Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 47

Изобретение относится к области биохимии, в частности к грызуну для экспрессии гуманизированного полипептида CD47, к его клетке, ткани и эмбриону, а также к способу получения указанного грызуна. Также раскрыт способ оценки приживления клеток человека с использованием вышеуказанного грызуна. Изобретение также относится к способу оценки терапевтической эффективности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на клетки человека, а также к способу оценки того, индуцирует ли кандидатный модулятор белка CD47 человека агглютинацию эритроцитов. Вышеуказанные способы предусматривают использование грызуна, экспрессирующего гуманизированный полипептид CD47. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать и разрабатывать новые терапевтические средства против рака. 9 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с серийным №62/087992, поданной 5 декабря 2014 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[002] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 96 кБ под названием 32584_10108WO01_SequenceListing.txt, созданный 23 ноября 2015 г. и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Терапию рака можно разделить на четыре основные категории: химио/лучевая терапия, гормональная терапия, направленная терапия и иммунотерапия. Значительное внимание научных исследований и разработок в области медицины сфокусировано на направленной терапии и были достигнуты значительные улучшения, однако рак все еще остается серьезной проблемой для пациентов и для отрасли здравоохранения во всем мире. Эта серьезная проблема частично обусловлена способностью раковых клеток ускользать от механизмов надзора врожденной и адаптивной иммунной системы, что отчасти является результатом ингибирования фагоцитарного клиренса. В настоящее время не существует системы in vivo для оптимального определения терапевтического потенциала новых средств для терапии рака, которые предназначены для активации фагоцитарного клиренса раковых клеток и определения молекулярных аспектов передачи ингибирующих сигналов от раковых клеток к макрофагам и фагоцитарным клеткам. Такая система обеспечивает источник для анализов фагоцитоза и функций макрофагов in vivo и идентификации новых средств для терапии рака, которые нацелены на обеспечение противоопухолевой среды путем стимуляции профагоцитарных сигналов иммунной системы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] Настоящее изобретение охватывает понимание того, что для обеспечения улучшенных систем для идентификации и разработки новых терапевтических средств против рака желательным является получение с помощью генной инженерии животных, отличных от человека. Настоящее изобретение также охватывает понимание того, что для обеспечения улучшенного приживления гемопоэтических стволовых клеток человека желательным является получение с помощью генной инженерии животных, отличных от человека. Кроме того, настоящее изобретение также охватывает понимание того, что животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген CD47 и/или иным образом экспрессирующие, содержащие или продуцирующие человеческий или гуманизированный полипептид CD47, являются желательными, например, для применения при идентификации и разработке терапевтических средств против рака, которые преодолевают системную токсичность, связанную с блокированием CD47, и преодолевают CD47-опосредованное ингибирование фагоцитоза опухолевых клеток и обеспечивают более эффективную систему in vivo для приживления гемопоэтических стволовых клеток человека, что обеспечивает увеличение гомеостаза большего числа типов клеток человека.

[005] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, имеющее геном, содержащий ген CD47, который содержит генетический материал от двух различных видов (например, человека и вида, отличного от человека). В некоторых вариантах осуществления ген CD47 животных, отличных от человека, описанных в данном документе, кодирует полипептид CD47, содержащий человеческую и отличную от человеческой части, где человеческая и отличная от человеческой части соединены вместе и образуют функциональный полипептид CD47.

[006] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению содержит ген CD47, который содержит эндогенную часть и человеческую часть, где эндогенная и человеческая части функционально связаны с эндогенным промотором.

[007] В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть содержит экзон 1 и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47. В некоторых определенных вариантах осуществления экзон 1 и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47 по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичны соответствующему экзону 1 и экзонам ниже экзона 7 гена CD47 мыши, который представлен в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления экзон 1 и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47 идентичны соответствующему экзону 1 и экзонам ниже экзона 7 гена CD47 мыши, который представлен в таблице 3.

[008] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть кодирует аминокислоты 16-292 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть кодирует аминокислоты 19-292 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть кодирует аминокислоты 19-141 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть кодирует аминокислоты 19-127 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека.

[009] В некоторых вариантах осуществления экзоны 2-7 гена CD47 человека по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичны соответствующим экзонам 2-7 гена CD47 человека, который представлен в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления экзоны 2-7 гена CD47 человека идентичны соответствующим экзонам 2-7 гена CD47 человека, который представлен в таблице 3.

[010] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное по настоящему изобретению экспрессирует полипептид CD47, содержащий внеклеточную часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть эндогенного полипептида CD47. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD47 содержит трансмембранную часть полипептида CD47 человека. В других вариантах осуществления полипептид CD47 содержит трансмембранную часть полипептида CD47, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD47 образуется в результате трансляции в клетке животного, отличного от человека, с сигнальным пептидом, отличным от человеческого. В некоторых определенных вариантах осуществления сигнальный пептид, отличный от человеческого, представляет собой сигнальный пептид грызуна (например, мыши или крысы).

[011] В некоторых вариантах осуществления полипептид CD47 по настоящему изобретению экспрессируется из эндогенного гена CD47, отличного от человеческого.

[012] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная часть эндогенного полипептида CD47 содержит внутрицитоплазматический «хвост», имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична внутрицитоплазматическому «хвосту» полипептида CD47 мыши, который представлен в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная часть эндогенного полипептида CD47 содержит внутрицитоплазматический «хвост», который имеет аминокислотную последовательность, идентичную внутрицитоплазматическому «хвосту» полипептида CD47 мыши, который представлен в таблице 3.

[013] В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть полипептида CD47 человека содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-141 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть полипептида CD47 человека содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-127 полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть полипептида CD47 человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична соответствующей аминокислотной последовательности внеклеточной части полипептида CD47 человека, которая представлена в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть полипептида CD47 человека содержит аминокислотную последовательность, идентичную соответствующей аминокислотной последовательности внеклеточной части полипептида CD47 человека, которая представлена в таблице 3.

[014] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает полипептид CD47, кодируемый геном CD47 животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления кодируемый полипептид CD47 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20. В некоторых определенных вариантах осуществления кодируемый полипептид CD47 содержит аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.

[015] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает гуманизированный ген CD47, содержащий один или более экзонов гена CD47, отличного от человеческого, функционально связанных с одним или более экзонами гена CD47 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 по настоящему изобретению содержит экзоны, отличные от человеческих, которые кодируют внутриклеточную часть полипептида CD47, и экзоны человека, которые кодируют внеклеточную часть полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 также содержит экзоны человека, которые кодируют трансмембранную часть полипептида CD47 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 по настоящему изобретению содержит экзоны, отличные от человеческих, которые кодируют полный или неполный сигнальный пептид и внутриклеточную часть полипептида CD47, и экзоны человека, которые кодируют внеклеточную часть и необязательно трансмембранную часть полипептида CD47.

[016] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку или ткань животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку или ткань, содержащую ген CD47, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана из дендритной клетки, лимфоцита (например, В- или Т-клетки), макрофага и моноцита. В некоторых вариантах осуществления ткань выбрана из жировой ткани, ткани мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфатического узла, мышцы, поджелудочной железы, плазмы крови, сыворотки крови, кожи, селезенки, желудка, вилочковой железы, яичка, яйцеклетки и их комбинации.

[017] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, геном которой содержит ген CD47, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена из линии 129, линии C57BL/6 или линии BALB/c. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена из помеси линий 129 и C57BL/6.

[018] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, описанной в данном документе, для получения животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и применяется для получения мыши, содержащей ген CD47, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку крысы и применяется для получения крысы, содержащей ген CD47, описанный в данном документе.

[019] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает эмбрион, отличный от человеческого, содержащий эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, содержащую ген CD47, описанный в данном документе, созданный из нее, полученный из нее или образованный из нее. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион грызуна. В некоторых вариантах осуществления эмбрион грызуна представляет собой эмбрион мыши. В некоторых вариантах осуществления эмбрион грызуна представляет собой эмбрион крысы.

[020] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения животного, отличного от человека, которое экспрессирует полипептид CD47 из эндогенного гена CD47, где полипептид CD47 содержит человеческую последовательность, при этом способ включает вставку геномного фрагмента в эндогенный ген CD47 в эмбриональной стволовой клетке, отличной от человеческой, где указанный геномный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный полипептид CD47 человека; получение эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, содержащей эндогенный ген CD47, который содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный полипептид CD47 человека; и создание животного, отличного от человека, с использованием эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, содержащей указанную нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный полипептид CD47 человека.

[021] В некоторых вариантах осуществления человеческая последовательность содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-141 (или 19-292) полипептида CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческая последовательность содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-127 полипептида CD47 человека.

[022] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более сайтов сайт-специфической рекомбинации.

[023] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию вставки геномного фрагмента в эндогенный ген SIRPα эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, где указанный геномный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный полипептид SIRPα человека (например, кодирует внеклеточную часть полипептида SIRαчеловека). В некоторых определенных вариантах осуществления геномный фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный полипептид SIRPα человека (например, кодирует внеклеточную часть полипептида SIRαчеловека), вставляют в эндогенный ген SIRPα эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, до вставки в эндогенный ген CD47.

[024] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает скрещивание животного, отличного от человека, содержащего эндогенный ген CD47, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полный или неполный полипептид CD47 человека, со вторым животным, отличным от человека, где указанное второе животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий ген SIRPα, кодирующий полипептид SIRPα, содержащий внеклеточную часть полипептида SIRPα человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 полипептида SIRPα человека) и внутриклеточную часть эндогенного полипептида SIRPα.

[025] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения животного, отличного от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, при этом способ включает модификацию генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, за счет чего получают указанное животное, отличное от человека. В некоторых вариантах осуществления ген CD47 кодирует полипептид CD47, который содержит внеклеточную часть и трансмембранную часть полипептида CD47 человека, связанные с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, отличного от человеческого. В других вариантах осуществления ген CD47 кодирует полипептид CD47, который содержит внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с трансмембранной частью и внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, отличного от человеческого.

[026] В некоторых вариантах осуществления модификацию генома животного, отличного от человека, проводят в эмбриональной стволовой клетке, отличной от человеческой. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна; в некоторых вариантах осуществления эмбриональную стволовую клетку мыши; в некоторых вариантах осуществления эмбриональную стволовую клетку крысы.

[027] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает модификацию генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал ген SIRPα, кодирующий внеклеточную часть полипептида SIRP человекаα (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 полипептида SIRP человекаα), связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида SIRPα. В некоторых определенных вариантах осуществления модификацию генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал ген SIRPα, кодирующий внеклеточную часть полипептида SIRPα человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 полипептида 8ШРачеловека), связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида SIRPα, проводят до модификации генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал ген CD47, кодирующий внеклеточную часть и необязательно трансмембранную часть полипептида CD47 человека, связанные с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47.

[028] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает скрещивание животного, отличного от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, со вторым животным, отличным от человека, где указанное второе животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий ген SIRPα, который кодирует полипептид SIRPα, содержащий внеклеточную часть полипептида SIRPα человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 полипептида SIRPα человека) и внутриклеточную часть эндогенного полипептида SIRPα.

[029] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, получаемое с помощью способов, описанных в данном документе.

[030] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ приживления клеток человека у животного, отличного от человека, при этом способ включает стадии получения животного, отличного от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47; и трансплантации одной или более клеток человека указанному животному, отличному от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию анализа приживления одной или более клеток человека у указанного животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления стадия анализа включает сравнение приживления одной или более клеток человека с приживлением у одного или более животных дикого типа, отличных от человека, или у одного или более животных, отличных от человека, геном которых не содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47.

[031] В некоторых вариантах осуществления клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки человека трансплантируют внутривенно. В некоторых вариантах осуществления клетки человека трансплантируют внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления клетки человека трансплантируют подкожно.

[032] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ оценки терапевтической эффективности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на клетки человека, при этом способ включает получение животного, отличного от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47; трансплантацию одной или более клеток человека указанному животному, отличному от человека; введение кандидатного лекарственного средства указанному животному, отличному от человека; и мониторинг клеток человека у животного, отличного от человека, для определения терапевтической эффективности кандидатного лекарственного средства.

[033] В некоторых вариантах осуществления клетки человека представляют собой раковые клетки, а кандидатное лекарственное средство представляет собой противораковое кандидатное лекарственное средство. В некоторых определенных вариантах осуществления кандидатное лекарственное средство представляет собой антитело.

[034] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, дополнительно содержит иммунные клетки человека. В некоторых определенных вариантах осуществления кандидатное лекарственное средство представляет собой биспецифическое антитело, которое связывает CD47 человека и антиген на трансплантированных раковых клетках человека.

[035] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ, включающий получение одной или более клеток, геном которых содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47; инкубирование одной или более клеток с меченым субстратом; и измерение фагоцитоза меченого субстрата одной или более клетками. В некоторых вариантах осуществления субстрат помечен флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах осуществления субстрат помечен с помощью антитела. В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой один или более эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой одну или более бактериальных клеток. В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой одну или более опухолевых клеток.

[036] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ, включающий получение животного, отличного от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47; воздействие антигеном на животное, отличное от человека; и измерение фагоцитоза антигена одной или более клетками животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления стадия воздействия включает воздействие на животное, отличное от человека, антигеном, который помечен флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах осуществления стадия воздействия включает воздействие на животное, отличное от человека, одной или более клетками, которые содержат антиген. В некоторых вариантах осуществления стадия воздействия включает воздействие на животное, отличное от человека, одной или более клетками человека, содержащими антиген, или одной или более бактериальными клетками, содержащими антиген. В некоторых вариантах осуществления стадия воздействия включает воздействие на животное, отличное от человека, одной или более клетками, которые были трансформированы антигеном, таким образом, чтобы антиген экспрессировался на поверхности одной или более трансформированных клеток. В некоторых вариантах осуществления стадия воздействия включает воздействие на животное, отличное от человека, одной или более опухолевыми клетками, которые содержат антиген.

[037] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации или валидации лекарственного средства или вакцины, при этом способ включает стадии доставки лекарственного средства или вакцины животному, отличному от человека, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47, и мониторинга одного или более из иммунных ответов на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления мониторинг профиля безопасности включает определение того, проявляется ли у животного, отличного от человека, побочный эффект или нежелательная реакция в результате доставки лекарственного средства или вакцины. В некоторых вариантах осуществления побочный эффект или нежелательная реакция выбраны из заболеваемости, смертности, изменения массы тела, изменения уровня одного или более ферментов (например, печеночных), изменения массы одного или более органов, потери функции (например, сенсорной, двигательной, функции органов и т.д.), повышенной восприимчивости к одному или более заболеваниям, изменений в геноме животного, отличного от человека, увеличения или уменьшения потребления пищи и осложнений одного или более заболеваний.

[038] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение животного, отличного от человека, описанного в данном документе, в разработке лекарственного средства или вакцины для применения в медицине, такого как применение в качестве лекарственного препарата.

[039] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение животного, отличного от человека, описанного в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения рака или новообразования.

[040] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение животного, отличного от человека, описанного в данном документе, для оценки эффективности терапевтического лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на клетки человека. В различных вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению трансплантируют клетки человека и животному вводят кандидатное лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на указанные клетки человека. В некоторых вариантах осуществления эффективность лекарственного средства определяют путем мониторинга клеток человека у животного, отличного от человека, после введения лекарственного средства.

[041] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, или клетку, отличную от человеческой, описанные в данном документе, для применения при разработке и/или идентификации лекарственного средства (например, антитела) для терапии или диагностики.

[042] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, или клетку, отличную от человеческой, описанные в данном документе, для применения при разработке и/или идентификации лекарственного средства (например, антитела) для лечения, профилактики или улучшения при раке или новообразовании.

[043] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ оценки фармакокинетики лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47 человека, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства животному, отличному от человека, описанному в данном документе, и проведения анализа для определения одного или более фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленного воздействующего на CD47 человека.

|044] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ оценки целевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47 человека, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства животному, отличному от человека, описанному в данном документе, и проведения анализа одного или более параметров, ассоциированных с целевой токсичностью лекарственного средства.

[045] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ оценки нецелевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47 человека, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства животному, отличному от человека, описанному в данном документе, и проведения анализа одного или более параметров, ассоциированных с нецелевой токсичностью лекарственного средства.

[046] Во многих вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, представляет собой грызуна, геном которого содержит ген CD47, кодирующий внеклеточную часть полипептида CD47 человека, связанную с внутриклеточной частью эндогенного полипептида CD47; в некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь; в некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой крысу.

[047] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на CD47 человека, представляет собой антагонист CD47. В некоторых определенных вариантах осуществления антагонист CD47 представляет собой антитело к CD47. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на CD47 человека, представляет собой агонист CD47.

[048] В различных вариантах осуществления ген CD47 по настоящему изобретению включает в себя ген CD47, описанный в данном документе. В различных вариантах осуществления полипептид CD47 по настоящему изобретению включает в себя полипептид CD47, описанный в данном документе.

[049] В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией эндогенного полноразмерного полипептида CD47, отличного от человеческого. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией внеклеточной части эндогенного полипептида CD47. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией внеклеточной части как эндогенного полипептида CD47, так и эндогенного полипептида SIRPα.

[050] В различных вариантах осуществления внеклеточная часть полипептида CD47 человека содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-141 полипептида CD47 человека, описанного в данном документе.

[051] В различных вариантах осуществления N-концевой иммуноглобулиновый V-домен полипептида CD47 человека содержит аминокислоты, соответствующие остаткам 19-127 полипептида CD47 человека, описанного в данном документе.

[052] В различных вариантах осуществления отличные от человека животные, отличные от человеческих клетки, ткани, эмбриональные стволовые клетки и/или эмбрионы по настоящему изобретению имеют геном, который дополнительно содержит ген SIRPα, который кодирует полипептид SIRPα, содержащий внеклеточную часть полипептида SIRPα человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 полипептида SIRPα человека) и внутриклеточную часть эндогенного полипептида SIRPα.

[053] В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна; в некоторых вариантах осуществления мышь; в некоторых вариантах осуществления крысу.

[054] Используемые в данной заявке термины «приблизительно» и «примерно» используются в качестве эквивалентов. Предполагается, что все числа, используемые в данной заявке, вместе с термином «приблизительно/примерно» или без него охватывают любые нормальные отклонения, понятные специалисту в соответствующей области.

[055] Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего подробного описания. Следует, однако, понимать, что подробное описание, хоть и указывает на варианты осуществления настоящего изобретения, приведено только в целях иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[056] Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации заявки на патент с цветным(цветными) графическим(графическими) материалом(материалами) будут предоставлены Ведомством после запроса и уплаты необходимой пошлины.

[057] Графические материалы, включенные в данный документ, которые содержат следующие фигуры, приведены только в иллюстративных целях, а не для ограничения.

[058] На фигуре 1 показана схема геномной организации отличного от человеческого (например, мышиного) и человеческого генов кластера дифференцировки 47 (CD47) без соблюдения масштаба. Экзоны пронумерованы под каждым экзоном.

[059] На фигуре 2 показана схема иллюстративного способа гуманизации гена кластера дифференцировки 47 (CD47), отличного от человеческого, без соблюдения масштаба.

[060] На фигуре 3 показана схема геномной организации генов кластера дифференцировки 47 (CD47) мыши и человека без соблюдения масштаба. Указаны местоположения зондов, использованных в анализе, описанном в примере 1.

[061] На фигуре 4 показана иллюстративная гистограмма экспрессии CD47 в эритроцитах мышей с гуманизированным CD47, выявленной с помощью антител к CD47. Ab А, Ab В, Ab С, Ab D и Ab Е: антитела к CD47; hIgG4s: IgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией; hIgG4: антитело IgG4 человека с несоответствующей специфичностью.

[062] На фигуре 5 показана иллюстративная гемагглютинация эритроцитов мыши от мышей дикого типа (n=2) и с гуманизированным CD47 (n=2) антителами к CD47. WT: дикого типа; HuCD47: гуманизированный CD47; Ab А, Ab В, Ab С, Ab D и Ab Е: антитела к CD47; hIgG4s: IgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией; hIgG4: антитело IgG4 человека с несоответствующей специфичностью.

[063] На фигуре 6 показаны иллюстративные фармакокинетические профили антител к CD47 у мышей с гуманизированным CD47, представленные как концентрация антитела (в μг/мл, по оси у) во времени (в днях, по оси х); Ab F, Ab G, Ab Н и Ab I: антитела к CD47; hIgG4s: антитело lgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией.

[064] На фигуре 7 показаны иллюстративные фармакокинетические профили антител к CD47 у мышей с гуманизированным CD47/SIRPα (CD47^hu/huSIRPα^hu/hu), представленные как концентрация антитела (в мкг/мл, по оси у) во времени (в днях, по оси х). Ab J, Ab F, Ab G и Ab I: антитела к CD47; hIgG4s: антитело IgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией.

[065] На фигуре 8 показаны иллюстративные фармакокинетические профили антител к CD47 у мышей с гуманизированным CD47/SIRPα (CD47^hu/huSIRPα^hu/hu), представленные как концентрация антитела (в мкг/мл, по оси у) во времени (в днях, по оси х). Ab J, Ab F: антитела к CD47; Ab Fs: Ab F с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией; Ab Fmono: моновалентный вариант Ab F; hIgG4s: антитело IgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией.

[066] На фигуре 9 показаны иллюстративные фармакокинетические профили антител к CD47 у мышей дикого типа, представленные как концентрация антитела (в мкг/мл, по оси у) во времени (в днях, по оси х). Мышей, демонстрирующих мышиный против человеческого гуморальный иммунный ответ (МАНА), исключали. Ab J, Ab F, Ab I и Ab G: антитела к CD47; hIgG4s: антитело IgG4 человека с несоответствующей специфичностью с модифицированной Fc-областью, которая обладает пониженной эффекторной функцией (звездочка: все точки через 15 дней исключали из группы с обработкой hIgG4s вследствие МАНА); Ab J F(ab')₂: F(ab')₂-фрагмент Ab J.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[067] Настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и условиями эксперимента, описанными в данном документе, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

[068] Если не определено иное, все термины и фразы, используемые в данном документе, имеют значения, которые данные термины и фразы приобрели в данной области, если в контексте, в котором используется термин или фраза, четко не указано или четко не видно противоположное. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны только конкретные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки.

[069] Термин «примерно», применяемый в данном документе в отношении одного или более значений, представляющих интерес, относится к значению, сходному с указанным эталонным значением. В некоторых вариантах осуществления термин «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону значений, находящихся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любую сторону (большую или меньшую) от указанного эталонного значения, если иное не указано или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, в которых такое число будет превышать 100% от возможного значения).

[070] Термин «биологически активный», используемый в данном документе, относится к характеристике любого средства, обладающего активностью в биологической системе in vitro или in vivo (например, в организме). Например, средство, которое в случае присутствия в организме обладает биологическим эффектом в этом организме, считается биологически активным. В конкретных вариантах осуществления, в которых белок или полипептид является биологически активным, часть этого белка или полипептида, обладающая по меньшей мере одним общим с данным белком или полипептидом видом биологической активности, обычно называется «биологически активной» частью.

[071] Термин «сравнимый», используемый в данном документе, относится к двум или более средствам, объектам, положениям, наборам условий и т.д., которые могут не быть идентичными друг другу, но которые являются достаточно сходными для обеспечения возможности сравнения между ними, так что на основании наблюдаемых различий или сходств можно сделать разумные выводы. Среднему специалисту в данной области будет понятно по контексту, какая степень идентичности необходима в любых заданных обстоятельствах для двух или более таких средств, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д., чтобы считать их сравнимыми.

[072] Термин «консервативный», используемый в данном документе для описания консервативной аминокислотной замены, относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена практически не будет изменять функциональные свойства белка, представляющие интерес, например, способность рецептора связываться с лигандом. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: алифатические боковые цепи, такие как у глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; алифатические боковые цепи с гидроксильными группами, такие как у серина и треонина; амидосодержащие боковые цепи, такие как у аспарагина и глутамина; ароматические боковые цепи, такие как у фенилаланина, тирозина и триптофана; основные боковые цепи, такие как у лизина, аргинина и гистидина; кислые боковые цепи, такие как у аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и серосодержащие боковые цепи, такие как у цистеина и метионина. Группы консервативных аминокислотных замен включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке аланином, применяемую, например, в аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления проводят консервативную замену, которая имеет положительное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, включенной в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, где замена имеет неотрицательное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250.

[073] Термин «контроль», используемый в данном документе, относится к понятному в данной области значению «контроля», подразумевающему стандарт, с которым сравнивают результаты. Как правило, контроли применяют для повышения целостности в экспериментах путем разделения переменных для того, чтобы сделать вывод об этих переменных. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, проводимые одновременно с тестовыми реакцией или анализом для обеспечения объекта сравнения. Как используется в данном документе, «контроль» может относиться к «контрольному животному». «Контрольное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). В одном эксперименте применяют «тест» (т.е. тестируемую переменную). Во втором, «контрольном», эксперименте тестируемую переменную не применяют. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. тест или анализ, проведенный ранее, или количество или результат, известные заранее). В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой или включает напечатанную или иным образом сохраненную запись. Контроль может представлять собой положительный контроль или отрицательный контроль.

[074] Термин «разрушение», используемый в данном документе, относится к результату события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к вставке, делеции, замене, замещению, миссенс-мутации или сдвигу рамки считывания в последовательности(последовательностях) ДНК или любой их комбинации или может быть представлено таковыми. Вставки могут включать вставку целых генов или фрагментов генов, например, экзонов, которые могут иметь происхождение, отличное от такого происхождения для эндогенной последовательности (например, гетерологичной последовательности). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к повышению экспрессии и/или активности гена или продукта гена (например, белка, кодируемого геном). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к снижению экспрессии и/или активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению последовательности гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к усечению или фрагментации гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к удлинению гена или кодируемого продукта гена; в некоторых таких вариантах осуществления разрушение может приводить к сборке белка слияния. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению уровня экспрессии, но не активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению активности, но не уровня экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект на уровень экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект на активность гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект ни на уровень экспрессии, ни на активность гена или продукта гена.

[075] Термины «определение», «измерение», «установление», «оценка», «анализ» и «анализирование» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения любой формы измерения и включают определения присутствия или отсутствия элемента. Эти термины включают количественные, а также и/или качественные определения. Анализ может быть относительным или абсолютным. «Анализ на наличие» может представлять собой определение количества чего-либо присутствующего и/или определение того, присутствует или отсутствует ли оно.

[076] Фраза «эндогенный локус» или «эндогенный ген», используемая в данном документе, относится к генетическому локусу, находящемуся в родительском или эталонном организме до введения разрушения, делеции, замещения, изменения или модификации, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживаемую в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм, полученный с помощью генной инженерии. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм, выведенный в лаборатории (дикого типа либо полученный с помощью генной инженерии).

[077] Фраза «эндогенный промотор» относится к промотору, связанному в естественных условиях, например, в организме дикого типа, с эндогенным геном.

[078] Термин «гетерологичный», используемый в данном документе, относится к средству или объекту из другого источника. Например, при использовании по отношению к полипептиду, гену или продукту гена, присутствующему в конкретной клетке или организме, данный термин поясняет, что соответствующий полипептид, ген или продукт гена: 1) был сконструирован человеком; 2) был введен в клетку или организм (или их предшественник) руками человека (например, посредством генной инженерии) и/или 3) в естественных условиях не продуцируется соответствующими клеткой или организмом (например, соответствующим типом клетки или типом организма) или не присутствует в них.

[079] Термин «клетка-хозяин», используемый в данном документе, относится к клетке, в которую были введены гетерологичные (например, экзогенные) нуклеиновая кислота или белок. Специалистам в данной области при прочтении данного раскрытия будет понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но также используются для обозначения потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях вследствие влияния мутаций или окружающей среды могут происходить определенные модификации, такое потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но по-прежнему включается в объем термина «клетка-хозяин», используемого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или включает прокариотическую или эукариотическую клетку. Как правило, клетка-хозяин представляет собой любую клетку, подходящую для приема и/или продуцирования гетерологичных нуклеиновой кислоты или белка, независимо от того, к какому царству живой природы относится клетка. Иллюстративные клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточных или многоклеточных), бактериальные клетки (например, штаммы Е. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, клетки дрожжей (например, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, клетки насекомых, зараженные бакуловирусами, Trichoplusia ni и т.д.), клетки животных, отличных от человека, клетки человека или продукты слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатки, Vero, CV1, клетки почки (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, ВНК), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60 (например, BHK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальной), CV-1, U937, 3T3, L-клетки, клетки С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетки Сертоли, клетки BRL 3А, клетки НТ1080, клетки миеломы, опухолевой клетки и линии клеток, происходящей из вышеупомянутых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например, клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6™). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или включает выделенную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть ткани. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть организма.

[080] Термин «гуманизированный» используется в данном документе в соответствии с понятным в данной области значением и относится к нуклеиновым кислотам или белкам, структуры (т.е. нуклеотидные или аминокислотные последовательности) которых содержат части, практически соответствующие или идентичные структурам конкретного гена или белка, обнаруживаемого в природе у животного, отличного от человека, а также включают части, отличающиеся от обнаруживаемых в соответствующем конкретном гене или белке, отличном от человеческого, и вместо этого более близко соответствующие сравнимым структурам, обнаруживаемым в соответствующем гене или белке человека. В некоторых вариантах осуществления «гуманизированный» ген представляет собой ген, который кодирует полипептид, имеющий практически такую же аминокислотную последовательность, как у полипептида человека (например, у белка человека или его части - например, у его характерной части). В виде лишь одного примера, в случае мембранного рецептора «гуманизированный» ген может кодировать полипептид, имеющий внеклеточную часть, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как у человеческой внеклеточной части, и такую же остальную часть последовательности, как у полипептида, отличного от человеческого (например, мышиного). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит по меньшей мере часть последовательности ДНК гена человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит всю последовательность ДНК гена человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит последовательность, имеющую часть, представленную в белке человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит всю последовательность белка человека и экспрессируется с эндогенного локуса животного, отличного от человека, который соответствует гомологу или ортологу гена человека.

[081] Термин «идентичность», используемый в данном документе применительно к сравнению последовательностей, относится к идентичности, определяемой с помощью ряда различных алгоритмов, известных из уровня техники, которые можно применять для измерения идентичности нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления значения идентичности, описанные в данном документе, определяют с применением выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленного), в котором используются штраф за открытие гэпа 10,0, штраф за продление гэпа 0,1, а также с применением матрицы подобия Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008).

[082] Термин «выделенный», используемый в данном документе, относится к веществу и/или объекту, которые были (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми они были связаны при первоначальном продуцировании (будь то в природе и/или в условиях проведения эксперимента), и/или (2) разработаны, продуцированы, получены и/или произведены руками человека. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются чистыми на приблизительно 80%, на приблизительно 85%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99% или более чем на приблизительно 99%. Как используется в данном документе, вещество является «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, что будет понятно специалистам в данной области, вещество может по-прежнему считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с определенными другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или наполнителей (например, с буфером, растворителем, водой и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или наполнителей. В виде лишь одного примера, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, встречающийся в природе, считается «выделенным», если: а) он ввиду своего происхождения или источника получения не связан с некоторыми или всеми компонентами, сопровождающими его в его нативном состоянии в природе; b) он практически не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от вида, который продуцирует их в природе; или с) он экспрессируется или иным образом связан с компонентами в клетке или другой системе экспрессии, не принадлежащей к виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, синтезируемый химическим путем или синтезируемый в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считается «выделенным» полипептидом. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одной или более методикам очистки, может считаться «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов: а) с которыми он связан в природе и/или b) с которыми он был связан при первоначальном продуцировании.

[083] Фраза «животное, отличное от человека», используемая в данном документе, относится к любому позвоночному организму, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой круглоротое, костную рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), земноводное, пресмыкающееся, млекопитающее или птицу. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, отличное от человека, представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[084] Фраза «нуклеиновая кислота», используемая в данном документе в своем самом широком смысле, относится к любому соединению и/или веществу, включенному или которое может быть включенным в состав олигонуклеотидной цепи. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, включенное или которое может быть включенным в состав олигонуклеотидной цепи с помощью фосфодиэфирной связи. Как будет очевидно из контекста, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам); в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» относится к олигонуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит PHK; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более остатков природной нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем, что в нем не используется фосфодиэфирный остов. Например, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой одну или более «пептидных нуклеиновых кислот», которые известны из уровня техники и имеют в остове пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей, содержит их или состоит из них, и они считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или более фосфотиоатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей вместо фосфодиэфирных связей. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более природных нуклеозидов (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-йодуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин, 2-тиоцитидин, метилированные основания, интеркалированные основания и их комбинации), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» содержит один или более модифицированных сахарных остатков (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с таковыми сахарными остатками в природных нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональный продукт гена, такой как PHK или белок. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» предусматривает один или более интронов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновую кислоту» получают посредством одного или более из выделения из природного источника, ферментативного синтеза путем полимеризации на основе комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), воспроизводства в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет длину по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является однонитевой; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является двухнитевой. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид, или являющуюся комплементарной по отношению к последовательности, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.

[085] Фраза «функционально связанный», используемая в данном документе, относится к контактному положению, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Контролирующая последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с функционированием контролирующих последовательностей. «Функционально связанные» последовательности включают в себя как последовательности, контролирующие экспрессию, смежные с геном, представляющим интерес, так и последовательности, контролирующие экспрессию, действующие в транс-положении или на некотором расстоянии, осуществляя контроль над геном, представляющим интерес. Термин «последовательность, контролирующая экспрессию», используемый в данном документе, относится к полинуклеотидным последовательностям, необходимым для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. «Последовательности, контролирующие экспрессию» включают: соответствующие последовательности для инициации и терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга PHK, такие как сигналы для сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козак); последовательности, повышающие стабильность белка; и, при необходимости, последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контролирующие последовательности обычно включают в себя промотор, сайт связывания рибосом и последовательность для терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие контролирующие последовательности обычно включают в себя промоторы и последовательность для терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» подразумевает включение компонентов, наличие которых является существенным для экспрессии и процессинга, и также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности-партнеры по слиянию.

[086] Термин «полипептид», используемый в данном документе, относится к любой полимерной цепи из аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит части, встречающиеся в природе отдельно друг от друга (т.е. из двух или более различных организмов, например, человеческую и отличную от человеческой части). В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая является сконструированной в том смысле, что она разработана и/или получена в результате действий человека.

[087] Термин «рекомбинантный», используемый в данном документе, предназначен для обозначения полипептидов (например, полипептидов CD47, описанных в данном документе), разрабатываемых, конструируемых, получаемых, экспрессируемых, создаваемых или выделяемых с помощью рекомбинантных способов, таких как полипептиды, экспрессируемые с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, вводимого путем трансфекции в клетку-хозяина, полипептиды, выделяемые из комбинаторной библиотеки рекомбинантных полипептидов человека (Hoogenboom Н.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy Н., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), антитела, выделяемые из животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158), или полипептиды, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые любыми другими способами, предусматривающими соединение выбранных элементов последовательностей друг с другом. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей обнаруживаются в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей разрабатывают in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей получают в результате мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид содержит последовательности, обнаруживаемые в геноме организма-источника, представляющего интерес (например, человека, мыши и т.д.). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид имеет аминокислотную последовательность, полученную в результате мутагенеза (например, in vitro или in vivo, например, у животного, отличного от человека), так что аминокислотные последовательности рекомбинантных полипептидов представляют собой последовательности, которые хоть и происходят из последовательностей полипептидов и являются родственными им, но в естественных условиях могут не существовать в геноме животного, отличного от человека, in vivo.

[088J Термин «замещение», используемый в данном документе, относится к процессу, посредством которого «замещаемая» последовательность нуклеиновой кислоты (например, ген), обнаруживаемая в локусе хозяина (например, в геноме), удаляется из этого локуса, а другая, «замещающая», нуклеиновая кислота располагается на ее месте. В некоторых вариантах осуществления последовательность замещаемой нуклеиновой кислоты и последовательности замещаемых нуклеиновых кислот сравнимы друг с другом в том, например, что они являются гомологичными друг другу и/или содержат соответствующие элементы (например, элементы, кодирующие белок, регуляторные элементы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления замещаемая последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя одно или более из промотора, энхансера, донорного сайта сплайсинга, акцепторного сайта сплайсинга, интрона, экзона, нетранслируемой области (UTR); в некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя одну или более кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой гомолог замещаемой последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты является ортологом замещаемой последовательности. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека. В некоторых вариантах осуществления, в том числе в тех, в которых замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность нуклеиновой кислоты человека, замещаемая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность от грызуна (например, мышиную или крысиную последовательность). Последовательность нуклеиновой кислоты, расположенная таким образом, может включать в себя одну или более регуляторных последовательностей, которые являются частью исходной последовательности нуклеиновой кислоты, применяемой для получения последовательности, расположенной таким образом (например, промоторы, эихансеры, 5'- или 3'-концевые нетранслируемые области и т.д.). Например, в различных вариантах осуществления замещение представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, что приводит к продуцированию продукта гена на последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной таким образом (содержащей гетерологичную последовательность), но не к экспрессии эндогенной последовательности; эндогенная геномная последовательность замещается последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, имеющий функцию, сходную с таковой у белка, кодируемого эндогенной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует белок CD47, а фрагмент ДНК кодирует один или более белков CD47 человека). В различных вариантах осуществления эндогенный ген или его фрагмент замещают соответствующим геном человека или его фрагментом. Соответствующий ген человека или его фрагмент представляет собой ген человека или его фрагмент, который является ортологом замещаемого эндогенного гена или его фрагмента или практически сходным или одинаковым с ним по структуре и/или функции.

[089] Фраза «белок кластера дифференцировки 47» или «белок CD47», используемая в данном документе, относится к многопроходному трансмембранному белку, который принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и имеет внеклеточный аминоконцевой иммуноглобулиновый V-домен, пять трансмембранных доменов и короткий карбоксиконцевой внутриклеточный «хвост». CD47 экспрессируется на клеточной поверхности и участвует во взаимодействии между белками поверхности мембраны, такими как, например, интегрины, SIRPα и тромбоспондин-1 (TSP-1). CD47 экспрессируется в нормальных тканях и активируется при многих формах рака человека. Было показано, что CD47 участвует в некоторых клеточных процессах, таких как, например, апоптоз, пролиферация, адгезия и миграция. Несколько альтернативно сплайсированных изоформ CD47 были идентифицированы между мышью и человеком. В качестве иллюстрации, нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов CD47 мыши и человека приведены в таблице 3. Специалистам в данной области при прочтении данного описания будет понятно, что один или более эндогенных генов CD47 в геноме (или их все) можно заместить одним или более гетерологичными генами CD47 (например, полиморфными вариантами, подтипами или мутантными формами, генами из других видов, гуманизированными формами и т.д.).

|090] Выражение «клетка, экспрессирующая CD47», используемое в данном документе, относится к клетке, которая экспрессирует трансмембранный белок CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CD47, экспрессирует трансмембранный белок CD47 на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления белок CD47 экспрессируется на поверхности клетки в количестве, достаточном для опосредования межклеточных взаимодействий через трансмембранный белок CD47, экспрессируемый на поверхности клетки. Иллюстративные клетки, экспрессирующие CD47, включают нейроны, иммунные клетки, кератиноциты и циркулирующие клетки. Клетки, экспрессирующие CD47, регулируют взаимодействие иммунных клеток и циркулирующих клеток для регуляции различных клеточных процессов, таких как адгезия, клеточная пролиферация и/или апоптоз, ангиогенез и воспаление. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению демонстрируют регуляцию различных клеточных процессов (описанных в данном документе) с помощью гуманизированных белков CD47, экспрессируемых на поверхности одной или более клеток животного, отличного от человека.

[091] Термин «эталон» используется в данном документе для описания стандартного или контрольного средства, группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, с которыми сравнивают средство, животное, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение, представляющие интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение тестируют и/или определяют практически одновременно с тестированием или определением средства, группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющих интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, группа, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение представляют собой исторический эталон, необязательно воплощенный в материальной форме. В некоторых вариантах осуществления эталон может относиться к контролю. Используемый в данном документе, термин «эталон» может относиться к «эталонному животному». «Эталонное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). Как будет понятно специалисту в данной области, эталонные средство, животное, группу, индивидуум, популяцию, образец, последовательность или значение обычно определяют или характеризуют в условиях, сравнимых с условиями, используемыми для определения или получения характеристик средства, животного (например, млекопитающего), группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющих интерес.

[092] Термин «практически», используемое в данном документе, относится к качественному состоянию проявления полной или почти полной меры или степени выраженности характеристики или свойства, представляющих интерес. Специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если это вообще происходит, продолжаются до окончания и/или протекают до завершения или достижения или избегания абсолютного результата. Таким образом, термин «практически» используется в данном документе для охвата потенциального отсутствия завершенности, присущего многим биологическим и химическим явлениям.

[093] Фраза «практически гомологичный», используемая в данном документе, относится к сравнению между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалисту в данной области, две последовательности обычно считаются «практически гомологичными», если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут являться идентичными остатками. В качестве альтернативы, гомологичные остатки могут являться неидентичными остатками с соответствующими сходными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как хорошо известно специалистам в данной области, определенные аминокислоты обычно классифицируют как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или как имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замена одной аминокислоты другой того же типа часто может считаться «гомологичной» заменой. Типичные виды распределения аминокислот по категориям обобщены в таблицах 1 и 2.

[094] Как хорошо известно из уровня техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот можно сравнивать с помощью любого из разнообразных алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410; Altschul et al. (1997) Methods in Enzymology; Altschul et al., «Gapped BLAST and PS1-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; и Misener et al. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. В дополнение к идентификации гомологичных последовательностей, программы, упомянутые выше, обычно выдают показатель степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически гомологичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются гомологичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит смежные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит прерывисто расположенные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[095] Фраза «практически идентичный», используемая в данном документе, относится к сравнению между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалисту в данной области, две последовательности обычно считаются «практически идентичными», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно из уровня техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот можно сравнивать с помощью любого из разнообразных алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol Biol, 215(3): 403-410; Altschul et al, Methods in Enzymology; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; и Misener et al, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. В дополнение к идентифицированию идентичных последовательностей, программы, упомянутые выше, обычно выдают показатель степени идентичности. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически идентичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются идентичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[096] Фраза «целенаправленно воздействующий вектор» или «целенаправленно воздействующая конструкция», используемая в данном документе, относится к молекуле полинуклеотида, содержащей область для целенаправленного воздействия. Область для направленного воздействия содержит последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности в целевых клетке, ткани или животном, и обеспечивает интеграцию целенаправленно воздействующей конструкции в положение в геноме клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Также включены области для целенаправленного воздействия, на которые целенаправленно воздействуют с помощью сайтов для распознавания сайт-специфической рекомбиназы (например, сайтов loxP или Frt). В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты или ген, представляющие особенный интерес, селективный маркер, контрольные и/или регуляторные последовательности, а также другие последовательности нуклеиновых кислот, обеспечивающие возможность рекомбинации, опосредованной добавлением экзогенных белков, которые способствуют или содействуют рекомбинации с участием таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит полный или неполный ген, представляющий интерес, где ген, представляющий интерес, представляет собой гетерологичный ген, который кодирует полный или неполный белок, имеющий функцию, сходную с таковой у белка, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит гуманизированный полный или неполный ген, представляющий интерес, где гуманизированный ген, представляющий интерес, кодирует полный или неполный белок, имеющий функцию, сходную с таковой функцией у белка, кодируемого эндогенной последовательностью.

[097] Термин «вариант», используемый в данном документе, относится к объекту, демонстрирующему значительную структурную идентичность с эталонным объектом, но структурно отличающемуся от эталонного объекта по наличию или уровню одного или более химических фрагментов по сравнению с эталонным объектом. Во многих вариантах осуществления «вариант» также отличается функционально от своего эталонного объекта. Как правило, то, уместно ли считать конкретный объект «вариантом» эталонного объекта, зависит от степени его структурной идентичности с эталонным объектом. Как будет понятно специалистам в данной области, любой биологический или химический эталонный объект имеет определенные характерные структурные элементы. «Вариант» по определению представляет собой отличающийся химический объект, имеющий один или более общих таких характерных структурных элементов. В виде лишь нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный сердцевинный структурный элемент (например, макроциклическую сердцевину) и/или один или более характерных «подвешенных» фрагментов, так что вариант малой молекулы имеет общие с ней сердцевинный структурный элемент и характерные «подвешенные» фрагменты, но отличается по другим «подвешенным» фрагментам и/или по типам связей (одинарные по сравнению с двойными, Е по сравнению с Z и т.д.), присутствующих в сердцевине, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество аминокислот, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве и/или способствующих осуществлению конкретной биологической функции, нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве. Например, «вариант полипептида» может отличаться от эталонного полипептида вследствие одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), прикрепленных ковалентной связью к полипептидному остову. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не имеет по меньшей мере один характерный элемент последовательности, общий с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» обладает одним или более видами биологической активности, общими с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не обладает одним или более видами биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует пониженный уровень одного или более видов биологической активности по сравнению с эталонным полипептидом. Во многих вариантах осуществления полипептид, представляющий интерес, считается «вариантом» исходного или эталонного полипептида, если полипептид, представляющий интерес, имеет аминокислотную последовательность, идентичную такой последовательности у исходной молекулы, за исключением небольшого количества изменений в конкретных положениях в последовательности. У варианта обычно заменены менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков по сравнению с исходной молекулой. В некоторых вариантах осуществления «вариант» имеет 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замененный остаток по сравнению с исходной молекулой. «Вариант» часто имеет очень небольшое количество (например, менее 5, 4, 3, 2 или 1) замененных функциональных остатков (т.е. остатков, принимающих участие в конкретном виде биологической активности). Кроме того, «вариант» обычно имеет не более 5, 4, 3, 2 или 1 добавления или делеции и часто не имеет добавлений или делеций по сравнению с исходной молекулой. Более того, любые добавления или делеции обычно охватывают менее приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6 и зачастую охватывают менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 остатков. В некоторых вариантах осуществления исходный или эталонный полипептид обнаруживается в природе. Как будет понятно специалистам в данной области, множество вариантов конкретного полипептида, представляющего интерес, можно зачастую обнаружить в природе, особенно если полипептид, представляющий интерес, представляет собой возбудитель инфекции в виде полипептида.

[098] Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую 1 гуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, называются в данном документе «векторами экспрессии».

[099] Термин «дикий тип», используемый в данном документе, имеет понятное в данной области значение, которое относится к объекту, обладающему структурой и/или активностью, обнаруживаемой в природе в «нормальном» (в противоположность мутантному, болезненному, измененному и т.д.) состоянии или окружении. Специалистам в данной области будет понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0100] Настоящее изобретение обеспечивает, среди прочего, улучшенных и/или сконструированных животных, отличных от человека, имеющих гуманизированный генетический материал, кодирующий ген кластера дифференциации 47 (CD47), для определения терапевтической эффективности антагонистов CD47 (например, антитела к CD47) для лечение рака и анализов при приживлении трансплантата, активации и фагоцитозе и сигнальной трансдукции. Предполагается, что такие животные, отличные от человека, обеспечивают улучшение определения терапевтической эффективности антагонистов CD47 и их потенциала в блокировании CD47. Также предполагается, что такие животные, отличные от человека, обеспечивают улучшение приживления трансплантированных клеток человека. Таким образом, настоящее изобретение особенно применимо для разработки методов терапии с применением антител к CD47 для лечения различных видов рака, а также для поддержания гемопоэтических клеток человека у животных, отличных от человека. В частности, настоящее изобретение охватывает гуманизацию гена CD47 мыши, приводящую к экспрессии гуманизированного белка CD47 на поверхности клеток животного, отличного от человека. Такие гуманизированные белки CD47 обладают способностью обеспечивать источник клеток человека CD47⁺ для определения эффективности терапевтических средств, направленных против CD47, для активации фагоцитоза опухолевых клеток. Кроме того, такие гуманизированные белки CD47 обладают способностью распознавать приживленные клетки человека через взаимодействие других белков клеточной поверхности и лигандов, присутствующих на поверхности приживленных клеток человека (например, SIRPα). В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению способны к активации фагоцитоза посредством блокирования передачи сигналов, опосредованной CD47, с помощью гуманизированного белка CD47, экспрессируемого на поверхности клеток животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению способны принимать трансплантированные гемопоэтические клетки человека; в некоторых вариантах осуществления такие млекопитающие, отличные от человека, развивают и/или имеют иммунную систему, включающую в себя клетки человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки CD47 имеют последовательность, соответствующую N-концевому иммуноглобулиновому V-домену белка CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки CD47 имеют последовательность, соответствующую N-концевой части белка CD47 человека, которая содержит внеклеточную часть и трансмембранную часть белка CD47 человека, где внеклеточная часть содержит N-концевой иммуноглобулиновый V-домен белка CD47 человека и трансмембранная часть содержит пять трансмембранных доменов белка CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки CD47 имеют последовательность, соответствующую внутрицитоплазматическому «хвосту» белка CD47, отличного от человеческого (например, мышиного). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки CD47 имеют последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 19-292 (или 19-141, или 19-127) белка CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат эндогенный ген CD47, который содержит генетический материал от животного, отличного от человека, и гетерологичного вида (например, человека). В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат гуманизированный ген CD47, где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны гена CD47 человека, которые кодируют внеклеточную часть, включая N-концевой иммуноглобулиновый V-домен гена CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 содержит экзоны CD47 человека, например, экзоны 2-7, кодирующие N-концевую часть белка CD47 человека, которая содержит внеклеточную часть и трансмембранную часть белка CD47 человека, где внеклеточная часть содержит N-концевой иммуноглобулиновый V-домен белка CD47 человека и трансмембранная часть содержит пять трансмембранных доменов белка CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 содержит экзоны CD47, отличного от человеческого, которые кодируют полный или неполный сигнальный пептид и внутрицитоплазматический «хвост» белка CD47, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 содержит экзон 1 из CD47, отличного от человеческого, и экзон(экзоны) ниже экзона 7, которые кодируют внутрицитоплазматический «хвост» и 3' UTR. В зависимости от изоформ, может быть один или более экзонов ниже экзона 7, при этом стоп-кодон и 3' UTR присутствуют в последнем экзоне для всех изоформ. Например, изоформа 2 CD47 как мыши, так и человека, показанная в таблице 3, имеет два экзона ниже экзона 7, обозначенные как экзон 8 и 9.

[0101] Различные аспекты настоящего изобретения подробно описаны в следующих разделах. Использование разделов не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел можно применять к любому аспекту настоящего изобретения. В настоящей заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное.

Ген кластера дифференцировки 47 (CD47)

[0102] CD47, первоначально названный интегрин-ассоциированным белком (IAP) за его роль в сигнальной трансдукции от интегринов на иммунных клетках, представляет собой трансмембранный белок, который содержит N-концевой иммуноглобулиновый V-домен (IgV), пять трансмембранных доменов и короткий С-концевой внутрицитоплазматический «хвост». Внутрицитоплазматический «хвост» различается по длине в соответствии с четырьмя альтернативно сплайсированными изоформами, которые были идентифицированы. Первоначально было описано, что CD47 (или IAP) экспрессируется на всех тканях (изоформа 2), нейронах (изоформа 4) и кератиноцитах и макрофагах (изоформа 1; см. Reinhold et al. (1995) J. Cell Sci. 108:3419-3425). Мало что известно об изоформе 3, несмотря на то, что эта форма имеет второй самый длинный внутрицитоплазматический «хвост» среди четырех изоформ. В дополнение к интегринам известно, что CD47 взаимодействует с несколькими другими белками клеточной поверхности, такими как, например, тромбоспондин и члены семейства SIRP. В первую очередь, CD47 взаимодействует с SIRPα и приводит к двунаправленной передаче сигналов, которая регулирует различные реакции между клетками, такие как, например, ингибирование фагоцитоза и активация Т-клеток. Действительно, в последние годы взаимодействие CD47-SIRPα оказалось в центре внимания из-за его роли в обеспечении способности опухолевых клеток избегать иммунологического надзора. Связывание CD47 с SIRPα обычно обеспечивает защиту с помощью антифагоцитарных сигналов («не ешь меня») для нормальных клеток. Однако было обнаружено, что опухоли также экспрессируют антифагоцитарные сигналы, включая CD47, чтобы избежать разрушения в результате фагоцитоза. Интересно, что CD47, как известно, активируется при некоторых гематологических формах рака и способствует как росту, так и распространению опухолей (Chao et al. (2012) Curr Opin Immunol. 24(2): 225-232).

[0103] Полные эффекты целенаправленного воздействия на CD47 и путь CD47-SIRPα в качестве нового метода лечения рака неизвестны и были изучены некоторые возможные токсические эффекты. Более тщательное и подробное понимание передачи сигнала CD47 и пути CD47-SIRPα необходимо для разработки более целенаправленных методов лечения рака в будущем.

Последовательности CD47

[0104] Иллюстративные последовательности CD47 для мыши и человека изложены в таблице 3. В последовательностях мРНК кодирующая последовательность указана жирным шрифтом, а последовательные экзоны в случаях, когда они указаны, разделены чередующимся подчеркнутым текстом. Для последовательностей белка мыши и человека сигнальные пептиды подчеркнуты, внеклеточные последовательности указаны жирным шрифтом, а внутрицитоплазматические последовательности курсивом. Для гуманизированных белковых последовательностей последовательности, отличные от человеческой, указаны обычным шрифтом, человеческие последовательности указаны жирным шрифтом, а сигнальные пептиды подчеркнуты. Как показано, изоформы отличаются по количеству экзонов. Например, изоформы 1-4 гена CD47 человека имеют в общей сложности 8, 9, 10 и 11 экзонов, соответственно, при этом экзоны 2-7 каждой изоформы кодируют внеклеточный домен и пять трансмембранных доменов.

Животные, отличные от человека, с гуманизированным CD47

[0105] Обеспечиваются животные, отличные от человека, которые экспрессируют гуманизированные белки CD47 на поверхности клеток животных, отличных от человека, в результате генетической модификации эндогенного локуса, кодирующего белок CD47, у животного, отличного от человека. Подходящие примеры, описанные в данном документе, включают грызунов, в частности, мышей.

[0106] Гуманизированный ген CD47 в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал от гетерологичного вида (например, человека), где гуманизированный ген CD47 кодирует белок CD47, который содержит часть, кодируемую генетическим материалом от гетерологичного вида. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 по настоящему изобретению содержит геномную ДНК от гетерологичного вида, которая кодирует внеклеточную часть белка CD47, экспрессируемого на плазматической мембране клетки. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 по настоящему изобретению содержит геномную ДНК от гетерологичного вида, которая кодирует внеклеточную часть и трансмембранную часть белка CD47, экспрессируемого на плазматической мембране клетки. Также обеспечиваются животные, отличные от человека, эмбрионы, клетки и направленные конструкты для получения животных, отличных от человека, эмбрионов, отличных от человеческих, и клеток, содержащих указанный гуманизированный ген CD47.

[0107] В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген CD47 подвергают делеции. В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген CD47 изменяют, при этом часть эндогенного гена CD47 замещают гетерологичной последовательностью (например, полной или неполной последовательностью CD47 человека). В некоторых вариантах осуществления весь или практически весь эндогенный ген CD47 замещают гетерологичным геном (например, геном CD47 человека). В некоторых вариантах осуществления часть гетерологичного гена CD47 вставляют в эндогенный ген CD47, отличный от человеческого, в эндогенном локусе CD47. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный ген представляет собой ген человека. В некоторых вариантах осуществления модификацию или гуманизацию проводят в отношении одной из двух копий эндогенного гена CD47, что приводит к получению животного, отличного от человека, являющегося гетерозиготным относительно гуманизированного гена CD47. В других вариантах осуществления обеспечивают животное, отличное от человека, являющееся гомозиготным по гуманизированному гену CD47.

[0108] Животное, отличное от человека, по настоящему изобретению содержит полный или неполный ген CD47 человека в эндогенном локусе CD47, отличного от человеческого. Таким образом, такие животные, отличные от человека, могут быть описаны как имеющие гетерологичный ген CD47. Замещенный, вставленный, модифицированный или измененный ген CD47 в эндогенном локусе CD47 можно выявить с применением разнообразных способов, включающих, например, ПЦР, вестерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) или анализ приобретения или потери аллеля. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным относительно гуманизированного гена CD47. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гомозиготным по гуманизированному гену CD47.

[0109] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 согласно настоящему изобретению включает в себя ген CD47, который имеет второй, третий, четвертый, пятый, шестой и седьмой экзоны, каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную второму, третьему, четвертому, пятому, шестому и седьмому экзонам, представленным в гене CD47 человека в таблице 3.

[0110] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 согласно настоящему изобретению включает в себя ген CD47, который имеет первый экзон и экзон(экзоны) ниже экзона 7 (например, восьмой и девятый экзоны изоформы 2), каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную соответствующему экзону, представленному в гене CD47 мыши в таблице 3.

[0111] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 согласно настоящему изобретению включает в себя ген CD47, который имеет 5'-концевую нетранслируемую область и 3'-концевую нетранслируемую область, каждая из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную 5'-концевой нетранслируемой области и 3'-концевой нетранслируемой области, представленным в гене CD47 мыши в таблице 3.

[0112] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD47 согласно настоящему изобретению включает в себя ген CD47, который имеет нуклеотидную кодирующую последовательность (например, последовательность кДНК), по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную нуклеотидной кодирующей последовательности, представленной в нуклеотидной кодирующей последовательности CD47 человека в таблице 3.

[0113] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную внеклеточной части белка CD47 человека, представленного в таблице 3.

[0114] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 19-141, представленным в белке CD47 человека в таблице 3.

[0115] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную N-концевому иммуноглобулиновому V-домену белка CD47 человека, представленного в таблице 3.

[0116] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 19-127, представленным в белке CD47 человека в таблице 3.

(0117] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен и пять трансмембранных доменов, каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную N-концевому иммуноглобулиновому V-домену и пяти трансмембранным доменам белка CD47 человека, представленного в таблице 3.

[0118] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внутрицитоплазматический «хвост», имеющий последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную внутрицитоплазматическому «хвосту» белка CD47 мыши, представленного в таблице 3.

[0119] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 16-292, представленным в белке CD47 человека в таблице 3.

[0120] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 19-292, представленным в белке CD47 человека в таблице 3.

[0121] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 19-292 (или 16-292), представленным в белке CD47 человека в таблице 3.

[0122] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотной последовательности гуманизированного белка CD47, представленного в таблице 3.

[0123] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок CD47, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности гуманизированного белка CD47, представленного в таблице 3.

[0124] Обеспечиваются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют гуманизированный белок CD47, в том числе конкретные полиморфные формы, аллельные варианты (например, с одиночными аминокислотными различиями) или изоформы, полученные в результате альтернативного сплайсинга, включающие композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют такие белки под контролем человеческой промоторной и человеческой регуляторной последовательности. В некоторых вариантах осуществления также обеспечиваются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют такие белки под контролем эндогенного промотора и эндогенной регуляторной последовательности. Способы включают вставку генетического материала, кодирующего полный или неполный белок CD47 человека, в точное местоположение в геноме животного, отличного от человека, которое соответствует эндогенному гену CD47, за счет чего создают гуманизированный ген CD47, который экспрессирует белок CD47, являющийся полностью или частично человеческим. В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку геномной ДНК, соответствующей экзонам 2-7 гена CD47 человека, в эндогенный ген CD47 животного, отличного от человека, за счет чего создают гуманизированны ген, который кодирует белок CD47, содержащий человеческую часть, содержащую аминокислоты, кодируемые вставленными экзонами.

[0125] При необходимости кодирующую область генетического материала или полинуклеотидной(полинуклеотидных) последовательности(последовательностей), кодирующую полный или неполный белок CD47 человека, можно модифицировать с тем, чтобы она содержала кодоны, оптимизированные для экспрессии в клетках животного, отличного от человека (см., например, патенты США №№5670356 и 5874304). Кодон-оптимизированные последовательности представляют собой синтетические последовательности и предпочтительно кодируют идентичный полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, обладающий практически такой же активностью, как и полноразмерный полипептид), кодируемый исходным полинуклеотидом, не являющимся кодон-оптимизированным. В некоторых вариантах осуществления кодирующая область генетического материала, кодирующая полный или неполный белок CD47 человека, может содержать измененную последовательность для оптимизации частоты использования кодонов для конкретного типа клеток (например, клетки грызуна). Например, кодоны геномной ДНК, соответствующие экзонам 2-7 гена CD47 человека, подлежащим вставке в эндогенный ген CD47 животного, отличного от человека (например, грызуна), можно оптимизировать для экспрессии в клетке животного, отличного от человека. Такая последовательность может быть описана как последовательность, подвергнутая оптимизации кодонов.

[0126] В подходе с гуманизированным геном CD47 используется относительно минимальная модификация эндогенного гена, и это приводит к естественной сигнальной трансдукции, опосредованной CD47, у животного, отличного от человека, в различных вариантах осуществления, поскольку геномные последовательности CD47 модифицированы в одном фрагменте и поэтому сохраняют нормальные функциональные свойства благодаря включению в себя необходимых регуляторных последовательностей. Таким образом, в таких вариантах осуществления модификация гена CD47 не влияет на другие окружающие гены или другие эндогенные гены, взаимодействующие с CD47 (например, тромбоспондин, SIRP и т.д.). Дополнительно, в различных вариантах осуществления модификация не влияет на сборку функционального трансмембранного белка CD47 на плазматической мембране и сохраняет нормальные эффекторные функции посредством связывания и последующей сигнальной трансдукции с помощью цитоплазматической части белка, не подвергнутой влиянию модификации.

[0127] Схематическая иллюстрация (без соблюдения масштаба) геномной организации эндогенного гена CD47 мыши и гена CD47 человека приведена на фигуре 1. Иллюстративный способ гуманизации эндогенного гена CD47 мыши с помощью геномного фрагмента, содержащего экзоны 2-7 гена CD47 человека, приведен на фигуре 2. Как проиллюстрировано, геномную ДНК, содержащую экзоны 2-7 гена CD47 человека вставляют в эндогенный локус гена CD47 мыши с помощью целенаправленно воздействующей конструкции. Эта геномная ДНК включает в себя часть гена, которая кодирует внеклеточную часть и трансмембранные домены (например, аминокислотные остатки 16-292) белка CD47 человека, отвечающие за связывание с лигандом.

[0128] Животное, отличное от человека (например, мышь), имеющее гуманизированный ген CD47 в эндогенном локусе CD47, можно получить любым способом, известным из уровня техники. Например, можно получить целенаправленно воздействующий вектор, с помощью которого вводят полный или неполный ген CD47 человека вместе с селективным маркерным геном. На фигуре 2 проиллюстрирован эндогенный локус CD47 генома мыши, содержащий вставку экзонов 2-7 гена CD47 человека. Как проиллюстрировано, целенаправленно воздействующая конструкция содержит 5'-концевое гомологичное плечо, содержащее последовательность выше экзона 2 эндогенного гена CD47 мыши (~39 т.п.о.), за которой расположен фрагмент геномной ДНК, содержащий экзоны 2-7 гена CD47 человека (~23,9 т.п.о.), кассета для отбора по чувствительности к лекарственному средству (например, ген устойчивости к неомицину, фланкированный последовательностями loxP; ~5 т.п.о.), а также 3'-концевое гомологичное плечо, содержащее последовательность ниже экзона 7 эндогенного гена CD47 мыши (~99 т.п.о.). Целенаправленно воздействующая конструкция содержит самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству (например, ген устойчивости к неомицину, фланкированный последовательностями loxP; см. патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, все из которых включены в данный документ посредством ссылки). После гомологичной рекомбинации экзоны 2-7 эндогенного гена CD47 мыши заменяют последовательностью, содержащейся в целенаправленно воздействующем векторе (т.е. экзонах 2-7 гена CD47 человека). Создают гуманизированный ген CD47, что приводит к получению клетки или животного, отличного от человека, которые экспрессируют гуманизированный белок CD47, содержащий аминокислоты, кодируемые экзонами 2-7 гена CD47 человека. Кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству удаляют способом, зависимым от развития, т.е. у потомства, происходящего от мышей, клетки зародышевой линии которых содержат гуманизированный ген CD47, описанный выше, будет утрачиваться селективный маркер из дифференцированных клеток в ходе развития.

[0129] Животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно получить, как описано выше, или с использованием способов, известных в данной области, с содержанием дополнительных человеческих или гуманизированных генов, часто в зависимости от предполагаемого применения животного, отличного от человека. Генетический материал таких дополнительных человеческих или гуманизированных генов можно вводить посредством дальнейшего изменения генома клеток (например, эмбриональных стволовых клеток), имеющих генетические модификации, как описано выше, или с помощью методов скрещивания, известных в данной области, с другими генетически модифицированными линиями, при желании. В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению получают для дополнительного включения одного или более человеческих или гуманизированных генов, выбранных из SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF и ТРО. В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно получить путем введения целенаправленно воздействующего вектора, описанного в данном документе, в клетку из модифицированной линии. В качестве только одного примера, целенаправленно воздействующий вектор, описанный в данном документе, можно вводить в мышь, которая является Rag2-дефицитной и IL-2Rγ-дефицитной и содержит четыре цитокина человека (Rag2^-/-IL2Rγc^-/-; M-CSF^Hu; IL-3/GM-CSF^Hu; hSIRPα^tg; TPO^Hu). В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению получают для дополнительного включения человеческого или гуманизированного гена сигнально-регуляторного белка альфа (SIRPα). В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат гуманизированный ген CD47, описанный в данном документе, и генетический материал из гетерологичного вида (например, человека), где генетический материал кодирует полный или неполный один или более гетерологичный белок, выбранный из SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF и ТРО. В некоторых определенных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению содержит гуманизированный ген CD47, описанный в данном документе, и генетический материал из гетерологичного вида (например, человека), где генетический материал кодирует полный или неполный гетерологичный белок SIRPα (например, человека) (CD172a). В некоторых определенных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению дополнительно содержит ген SIRPα, который включает в себя эндогенную часть и человеческую часть (например, экзоны 2-4 гена SIRPα человека), где человеческая часть кодирует внеклеточный домен белка SIRPα (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362 белка SIRPα человека) и эндогенная часть кодирует внутриклеточный домен эндогенного белка SIRPα; в некоторых вариантах осуществления человеческая часть и эндогенная часть функционально связаны с эндогенным промотором SIRPα.

[0130] Например, как описано в данном документе, животные, отличные от человека, содержащие гуманизированный ген CD47, могут дополнительно содержать (например, посредством стратегий скрещивания или целенаправленного воздействия полимерных генов) одну или более модификаций, описанных в заявке на патент PCT/US 2010/051339, поданной 4 октября 2010 г.; PCT/US 2013/058448, поданной 6 сентября 2013 г.; PCT/US 2013/045788, поданной 14 июня 2013 г.; PCT/US 2014/056910, поданной 23 сентября 2014 г.; PCT/US 2014/060568, поданной 15 октября 2014 г.; PCT/US 2012/025040, поданной 14 февраля 2014 г.; PCT/US 2012/062379, поданной 29 октября 2012 г.; PCT/US 2014/064806, поданной 10 ноября 2014 г. и PCT/US 2014/064810, поданной 10 ноября 2014 г.; эти заявки включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В определенных вариантах осуществления грызуна, содержащего гуманизированный ген CD47 (т.е., экзоны 2-7 гена CD47 человека, функционально связанные с экзоном 1 и экзоном 8 (и, следовательно, с любыми экзонами ниже) эндогенного гена CD47 грызуна гак, что гуманизированный ген CD47 кодирует полипептид CD47, имеющий внеклеточную часть из белка CD47 человека и внутриклеточную часть из белка CD47 грызуна), скрещивают с грызуном, содержащим гуманизированный ген SIRPα (например, экзоны 2-4 гена SIRPα человека, функционально связанные с экзонами 1 и 5-8 эндогенного гена SIRPα грызуна так, что гуманизированный ген SIRPα кодирует полипептид SIRPα, имеющий внеклеточную часть из белка SIRPα человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 28-362) и внутриклеточную часть из белка SIRPα грызуна; см., например, PCT/US 2014/056910, поданную 23 сентября 2014 г., включенную в данный документ посредством ссылки).

[0131) Хотя варианты осуществления, в которых используется гуманизированный ген CD47 мыши (т.е. мыши с геном CD47, кодирующим белок CD47, который содержит человеческую часть и мышиную часть), широко обсуждаются в данном документе, также обеспечиваются другие животные, отличные от человека, которые содержат гуманизированный ген CD47. В некоторых вариантах осуществления такие животные, отличные от человека, содержат гуманизированный ген CD47, функционально связанный с эндогенным промотором CD47. В некоторых вариантах осуществления такие животные, отличные от человека, экспрессируют гуманизированный белок CD47 в эндогенном локусе, где гуманизированный белок CD47 содержит аминокислотные остатки 16-292 (или 19-141, или 19-127) белка CD47 человека. Такие животные, отличные от человека, включают любых из тех, которые можно генетически модифицировать для экспрессии белка CD47, раскрытого в данном документе, в том числе, например, млекопитающих, например, мышь, крысу, кролика, свинью, бычьих (например, корову, быка, буйвола), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, игрунку, макака-резуса) и т.д. Например, для тех животных, отличных от человека, для которых подходящие генетически модифицируемые ES-клетки являются труднодоступными, используют другие способы для получения животного, отличного от человека, содержащего генетическую модификацию. Такие способы включают, например, модификацию генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и использование переноса ядер соматических клеток (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в подходящую клетку, например, в энуклеированный ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) животным, отличным от человека, в подходящих условиях с образованием эмбриона.

[0132] Способы модификации генома животного, отличного от человека (например, генома свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.д.), включают, например, использование нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), для модификации генома с тем, чтобы он содержал гуманизированный ген CD47.

[0133] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой мелкое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное по настоящему изобретению представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное по настоящему изобретению принадлежит к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяки, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (лазающие мыши, скальные мыши, белохвостые крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун по настоящему изобретению выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь по настоящему изобретению является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой мышь.

[0134] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна, который является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой линию 129, выбранную из группы, состоящей из линии, представляющей собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь по настоящему изобретению является помесью вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению является помесью вышеупомянутых линий 129 или помесью вышеупомянутых линий BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления линия 129 в помеси, описанной в данном документе, представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой линию BALB, например, линию BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой помесь линии BALB и другой вышеупомянутой линии.

[0135] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой крысу. В некоторых определенных вариантах осуществления крыса по настоящему изобретению выбрана из крысы линии Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых определенных вариантах осуществления линия крыс, описанная в данном документе, представляет собой помесь двух или более линий, выбранных из группы, включающей Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

Способы, в которых используются животные, отличные от человека, имеющие гуманизированные гены CD47

[0136] Сообщалось о мутантных и трансгенных по CD47 животных, отличных от человека, (например, миниатюрные свиньи) и клетках (Koshimizu Н. et al. (2014) PLoS One, 9(2):e89584; Lavender, K.J. et al. (2014) J. Immunol. Methods, 407:127-134; Tena, A. et al. (2014) Am. J. Transplant. doi: 10.1111/ajt.12918; Lavender K.J. et al. (2013) Blood, 122(25):4013-4020; Tena, A. et al. (2012) Transplantation 94(10S):776; Wang, C. et al. (2011) Cell Transplant. 20(11-12): 1915-1920; Johansen, M.L. and Brown, E.J. (2007) J. Biol. Chem. 282:24219-24230; Wang, H. et al. (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104:13744-13749; Tulasne D. et al. (2001) Blood, 98(12):3346-52; Oldenborg, P. et al. (2000) Science 288:2051-2054; Verdrengh, M. et al. (1999) Microbes Infect. 1(10):745-751; Chang, H.P. et al. (1999) Learn Mem. 6(5):448-457; Wang, X.Q. et al. (1999) J. Cell Biol. 147(2):389-400; Lindberg, F.P. et al. (1996) Science 274(5288):795-798). Такие животные применялись во множестве анализов для определения, например, молекулярных аспектов экспрессии, функции и регуляции CD47. Были обнаружены значительные различия между видами. Действительно, диабетические мыши без ожирения/с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID) экспрессируют белок SIRPα, который способен взаимодействовать с CD47 человека и, следовательно, их широко использовали для разработки мышиных моделей с компонентами иммунной системы человека (например, см. Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8(120:1313-1323). Аллель SIRPα, присутствующий у этих мышей, не является типичным аллелем SIRPα, присутствующим в других линиях мышей, и, как правило, межвидовая перекрестная реактивность между CD47 и SIRPα незначительна. Также сообщалось, что CD47 на клетках мыши обладает почти полной подвижностью, в то время как CD47 на клетках человека демонстрирует только около 30-40% (Bruce, L. et al. (2003) Blood 101:4180-4188; Mouro-Chanteloup, L. et al. (2000) VoxSanguinis 78:P030; Mouro-Chanteloup. L. et al. (2003) Blood 101:338-344). Таким образом, мыши NOD/SCID не лишены ограничений. Например, хотя развитие множества линий дифференцировки гематопоэтических клеток человека может поддерживаться при некоторых генетических условиях (например, BALB/c Rag2^-/-IL-2Rγc^-/-), гомеостаз других типов клеток остается неэффективным (например, Т-клетки и NK-клетки; см., например, Gimeno, R. et al. (2004) Blood 104:3886-3893; Traggiai, E. et al. (2004) Science 304:104-107; Legrand, N. et al. (2006) Blood 108:238-245). Кроме того, известно, что CD47 взаимодействует с другими белками клеточной поверхности и обеспечивает двунаправленную передачу сигналов. Таким образом, имеющиеся мыши представляют собой неэффективную систему in vivo для выяснения зависимых от CD47 функций в различных биологических процессах, таких как, например, приживление и фагоцитоз. Кроме того, имеющиеся мыши представляют собой неоптимальную систему in vivo для разработки целенаправленно воздействующих на CD47 методов лечения.

[0137] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo и источник биологических материалов (например, клеток), экспрессирующих CD47 человека, которые являются применимыми в разнообразных анализах. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для разработки терапевтических средств, которые целенаправленно воздействуют на CD47 и/или модулируют передачу сигнала CD47-SIRPα. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для скрининга и разработки кандидатных терапевтических средств (например, антител), которые связывают CD47 человека. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для скрининга и разработки кандидатных терапевтических средств (например, антител), которые блокируют взаимодействие CD47 человека с SIRPα человека. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов гуманизированного CD47 на поверхности клетки животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения эпитопа или эпитопов одного или более кандидатных терапевтических антител, которые связывают CD47 человека.

[0138] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения фармакокинетических профилей антител к CD47. В различных вариантах осуществления каждое из одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению и одного или более контрольных или эталонных животных, отличных от человека, подвергают воздействию одного или более кандидатных терапевтических антител к CD47 в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более). Кандидатные терапевтические антитела можно вводить посредством любого желаемого пути введения (например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно и т.д.). У животных, отличных от человека (гуманизированных и контрольных), отбирают кровь в различные моменты времени (например, 0 ч., 6 ч., 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или до 30 или более дней). Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических профилей вводимых кандидатных терапевтических антител с применением образцов, полученных от животных, отличных от человека, описанных в данном документе, в том числе без ограничения уровня общего IgG, гуморального ответа на терапевтические антитела, агглютинации и т.д.

[0139] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для измерения терапевтического эффекта блокирования или модулирования передачи сигналов, опосредованной CD47, и эффекта в отношении экспрессии генов в результате клеточных изменений. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению или клетки, выделенные из него, подвергают воздействию кандидатного терапевтического средства, которое связывается с гуманизированным белком CD47 (или человеческой частью белка CD47) на поверхности клетки животного, отличного от человека, и по истечении последующего периода времени анализируют на эффекты в отношении CD47-зависимых процессов, например, адгезии, ангиогенеза, апоптоза, воспаления, миграции, фагоцитоза, пролиферации и клиренса опухолей (или опухолевых клеток).

[0140] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению экспрессируют гуманизированный белок CD47, поэтому можно создавать клетки, линии клеток и культуры клеток, служащие в качестве источника гуманизированного CD47 для применения в анализах связывания и функциональных анализах, например, для анализа связывания или функции антагониста или агониста CD47, в частности, если антагонист или агонист является специфичным к последовательности или эпитопу SIRPα человека. В различных вариантах осуществления эпитопы CD47, которые связывают кандидатные терапевтические антитела, можно определять с применением клеток, выделенных из животных, отличных от человека, по настоящему изобретению.

]0141] Клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно выделять и применять для конкретной цели или можно поддерживать в культуре в течение многих поколений. В различных вариантах осуществления клетки животного, отличного от человека, по настоящему изобретению иммортализируют и сохраняют в культуре в течение неопределенного времени (например, в сериях культур).

[0142] В различных вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе выживаемости и/или пролиферации (например, с использованием В- или Т-клеток) для скрининга и разработки кандидатных терапевтических средств, модулирующих передачу сигналов, опосредованную CD47 человека. Активация или утрата CD47 может играть важную роль в регуляции клеточной пролиферации и индукция апоптоза с помощью CD47 может являться следствием активации специфических эпитопов внеклеточного домена CD47, и поэтому кандидатных модуляторов для CD47 (например, антагонистов или агонистов) можно идентифицировать, характеризовать и разрабатывать с использованием клеток животных, отличных от человека, по настоящему изобретению и/или животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе(анализах) выживаемости или гибели для определения эффекта в отношении пролиферации или апоптоза конкретной(конкретных) клетки(клеток) (например, раковых клеток) в присутствии и в отсутствие CD47.

[0143] В различных вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в ксенотрансплантации гетерологичных клеток (например, человека) для определения функций, опосредованных CD47, в физиологическом (например, иммунном) ответе на трансплантированные клетки человека. В некоторых вариантах осуществления кандидатные терапевтические средства, которые связываются с CD47 человека или блокируют одну или более его функций, характеризуют у животного, отличного от человека, по настоящему изобретению. Подходящие измерения включают различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ уровня сывороточного иммуноглобулина (например, титра антител), анализы цитотоксичности и получение характеристик лиганд-рецепторных взаимодействий (анализы иммунопреципитации). В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для получения характеристик функций, опосредованных CD47, регулирующих иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с аутоиммунным заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдают один или более пациентов-людей, нуждающихся в лечении.

[0144] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в экспериментах по трансплантации или адоптивному переносу для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования CD47-зависимой регуляции новых лимфоцитов и их иммунной функции. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению трансплантируют В-клетки человека.

[0145] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе миграции или распространения клеток для скрининга и разработки кандидатных терапевтических средств, модулирующих CD47 человека. Такие процессы необходимы для многих клеточных процессов, включая заживление ран, дифференцировку, пролиферацию и выживание.

[0146] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализах фагоцитоза для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования CD47-зависимой регуляции фагоцитоза.

[0147] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализах роста (или пролиферации) опухолевых клеток для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования CD47-зависимых регуляции и/или апоптоза опухолевых клеток.

[0148] В различных вариантах осуществления у одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению индуцируют воспалительное заболевание или состояние для обеспечения системы in vivo для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования CD47-зависимой регуляции одной или более функций при воспалительном заболевании или состоянии. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание или состояние ассоциировано с новообразованием.

[0149] В различных вариантах осуществления у одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению индуцируют антиангиогенное состояние для обеспечения системы in vivo для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования CD47-зависимой регуляции одной или более функций при антиангиогенном состоянии. Иллюстративные функции, которые можно оценить для определения терапевтической эффективности, включают в себя экспрессию хемокинов, ответы, стимулированные оксидом азота (NO), и восстановление кровотока.

[0150] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для анализа и тестирования лекарственного средства или вакцины. В различных вариантах осуществления кандидатное лекарственное средство или кандидатную вакцину можно доставлять одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом животных, отличных от человека, для определения одного или более из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания или состояния. Иллюстративные способы, используемые для определения профиля безопасности, включают измерения токсичности, оптимальной концентрации дозы, эффективности лекарственного средства или вакцины и возможных факторов риска. Такие лекарственные средства или вакцины можно улучшать и/или разрабатывать у таких животных, отличных от человека.

[0151] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на CD47, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения эффекта лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Фармакокинетические свойства включают без ограничения характер переработки животным лекарственного средства в различные метаболиты (или выявляемое наличие или отсутствие одного или более метаболитов лекарственных средств, в том числе токсичных метаболитов), период полувыведения лекарственного средства, уровни циркулирующего в крови лекарственного средства после введения (например, концентрацию лекарственного средства в сыворотке крови), гуморальный ответ на лекарственное средство (например, выработку антител к лекарственным средствам), всасывание и распределение лекарственного средства, путь введения, пути выведения и/или клиренс лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления мониторинг фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных средств (например, модуляторов CD47) проводят у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению или посредством их применения.

[0152] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки целевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на CD47, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения целевого эффекта токсичности лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Как правило, лекарственные средства предназначены для модулирования одной или более функций их мишеней. В виде лишь одного примера, модулятор CD47 предназначен для модулирования функций, опосредованных CD47 (например, индуцированного CD47 апоптоза), посредством взаимодействия некоторым образом с молекулой CD47 на поверхности одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления такой модулятор может оказывать неблагоприятный эффект, заключающийся в усилении требуемого(требуемых) фармакологического(фармакологических) действия(действий) модулятора. Такие эффекты называют целевыми эффектами. Иллюстративные целевые эффекты предусматривают чрезмерно высокую дозу, длительную активацию/инактивацию и надлежащее действие в ненадлежащей ткани. В некоторых вариантах осуществления целевые эффекты лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47, которые идентифицируют у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению или посредством их применения, используют для определения ранее неизвестной(неизвестных) функции(функций) CD47.

[0153] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки нецелевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на CD47, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения нецелевого эффекта токсичности лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Нецелевые эффекты могут иметь место в тех случаях, когда лекарственное средство взаимодействует с ненамеченной мишенью (например, при перекрестной реактивности в отношении общего эпитопа). Такие взаимодействия могут иметь место в намеченной или ненамеченной ткани. В виде лишь одного примера, изомеры лекарственного средства, представляющие собой его зеркальные отражения (энантиомеры), могут приводить к нецелевым эффектам токсичности. Дополнительно, лекарственное средство может ненадлежащим образом взаимодействовать с различными подтипами рецепторов и непреднамеренно активировать их. Иллюстративные нецелевые эффекты предусматривают ненадлежащие активацию/ингибирование ненадлежащей мишени вне зависимости от ткани, в которой находится ненадлежащая мишень. В некоторых вариантах осуществления нецелевые эффекты лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47, определяют путем сравнения эффектов от введения лекарственного средства животным, отличным от человека, по настоящему изобретению и одному или более эталонным животным, отличным от человека.

[0154] В некоторых вариантах осуществления проведение анализа предусматривает определение эффекта в отношении фенотипа (например, изменение массы тела) и/или генотипа животного, отличного от человека, которому вводят лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления проведение анализа предусматривает определение изменчивости от партии к партии для модулятора CD47 (например, антагониста или агониста). В некоторых вариантах осуществления проведение анализа предусматривает определение различий между эффектами лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47, вводимого животному, отличному от человека, по настоящему изобретению и эталонному животному, отличному от человека. В различных вариантах осуществления эталонные животные, отличные от человека, могут иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе (например, в случае животного, имеющего разрушенный, содержащий делецию или по иным причинам нефункциональный ген CD47), или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа, отличного от человека).

[0155] Иллюстративные параметры, которые можно измерять у животных, отличных от человека (или в клетках, выделенных из них, и/или с их применением), для оценки фармакокинетических свойств, целевой токсичности и/или нецелевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47, включают без ограничения агглютинацию, аутофагию, деление клеток, гибель клеток, комплементзависимый гемолиз, целостность ДНК, титр антител, специфичных к лекарственному средству, метаболизм лекарственного средства, экспрессию генов, определяемую с помощью биочипов, уровни гематокрита, гематурию, метаболическую активность, митохондриальную активность, окислительный стресс, фагоцитоз, биосинтез белка, распад белка, секрецию белка, стрессовую реакцию, концентрацию лекарственного средства в целевой ткани, концентрацию лекарственного средства в нецелевой ткани, транскрипционную активность и т.п. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения фармацевтически эффективной дозы модулятора CD47.

[0156] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и получения характеристик кандидатных терапевтических средств для использования при раке. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению можно имплантировать опухоль с последующим введением одного или более кандидатных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления кандидатные терапевтические средства могут включать полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или коктейль из антител; в некоторых вариантах осуществления использование кандидатных терапевтических средств предусматривает комбинированную терапию, такую как, например, последовательное или одновременное введение доз моноспецифических антител. Опухоли может быть предоставлено достаточное время для развития в одном или более местоположениях в организме животного, отличного от человека. Пролиферацию, рост и т.д. опухолевых клеток можно измерять как до, так и после введения кандидатного(кандидатных) терапевтического(терапевтических) средства(средств). При желании у животного, отличного от человека, также можно измерять цитотоксичность кандидатных терапевтических средств.

[0157] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo для выявления механизмов взаимодействия клеток человека посредством адоптивного переноса. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, могут имплантировать опухолевый ксенотрансплантат с последующей второй имплантацией инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, которые могут быть имплантированы животным, отличным от человека, посредством адоптивного переноса для определения эффективности ликвидации солидных опухолей или других злокачественных новообразований. Такие эксперименты можно проводить с клетками человека из-за исключительного присутствия CD47 человека без конкуренции с эндогенным CD47 животного, отличного от человека. В качестве альтернативы, такие эксперименты могут предусматривать применение клеток мыши NOD/SCID или BRG (BALB/c Rag2^-/-IL-2Rγc^-/-). Кроме того, методы лечения и фармацевтические препараты для применения в ксенотрансплантации можно улучшить и/или разработать на таких животных, отличных от человека.

[0158] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo для поддержания и развития гематопоэтических стволовых клеток человека посредством приживления. В различных вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенное развитие и поддержание стволовых клеток человека у животного, отличного от человека. В различных вариантах осуществления увеличенные популяции дифференцированных В- и Т-клеток человека наблюдаются в крови, костном мозге, селезенке и тимусе животного, отличного от человека. В различных вариантах осуществления оптимальный гомеостаз Т- и NK-клеток наблюдается в клетках в крови, костном мозге, селезенке и тимусе животного, отличного от человека. В различных вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению демонстрируют повышение уровня или количества эритроцитов (RBC) по сравнению с одним или более эталонными животными, отличными от человека.

(0159) Животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно использовать для оценки эффективности терапевтического лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на клетки человека. В различных вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению трансплантируют клетки человека, и такому животному, отличному от человека, вводят кандидатное лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на такие клетки человека. Затем определяют терапевтическую эффективность лекарственного средства путем мониторинга клеток человека у животного, отличного от человека, после введения лекарственного средства. Лекарственные средства, которые можно тестировать на животных, отличных от человека, включают в себя как низмолекулярные соединения, т.е. соединения со значениями молекулярной массы менее 1500 кДа, 1200 кДа, 1000 кДа или 800 дальтон, так и высокомолекулярные соединения (такие как белки, например, антитела), которые оказывают предусматриваемые терапевтические эффекты для лечения заболеваний и состояний человека путем целенаправленного воздействия на клетки человека (например, путем связывания с ними и/или действия на них).

[0160] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство, и клетки человека представляют собой раковые клетки, которые могут представлять собой клетки первичной раковой опухоли или клетки из линий клеток, развившихся из первичной раковой опухоли. В этих вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению трансплантируют раковые клетки человека, и животному, отличному от человека, дают противораковое лекарственное средство. Эффективность лекарственного средства можно определить путем оценки ингибирования роста или метастазирования раковых клеток человека у животного, отличного от человека, в результате введения лекарственного средства.

[0161] В конкретных вариантах осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой молекулу антитела, которая связывается с антигеном на раковых клетках человека. В конкретных вариантах осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с антигеном на раковых клетках человека и с антигеном на других клетках человека, например, клетках иммунной системы человека (или «иммунных клетках человека»), таких как В-клетки и Т-клетки.

[0162] В некоторых вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению приживляют иммунные клетки человека или клетки, которые дифференцируются в иммунные клетки человека. Такому животному, отличному от человека, с приживленными иммунными клетками человека трансплантируют раковые клетки человека и вводят противораковое лекарственное средство, такое как биспецифическое антитело, которое связывается с антигеном на раковых клетках человека и с антигеном на иммунных клетках человека (например, Т-клетках). Терапевтическую эффективность биспецифического антитела можно оценить по его способности ингибировать рост или метастазирование раковых клеток человека у животного, отличного от человека. В конкретном варианте осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению приживляют гематопоэтические CD34⁺ клетки-предшественники человека, которые дают начало иммунным клеткам человека (в том числе, среди прочего, Т-клеткам, В-клеткам, NK-клеткам). Клетки В-клеточной лимфомы человека (например, клетки Raji) трансплантируют такому животному, отличному от человека, с приживленными иммунными клетками человека, которому затем вводят биспецифическое антитело, связывающееся с опухолевым антигеном (например, антигеном на нормальных В-клетках и определенных В-клеточных злокачественных новообразованиях, таким как CD20) и с субъединицей CD3 рецептора Т-клеток для тестирования способности биспецифического антитела ингибировать опухолевый рост у животного, отличного от человека.

ПРИМЕРЫ

[0163] Следующие примеры приведены для того, чтобы обеспечить специалистов в данной области описанием того, как создавать и применять способы и композиции по настоящему изобретению, и они не предполагают ограничение объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Если не указано иное, температура указана по Цельсию, а давление является атмосферным или близким к нему.

Пример 1. Гуманизация эндогенного гена кластера дифференцировки 47 (CD47).

[0164] В данном примере показаны иллюстративные способы гуманизации эндогенного гена, кодирующего кластер дифференцировки 47 (CD47), у млекопитающего, отличного от человека, такого как грызун (например, мышь). Способы, описанные в данном примере, можно по желанию использовать для гуманизации эндогенного гена CD47 животного, отличного от человека, с помощью любой человеческой последовательности или комбинации человеческих последовательностей (или фрагментов последовательностей). В данном примере ген CD47 человека, который появляется в клоне бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RP11-69A17, используют для гуманизации эндогенного гена CD47 мыши.

[0165] Целенаправленно воздействующий вектор для гуманизации генетического материала, кодирующего внеклеточный N-концевой домен IgV и пять трансмембранных доменов эндогенного гена CD47, конструировали с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6586251 и Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659; включенные в данный документ посредством ссылки).

(01661 Вкратце, мышиный клон бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RP23-230L20 (Invitrogen) модифицировали с удалением последовательности, содержащей экзоны 2-7 эндогенного гена CD47, и вставкой экзонов 2-7 гена CD47 человека с использованием человеческого ВАС-клона RP11-69A17 (Invitrogen), который кодирует аминокислоты 16-292 полипептида CD47 человека. Эндогенную ДНК, содержащую геномную ДНК, соответствующую экзонам 1, 8 и 9 изоформы 2, а также 5'- и 3'-концевые нетранслируемые области (UTR), сохраняли. Анализ последовательности CD47 человека, содержащейся в ВАС-клоне RP11-69A17, подтвердил все экзоны CD47 и сигналы сплайсинга. Анализ последовательности выявил, что последовательность соответствует эталонному геному и транскриптам CD47 NM_001777.3 и NM_198793.2. Геномную ДНК, соответствующую экзонам 2-7 эндогенного гена CD47 (~30,8 т.п.о.) заменяли в ВАС-клоне RP23-230L20 путем гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках со вставкой фрагмента ДНК, содержащего ~23,9 т.п.о. геномной ДНК человека, соответствующей экзонам 2-7 гена CD47 человека из ВАС-клона RP11-69A17, и ~4995 п.о., соответствующих самоудалающейся кассете для отбора по чувствительности к неомицину, фланкированной сайтами распознавания рекомбиназы (loxP-hUb 1-em7-Neo-pA-mPrm 1-Crei-loxP; см. патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, которые включены в данный документ посредством ссылки). Самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к неомицину добавляли к концу фрагмента ДНК человека размером ~23,9 т.п.о., содержащего экзоны 2-7 гена CD47 человека (фигура 2). Целенаправленно воздействующий вектор содержал в направлении от 5' к 3' 5'-концевое гомологичное плечо, содержащее - 39 т.п.о. геномной ДНК мыши из ВАС-клона RP23-230L20, ~29,3 т.п.о. геномной ДНК человека из ВАС-клона RP11-69А17 (содержащей экзоны 2-7 гена CD47 человека), самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к неомицину, фланкированную сайтами loxP, и ~98,8 т.п.о. геномной ДНК мыши из ВАС-клона RP23-230L20. После гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках с целенаправленно воздействующим вектором, описанным выше, создавали модифицированный ВАС-клон RP23-230L20, который давал в результате гуманизированный ген CD47, содержащий 5' UTR мыши, экзон 1 мыши, экзоны 2-7 человека, экзоны 8-9 мыши и 3'UTR мыши. Белковые последовательности четырех спроектированных альтернативно сплайсированных изоформ гуманизированного CD47 приведены в таблице 3, где указаны полученные в результате аминокислоты мыши и человека, кодируемые ДНК мыши и человека, соответственно.

[0167] Модифицированный ВАС-клон, описанный выше, использовали для электропорации эмбриональных стволовых (ES) клеток F1H4 мыши (50% 129/S6/SvEv/Tac, 50% C57BL/6NTac; Auerbach, W. et al. (2000) Biotechniques 29(5): 1024-8, 1030, 1032) для создания модифицированных ES-клеток, содержащих эндогенный ген CD47, гуманизированный экзонами 2-7. Подвергнутые положительному целенаправленному воздействию ES-клетки, содержащие гуманизированный ген CD47, идентифицировали с помощью анализа (ValenzueJa et al., выше), в котором выявляли наличие последовательностей CD47 человека (например, экзонов 2-7) и подтверждали потерю и/или сохранение последовательностей CD47 мыши (например, экзонов 1, 8 и 9 и/или экзонов 2-7). В таблице 4 представлены праймеры и зонды, которые использовали для подтверждения гуманизации эндогенного гена CD47, описанной выше (фигура 3). Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную выше от точки вставки часть, включала в себя следующую последовательность, причем указана эндогенная мышиная последовательность выше точки вставки (ниже заключенная в круглые скобки с выделенным курсивом сайтом рестрикции AsiSI), непосредственно соединенная с последовательностью CD47 человека, присутствующей в точке вставки: (GCAGACATGA TTACTTCAGA GCTTTCAAAG CTAGATACTG TACCTTGCAT ATTCCAACAC) GCGATCGC ATTTTAAGAT TTTCCATCCT AGTGGAAAGA TATGATTTGA TTCATCCTAT TTACTTTGTA TATTAAAGTA CAGTAGAACC TGCCACTTTT (SEQ ID NO: 33). Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную ниже от точки вставки часть с 5'-конца самоудаляющейся кассеты для отбора по чувствительности к неомицину, включала в себя следующую последовательность, причем указана геномная последовательность CD47 человека, смежная с последовательностью кассеты ниже точки вставки (ниже заключенная в круглые скобки с выделенной курсивом последовательностью loxP): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG) (SEQ ID NO: 34). Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную ниже от точки вставки часть с 3'-конца кассеты для отбора по чувствительности к неомицину, включала в себя следующую последовательность, причем указана последовательность кассеты. смежная с геномной последовательностью мыши в направлении от 3' от экзона 7 эндогенного гена CD47 (ниже заключенная в круглые скобки с выделенной курсивом последовательностью loxP): CATGTCTGGA ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGACTAGC (ATTAGTATGG AAGGTCCGTC CACTGTCCAG GTTCCTCTTG CGGAGCTCTT TGTCTCTCTG GACTCTGTAT ACACTGCTTG) (SEQ ID NO: 35). Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную ниже от точки вставки часть после делеции кассеты для отбора по чувствительности к неомицину (при оставшихся 76 п.о.), включала в себя следующую последовательность, причем указаны геномные последовательности человека и мыши, расположенные рядом с оставшейся частью последовательности кассеты и последовательностью loxP (ниже заключенные в круглые скобки с выделенной курсивом последовательностью loxP): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ACTAGQATT AGTATGGAAG GTCCGTCCAC TGTCCAGGTT CCTCTTGCGG AGCTCTTTGT CTCTCTGGAC TCTGTATACA CTGCTTGCAT (SEQ ID NO: 36).

[0168] Затем положительные клоны ES-клеток использовали для имплантации самкам мышей с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США №7294754 и Poueymirou et al, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) для создания выводка детенышей, содержащих вставку экзонов 2-7 гена CD47 человека в эндогенном гене CD47 мыши. Для мышей, содержащих гуманизированные экзоны 2-7 эндогенного гена CD47, вновь проводили подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с применением анализа модификации аллеля (Valenzuela et al., выше), выявившего наличие последовательностей гена CD47 человека. Детенышей генотипировали, и группы животных, гетерозиготных по конструкции с гуманизированным геном CD47, отбирали для получения характеристик.

Пример 2. Экспрессия гуманизированного полипептида CD47 эритроцитами мыши.

[0169] В этом примере демонстрируется, что животных, отличных от человека (например, грызунов), модифицированных с тем, чтобы содержать гуманизированный ген CD47 согласно примеру 1, можно использовать для скрининга модуляторов CD47 (например, антител к CD47) и определения различных характеристик, таких как, например, фармакокинетика и профили безопасности. В данном примере несколько антител к CD47 подвергают скринингу на эритроцитах (RBC) мыши, выделенных из грызунов, полученных в соответствии с примером 1, где грызуны экспрессируют гуманизированный полипептид CD47, описанный в данном документе.

[0170] Вкратце, 2 мл цельной крови от гуманизированных по CD47 мышей (n=2) переносили в пробирку на 15 мл и центрифугировали при 200xg в течение 10 минут при 4°С. Плазму и лейкоцитарную пленку удаляли и затем добавляли 15 мл PBS и клетки осторожно перемешивали. Смесь снова центрифугировали при 200xg в течение пяти минут при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли и клетки промывали еще два раза. Осажденные RBC ресуспендировали до конечного объема в 10 мл PBS. Ресуспендированные RBC центрифугировали в последний раз при 200xg в течение 10 минут при 4°С. Объем уплотненных RBC составлял примерно 0,5 мл и его разбавляли до концентрации 0,5% с PBS (0,5 мл уплотненных RBC/100 мл PBS). Фактическую концентрацию RBC определяли с помощью Cellometer Auto Т4 (1,5×10⁷/мл; Nexcelom Bioscience).

[0171] Восемьдесят (80) мкл 0,5% RBC мыши добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с V-образным дном. Антитела к CD47 добавляли в каждую лунку (20 мкл при концентрации 33 нМ). Планшет осторожно постукивали для перемешивания и инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем планшет дважды промывали буфером для окрашивания (PBS с 2% FBS). Вторичное антитело Fab-488 (Alexa Fluor 488-конъюгированное мышиное к IgG человека AffiniPure, F(ab')_2- специфичное, Jackson Immuno Research) добавляли в каждую лунку при концентрации 10 мкг/мл. Планшет снова инкубировали на льду в течение 30 минут, после чего однократно промывали буфером для окрашивания. Клетки в каждой лунке ресусиендировали в 200 мкл буфера для окрашивания и фильтровали через 96-луночный фильтровальный планшет. Клетки в планшете анализировали с использованием системы BD ACCURI™ С6 (BD Biosciences). Иллюстративные результаты показаны на фигуре 4. Среднее значение интенсивности флуоресценции (MFI) выше изотопического контроля для каждого тестируемого антитела показано в таблице 5.

[0172] Как показано на фигуре 4, все антитела к CD47 связывались с RBC от гуманизированных по CD47 мышей. Вместе взятый, данный пример демонстрирует, что (1) животные, отличные от человека, (например, грызуны) сконструированные для содержания гуманизированного гена CD47, описанные в данном документе, экспрессируют гуманизированный полипептид CD47 на поверхности клеток (например, RBC) животного, отличного от человека, и (2) такие клетки пригодны для скрининга модуляторов CD47 (например, антител к CD47) и определения фармакокинетических профилей таких модуляторов.

Пример 3. Гемагглютинация эритроцитов мыши, экспрессирующих гуманизированный полипептид CD47.

[0173] Данный пример дополнительно демонстрирует, что животных, отличных от человека, (например, грызунов) модифицированных для содержания гуманизированного гена CD47 в соответствии с примером 1, можно использовать в различных анализах (например, в анализе гемагглютинации) для скрининга модуляторов CD47 (например, антител к CD47) и определения различных характеристик, таких как, например, фарамкокинетика и профили безопасности. В данном примере несколько антител к CD47 подвергают скринингу на эритроцитах (RBC) мыши, которые экспрессируют гуманизированный полипептид CD47, описанный в данном документе, для определения концентрации антитела, которая стимулирует гемагглютинацию.

[0174] Вкратце, RBC от мышей дикого типа и гуманизированных по CD47 мышей (n=2) получали, как описано в примере 2. Двадцать (20) мкл антитела к CD47 (при 5-кратном серийном разведении) добавляли в лунки 1-12 96-луночного планшета с V-образным дном, а затем добавляли 80 мкл 0,5% RBC мыши во все лунки планшета. Планшет осторожно постукивали для перемешивания и инкубировали при комнатной температуре (24-27°С) в течение 30 минут. Конечная точка агглютинации наблюдалась визуально (т.е. RBC оседали на дно в отрицательных образцах, тогда как в положительных образцах RBC агглютинировали). Иллюстративные результаты показаны на фигуре 5 с прямоугольными рамками, обводящими лунки, которые демонстрируют гемагглютинацию.

[0175] Как показано на фигуре 5, только лектин вызывал агглютинацию у мышей дикого типа. Однако два антитела к CD47 (Ab Е и Ab С) в дополнение к лектину индуцировали агглюцинацию RBC от двух гуманизированных по CD47 грызунов, полученных в соответствии с примером 1. Концентрация, при которой эти два антитела индуцировали агглютинацию, начиналась с 11 нМ. Вместе взятый, данный пример демонстрирует, что животных, отличных от человека, (например, грызунов) сконструированных для содержания гуманизированного гена CD47, описанных в данном документе, можно использовать для оценки одного или более свойств (например, гемагглютинации) модуляторов CD47 (например, антител к CD47).

Пример 4. Фармакокинетические параметры клиренса модуляторов CD47 у гуманизированных по CD47 грызунов.

[0176] Данный пример иллюстрирует способ оценки фармакокинетических параметров клиренса модуляторов CD47 (например, антител к CD47) у животных, отличных от человека, (например, грызунов) модифицированных для содержания гуманизированного гена CD47 в соответствии с примером 1. В данном примере грызунам дикого типа и гуманизированным по CD47 (например мышам) вводили антитела к CD47 и определяли уровни антител в сыворотке с использованием анализа ELISA.

[0177] Вкратце, мышам дикого типа (n=5) или гомозиготным по гуманизированному CD47 (n=5; как описано выше) вводили четыре антитела к CD47 (Ab F, Ab G, Ab Н и Ab I) и антитело-IgG4 изотипического контроля (IgG4). Генетическое происхождение мышей представляло собой 75% CD57BL/6 и 25% 129Sv. Каждое антитело тестировали на пяти гуманизированных по CD47 грызунах. Все антитела вводили подкожно в дозе 50 мг/кг. Один предварительный образец крови отбирали за день до введения антитела (день 0). Образцы крови после инъекции отбирали через 6 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней и 14 дней. Сывороточные фракции из образцов крови разделяли и подвергали общему анализу на антитела человека с использованием иммунологического анализа ELISA.

[0178] Вкратце, козьим поликлональным антителом к IgG человека (Jackson ImmunoResearch) покрывали 96-луночные планшеты для захвата тестируемых антител человека в сыворотке крови, а затем антитела, связанные с подложкой планшета, выявляли с помощью козьего поликлонального антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch), и субстрата ТМВ (BD Pharmingen). Образцы сыворотки крови представляли собой шестикратные серийные разведения, а эталонные стандарты соответствующих антител представляли собой 12-кратные серийные разведения дозы. Концентрации лекарственного антитела в сыворотке крови рассчитывали на основе калибровочной кривой, построенной с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Иллюстративные результаты показаны на фигуре 6 и в таблице 6.

[0179] Данные демонстрируют, что антитела, вводимые мышам дикого типа и гуманизированным мышам, описанным в данном документе, хорошо переносились. Вместе взятый, данный пример демонстрирует, что животных, отличных от человека, по настоящему изобретению, можно использовать для оценки одного или более фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47 (например, антитела к CD47), таких как, например, уровни циркулирующего лекарственного средства. Более того, описанных в данном документе животных, отличных от человека, можно использовать для оценки токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на CD47, путем определения побочных эффектов после введения.

Пример 5. Фармакокинетические профили модуляторов CD47 у гуманизированных по CD47/SIRPα грызунов.

[0180] Данный пример иллюстрирует способ оценки фармакокинетических параметров клиренса модуляторов CD47 (например, антител к CD47) у животных, отличных от человека, (например, грызунов) модифицированных для содержания гуманизированных генов CD47 (в соответствии с примером 1) и SIRPα. В частности, гуманизированных по CD47 грызунов, описанных в данном документе, модифицировали для дополнительного содержания гуманизированного гена SIRPα, который содержит эндогенную часть и человеческую часть, где человеческая часть кодирует внеклеточный домен белка SIRPα человека (например, аминокислоты 28-362 белка SIRPα человека) и где эндогенная часть кодирует внутриклеточный домен эндогенного белка SIRPα (например, аминокислоты, кодирующие трансмембранную и внутриклеточную части белка SIRPα мыши), как описано в PCT/US 14/56910, поданной 23 сентября 2014 г., которая включена в данный документ посредством ссылки. Дважды гуманизированных по CD47/SIRPα мышей получали путем скрещивания мышей, гуманизированных по SIRPα, с мышами, гуманизированными по CD47. В данном примере дважды гуманизированным по CD47/SIRPα грызунам (например, мышам) вводили различные антитела к CD47 и определяли их соответствующие фармакокинетические профили.

[0181] Вкратце, группам мышей дикого типа (n=5) и гомозиготным по гуманизированным генам CD47 и SIRPα (CD47^hu/huSIRPα^hu/hu; n=5 на группу) вводили выбранные антитела к CD47 и антитело-IgG4 изотопического контроля (hIgG4s). Генетическое происхождение мышей представляло собой 75% CD57BL/6 и 25% 129Sv. Все антитела вводили в одной подкожной дозе 50 мг/кг. Один предварительный образец крови отбирали за день до введения антитела (день 0). Образцы крови после инъекции отбирали через 6 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней и 10 дней. Сывороточные фракции из образцов крови разделяли и подвергали общему анализу на антитела человека с использованием иммунологического анализа ELISA (описано выше). Кроме того, уровни гематокрита измеряли через 6 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней и 10 дней, и по мере необходимости проводили анализ мочи (через 6 часов и когда цвет мочи отклонялся от желтого цвета) для определения количества эритроцитов. Иллюстративные результаты показаны на фигурах 7-9.

[0182] Как показано на фигурах 7 и 8, все антитела к CD47 демонстрировали опосредованный мишенью клиренс у мышей CD47^hu/huSIRPα^hu/hu и, в частности, многие демонстрировали сходные фармакокинетические профили. Кроме того, моновалентный вариант одного антитела к CD47 (Ab F) демонстрировал большую биодоступность, чем его бивалентный эквивалент (фигура 8). Авторы настоящего изобретения наблюдали сходные фармакокинетические профили для данных антител в многочисленных экспериментах с гуманизированными по CD47 и дважды гуманизированными животными (т.е. мышами CD47^hu/huSIRPα^hu/hu).

[0183] Ab J оказывало меньшее воздействие на уровни гематокрита, чем другие протестированные антитела к CD47 (Ab F, Ab G, Ab I и т.д.) и сопоставимые изменения уровней гематокрита относительно контроля (hIgG4s) у мышей CD47^hu/huSIRPα^hu/hu. Измерения гематокрита в дни 2-4 показывали наибольшее падение относительно нормальных диапазонов (~38,5-45,1%), что охватывало группы с введением Ab F, G и I. В частности, моновалентная форма Ab F демонстрировала замедленное понижающее воздействие на гематокрит по сравнению с другими протестированными антителами. Авторы настоящего изобретения объяснили, что различия в уровнях гематокрита среди различных групп лечения могут быть связаны с различием в эпитопе, распознаваемом различными антителами. Кроме того, мыши, которым вводили выбранные антитела к CD47, демонстрировали положительные тесты на определение уровня гема в моче через 6 часов. Например, в каждой из групп лечения с Ab J и Ab F была одна мышь, положительная на гем в день 1, тогда как все другие временные точки были отрицательными. Никакой значительной потери массы тела (>20%) не наблюдалось ни в одной группе лечения.

[0184] Вместе взятый, данный пример демонстрирует, что животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки фармакокинетических свойств и/или профилей одного или более лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на CD47 (например, одного или более антител к CD47), таких как, например, уровни циркулирующего лекарственного средства. Более того, животных, отличных от человека, описанных в данном документе, сконструированных для дополнительного содержания других гуманизированных генов (например, гуманизированного SIRPα), можно использовать для оценки опосредованного мишенью клиренса одного или более лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на CD47.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0185] При наличии описанных таким образом некоторых аспектов по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения, модификации и улучшения без труда придут на ум специалистам в данной области. Подразумевается, что такие изменения, модификации и улучшения являются частью настоящего раскрытия, и подразумевается, что они находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, вышеприведенные описание и графические материалы представлены исключительно в качестве примера, и настоящее изобретение подробно описано в нижеследующей формуле изобретения.

[0186] Порядковые термины, такие как «первый», «второй», «третий» и т.д., используемые в формуле изобретения для модификации элемента формулы изобретения, сами по себе не означают какой-либо приоритет, предшествование или порядок расположения одного элемента формулы изобретения перед другим или временной порядок, в котором осуществляют действия способа, но используются исключительно в качестве отметок для проведения различий между одним элементом формулы изобретения, имеющим определенное название, и другим элементом, имеющим такое же название (за исключением используемого порядкового термина), для проведения различий между элементами формулы изобретения.

[0187] Формы единственного числа, используемые в данном документе в описании и формуле изобретения, если четко не указано противоположное, следует понимать как охватывающие определяемые объекты в форме множественного числа. Признаки, раскрытые в пунктах формулы изобретения или частях описания, в которых содержатся «или» между одним или более членами группы, считаются охваченными, если один, более одного или все члены группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в них или иным образом имеют отношение к ним, если не указано противоположное или иное не очевидно из контекста. Настоящее изобретение охватывает варианты осуществления, в которых только один член группы присутствует в указанном продукте или способе, используется в них или иным образом имеет отношение к ним. Настоящее изобретение также охватывает варианты осуществления, в которых более одного или все члены группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в них или иным образом имеют отношение к ним. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения входят в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же основного пункта формулы изобретения (или, в зависимости от того, что применимо, любого другого пункта формулы изобретения), если не указано иное или если среднему специалисту в данной области не будет очевидным возникновение противоречия или несоответствия. В тех случаях, когда элементы представлены в виде перечней (например, в виде группы Маркуша или в аналогичном формате), следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа элементов, и любой(любые) элемент(элементы) можно исключить из группы. Следует понимать, что, как правило, в тех случаях, когда настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения рассматриваются как включающие конкретные элементы, признаки и т.д., определенные варианты осуществления настоящего изобретения или аспектов настоящего изобретения включают или включают главным образом такие элементы, признаки и т.д. В целях простоты эти варианты осуществления не были в каждом случае специально недвусмысленно изложены в данном документе. Также следует понимать, что любой вариант осуществления или аспект настоящего изобретения может быть явным образом исключен из формулы изобретения независимо от упоминания конкретного исключения в описании.

[0188] Специалистам в данной области будут понятны типичные среднеквадратические отклонения или ошибки, присущие значениям, получаемым в анализах или других процессах, описанных в данном документе.

[0189] Публикации, веб-сайты и другие справочные материалы, упоминаемые в данном документе для описания предпосылок настоящего изобретения и для предоставления дополнительных подробностей, относящихся к его практическому осуществлению, включены в данный документ посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.

<120> ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ИМЕЮЩИЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ГЕН КЛАСТЕРА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ 47

<130> 32584 (10108WO01)

<140>

<141>

<150> 62/087992

<151> 2014-12-05

<160> 36

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 5591

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60

gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120

gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180

cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240

cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300

tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360

cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420

tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480

gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540

tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600

agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660

aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720

atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780

cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840

actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900

accgcacggc cttcaacact gaccaaggat cagcctgttc ttacgaggag gagaaaggag 960

gttgcaaatt agtttcgtgg ttttctccaa atgaaaagat cctcattgtt attttcccaa 1020

ttttggctat actcctgttc tggggaaagt ttggtatttt aacactcaaa tataaatcca 1080

gccatacgaa taagagaatc attctgctgc tcgttgccgg gctggtgctc acagtcatcg 1140

tggttgttgg agccatcctt ctcatcccag gagaaaagcc cgtgaagaat gcttctggac 1200

ttggcctcat tgtaatctct acggggatat taatactact tcagtacaat gtgtttatga 1260

cagcttttgg aatgacctct ttcaccattg ccatattgat cactcaagtg ctgggctacg 1320

tccttgcttt ggtcgggctg tgtctctgca tcatggcatg tgagccagtg cacggccccc 1380

ttttgatttc aggtttgggg atcatagctc tagcagaact acttggatta gtttatatga 1440

agtttgtcga ataggtgaag ggaagtgacg gactgtaact tggaagtcag aaatggaaga 1500

atacagttgt ctaagcacca ggtcttcacg actcacagct ggaaggaaca gacaacagta 1560

actgacttcc atccaggaaa acatgtcaca taaatgatta ctaagtttat attcaaagca 1620

gctgtacttt acataataaa aaaaatatga tgtgctgtgt aaccaattgg aatcccattt 1680

ttctattgtt tctactcaac taggggcaaa cgtttcaggg gcaacttcca agaatgatgc 1740

ttgttagatc ctagagtctc tgaacactga gtttaaattg attccgagtg agactcgcca 1800

agcactaacc tgagggttag ttacccagag atacctatga aaaacagtgg tatccagcaa 1860

gccttagtaa actcaggttg ccagcagctt tgccacttcc gctgctagct gaataacaag 1920

actgccactt ctgggtcata gtgatagaga ctgaagtaga aaaacgaatg tggttgggca 1980

aatcccgtgt ggcccctctg tgtgctatga tattgatggc actggtgtct tcattcttgg 2040

gggttgccat cattcacaca cacccctttg acatacagtg caccccagtt ttgaatacat 2100

tttttttgca ccctgtcccg ttctgctact ttgatttgcg ttatgatata tatatatata 2160

tataatacct tttctcctct ttaaacatgg tcctgtgaca caatagtcag ttgcagaaag 2220

gagccagact tattcgcaaa gcactgtgct caaactcttc agaaaaaaag gaaaaaaaaa 2280

aaaagctata gttgtaacat atgtattcca gacctctggt ttaaaggcaa aagaaaaaaa 2340

atctacagtg tttcttctca tgttttctga tcggaggcat gacaaagcaa gactgaaatc 2400

tgaactgtgt ctcctgcatg gcaacacgtg tctccgtcag gccctcgcaa ggcccgggga 2460

gggggttcta cgcctcttgt ctctttgttg catgctgaac actcatcgcc ttcctactgt 2520

atcctgcctc ctgcagcctc cctcttcctc ctcctcttcc tcttcctcct cttcctcctc 2580

ctcctcctct tcctccaagt ttgaaaggtc aaacaaaact accacattcc ctacccagtt 2640

agaagaaaac caccgtcctg acagttgtga tcgcatggag tacttttaga ttattagcac 2700

ctgtttttac ctcgtttgtg ggcgtgtttg tatgtgcaca tgtatgaagt cggcacatgc 2760

accttctgta tgggcagagg cgtggcatct acagaagagc agatgccaac tttgtgcttt 2820

tagtgaatac attaaaaaaa aaaaaccaac ggtccttatt gagtggaatt ctatttgatg 2880

caaatatttg agctctttaa gactttaaaa ctagataatg tgccaagctt ttaggactgc 2940

tcaccagtgc cctctgaaga aacaccagta ctttttcctg tttgtgtaat aaaggcatat 3000

ttgtatttgt gtttgcatca ctaatggtta tttcttctta gtccactgaa tgtttccatg 3060

tgcctctcgt atgccaaact ttttgtcatc tttcatgtgg ggaccaaatg gtttgtctgt 3120

ggcaaaccta aacctatgac ctgctgaggc ctctcagaaa actgaccaca gtaccaagat 3180

agtacttcgc aaagaaaagt aggttccctc cctggttttg tagctgtcgc caatattagc 3240

gtaattccaa ggagctgaac gcctttatat aaatctgatg gcacctgatg cttttagttc 3300

tgaaaatatt tacactcgga tcatgttgtt gatgacttaa acaaagtttt gatgaagaga 3360

gcaaaaaaaa agcaggtgga tttggaacag tttcagggtt ttttttgttt tttgtttttt 3420

gtttttgttt tttttttttt atttttgttt ttctgttctc tgttagaaaa gtcaggtgtt 3480

ctctgtcagg ctatctttat agtcaatttt ttttacgaac taaagtagta ccttttaata 3540

tgtagtcaac gcccctctgc tcggggttca gttttgggtc ttaaccagct gtcatgttct 3600

ctatgctgcc tgccacttga ggcactgagt gccctagaca gtcccatcgg tggtagccag 3660

ggaaacgaaa gacgaactca actcttgctc ctaataatca actctctgta tgaaggatgg 3720

cagcattaag agtcctcctg cctgggcatt attgggccag ttcaccctct ttaaatcaaa 3780

cccgcagtgg ctcccagttc tcgtcccatc agatttaaat tgctaacagt atggggggca 3840

ccacgcatct gttttgtccc acaatgcgct tttctctccc aaatcccgat ttctgctgtc 3900

atagcctcta ttcaattttt atttattgtc tgccctccac ttatacaatc gtagagagca 3960

atgccatttg tcactttctg caacagtttt ttgagccttt atggctgaat cccatttttc 4020

ttctctttca aactgtttgc tccattgctc ctcccgcacg gctgtccgta cagtcatccc 4080

atccatctgg gggcctcttt catctctcac ccttcctggt gcttcgtgga tctctgctta 4140

cctctgtggg tttttttttt tttttttgac ttattcttct cactggactt taagattact 4200

tccacagcga aagtgctgcc tcccttttct gcccgcagtg ttctgcgtac tttagatact 4260

actcagtgct gacatttgat ggcaaaagtt gcctgcactt aaatttctct ttttaatagg 4320

gtgaactaga gttggagttt ttttctcttt tttctctttt ctctctctct ctctctctct 4380

ctctctctct ctctctctct ctccctccct ccctccctcc ctccctccct ccctctctct 4440

ctctttttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 4500

ttttgacaaa tctcacaggc tttgagaatt ataaaaggtg acagttcacc tgaaaatcac 4560

aggtctggtc tgtttaaatt gttgagaaat atccgattaa aagtcttgtg gctgtgtcct 4620

aataggctct ctttcaggac gttgtagtca atagagtggc tgaaccatac ttgagtttat 4680

aaagctcaaa aactgatgca cccactctgc tattatcgtg ttagtaagag ttcagctgta 4740

tatcattgtc taggtttatc ttgtcctaca gtgggtattc aaatatggcc accagaggat 4800

atgtgtaaat ataagcacct gtatttgcct gttgttgaga actggaggga aaacaaaaaa 4860

tgtctggcaa ccctttgcct ttttaaccgt aattaattga cagtttattt agagataaga 4920

gttttcaaaa atctcttaac tgccacaacc cacagagggt cttgttttgc catcttcagt 4980

ggctcacaga tatgatccaa gttaacttga aagagatgag cagtacccag gaaattgtcc 5040

tgcctttaac tctggctgtc cttaattatg actgtttaat gctgaatttt ccatccgtct 5100

agtgtttgag ggtaaagaaa agcctttttt aaataagtat ttctgtaaaa cggcatcggt 5160

gggatcttct gtgttgctat cacgggtgaa agagggaaac atttcttatt tttattaagc 5220

agagcattat ttacagaaag ccattgttga gaattagttc ccacatcata taaatatcca 5280

ttaaccattc taaattgtaa gagaactcca gtgttgctat gcacaaggaa ctctcctggg 5340

ggcctttttt tgcatagcaa ttaaaggtat gctatttgtc agtagccatt ttttgcagtg 5400

atttaaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccctta aaggtttttt ttttatgtat 5460

taaatcaatt tatcactgtt tgaagctttg aatacctgca atctttgcca agatactttt 5520

ttatttaaaa aaataactgt gtaaatatta ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac 5580

attttaagct a 5591

<210> 2

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser

20 25 30

Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala

35 40 45

Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr

50 55 60

Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn

65 70 75 80

Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys

100 105 110

Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys

115 120 125

Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu

145 150 155 160

Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp

165 170 175

Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn

180 185 190

Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile

195 200 205

Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys

210 215 220

Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile

225 230 235 240

Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe

245 250 255

Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu

260 265 270

Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro

275 280 285

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly

290 295 300

Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu

305 310

<210> 3

<211> 5560

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 3

gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60

gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120

gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180

cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240

cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300

tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360

cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420

tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480

gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540

tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600

agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660

aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720

atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780

cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840

actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900

accgcacggt ttcgtggttt tctccaaatg aaaagatcct cattgttatt ttcccaattt 960

tggctatact cctgttctgg ggaaagtttg gtattttaac actcaaatat aaatccagcc 1020

atacgaataa gagaatcatt ctgctgctcg ttgccgggct ggtgctcaca gtcatcgtgg 1080

ttgttggagc catccttctc atcccaggag aaaagcccgt gaagaatgct tctggacttg 1140

gcctcattgt aatctctacg gggatattaa tactacttca gtacaatgtg tttatgacag 1200

cttttggaat gacctctttc accattgcca tattgatcac tcaagtgctg ggctacgtcc 1260

ttgctttggt cgggctgtgt ctctgcatca tggcatgtga gccagtgcac ggcccccttt 1320

tgatttcagg tttggggatc atagctctag cagaactact tggattagtt tatatgaagt 1380

ttgtcgcttc caaccagagg actatccaac ctcctaggaa taggtgaagg gaagtgacgg 1440

actgtaactt ggaagtcaga aatggaagaa tacagttgtc taagcaccag gtcttcacga 1500

ctcacagctg gaaggaacag acaacagtaa ctgacttcca tccaggaaaa catgtcacat 1560

aaatgattac taagtttata ttcaaagcag ctgtacttta cataataaaa aaaatatgat 1620

gtgctgtgta accaattgga atcccatttt tctattgttt ctactcaact aggggcaaac 1680

gtttcagggg caacttccaa gaatgatgct tgttagatcc tagagtctct gaacactgag 1740

tttaaattga ttccgagtga gactcgccaa gcactaacct gagggttagt tacccagaga 1800

tacctatgaa aaacagtggt atccagcaag ccttagtaaa ctcaggttgc cagcagcttt 1860

gccacttccg ctgctagctg aataacaaga ctgccacttc tgggtcatag tgatagagac 1920

tgaagtagaa aaacgaatgt ggttgggcaa atcccgtgtg gcccctctgt gtgctatgat 1980

attgatggca ctggtgtctt cattcttggg ggttgccatc attcacacac acccctttga 2040

catacagtgc accccagttt tgaatacatt ttttttgcac cctgtcccgt tctgctactt 2100

tgatttgcgt tatgatatat atatatatat ataatacctt ttctcctctt taaacatggt 2160

cctgtgacac aatagtcagt tgcagaaagg agccagactt attcgcaaag cactgtgctc 2220

aaactcttca gaaaaaaagg aaaaaaaaaa aaagctatag ttgtaacata tgtattccag 2280

acctctggtt taaaggcaaa agaaaaaaaa tctacagtgt ttcttctcat gttttctgat 2340

cggaggcatg acaaagcaag actgaaatct gaactgtgtc tcctgcatgg caacacgtgt 2400

ctccgtcagg ccctcgcaag gcccggggag ggggttctac gcctcttgtc tctttgttgc 2460

atgctgaaca ctcatcgcct tcctactgta tcctgcctcc tgcagcctcc ctcttcctcc 2520

tcctcttcct cttcctcctc ttcctcctcc tcctcctctt cctccaagtt tgaaaggtca 2580

aacaaaacta ccacattccc tacccagtta gaagaaaacc accgtcctga cagttgtgat 2640

cgcatggagt acttttagat tattagcacc tgtttttacc tcgtttgtgg gcgtgtttgt 2700

atgtgcacat gtatgaagtc ggcacatgca ccttctgtat gggcagaggc gtggcatcta 2760

cagaagagca gatgccaact ttgtgctttt agtgaataca ttaaaaaaaa aaaaccaacg 2820

gtccttattg agtggaattc tatttgatgc aaatatttga gctctttaag actttaaaac 2880

tagataatgt gccaagcttt taggactgct caccagtgcc ctctgaagaa acaccagtac 2940

tttttcctgt ttgtgtaata aaggcatatt tgtatttgtg tttgcatcac taatggttat 3000

ttcttcttag tccactgaat gtttccatgt gcctctcgta tgccaaactt tttgtcatct 3060

ttcatgtggg gaccaaatgg tttgtctgtg gcaaacctaa acctatgacc tgctgaggcc 3120

tctcagaaaa ctgaccacag taccaagata gtacttcgca aagaaaagta ggttccctcc 3180

ctggttttgt agctgtcgcc aatattagcg taattccaag gagctgaacg cctttatata 3240

aatctgatgg cacctgatgc ttttagttct gaaaatattt acactcggat catgttgttg 3300

atgacttaaa caaagttttg atgaagagag caaaaaaaaa gcaggtggat ttggaacagt 3360

ttcagggttt tttttgtttt ttgttttttg tttttgtttt ttttttttta tttttgtttt 3420

tctgttctct gttagaaaag tcaggtgttc tctgtcaggc tatctttata gtcaattttt 3480

tttacgaact aaagtagtac cttttaatat gtagtcaacg cccctctgct cggggttcag 3540

ttttgggtct taaccagctg tcatgttctc tatgctgcct gccacttgag gcactgagtg 3600

ccctagacag tcccatcggt ggtagccagg gaaacgaaag acgaactcaa ctcttgctcc 3660

taataatcaa ctctctgtat gaaggatggc agcattaaga gtcctcctgc ctgggcatta 3720

ttgggccagt tcaccctctt taaatcaaac ccgcagtggc tcccagttct cgtcccatca 3780

gatttaaatt gctaacagta tggggggcac cacgcatctg ttttgtccca caatgcgctt 3840

ttctctccca aatcccgatt tctgctgtca tagcctctat tcaattttta tttattgtct 3900

gccctccact tatacaatcg tagagagcaa tgccatttgt cactttctgc aacagttttt 3960

tgagccttta tggctgaatc ccatttttct tctctttcaa actgtttgct ccattgctcc 4020

tcccgcacgg ctgtccgtac agtcatccca tccatctggg ggcctctttc atctctcacc 4080

cttcctggtg cttcgtggat ctctgcttac ctctgtgggt tttttttttt ttttttgact 4140

tattcttctc actggacttt aagattactt ccacagcgaa agtgctgcct cccttttctg 4200

cccgcagtgt tctgcgtact ttagatacta ctcagtgctg acatttgatg gcaaaagttg 4260

cctgcactta aatttctctt tttaataggg tgaactagag ttggagtttt tttctctttt 4320

ttctcttttc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tccctccctc 4380

cctccctccc tccctccctc cctctctctc tctttttctt tctttctttc tttctttctt 4440

tctttctttc tttctttctt tctttctttt tttgacaaat ctcacaggct ttgagaatta 4500

taaaaggtga cagttcacct gaaaatcaca ggtctggtct gtttaaattg ttgagaaata 4560

tccgattaaa agtcttgtgg ctgtgtccta ataggctctc tttcaggacg ttgtagtcaa 4620

tagagtggct gaaccatact tgagtttata aagctcaaaa actgatgcac ccactctgct 4680

attatcgtgt tagtaagagt tcagctgtat atcattgtct aggtttatct tgtcctacag 4740

tgggtattca aatatggcca ccagaggata tgtgtaaata taagcacctg tatttgcctg 4800

ttgttgagaa ctggagggaa aacaaaaaat gtctggcaac cctttgcctt tttaaccgta 4860

attaattgac agtttattta gagataagag ttttcaaaaa tctcttaact gccacaaccc 4920

acagagggtc ttgttttgcc atcttcagtg gctcacagat atgatccaag ttaacttgaa 4980

agagatgagc agtacccagg aaattgtcct gcctttaact ctggctgtcc ttaattatga 5040

ctgtttaatg ctgaattttc catccgtcta gtgtttgagg gtaaagaaaa gcctttttta 5100

aataagtatt tctgtaaaac ggcatcggtg ggatcttctg tgttgctatc acgggtgaaa 5160

gagggaaaca tttcttattt ttattaagca gagcattatt tacagaaagc cattgttgag 5220

aattagttcc cacatcatat aaatatccat taaccattct aaattgtaag agaactccag 5280

tgttgctatg cacaaggaac tctcctgggg gccttttttt gcatagcaat taaaggtatg 5340

ctatttgtca gtagccattt tttgcagtga tttaaagacc aaagttgttt tacagctgtg 5400

ttacccttaa aggttttttt tttatgtatt aaatcaattt atcactgttt gaagctttga 5460

atacctgcaa tctttgccaa gatacttttt tatttaaaaa aataactgtg taaatattac 5520

cctgtaatat tatatatact taataaaaca ttttaagcta 5560

<210> 4

<211> 303

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 4

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser

20 25 30

Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala

35 40 45

Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr

50 55 60

Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn

65 70 75 80

Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys

100 105 110

Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys

115 120 125

Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val

130 135 140

Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile

145 150 155 160

Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala

180 185 190

Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu

195 200 205

Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn

210 215 220

Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu

225 230 235 240

Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu

245 250 255

Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly

260 265 270

Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys

275 280 285

Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn Arg

290 295 300

<210> 5

<211> 5648

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 5

gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60

gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120

gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180

cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240

cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300

tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360

cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420

tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480

gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540

tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600

agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660

aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720

atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780

cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840

actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900

accgcacggc cttcaacact gaccaaggat cagcctgttc ttacgaggag gagaaaggag 960

gttgcaaatt agtttcgtgg ttttctccaa atgaaaagat cctcattgtt attttcccaa 1020

ttttggctat actcctgttc tggggaaagt ttggtatttt aacactcaaa tataaatcca 1080

gccatacgaa taagagaatc attctgctgc tcgttgccgg gctggtgctc acagtcatcg 1140

tggttgttgg agccatcctt ctcatcccag gagaaaagcc cgtgaagaat gcttctggac 1200

ttggcctcat tgtaatctct acggggatat taatactact tcagtacaat gtgtttatga 1260

cagcttttgg aatgacctct ttcaccattg ccatattgat cactcaagtg ctgggctacg 1320

tccttgcttt ggtcgggctg tgtctctgca tcatggcatg tgagccagtg cacggccccc 1380

ttttgatttc aggtttgggg atcatagctc tagcagaact acttggatta gtttatatga 1440

agtttgtcgc ttccaaccag aggactatcc aacctcctag gaaagctgta gaggaacccc 1500

ttaacgaata ggtgaaggga agtgacggac tgtaacttgg aagtcagaaa tggaagaata 1560

cagttgtcta agcaccaggt cttcacgact cacagctgga aggaacagac aacagtaact 1620

gacttccatc caggaaaaca tgtcacataa atgattacta agtttatatt caaagcagct 1680

gtactttaca taataaaaaa aatatgatgt gctgtgtaac caattggaat cccatttttc 1740

tattgtttct actcaactag gggcaaacgt ttcaggggca acttccaaga atgatgcttg 1800

ttagatccta gagtctctga acactgagtt taaattgatt ccgagtgaga ctcgccaagc 1860

actaacctga gggttagtta cccagagata cctatgaaaa acagtggtat ccagcaagcc 1920

ttagtaaact caggttgcca gcagctttgc cacttccgct gctagctgaa taacaagact 1980

gccacttctg ggtcatagtg atagagactg aagtagaaaa acgaatgtgg ttgggcaaat 2040

cccgtgtggc ccctctgtgt gctatgatat tgatggcact ggtgtcttca ttcttggggg 2100

ttgccatcat tcacacacac ccctttgaca tacagtgcac cccagttttg aatacatttt 2160

ttttgcaccc tgtcccgttc tgctactttg atttgcgtta tgatatatat atatatatat 2220

aatacctttt ctcctcttta aacatggtcc tgtgacacaa tagtcagttg cagaaaggag 2280

ccagacttat tcgcaaagca ctgtgctcaa actcttcaga aaaaaaggaa aaaaaaaaaa 2340

agctatagtt gtaacatatg tattccagac ctctggttta aaggcaaaag aaaaaaaatc 2400

tacagtgttt cttctcatgt tttctgatcg gaggcatgac aaagcaagac tgaaatctga 2460

actgtgtctc ctgcatggca acacgtgtct ccgtcaggcc ctcgcaaggc ccggggaggg 2520

ggttctacgc ctcttgtctc tttgttgcat gctgaacact catcgccttc ctactgtatc 2580

ctgcctcctg cagcctccct cttcctcctc ctcttcctct tcctcctctt cctcctcctc 2640

ctcctcttcc tccaagtttg aaaggtcaaa caaaactacc acattcccta cccagttaga 2700

agaaaaccac cgtcctgaca gttgtgatcg catggagtac ttttagatta ttagcacctg 2760

tttttacctc gtttgtgggc gtgtttgtat gtgcacatgt atgaagtcgg cacatgcacc 2820

ttctgtatgg gcagaggcgt ggcatctaca gaagagcaga tgccaacttt gtgcttttag 2880

tgaatacatt aaaaaaaaaa aaccaacggt ccttattgag tggaattcta tttgatgcaa 2940

atatttgagc tctttaagac tttaaaacta gataatgtgc caagctttta ggactgctca 3000

ccagtgccct ctgaagaaac accagtactt tttcctgttt gtgtaataaa ggcatatttg 3060

tatttgtgtt tgcatcacta atggttattt cttcttagtc cactgaatgt ttccatgtgc 3120

ctctcgtatg ccaaactttt tgtcatcttt catgtgggga ccaaatggtt tgtctgtggc 3180

aaacctaaac ctatgacctg ctgaggcctc tcagaaaact gaccacagta ccaagatagt 3240

acttcgcaaa gaaaagtagg ttccctccct ggttttgtag ctgtcgccaa tattagcgta 3300

attccaagga gctgaacgcc tttatataaa tctgatggca cctgatgctt ttagttctga 3360

aaatatttac actcggatca tgttgttgat gacttaaaca aagttttgat gaagagagca 3420

aaaaaaaagc aggtggattt ggaacagttt cagggttttt tttgtttttt gttttttgtt 3480

tttgtttttt tttttttatt tttgtttttc tgttctctgt tagaaaagtc aggtgttctc 3540

tgtcaggcta tctttatagt caattttttt tacgaactaa agtagtacct tttaatatgt 3600

agtcaacgcc cctctgctcg gggttcagtt ttgggtctta accagctgtc atgttctcta 3660

tgctgcctgc cacttgaggc actgagtgcc ctagacagtc ccatcggtgg tagccaggga 3720

aacgaaagac gaactcaact cttgctccta ataatcaact ctctgtatga aggatggcag 3780

cattaagagt cctcctgcct gggcattatt gggccagttc accctcttta aatcaaaccc 3840

gcagtggctc ccagttctcg tcccatcaga tttaaattgc taacagtatg gggggcacca 3900

cgcatctgtt ttgtcccaca atgcgctttt ctctcccaaa tcccgatttc tgctgtcata 3960

gcctctattc aatttttatt tattgtctgc cctccactta tacaatcgta gagagcaatg 4020

ccatttgtca ctttctgcaa cagttttttg agcctttatg gctgaatccc atttttcttc 4080

tctttcaaac tgtttgctcc attgctcctc ccgcacggct gtccgtacag tcatcccatc 4140

catctggggg cctctttcat ctctcaccct tcctggtgct tcgtggatct ctgcttacct 4200

ctgtgggttt tttttttttt ttttgactta ttcttctcac tggactttaa gattacttcc 4260

acagcgaaag tgctgcctcc cttttctgcc cgcagtgttc tgcgtacttt agatactact 4320

cagtgctgac atttgatggc aaaagttgcc tgcacttaaa tttctctttt taatagggtg 4380

aactagagtt ggagtttttt tctctttttt ctcttttctc tctctctctc tctctctctc 4440

tctctctctc tctctctctc cctccctccc tccctccctc cctccctccc tctctctctc 4500

tttttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttttt 4560

tgacaaatct cacaggcttt gagaattata aaaggtgaca gttcacctga aaatcacagg 4620

tctggtctgt ttaaattgtt gagaaatatc cgattaaaag tcttgtggct gtgtcctaat 4680

aggctctctt tcaggacgtt gtagtcaata gagtggctga accatacttg agtttataaa 4740

gctcaaaaac tgatgcaccc actctgctat tatcgtgtta gtaagagttc agctgtatat 4800

cattgtctag gtttatcttg tcctacagtg ggtattcaaa tatggccacc agaggatatg 4860

tgtaaatata agcacctgta tttgcctgtt gttgagaact ggagggaaaa caaaaaatgt 4920

ctggcaaccc tttgcctttt taaccgtaat taattgacag tttatttaga gataagagtt 4980

ttcaaaaatc tcttaactgc cacaacccac agagggtctt gttttgccat cttcagtggc 5040

tcacagatat gatccaagtt aacttgaaag agatgagcag tacccaggaa attgtcctgc 5100

ctttaactct ggctgtcctt aattatgact gtttaatgct gaattttcca tccgtctagt 5160

gtttgagggt aaagaaaagc cttttttaaa taagtatttc tgtaaaacgg catcggtggg 5220

atcttctgtg ttgctatcac gggtgaaaga gggaaacatt tcttattttt attaagcaga 5280

gcattattta cagaaagcca ttgttgagaa ttagttccca catcatataa atatccatta 5340

accattctaa attgtaagag aactccagtg ttgctatgca caaggaactc tcctgggggc 5400

ctttttttgc atagcaatta aaggtatgct atttgtcagt agccattttt tgcagtgatt 5460

taaagaccaa agttgtttta cagctgtgtt acccttaaag gttttttttt tatgtattaa 5520

atcaatttat cactgtttga agctttgaat acctgcaatc tttgccaaga tactttttta 5580

tttaaaaaaa taactgtgta aatattaccc tgtaatatta tatatactta ataaaacatt 5640

ttaagcta 5648

<210> 6

<211> 331

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser

20 25 30

Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala

35 40 45

Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr

50 55 60

Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn

65 70 75 80

Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys

100 105 110

Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys

115 120 125

Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu

145 150 155 160

Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp

165 170 175

Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn

180 185 190

Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile

195 200 205

Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys

210 215 220

Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile

225 230 235 240

Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe

245 250 255

Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu

260 265 270

Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro

275 280 285

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly

290 295 300

Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro

305 310 315 320

Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu

325 330

<210> 7

<211> 5618

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 7

gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60

gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120

gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180

cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240

cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300

tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360

cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420

tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480

gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540

tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600

agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660

aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720

atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780

cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840

actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900

accgcacggt ttcgtggttt tctccaaatg aaaagatcct cattgttatt ttcccaattt 960

tggctatact cctgttctgg ggaaagtttg gtattttaac actcaaatat aaatccagcc 1020

atacgaataa gagaatcatt ctgctgctcg ttgccgggct ggtgctcaca gtcatcgtgg 1080

ttgttggagc catccttctc atcccaggag aaaagcccgt gaagaatgct tctggacttg 1140

gcctcattgt aatctctacg gggatattaa tactacttca gtacaatgtg tttatgacag 1200

cttttggaat gacctctttc accattgcca tattgatcac tcaagtgctg ggctacgtcc 1260

ttgctttggt cgggctgtgt ctctgcatca tggcatgtga gccagtgcac ggcccccttt 1320

tgatttcagg tttggggatc atagctctag cagaactact tggattagtt tatatgaagt 1380

ttgtcgcttc caaccagagg actatccaac ctcctaggaa agctgtagag gaacccctta 1440

acgcatttaa agagtcaaaa ggaatgatga atgacgaata ggtgaaggga agtgacggac 1500

tgtaacttgg aagtcagaaa tggaagaata cagttgtcta agcaccaggt cttcacgact 1560

cacagctgga aggaacagac aacagtaact gacttccatc caggaaaaca tgtcacataa 1620

atgattacta agtttatatt caaagcagct gtactttaca taataaaaaa aatatgatgt 1680

gctgtgtaac caattggaat cccatttttc tattgtttct actcaactag gggcaaacgt 1740

ttcaggggca acttccaaga atgatgcttg ttagatccta gagtctctga acactgagtt 1800

taaattgatt ccgagtgaga ctcgccaagc actaacctga gggttagtta cccagagata 1860

cctatgaaaa acagtggtat ccagcaagcc ttagtaaact caggttgcca gcagctttgc 1920

cacttccgct gctagctgaa taacaagact gccacttctg ggtcatagtg atagagactg 1980

aagtagaaaa acgaatgtgg ttgggcaaat cccgtgtggc ccctctgtgt gctatgatat 2040

tgatggcact ggtgtcttca ttcttggggg ttgccatcat tcacacacac ccctttgaca 2100

tacagtgcac cccagttttg aatacatttt ttttgcaccc tgtcccgttc tgctactttg 2160

atttgcgtta tgatatatat atatatatat aatacctttt ctcctcttta aacatggtcc 2220

tgtgacacaa tagtcagttg cagaaaggag ccagacttat tcgcaaagca ctgtgctcaa 2280

actcttcaga aaaaaaggaa aaaaaaaaaa agctatagtt gtaacatatg tattccagac 2340

ctctggttta aaggcaaaag aaaaaaaatc tacagtgttt cttctcatgt tttctgatcg 2400

gaggcatgac aaagcaagac tgaaatctga actgtgtctc ctgcatggca acacgtgtct 2460

ccgtcaggcc ctcgcaaggc ccggggaggg ggttctacgc ctcttgtctc tttgttgcat 2520

gctgaacact catcgccttc ctactgtatc ctgcctcctg cagcctccct cttcctcctc 2580

ctcttcctct tcctcctctt cctcctcctc ctcctcttcc tccaagtttg aaaggtcaaa 2640

caaaactacc acattcccta cccagttaga agaaaaccac cgtcctgaca gttgtgatcg 2700

catggagtac ttttagatta ttagcacctg tttttacctc gtttgtgggc gtgtttgtat 2760

gtgcacatgt atgaagtcgg cacatgcacc ttctgtatgg gcagaggcgt ggcatctaca 2820

gaagagcaga tgccaacttt gtgcttttag tgaatacatt aaaaaaaaaa aaccaacggt 2880

ccttattgag tggaattcta tttgatgcaa atatttgagc tctttaagac tttaaaacta 2940

gataatgtgc caagctttta ggactgctca ccagtgccct ctgaagaaac accagtactt 3000

tttcctgttt gtgtaataaa ggcatatttg tatttgtgtt tgcatcacta atggttattt 3060

cttcttagtc cactgaatgt ttccatgtgc ctctcgtatg ccaaactttt tgtcatcttt 3120

catgtgggga ccaaatggtt tgtctgtggc aaacctaaac ctatgacctg ctgaggcctc 3180

tcagaaaact gaccacagta ccaagatagt acttcgcaaa gaaaagtagg ttccctccct 3240

ggttttgtag ctgtcgccaa tattagcgta attccaagga gctgaacgcc tttatataaa 3300

tctgatggca cctgatgctt ttagttctga aaatatttac actcggatca tgttgttgat 3360

gacttaaaca aagttttgat gaagagagca aaaaaaaagc aggtggattt ggaacagttt 3420

cagggttttt tttgtttttt gttttttgtt tttgtttttt tttttttatt tttgtttttc 3480

tgttctctgt tagaaaagtc aggtgttctc tgtcaggcta tctttatagt caattttttt 3540

tacgaactaa agtagtacct tttaatatgt agtcaacgcc cctctgctcg gggttcagtt 3600

ttgggtctta accagctgtc atgttctcta tgctgcctgc cacttgaggc actgagtgcc 3660

ctagacagtc ccatcggtgg tagccaggga aacgaaagac gaactcaact cttgctccta 3720

ataatcaact ctctgtatga aggatggcag cattaagagt cctcctgcct gggcattatt 3780

gggccagttc accctcttta aatcaaaccc gcagtggctc ccagttctcg tcccatcaga 3840

tttaaattgc taacagtatg gggggcacca cgcatctgtt ttgtcccaca atgcgctttt 3900

ctctcccaaa tcccgatttc tgctgtcata gcctctattc aatttttatt tattgtctgc 3960

cctccactta tacaatcgta gagagcaatg ccatttgtca ctttctgcaa cagttttttg 4020

agcctttatg gctgaatccc atttttcttc tctttcaaac tgtttgctcc attgctcctc 4080

ccgcacggct gtccgtacag tcatcccatc catctggggg cctctttcat ctctcaccct 4140

tcctggtgct tcgtggatct ctgcttacct ctgtgggttt tttttttttt ttttgactta 4200

ttcttctcac tggactttaa gattacttcc acagcgaaag tgctgcctcc cttttctgcc 4260

cgcagtgttc tgcgtacttt agatactact cagtgctgac atttgatggc aaaagttgcc 4320

tgcacttaaa tttctctttt taatagggtg aactagagtt ggagtttttt tctctttttt 4380

ctcttttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc cctccctccc 4440

tccctccctc cctccctccc tctctctctc tttttctttc tttctttctt tctttctttc 4500

tttctttctt tctttctttc tttctttttt tgacaaatct cacaggcttt gagaattata 4560

aaaggtgaca gttcacctga aaatcacagg tctggtctgt ttaaattgtt gagaaatatc 4620

cgattaaaag tcttgtggct gtgtcctaat aggctctctt tcaggacgtt gtagtcaata 4680

gagtggctga accatacttg agtttataaa gctcaaaaac tgatgcaccc actctgctat 4740

tatcgtgtta gtaagagttc agctgtatat cattgtctag gtttatcttg tcctacagtg 4800

ggtattcaaa tatggccacc agaggatatg tgtaaatata agcacctgta tttgcctgtt 4860

gttgagaact ggagggaaaa caaaaaatgt ctggcaaccc tttgcctttt taaccgtaat 4920

taattgacag tttatttaga gataagagtt ttcaaaaatc tcttaactgc cacaacccac 4980

agagggtctt gttttgccat cttcagtggc tcacagatat gatccaagtt aacttgaaag 5040

agatgagcag tacccaggaa attgtcctgc ctttaactct ggctgtcctt aattatgact 5100

gtttaatgct gaattttcca tccgtctagt gtttgagggt aaagaaaagc cttttttaaa 5160

taagtatttc tgtaaaacgg catcggtggg atcttctgtg ttgctatcac gggtgaaaga 5220

gggaaacatt tcttattttt attaagcaga gcattattta cagaaagcca ttgttgagaa 5280

ttagttccca catcatataa atatccatta accattctaa attgtaagag aactccagtg 5340

ttgctatgca caaggaactc tcctgggggc ctttttttgc atagcaatta aaggtatgct 5400

atttgtcagt agccattttt tgcagtgatt taaagaccaa agttgtttta cagctgtgtt 5460

acccttaaag gttttttttt tatgtattaa atcaatttat cactgtttga agctttgaat 5520

acctgcaatc tttgccaaga tactttttta tttaaaaaaa taactgtgta aatattaccc 5580

tgtaatatta tatatactta ataaaacatt ttaagcta 5618

<210> 8

<211> 321

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 8

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser

20 25 30

Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala

35 40 45

Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr

50 55 60

Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn

65 70 75 80

Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys

100 105 110

Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys

115 120 125

Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val

130 135 140

Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile

145 150 155 160

Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala

180 185 190

Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu

195 200 205

Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn

210 215 220

Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu

225 230 235 240

Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu

245 250 255

Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly

260 265 270

Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys

275 280 285

Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val

290 295 300

Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp

305 310 315 320

Glu

<210> 9

<211> 5021

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 9

agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg 60

cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg gcggcggctg ctgctccgga cacctgcggc 120

ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg 180

ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc 240

acgttttgta atgacactgt cgtcattcca tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac 300

actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt aaaggaagag atatttacac ctttgatgga 360

gctctaaaca agtccactgt ccccactgac tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa 420

ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg gataagagtg atgctgtctc acacacagga 480

aactacactt gtgaagtaac agaattaacc agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa 540

tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt 600

tttgctatac tcctgttctg gggacagttt ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt 660

ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc 720

attgttggag ccattctttt cgtcccaggt gaatattcat taaagaatgc tactggcctt 780

ggtttaattg tgacttctac agggatatta atattacttc actactatgt gtttagtaca 840

gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc atattggtta ttcaggtgat agcctatatc 900

ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt 960

ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa 1020

tttgtggaat aactgaagtg aagtgatgga ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa 1080

ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca 1140

agaaaagtaa ctggttgtca cctatgagac ccttacgtga ttgttagtta agtttttatt 1200

caaagcagct gtaatttagt taataaaata attatgatct atgttgtttg cccaattgag 1260

atccagtttt ttgttgttat ttttaatcaa ttaggggcaa tagtagaatg gacaatttcc 1320

aagaatgatg cctttcaggt cctagggcct ctggcctcta ggtaaccagt ttaaattggt 1380

tcagggtgat aactacttag cactgccctg gtgattaccc agagatatct atgaaaacca 1440

gtggcttcca tcaaaccttt gccaactcag gttcacagca gctttgggca gttatggcag 1500

tatggcatta gctgagaggt gtctgccact tctgggtcaa tggaataata aattaagtac 1560

aggcaggaat ttggttggga gcatcttgta tgatctccgt atgatgtgat attgatggag 1620

atagtggtcc tcattcttgg gggttgccat tcccacattc ccccttcaac aaacagtgta 1680

acaggtcctt cccagattta gggtactttt attgatggat atgttttcct tttattcaca 1740

taaccccttg aaaccctgtc ttgtcctcct gttacttgct tctgctgtac aagatgtagc 1800

accttttctc ctctttgaac atggtctagt gacacggtag caccagttgc aggaaggagc 1860

cagacttgtt ctcagagcac tgtgttcaca cttttcagca aaaatagcta tggttgtaac 1920

atatgtattc ccttcctctg atttgaaggc aaaaatctac agtgtttctt cacttctttt 1980

ctgatctggg gcatgaaaaa agcaagattg aaatttgaac tatgagtctc ctgcatggca 2040

acaaaatgtg tgtcaccatc aggccaacag gccagccctt gaatggggat ttattactgt 2100

tgtatctatg ttgcatgata aacattcatc accttcctcc tgtagtcctg cctcgtactc 2160

cccttcccct atgattgaaa agtaaacaaa acccacattt cctatcctgg ttagaagaaa 2220

attaatgttc tgacagttgt gatcgcctgg agtactttta gacttttagc attcgttttt 2280

tacctgtttg tggatgtgtg tttgtatgtg catacgtatg agataggcac atgcatcttc 2340

tgtatggaca aaggtggggt acctacagga gagcaaaggt taattttgtg cttttagtaa 2400

aaacatttaa atacaaagtt ctttattggg tggaattata tttgatgcaa atatttgatc 2460

acttaaaact tttaaaactt ctaggtaatt tgccacgctt tttgactgct caccaatacc 2520

ctgtaaaaat acgtaattct tcctgtttgt gtaataagat attcatattt gtagttgcat 2580

taataatagt tatttcttag tccatcagat gttcccgtgt gcctctttta tgccaaattg 2640

attgtcatat ttcatgttgg gaccaagtag tttgcccatg gcaaacctaa atttatgacc 2700

tgctgaggcc tctcagaaaa ctgagcatac tagcaagaca gctcttcttg aaaaaaaaaa 2760

tatgtataca caaatatata cgtatatcta tatatacgta tgtatataca cacatgtata 2820

ttcttccttg attgtgtagc tgtccaaaat aataacatat atagagggag ctgtattcct 2880

ttatacaaat ctgatggctc ctgcagcact ttttccttct gaaaatattt acattttgct 2940

aacctagttt gttactttaa aaatcagttt tgatgaaagg agggaaaagc agatggactt 3000

gaaaaagatc caagctccta ttagaaaagg tatgaaaatc tttatagtaa aattttttat 3060

aaactaaagt tgtacctttt aatatgtagt aaactctcat ttatttgggg ttcgctcttg 3120

gatctcatcc atccattgtg ttctctttaa tgctgcctgc cttttgaggc attcactgcc 3180

ctagacaatg ccaccagaga tagtggggga aatgccagat gaaaccaact cttgctctca 3240

ctagttgtca gcttctctgg ataagtgacc acagaagcag gagtcctcct gcttgggcat 3300

cattgggcca gttccttctc tttaaatcag atttgtaatg gctcccaaat tccatcacat 3360

cacatttaaa ttgcagacag tgttttgcac atcatgtatc tgttttgtcc cataatatgc 3420

tttttactcc ctgatcccag tttctgctgt tgactcttcc attcagtttt atttattgtg 3480

tgttctcaca gtgacaccat ttgtcctttt ctgcaacaac ctttccagct acttttgcca 3540

aattctattt gtcttctcct tcaaaacatt ctcctttgca gttcctcttc atctgtgtag 3600

ctgctctttt gtctcttaac ttaccattcc tatagtactt tatgcatctc tgcttagttc 3660

tattagtttt ttggccttgc tcttctcctt gattttaaaa ttccttctat agctagagct 3720

tttctttctt tcattctctc ttcctgcagt gttttgcata catcagaagc taggtacata 3780

agttaaatga ttgagagttg gctgtattta gatttatcac tttttaatag ggtgagcttg 3840

agagttttct ttctttctgt tttttttttt tgtttttttt tttttttttt tttttttttt 3900

ttttgactaa tttcacatgc tctaaaaacc ttcaaaggtg attatttttc tcctggaaac 3960

tccaggtcca ttctgtttaa atccctaaga atgtcagaat taaaataaca gggctatccc 4020

gtaattggaa atatttcttt tttcaggatg ctatagtcaa tttagtaagt gaccaccaaa 4080

ttgttatttg cactaacaaa gctcaaaaca cgataagttt actcctccat ctcagtaata 4140

aaaattaagc tgtaatcaac cttctaggtt tctcttgtct taaaatgggt attcaaaaat 4200

ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca tactccttaa tttacctgtt gttggaaact 4260

ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt 4320

tttttataaa cagttttact tgtgtcatat tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg 4380

gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact aatagggata atccaggtaa ctttgaagag 4440

atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga 4500

tcattgaaga ccagctttct cataaatttc tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact 4560

aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga 4620

gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa 4680

ttagatccca catcgtataa atatctatta accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt 4740

gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg 4800

tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg 4860

ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata 4920

tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta 4980

ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac attttaagct a 5021

<210> 10

<211> 293

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Glu

290

<210> 11

<211> 5288

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 11

ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60

gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120

gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 480

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 540

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 600

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 660

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080

cctcctagga ataactgaag tgaagtgatg gactccgatt tggagagtag taagacgtga 1140

aaggaataca cttgtgttta agcaccatgg ccttgatgat tcactgttgg ggagaagaaa 1200

caagaaaagt aactggttgt cacctatgag acccttacgt gattgttagt taagttttta 1260

ttcaaagcag ctgtaattta gttaataaaa taattatgat ctatgttgtt tgcccaattg 1320

agatccagtt ttttgttgtt atttttaatc aattaggggc aatagtagaa tggacaattt 1380

ccaagaatga tgcctttcag gtcctagggc ctctggcctc taggtaacca gtttaaattg 1440

gttcagggtg ataactactt agcactgccc tggtgattac ccagagatat ctatgaaaac 1500

cagtggcttc catcaaacct ttgccaactc aggttcacag cagctttggg cagttatggc 1560

agtatggcat tagctgagag gtgtctgcca cttctgggtc aatggaataa taaattaagt 1620

acaggcagga atttggttgg gagcatcttg tatgatctcc gtatgatgtg atattgatgg 1680

agatagtggt cctcattctt gggggttgcc attcccacat tcccccttca acaaacagtg 1740

taacaggtcc ttcccagatt tagggtactt ttattgatgg atatgttttc cttttattca 1800

cataacccct tgaaaccctg tcttgtcctc ctgttacttg cttctgctgt acaagatgta 1860

gcaccttttc tcctctttga acatggtcta gtgacacggt agcaccagtt gcaggaagga 1920

gccagacttg ttctcagagc actgtgttca cacttttcag caaaaatagc tatggttgta 1980

acatatgtat tcccttcctc tgatttgaag gcaaaaatct acagtgtttc ttcacttctt 2040

ttctgatctg gggcatgaaa aaagcaagat tgaaatttga actatgagtc tcctgcatgg 2100

caacaaaatg tgtgtcacca tcaggccaac aggccagccc ttgaatgggg atttattact 2160

gttgtatcta tgttgcatga taaacattca tcaccttcct cctgtagtcc tgcctcgtac 2220

tccccttccc ctatgattga aaagtaaaca aaacccacat ttcctatcct ggttagaaga 2280

aaattaatgt tctgacagtt gtgatcgcct ggagtacttt tagactttta gcattcgttt 2340

tttacctgtt tgtggatgtg tgtttgtatg tgcatacgta tgagataggc acatgcatct 2400

tctgtatgga caaaggtggg gtacctacag gagagcaaag gttaattttg tgcttttagt 2460

aaaaacattt aaatacaaag ttctttattg ggtggaatta tatttgatgc aaatatttga 2520

tcacttaaaa cttttaaaac ttctaggtaa tttgccacgc tttttgactg ctcaccaata 2580

ccctgtaaaa atacgtaatt cttcctgttt gtgtaataag atattcatat ttgtagttgc 2640

attaataata gttatttctt agtccatcag atgttcccgt gtgcctcttt tatgccaaat 2700

tgattgtcat atttcatgtt gggaccaagt agtttgccca tggcaaacct aaatttatga 2760

cctgctgagg cctctcagaa aactgagcat actagcaaga cagctcttct tgaaaaaaaa 2820

aatatgtata cacaaatata tacgtatatc tatatatacg tatgtatata cacacatgta 2880

tattcttcct tgattgtgta gctgtccaaa ataataacat atatagaggg agctgtattc 2940

ctttatacaa atctgatggc tcctgcagca ctttttcctt ctgaaaatat ttacattttg 3000

ctaacctagt ttgttacttt aaaaatcagt tttgatgaaa ggagggaaaa gcagatggac 3060

ttgaaaaaga tccaagctcc tattagaaaa ggtatgaaaa tctttatagt aaaatttttt 3120

ataaactaaa gttgtacctt ttaatatgta gtaaactctc atttatttgg ggttcgctct 3180

tggatctcat ccatccattg tgttctcttt aatgctgcct gccttttgag gcattcactg 3240

ccctagacaa tgccaccaga gatagtgggg gaaatgccag atgaaaccaa ctcttgctct 3300

cactagttgt cagcttctct ggataagtga ccacagaagc aggagtcctc ctgcttgggc 3360

atcattgggc cagttccttc tctttaaatc agatttgtaa tggctcccaa attccatcac 3420

atcacattta aattgcagac agtgttttgc acatcatgta tctgttttgt cccataatat 3480

gctttttact ccctgatccc agtttctgct gttgactctt ccattcagtt ttatttattg 3540

tgtgttctca cagtgacacc atttgtcctt ttctgcaaca acctttccag ctacttttgc 3600

caaattctat ttgtcttctc cttcaaaaca ttctcctttg cagttcctct tcatctgtgt 3660

agctgctctt ttgtctctta acttaccatt cctatagtac tttatgcatc tctgcttagt 3720

tctattagtt ttttggcctt gctcttctcc ttgattttaa aattccttct atagctagag 3780

cttttctttc tttcattctc tcttcctgca gtgttttgca tacatcagaa gctaggtaca 3840

taagttaaat gattgagagt tggctgtatt tagatttatc actttttaat agggtgagct 3900

tgagagtttt ctttctttct gttttttttt tttgtttttt tttttttttt tttttttttt 3960

ttttttgact aatttcacat gctctaaaaa ccttcaaagg tgattatttt tctcctggaa 4020

actccaggtc cattctgttt aaatccctaa gaatgtcaga attaaaataa cagggctatc 4080

ccgtaattgg aaatatttct tttttcagga tgctatagtc aatttagtaa gtgaccacca 4140

aattgttatt tgcactaaca aagctcaaaa cacgataagt ttactcctcc atctcagtaa 4200

taaaaattaa gctgtaatca accttctagg tttctcttgt cttaaaatgg gtattcaaaa 4260

atggggatct gtggtgtatg tatggaaaca catactcctt aatttacctg ttgttggaaa 4320

ctggagaaat gattgtcggg caaccgttta ttttttattg tattttattt ggttgaggga 4380

tttttttata aacagtttta cttgtgtcat attttaaaat tactaactgc catcacctgc 4440

tggggtcctt tgttaggtca ttttcagtga ctaataggga taatccaggt aactttgaag 4500

agatgagcag tgagtgacca ggcagttttt ctgcctttag ctttgacagt tcttaattaa 4560

gatcattgaa gaccagcttt ctcataaatt tctctttttg aaaaaaagaa agcatttgta 4620

ctaagctcct ctgtaagaca acatcttaaa tcttaaaagt gttgttatca tgactggtga 4680

gagaagaaaa cattttgttt ttattaaatg gagcattatt tacaaaaagc cattgttgag 4740

aattagatcc cacatcgtat aaatatctat taaccattct aaataaagag aactccagtg 4800

ttgctatgtg caagatcctc tcttggagct tttttgcata gcaattaaag gtgtgctatt 4860

tgtcagtagc catttttttg cagtgatttg aagaccaaag ttgttttaca gctgtgttac 4920

cgttaaaggt tttttttttt atatgtatta aatcaattta tcactgttta aagctttgaa 4980

tatctgcaat ctttgccaag gtactttttt atttaaaaaa aaacataact ttgtaaatat 5040

taccctgtaa tattatatat acttaataaa acattttaag ctattttgtt gggctatttc 5100

tattgctgct acagcagacc acaagcacat ttctgaaaaa tttaatttat taatgtattt 5160

ttaagttgct tatattctag gtaacaatgt aaagaatgat ttaaaatatt aattatgaat 5220

tttttgagta taatacccaa taagctttta attagagcag agttttaatt aaaagtttta 5280

aatcagtc 5288

<210> 12

<211> 305

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn

290 295 300

Asn

305

<210> 13

<211> 5078

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 13

agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg 60

cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg gcggcggctg ctgctccgga cacctgcggc 120

ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg 180

ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc 240

acgttttgta atgacactgt cgtcattcca tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac 300

actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt aaaggaagag atatttacac ctttgatgga 360

gctctaaaca agtccactgt ccccactgac tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa 420

ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg gataagagtg atgctgtctc acacacagga 480

aactacactt gtgaagtaac agaattaacc agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa 540

tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt 600

tttgctatac tcctgttctg gggacagttt ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt 660

ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc 720

attgttggag ccattctttt cgtcccaggt gaatattcat taaagaatgc tactggcctt 780

ggtttaattg tgacttctac agggatatta atattacttc actactatgt gtttagtaca 840

gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc atattggtta ttcaggtgat agcctatatc 900

ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt 960

ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa 1020

tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt 1080

aatgaataac tgaagtgaag tgatggactc cgatttggag agtagtaaga cgtgaaagga 1140

atacacttgt gtttaagcac catggccttg atgattcact gttggggaga agaaacaaga 1200

aaagtaactg gttgtcacct atgagaccct tacgtgattg ttagttaagt ttttattcaa 1260

agcagctgta atttagttaa taaaataatt atgatctatg ttgtttgccc aattgagatc 1320

cagttttttg ttgttatttt taatcaatta ggggcaatag tagaatggac aatttccaag 1380

aatgatgcct ttcaggtcct agggcctctg gcctctaggt aaccagttta aattggttca 1440

gggtgataac tacttagcac tgccctggtg attacccaga gatatctatg aaaaccagtg 1500

gcttccatca aacctttgcc aactcaggtt cacagcagct ttgggcagtt atggcagtat 1560

ggcattagct gagaggtgtc tgccacttct gggtcaatgg aataataaat taagtacagg 1620

caggaatttg gttgggagca tcttgtatga tctccgtatg atgtgatatt gatggagata 1680

gtggtcctca ttcttggggg ttgccattcc cacattcccc cttcaacaaa cagtgtaaca 1740

ggtccttccc agatttaggg tacttttatt gatggatatg ttttcctttt attcacataa 1800

ccccttgaaa ccctgtcttg tcctcctgtt acttgcttct gctgtacaag atgtagcacc 1860

ttttctcctc tttgaacatg gtctagtgac acggtagcac cagttgcagg aaggagccag 1920

acttgttctc agagcactgt gttcacactt ttcagcaaaa atagctatgg ttgtaacata 1980

tgtattccct tcctctgatt tgaaggcaaa aatctacagt gtttcttcac ttcttttctg 2040

atctggggca tgaaaaaagc aagattgaaa tttgaactat gagtctcctg catggcaaca 2100

aaatgtgtgt caccatcagg ccaacaggcc agcccttgaa tggggattta ttactgttgt 2160

atctatgttg catgataaac attcatcacc ttcctcctgt agtcctgcct cgtactcccc 2220

ttcccctatg attgaaaagt aaacaaaacc cacatttcct atcctggtta gaagaaaatt 2280

aatgttctga cagttgtgat cgcctggagt acttttagac ttttagcatt cgttttttac 2340

ctgtttgtgg atgtgtgttt gtatgtgcat acgtatgaga taggcacatg catcttctgt 2400

atggacaaag gtggggtacc tacaggagag caaaggttaa ttttgtgctt ttagtaaaaa 2460

catttaaata caaagttctt tattgggtgg aattatattt gatgcaaata tttgatcact 2520

taaaactttt aaaacttcta ggtaatttgc cacgcttttt gactgctcac caataccctg 2580

taaaaatacg taattcttcc tgtttgtgta ataagatatt catatttgta gttgcattaa 2640

taatagttat ttcttagtcc atcagatgtt cccgtgtgcc tcttttatgc caaattgatt 2700

gtcatatttc atgttgggac caagtagttt gcccatggca aacctaaatt tatgacctgc 2760

tgaggcctct cagaaaactg agcatactag caagacagct cttcttgaaa aaaaaaatat 2820

gtatacacaa atatatacgt atatctatat atacgtatgt atatacacac atgtatattc 2880

ttccttgatt gtgtagctgt ccaaaataat aacatatata gagggagctg tattccttta 2940

tacaaatctg atggctcctg cagcactttt tccttctgaa aatatttaca ttttgctaac 3000

ctagtttgtt actttaaaaa tcagttttga tgaaaggagg gaaaagcaga tggacttgaa 3060

aaagatccaa gctcctatta gaaaaggtat gaaaatcttt atagtaaaat tttttataaa 3120

ctaaagttgt accttttaat atgtagtaaa ctctcattta tttggggttc gctcttggat 3180

ctcatccatc cattgtgttc tctttaatgc tgcctgcctt ttgaggcatt cactgcccta 3240

gacaatgcca ccagagatag tgggggaaat gccagatgaa accaactctt gctctcacta 3300

gttgtcagct tctctggata agtgaccaca gaagcaggag tcctcctgct tgggcatcat 3360

tgggccagtt ccttctcttt aaatcagatt tgtaatggct cccaaattcc atcacatcac 3420

atttaaattg cagacagtgt tttgcacatc atgtatctgt tttgtcccat aatatgcttt 3480

ttactccctg atcccagttt ctgctgttga ctcttccatt cagttttatt tattgtgtgt 3540

tctcacagtg acaccatttg tccttttctg caacaacctt tccagctact tttgccaaat 3600

tctatttgtc ttctccttca aaacattctc ctttgcagtt cctcttcatc tgtgtagctg 3660

ctcttttgtc tcttaactta ccattcctat agtactttat gcatctctgc ttagttctat 3720

tagttttttg gccttgctct tctccttgat tttaaaattc cttctatagc tagagctttt 3780

ctttctttca ttctctcttc ctgcagtgtt ttgcatacat cagaagctag gtacataagt 3840

taaatgattg agagttggct gtatttagat ttatcacttt ttaatagggt gagcttgaga 3900

gttttctttc tttctgtttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960

tgactaattt cacatgctct aaaaaccttc aaaggtgatt atttttctcc tggaaactcc 4020

aggtccattc tgtttaaatc cctaagaatg tcagaattaa aataacaggg ctatcccgta 4080

attggaaata tttctttttt caggatgcta tagtcaattt agtaagtgac caccaaattg 4140

ttatttgcac taacaaagct caaaacacga taagtttact cctccatctc agtaataaaa 4200

attaagctgt aatcaacctt ctaggtttct cttgtcttaa aatgggtatt caaaaatggg 4260

gatctgtggt gtatgtatgg aaacacatac tccttaattt acctgttgtt ggaaactgga 4320

gaaatgattg tcgggcaacc gtttattttt tattgtattt tatttggttg agggattttt 4380

ttataaacag ttttacttgt gtcatatttt aaaattacta actgccatca cctgctgggg 4440

tcctttgtta ggtcattttc agtgactaat agggataatc caggtaactt tgaagagatg 4500

agcagtgagt gaccaggcag tttttctgcc tttagctttg acagttctta attaagatca 4560

ttgaagacca gctttctcat aaatttctct ttttgaaaaa aagaaagcat ttgtactaag 4620

ctcctctgta agacaacatc ttaaatctta aaagtgttgt tatcatgact ggtgagagaa 4680

gaaaacattt tgtttttatt aaatggagca ttatttacaa aaagccattg ttgagaatta 4740

gatcccacat cgtataaata tctattaacc attctaaata aagagaactc cagtgttgct 4800

atgtgcaaga tcctctcttg gagctttttt gcatagcaat taaaggtgtg ctatttgtca 4860

gtagccattt ttttgcagtg atttgaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccgtta 4920

aaggtttttt tttttatatg tattaaatca atttatcact gtttaaagct ttgaatatct 4980

gcaatctttg ccaaggtact tttttattta aaaaaaaaca taactttgta aatattaccc 5040

tgtaatatta tatatactta ataaaacatt ttaagcta 5078

<210> 14

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu

305 310

<210> 15

<211> 5346

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60

gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120

gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 480

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 540

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 600

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 660

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080

cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 1140

aatgatgaat aactgaagtg aagtgatgga ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa 1200

ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca 1260

agaaaagtaa ctggttgtca cctatgagac ccttacgtga ttgttagtta agtttttatt 1320

caaagcagct gtaatttagt taataaaata attatgatct atgttgtttg cccaattgag 1380

atccagtttt ttgttgttat ttttaatcaa ttaggggcaa tagtagaatg gacaatttcc 1440

aagaatgatg cctttcaggt cctagggcct ctggcctcta ggtaaccagt ttaaattggt 1500

tcagggtgat aactacttag cactgccctg gtgattaccc agagatatct atgaaaacca 1560

gtggcttcca tcaaaccttt gccaactcag gttcacagca gctttgggca gttatggcag 1620

tatggcatta gctgagaggt gtctgccact tctgggtcaa tggaataata aattaagtac 1680

aggcaggaat ttggttggga gcatcttgta tgatctccgt atgatgtgat attgatggag 1740

atagtggtcc tcattcttgg gggttgccat tcccacattc ccccttcaac aaacagtgta 1800

acaggtcctt cccagattta gggtactttt attgatggat atgttttcct tttattcaca 1860

taaccccttg aaaccctgtc ttgtcctcct gttacttgct tctgctgtac aagatgtagc 1920

accttttctc ctctttgaac atggtctagt gacacggtag caccagttgc aggaaggagc 1980

cagacttgtt ctcagagcac tgtgttcaca cttttcagca aaaatagcta tggttgtaac 2040

atatgtattc ccttcctctg atttgaaggc aaaaatctac agtgtttctt cacttctttt 2100

ctgatctggg gcatgaaaaa agcaagattg aaatttgaac tatgagtctc ctgcatggca 2160

acaaaatgtg tgtcaccatc aggccaacag gccagccctt gaatggggat ttattactgt 2220

tgtatctatg ttgcatgata aacattcatc accttcctcc tgtagtcctg cctcgtactc 2280

cccttcccct atgattgaaa agtaaacaaa acccacattt cctatcctgg ttagaagaaa 2340

attaatgttc tgacagttgt gatcgcctgg agtactttta gacttttagc attcgttttt 2400

tacctgtttg tggatgtgtg tttgtatgtg catacgtatg agataggcac atgcatcttc 2460

tgtatggaca aaggtggggt acctacagga gagcaaaggt taattttgtg cttttagtaa 2520

aaacatttaa atacaaagtt ctttattggg tggaattata tttgatgcaa atatttgatc 2580

acttaaaact tttaaaactt ctaggtaatt tgccacgctt tttgactgct caccaatacc 2640

ctgtaaaaat acgtaattct tcctgtttgt gtaataagat attcatattt gtagttgcat 2700

taataatagt tatttcttag tccatcagat gttcccgtgt gcctctttta tgccaaattg 2760

attgtcatat ttcatgttgg gaccaagtag tttgcccatg gcaaacctaa atttatgacc 2820

tgctgaggcc tctcagaaaa ctgagcatac tagcaagaca gctcttcttg aaaaaaaaaa 2880

tatgtataca caaatatata cgtatatcta tatatacgta tgtatataca cacatgtata 2940

ttcttccttg attgtgtagc tgtccaaaat aataacatat atagagggag ctgtattcct 3000

ttatacaaat ctgatggctc ctgcagcact ttttccttct gaaaatattt acattttgct 3060

aacctagttt gttactttaa aaatcagttt tgatgaaagg agggaaaagc agatggactt 3120

gaaaaagatc caagctccta ttagaaaagg tatgaaaatc tttatagtaa aattttttat 3180

aaactaaagt tgtacctttt aatatgtagt aaactctcat ttatttgggg ttcgctcttg 3240

gatctcatcc atccattgtg ttctctttaa tgctgcctgc cttttgaggc attcactgcc 3300

ctagacaatg ccaccagaga tagtggggga aatgccagat gaaaccaact cttgctctca 3360

ctagttgtca gcttctctgg ataagtgacc acagaagcag gagtcctcct gcttgggcat 3420

cattgggcca gttccttctc tttaaatcag atttgtaatg gctcccaaat tccatcacat 3480

cacatttaaa ttgcagacag tgttttgcac atcatgtatc tgttttgtcc cataatatgc 3540

tttttactcc ctgatcccag tttctgctgt tgactcttcc attcagtttt atttattgtg 3600

tgttctcaca gtgacaccat ttgtcctttt ctgcaacaac ctttccagct acttttgcca 3660

aattctattt gtcttctcct tcaaaacatt ctcctttgca gttcctcttc atctgtgtag 3720

ctgctctttt gtctcttaac ttaccattcc tatagtactt tatgcatctc tgcttagttc 3780

tattagtttt ttggccttgc tcttctcctt gattttaaaa ttccttctat agctagagct 3840

tttctttctt tcattctctc ttcctgcagt gttttgcata catcagaagc taggtacata 3900

agttaaatga ttgagagttg gctgtattta gatttatcac tttttaatag ggtgagcttg 3960

agagttttct ttctttctgt tttttttttt tgtttttttt tttttttttt tttttttttt 4020

ttttgactaa tttcacatgc tctaaaaacc ttcaaaggtg attatttttc tcctggaaac 4080

tccaggtcca ttctgtttaa atccctaaga atgtcagaat taaaataaca gggctatccc 4140

gtaattggaa atatttcttt tttcaggatg ctatagtcaa tttagtaagt gaccaccaaa 4200

ttgttatttg cactaacaaa gctcaaaaca cgataagttt actcctccat ctcagtaata 4260

aaaattaagc tgtaatcaac cttctaggtt tctcttgtct taaaatgggt attcaaaaat 4320

ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca tactccttaa tttacctgtt gttggaaact 4380

ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt 4440

tttttataaa cagttttact tgtgtcatat tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg 4500

gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact aatagggata atccaggtaa ctttgaagag 4560

atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga 4620

tcattgaaga ccagctttct cataaatttc tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact 4680

aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga 4740

gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa 4800

ttagatccca catcgtataa atatctatta accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt 4860

gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg 4920

tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg 4980

ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata 5040

tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta 5100

ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac attttaagct attttgttgg gctatttcta 5160

ttgctgctac agcagaccac aagcacattt ctgaaaaatt taatttatta atgtattttt 5220

aagttgctta tattctaggt aacaatgtaa agaatgattt aaaatattaa ttatgaattt 5280

tttgagtata atacccaata agcttttaat tagagcagag ttttaattaa aagttttaaa 5340

tcagtc 5346

<210> 16

<211> 323

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met

305 310 315 320

Asn Asp Glu

<210> 17

<211> 293

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 17

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Glu

290

<210> 18

<211> 305

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 18

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn

290 295 300

Arg

305

<210> 19

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 19

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu

305 310

<210> 20

<211> 323

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 20

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met

305 310 315 320

Asn Asp Glu

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 21

tgcagaagtc actaggagga at 22

<210> 22

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический зонд

<400> 22

tcagtcaact tcttctgggt tgtttcc 27

<210> 23

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 23

gtgccagact cactttctat cca 23

<210> 24

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 24

tgctgccaat atacggcttc tg 22

<210> 25

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> //примечание = описание искусственной последовательности: синтетический зонд

<400> 25

cagctctcat agccaactat ggtgcc 26

<210> 26

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 26

tcaagcagag cctggttatc tg 22

<210> 27

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 27

gtcgtcattc catgctttgt tac 23

<210> 28

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический зонд

<400> 28

tggaggcaca aaacactact gaagtatacg 30

<210> 29

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 29

ggacagtgga cttgtttaga gc 22

<210> 30

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 30

ggcttggtgg ctgattgttc t 21

<210> 31

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 31

agcacccaaa ctgatatgcc tgtatttg 28

<210> 32

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 32

tgggaactgg tgtttcaagt cta 23

<210> 33

<211> 158

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 33

gcagacatga ttacttcaga gctttcaaag ctagatactg taccttgcat attccaacac 60

gcgatcgcat tttaagattt tccatcctag tggaaagata tgatttgatt catcctattt 120

actttgtata ttaaagtaca gtagaacctg ccactttt 158

<210> 34

<211> 160

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 34

ggatccattt taagtaatag aataggattt ttaattgttc cagtgtttct gtgatagagc 60

tgtcctgcac agacctgttt ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120

atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160

<210> 35

<211> 160

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид "

<400> 35

catgtctgga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt aactataacg 60

gtcctaaggt agcgactagc attagtatgg aaggtccgtc cactgtccag gttcctcttg 120

cggagctctt tgtctctctg gactctgtat acactgcttg 160

<210> 36

<211> 239

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание = описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 36

ggatccattt taagtaatag aataggattt ttaattgttc cagtgtttct gtgatagagc 60

tgtcctgcac agacctgttt ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120

gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg actagcatta gtatggaagg tccgtccact 180

gtccaggttc ctcttgcgga gctctttgtc tctctggact ctgtatacac tgcttgcat 239

<---

1. Грызун для экспрессии гуманизированного полипептида CD47,

где геном грызуна содержит гуманизированный ген CD47, кодирующий гуманизированный полипептид CD47,

где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный полипептид CD47 содержит часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть полипептида CD47 грызуна;

где часть полипептида CD47 человека содержит внеклеточный домен и трансмембранные домены полипептида CD47 человека и кодируется экзонами 2-7 гена CD47 человека;

где внутриклеточная часть полипептида CD47 грызуна кодируется экзонами ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный ген CD47 функционально связан с эндогенным промотором CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна; и

где грызун представляет собой мышь или крысу.

2. Грызун по п. 1, где гуманизированный ген CD47 получен в результате замещения геномного фрагмента, содержащего экзоны 2-7 эндогенного гена CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна, геномным фрагментом, содержащим экзоны 2-7 гена CD47 человека.

3. Грызун по п. 1, где гуманизированный ген CD47 содержит экзон 1 эндогенного гена CD47 грызуна, экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47.

4. Грызун по любому из пп. 1-3, где грызун содержит ген SIRPa, который кодирует полипептид SIRPa, содержащий внеклеточный домен полипептида SIRPa человека и внутриклеточный домен эндогенного полипептида SIRPa грызуна, причем полипептид SIRPa взаимодействует с CD47.

5. Грызун по п. 4, где ген SIRPa содержит экзоны 1, 5, 6, 7 и 8 эндогенного гена SIRPa грызуна и экзоны 2-4 гена SIRPa человека.

6. Выделенная клетка грызуна для экспрессии гуманизированного полипептида CD47,

где геном клетки грызуна содержит гуманизированный ген CD47, кодирующий гуманизированный полипептид CD47,

где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный полипептид CD47 содержит часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть полипептида CD47 грызуна;

где часть полипептида CD47 человека содержит внеклеточный домен и трансмембранные домены полипептида CD47 человека и кодируется экзонами 2-7 гена CD47 человека;

где внутриклеточная часть полипептида CD47 грызуна кодируется экзонами ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный ген CD47 функционально связан с эндогенным промотором CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна; и

где клетка грызуна представляет собой клетку мыши или клетку крысы.

7. Выделенная клетка грызуна для получения грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид CD47,

где геном клетки грызуна содержит гуманизированный ген CD47, кодирующий гуманизированный полипептид CD47,

где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный полипептид CD47 содержит часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть полипептида CD47 грызуна;

где часть полипептида CD47 человека содержит внеклеточный домен и трансмембранные домены полипептида CD47 человека и кодируется экзонами 2-7 гена CD47 человека;

где внутриклеточная часть полипептида CD47 грызуна кодируется экзонами ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный ген CD47 функционально связан с эндогенным промотором CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна; и

где клетка грызуна представляет собой клетку мыши или клетку крысы.

8. Клетка грызуна по п. 6 или 7, где гуманизированный ген CD47 содержит экзон 1 эндогенного гена CD47 грызуна, экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47.

9. Клетка грызуна по п. 7 или 8, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна.

10. Эмбрион грызуна для получения грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид CD47, где эмбрион грызуна содержит эмбриональную стволовую клетку грызуна по п. 9 и где эмбрион грызуна представляет собой эмбрион крысы или эмбрион мыши.

11. Выделенная ткань грызуна для экспрессии гуманизированного полипептида CD47,

где геном ткани грызуна содержит гуманизированный ген CD47, кодирующий гуманизированный полипептид CD47,

где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный полипептид CD47 содержит часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть полипептида CD47 грызуна;

где часть полипептида CD47 человека содержит внеклеточный домен и трансмембранные домены полипептида CD47 человека и кодируется экзонами 2-7 гена CD47 человека;

где внутриклеточная часть полипептида CD47 грызуна кодируется экзонами ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный ген CD47 функционально связан с эндогенным промотором CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна; и

где ткань грызуна представляет собой ткань мыши или ткань крысы.

12. Ткань грызуна по п. 11, где гуманизированный ген CD47 содержит экзон 1 эндогенного гена CD47 грызуна, экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47.

13. Способ получения грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид CD47, при этом способ включает модификацию генома грызуна, за счет чего получают грызуна, содержащего модифицированный геном грызуна, который содержит гуманизированный ген CD47, кодирующий гуманизированный полипептид CD47,

где гуманизированный ген CD47 содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный полипептид CD47 содержит часть полипептида CD47 человека и внутриклеточную часть полипептида CD47 грызуна;

где часть полипептида CD47 человека содержит внеклеточный домен и трансмембранные домены полипептида CD47 человека и кодируется экзонами 2-7 гена CD47 человека;

где внутриклеточная часть полипептида CD47 грызуна кодируется экзонами ниже экзона 7 гена CD47 грызуна;

где гуманизированный ген CD47 функционально связан с эндогенным промотором CD47 грызуна в эндогенном локусе CD47 грызуна; и

где грызун представляет собой мышь или крысу;

где указанная модификация включает:

(a) вставку геномного фрагмента в эндогенный локус CD47 грызуна в эмбриональной стволовой клетке грызуна, при этом указанный геномный фрагмент содержит экзоны 2-7 гена CD47 человека, за счет чего получают гуманизированный ген CD47 в эндогенном локусе CD47 грызуна;

(b) получение эмбриональной стволовой клетки грызуна, геном которой содержит гуманизированный ген CD47 из (а); и

(c) создание грызуна с применением эмбриональной стволовой клетки грызуна из (b).

14. Способ по п. 13, где гуманизированный ген CD47 содержит экзон 1 эндогенного гена CD47 грызуна, экзоны 2-7 гена CD47 человека и экзоны ниже экзона 7 эндогенного гена CD47.

15. Способ оценки приживления клеток человека, где указанный способ включает трансплантацию клеток человека грызуну по любому из пп. 1-5 и оценку приживления клеток человека у грызуна.

16. Способ по п. 15, где клетки человека представляют собой гематопоэтические стволовые клетки.

17. Способ оценки терапевтической эффективности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на клетки человека, при этом способ включает:

введение кандидатного лекарственного средства грызуну по любому из пп. 1-5, в который была трансплантирована одна или более клеток человека;

и мониторинг клеток человека у грызуна для определения терапевтической эффективности кандидатного лекарственного средства.

18. Способ оценки того, индуцирует ли кандидатный модулятор белка CD47 человека агглютинацию эритроцитов, при этом указанный способ включает:

инкубирование эритроцитов, выделенных из грызуна по любому из пп. 1-5, в присутствии кандидатного модулятора, причем эритроциты экспрессировали гуманизированный полипептид CD47; и

оценивание того, индуцирует ли кандидатный модулятор агглютинацию эритроцитов.