Способ очистки полисиалированного инсулина человека

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки белка, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, от побочных продуктов реакции и исходного материала, не вступившего в реакцию, с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Используется хроматографический материал PLRP-S, уравновешенный раствором с содержанием этанола 2-8%, и элюция ступенчатым градиентом. Изобретение обеспечивает высокую чистоту белка за одну стадию очистки. 6 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу очистки полисиалированного инсулина с помощью способа элюции ступенчатым градиентом с использованием колонки, заполненной хроматографической фазой PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм).

Предшествующий уровень техники

Белки играют важную роль в современной медицине. Каждый белок, который используется в терапевтических целях для лечения человека, должен отвечать определенным критериям. Чтобы обеспечить безопасность биофармацевтических препаратов для человека, все побочные продукты, которые накапливаются во время производственного процесса, должны быть тщательным образом удалены. Для выполнения нормативных требований за процессом производства должны следовать один или более этапов очистки. Среди других критериев, важную роль в определении подходящего процесса очистки играет чистота, производительность и выход.

Конъюгаты терапевтических белков были описаны, например, для полиэтиленгликоля (ПЭГ) и интерлейкина-6 (ЕР 0442724), для ПЭГ и эритропоэтина (WO 01/02017), для гормона роста и полисиаловой кислоты (US 2008/0262209 A1), для пегилированных полипептидов (US 2005/0114037), для интерферона-α-2b и полисиаловой кислоты (Hreczuk-Hirst D. et al, AAPS Annual Meeting, 2002, Canada, M1056).

Из приведенных выше и многих других коньюгатов полисиаловой кислоты и терапевтических агентов белковой природы наиболее типичным является многоступенчатый способ выделения и очистки конъюгатов из реакционной смеси: предварительное осаждение коньюгата фермента каталазы и полисиаловой кислоты 10%-ой трихлоруксусной кислотой с последующим хроматографированием остатка на гель-фильтрационной колонке описано в работе Fernandes A. et al, Eur. J. Pharm. Sci. 2 (1994), 111. В качестве альтернативного способа выделения полисиалированной каталазы в другой работе авторы (Fernandes A. et al, Biochimica et Biophysica Acta. 1293 (1996), 90-96) применяют осаждение продукта концентрированным раствором сульфата аммония с последующим диализом ресуспендированного остатка. В работе Fernandes А. et al, Biochimica et Biophysica Acta. 1341 (1997), 26-34 описана очистка и выделение коньюгата полисиаловой кислоты и L-аспарагиназы, которая экспрессируется в культуре Ervinia carotovora, посредством типового осаждения продукта раствором сульфата аммония с последующим диализом ресуспендированного остатка. Однако, иные авторы предлагают усовершенствованный способ выделения и очистки коньюгатов - так, например, в случае с полисиалированным инсулином в дополнение к осаждению концентрированным раствором сульфата аммония применяют не диализ, а катионообменную или гель-фильтрационную хроматографию (Jain S. et al, Biochimica et Biophysica Acta. 1622 (2003), 42-49). Одноступенчатый способ очистки коньюгата рекомбинантного инсулина человека и коломиновой кислоты посредством обращенно-фазовой хроматографии упомянут в работе Zhang, R., et al., J. Diabetes Sci. Techn. 4 (2010) 532-539. В работе Ilyushin D.G. et al., PNAS 110 (2013), 1243-1248 с помощью афинной хроматографии проводят очистку коньюгата полисиаловой кислоты и фермента бутилхолинэстеразы.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении описан способ очистки коньюгата белка, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, от побочных продуктов реакции или исходного матераила, не вступившего в реакцию, с помощью метода обращенно-фазовой хроматографии. Было обнаружено, что использование обращенно-фазового хроматографического материала PLRP-S, а также элюции ступенчатым градиентом, который создают в колонке с помощью буферного раствора с определенной концентрацией этанола, позволяет получить с высокой степенью чистоты заранее конъюгированный белок, содержащий инсулин и один остаток полисиаловой кислоты.

Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является способ получения коньюгата, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, который включает следующие стадии:

a) уравновешивание хроматографической колонки, содержащей хроматографический материал PLRP-S, раствором с содержанием этанола 2-8%,

b) нанесение на колонку по п. а) раствора, содержащего смесь свободного инсулина, а также коньюгатов инсулина и полисиаловой кислоты, содержащих один или более остаток полисиаловой кислоты на одну молекулу инсулина,

c) промывка колонки раствором с содержанием этанола 2-8% и, таким образом, удаление свободной полисиаловой кислоты,

d) промывка колонки раствором со ступенчато возрастающей концентрацией этанола до конечного значения около 80% и, таким образом, раздельное высвобождение с колонки белков, содержащих два или более остатков полисиаловой кислоты, также белка, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, и инсулина.

В одном из вариантов реализации раствор с содержанием этанола 2-8% представляет собой раствор с pH, значение которого варьирует от 6,0 до 8,0. В другом варианте реализации раствор с содержанием этанола 2-8% представляет собой буферную систему на основе триэтиламмония ацетата, значение pH которого варьирует от 6.0 до 8.0.

В одном из вариантов реализации раствор со ступенчато возрастающей концентрацией этанола имеет pH, значение которого составляет 6,0-8,0.

В одном из вариантов реализации инсулин представляет собой инсулин человека.

В одном из вариантов реализации один остаток полисиаловой кислоты имеет молекулярную массу от 10 кДа до 40 kDa.

В одном из вариантов реализации раствор, состоящий из смеси свободного инсулина и коньюгатов инсулина и полисиаловой кислоты, содержащих один или более остатков полисиаловой кислоты на одну молекулу инсулина, наносят на хроматографический материал таким образом, чтобы на 1 мл хроматографического материала приходилось от 1 мг до 7 мг общего белка.

Описание изобретения

В настоящем изобретении описан способ очистки белка, содержащего одну молекулу инсулина и остаток полисиаловой кислоты, с помощью способа градиентной элюции. При этом градиент представляет собой ступенчатый градиент концентрации этанола, создаваемый в хроматографической колонке (содержащей хроматографический материал PLRP-S), которую перед нанесением раствора, содержащего белок, уравновешивают раствором с определенной долей этанола.

Обычные хроматографические способы и их применение широко известны специалистам в данной области техники. См., например, Heftmann, Е., (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z., (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J., et al., (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); or Ausubel, F.M., et at., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1994).

Термин "нанесение на" обозначает промежуточный этап (стадию) способа очистки, при котором раствор приводится в контакт с хроматографическим материалом. Этот термин описывает два случая: а) раствор добавляют в хроматографический прибор, в котором содержится хроматографический материал, или b) хроматографический материал добавляют в раствор. В случае а) раствор пропускают через прибор, при этом происходит взаимодействие между хроматографическим материалом и веществами, содержащимися в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, pH, электропроводность, концентрация соли, температура и/или скорость потока, некоторые соединения раствора связываются с хроматографическим материалом и, таким образом, могут быть удалены с хроматографического материала на последующем этапе.

Вещества, перешедшие в раствор, можно обнаружить в элюате. "Элюат" обозначает раствор, полученный после прохождения прибора, который может быть раствором нанесения или буферным раствором, который используют для промывки колонки или для элюции соединений, связанных с хроматографическим материалом. В одном из вариантов реализации прибором является колонка или кассета. В случае b) хроматографический материал может быть добавлен, например, в виде твердого вещества, в раствор, например, содержащий целевое соединение, которое необходимо очистить, для того, чтобы привести во взаимодействие хроматографический материал и вещество в растворе. После взаимодействия хроматографический материал отделяют от раствора, например, с помощью фильтрации, а вещество, связанное с хроматографическим материалом, также извлекается вместе с ним из раствора, в то время как соединения, не связавшиеся с хроматографическим материалом, остаются в растворе.

Термин "режим связывания и элюции" обозначает один из режимов работы в ходе проведения хроматографии, при котором раствор, содержащий целевое соединение, которое необходимо очистить, наносят на хроматографический материал, в результате чего соединение, представляющее интерес, связывается с хроматографическим материалом. Таким образом, целевое соединение удерживается на хроматографическом материале, в то время как соединения, не представляющие интерес, удаляются вместе с элюатом или супернатантом. Целевое соединение впоследствии высвобождается с хроматографического материала на втором этапе очистки с помощью элюирующего раствора. В одном из вариантов реализации способ, описанный в настоящем изобретении, осуществляется в "режиме связывания и элюции".

Растворы, которые используют в способе, описанном в настоящем изобретении, представляют собой неочищенные или буферные растворы. Термин "буферный раствор" обозначает раствор, в котором изменения pH в результате добавления или высвобождения кислых или щелочных соединений уравновешиваются с помощью растворенного буферного соединения. Любые буферные соединения с подобными свойствами могут быть использованы. Обычно используются фармацевтически приемлемые буферные соединения.

В одном из вариантов реализации буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, состоящего из фосфорной кислоты и/или ее солей, или ацетатного буферного раствора, состоящего из уксусной кислоты и ее солей, или цитратного буферного раствора, состоящего из лимонной кислоты или ее солей, или трис(гидроксиметил)аминометанового (TRIS) буферного раствора. Возможно буферный раствор может содержать полярные компоненты такие, например, как этанол, изопропанол, ацетонитрил или метанол.

Возможно буферный раствор может содержать дополнительные соли, такие, например, как хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия, или цитрат калия.

Термины "непрерывная элюция" и "способ непрерывной элюции", которые используются как взаимозаменяемые в рамках данной заявки, обозначают способ, в котором содержание полярного компонента раствора, вызывающего элюцию, т.е. высвобождение соединения, связанного с хроматографическим материалом, изменяют, т.е. повышают или понижают, непрерывно, т.е. концентрацию изменяют постепенно в несколько этапов, каждый из которых состоит в изменении концентрации соединения, вызывающего элюцию, не более чем на 2%, или 1%. В ходе этой "непрерывной элюции" одно или более условий, например pH, ионную силу, концентрацию соли, содержание полярного компонента и/или скорость хроматографии, можно менять линейно, или экспоненциально, или асимптотически, или ступенчато. В одном из вариантов реализации изменение является ступенчатым.

Термин "хроматографический материал PRLP-S" обозначает обращенно-фазовый хроматографический материал (материал поставляет Varian Inc.). Хроматографический материал PLRP-S в одном из вариантов реализации представляет собой сополимер с поперечными сшивками, который получен из стирола и дивинилбензола. Наличие в этом материале большого количества ароматических групп и отсутствие лабильных к щелочам и кислоте групп помогает ему работать в качестве обращенно-фазового хроматографического материала в широком интервале pH.

Термин "полисиаловая кислота" или "остаток полисиаловой кислоты" обозначает небелковый остаток, содержащий полисиаловую кислоту в качестве основного компонента. В особенности ту полисиаловую кислоту, которая получена в клетках E. coli K1, а потом фракционирована с использованием ионобменной хроматографии.

Такой остаток полисиаловой кислоты может содержать дополнительные химические группы, которые необходимы для реакций связывания и которые образуются в результате химического синтеза молекулы, или являются спейсерами для создания оптимальных расстояний между различными частями молекулы. Эти дополнительные химические группы не учитываются при вычислении молекулярной массы остатка полисиаловой кислоты.

Термин "конъюгат инсулина с остатком полисиаловой кислоты" означает соединение, содержащее ковалентную сшивку, введенную с помощью химической реакции между полисиаловой кислотой и N-концом В-цепочки инсулина. Слияние может приводить к получению коньюгата белка, который содержит одну молекулу инсулина и один или более остаток/остатков полисиаловой кислоты. Такой процесс слияния называют полисиалированием, а продукт, который получается в результате этого процесса, - (мульти)полисиалированный инсулин.

Слияние/конъюгирование полипептидов с остатками полисиаловой кислоты широко известны в данной области техники и обобщены, например, в работе Gregoriadis G. et al., Int. J. of Pharm. 300 (2005) 125-130. Остаток полисиаловой кислоты может быть присоединен с помощью различных функциональных групп. Для этого могут быть использованы полисиаловые кислоты с разной молекулярной массой, разной формой, а также разными сшивающими группами.

Слияние инсулина и остатка полисиаловой кислоты может быть проведено в водном растворе с использованием реагентов для присоединения остатка полисиаловой кислоты, как описано, например, в заявке WO 2005/016974. Термины "слияние инсулина и полисиаловой кислоты" и "полисиалирование" означают образование ковалентной сшивки между остатком полисиаловой кислоты и одним из N-концов инсулина и/или внутренним остатком лизина с тем, чтобы получить конъюгат белка, который содержит одну молекулу инсулина и один остаток полисиаловой кислоты. В одном из вариантов реализации полисиалирование инсулина осуществляют в водном растворе с использованием окисленных периодатом активированных линейных молекул полисиаловой кислоты с молекулярной массой между 10 кДа и 40 кДа.

Химическое слияние или конъюгирование инсулина и полисиаловой кислоты, как правило, приводит к смеси разных соединений, таких как мультиполисиалированный инсулин, монополисиалированный инсулин, неполисиалированный инсулин, продукты гидролиза ПСК, а также продукты гидролиза самого инсулина. Чтобы получить монополисиалированный инсулин с высокой степенью чистоты, все побочные соединения должны быть удалены.

Поэтому одним из аспектов настоящего изобретения является способ получения коньюгата белка, который содержит одну молекулу инсулина и один остаток полисиаловой кислоты, с высокой степенью чистоты, при этом способ включает следующие стадии:

a) конъюгирование инсулина и полисиаловой кислоты с использованием полисиаловой кислоты с молекулярной массой от 10 кДа до 40 кДа,

b) нанесение коньюгатов, полученных на стадии а), на хроматографический материал PRLP-S, уравновешенный раствором с содержанием этанола 2-8%,

c) высвобождение белка, который содержит одну молекулу инсулина и один остаток полисиаловой кислоты (монополисиалированный инсулин), с высокой степенью чистоты с помощью элюции ступенчатым градиентом концентрации этанола, и, таким образом, получение коньюгата белка, который содержит инсулин и один остаток полисиаловой кислоты.

В одном из вариантов реализации хроматографический материал PRLP-S представляет собой хроматографическую колонку. Этот способ лучше всего подходит для очистки полисиалированного рекомбинантного инсулина, который гликозилирован, т.е. который получают с помощью линии клеток E. coli, после чего проводят химическое полисиалирование.

На первой стадии способа по настоящему изобретению проводят полисиалирование инсулина. Молекула полимера полсиаловой кислоты (ПСК), использованная в реакции полисиалирования, имеет молекулярную массу около 10 кДа - 40 кДа (термин "молекулярная масса", который используется в настоящей заявке, означает среднюю молекулярную массу ПСК, поскольку молекула ПСК является полимерным соединением и не может быть получена с определенной молекулярной массой, а на самом деле имеет распределение молекулярных масс; термин "около" означает, что в препарате ПСК некоторые молекулы весят больше, а некоторые весят меньше указанной молекулярной массы, т.е. термин "около" означает распределение молекулярных масс, в котором 95% молекул ПСК имеют молекулярную массу в пределах указанной молекулярной массы +/-10%. Например, молекулярная масса 30 кДа означает диапазон молекулярных масс от 27 кДа до 33 кДа).

Термин "инсулин человека" как он здесь используется, означает гормон человека, структура и свойства которого хорошо известны. Инсулин человека имеет две полипептидных цепи, которые соединены дисульфидными мостиками между цистеиновыми остатками, а именно, А-цепь и В-цепь. А-цепь представляет собой пептид из 21 аминокислоты, а В-цепь представляет собой пептид из 30 аминокислот, две цепи соединены посредством трех дисульфидных мостиков: один между цистеинами в положении 6 и 11 А-цепи, второй между цистеином в положении 7 А-цепи и цистеином в положении 7 В-цепи, а третий между цистеином в положении 20 А-цепи и цистеином в положении 19 В-цепи. (Brandenburg D, Wollmer A. Insulin: chemistry, structure, and function of insulin and related hormones: proceedings of the Second International Insulin Symposium, Aachen, Germany, September 4-7, 1979. Publisher: New York: W. de Grayter, 1980) Инсулин человека, может быть получен, например, генно-инженерным способом (так называемый рекомбинантный человеческий инсулин) путем экспрессии инсулина или его предшественника в бактериях Escherichia coli, (Chance RE, Kroeff ЕР, Hoftmann JA, Frank ВН. Chemical, physical, and biologic properties of biosynthetic human insulin. Diabetes Care, 1981,2:147-54.) или в дрожжах (Thim L, Hansen MT, Norris K, Hoegh 1, Boel E, Forstrom J, Ammerer G, and Fiil NP. Secretion and Processing of Insulin Precursors in Yeast. PNAS, 1986, 83: 6766-6770], [Cousens LS, Shuster JR, Gallegos C, Ku LL, Stempien MM, Urdea MS, Sanchez-Pescador R, Taylor А, Теkamp-Olson P. High level expression of proinsulin in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1987, 61: 265-275). Далее осуществляется рефолдинг слитого полипептида с целью формирования правильных дисульфидных связей; ферментативное расщепление рефолдированного полипептида трипсином и карбоксипептидазой В; очистка полученного продукта и получение собственно рекомбинантного инсулина человека.

Биологическая активность полисиалированного инсулина человека может быть определена с помощью различных анализов, известных в данной области техники. Биологическая активность полисиалированного инсулина, полученного согласно способу, описанному в настоящем изобретении, может быть проверена с помощью известных методов in vitro и in vivo, например, описанных в работах (Shukla А, Grisouard J, Ehemann V, Hermani A, Enzmann H, Mayer D. Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines Arch Physiol Biochem. 2009 Jul; 115(3):119-26.), (Shukla Al, Enzmann H, Mayer D. Proliferative effect of Apidra (insulin glulisine), a rapid-acting insulin analogue on mammary epithelial cells, Endocr Relat Cancer. 2009 Jun; 16 (2): 429-41), ( Al, Brange J, Drejer K, Jensen 1, Markussen J, Ribel U, AR, Schlichtkrull J. In vitro and in vivo potency of insulin analogues designed for clinical use, Diabet Med. 1991 Nov; 8 (9): 839-47)

Химическое полисиалирование инсулина обычно приводит к получению препарата белка, содержащего инсулин, который полисиалирован по одной или более е-аминогруппам остатков лизина и/или по N-концевой аминогруппе. Избирательное полисиалирование по N-терминальной аминокислоте может быть выполнено согласно протоколу, описанному в заявке (US 2008/0262209). Подходящие производные полисиаловой кислоты представляют собой молекулы активированной полисиаловой кислоты, средняя молекулярная масса которой составляет в одном из вариантов реализации около 10 кДа-40 кДа, в другом варианте реализации около 20 кДа-50 кДа. Доступно большое разнообразие производных сиаловых кислот, подходящих для применения с целью приготовления коньюгатов инсулина.

Активированные производные полисиаловой кислоты широко известны в данной области техники и описаны, например, в заявке US 2008/026209, а также в заявке WO 2005/016974.

В одном из вариантов реализации типы ПСК представляют собой активированные окислением периодатом полисиаловые кислоты, например, САО и CAORO (WO 2005/016973, WO 2005/016974).

Термин "с высокой степенью чистоты" означает, что конъюгат белка инсулина или конъюгат, полученный, содержащийся, или используемый, содержит определенное количество остатков полисиаловой кислоты, связанных с инсулином. В одном из вариантов реализации полисиалированный инсулин является продуктом, содержащим остатки белка и полисиаловой кислоты в мольном соотношении 1:1. Препарат может содержать не вступивший в реакцию инсулин (т.е. не содержащий остатков полисиаловой кислоты), мультиполисиалированный инсулин, а также фрагменты белка, которые образуются в ходе химической деструкции при проведении реакции полисиалирования.

Термин "с высокой степенью чистоты" означает, что препарат монополисиалированного инсулина содержит, по меньшей мере, 95% (мас./мас.) монополисиалированного инсулина или более чем 95% монополисиалированного инсулина. Значения концентрации в процентах получены на основе площади под кривой на хроматограмме в соответствии с хроматографическим способом, с помощью которого получен полисиалированный инсулин.

Настоящее изобретение относится к способу очистки полисиалированного инсулина, который позволяет получить монополисиалированный инсулин с высокой степенью читоты. Было обнаружено, что хроматографический материал PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм) необходимо уравновесить с помощью раствора, содержащего 2-8% полярного компонента - метанола, этанола, 2-пропанола или ацетонитрила - перед тем, как наносить препарат полисиалированного инсулина.

В случае, когда хроматографический материал уравновешен раствором с более низким или более высоким содержанием полярного компонента, разделение разных типов полисиалированного инсулина менее эффективно.

Восстановление исходного инсулина, не вступившего в реакцию, является предпочтительным, поскольку он может быть повторно использован в реакции полисиалирования.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения монополисиалированного инсулина с использованием хроматографического материала PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм) в один этап посредством первоначального уравновешивания хроматографического материала и последующего нанесения на хроматографический материал раствора, содержащего препарат полисиалированного инсулина. Было обнаружено, что состав элюента нужно тщательно контролировать, чтобы обеспечить хорошее разделение индивидуальных компонентов неочищенного препарата белка и обеспечить получение целевого продукта с высокой степенью чистоты.

Таким образом, способ получения коньюгата белка, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, который описан в данной заявке, состоит из следующих этапов:

a) уравновешивание хроматографической колонки, содержащей хроматографический материал PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), раствором, содержащим 2-8% этанола,

b) нанесение на колонку по п. а) раствора, содержащего смесь свободного инсулина и коньюгатов белка инсулина и полисиаловой кислоты, содержащих один или более остаток полисиаловой кислоты на одну молекулу инсулина,

с) промывка колонки раствором с содержанием этанола 2-8% и, таким образом, удаление свободной полисиаловой кислоты и коньюгатов, содержащих два или более остатков полисиаловой кислоты, в ходе которой с колонки высвобождаются конъюгаты, содержащие два или более остатков полисиаловой кислоты, а также свободная полисиаловая кислота.

Было обнаружено, что для разделения индивидуальных компонентов препарата необходимо сначала уравновесить хроматографический материал PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), раствором, содержащим 2-8% полярного компонента (этанола, метанола, 2-пропанола либо ацетонитрила).

В одном из вариантов реализации способ по настоящему изобретению основан на применении автоматизированной препаративной хроматографической системы с программным управлением и документированием.

После нанесения на колонку раствора, содержащего препарат полисиалированного инсулина, и вышеописанной промывки колонки раствором, содержащим 2-8% полярного компонента (этанола, метанола, 2-пропанола либо ацетонитрила), осуществляют промывку колонки раствором со ступенчато возрастающей концентрацией полярного компонента до конечного значения около 80% и, таким образом, добиваются раздельного высвобождения с колонки белка, содержащего инсулин и один остаток полисиаловой кислоты, и инсулина.

В одном из вариантов реализации через хроматографический материал пропускают до 50 объемов колонки раствора с возрастающим содержанием полярного компонента от 5 до 80%.

После того, как полисиалированный инсулин удаляется с хроматографического материала, начинают непрерывную элюцию ступенчатым градиентом.

Содержание полярного компонента в подвижной фазе, которую пропускают через хроматографический материал, повышают непрерывно и ступенчато до значения, которое составляет по меньшей мере 80%.

Ступенчатый градиент позволяет элюировать с колонки монополисиалированный инсулин, а потом выходит свободный инсулин с высокой степенью чистоты.

В одном из вариантов реализации раствор, который используют для элюирования, имеет pH, значение которого составляет 6-8.

В одном из вариантов реализации раствор с pH 6-8 представляет собой буферную систему на основе триэтиламмония ацетата.

Термин "хроматографический материал PRLP-S" обозначает обращенно-фазовый хроматографический материал (материал поставляет Varian Inc.). Хроматографический материал PLRP-S в одном из вариантов реализации представляет собой сополимер с поперечными сшивками, который получен из стирола и дивинилбензола. Наличие в этом материале большого количества ароматических групп и отсутствие лабильных к щелочам и кислоте групп помогает ему работать в качестве обращенно-фазового хроматографического материала в широком интервале pH.

Следующие примеры и графические материалы приведены, чтобы облегчить понимание сути настоящего изобретения, которое представлено в полном объеме в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что в изложенные процедуры могут быть внесены изменения в пределах объема настоящего изобретения.

Описание графических материалов

Фиг. 1: Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата полисиалированного инсулина с помощью способа ступенчатой элюции 1.

Фиг. 2: Гель-электрофорез фракций представленных на Фиг. 1.

Фиг. 3: Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата полисиалированного инсулина с помощью способа ступенчатой элюции 2.

Фиг. 4: Гель-электрофорез фракций, представленных на Фиг. 3.

Фиг. 5: Хроматограмма элюции, описывающая очистку препарата полисиалированного инсулина с помощью способа по настоящему изобретению.

Фиг. 6: Гель-электрофорез фракций, представленных на Фиг. 5.

Примеры

Материалы и методы

Обращенно-фазовая хроматография полисиалированного инсулина

Гель-электрофорез фракций

Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) (MiniGel, вертикальная гелевая установка, модель Mini-PROTEAN, энергоснабжение модель PowerPac™ Basic; Bio-Rad, USA) использовали для определения изменения размера молекул инсулина при полисиалировании. SDS-PAGE инсулина и его коньюгатов, образцов из реакционных смесей проводили при использовании трис-глицин полиакриламидных гелей 4-20%. Образцы калибровали в широком диапазоне молекулярной массы маркеров.

Пример 1.

Хроматография препарата полисиалированного инсулина на хроматографическом материале PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), уравновешенном буферным раствором А.

Хроматографию полисиалированного инсулина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы.

Хроматограмма элюции, иллюстрирующая данный пример, представлена на Фиг. 1.

Аналитическая гель-электрофореграмма фракций хроматографической очистки согласно Фиг. 1, содержащих полисиалированный инсулин, представлена на Фиг. 2. Согласно ей фракции с 17 по 23 содержат полисиалированный инсулин, фракции 24 и более содержат полисиалированный и не полисиалированный инсулин, а фракции до 17 содержат полисиалированный инсулин со значительным количеством примесей.

Пример 2

Хроматография препарата полисиалированного инсулина на хроматографическом материале PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), уравновешенном буферным раствором А.

Хроматографию полисиалированного инсулина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы, внеся изменения в следующие параметры:

Аналитическая гель-электрофореграмма фракций хроматографической очистки согласно Фиг. 3, содержащих полисиалированный инсулин, представлена на Фиг. 4.

Согласно ей фракции с 14 по 17 содержат полисиалированный инсулин, фракции 18 и более содержат полисиалированный и не полисиалированный инсулин, а фракции до 14 содержат полисиалированный инсулин со значительным количеством примесей.

Пример 3

Хроматография препарата полисиалированного инсулина на хроматографическом материале PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), уравновешенном буферным раствором А.

Хроматографию полисиалированного инсулина выполняли в соответствии с разделом Материалы и Методы, внеся изменения в следующие параметры:

Аналитическая гель-электрофореграмма фракций хроматографической очистки согласно Фиг. 5, содержащих полисиалированный инсулин, представлена на Фиг. 5.

Согласно ей фракции с 24 по 33 содержат полисиалированный инсулин, фракции 34 и более содержат полисиалированный и не полисиалированный инсулин, а фракции до 24 содержат полисиалированный инсулин со значительным количеством примесей.

Способ очистки конъюгата белка, который содержит рекомбинантный инсулин человека и один остаток полисиаловой кислоты с молекулярной массой остатка от 10 до 40 кДа, где указанный способ включает следующие стадии:

a) нанесение раствора, содержащего смесь, полученную в результате конъюгирования инсулина и указанной полисиаловой кислоты, на колонку, содержащую хроматографический материал PRLP-S (диаметр пор 300 , размер частиц 10 мкм), уравновешенный буферной системой на основе триэтиламмония ацетата с рН от 6,0 до 8,0 с содержанием этанола 2-8 %,

b) промывка колонки буферной системой на основе триэтиламмония ацетата с рН от 6,0 до 8,0 с содержанием этанола 2-8 %,

c) промывка колонки буферной системой на основе триэтиламмония ацетата с рН от 6,0 до 8,0 со ступенчато возрастающей концентрацией этанола до конечной концентрации этанола около 80 % с получением целевого продукта.