Способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, молекулярной биологии, молекулярной генетике, биохимии, и может быть использовано для диагностики тяжелой преэклампсии у беременных. В плазме крови беременной определяют концентрацию внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1. В ядерной ДНК лейкоцитов определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК). При вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл, диагностируют тяжелую преэклампсию. Способ обеспечивает точное выявление тяжелого течения преэклампсии за счет определения набора молекулярно-биологических факторов – критериев объективной достоверной диагностики тяжелых асимптомных форм преэклампсии. 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, а также, к молекулярной биологии, молекулярной генетике, биохимии, может быть использовано при определении критического (тяжелого) состояния беременных, в том числе и с атипичным течением преэклампсии для корректного выбора врачебной тактики.

Преэклампсия представляет собой осложнение беременности, для которой свойственны глубокие расстройства жизненно важных органов и систем, часто сопровождающиеся развитием плацентарной недостаточности и гипотрофии плода. В настоящее время по данным ВОЗ преэклампсия осложняет 2,2% беременностей и имеется тенденция роста частоты ее встречаемости.

Проспективное исследование всех случаев эклампсии, произошедших в Великобритании в 1992 г. (383 случая, частота 4,9 на 10000 родов), показало, что в 38,0% случаев приступы развились до того, как появились и были диагностированы протеинурия и артериальная гипертензия [Douglas К.А., Redman C.W. / Eclampsia in the United Kingdom // BMJ, 1994; 309: 1395-1400].

Учитывая тот факт, что все три классических симптома (артериальная гипертензия, отеки и протеинурия) преэклампсии редко обнаруживаются у беременных одновременно, были предложены новые названия этого осложнения. К ним можно отнести номенклатуру «артериальная гипертензия», «атипическая преэклампсия». К «атипической преэклампсии» относят случаи с отсутствием одного или более симптомов, подчеркивая факт частоты развития таких вариантов в сроки до 20 недель беременности [Sibai В.М. / Diagnosis and management of gestational hypertension and preeclampsia // Obstet Gynecol, 102 (1) (2003), pp. 181-192].

Существует целый комплекс субъективных причин, затрудняющих оценку степени тяжести преэклампсии. К ним относятся следующие субъективные причины: отсутствие точных знаний об этиологии и патогенезе, высокая частота встречаемости атипично протекающей преэклампсии, узкий диапазон характеристик, ориентированных на небольшое количество критериев, не принадлежащих к специфическим из доказательной медицины: повышение АД, протеинурия, тесты функциональной диагностики, антропометрия, допплерометрия и др.

Известны способы прогнозирования тяжелых форм преэклампсии, основанные на определении молекулярно-биологических и генетических факторов.

Известен способ прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения с учетом генетических данных (RU 2653765 С1). Способ осуществляют следующим образом. ДИК выделяют из образцов периферической венозной крови пациенток в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Получают генетические полиморфизмы ММР-2 (rs243865), ММР-8 (rs11225395), ММР-8 (rs1320632), ММР-9 (rs17577) и прогнозируют повышенный риск развития преэклампсии тяжелого течения при наличии сочетания генетических вариантов G ММР-9 (rs17577) и G ММР-8 (rs1320632), пониженный риск развития преэклампсии тяжелого течения - при наличии сочетания генетических вариантов Т ММР-2 (rs243865) и А ММР-9 (rs17577). Однако известный способ не позволяет определять критическое состояние здоровья пациенток при преэклампсии для определения врачебной тактики - пролонгирование или прерывание беременности.

Известен также способ прогнозирования высокого риска репродуктивных потерь в первом триместре беременности (RU 2611358 С1), который включает выделение ДНК из периферической венозной крови беременных и последующую амплификацию полиморфного варианта A66G гена метионинсинтазы редуктазы MTRR. Способ осуществляют следующим образом: в пробирку типа Эппендорф вносят 1000 мкл цельной крови пациентки, центрифугируют пробу со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин. Аккуратно удаляют плазму. Закрывают пробирку и замораживают ее при -20°С до полного замораживания форменных элементов не менее 1 часа. Размораживают содержимое пробирки при комнатной температуре. Вносят в пробирку реактив «ДНК-экспресс-кровь» объемом, равным объему оставшихся в пробирке форменных элементов. Содержимое пробирки тщательно перемешивают на вортексе. Устанавливают пробирку в предварительно прогретый до 99°С термостат и выдерживают в течение 15 мин. По окончании охлаждают до 70°С. Центрифугируют пробирку со скоростью 12000 об/мин при комнатной температуре в течение 60 сек. Полученный супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК. Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Россия) согласно инструкции производителя. Проводят амплификацию аллельных вариантов генов провоспалительных цитокинов - 31C-T(rs1143627) IL-lβ, -174G-C (rs1800795) IL-6 и ферментов фолатного цикла С677Т (rs1801133) MTHFR и при выявлении одного из четырех генотипов: -31СТ IL-1β / -174GG IL-6 / 677СТ MTHFR / 66GG MTRR; -31СТ IL-1β / -174СС IL-6 / 677СС MTHFR / 66AG MTRR; -31СС IL-1β / -174СС IL-6 / 677СС MTHFR/ 66AG MTRR; -31СС IL-lβ / -174GC IL-6 / 677СТ MTHFR/ 66AG MTRR прогнозируют высокий риск репродуктивных потерь в первом триместре беременности. Этот способ также не дает возможности проводить определение тяжести преэклампсии для выбора врачебной тактики - пролонгирование или прерывание беременности.

В качестве прототипа нами выбран классический способ определения тяжелой преэклампсии у беременных по триаде Цангемейстера (отеки, протеинурия, артериальная гипертензия) для корректного выбора врачебной тактики [Шалина Р.И., Михалева Л.М., Симухина М.А., Коноплянников А.Г., Штабницкий A.M. / Особенности клинического течения тяжелых форм преэклампсии в современных условиях // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2017. Т. 16. №6. С. 16-23].

Однако в настоящее время не редко отсутствуют все три классические симптомы преэклампсии. Так, по данным Савельевой Г.М. и соавт.[Савельева Г.М., Шалина Р.И., Курцер М.А. и др. / Эклампсия в современном акушерстве // Акуш. и гинек., 2010, №6, С. 4-10], артериальная гипертензия выше 160/100 мм рт.ст. определялась лишь в 25,5% случаев эклампсии, а в остальных находилась в пределах 130/90-150/100 мм рт.ст.и ниже. Протеинурия не была подтверждена в 25,0% случаев эклампсии. Выявлены большие различия в тяжести отечного синдрома, характере субъективных симптомов. Наличие всех трех симптомов отмечено только в 58,8% случаев.

Нами поставлена задача разработать критерии объективной достоверной диагностики тяжелых асимптомных форм преэклампсии.

Медико-технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в снижении материнской и перинатальной смертности и заболеваемости за счет своевременного выбора адекватной врачебной тактики, уточнения показаний к прерыванию беременности путем точного выявления тяжелого течения преэклампсии.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для диагностики тяжелой преэклампсии у беременных в плазме крови определяют концентрацию внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе вк ДНК (вк мтДНК) (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе вк ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1. В ядерной ДНК лейкоцитов беременной определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК). При концентрации вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл - диагностируют тяжелую преэклампсию.

Способ осуществляется следующим образом.

Пробы свежевзятой (с антикоагулянтом) периферической крови пациентов центрифугировали при 400g 10 мин, плазму отбирали в сухие пробирки, далее плазму и красные осадки замораживали и хранили при -80°С.

Молекулярно-биологические факторы в крови, приведенные в нашем исследовании:

вк ДНК - концентрация ДНК в плазме крови в нг/мл;

вк рДНК - число копий или повторов рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК;

вк мтДНК - число копий или повторов митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК. По своему строению напоминает плодную ДНК, обладает мощным стимулирующим эффектом, может провоцировать прерывание беременности;

ДНК-аза 1 - фермент, разрушающий ДНК в ед/мл;

геном рДНК (геномная рДНК) - число копий, повторов ядерной лейкоцитарной рибосомальной ДНК в ядерной ДНК;

геном мтДНК (геномная мтДНК) - число копий, повторов ядерной лейкоцитарной митохондриальной ДНК в ядерной ДНК свидетельствует о гибели лейкоцитов;

вк рДНК/геном рДНК - интегративный показатель, свидетельствующий о накоплении рибосомальной ДНК в кровотоке;

вк мтДНК/геном мтДНК - интегративный показатель, свидетельствующий о накоплении митохондриальной ДНК в кровотоке.

Внеклеточную и геномную ДНК выделяли методом экстракции органическими растворителями, соответственно, из плазмы крови, полученной методом центрифугирования цельной крови, и красных осадков (форменных элементов).

Концентрацию геномной ДНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм с учетом светорассеяния (320 нм) в кварцевой кювете при длине хода луча 1 см.

Концентрацию внеклеточной ДНК определяли флуориметрически с использованием интеркалирующего красителя Pico Green (Invitrogen).

Содержание числа копий исследуемого показателя в составе ДНК определяли методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации. Для этого пробы ДНК известной концентрации и набор калибровочных образцов с известным содержанием повторов генома наносили в нескольких повторах на нитроцеллюлозные фильтры, и, после температурной иммобилизации, инкубировали с набором биотинилированных олигонуклеотидных зондов, сигнал визуализировали при помощи коньюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (Merck) и колориметрического субстрата.

Содержание копий рассчитывали по калибровочной зависимости при помощи компьютерного анализа изображений, вычисляя интегральную интенсивность каждого окрашенного пятна.

Нуклеазную активность ДНКазы 1 плазмы крови исследовали при помощи метода радиальной диффузии в агарозном геле.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного медико-технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

У беременной А. была взята венозная кровь в 32 недели гестации. При определении характеристик вкДНК в плазме крови было обнаружено: концентрация вкДНК составила 340 нг/мл, число копий рДНК 638 в составе вкДНК, отношение вк рДНК/геном рДНК - 1,5, число копий мтДНК 180 в составе вкДНК, отношение вк мтДНК/геном мтДНК - 0,44, нуклеазная активность ДНКазы 1-5,4 ед/мл. В течении всей беременности у беременной А. не было симптомов преэклампсии. Она родила в срок девочку (вес 3634 г., рост 52 см). Послеродовый период протекал без осложнений.

Пример 2.

У беременной С. была взята венозная кровь в 36 недель беременности при ее поступлении в больницу. В плазме крови было обнаружено: концентрация вкДНК составила 4890 нг/мл, число копий рДНК в составе вкДНК 1750, отношение вк рДНК/геном рДНК - 5,4, число копий мтДНК в составе вкДНК 2300, отношение вк мтДНК/геном мтДНК - 12,8, нуклеазная активность - ДНКазы 1-18 ед/мл. Диагностировали тяжелую преэклампсию.

В начале родов появились жалобы на головную боль, повышение АД, предсудорожное состояние. Несмотря на проводимое в отделении реанимации соответствующее лечение в течение 2 часов состояние пациентки не улучшилось из-за чего было произведено кесарево сечение. Родился мальчик (вес 2100 гр., рост 47 см). После родов понадобилась соответствующая интенсивная терапия в течение 8 дней.

Пример 3. У беременной В. взята венозная кровь в 39 недель беременности при поступлении в отделение патологии с жалобами на отеки нижних конечностей и повышение артериального давления до 150 мм рт.ст. В плазме крови было обнаружено: концентрация вкДНК составила 580 нг/мл, число копий рДНК 780 в составе вкДНК, отношение вк рДНК/геном рДНК - 1,4, число копий мтДНК 198 в составе вкДНК, отношение вк мтДНК/геном мтДНК - 0,56, нуклеазная активность - ДНКазы 1-8 ед/мл. Состояние пациентки расценено как умеренная преэклампсия. Проведена симптоматическая терапия, выбрана тактика ведения родов через естественные родовые пути с использованием эпидуральной анестезии. Роды прошли без осложнений, родился мальчик весом 3760 гр., длиной 53 см. Послеродовый период протекал гладко. Выписана из роддома на 5 сутки в удовлетворительном состоянии.

Предлагаемый способ был использован при определении тяжелой преэклампсии у 57 беременных. Во всех случаях диагноз тяжелой преэклампсии был подтвержден клинически, в результате выбора врачебной тактики на основе предлагаемого способа материнской смертности не наблюдалось, перинатальной смертности не было, заболеваемость составила 61,4% из-за незрелости легочной ткани ребенка и респираторных проблем.

Использование данного способа диагностики позволит выявлять критическое состояние у беременных с малосимптомной преэклампсией; своевременная диагностика и терапия позволит снизить материнскую и перинатальную заболеваемость и смертность, что имеет большое социальное и народнохозяйственное значение.

Способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных, отличающийся тем, что в плазме крови беременной определяют концентрацию внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1; в ядерной ДНК лейкоцитов определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК) и при вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл - диагностируют тяжелую преэклампсию.