Способ клонального микроразмножения сортов ирги ольхолистной (amelanchier alnifolia (nutt.) nutt. ex m.roem.)
Владельцы патента RU 2732450:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения в культуре in vitro сортов Amelanchier alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem., включающий стерилизацию апикальных и латеральных почек с последующим культивированием на питательной среде, размножение микропобегов, их дальнейшее укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и последующего доращивания получают стандартные саженцы сортов ирги ольхолистной с закрытой корневой системой. Предлагаемый способ клонального микроразмножения ирги ольхолистной позволяет получить высокий коэффициент размножения и, как следствие, необходимое количество саженцев. 5 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала. Полученные растения могут быть использованы в таких отраслях сельского хозяйства как: плодоводство, питомниководство, лекарственное растениеводство и в качестве посадочного материала при создании объектов ландшафтной архитектуры.
Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков.
Иргу выращивают в качестве плодовой и декоративной культуры. В ирге обнаружены полезные для человека биологически активные вещества, что делает перспективным применение различных частей данного растения в лечебных целях [2, 3].
Известны генеративный и вегетативный способы размножения данной культуры. Генеративный способ размножения не приемлем для получения сортового посадочного материала ирги вследствие генотипической неоднородности потомства. У ирги отмечена специфическая особенность: прорастание семян на второй год после их посева, что усложняет быстрое получение высококачественного посадочного материала.
Из вегетативных способов размножения применяют: деление куста, выкапывание корневых отпрысков, черенкование и клональное микроразмножение. Деление куста позволяет получить от 4 до 6 дочерних растения, чего недостаточно для коммерческого использования данного метода размножения. Некоторые сорта ирги не формируют корневые отпрыски или формируют их в ограниченном количестве.
Получение посадочного материала видовых представителей A. alnifolia и А. canadensis (L.) Medik. зеленым черенкованием было изучено Н.В. Хромовым (2007) и А.В. Степановой (2017). По данным исследования Н.В. Хромова выход укорененных черенков составил 60% [5]. Из опытов А.В. Степановой получения посадочного материала ирги зеленеными черенками в условиях подогрева субстрата и искусственного тумана укореняемость варьировала в пределах от 65 до 75% [4]. Данный способ размножения зависит от времени года и многих других факторов, что также затрудняет стабильное получение посадочного материала.
В зарубежной литературе имеются сообщения о культивировании тканей некоторых представителей рода Amelanchier Medik. in vitro. Отмечалась эффективность использования питательной среды Мурасиге-Скуга (1962) (MS) и фитогормона 6-бензиламинопурина (6-БАП) в сравнении с тидиазуроном, зеатином и кинетином для клонального микроразмножения данной культуры [6, 7].
Наиболее близким предлагаемому изобретению в отечественной литературе является способ размножения Amelanchier canadensis (L.) Medik. в культуре in vitro, описанный в диссертации А.В. Высоцкого (1995). Максимальный коэффициент размножения был достигнут через 1,5 месяца на питательной среде MS с добавлением 10 мг/л 2-изопентиладенина (2-ИП) и составил 7,0±0,8. Наибольшее число укоренившихся микропобегов было получено при замачивании на 18 часов в растворе β-индолилмасляной кислоты (ИМК) 25 мг/л и составил 87% [1]. Недостатками данного метода является требование существенных затрат дорогостоящего реактива (2-ИП) и трудоемкость процесса. При разработке методики клонального микроразмножения для каждого вида и генотипа требуется индивидуальный подбор регуляторов роста и их концентраций.
Изобретение представляет собой способ размножения в культуре in vitro сортов Amelanchier alnifolia, включающий стерилизацию апикальных и латеральных почек с последующим культивированием на питательной среде, размножение микропобегов, их дальнейшее укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и последующего доращивания получают стандартные саженцы сортов ирги ольхолистной с закрытой корневой системой.
Ход работы
В ходе наших исследований разработана методика клонального микроразмножения сортов Amelanchier alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem.
Стерилизацию эксплантов проводили в три этапа: обработка раствором фунгицида комлексного действия 10 минут, обработка 70% раствором этанола (C2H6O) 1 минута, обработка 7% раствором гипохлорида кальция (Ca(ClO)2) 7 минут с добавлением Tween 20.
На стадии собственно размножения используется питательная среда MS, дополненная менее дорогостоящим, чем 2-ИП, регулятором роста 6-БАП (6-бензиламинопурин) в различных концентрациях (0,2; 0,3; 0,5; 1,0 мг/л). Через 30 дней измеряли высота микропобегов и рассчитан коэффициент размножения.
Наибольшую высоту микропобегов наблюдали на питательной среде, содержащей 6-БАП в концентрации 0,3 мг/л и составила у сорта Красноярская 19,1±1,4 мм, у сорта Mandan 18,0±1,5 мм. Максимальный коэффициент размножения был отмечен на питательной среде, содержащий 1,0 мг/л 6-БАП: у сорта Красноярская 10,1±1,4, у сорта Mandan 7,6±0,6, высота микропобегов составляла 14,7±1,4 и 14,0±1,3 соответственно (фиг. 1). Для более успешного прохождения этапов укоренения было установлено, что высота растений-регенератов должна превышать 15 мм. Из этого следует, что для достижения оптимальной высоты микропобегов перед стадией ризогенеза требуется предварительное культивирование эксплантов на питательной среде, содержащей 0,3 мг/л 6-БАП. В условиях лаборатории микропобеги сортов Amelanchier alnifolia Nutt. культивировали при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч., температуре 23-25°С и влажности 70%.
На этапе укоренения использовали агаризированную среду 1/2 MS, содержащую 20 мг/л сахарозы. Были испытаны такие регуляторы роста как β-индолилмасляная кислота (ИМК) и индолилуксусная кислота (ИУК) в различных концентрациях. Наилучшие результаты были достигнуты на питательной среде, содержащей 1 мг/л ИМК, укореняемость сорта Красноярская - 90%, сорта Mandan - 71% (фиг. 3). Растения с хорошо развитой корневой системой высаживают на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1.
Этапы пролиферации, ризогенеза и адаптированные растения-регенеранты представлены на Фиг. 2; 4; 5.
Источники информации
1. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений / В.А. Высоцкий: Автореферат дисс. на соискание учен, степени д-ра с.-х. наук - М., 1998. - 44 с.
2. Горбунов, А.Б. Изучение видов ирги (Amelanchier Medik.) с целью использования в селекции. / А.Б. Горбунов, B.C. Симагин, С.В. Асбаганов, А.Г. Куклина // Плодоводство и Ягодоводство России - М., - 2009. - Т. 21. - С. 92-102.
3. Лаксаева, Е.А. Плоды растений рода Ирги (Amelanchier Medik.) как источник биологически активных веществ и минералов. / Е.А Лаксаева, // Российский медико-биологический вестник им. Академика И.П. Павлова. - Рязань. - 2018. - Т. 26. - №2. - С. 296-304.
4. Степанова А.В. Технология размножения ирги методом укоренения зеленых черенков в условиях искусственного тумана с применением подогрева субстрата / А.В. Степанова // Успехи современной науки и образования.: Издательство Клюев Сергей Васильевич - 2017. - Т. 2. - №3. - С .82-84.
5. Хромов Н.В. Оценка генофонда ирги по хозяйственно-биологическим признакам и технология размножения в условиях Тамбовской области / Н.В. Хромов: Автореферат дисс. на соискание учен, степени канд. с.-х. наук. - Мичуринск, 2007. - 22 с.
6. Pruski К., Nowak J., Grainger G. Micropropagation of four cultivars of Saskatoon berry (Amelanchier alnifolia Nutt.) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1990. - Vol. 21-P. 103-109.
7. Yang F., Du B. In vitro proliferation of Saskatoon berry (Amelanchier alnifolia Nutt) is affected by plant growth regulators and their concentrations but less by carbon source // Indian Journal of Biotechnology. - 2017. - Vol. 16. - P. 648-654.
Способ клонального микроразмножения сортов Amelanchier alnifolia Nutt. включает вычленение апикальных и латеральных почек, трехступенчатую стерилизацию (раствор фунгицида комплексного действия 10 минут, 70% C2H6O 1 минута, 7% Ca(ClO)2 7 минут), помещение эксплантов на питательную среду MS (Murashige and Skoog (1962)) с добавлением 1,0 мг/л 6-БАП, размножение микропобегов, пересадка на питательную среду MS с добавлением 0,3 мг/л 6-БАП с целью достижения оптимальной для укоренения высоты микропобегов, их последующее укоренение на среде 1/2 MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 1 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1.
