Способ получения растений-регенерантов рода brassica in vitro

Способ относится к биотехнологии и может быть использован для получения нового исходного материала для создания сортов. Способ включает изолирование соцветий и культивирование пыльников и завязей на питательной среде. Изолированные соцветия выдерживают в течение двух суток в условиях низкой положительной температуры от 4 до 6°C с одновременным погружением их в раствор дроппа, взятый в концентрации 10 мг/л, приготовленный на основе католита. Затем раствором анолита АНК, взятого в концентрации 0,03%, в течение 10 минут осуществляют стерилизацию бутонов и культивируют их на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга, приготовленной на основе электрохимически активированного водного раствора католита. В качестве индукторов эмбриогенеза используют препарат дроппа в концентрации 0,01 мг/л и индолилуксусную кислоту в концентрации 0,3 мг/л. Способ обеспечивает ускорение процесса селекции за счет повышения частоты образования гаплоидных растений рода Brassica in vitro. 1 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности прикладным исследованиям, связанным с получением нового исходного материала для создания сортов, и может быть востребовано образовательными и научными учреждениями биотехнологического и сельскохозяйственного профиля, семеноводческими компаниями и селекционными станциями.

Наиболее известные способы получения гаплоидных растений до сих пор применяются для многих культур, но они позволяют получать их в небольшом количестве (Патент СССР №1650051 А1, патент СССР №1036306 А1, патент WO 2005084420, патент JPH 0698648, патент СССР 5770788 А, СССР 6362393 В1, патент KR 100952103, патент WO 2002052926 A3, патент SUS 6764854 В2, патент РФ №2120741, патент РФ №2175189, патент РФ №2035134, патент РФ №2084135, патент РФ №2142013, патент РФ №2557389, патент РФ №2681339).

Показано, что нет универсальной технологии, позволяющей получить достаточный результат на разных растениях, в связи с чем разрабатываются регламенты для конкретных видов растений для решения какой-либо частной проблемы.

Культура репродуктивных органов - один из эффективных методов создания чистых линий за короткое время. С его помощью можно ускорить процесс получения F1 гибридов представителей рода Brassica (капуста белокочанная, капуста краснокочанная, брокколи, кольраби, брюссельская капуста) - экономически важных сельскохозяйственных культур, которые возделывают во всем мире.

Однако эффективность эмбриогенеза зависит от многих факторов, которые еще недостаточно изучены. В связи с этим достаточно эффективная технология культивирования пыльников и завязей представителей рода Brassica пока что не разработана и работы по выявлению сортов, гибридов, линий, обладающих высокой гаплоидной способностью и установление факторов, оказывающих влияние на этот процесс, являются актуальными.

Для создания гаплоидных растений применяют различные первичные экспланты: изолированные пыльники, микроспоры, завязи, семяпочки, а также изолированные зародыщи, у которых потеряна отцовская хромосома.

Например, известен способ получения гаплоидных растений овощных культур, заключающийся в культивировании изолированных пыльников на безгормональной питательной среде Мурасиге и Скуга, обогащенной 120 г/л сахарозы + 3 мг/л 6-БАП + 1 мг/л -НУК + 2 мг/л AgNO3 + 1 мг/л янтарной кислоты (Савенко Е.Г., Королева С.В., Мухина Ж.М., Глазырина В.А., Шундри Л.А. Получение гаплоидов овощных культур для повышения эффективности селекции // Е.Г. Савенко, С.В. Королева, Ж.М. Мухина, В.А. Глазырина, Л.А. Шундри / Овощеводство. - №2(25). - 2014). Недостатком данного метода является то, что на изолированных пыльниках всех изучаемых генотипов капусты белокочанной первоначально образуется каллусная ткань. В таком способе, образовавшиеся растения-регенеранты не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности, в связи с гетерогенностью клеток каллусной ткани по числу хромосом. Кроме того, в настоящее время до конца не выявлено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Известен способ создания гаплоидов и удвоенных гаплоидов овощных культур - по морфологическим признакам и с помощью цитологического анализа отбирали бутоны, пыльники которых содержали микроспоры преимущественно одноядерной стадии развития. Бутоны поверхностно стерилизовали и раздавливали в небольшом объеме питательной среды. Полученную суспензию фильтровали, центрифугировали, микроспоры дважды промывали свежей средой. Микроспоры культивировали на жидкой питательной среде NLN с добавлением активированного угля и регуляторов роста NAA и 2,4-D в темноте. После введения в культуру микроспоры подвергали высокотемпературной обработке в течение 2 суток, затем культивировали при температуре 24°С. Через три месяца отметили формирование веретеновидных и шаровидных многоклеточных структур и эмбриоида в семядольной стадии развития, после чего микроспоры культивировали при бытовом освещении на шейкере (65 об/мин). На пятый месяц наблюдали формирование эмбриоидов у пяти из двенадцати генотипов. В зависимости от генотипа наблюдали образование от 0 до 3,5 эмбриоподобных структур, однако только 4 из 17 сформировавшихся структур достигли семядольной стадии развития (Чистова А.В., Монахос С.Г. // Получение удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор и перспективы их использования / А.В. Чистова, С.Г. Монахос. Тезисы XV Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2015 г.). - М.: ВНИИСБ, 2015. - С. 18-20).

Известен другой способ получения гаплоидных растений - из изолированных микроспор. Технология предусматривает применение стандартного протокола получения DH-растений в культуре изолированных микроспор in vitro и протокола с добавлением в питательную среду нитрата серебра (AgNO₃) в концентрации 0,1 мг/л, для индукции эмбриогенеза у Brassica purpuraria. - прототип.

Стандартный протокол получения DH-растений включает в себя культивирование микроспор in vitro на питательной среде NLN-13, с последующей их температурной обработкой в термостате при 32°С. Эмбриоиды на сердечковидной и торпедовидной стадиях помещают на среду МС, рН 5,8 с 2% сахарозы, 7 г/л агара с добавлением регуляторов роста ГК 0,1 мг/л и БАП 1 мг/л.

В результате исследования было установлено, что эмбриогенез в культуре В. purpuraria возможен как при использовании стандартного протокола, так и с добавлением нитрата серебра. Выход эмбриоидов варьировал в зависимости от генотипа индивидуального растения в пределах сортообразца и составил 40 эмбриоидов на одну чашку Петри (Козарь Е.В., Коротцева К.С., Романова О.В., Чичварина О.А., Кан Л.Ю., Ахраменко В.А., Домблидес Е.А. // Получение удвоенных гаплоидов Brassica purpuraria / Е.В. Козарь, К.С. Коротцева, О.В. Романова, О.А Чичварина., Л.Ю. Кан, В.А. Ахраменко, Е.А. Домблидес. Овощи России. 2019. №6(50). С. 10-18). Недостатком данного метода являлось то, что на этапе регенерации примерно половина растений-регенерантов оказались альбиносами и были нежизнеспособны. Показана высокая степень спонтанного удвоения хромосом в растениях-регенерантах. Всего было получено 38 растений из сортообразца No1301. Выявлено, что у некоторых DH-растений при инбридинге проявляется самонесовместимость (4 шт), в то время как у остальных растений было получено семенное потомство.

Из анализа известных аналогичных технических решений выявлено, что технической проблемой в данной области является необходимость расширения арсенала технологий для массового получения гаплоидных растений различных культур.

Техническим результатом изобретения является ускорение процесса селекции за счет повышения частоты образования гаплоидных растений рода Brassica in vitro, используемых в качестве нового исходного материала для создания сортов.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного технического результата производят изолирование соцветий и культивирование пыльников и завязей на питательной среде Мурасиге-Скуга. Изолированные соцветия выдерживают в течение двух суток в условиях низкой положительной температуры от 4 до 6°C с одновременным погружением их в раствор дроппа, взятый в концентрации 10 мг/л, приготовленный на основе католита. Затем раствором анолита АНК, взятого в концентрации 0,03% в течение 10 минут осуществляют стерилизацию бутонов и культивируют их на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга, приготовленной на основе электрохимически активированного водного раствора католита. В качестве индукторов эмбриогенеза используют препарат дропп в концентрации 0,01 мг/л и индолилуксусную кислоту в концентрации 0,3 мг/л.

Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

Работу проводили на бутонах, которые изолировали как с главного, так и боковых побегов. В исследованиях была применена следующая схема работы:

1) выдерживание соцветий в течение 2-х суток в условиях низкой положительной температуры (+4-6°С) с одновременным погружением их раствор дроппа в концентрации 10 мг/л, приготовленного на основе католита,

2) стерилизация бутонов раствором анолита АНК в концентрации 0,03% в течение 10 мин. Это позволило получить выход 90-100% стерильных и жизнеспособных эксплантов,

3) пыльники и завязи асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и культивировали на индуцирующей питательной среде МС, содержащей препарат дропп 0,01 мг/л и индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,3 мг/л, приготовленной на основе электрохимически активированного водного раствора католита в чашках Петри. Культивировали пыльники и завязи в климакамере (Binder, Германия) в темноте при температуре 35°С в течение 5-ти суток, после чего температурный режим уменьшали до 25°С. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем переносили в световую комнату, где был установлен 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс.лк.

4) Сформированные эмбриоиды отделяли от первичного экспланта и переносили на среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, а также гормоны ИУК - 2 мг/л, БАЛ - 1 мг/л, сахарозу - 3%, агар - 7 г/л. Питательная среда приготовлена на основе электрохимически активированного водного раствора католита. В этих условиях из эмбриоидов формировались растения, которые проявили высокую способность к последующему размножению.

Предлагаемый способ получения растений-регенерантов сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической селекционной работе:

1. Способ предполагает применение на всех этапах технологии получения гаплоидных растений доступного растворителя, в виде водного раствора католита и аналита.

2. Способ увеличивает на 20-30% выход стерильных и жизнеспособных пыльников и завязей и предполагает использование дешевого стерилизатора.

3. Предлагаемый способ повышает способность изолированных пыльников и завязей к эмбриогенезу на 2-3%.

4. Предлагаемый способ получения гаплоидных растений является экологически чистой и экономически выгодной технологией, которая не сложна в исполнении по сравнению с ранее предложенными известными авторами.

Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения гаплоидных растений. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением электрохимически активированных водных растворов, не достигался в известных решениях.

Использование изобретения позволит увеличить частоту возникновения гаплоидных растений в 2-3 раза, что дает возможность получать их в количестве, достаточном для ведения селекционных работ, что в значительной степени ускоряет процесс селекции.

Способ получения растений-регенерантов рода Brassica in vitro, включающий изолирование соцветий и культивирование пыльников и завязей на питательной среде Мурасиге-Скуга, отличающийся тем, что изолированные соцветия выдерживают в течение двух суток в условиях низкой положительной температуры от 4 до 6°C с одновременным погружением их в раствор дроппа, взятый в концентрации 10 мг/л, приготовленный на основе католита, затем раствором анолита АНК, взятого в концентрации 0,03%, в течение 10 минут осуществляют стерилизацию бутонов и культивируют их на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга, приготовленной на основе электрохимически активированного водного раствора католита, при этом в качестве индукторов эмбриогенеза используют препарат дропп в концентрации 0,01 мг/л и индолилуксусную кислоту в концентрации 0,3 мг/л.