Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода



Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода
Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода

Владельцы патента RU 2733935:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризующийся погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25%-ный раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II) и инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут. Изобретение обеспечивает сокращение длительности процедуры иммобилизации. 2 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 ил.

 

Изобретение относится к способам иммобилизации рецепторного слоя электрохимических биосенсоров. Изобретение создано с целью совершенствования конструкций современных электрохимических биосенсоров, а именно: сокращения временных, материало- и трудозатрат, миниатюризации и автоматизации. Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине, технологии изготовления биосенсорных устройств.

Известен способ ковалентной иммобилизации белковых молекул на поверхность предметного стекла посредством реакции CuAAC [P.-C. Lin, S.-H. Ueng, M.-C. Tseng, J.-L. Ko, K.-T. Huang, S.-C. Yu, A. K. Adak, Y.-J. Chen, C.-C. Lin / Site-Specific Protein Modification through CuI-Catalyzed 1,2,3-Triazole Formation and Its Implementation in Protein Microarray Fabrication// Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 4286-4290]. Предметное стекло функцианолизировали азидными группами, после чего проводили реакцию CuAAC катализируемую системой "CuSO4-трис(карбоксиэтил)-фосфин" с алкин-функцианализированными белками, в течение 12 часов.

Описан метод [E. Sánchez-Tirado, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, J. M. Pingarrón / Carbon nanotubes functionalized by click chemistry as scaffolds for the preparation of electrochemical immunosensors. Application to the determination of TGF-beta 1 cytokine // Analyst 14 (2016) 5730-5737] к иммобилизации антител на рабочий электрод посредством CuAAC реакции на поверхности азид-функционализированных углеродных нанотрубок. CuAAC реакция протекала в объеме суспензии, содержащей предварительно синтезированные конъюгаты антител с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом, после чего на рабочий электрод капали нанотрубки с иммобиллизованными антителами. В качестве катализатора авторы применяли систему "CuSO4-аскорбиновая кислота", время реакции составляло12 часов.

Известен способ адресной иммобилизации белков на поверхности силиконового носителя с использованием реакции CuAAC [T. Vrankena, E. S. Redeker, A. Miszta, B. Billena, W. Hermens, B. de Laat, P. Adriaensens, W. Guedensa, T. J. Cleij / In situ monitoring and optimization of CuAAC-mediated proteinfunctionalization of biosurfaces // Sensors and Actuators B 238 (2017) 992–1000]. В предложенном способе поверхность карбоксилированной силиконовой подложки модифицировали азидным линкером, белковую молекулу алкилиовали эфиром N-гидроксисукцинимида. После этого между азидной группой функционализированной подложки и ацетиленфункционализированным белком проводили реакцию CuAAC, катализируемую системой "CuSO4-аскорбат натрия". Общее время иммобилизации превышало 4 часа.

Также известен метод [N. Meini, M. Ripert, C. Chaix, C. Farre, G. De Crozals, R. Kherrat, N. Jaffrezic-Renault / Label-free electrochemical monitoring of protein addressing through electroactivated “click” chemistry on gold electrodes // Materials Science and Engineering C 38 (2014) 286–291] адресной иммобилизации стрептавидина на поверхности золотого электрода. Поверхность электрода модифицировали гексинил-терминальным дитиол фософорамидитом, после чего между ацетиленовой группой данного соединения и предварительно синтезированным конъюгатом «азид-полиэтиленгликоль-биотин» проводили клик-реакцию, катализируемую ионами меди Cu(I), электрогенерируемыми из раствора CuSO4. Далее модифицированный рабочий электрод инкубировали в суспензии стрептавидина. Общее время иммобилизации составило 2 часа 30 минут.

Другим известным техническим решением служит способ иммобилизации фермента пероксидазы хрена на поверхности рабочего электрода с использованием реакции CuAAC [G. Rydzek, T. G. Terentyeva, A. Pakdel, D. Golberg, J. P. Hill, K. Ariga / Simultaneous Electropolymerization and Electro-Click Functionalization for Highly Versatile Surface Platforms // American Chemical Society 5(2014) 5240-5248]. В предложенном способе на поверхности рабочего электрода из оксида индия-олова проводили реакцию электрополимеризации 4-азиданилина с одновременным протеканием реакции CuAAC, катализируемой ионами Cu(I), электровосстановленными из раствора сульфата меди в течении 450 циклов. В реакцию азид-алкинового циклоприсоединения вступали азидные группы электроосажденной пленки полимера и уницидиновая кислота, после чего посредством карбодиимидной сшивки происходила иммобилизация на электрод фермента. Существенным недостатком предложенного способа является длительность (более 4 часов) и многостадийность процедуры иммобилизации.

Недостатками вышеописанных методов и способов являются длительность и многостадийность процедуры иммобилизации, необходимость предварительного получения и очистки конъюгатов. Кроме того, присутствие ионов меди в растворе на стадии инкубирования белков может приводить к уменьшению аффинности иммунорецептора и, следовательно, ухудшить чувствительность и точность определения.

Предлагаемый способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризуется погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25% раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II), перемещением электрода в водный раствор эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида, наложением трех линейных разверток потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В при перемешивании, инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут. Частицы Cu0 электрохимически осаждают либо одновременно с формированием на электроде пленки поливинилбензилазида, добавляя в электрохимическую ячейку гексафторацетилацетонат меди (II), либо в заранее сформированную на электроде пленку поливинилбензилазида из водного раствора 0,01 М CuSO4 при потенциале -1 В в течение 120 секунд.

Общая схема процедуры иммобилизации и уравнения соответствующих химических реакций приведены в приложении 1.

Электрополимеризация винилбензилазида и электрохимическое осаждение частиц меди позволяет сформировать на поверхности электрода пленку, пригодную для последующего проведения реакции CuAAC при минимальных временных, материало- и трудозатратах, поскольку катализатор – ионы Cu1+ генерируется и локализуется непосредственно в области протекания реакции - приэлектродном слое, винилбензилазид иммобилизован на электроде, а эфир пропаргил-N-гидроксисукцинимида содержится в растворенном виде и непрерывно доставляется к электроду посредством перемешивания раствора. Адресность иммобилизации белка достигается за счет электрополимеризации винилбензилазида, а уменьшение числа материало- и трудозатрат - отсутствием стадии синтеза и очистки конъюгатов белков с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом. Общее иммобилизации не превышает 60 минут, 30 минут из которых требуется для инкубации модифицированного электрода в суспензии белка. Иммобилизация белка в предложенном способе протекает в одну стадию без непосредственного контакта с ионами меди, что способствует сохранению нативной структуры белка.

Таким образом, предлагаемое техническое решение направлено создание на поверхности рабочего электрода адресно локализованного функционального покрытия для ковалентного связывания с белком посредством реакции CuAAC. Это позволит уменьшить число стадий и сократить длительность процедуры иммобилизации.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Стеклоуглеродный дисковый электрод помещают в раствор диметилформамида, содержащий 25% винилбензилазида, 0,01 М гексафторацетилацетоната меди и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Модифицированный электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия и производят трехкратную линейную развертку потенциала от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в растворе, содержащем антитела против карциноэмбрионального антигена в концентрации 0,1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], до (1) и после (2) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 1).

На фигуре 1 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на стеклоуглеродном дисковом электроде до (1) и после (2) проведения процедуры иммобилизации антител против карциноэмбрионального антигена.

Пример 2

Толстопленочный графитсодержащий электрод помещают в раствор диметилформамида содержащий 25 % винилбензилазида и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,01 М CuSO4 и выдерживают при потенциале -1 В в течение 120 секунд. Модифицированный электрод помещают в раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия, и производят трехкратную линейную развертку потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в суспензии бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине сопротивления переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], до (3) и после (4) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 2).

На фигуре 2 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на толстопленочном графитсодержащем электроде до (3) и после (4) проведения процедуры иммобилизации бычьего сывороточного альбумина.

1. Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризующийся погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25%-ный раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II), перемещением электрода в водный раствор эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида, наложением трех линейных разверток потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В при перемешивании, инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы Cu0 электрохимически осаждают одновременно с формированием на электроде пленки поливинилбензилазида, добавляя в электрохимическую ячейку гексафторацетилацетонат меди (II).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в заранее сформированную на электроде пленку поливинилбензилазида электрохимически осаждают частицы Cu0 из водного раствора 0,01 М CuSO4 при потенциале -1 В в течение 120 секунд.



 

Похожие патенты:

Устройство для идентификации перевернутых яиц партии яиц содержит модуль нагрева, выполненный с возможностью воздействия потоком излучения на воздушную полость в каждом яйце партии яиц.

Изобретение относится к области иммунохроматографического анализа. Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем лактатом серебра и гидрохиноном заключается в том, что предварительно подготавливают две мембраны - нитроцеллюлозную, пропитанную 0,075 % раствором лактата серебра, и мембрану, обработанную 3 % раствором гидрохинона, приготовленным на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0; собирают готовый мультимембранный композит иммунохроматографической тест-системы путем наклеивания на нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембраны для образца и мембраны для абсорбента; тестируют готовую иммунохроматографическую тест-систему путем внесения 100 мкл пробы на мембрану для образца; накладывают через 10 минут после внесения пробы на детектируемую зону тест-системы мембрану, пропитанную 3 % раствором гидрохинона; наносят на наложенную мембрану 30 мл 0,01 М Трис-НСl буфера с 1 М NaCl с 0,1 % Tween-20, рН 7,5, через 5 мин удаляют мембрану с гидрохиноном и определяют в тестовой зоне детектируемый антиген.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для экспресс-диагностики связи кисты поджелудочной железы с протоковой системой. Осуществляют оценку состояния ее содержимого.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству. Способ прогнозирования развития хориоамнионита у женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности и угрозой невынашивания заключается в том, что у женщин во втором триместре беременности с угрозой невынашивания определяют маркеры обострения цитомегаловирусной инфекции в баллах (А), содержание в сыворотке крови интерлейкина – 6 (IL-6) (пг/мл) (В); толщину плаценты при её ультразвуковом исследовании в баллах (С), проводят оценку клинико-эхографических признаков угрозы невынашивания в баллах (N), а затем прогнозируют развитие хориоамнионита с помощью дискриминантного уравнения: D = -1,085×А - 0,870×В - 2,056×С - 0,504×N, где D – дискриминантная функция, и при D равном или больше -15,86 прогнозируют отсутствие риска развития хориоамнионита, при D меньше -15,86 прогнозируют развитие хориоамнионита.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, может быть использовано для оценки риска развития прогрессии заболевания при лечении пациентов с плоскоклеточным раком гортани.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, хирургии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики заболеваний поджелудочной железы. На этапе обследования в крови больного с заболеванием поджелудочной железы методом иммунофенотипирования определяют содержание дегидроэпиандростерона-сульфата - ДГЭА-S и 17-оксипрогестерона - 17-ОНР.

Изобретение относится к области медицины. Способ иммунофлуоресцентной детекции локальной распространенности опухолевого процесса при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) включает приготовление одноклеточной суспензии из образца ткани НМРЛ, фиксацию в 4% растворе формалина, отмывку с помощью фосфатного буфера рН=7,4, инкубацию с красителем ДНК Hoechst 33258, двойную отмывку от антител с помощью 0,05% раствора БСА в фосфатном буфере рН=7,4, проведение анализа флуоресценции на проточном цитофлуориметре, при этом инкубацию проводят одновременно с двумя типами первичных антител – кроличьи антитела к TUBB3 и мышиные антитела к цитокератинам, при этом первичные антитела к TUBB3 и цитокератину добавляют одновременно и инкубируют в течение ночи при температуре +4°С, и одновременно с двумя типами вторичных антител - антикроличьи антитела, конъюгированные с красителем DyLight 650, и антимышиные антитела, конъюгированные с DyLight 488, строят точечные гистограммы, сравнивают уровни экспрессии TUBB3 в эпителиальных клетках опухоли и окружающей нормальной ткани, где повышенная экспрессия TUBB3 характеризует локальную распространенность опухолевого процесса при НМРЛ.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, андрологии, репродуктологии, и может быть использовано для определения качества эякулята у мужчин по активности креатинфосфокиназы в спермальной плазме.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ иммобилизации меченого олигонуклеотида, способ иммобилизации интересующей молекулы (варианты), микрочип, диагностический набор для определения нуклеиновой кислоты, а также применение присоединенной к олигонуклеотиду метки для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате.

Изобретение относится к области экологии, прикладной гидробиологии и охране окружающей среды и предназначено для оценки экологического состояния прибрежных морских акваторий.

Группа изобретений относится к определению продукции нейтрализующих антител у субъектов, проходящих лечение болезни Гоше. Раскрыт способ детекции нейтрализующего антитела против глюкоцереброзидазы в образце от субъекта, включающий иммобилизацию глюкоцереброзидазы на поверхность; приведение образца в контакт с иммобилизованной глюкоцереброзидазой; стадию промывки; добавление меченой глюкоцереброзидазы; стадию промывки для удаления меченой глюкоцереброзидазы, которая не связалась с антителом против глюкоцереброзидазы; обнаружение и количественную оценку метки; оценку присутствия специфического изотипа антитела против глюкоцереброзидазы, где изотип выбран из группы, состоящей из IgG, IgM, IgA и IgE, и определение, нейтрализует ли антитело против глюкоцереброзидазы активность глюкоцереброзидазы, с использованием клеток, которые экспрессируют человеческие рецепторы макрофагов против маннозы (MMR).
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2019-03-26 2020-10-08T10:20:38
Наверх