Способ иммуноферментного анализа идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека

Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и клинической лабораторной диагностики. Раскрыт способ определения идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека, включающий забор и подготовку донорской крови, иммобилизацию человеческого рекомбинантного идиотипического Т72 и антиидиотипического А4 антител к бензо[а]пирену на иммунологический планшет, инкубацию с сывороткой крови человека, инкубацию с антителами к IgG человека, меченными пероксидазой хрена и анализ с помощью раствора тетраметилбензидина. Изобретение обеспечивает одновременное определение идиотипических и антиидиотипичеких антител против бензо[а]пирена в одном образце биологической жидкости человека, снижение канцерогенной опасности для здоровья исследователя и изготовителя тест-систем за счет исключения из тест-систем конъюгатов химических канцерогенов, а также высокие чувствительность и воспроизводимость анализа. 2 табл.

 

Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и клинической лабораторной диагностики и может найти применение для определения индивидуальных рисков возникновения заболеваний, связанных с воздействием химических канцерогенов окружающей среды: злокачественных опухолей, врожденных пороков развития, аутоиммунных и других.

Известно достаточно много аналогичных решений, но все они, на наш взгляд, имеют те или иные недостатки. Все найденые нами аналоги разбираются ниже. В литературе и базах данных не описан способ определения идиотипичеких и антиидиотипичеких антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека с использованием рекомбинантных человеческих идиотипичеких и антиидиотипичеких антител методом иммуноферментного анализа, предлагаемый нами.

Одним из известных подходов к решению определения индивидуальных онкорисков является анализ антител, специфических к химическим канцерогенам, в частности бензо[а]пирену, в биологических жидкостях человека. Ранее, методом иммуноферментного анализа были обнаружены ассоциации антител к химическим канцерогенам из окружающей среды с онкологическими заболеваниями. Поэтому предлагаемый нами метод определения идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологичеких жидкостях человека является измерением изменений иммунной системы человека в ответ на воздействие химических канцерогенов из окружающей среды.

Аналогами заявляемого изобретения являются способы определения антител в биологических жидкостях человека (например, патенты РФ: G01N 33/531, G01N 33/68, G01N 33/577, G01N 33/53, CN 108196061 (А), CN 108226460 (A), CN 107677810 (А); другие патенты: US 8383350 (В1), WO 2005108989 (А2), US 5219730 (A), US 4910131 (A), WO 9901477 (А1), WO 9006515 (A1), CN 105785030 (A), CN 105203750 (A), UA 78419 (U)), основанных на использовании твердофазного иммуноферментного анализа. Традиционный твердофазный иммуноферментный анализ включает связывание антигена с поверхностью микропланшета с последующим помещением биологической жидкости, содержащей антитела, на микропланшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции.

Признаками данных технических решений, совпадающих с существенными признаками заявляемого изобретения являются.

1) Использование иммуноферментного анализа.

Недостатками этих предложенных методов:

1) Не было предложено измерять идиотипические и антиидиотипические антитела против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека, используя человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Другим аналогом заявляемого изобретения является метод, запатентованный ранее (патент RU 21244731 С1). Согласно этому методу предлагается использовать твердофазный иммуноферментный анализ, где конъюгат фторметилбензантрила уксусной кислоты с человеческим сывороточным альбумином адсорбирован на стенках лунок иммунологического планшета. Затем инкубируют исследуемую биологическую жидкость с адсорбированным антигеном. Проявляют связавшиеся с антигеном антитела с помощью анти-антител, меченых ферментом.

Недостатками известного способа являются:

1) Использование конъюгата бензо[а]пирена для определения идиотипических антител против бензо[а]пирена, что может привести неточному определению идиотипических антител в биологической жидкости человека;

2) Использование конъюгата фторметилбензантрила уксусной кислоты с человеческим сывороточным альбумином в качестве антигена может сопровождаться в ряде случаев высоким неспецифическим связыванием антител исследуемой биологической жидкости человека не с антигеном, а с белком-носителем, что существенно ограничивает возможность метода.

Используя иммуноферментный анализ в патентах: US 8383350 (В1), WO 2005108989 (А2), US 5219730 (A), US 4910131 (A), WO 9901477 (А1), WO 9006515 (А1) было предложено использовать антиидиотипичекие антитела для детекции идиотипических антител в биологических жидкостях человека.

Признаками данных технических решений, совпадающих с существенными признаками заявляемого изобретения являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Использование антиидиотипичеких антител для детекции идиотипических антител в биологических жидкостях человека.

Недостатками этих предложенных методов:

1) Не было предложено измерять идиотипические и антиидиотипические антитела против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека, используя человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Другим аналогом изобретения является анализ антител к бензо[а]пирену и его метаболитам в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа и иммобилизованных на иммунологичекий планшет конъюгатов бензо[а]пирена и его производных с белками: Harris et al, 1985; Haugen et al, 1986; Newman et al, 1988; Ovrebo et al, 1995; Petruzzelli et al, 1998; Galati et al, 2001; Глушков и др, 2000; Глушков и др, 2002; Глушков и др, 2004; De Buck et al, 2005; Глушков и др, 2006; Глушков и др, 2008; Pouns et al, 2009; Глушков и др, 2010; Глушков и др, 2011; Глушков и др, 2012; Глушков и др, 2013; Pauk et al, 2013; Глушков и др, 2014; Borska et al, 2014; Глушков и др, 2016, 2016; Glushkov et al, 2016; Глушков и др, 2017; Borsky et al, 2017; Глушков и др, 2018; Глушков и др, 2018).

Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Измерение уровней идиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека.

Однако, в этой группе работ:

1) Идиотипические антитела к бензо[а]пирену определялись с помощью конъюгатов бензо[а]пирена и его метаболитов с ДНК или белком, иммобилизованных на иммунологический планшет.

2) Наличие бензо[а]пирена и его производных в составе аналитических тест-систем представляет собой угрозу здоровью для пользователей и исследователей.

3) В данной группе работ не определялся уровень антиидиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

Следующим аналогом изобретения является анализ идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа, конъюгатов бензо[а]пирена с белком и мышиных идиотипических одноцепочечных антител против бензо[а]пирена: Ustinov et al, 2013; Grebenshchikov et al., 2019. В этом случае иммобилизованный на иммунологичекий планшет конъюгат бензо[а]пирена с белком связывает идиотипические антитела, а мышиное идиотипическое одноцепочечное антитело против бензо[а]пирена - антиидиотипические антитела к бензо[а]пирену из биологических жидкостей человека. Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Определение идиотипических и антиидиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

Недостатками предложенного метода являются:

1) Уровень идиотипических антител в биологических жидкостях человека определялся с помощью конъюгата бензо[а]пирена с белком.

2) Уровень антиидиотипических антител в биологических жидкостях человека определялся с помощью мышиных одноцепочечных антител против бензо[а]пирена.

3) Этот метод гетерогенен, т.к. идиотипические антитела определяются с помощью конъюгата бензо[а]пирена с белком, а антиидиотипические с помощью мышиных одноцепочечных антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

4) Не использовались человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Поэтому, такая гетерогенная система определения антител в сыворотках крови человека не дает точной оценки специфической иммунной реакции организма на химические канцерогены.

Другим аналогом изобретения является анализ идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа, конъюгатов бензо[а]пирена с белком и мышиных моноклональных идиотипических одноцепочечных антител против бензо[а]пирена: Chagnaud et al., 1991; Chagnaud et al., 1992; Chagnaud et al., 1995. Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Определение идиотипических и антиидиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

Недостатками предложенного метода являются:

1) Уровень идиотипических антител в биологических жидкостях человека определялся с помощью конъюгата бензо[а]пирена с белком.

2) Уровень антиидиотипических антител в биологических жидкостях человека определялся с помощью мышиных моноклональных антител против бензо[а]пирена.

3) Данный метод также гетерогенен, как и в предыдущем примере.

4) Не использовались человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Следующим аналогом данного изобретения является анализ антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа и крысиных моноклональных идиотипических антител против бензо[а]пирена: Herlyn et al., 1991; Herlyn et al., 1994. Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Определение антиидиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

Недостатками предложенного метода являются:

1) В данной работе не определялся уровень идиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

2) Для определения применялись крысиные моноклональные идиотипических антител против бензо[а]пирена.

3) Не использовались человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Следующим аналогом данного изобретения является анализ антиидиотипических антител к раково-эмбриональному антигену при раке кишечника в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа и F(ab')2 мышиных моноклональных антител: Frodin et al., 1991. Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Определение антиидиотипических антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека.

Недостатками предложенного метода являются:

1) Не использовались идиотипические и антиидиотипические антитела против бензо[а]пирена.

2) Не использовались человеческие одноцепочечые антитела.

3) В данной работе не определялся уровень идиотипических антител в биологических жидкостях человека.

4) Для определения антиидиотипических антител против бензо[а]пирена использовались F(ab')2 мышиные моноклональные антитела.

5) Не использовались человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Следующим аналогом данного изобретения является анализ идиотипических и антиидиотипических антител к маркеру рака кишечника СО17-1A/GA733/Ep-CAM в биологических жидкостях человека с помощью иммуноферментного анализа, мышиных идиотипических моноклональных антител против CO17-1A/GA733/Ep-CAM и поликлональных антиидиотипических против CO17-1A/GA733/Ep-CAM из козы: Herlyn et al., 1986; Herlyn et al., 1994; Gruber et al., 2000. Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются:

1) Использование иммуноферментного анализа;

2) Определение идиотипических и антиидиотипических антител в биологических жидкостях человека.

Недостатками предложенного метода являются:

1) Не использовались идиотипические и антиидиотипические антитела против бензо[а]пирена.

2) Не использовались человеческие одноцепочечые антитела.

3) Для определения антиидиотипических антител в биологических жидкостях человека использовались мышиные идиотипические моноклональные антитела.

4) Для определения идиотипических антител в биологических жидкостях человека использовались поликлональные антитела из козы.

5) Не использовались человеческие одноцепочечные антитела против бензо[а]пирена.

Общими недостатками перечисленных последних примеров определения антиидиотипических антител в биологических жидкостях человека является использование в качестве адсорбированного антитела идиотипических антител, полученных от животных после активной иммунизации против бензо[а]пирена или раковых маркеров. В предлагаемом нами методе используются человеческие нативные антитела не иммунизированных людей.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является одновременное определение идиотипических и антиидиотипичеких антител против бензо[а]пирена в одном образце биологической жидкости человека; предлагаемый метод отличается от ранее предложенных методов по воспроизводимости и чувствительности; снижение канцерогенной опасности для здоровья исследователя и изготовителя тест-систем за счет исключения из тест-систем конъюгатов химических канцерогенов.

Предлагается способ определения антител к бензо[а]пирену, включающий забор и подготовку донорской крови, иммобилизацию человеческого рекомбинантного идиотипического Т72 и антиидиотипического А4 антител к бензо[а]пирену на иммунологический планшет, добавление сыворотки крови человека и детекцию связавшихся из сыворотки крови антител к бензо[а]пирену с помощью антител против IgG человека, меченных пероксидазой хрена и субтрата пероксидазы - тетраметилбензидин.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

1. Для осуществления способа использовались сыворотки крови доноров. Все исследования были проведены с согласия доноров крови.

2. Антитела по изобретению известны и подробно описаны в Ustinov et al., 2015 и Studennikov et al., 2017. Использовались: человеческое рекомбинантное идиотипическое антитело против бензо[а]пирена - Т72, и человеческое рекомбинантное антиидиотипическое антитело против бензо[а]пирена - А4. Все антитела были экспрессированы и выделены из E. coli.

3. Лунки иммунологического планшета сенсибилизировали 50 мкл буферным раствором PBS с одноцепочечными антителами А4 20 нг/мкл и в другие лунки иммунологического планшета - Т72 20 нг/мкл инкубированием в течение часа при 37°С с покачиванием.

4. Затем во все лунки иммунологического планшета вносили 250 мкл буферного раствора PBS с 1% БСА и 0,05% твин-20, инкубировали час при 37°С с покачиванием.

5. Промывали 3 раза по 250 мкл буферным раствором PBS с 0,05% твин-20.

6. Затем вносили во все лунки иммунологического планшета по 50 мкл раствора коммерческого препарата антител против IgG человека, меченных пероксидазой хрена, с разведением 1:5000 и инкубировали час при 37°С с покачиванием.

7. Все лунки иммунологического планшета промывали 3 раза по 250 мкл буферным раствором PBS с 0,05% твин-20.

8. Регистрацию сигнала проводили с помощью коммерческого раствора тетраметилбензидин (по 50 мкл в каждую лунку иммунологического планшета) при длине волны 450 нм.

Изобретение предлагается использовать для осуществления метода иммуноанализа идиотипических и антиидиотипических антител антител против бензо[а]пирена в биологических жидкостях человека, в котором в качестве антигенов применяются - человеческие рекомбинантные идиотипические и антиидиотипические антитела к бензо[а]пирену, иммобилизованные на иммунологический планшет.

В то же время, нами получены рекомбинантные антитела человека, специфичные к наиболее распространенным канцерогенам окружающей среды - бензо[а]пирену, которые можно использовать в качестве стандарта, а также соответствующие антиидиотипические рекомбинантные антитела человека к бензо[а]пирену, которые можно использовать в качестве антигена при разработке безопасного для здоровья метода иммуноанализа антител против химических канцерогенов в биологических жидкостях человека.

Таким образом, значимость и причинно-следственная связь с заявленным техническим результатом разработки предлагаемого способа определения антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека обусловлена следующим:

- доказанным канцерогенным эффектом бензо[а]пирена из окружающей среды;

- возможностью выявления неизвестных ранее иммунологических механизмов адаптации человека к бензо[а]пирену и особенностей их нарушения при онкологических заболеваниях;

- практической важностью создания информативного и безопасного для здоровья метода оценки индивидуальных онкологических рисков для последующей профилактики рака.

Причинно-следственная связь с заявленным техническим результатом достигается за счет использования в качестве антигена не конъюгаты бензо[а]пирена с белком и антитела иммунизированных животных, а гомогенной системы нативных человеческих идиотипических и антиидиотипических антител.

Предлагаемый способ актуален, осуществим и позволяет достигать заявленный технический результат, отличается от известных аналогов и имеет явные преимущества перед ними.

Сущность предлагаемого изобретения показана в табл. 1 и табл. 2:

где в табл. 1 показаны средние значения уровней идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в сыворотках крови здоровых доноров и больных раком легкого;

в табл. 2 - воспроизводимость и чувствительность предлагаемого метода в сравнении с ранее предложенным методом определения уровней идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в сыворотках крови человека.

Табл. 1. Значения средних арифметических значений уровней для идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в сыворотках крови здоровых доноров и больных раком легкого. В последнем столбце указаны данные Т-критерия Стьюдента между группами больных и здоровых людей по идиотипическим и антиидиотипическим антителам к бензо[а]пирену. Уровни антител рассчитывали по формуле: (оптическая плотность антитела - оптическая плотность фона) / оптическая плотность фона.

Табл. 2. Воспроизводимость и чувствительность предлагаемого метода в сравнении с ранее предложенным методом. Воспроизводимость определяли несколькими измерениями идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в сыворотках крови. Чувствительность предлагаемого метода расчитывали по калибровочной кривой, построенной по результатам иммуноферментного анализа прямого связывания очищенных человеческих рекомбинантных идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену.

Способ определения идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека, включающий забор и подготовку донорской крови, иммобилизацию человеческого рекомбинантного идиотипического Т72 и антиидиотипического А4 антител к бензо[а]пирену на иммунологический планшет, инкубацию с сывороткой крови человека, инкубацию с антителами к IgG человека, меченными пероксидазой хрена, и анализ связавшихся антител с помощью раствора тетраметилбензидина.