ с высоким пространственным и временным разрешением.

Примечательно, что появляются новые доказательства того, что концентрация K⁺ в клетках контролирует ключевые события передачи сигнала, независимо от ее влияния на потенциал мембраны.

В недавнем исследовании показано, что повышенные внутриклеточные уровни K⁺ повышают активность фосфатазы PP2A в T-клетках (Eil et al., Nature 537, 539-543 (22 сентября 2016 года). В результате комплекс Akt-mTOR гипофосфорилирован, и эффекторная функция T-клеток супрессируется. Это исследование показало, насколько сильно фундаментальные функции клетки контролируются ионами K⁺, независимо от их вклада в потенциал мембраны. Кроме того, распределение K⁺ в органеллах клеток и то, насколько динамично и сильно на концентрации K⁺ внутри органелл могут влиять некоторые физиологические и патологические состояния, еще не подверглось всестороннему исследованию. Понимание этого вопроса остается недостаточным, в основном, по причине отсутствия подходящих способов и инструментов, делающих возможным количественный анализ потоков K⁺ на уровне отдельных клеток и органелл клеток в реальном времени. В настоящее время зачастую для измерения колебаний внеклеточного K⁺ используют K⁺-чувствительные электроды, и, как правило, для них необходимы большие объемы образцов, по меньшей мере 1 мл. Эти электроды являются высокоселективными в отношении K⁺, но их с трудом можно использовать для определения пространственно-временной динамики колебаний K⁺ и внутриклеточных сигналов K⁺. С целью визуализации колебаний внеклеточного K⁺ или изменений K⁺ внутри клеток разработано несколько небольших химических флуоресцентных K⁺-сенсоров. Однако эти флуоресцентные ионные индикаторы обладают множеством ограничений, т.к. зачастую они менее специфичным к K⁺, имеют небольшой динамический диапазон, являются K⁺-чувствительными в нефизиологическом диапазоне, их трудно помещать в клетки и органеллы клетки и в некоторых случаях их трудно получать.

В результате этих многочисленных строгих ограничений флуоресцентных K⁺-зондов целенаправленная количественная визуализация K⁺ с использованием флуоресцентной микроскопии и/или флуориметров практически невозможна.

Ashraf et al. описывают, что калий-связывающий белок (Kbp) может действовать in vivo как цитоплазматический калиевый сенсор, необходимый для нормального роста E. coli при высоких концентрациях K⁺ (Structure 2016, May 3; 24(5) 741-9).

В WO 01/04623 A1 описывают флуоресцентно меченые циклические пептолиды (депсипептиды) и их применение для оптического определения концентрации ионов калия в образце.

В US 2013/244891 A1 описывают биосенсор, содержащий активируемый акцепторный флуороген, соединенный линкер с донором, чувствительным к окружающей среде, взаимодействующим с аналитом.

В WO 2012/112440 A2 описывают флуоресцентный сополимер, который может функционировать в качестве сенсора ионов калия.

В US 2003/119195 A1 описывают флуоресцентные флуороионофоры на основе антрацена в качестве калиевых сенсоров.

В свете существующего уровня техники, все еще существует потребность в получении дополнительных K⁺-сенсоров. Разработка таких сенсоров затруднительна, т.к. затруднительно, например, конструирование зондов проксимального действия. В настоящее время нельзя надежно спрогнозировать, могут ли стерические эффекты в генетически кодируемом сенсоре по причине связывания с лигандом индуцировать конформационное изменение, которое может быть детектируемым, например, по тушению флуоресценции или Ферстеровскому резонансному переносу энергии (FRET). Таким образом, пригодность генетически кодируемого сенсора в каждом конкретном случае зависит от отдельного связывающего домена, степени и стабильности его конформационного изменения после связывания лиганда и необязательной последовательности линкера между связывающим модулем и детекторными доменами.

Таким образом, целью настоящего изобретения являются новые средства, подходящие для детекции K⁺.

Кроме того, дополнительной целью настоящего изобретения являются новые способы детекции K⁺ в образце.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целей настоящего изобретения достигали с помощью полипептида, содержащего:

a) первый сигнальный домен и

b) калиевый сенсор, содержащий

b1) первый домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1; и

b2) второй домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2;

где калиевый сенсор может связываться с положительно заряженным ионом калия, и первый сигнальный домен может генерировать детектируемый сигнал после связывания положительно заряженных ионов калия с калиевым сенсором.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, подходящий для детекции K⁺.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору, кодирующему полипептид по настоящему изобретению и подходящему для экспрессии эукариотического или прокариотического гена.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей полинуклеотид, вектор или полипептид по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции положительно заряженных ионов калия в образце, включающему стадии

a) получения полипептида по настоящему изобретению;

b) приведения полипептида по настоящему изобретению в контакт с образцом;

c) измерения сигнала, генерируемого первым сигнальным доменом; и/или

d) измерения сигнала, генерируемого совместно первым сигнальным доменом и вторым сигнальным доменом;

где изменение интенсивности сигнала после контакта с образцом свидетельствует о наличии ионов калия в образце.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида по настоящему изобретению для детекции положительно заряженного иона калия в образце.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к набору для детекции положительно заряженных ионов калия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана схема конформационного изменения полипептида после связывания K⁺ с доменом BON, повышающего детектируемый сигнал FRET.

На фиг. 2 показаны полипептиды на основе FRET по настоящему изобретению, в частности, (a) схема двух полипептидов, названных GEPII 1.0 и R-GEPII 1.0, (b) предсказанная трехмерная структура R-GEPII 1.0, (c) клетки HeLa, экспрессирующие GEPII 1.0 (две левые панели) или R-GEPII 1.0 (две правые панели). Измерительная линейка соответствует 10 мкм, (d) ECFP, сигналы FRET (левая панель) и соотношение сигналов FRET (средняя панель) GEPII 1.0 с течением времени после добавления и удаления различных концентраций K+. На правой панели показана кривая концентрация-эффект для GEPII 1.0 в пермеабилизованных (3 мкМ дигитонина+2 мкМ валиномицина) клетках HeLa; EC₅₀=2,04 (от 1,716 до 2,413) мМ; N=10. (e) Типичные сигналы соотношения FRET (левая панель), сигналы Clover (средняя панель) и сигналы FRET (правая панель) R-GEPII 1.0 с течением времени в клетках HeLa, обработанных валиномицином (10 мкМ).

На фиг. 3 показана предсказанная трехмерная структура K⁺-связывающего домена BON (a, b), где высвечены кислые аминокислоты. На фиг. 3 (c) показано расстояние между двумя ближайшими кислыми аминокислотами. На фиг. 3 (d) показан предсказанный диаметр пор с ионом K⁺, на (e) показан радиус иона K⁺ с гидратацией и без нее.

На фиг. 4 показаны конфокальные изображения вариантов GEPII 1.0, экспрессируемых в клетках HeLa без разных последовательностей таргетинга и с ними, измерительная линейка на панели соответствует 10 мкм: на (a) показан GEPII 1.0 без какой-либо последовательности таргетинга, (b) GEPII 1.0 с последовательностью ядерного экспорта, NES, (c) GEPII 1.0 с ядерной лидирующей последовательностью, NLS, (d) GEPII 1.0 с последовательностью для митохондриального таргетинга (тандемный димерный повтор COX8), (e) GEPII с последовательностью для таргетинга ER (из кальретикулина на N-конце) с последовательностью KDEL на C-конце, (f) GPI-заякоренный GEPII 1.0, (g) GEPII 1.0, перинуклеарно направленный посредством слияния с C-концом эмерина, и (h) CAAX-GEPII 1.0 для мониторинга K⁺ в субплазмалеммной области. На изображениях показано, что полипептид локализован в целевой органелле или субдомене клетки.

На фиг. 5 показана максимальная дельта сигналов соотношения FRET очищенного GEPII 1.0 в ответ на 3 мМ K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Rb⁺ или Cs⁺, соответственно. Наибольшего соотношения достигали в случае K⁺. В случае Na⁺ и Ca²⁺ наблюдали наименьшие соотношения. Эксперименты осуществляли с использованием флуоресцентного спектрофотометра для чтения микропланшетов CLARIOstar (BMG Labtech, Germany). 200 нМ очищенного GEPII в забуференном HEPES растворе (pH 7,3), содержащем 0,05% Triton X 100, анализировали в отсутствие или присутствии 3 мМ KCl, NaCl, CaCl₂, RbCl или CsCl. 80 мкл содержащих GEPII растворов переносили в многолуночный планшет (96-луночный планшет для флуоресцентного анализа, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria) и освещали при 430 нм ± 10 нм. Эмиссию регистрировали при 475 нм ± 10 нм и 525 нм ± 10 нм, соответственно. Вычисляли значения соотношения FRET (F₅₂₅/F₄₇₅), и они коррелировали с соответствующими значениями соотношения FRET GEPII в отсутствие одно- и двухвалентных ионов.

На фиг. 6 показано возможное использование полипептида по настоящему изобретению. Концентрацию калия в небольшом биологическом образце (например, образце из человека или мыши) можно разводить буфером, не содержащим K⁺, а затем добавляют полипептид по настоящему изобретению и определяют концентрацию ионов калия посредством FRET, например, в многолуночном планшете (A). Очищенный GEPII использовали для определения концентрации K⁺ в сыворотке в небольших образцах крови (~30 мкл), полученных из лицевой или орбитальной вены (B) лабораторных мышей без умерщвления животных. Уровни K⁺ в сыворотке определяли с помощью соответствующих значений соотношения FRET для GEPII с использованием линейной калибровки, показанной на панели C. Как показано, калибровочную кривую получали с использованием 6 определенных концентраций K⁺ в забуференном HEPES растворе. Сыворотки мышей разводили 1:12,5 буфером HEPES и смешивали с раствором GEPII в 96-луночном планшете, получая конечное разведение 1:25. Сигналы соотношения FRET в этих образцах измеряли с использованием флуоресцентного спектрофотометра для чтения микропланшетов CLARIOstar (BMG Labtech, Germany). (D) Значения K⁺ в сыворотке в мМ, определенные с использованием очищенного GEPII 1.0, для 4 разных мышей, кровь которых получали из лицевой вены (красные круги) или орбитальной вены (синие квадраты). Способ забора крови не влиял на значения K⁺. (E) Строили график результатов, показанных на панели D, в зависимости от способа забора крови. (F) Значения K⁺, определенные с использованием очищенного GEPII 1.0 в сыворотке 5 разных мышей вскоре после забора крови (0 часов), через 2 и 4 часа. Эти данные свидетельствуют о том, что GEPII 1.0 остается функциональным в сыворотках мышей в течение часов. (G) Строили график результатов, показанных на панели F, в зависимости от времени измерения FRET после забора крови.

На панели A фиг. 7. схематически показано использование очищенного GEPII для динамической регистрации концентрации внеклеточного K⁺ с течением времени в (многолуночном) планшете для культур клеток в качестве энергетической меры жизнеспособности клеток. Клетки, снабженные субстратом, таким как глюкоза, выживают и поддерживают физиологический градиент K⁺ с концентрацией внеклеточного K⁺ ~5 мМ и концентрацией внутриклеточного K⁺ ~130 мМ. В этих условиях лишь некоторые клетки погибали и высвобождали K⁺. В отличие от этого, клетки, обработанные токсическими антиметаболитами, такими как 2-дезоксиглюкоза (2-DG), погибали и высвобождали K⁺, таким образом, повышающийся в супернатанте. (B) Концентрация K⁺ с течением времени во внеклеточной среде, измеряемая в 96-луночном планшете с использованием очищенного GEPII 1.0 (c=500 нМ). Клональные бета-клетки поджелудочной железы (INS-1) поддерживали в присутствии 10 мМ глюкозы (синяя кривая, контроль) или 10 мМ 2-DG (красная кривая). Как показано, контрольные клетки обрабатывали 50 мкМ дигитонина во временной точке 14 часов, что приводило к максимальному высвобождению клеточного K⁺. Сигналы соотношения FRET для GEPII определяли с использованием флуоресцентного спектрофотометра для чтения микропланшетов CLARIOstar (BMG Labtech, Germany), как описано выше.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, способами и реагентами, представленными в настоящем описании, т.к. они могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения объема настоящего изобретения, ограниченного только формулой изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают значением, общепринято понятным специалисту в этой области.

Хотя на всем протяжении настоящего описания процитировано несколько документов, включенных в него в полном объеме в качестве ссылки, ничто в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что изобретение не имеет права предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения.

K⁺-связывающий белок (Kbp), также известный как YgaU, является растворимым цитоплазматическим массой 16 кДа из Escherichia coli. Он является высокоспецифическим K⁺-связывающим белком и необходим для нормального роста в присутствии высоких уровней внешнего K⁺. Ион калия связывается исключительно с доменом BON (SEQ ID NO: 1), который после связывания подвергается конформационному изменению. Kbp дополнительно содержит домен LysM (SEQ ID NO: 2), который может взаимодействовать с доменом BON.

Аминокислотные последовательности домена BON, домена LysM, а также полноразмерного Kbp приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1. Последовательности домена BON и домена LysM Kbp

SEQ ID NO:	Примечание	Аминокислотная последовательность
1	Домен BON	QAKKVQEHLNKTGIPDADKVNIQIADGKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGNISGIASVDDQVKT
2	Домен LysM	QFYTVKSGDTLSAISKQVYGNANLYNKIFEANKPMLKSPDKIYPGQVLRI

Неожиданно обнаруживали, что K⁺ можно определять с помощью слитого белка, содержащего

a) первый сигнальный домен и

b) калиевый сенсор, содержащий

b1) первый домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1; и

b2) второй домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2;

где калиевый сенсор может связываться с положительно заряженным ионом калия, и первый сигнальный домен может генерировать детектируемый сигнал после связывания положительно заряженного иона калия с калиевым сенсором.

Связывание K⁺ с калиевым сенсором может запускать конформационное изменение в указанном калиевом сенсоре, которое затем можно определять с помощью сигнального домена. Этот принцип проиллюстрирован на фиг. 1 для одного из полипептидов по настоящему изобретению. Полипептиды по изобретению также обозначены в настоящем описании как генетически кодируемый индикатор иона калия (GEPII).

В предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен является доменом флуоресцентного белка. Даже более предпочтительно, первый сигнальный домен является голубым флуоресцентным белком, предпочтительно - голубым флуоресцентным белком, который может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 6.

В предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен является доменом флуоресцентного белка. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что детектируемый сигнал, генерируемый первым сигнальным доменом, может представлять собой тушение флуоресцентного сигнала домена флуоресцентного белка. В одном из предпочтительных вариантов осуществления аминокислотная последовательность полипептида по настоящему изобретению содержит от N-конца к C-концу:

i) первый домен калиевого сенсора;

ii) первый сигнальный домен; и

iii) второй домен калиевого сенсора.

Первому сигнальному домену, необязательно, может предшествовать последовательность линкера, и/или она может следовать за ним.

В другом предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида по настоящему изобретению содержит от N-конца к C-концу: i) первый домен калиевого сенсора;

i) второй домен калиевого сенсора;

ii) первый сигнальный домен; и

iii) первый домен калиевого сенсора.

Первому сигнальному домену, необязательно, может предшествовать последовательность линкера, и/или она может следовать за ним.

Первый домен калиевого сенсора имеет в своей основе домен BON Kbp.

В предпочтительном варианте осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 75% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 90% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 95% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. В другом предпочтительном варианте осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления первый домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 по меньшей мере с одной заменой аминокислоты. Предпочтительно, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 содержит от приблизительно 1 до приблизительно 11 замен. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна замена аминокислоты выбрана из группы, состоящей из D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q или G52D. В особенно предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность первого домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 1, содержащую следующие замены: Q26R, N35Q, N75Q, G52D (SEQ ID NO: 5).

Второй домен калиевого сенсора имеет в своей основе домен LysM Kbp.

В предпочтительном варианте осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 75% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2. В одном из предпочтительных вариантов осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2. В одном из предпочтительных вариантов осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2. В одном из предпочтительных вариантов осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 90% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2. В одном из предпочтительных вариантов осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 95% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2. В другом предпочтительном варианте осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2.

В другом предпочтительном варианте осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 по меньшей мере с одной заменой аминокислоты. В предпочтительном варианте осуществления второй домен калиевого сенсора содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, содержащую от приблизительно 1 до приблизительно 11 замен. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна замена аминокислоты выбрана из группы, состоящей из D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q и N127Q. В особенно предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность второго домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 2, содержащую следующие замены: D104N, E125Q, D135N (SEQ ID NO: 4). Нумерация аминокислот в последовательности основана на последовательности дикого типа Kbp (SEQ ID NO: 3).

В таблице 2 приведены соответствующие аминокислотные последовательности Kbp и вариантов доменов BON и Lys.

Таблица 2: Kbp и варианты доменов BON и Lys

SEQ ID NO	Примечания	Аминокислотная последовательность
3	Kbp	MGLFNFVКДАGEKLWDAVTGQHDKDDQAKKVQEHLNKTGIPDADKVNIQIADGKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGNISGIASVDDQVKTATPATASQFYTVKSGDTLSAISKQVYGNANLYNKIFEANKPMLKSPDKIYPGQVLRIPEE
4	LysM D104N, E125Q, D135N	QFYTVKSGNTLSAISKQVYGNANLYNKIFQANKPMLKSPNKIYPGQVLRI
5	BON Q26R, N35Q, N75Q, G52D	QAKKVQEHLQKTGIPDADKVNIQIADDKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGQISGIASVDDQVKT

Настоящее изобретение также относится к полипептиду, содержащему

a) первый сигнальный домен и

b) калиевый сенсор, содержащий

b1) первый домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1; и

b2) второй домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2; и

c) второй сигнальный домен,

где калиевый сенсор может связываться с положительно заряженным ионом калия, и первый сигнальный домен и второй сигнальный домен совместно могут генерировать детектируемый сигнал после связывания положительно заряженного иона калия с калиевым сенсором. Предпочтительно, детектируемый сигнал может генерироваться после связывания K⁺ с калиевым сенсором. Связывание K⁺, например, может индуцировать конформационный сдвиг в калиевом сенсоре, а затем сближать или отдалять первый сигнальный домен и второй сигнальный домен друг от друга, таким образом, по меньшей мере внося вклад в генерирование детектируемого сигнала. В предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен и второй сигнальный домен вместе выбраны из группы, состоящей из пар донор-акцептор FRET, пары частей раздельного фермента или пары частей флуоресцентного белка, где первый сигнальный домен и второй сигнальный домен являются соответствующими частями пары (например, двумя половинами раздельного фермента или двумя половинами раздельного флуоресцентного белка). Предпочтительно, связывание K⁺ с калиевым сенсором может индуцировать конформационный сдвиг в полипептиде, и первый сигнальный домен и второй сигнальный домен могут генерировать детектируемый сигнал, например пара донор-акцептор FRET может генерировать детектируемый сигнал FRET, две половины раздельного фермента могут быть функциональными и могут катализировать реакцию, которая может приводить к детектируемому сигналу, или две половины раздельного флуоресцентного белка будут способны испускать свет с определенной длиной волны в качестве детектируемого сигнала при возбуждении светом с длиной волны в подходящем диапазоне.

В предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен и второй сигнальный домен являются парой донор-акцептор FRET. Предпочтительно, донор может являться доменом голубого флуоресцентного белка (CFP), а акцептор может являться доменом желтого флуоресцентного белка (YFP). Более предпочтительно, первый сигнальный домен может являться донором, а второй сигнальный домен может являться акцептором. В даже более предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен является донорным доменом CFP, а второй сигнальный домен является акцепторным доменом YFP. Также предпочтительно, домен CFP может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 6, где длина волны возбуждения и длина волны флуоресценции являются теми же или, по существу, теми же, что и для домена CFP, приведенного в SEQ ID NO: 6, а именно, с пиком возбуждения при длине волны приблизительно 436 нм и пиком эмиссии при длине волны приблизительно 477 нм. Предпочтительно, домен YFP может являться циркулярно пермутированным белком Venus (CPV), даже более предпочтительно, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 7, где длина волны возбуждения и длина волны флуоресценции являются теми же или, по существу, теми же, что и для домена YFP, приведенного в SEQ ID NO: 7, а именно, с пиком возбуждения при длине волны приблизительно 514 нм и пиком эмиссии при приблизительно 527 нм.

В другом предпочтительном варианте осуществления донор может являться доменом Clover, и акцептор может являться доменом mRuby2. Более предпочтительно, первый сигнальный домен может являться донором, а второй сигнальный домен может являться акцептором. Также предпочтительно, домен Clover может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 8, где длина волны возбуждения и длина волны флуоресценции являются теми же или, по существу, теми же, что и для домена Clover, приведенного в SEQ ID NO: 8, а именно, с пиком возбуждения при длине волны приблизительно 505 нм и пиком эмиссии при длине волны приблизительно 515 нм. Предпочтительно, домен mRuby2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 9, где длина волны возбуждения и длина волны флуоресценции являются теми же или, по существу, теми же, что и для домена mRuby2, приведенного в SEQ ID NO: 9, а именно, с пиком возбуждения при длине волны приблизительно 559 нм и пиком эмиссии при длине волны приблизительно 600 нм.

В таблице 3 приведены аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6-9.

Таблица 3: Аминокислотные последовательности сигнальных доменов

SEQ ID NO:	Примечания	Аминокислотная последовательность
6	mseCFP	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHRFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKAHFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAA
7	cpV	MDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIE
8	Clover	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVACFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSHQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSRGPYSIVSPKC
9	mRuby2	MVSKGEELIKENMRMKVVMEGSVNGHQFKCTGEGEGNPYMGTQTMRIKVIEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFIKYPKGIPDFFKQSFPEGFTWERVTRYEDGGVVTVMQDTSLEDGCLVYHVQVRGVNFPSNGPVMQKKTKGWEPNTEMMYPADGGLRGYTHMALKVDGGGHLSCSFVTTYRSKKTVGNIKMPGIHAVDHRLERLEESDNEMFVVQREHAVAKFAGLGGGMDELYK

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность GEPII 1.0 (SEQ ID NO: 13) или R-GEPII 1.0 (SEQ ID NO: 21).

В другом предпочтительном варианте осуществления первый сигнальный домен и второй сигнальный домен содержат посттрансляционные модификации, такие как конъюгированная молекула флуоресцеина или другие низкомолекулярные флуорофоры или детектируемые функциональные фрагменты, которые могут вносить вклад в генерирование детектируемого сигнала первого сигнального домена вместе со вторым сигнальным доменом после связывания K⁺ с калиевым сенсором.

В другом предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность Kbp. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 75% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 90% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 95% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. В предпочтительном варианте осуществления калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 100% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3.

В другом предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида по настоящему изобретению от N-конца к C-концу содержит:

i) первый сигнальный домен;

ii) калиевый сенсор, где, предпочтительно, за первым доменом калиевого сенсора следует второй домен калиевого сенсора; и

iii) второй сигнальный домен.

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одну последовательность линкера. С помощью линкера, предпочтительно, имеющего гибкую, т.е. нежесткую, структуру, можно модифицировать чувствительность детектируемого сигнала. Аминокислотную последовательность линкера можно помещать в аминокислотную последовательность полипептида между любыми двумя из первой сигнальной группы, первого домена калиевого сенсора, второго домена калиевого сенсора и второго сигнального домена. В предпочтительном варианте осуществления аминокислотной последовательности линкера предшествует аминокислотная последовательность первого домена калиевого сенсора, а после линкера следует второй домен калиевого сенсора. Однако разумеется, линкерный домен также можно располагать между калиевым сенсором и первым сигнальным доменом или между калиевым сенсором и вторым сигнальным доменом.

В одном из вариантов осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность -GGGG-.

В предпочтительном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность линкера формулы (I):

-(GGS)_x(GGGGS)_y(GG)_z-(I)

где

x является целым числом 0 или 1,

y является целым числом от 1 до 6,

z является целым числом 0 или 1.

В предпочтительном варианте осуществления y не является 4.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления y является 2, 3 или 5.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления x является 0, y является 1, и z является 1. Также предпочтительно, в этом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом предпочтительном варианте осуществления x является 0, y является 2 или 3, и z является 0. Также предпочтительно, в этом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16.

В другом предпочтительном варианте осуществления x является 0, y является 4, и z является 1. Также предпочтительно, в этом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

В другом предпочтительном варианте осуществления x является 1, y является 5, и z является 0. Также предпочтительно, в этом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.

Известно, что внеклеточные уровни K⁺ в биологических системах, как правило, находятся в диапазоне от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В отличие от этого, внутриклеточные концентрации K⁺ в цитозоле и органеллах, как правило, находятся в диапазоне приблизительно от 100 мМ до 300 мМ. Как будет очевидно из примеров, полипептиды по настоящему изобретению могут обеспечивать разную чувствительность к K⁺, и это может зависеть от наличия последовательности линкера или замен аминокислот в SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, как описано выше. Следует понимать, что, таким образом, специалист в этой области будет использовать полипептид по настоящему изобретению с подходящей чувствительностью для соответствующей цели. Например, специалист в этой области может использовать полипептид с относительно низким значением EC₅₀, т.е. до 20 мМ, предпочтительно - до 10 мМ, и более предпочтительно - приблизительно 5 мМ, для измерения внеклеточных уровней K⁺, и полипептиды по настоящему изобретению, имеющие более высокое значение EC₅₀, т.е. от приблизительно 10 до приблизительно 300 мМ, предпочтительно - от приблизительно 50 до приблизительно 150 мМ для измерения внутриклеточных концентраций K⁺. Упоминаемые значения EC₅₀ являются значениями EC₅₀, полученными способом, описанным в пример 4.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению обеспечивает значение EC₅₀ от приблизительно 10 до приблизительно 300 мМ. Этот полипептид может особенно подходить для детекции внутриклеточного K⁺.

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению обеспечивает значение EC₅₀ от приблизительно 20 мМ и, предпочтительно, от приблизительно 5 мМ при измерении внеклеточного K⁺.

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит последовательность таргетинга. Последовательность таргетинга является аминокислотной последовательностью, направляющей полипептид к целевой органелле или субдомену клетки или для внеклеточной секреции.

Целевые органеллы и субдомены, например, могут включать ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ER), поверхность клетки, ядерную оболочку и субплазмалеммную область. Последовательность таргетинга можно помещать на N-конец или C-конец полипептида. Добавление последовательности ядерного экспорта, например, аминокислотной последовательности LPPLERLTL, на C-конец полипептида может приводить к локализации полипептида только в цитозоле. Добавление C-концевой ядерной лидирующей последовательности (KRSWSMAFC) может приводить к таргетингу ядра. Митохондрии можно подвергать таргетингу с помощью последовательности для таргетинга митохондрий, такой как тандемный димерный повтор COX8. Примеры последовательности для таргетинга ER включают последовательность для таргетинга ER кальретикулина на N-конце и последовательность KDEL на C-конце полипептида по изобретению. Последовательность GPI-якоря, например, может направлять полипептид к поверхности клетки. Примеры последовательности для перинуклеарного таргетинга включают эмерин, где последовательность полипептида по настоящему изобретению подвергают слиянию с C-концом эмерина. Примером последовательности для таргетинга субплазмалеммной области является домен CAAX изоформы b ГТФазы Kras, например, имеющий последовательность MSKDVKKKKKKSKTKCVIM, слитый с C-концом полипептида по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению является выделенным полипептидом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид по настоящему изобретению.

Специалисту в этой области очевидно, что в результате вырожденности генетического кода указанный полипептид по изобретению может кодироваться разными нуклеотидными последовательностями.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению имеет длину менее 9000 нуклеотидов, менее 8000 нуклеотидов, менее 7000 нуклеотидов, менее 6000 нуклеотидов, менее 5000 нуклеотидов, менее 4000 нуклеотидов, менее 3000 нуклеотидов, менее 2000 нуклеотидов, менее 1000 нуклеотидов или менее 500 нуклеотидов.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления выделенный полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере от 24 до 9000 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере от 24 до 8000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 24 до 7000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 24 до 6000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 24 до 5000 нуклеотидов, и даже более предпочтительно - по меньшей мере от 24 до 4000 нуклеотидов. В другом предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере от 60 до 9000 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере от 60 до 8000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 60 до 7000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 60 до 6000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 60 до 5000 нуклеотидов, и даже более предпочтительно - по меньшей мере от 60 до 4000 нуклеотидов. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере от 90 до 9000 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере от 90 до 8000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 90 до 7000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 90 до 6000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 90 до 5000 нуклеотидов, и даже более предпочтительно - по меньшей мере от 90 до 4000 нуклеотидов. В другом предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере от 120 до 9000 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере от 120 до 8000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 120 до 7000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 120 до 6000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 120 до 5000 нуклеотидов, и даже более предпочтительно - по меньшей мере от 120 до 4000 нуклеотидов. В другом предпочтительном варианте осуществления выделенный полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере от 300 до 9000 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере от 300 до 8000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 300 до 7000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 300 до 6000 нуклеотидов, более предпочтительно - по меньшей мере от 300 до 5000 нуклеотидов, и даже более предпочтительно - по меньшей мере от 300 до 4000 нуклеотидов.

В другом предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению имеет длину по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 1000 нуклеотидов, по меньшей мере 2000 нуклеотидов или по меньшей мере 2500 нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 10. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 91%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 92%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 93%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 94%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 96%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 97%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 10. В особенно предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 95% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 10.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 11. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере, 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 91%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 92%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 93%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 94%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 96%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 97%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 11. В особенно предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 95% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 11.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 12. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 91%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 92%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 93%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 94%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 96%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 97%, даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 12. В особенно предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 85%, предпочтительно - по меньшей мере 90%, более предпочтительно - по меньшей мере 95% или даже более предпочтительно - по меньшей мере 98% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 12.

Последовательности SEQ ID NO: 10-12 приведены ниже в таблице 4.

Таблица 4: Нуклеотидные последовательности, кодирующие домен BON, домен LysM и Kbp

SEQ ID NO:	Примечания	Нуклеотидная последовательность
10	BON	CAGGCGAAGAAGGTGCAGGAGCATCTGAACAAAACCGGTATACCGGATGCCGATAAAGTGAATATTCAAATTGCCGACGGCAAAGCGACGGTCACTGGTGACGGCCTGAGTCAGGAGGCGAAGGAGAAAATCCTTGTTGCGGTGGGGAATATTTCCGGTATTGCCAGTGTCGATGATCAGGTGAAAACG
11	LysM	CAGTTTTATACCGTTAAGTCTGGCGACACTCTGAGTGCCATTTCCAAACAGGTCTACGGTAACGCTAATCTGTACAATAAAATCTTCGAAGCGAATAAACCGATGCTAAAAAGCCCGGATAAAATTTATCCGGGGCAAGTGTTGCGTATT
12	Kbp	ATGGGTCTGTTCAATTTTGTGAAAGATGCCGGAGAAAAACTCTGGGACGCGGTTACAGGTCAGCACGATAAAGACGATCAGGCGAAGAAGGTGCAGGAGCATCTGAACAAAACCGGTATACCGGATGCCGATAAAGTGAATATTCAAATTGCCGACGGCAAAGCGACGGTCACTGGTGACGGCCTGAGTCAGGAGGCGAAGGAGAAAATCCTTGTTGCGGTGGGGAATATTTCCGGTATTGCCAGTGTCGATGATCAGGTGAAAACGGCGACACCAGCCACTGCCAGCCAGTTTTATACCGTTAAGTCTGGCGACACTCTGAGTGCCATTTCCAAACAGGTCTACGGTAACGCTAATCTGTACAATAAAATCTTCGAAGCGAATAAACCGATGCTAAAAAGCCCGGATAAAATTTATCCGGGGCAAGTGTTGCGTATTCCGGAAGAG

Полинуклеотид по изобретению может являться одноцепочечной или двухцепочечной молекулой РНК или ДНК.

В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид по изобретению можно встраивать в вектор, такой как экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор, например, может являться прокариотическим или эукариотическим экспрессирующим вектором, таким как, например, выделенная плазмида, минихромосома, космида, бактериофаг, ретровирусный вектор или любой другой вектор, известный специалисту в этой области. Специалисту в этой области будет известно, как выбирать подходящий вектор в зависимости от конкретной потребности. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор является выделенной плазмидой.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке, содержащей полипептид, полинуклеотид, экспрессирующий вектор и/или плазмиду, кодирующую полипептид по настоящему изобретению. Указанная клетка не является эмбриональной стволовой клеткой человека. Неограничивающие примеры клетки включают культуры клеток in vitro или лизаты эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих, клетки человека, или растительные клетки, или прокариотические клетки, все из которых, необязательно, могут быть генетически модифицированы способами, общепринято известными специалисту в этой области, такими как трансфекция или трансформация указанных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу детекции положительно заряженных ионов калия в образце, включающему стадии

a) получения полипептида по настоящему изобретению;

b) приведения полипептида по настоящему изобретению в контакт;

c) измерения сигнала, генерируемого первым сигнальным доменом;

где изменение интенсивности сигнала после контакта с образцом свидетельствует о наличии ионов калия в образце.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу детекции положительно заряженных ионов калия в образце, включающему стадии

a) получение полипептида по настоящему изобретению;

b) приведение полипептида по настоящему изобретению в контакт;

c) измерения сигнала, генерируемого первым сигнальным доменом; и/или

d) измерения сигнала, генерируемого совместно первым сигнальным доменом и вторым сигнальным доменом;

где изменение интенсивности сигнала после контакта с образцом свидетельствует о наличии ионов калия в образце.

Стадию a) получения полипептида осуществляют вне организма человека.

В одном из вариантов осуществления указанного способа изменение интенсивности сигнала после контакта с образцом по сравнению с сигналом полипептида в отсутствие образца свидетельствует о наличии K⁺ в образце.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению является (количественным) способом визуализации in vivo.

В предпочтительном варианте осуществления измеряемый сигнал является сигналом флуоресценции, колориметрическим сигналом или сигналом FRET. Предпочтительно, сигнал может генерироваться после связывания K⁺ с калиевым сенсором из полипептида по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления сигнал может генерироваться парой донор-акцептор FRET, парой частей раздельного фермента или парой частей раздельного флуоресцентного белка. Детекцию можно осуществлять способами, общепринято известными специалисту в этой области.

В одном из вариантов осуществления измеряемый сигнал является сигналом флуоресценции. В предпочтительном варианте осуществления сигнал флуоресценции тушится при связывании K⁺ с доменом калиевого сенсора.

В более предпочтительном варианте осуществления измеряемый детектируемый сигнал является сигналом FRET. Предпочтительно, сигнал FRET генерируется первым сигнальным доменом и вторым сигнальным доменом. Более предпочтительно, сигнал FRET генерируется парой донор-акцептор FRET, предпочтительно - YFP, таким как CPV, и CFP. Специалисту в этой области известно, как измерять сигналы FRET. Предпочтительно, FRET между YFP и CFP измеряют после возбуждения светом с длиной волны в диапазоне от приблизительно 420 нм до приблизительно 450 нм. Более предпочтительно, измерение осуществляют после возбуждения светом с длиной волны приблизительно 440 нм. Также предпочтительно, эмиссию света измеряют при длине волны в диапазоне от приблизительно 525 нм до приблизительно 545 нм и более предпочтительно - приблизительно 535 нм.

В другом предпочтительном варианте осуществления пара FRET представляет собой Clover и mRuby2 вместо YFP и CFP. В этом случае сигнал FRET измеряют после возбуждения светом от 470 нм до приблизительно 490 нм и/или эмиссии света в диапазоне от приблизительно 510 нм до 520 нм (эмиссия 1) и от 590 нм до приблизительно 610 нм (эмиссия 2).

В предпочтительном варианте осуществления стадия a) способа детекции K⁺, т.е. получение полипептида по изобретению, может включать трансфекцию по меньшей мере одной клетки вне организма человека или животного или трансформации прокариотической клетки с использованием полинуклеотида, плазмиды и/или экспрессирующего вектора, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Затем полипептид по изобретению можно получать посредством синтеза белка в указанной клетке. Затем полипептид по настоящему изобретению можно выделять из клетки, он может секретироваться клеткой или оставаться внутри клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению можно получать на стадии a) способа по настоящему изобретению посредством получения клетки по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления способом по настоящему изобретению можно определять наличие ионов калия в любом типе образца. Более предпочтительно, образец выбран из группы, состоящей из биологических образцов, или жидких образцов, или их комбинации. Даже более предпочтительно, образец является культурой клеток, клеточным осадком, лизатом клеток, образцом ткани человека или животного, кровью или жидкостью, содержащей K⁺. В одном из вариантов осуществления образец также может содержать биологический образец, такой как культура клеток, включая монослойную культуру клеток или трехмерную культуру клеток, суспензию клеток, клеточный осадок, лизат клеток, образец ткани человека или животного и жидкий образец, содержащий K⁺. Предпочтительно, затем способ по настоящему изобретению можно использовать для определения влияния K⁺ на биологический образец посредством детекции наличия и/или распределения K⁺ и, необязательно, в комбинации с определением других важных параметров биологического образца, таких как апоптоз клеток, передача сигнала в клетке, экспрессия генов в клетке или т.п.

В одном из аспектов полипептид по настоящему изобретению, таким образом, можно использовать для детекции K⁺ в образце, как описано выше. В предпочтительном варианте осуществления применение по настоящему изобретению включает применение полипептида по настоящему изобретению в (количественной) визуализации in vivo. Термин "визуализация in vivo" относится к визуализации в живых клетках вне организма человека, такой как микроскопия выделенных живых клеток, которые культивировали in vitro. С помощью внутриклеточного полипептида по настоящему изобретению, например, можно определять изменения уровней K⁺ в цитозоле, субплазмалеммной области, ядре, эндоплазматическом ретикулуме, ядерной оболочке и митохондриях, например, в ответ на определенные стимулы или стресс.

В другом предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид по изобретению можно приводить в контакт в подходящей емкости, например, многолуночном планшете, с биологическим образцом и напрямую измерять концентрацию калия, например, с использованием флуоресцентного спектрофотометра для считывания планшетов. Одним из преимуществ применения полипептида по настоящему изобретению является то, что для такого анализа необходимо небольшое количество образца (всего лишь приблизительно 5-10 мкл) по сравнению с количеством биологического образца, необходимым для измерения концентрации калия с использованием электродов, в случае чего, как правило, для достаточного погружения K⁺-электрода необходимо приблизительно от 100 до 1000 мкл или даже больший объем. Таким образом, для определения концентрации K⁺ в сыворотке с использованием такого K⁺-электрода в случае небольших лабораторных животных, таких как мыши, имеющих общий объем крови 1,5-2,5 мл (6-8% массы тела), как правило, необходимо умерщвление животного для получения максимального количества крови.

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению можно использовать в анализе гибели клеток in vitro. Практически во всех типах клеток, особенно в возбудимых клетках, для поддержания градиента Na⁺ и K⁺ в плазматической мембране с помощью Na⁺/K⁺-АТФазы необходимо огромное количество энергии. В стрессовых условиях клеткам начинает не хватать энергии, и, таким образом, они будут иметь сниженную жизнеспособность и в конечном итоге погибнут. В этом варианте осуществления настоящего изобретения выделенный полипептид по настоящему изобретению добавляют в среду для культивирования клеток, и его можно использовать для мониторинга концентрации K⁺ в среде для культивирования с течением времени. Когда снижается жизнеспособность клеток или повышается частота гибели клеток, концентрация K⁺ в среде будет повышаться. И, таким образом, это можно определять с использованием полипептида по настоящему изобретению. Применение полипептида по настоящему изобретению в этом анализе обеспечивает преимущество, состоящее в том, что он делает возможными измерения в реальном времени, которые не будут в дальнейшем повреждать/влиять на клетки в отличие от других анализов гибели/жизнеспособности, известных в этой области (например, анализа MTT или анализов на основе резазурина, таких как анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Blue®).

В другом варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению используют в анализе роста клеток. Известно, что концентрация K⁺ снижается с ростом клеток. Когда выделенный полипептид по настоящему изобретению добавляют в среду для культивирования клеток, снова можно осуществлять мониторинг степени роста клеток. Этот анализ можно использовать, например, для различения растущей культуры бактериальных клеток и культуры бактериальных клеток, содержащей, главным образом, погибшие клетки, которые не растут и не делятся. Это нельзя определить существующими стандартными способами мониторинга роста бактерий, например, посредством измерения оптической плотности (OD600) культуры бактериальных клеток.

В еще одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению можно использовать в качестве сенсора для визуализации колебаний внеклеточного K⁺ в живых животных с использованием интравитальной микроскопии, например, головного мозга или мышц, в реальном времени. В этом случае полипептид по настоящему изобретению, например, можно вводить животным местно. В связи с этим, полипептид по настоящему изобретению, например, можно использовать в качестве исследовательского инструмента для исследования злокачественных новообразований или неврологических нарушений, таких как эпилепсия, мигрень или черепно-мозговая травма, для исследования моделей на животных.

В одном из аспектов, настоящее изобретение также относится к набору для детекции K⁺ в образце, содержащему по меньшей мере один из:

a) полипептида по изобретению;

b) полинуклеотида по изобретению или вектора по изобретению; и/или

c) клетки по изобретению.

Примеры таких наборов включают наборы для определения гибели клеток или жизнеспособности клеток, как описано выше. Помимо полипептида по настоящему изобретению, такой набор, например, может включать по меньшей мере одно из следующего:

a) подходящий буфер, не содержащий K⁺, для разведения образца;

b) по меньшей мере один раствор стандарта с известной концентрацией K⁺ в качестве положительного контроля;

c) если набор содержит несколько растворов, растворы стандартов могут содержать разные концентрации K⁺ для получения калибровочной кривой с использованием указанных растворов стандартов; или

d) подходящий буфер для разведения полипептида по настоящему изобретению.

Набор, содержащий полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению, может дополнительно содержать плазмиды, кодирующие только один или оба сигнальных домена или только калиевый сенсор, для получения контрольных образцов. Набор может дополнительно содержать подходящий буфер для разведения полинуклеотида или вектора.

Набор, содержащий клетку по настоящему изобретению, может дополнительно содержать подходящую среду для культивирования и/или среду для криоконсервации клеток.

В еще одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению также можно использовать в портативном наборе для быстрого тестирования K⁺. В случае такого теста полипептид по настоящему изобретению может находиться в растворе, предпочтительно растворе, не содержащем калий, или его можно иммобилизовать на твердой фазе или частицах.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Включены следующие определения. В рамках изобретения формы в единственном числе также включают соответствующее множественное число, если контекст четко не указывает на иное.

Следует понимать, что термин "содержат" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", не являются ограничивающими. В целях по настоящему изобретению термин "состоящий из" считают предпочтительным вариантом термина "содержащий".

Если далее в настоящем описании группа определена как содержащая по меньшей мере некоторое количество вариантов осуществления, этот термин также включает группу, предпочтительно, состоящую только из этих вариантов осуществления.

Термины "приблизительно" или "по существу, тот же" в контексте настоящего изобретения означают интервал погрешности, который, как понятно специалисту в этой области, все равно обеспечивает технический эффект интересующего признака. Как правило, термин включает отклонение от указанного численного значения ±10%, и предпочтительно - ±5%.

В рамках изобретения термин "домен" относится к элементам структуры полипептидов или слитых белков. Таким образом, термин "домен" включает части полипептида, которые могут сворачиваться, функционировать и/или существовать независимо от остальной части полипептидной цепи или структуры. Например, голубой флуоресцентный белок считают доменом, когда он является частью слитого белка. Кроме того, в рамках изобретения термин "домен" также включает каждую часть раздельного фермента или раздельного флуоресцентного белка, где каждую часть считают доменом, даже если два домена раздельного фермента или раздельного флуоресцентного белка могут сворачиваться и функционировать только совместно.

В рамках изобретения термин "полипептид" и "белок" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для описания белковых молекул, которые могут содержать части белка или полноразмерные белки. Термин включает "слитые белки", содержащие белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Слитый белок также может включать связующие области аминокислот между частями аминокислотных последовательностей, полученных из разных белков.

В рамках изобретения термин "детектируемый сигнал" относится к повышению или снижению сигналов, общеупотребительных в области биохимии, химии, медицины или диагностики. Неограничивающие примеры детектируемого сигнала включают в электрический (например, емкостной), механический, оптический, акустический или термический сигнал. Предпочтительно, оптический сигнал может являться флуоресцентным сигналом, сигналом FRET, колориметрическим сигналом или электрохемилюминесцентным сигналом. Также предпочтительно, сигнал может являться детектируемым, т.е. сигнал и соответствующее изменение сигнала можно подвергать мониторингу с использованием соответствующего оборудования. Предпочтительно, детектируемый сигнал может являться сигналом, генерируемым или изменяемым в зависимости от близкого расположения, например, индуцируемым посредством конформационного изменения полипептида.

В рамках изобретения термин "FRET" относится к резонансному переносу энергии флуоресценции между молекулами или внутри молекул. В способах FRET один флуорофор может действовать в качестве донора энергии, а другой является акцептором энергии. Иногда их обозначают как репортер и гаситель, соответственно. Донор может возбуждаться при определенной длине волны света, которая, как правило, будет длиной волны флуоресценции. Акцептор также может возбуждаться при длине волны таким образом, что он может получать энергию эмиссии молекулы донора с помощью множества механизмов зависящего от расстояния переноса энергии. Как правило, акцептор получает энергию эмиссии донора, когда они находятся в непосредственной близости. Донор и акцептор могут являться разными молекулами или разными частями одной молекулы, такими как два разных домена полипептида. Способы измерения FRET хорошо известны в этой области.

В рамках изобретения термин "пара донор-акцептор FRET" относится к флуорофорам, представляющим собой донор энергии и акцептор энергии, способные к FRET, как описано выше. В связи с этим, термин "флуорофор" относится к компоненту молекулы, заставляющему молекулу быть флуоресцентной. Он является функциональной группой в молекуле, которая будет поглощать свет со специфической длиной волны и испускать свет с другой (но в равной степени специфической) длиной волны. Количество и длина волны испускаемого света зависят от флуорофора и химического окружения флуорофора. Флуорофоры включают, в качестве неограничивающих примеров, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), реакционноспособное производное флуоресцеина, родамин (TRITC), кумарин, цианиновые красители (Cy), например, цианин 3, цианин 5 или цианин 7, флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea Victoria или Renilla reniformis или варианты таких белков, такие как желтый флуоресцентный белок (YFP), включая Citrine, Venus и Ypet; синий флуоресцентный белок (BFP), такой как EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1; голубой флуоресцентный белок (CFP) такой как ECFP, Cerulean, CyPet; и другие флуоресцентные белки, такие как UnaG, dsRed, mRuby2, Clover, eqFP611, Dronpa, TagRFP, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP, Clover, mRubby, mKOk и mKO2. Низкомолекулярные флуорофоры, такие как флуоресцеинизотиоцианат (FITC), реакционноспособное производное флуоресцеина, родамин (TRITC), кумарин, цианин (Cy), можно конъюгировать с белками, и они могут действовать в качестве флуорофора. Неограничивающие примеры флуорофоров, которые можно использовать в качестве пары донор-акцептор FRET, включают CFP в качестве донора и YFP в качестве акцептора, EGFP в качестве донора и Cy3 в качестве акцептора, или EGFP в качестве донора и YFP в качестве акцептора, или Clover в качестве донора и mRuby2 в качестве акцептора или cpEGFP в качестве донора и mKO2 в качестве акцептора.

В рамках изобретения термин "раздельный фермент" относится к биологически активному ферменту, разделенному по меньшей мере на две части, имеющие по меньшей мере сниженную биологическую активность или не имеющие ее. В связи с этим, термин "пара частей раздельного фермента" относится по меньшей мере к двум по меньшей мере частично неактивным частям фермента. В непосредственной близости части фермента взаимодействуют с образованием биологически активного фермента, который можно определять с использованием общепринятых способов детекции ферментов. Технология раздельных ферментов также описана в WO 2005/094441 A2. Неограничивающие примеры раздельных ферментов включают люциферазу Renilla, которую можно восстанавливать и подвергать мониторингу посредством биолюминесценции; комплементарную раздельную β-галактозидазу, где активность можно подвергать мониторингу посредством колориметрической, хемилюминесцентной или флуоресцентной детекции; раздельную β-лактамазу, комплементацию которой можно анализировать по изменению цвета нитроцефина после гидролиза или по флуоресценции CCF-2/AM; ГТФазы (изменение заряда), пероксидазы (колориметрическая детекция), нуклеазы (эндо- и экзо-расщепление), рестрикционные эндонуклеазы (специфическое в отношении последовательности эндо-расщепление), протеазы (расщепление белков), лигазы (лигирование олигонуклеотидов) и тиол-дисульфидные оксидоредуктазы (конформационное изменение по причине дисульфидных связей).

В рамках изобретения термин "пары частей раздельного флуоресцентного белка (SFP)" относится по меньшей мере к двум частям флуоресцентного белка. SFP состоят из множества пептидных или полипептидных фрагментов, которые по отдельности не являются флуоресцентными, но при комплементации образуют функциональную флуоресцентную молекулу. Например, раздельный зеленый флуоресцентный белок (раздельный GFP) является SFP. Некоторые сконструированные молекулы раздельного GFP являются самособирающимися (см., например, публикацию патентной заявки США № 2005/0221343 и публикацию PCT № WO/2005/074436; Cabantous et al., Nat. Biotechnol., 23:102-107, 2005; Cabantous and Waldo, Nat. Способы, 3:845-854, 2006). В US 2012282643 также описывают варианты раздельного желтого флуоресцентного белка и варианты раздельного голубого флуоресцентного белка.

В рамках изобретения определение "процента идентичности" двух последовательностей, предпочтительно, осуществляют с использованием математического алгоритма по Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм, например, включен в программы BLASTn и BLASTp по Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 403-410, доступные в NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).

Определение процента идентичности, предпочтительно, осуществляют с использованием стандартных параметров программ BLASTn и BLASTp.

Поиски полинуклеотидов BLAST, предпочтительно, осуществляют с помощью программы BLASTn.

Что касается общих параметров, в поле "максимальные целевые последовательности" можно задавать 100, можно отмечать поле "короткие запросы", в поле "ожидаемое пороговое значение" можно задавать 10 и в поле "размер слова" можно задавать 28. Что касается параметров балльной оценки, "баллы совпадения/несовпадения" можно устанавливать на 1-2 и поле "штраф за пропуск" можно устанавливать как линейное. Что касается параметров фильтров и маски, можно не отмечать поле "области низкой сложности", можно не отмечать поле "специфические для вида повторы", можно отмечать поле "маска только для таблицы поиска", можно не отмечать поле "маска для регистра строчных букв".

Поиски белков в BLAST, предпочтительно, с помощью программы BLASTp.

Что касается общих параметров, в поле "максимальные целевые последовательности" можно задавать 100, можно отмечать поле "короткие запросы", в поле "ожидаемое пороговое значение" можно задавать 10 и в поле "размер слова" можно задавать "3". Что касается параметров балльной оценки, поле "матрица" можно устанавливать "BLOSUM62", в поле "штраф за пропуск" можно задавать "открытие: 11 удлинение: 1", в поле "композиционные поправки" можно задавать "Условная композиционная поправка матрицы замен". Что касается параметров фильтров и маски, можно не отмечать поле "области низкой сложности", можно не отмечать поле "маска только для таблицы поиска" и можно не отмечать поле "маска для регистра строчных букв".

Процент идентичности определяют по всей длине соответствующей референсной последовательности, т.е. по всей длине последовательности, приведенной в SEQ ID NO, упомянутых в соответствующем контексте. Например, аминокислотная последовательность, демонстрирующая по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1, демонстрирует по меньшей мере 80% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 1 по всей длине SEQ ID NO: 1. В другом примере последовательность, демонстрирующая по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3, демонстрирует по меньшей мере 80% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 3 по всей длине SEQ ID NO: 3.

Термин "выделенный" в контексте настоящего изобретения означает, что полипептид или полинуклеотид удален из своего природного окружения и/или находится в форме, в которой его не обнаруживают в природе. "Выделенный" полипептид или "выделенный" полинуклеотид также могут являться полипептидом или полинуклеотидом, полученным in vitro.

В рамках изобретения термин "замена аминокислоты" относится к замене в аминокислотной последовательности в соответствии с консервативной или неконсервативной заменой, предпочтительно - консервативной заменой. В некоторых вариантах осуществления замена также включает замену природной аминокислоты неприродной аминокислотой. Консервативная замена включает замену аминокислоты другой аминокислотой, имеющей химические свойства, схожие с замещаемой аминокислотой. Предпочтительно, консервативная замена является заменой, выбранной из группы, состоящей из:

(i) замены основной аминокислоты другой основной аминокислотой;

(ii) замены кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой;

(iii) замены ароматической аминокислоты другой ароматической аминокислотой;

(iv) замены неполярной, алифатической аминокислоты другой неполярной, алифатической аминокислотой; и

(v) замены полярной, незаряженной аминокислоты другой полярной, незаряженной аминокислотой.

Основная аминокислота, предпочтительно, выбрана из группы, состоящей из аргинина, гистидина и лизина. Кислая аминокислота, предпочтительно, является аспартатом или глутаматом.

Ароматическая аминокислота, предпочтительно, выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина и триптофана. Неполярная, алифатическая аминокислота, предпочтительно, выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, метионина и изолейцина. Полярная, незаряженная аминокислота, предпочтительно, выбрана из группы, состоящей из серина, треонина, цистеина, пролина, аспарагина и глутамина. В отличие от консервативной аминокислотной замены, неконсервативная аминокислотная замена является заменой аминокислоты любой аминокислотой, не попадающей в указанные выше консервативные замены (i)-(v).

В рамках изобретения термин "биологический образец" относится к образцу ткани (например, биоптату ткани), органа, клетки, лизату клеток или физиологической жидкости (крови, моче, слюне, желчи, сыворотке, цереброспинальной жидкости и т.п.) вне организма человека или животного. Кроме того, термин "биологический образец" также включает культивируемые in vitro клетки или лизаты эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих, клетки человека или растительные клетки, или прокариотических клеток, необязательно, генетически модифицированных способами, общепринято известными специалисту в этой области, включая способы трансфекции и трансформации.

В рамках изобретения термин "связывание" относится к взаимодействию притяжения между двумя молекулами, приводящему к стабильной ассоциации, при которой молекулы находятся в непосредственной близости друг к другу. Иногда результатом связывания является образование молекулярного комплекса, в котором силы притяжения, удерживающие компоненты вместе, как правило, являются нековалентными и, таким образом, как правило, являются энергетически более слабыми, чем ковалентные связи.

ПРИМЕРЫ

1. Культуры клеток, трансфекция клеток, химические реагенты и буферы

Клетки HeLa выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Sigma Aldrich), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. При конфлуэнтности 60-80% клетки в чашках для визуализации 30 мм трансфицировали с использованием 1 мл среды, не содержащей сыворотку и антибиотики, смешанной с 1,5 мкг соответствующей плазмидной ДНК и 3 мкг реагента для трансфекции TransFastTM (Promega). Клетки держали во влажной камере (37°C, 5% CO₂, 95% воздуха) в течение 16-20 часов перед заменой обратно на соответствующую среду для культивирования. Все эксперименты осуществляли через 24 часа после трансфекции. Валиномицин приобретали в Sigma Aldrich и использовали в конечной концентрации 7 мкМ. Используемый экспериментальный буфер состоял из (в г/л): 8,0 или 7,6 NaCl, 1,44 Na₂HPO₄, 0,12 NaH₂PO₄, pH 7,40, с использованием NaOH с 0,4 KCl или без KCl.

2. Визуализация живых клеток

Флуоресцентную визуализацию осуществляли с использованием TiLL iMIC (Till Photonics, Graefelfing, Germany), цифровой широкопольной системы для флуоресцентной визуализации. R-GEPII на основе FRET с красным смещением возбуждали при 480 нм и регистрировали эмиссию при 510-540 нм (Clover, т.е. донор FRET) и 560-610 нм (FRET от Clover к mRuby2), соответственно. GEPII 1.0 на основе CFP/YFP возбуждали при 430 нм и регистрировали эмиссию при 480 нм и 535 нм, соответственно. Регистрацию данных и контроль цифрового флуоресцентного микроскопа осуществляли с использованием программного обеспечения Live Acquisition версии 2.0.0.12 (Till Photonics).

3. Моделирование in silico

Модели домена BON и полноразмерного Kbp предсказывали с использованием он-лайн программы Phyre2 (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index). Дальнейший анализ предсказанных трехмерных структур химеры осуществляли с использованием программного обеспечения PyMol Viewer. Предсказание структуры тоннеля осуществляли с использованием он-лайн программы PoreWalker 1.0 (http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/PoreWalker/).

4. Детекция K⁺ посредством FRET

Плазмидную ДНК, кодирующую полипептиды GEPII 1.0 и R-GEPII 1.0 (фиг. 2a и b), получали с использованием классических способов клонирования. GEPII 1.0 содержит оптимизированную пару FRET CFP/YFP (sECFP в качестве донора FRET и cpV в качестве акцептора FRET) (фиг. 2a, верхняя панель). R-GEPII 1.0 с красным смещением содержит Clover и mRuby2 (фиг. 2a, нижняя панель и b), являющиеся светло-зеленым и красным вариантами FP, соответственно, оптимизированными для получения батохромных зондов на основе FRET с улучшенной динамикой. Оба зонда тестировали в клетках HeLa, экспрессирующих GEPII 1.0 на основе CFP/YFP (фиг. 2c, левые панели) или R-GEPII 1.0 с красным смещением (фиг. 2c, правые панели) после трансфекции с использованием соответствующей плазмидной ДНК. Для контроля цитозольной концентрации K⁺ ([K⁺]_cyto), клетки пермеабилизовали смесью дигитонина и ионофора K⁺ валиномицина (фиг. 2d) или только валиномицином (фиг. 2e). Фактически, сигналы соотношения FRET GEPII повышались в ответ на добавление K⁺ в зависимости от концентрации (фиг. 2d), при этом флуоресценция FRET незамедлительно снижалась после удаления K⁺ (фиг. 2d и e). С помощью этих экспериментов подтверждали, что посредством дизайна и получения химерных конструкций FP и kbp получали функциональные зонды на основе FRET, обеспечивающие считывание изменений K⁺ в реальном времени.

In situ обнаруживали, что полумаксимальная эффективная концентрация (EC₅₀) GEPII 1.0 на основе CFP/YFP и соответствующего R-GEPII 1.0 составляет 2,04 (1,72-2,41) мМ (фиг. 2d, правая панель) и 4,11 (3,25-5,19) мМ (n=8), соответственно. Для определения значений EC₅₀ in situ (при культивировании отдельных клеток HeLa) клетки, экспрессирующие GEPII, пермеабилизовали 5 мкМ дигитонина в течение 10 минут в растворе, не содержащем K⁺. Дигитонин наносили на клетки под микроскопом с использованием полуавтоматической перфузионной системы. Непрерывную визуализацию соотношения FRET с течением времени использовали для исследования чувствительности зондов к K⁺. Разные концентрации K⁺ в диапазоне от 0,01 мМ до 100 мМ добавляли с помощью перфузионной системы до тех пор, пока сигнал соотношения FRET не повышался и оставался стабильным. Строили график максимальных значений дельты соотношения FRET относительно соответствующих логарифмических концентраций K⁺ и аппроксимировали с использованием сигмоидального уравнения концентрация-ответ. Анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.

5. Рациональный дизайн вариантов полипептидов

Для воздействия на чувствительность GEPII к K⁺ авторы настоящего изобретения осуществляли рациональный дизайн kbp дикого типа с учетом анализа последовательности и гомологичного трехмерного моделирования с использованием программного обеспечения Phyre-2 и PyMol. Прогнозы авторов настоящего изобретения, а также предварительные данные свидетельствовали о том, что мутации, кодирующие заряженные и полярные аминокислоты в доменах BON и LysM, значительно снижали чувствительность соответствующих GEPII на основе FRET к K⁺.

В K⁺-связывающем домене BON дикого типа из kbp можно идентифицировать 8 положений кислых аминокислот: D41, D43, D51, D59, E64, E67, D83 и D84 (фиг. 3a и b, красные области). Примечательно, что посредством трехмерного моделирования домена BON с использованием Phyre2 и PyMol предсказывали поры или тоннеле-подобные структуры (фиг. 3a). Минимальное расстояние между двумя кислыми аминокислотами в этой поре составляет приблизительно от 680 до 800 пм (фиг. 3c). Рассматривали минимальный диаметр пор приблизительно 660 пм (фиг. 3d). Кислые аминокислоты, близкие к поре и находящиеся в ней, могут хорошо противодействовать и связываться с гидратированным ионом K⁺ (фиг. 3e).

Кроме того, с помощью анализов последовательностей в комбинации с трехмерным моделированием домена BON (фиг. 3) прогнозировали, что, в дополнение ко всем из кислых аминокислот, Q (глутамин) в положении 27, N (аспарагин) в положении 35, N (аспарагин) в положении 75 и G (глицин) в положении 53 важны для чувствительности к K⁺.

Три отрицательно заряженные аминокислоты в положениях 105 (D), 126 (E) и 408 (D) в домене LysM, как предполагают, взаимодействующем с K⁺-связывающим доменом BON, также, по-видимому, важны для конформационного изменения белка после связывания K⁺.

6. Детекция FRET с использованием вариантов полипептидов

Плазмидную ДНК, кодирующую мутантные GEPII 1.0, получали с использованием сайт-специфического мутагенеза. В этом случае праймеры, содержащие сконструированные однонуклеотидные полиморфизмы, использовали для соответствующей ПЦР с использованием полимеразы геркулазы II (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Затем соответствующие продукты ПЦР субклонировали экспрессирующий вектор млекопитающего pcDNA3.1(-) с использованием соответствующих ферментов рестрикции. Затем клетки Hela трансфицировали с использованием соответствующей плазмидной ДНК и определяли EC₅₀, как описано выше в примере 4. Результаты для соответствующих вариантов полипептидов, приведены в таблице 5.

Таблица 5: Чувствительность вариантов GEPII 1.0 с заменами аминокислот

Конструкция	Варианты последовательности калиевого сенсора в полипептиде (SEQ ID NO)	EC50 in situ (мМ)
GEPII 1.0 (13)	Kbp дикого типа (wt) (3)	2,6
∆BON GEPII 1.1	Q26R, N35Q, N75Q, G52D (5)	52,9
∆LysM GEPII 1.0	D104N, E125Q, D135N (4)	55,8

7. Детекция FRET вариантов полипептидов с использованием разных линкерных молекул между первым доменом калиевого сенсора и вторым доменом калиевого сенсора

Плазмиды, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, содержащие последовательность линкера, содержащую остатки глицина и серина, получали с использованием пар сконструированных прямых и обратных праймеров, кодирующих аминокислоты, образующие соответствующие линкеры. Прямой праймер конструировали для элонгации домена LysM дикого типа с 5'-липким концом, образующим линкер при ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов. Обратный праймер конструировали для связывания домена BON дикого типа и образования того же линкера на 3'-конце. Затем эти два продукта ПЦР подвергали слиянию посредством дополнительной ПЦР и субклонировали в вектор pcDNA3.1(-), фланкируя нуклеотидными последовательностями, кодирующими mseCFP и cpV, соответственно. Конечные конструкции кодируют новые варианты GEPII на основе CFP/YFP FRET с гибкими линкерами между доменами BON и LysM Kbp.

Затем клетки трансфицировали с использованием плазмидной ДНК и определяли EC₅₀, как описано выше в примере 4. Результаты для соответствующих вариантов полипептидов приведены в таблице 6.

Таблица 6: Чувствительность вариантов GEPII 1.0, в которых BON и LysM соединены разными последовательностями линкеров

Конструкция	Последовательность калиевого сенсора в полипептиде (SEQ ID NO)	EC50 in situ (мМ)
GEPII 1.0 (13)	Kbp дикого типа (wt) (3)	2,6
GEPII 2.7	wtBON-GGGGSGG-wtLysM (14)	9,15
GEPII 2.10	wtBON-GGGGSGGGGS-wtLysM (15)	11,54
GEPII 2.15	wtBON-GGGGSGGGGSGGGGS-wtLysM (16)	16,96
GEPII 2.22	wtBON-GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG-wtLysM (17)	59,95
GEPII 2.28	wtBON-GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS-wtLysM (18)	31,35

Полипептиды, содержащие линкерную молекулу, демонстрировали повышенную EC₅₀ по сравнению с GEPII 1.0.

8. Детекция FRET вариантов полипептидов, содержащих линкер между доменами BON и LysM

Плазмиды, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, содержащие замены аминокислот и последовательность линкера, получали с использованием пар сконструированных прямых и обратных праймеров, кодирующих аминокислоты, образующие соответствующие линкеры. Прямой праймер конструировали для элонгации домена ΔLysM (см. ΔLysM GEPII 1.0) с 5'-липким концом, образующим линкер при ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов. Обратный праймер конструировали для связывания домена BON дикого типа и образования того же линкера на 3'-конце. Затем эти два продукта ПЦР подвергали слиянию посредством дополнительной ПЦР и субклонировали в вектор pcDNA3.1(-), фланкируя нуклеотидными последовательностями, кодирующими mseCFP и cpV, соответственно. Конечная конструкция кодирует новые варианты GEPII на основе CFP/YFP FRET с гибкими линкерами между доменами BON и ΔLysM.

Затем клетки Hela трансфицировали с использованием плазмидной ДНК и определяли EC₅₀, как описано выше в примере 4. Результаты для соответствующих вариантов полипептидов приведены в таблице 7.

Таблица 7: Чувствительности вариантов GEPII 1.0, содержащих замены аминокислот и последовательности линкеров

Конструкция	Последовательность калиевого сенсора в полипептиде (SEQ ID NO)	EC50 in situ (мМ)
ΔLysM GEPII 2.4	wtBON-GGGG-ΔLysMD104N, E125Q, D135N (19)	>60
ΔLysM GEPII 2.7	wtBON-GGGGSGG-ΔLysMD104N, E125Q, D135N (20)	>100

9. Таргетинг органелл и субдоменов клеток, экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению

Значительным преимуществом генетически кодируемых зондов является то, что их можно точно направлять в органеллы и субдомены клетки. Таким образом, таргетинг GEPII сделает возможным количественный анализ уровней K⁺ и динамики с высоким пространственным и временным разрешением. По причине отсутствия направляемых K⁺-зондов идея авторов настоящего изобретения, касающаяся субклеточных потоков K⁺, является очень неопределенной.

Соответствующую плазмидную ДНК, кодирующую GEPII 1.0 с N-концевыми или C-концевыми последовательностями таргетинга, клонировали общепринятыми способами молекулярной биологии, известными специалистам в этой области. Эксперименты по таргетингу полипептида GEPII 1.0 (см. Фиг. 2) в ядро (фиг. 4c), митохондрии (фиг. 4d), эндоплазматический ретикулум (ER, Фиг. 4e), поверхность клетки (фиг. 4f), ядерную оболочку (фиг. 4g) и субплазмалеммную область (фиг. 4h) анализировали посредством флуоресцентной микроскопии, и результаты представлены на фиг. 4. GEPII 1.0 без какой-либо последовательности таргетинга локализуется в цитозоле и ядре (фиг. 4a). Добавление последовательности ядерного экспорта (NES; LPPLERLTL) на C-конец GEPII 1.0 приводило к локализации K⁺-зонда только в цитозоле (фиг. 4b). Направленные зонды сделают возможной временную флуоресцентную визуализацию субклеточных потоков K⁺.

10. Характеризация выделенных полипептидов

Разные варианты GEPII клонировали в бактериальный экспрессирующий вектор petM11. После трансформации химически компетентных бактерий DH5α с использованием бактериальных экспрессирующих плазмид, кодирующих GEPII, клетки культивировали на чашках с LB-агаром для получения отдельных колоний. Предварительные культуры, содержащие отдельные колонии, культивировали в течение ночи, а затем инокулировали в 1 л свежих сред LB при 37°C. Когда достигали оптической плотности 0,7, индуцировали экспрессию белка посредством добавления IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида) до конечной концентрации 0,5 мМ и дополнительно культивировали клетки при комнатной температуре. Затем экспрессируемые GEPII выделяли из бактериальных клеток посредством их лизиса, а затем очищали с использованием аффинной хроматографии. Элюцию из колонок осуществляли с помощью имидазола. GEPII-содержащие элюаты разводили в забуференном HEPES растворе, содержащем Triton X 100 (0,05%). Для подтверждения выделения рекомбинантного GEPII дополнительно использовали эксклюзионную хроматографию. Измерения FRET с помощью флуоресцентного спектрофотометра для чтения планшетов показали, что Na⁺ и Ca²⁺ не влияли на сигнал соотношения FRET рекомбинантного полипептида. В отличие от этого, K⁺, относительно Rb⁺ и Cs⁺, повышал сигнал соотношения FRET очищенных GEPII в ответ на добавление 3 мМ соответствующих ионов (см. фиг. 5).

11. Определение концентрации K⁺ в биологическом образце

В предварительных экспериментах авторы настоящего изобретения использовали очищенный GEPII 1.0, как описано выше, для определения K⁺ в сыворотках мышей в экспериментальных условиях, показанных на фиг. 6A. Авторы настоящего изобретения определяли концентрацию K⁺ в сыворотке 6,63±0,34 мМ (SD; n=5; Фиг. 6), что соответствует опубликованным данным. Важно, что воспроизводимость и повторяемость, независимо от способа забора крови (из лицевой или орбитальной вены), а также стабильность GEPII в сыворотках мышей были крайне высокими (фиг. 6), что свидетельствует о том, что определение K⁺ с помощью GEPII в биологических образцах представляет собой надежный и точный способ.

12. Анализ жизнеспособности/гибели клеток

Кроме того, очищенный GEPII 1.0 использовали для динамической регистрации концентрации внеклеточного K⁺ в (многолуночном) планшете для культур клеток как меры жизнеспособности и гибели клеток. Сигнал соотношения FRET внеклеточно локализованного рекомбинантного GEPII 1.0 измеряли каждый час, держа клетки в среде для культивирования, содержащей глюкозу или 2-дезоксиглюкозу (2-DG). Как показано на фигуре 7, концентрация внеклеточного K⁺ в супернатанте контрольных клеток в присутствии 10 мМ глюкозы оставалась постоянной с течением времени, пока клетки не пермеабилизовали 50 мкМ дигитонина. В отличие от этого, сигнал соотношения FRET очищенного GEPII 1.0 значительно повышался с течением времени, если клетки обрабатывали 2-DG, что свидетельствует о метаболическом кризисе, что быстро приводит к потере внутриклеточного K⁺. Эти данные дополнительно подтверждают, что измерение высвобождения K⁺ клетками в культуре представляет собой анализ жизнеспособности клеток в реальном времени.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Medical University Graz

<120> ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ИНДИКАТОРЫ ИОНОВ КАЛИЯ

<130> M11159

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 1

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr

50 55 60

<210> 2

<211> 50

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 2

Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys

1 5 10 15

Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn

20 25 30

Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu

35 40 45

Arg Ile

50

<210> 3

<211> 149

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 3

Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp

1 5 10 15

Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln

20 25 30

Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp Ala Asp Lys Val Asn Ile

35 40 45

Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr Gly Asp Gly Leu Ser Gln

50 55 60

Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val Gly Asn Ile Ser Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys

100 105 110

Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn

115 120 125

Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu

130 135 140

Arg Ile Pro Glu Glu

145

<210> 4

<211> 50

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LysM D104N,E125Q,D135N

<400> 4

Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys

1 5 10 15

Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn

20 25 30

Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu

35 40 45

Arg Ile

50

<210> 5

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> BON Q26R,N35Q, N75Q, G52D

<400> 5

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Asp Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Gln Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr

50 55 60

<210> 6

<211> 228

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mseCFP

<400> 6

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala

225

<210> 7

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> cpV

<400> 7

Met Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

1 5 10 15

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr

20 25 30

Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

35 40 45

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

50 55 60

Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu

65 70 75 80

Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn

85 90 95

Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr

100 105 110

Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val

115 120 125

Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe

130 135 140

Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala

145 150 155 160

Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp

165 170 175

Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

180 185 190

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn

195 200 205

Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr

210 215 220

Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile

225 230 235 240

Arg His Asn Ile Glu

245

<210> 8

<211> 251

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Glover

<400> 8

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys

245 250

<210> 9

<211> 237

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mRuby2

<400> 9

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Arg Met Lys

1 5 10 15

Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe Lys Cys Thr Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys

35 40 45

Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr

50 55 60

Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Lys Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg

85 90 95

Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Met Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr His Val Gln Val Arg Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp

130 135 140

Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly

145 150 155 160

Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu Ser Cys

165 170 175

Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys

180 185 190

Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His Arg Leu Glu Arg Leu Glu Glu

195 200 205

Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His Ala Val Ala Lys

210 215 220

Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 10

<211> 189

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 10

caggcgaaga aggtgcagga gcatctgaac aaaaccggta taccggatgc cgataaagtg 60

aatattcaaa ttgccgacgg caaagcgacg gtcactggtg acggcctgag tcaggaggcg 120

aaggagaaaa tccttgttgc ggtggggaat atttccggta ttgccagtgt cgatgatcag 180

gtgaaaacg 189

<210> 11

<211> 150

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 11

cagttttata ccgttaagtc tggcgacact ctgagtgcca tttccaaaca ggtctacggt 60

aacgctaatc tgtacaataa aatcttcgaa gcgaataaac cgatgctaaa aagcccggat 120

aaaatttatc cggggcaagt gttgcgtatt 150

<210> 12

<211> 447

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 12

atgggtctgt tcaattttgt gaaagatgcc ggagaaaaac tctgggacgc ggttacaggt 60

cagcacgata aagacgatca ggcgaagaag gtgcaggagc atctgaacaa aaccggtata 120

ccggatgccg ataaagtgaa tattcaaatt gccgacggca aagcgacggt cactggtgac 180

ggcctgagtc aggaggcgaa ggagaaaatc cttgttgcgg tggggaatat ttccggtatt 240

gccagtgtcg atgatcaggt gaaaacggcg acaccagcca ctgccagcca gttttatacc 300

gttaagtctg gcgacactct gagtgccatt tccaaacagg tctacggtaa cgctaatctg 360

tacaataaaa tcttcgaagc gaataaaccg atgctaaaaa gcccggataa aatttatccg 420

gggcaagtgt tgcgtattcc ggaagag 447

<210> 13

<211> 626

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEP II 1.0

<400> 13

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Ile Asp Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala

225 230 235 240

Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp

245 250 255

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

260 265 270

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

275 280 285

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

290 295 300

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

305 310 315 320

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr

325 330 335

Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn

340 345 350

Lys Ile Phe Glu Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile

355 360 365

Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro Glu Glu Glu Phe Met Asp Gly

370 375 380

Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp

385 390 395 400

Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys

405 410 415

Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu

420 425 430

Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

450 455 460

Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys

465 470 475 480

Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu

485 490 495

Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro

500 505 510

Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr

515 520 525

Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu

530 535 540

Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr

545 550 555 560

Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg

565 570 575

Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly

580 585 590

His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala

595 600 605

Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn

610 615 620

Ile Glu

625

<210> 14

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.7

<400> 14

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr

85 90 95

Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met

100 105 110

Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile

115 120 125

<210> 15

<211> 130

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.10

<400> 15

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys

85 90 95

Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn

100 105 110

Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu

115 120 125

Arg Ile

130

<210> 16

<211> 135

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.15

<400> 16

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu

85 90 95

Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys

100 105 110

Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr

115 120 125

Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile

130 135

<210> 17

<211> 142

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.22

<400> 17

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr Thr

85 90 95

Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly

100 105 110

Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu

115 120 125

Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile

130 135 140

<210> 18

<211> 148

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEP II 2.28

<400> 18

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile

100 105 110

Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln

130 135 140

Val Leu Arg Ile

145

<210> 19

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.4

<400> 19

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gln Phe Tyr Thr Val Lys

65 70 75 80

Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala

85 90 95

Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser

100 105 110

Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile

115 120

<210> 20

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GEPII 2.7

<400> 20

Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp

1 5 10 15

Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr

20 25 30

Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala

50 55 60

Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr

85 90 95

Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met

100 105 110

Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile

115 120 125

<210> 21

<211> 641

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R-GEPII 1.0

<400> 21

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys Ile Asp Met Gly Leu

245 250 255

Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr

260 265 270

Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu

275 280 285

Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala

290 295 300

Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys

305 310 315 320

Glu Lys Ile Leu Val Ala Val Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val

325 330 335

Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr

340 345 350

Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr

355 360 365

Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn Lys Pro Met

370 375 380

Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro

385 390 395 400

Glu Glu Glu Phe Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn

405 410 415

Met Arg Met Lys Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe

420 425 430

Lys Cys Thr Gly Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr

435 440 445

Met Arg Ile Lys Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp

450 455 460

Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr

465 470 475 480

Pro Lys Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe

485 490 495

Thr Trp Glu Arg Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

500 505 510

Met Gln Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr His Val Gln

515 520 525

Val Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

530 535 540

Thr Lys Gly Trp Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly

545 550 555 560

Gly Leu Arg Gly Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly

565 570 575

His Leu Ser Cys Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val

580 585 590

Gly Asn Ile Lys Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His Arg Leu Glu

595 600 605

Arg Leu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His

610 615 620

Ala Val Ala Lys Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr

625 630 635 640

Lys

<---

1. Полипептид, содержащий

a) первый сигнальный домен и

b) калиевый сенсор, содержащий

b1) первый домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1; и

b2) второй домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2;

где калиевый сенсор может связываться с положительно заряженным ионом калия и первый сигнальный домен может генерировать детектируемый сигнал после связывания положительно заряженного иона калия с калиевым сенсором.

2. Полипептид по п.1, содержащий

a) первый сигнальный домен и

b) калиевый сенсор, содержащий

b1) первый домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1; и

b2) второй домен калиевого сенсора, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2; и

c) второй сигнальный домен,

где калиевый сенсор может связываться с положительно заряженным ионом калия и первый сигнальный домен и второй сигнальный домен совместно могут генерировать детектируемый сигнал после связывания положительно заряженного иона калия с калиевым сенсором.

3. Полипептид по любому из пп.1 или 2, где калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

4. Полипептид по любому из пп.1–3, где калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность первого домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 1, содержащую по меньшей мере одну из следующих замен аминокислот: D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q или G52D.

5. Полипептид по п.4, где калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность первого домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 1, содержащую следующие замены: Q26R, N35Q, N75Q, G52D.

6. Полипептид по любому из пп.1–5, где калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность второго домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 2, содержащую по меньшей мере одну из следующих замен аминокислот: D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q или N127Q.

7. Полипептид по п.6, где калиевый сенсор содержит аминокислотную последовательность второго домена калиевого сенсора SEQ ID NO: 2, содержащую следующие замены: D104N, E125Q, D135N.

8. Полипептид по любому из пп.1–7, где полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность линкера –GGGG– или по меньшей мере одну последовательность линкера формулы (I):

–(GGS)_x(GGGGS)_y(GG)_z– (I)

где

x является целым числом 0 или 1,

y является целым числом от 1 до 6,

z является целым числом 0 или 1.

9. Полипептид по п.8, где y является 2, 3 или 5.

10. Полипептид по любому из пп.8 или 9, где аминокислотной последовательности линкера предшествует аминокислотная последовательность первого домена калиевого сенсора, а после линкера следует второй домен калиевого сенсора.

11. Полипептид по любому из пп.2–10, где первый сигнальный домен и второй сигнальный домен вместе выбраны из группы, состоящей из пар донор–акцептор резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), пар частей раздельного фермента или пар частей раздельного флуоресцентного белка, где первый сигнальный домен и второй сигнальный домен являются соответствующими частями пары и, предпочтительно, где первый сигнальный домен и второй сигнальный домен являются парой донор–акцептор FRET.

12. Полипептид по любому из пп.2–11, где пара донор–акцептор FRET представляет собой домен голубого флуоресцентного белка (CFP) и домен желтого флуоресцентного белка (YFP), такой как циркулярно пермутированный белок Venus (CPV).

13. Полипептид по любому из пп.2–11, где пара донор–акцептор FRET представляет собой Clover и mRuby2.

14. Полипептид по пп.1–10, где первый сигнальный домен является доменом флуоресцентного белка, предпочтительно, доменом CFP.

15. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп.1–14.

16. Полинуклеотид по п.15, где указанный полинуклеотид содержит последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичности по отношению к последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.

17. Вектор, кодирующий полипептид по любому из пп.1–14, подходящий для экспрессии эукариотического или прокариотического гена.

18. Клетка, содержащая полинуклеотид по п.15 или 16, вектор по п.17 и/или полипептид по любому из пп.1–14.

19. Способ детекции положительно заряженных ионов калия в образце, включающий стадии

a) получения полипептида по любому из пп.1–14;

b) приведения полипептида по любому из пп.1–14 в контакт с образцом;

c) измерения сигнала, генерируемого первым сигнальным доменом; и/или

d) измерения сигнала, генерируемого совместно первым сигнальным доменом и вторым сигнальным доменом;

где изменение интенсивности сигнала после контакта с образцом свидетельствует о наличии ионов калия в образце.

20. Способ по п.19, где сигнал, измеряемый на стадии c) и/или d), является флуоресцентным сигналом, колориметрическим сигналом или сигналом FRET.

21. Способ по любому из пп.19 или 20, где измеряемый сигнал является сигналом FRET.

22. Способ по п.21, где сигнал FRET измеряют после возбуждения светом с длиной волны в диапазоне от приблизительно 470 нм до приблизительно 490 нм и/или эмиссии света в диапазоне приблизительно от 510 нм до 520 нм и от 590 нм до приблизительно 610 нм.

23. Способ по любому из пп.19–22, где на стадии a) получение полипептида включает (i) трансфекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки вне организма человека или животного, или трансформацию прокариотической клетки с использованием полинуклеотида по любому из пп.15 или 16 или вектора по п.17, или (ii) получение клетки по п.18.

24. Применение полипептида по любому из пп.1–14 для детекции положительно заряженного иона калия в образце.

25. Набор для детекции положительно заряженных ионов калия, содержащий по меньшей мере один из:

a) полипептида по любому из пп.1–14;

b) полинуклеотида по любому из пп.15 или 16 или вектора по п.17; и/или

c) клетки по п.18.