Продукты лечебного питания и косметические средства для увеличения количества апоптотических клеток и уменьшения количества некротических клеток и способ получения компонента из прорастающих виноградных косточек для увеличения количества апоптотических клеток и уменьшения количества некротических клеток
Изобретение относится к пищевой и косметической промышленности. Продукт питания или косметическое средство, содержащий компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или более полифенола грубой очистки, полученного из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, при этом компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек получен экстрагированием из виноградных косточек в состоянии прорастания, виноградные косточки представляют собой одну или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L., продукт питания обеспечивает увеличение количества апоптотических клеток и уменьшение количества некротических клеток. Способ получения компонента из стимулированных к прорастанию виноградных косточек для увеличения количества апоптотических клеток и уменьшения количества некротических клеток, включающий: (этап 1) погружение одной или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L., в воду при 30-60°С на 20-80 часов; (этап 2) удаление из воды виноградных косточек, погруженных на указанном этапе 1, и естественное высушивание их на воздухе; (этап 3) погружение виноградных косточек, естественным образом высушенных на указанном этапе 2, в воду при 15-45°С на 10-100 минут; (этап 4) удаление из воды виноградных косточек, погруженных на указанном этапе 3, и естественное высушивание их на воздухе; (этап 5) повторение указанных этапов 3 и 4 для стимулирования прорастания виноградных косточек до тех пор, пока зародышевая часть виноградных косточек, естественным образом высушенных на указанном этапе 4, слегка не вздуется и не набухнет; (этап 6) высушивание стимулированных к прорастанию виноградных косточек при 35-60°С; (этап 7) измельчение в порошок виноградных косточек, высушенных на указанном этапе 6; (этап 8) получение экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек, путем погружения измельченных в порошок виноградных косточек, полученных на указанном этапе 7, в воду, этанол или смешанный растворитель из воды и этанола; и (этап 9) высушивание и измельчение в порошок полученной на указанном этапе 8 экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек. Изобретение позволяет получить антивозрастной компонент из виноградных косточек, обладающий лучшим антивозрастным эффектом, чем ресвератрол. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 6 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к антивозрастным продуктам лечебного питания и косметическим средствам, а также к способу получения антивозрастного компонента из виноградных косточек, в частности к антивозрастным продуктам лечебного питания и косметическим средствам, обладающим улучшенным антивозрастным эффектом по сравнению с ресвератролом, и к способу получения антивозрастного компонента из виноградных косточек, обладающего улучшенным антивозрастным эффектом.
ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ
[0002] Предшествующее исследование относительно профилактики старения и контроля жизни показало, что соединение, например, ресвератрол (транс-3,4',5-тригидроксистильбен), должно оказывать антивозрастной эффект.
[0003] Например, Konrad Т. Howitz et al., Nature 425, и 191-196 (2003) сообщает, что у почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) ресвератрол стимулировал Sir2, фермент Caenorhabditis elegans, регулируя продолжительность жизни путем улучшения стабильности ДНК почкующихся дрожжей, увеличивая тем самым продолжительность жизни почкующихся дрожжей на 70%.
[0004] Однако, как описано в Richard A. Miller et al., Journal of Gerontology: BIOLOGICAL SCIENCES 191-201 (2010), сообщалось, что ресвератрол не увеличивает продолжительность жизни самцов и самок мышей и не оказывает какого-либо антивозрастного эффекта.
[0005] Соответственно, хотя ожидается, что ресвератрол обладает антивозрастным эффектом, не было подтверждено, действительно ли ресвератрол обладает антивозрастным эффектом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Как описано выше, не было подтверждено, действительно ли ресвератрол, по ожиданиям обладающий антивозрастным эффектом, обладает таким антивозрастным эффектом.
Соответственно, существует потребность в веществе, обладающем более надежным и лучшим антивозрастным эффектом, чем ресвератрол.
[0007] После серьезного рассмотрения авторами настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт, состоящий из полифенола из виноградных косточек, обладает лучшим антивозрастным эффектом, чем ресвератрол.
[0008] Задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в обеспечении антивозрастного компонента из виноградных косточек, обладающего лучшим антивозрастным эффектом, чем ресвератрол, и который, как ожидается, имеет такой антивозрастной эффект, и способа получения такого антивозрастного компонента из виноградных косточек, и в обеспечении антивозрастных продуктов лечебного питания и антивозрастных косметических средств, содержащих данный антивозрастной компонент.
СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ
[0009] Настоящее изобретение в соответствии с первым аспектом относится к антивозрастным продуктам лечебного питания и косметическим средствам, содержащим антивозрастной компонент из виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или больше полифенола грубой очистки, полученного из виноградных косточек.
[0010] Настоящее изобретение в соответствии со вторым аспектом относится к способу получения антивозрастного компонента из виноградных косточек, включающему:
(этап 1) предварительную обработку одной или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrasca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L., с тем чтобы вызвать прорастание этих виноградных косточек, и высушивание прорастающих виноградных косточек при 35°C-60°C;
(этап 2) измельчение в порошок виноградных косточек, высушенных на этапе 1;
(этап 3) получение экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек, путем погружения измельченных в порошок виноградных косточек, полученных на этапе 2, в воду, этанол или смешанный растворитель из воды и этанола; и
(этап 4) высушивание и измельчение в порошок экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек на этапе 3.
[0012] Настоящее изобретение в соответствии с третьим аспектом относится к антивозрастным продуктам лечебного питания и косметическим средствам по первому аспекту или способу по второму аспекту, где виноградная косточка представляет собой семя одного или нескольких сортов винного винограда, выбранных из группы, состоящей из: Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро дАвола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау Мурведр, Менье, Мелон де Бургонь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне.
Эффект настоящего изобретения
[0012] Согласно первому аспекту настоящего изобретения антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства содержат антивозрастной компонент из виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или больше полифенола грубой очистки, полученного из виноградных косточек. Таким образом, можно обеспечить получение антивозрастных продуктов лечебного питания и косметических средств, обладающих хорошим антивозрастным эффектом.
[0013] Согласно второму аспекту настоящего изобретения антивозрастной компонент из виноградных косточек получают на этапах, где (этап 1) предварительно обрабатывают одну или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrasca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L., чтобы вызвать прорастание этих виноградных косточек, и высушивают прорастающие виноградные косточки при 35°C-60°C;
(этап 2) измельчают в порошок виноградные косточки, высушенные на этапе 1;
(этап 3) получают экстрагированную фракцию, содержащую полифенол, полученный из виноградных косточек, путем погружения измельченных в порошок виноградных косточек, полученных на этапе 2, в воду, этанол или смешанный растворитель из воды и этанола; и
(этап 4) сушат и измельчают в порошок экстрагированную фракцию, содержащую полифенол, полученный из виноградных косточек на этапе 3. Таким образом, можно изготовить антивозрастной компонент из виноградных косточек, обладающий хорошим антивозрастным эффектом.
[0014] Согласно третьему аспекту настоящего изобретения виноградная косточка, используемая для антивозрастных продуктов лечебного питания и косметических средств по первому аспекту или для способа по второму аспекту, представляет собой семя одного или более сортов винного винограда, выбранных из группы, состоящей из Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро д'Авола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау Мурведр, Менье, Мелон де Бургонь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне. Таким образом, можно изготовить антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства, обладающие лучшим антивозрастным эффектом, или можно изготовить антивозрастной компонент из виноградных косточек, обладающий лучшим антивозрастным эффектом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0015] [Фиг. 1] На фиг. 1 представлен график, показывающий количество стареющих клеток, рассчитанное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле. На (а) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, предполагая, что количество стареющих клеток, рассчитанное в контроле, составляет 100%, количество стареющих клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано в соотношении с количеством стареющих клеток в контроле.
[Фиг. 2] На фиг. 2 представлен график, показывающий количество митохондрий, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле. На (а) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, предполагая, что количество митохондрий, рассчитанное в контроле, составляет 100%, количество митохондрий в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано в соотношении с количеством митохондрий в контроле.
[Фиг. 3] На фиг. 3 представлен график, показывающий рабочую нагрузку определенного количества митохондрий, измеренную в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле. На (а) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 7 дней, (b) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, предполагая, что рабочая нагрузка определенного количества митохондрий, рассчитанная в контроле, составляет 100%, рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показана в соотношении с рабочей нагрузкой определенного количества митохондрий в контроле.
[Фиг. 4] На фиг. 4 представлен график, показывающий количество апоптотических клеток, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле. На (а) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, предполагая, что количество апоптотических клеток, рассчитанное в контроле, составляет 100%, количества апоптотических клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показаны в соотношении с количеством апоптотических клеток в контроле.
[Фиг. 5] На фиг. 5 представлен график, показывающий количество некротических клеток, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле. На (а) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, предполагая, что количество некротических клеток, рассчитанное в контроле, составляет 100%, количества некротических клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показаны в соотношении с количеством некротических клеток в контроле.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0016] Далее будут описаны антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства, а также способ получения антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению.
Кроме того, в данном описании «старение» относится к состоянию, при котором способность клетки к удвоению уменьшается, или к состоянию, при котором клетка необратимо прекращает расти в фазе G1. Супрессия гена, способствующего прохождению клеточного цикла, и повышенная экспрессия генов p16INK4a и р53, ингибирующих клеточный цикл, и их целевого транскрипционного фактора, p21CIP1, вовлечены в эти состояния. Кроме того, стареющая клетка устойчива к митоген-индуцированной пролиферации клеток и, таким образом, увеличивается в размерах и сглаживается. Стареющая клетка проявляет общий биохимический маркер, такой как связанная со старением активность β-галактозидазы (SA β Gal). Хотя этот феномен старения охарактеризован на культивируемой клетке, было доказано, что он имеет место и в живом организме.
[0017] Антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства по настоящему изобретению содержат антивозрастной компонент из виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или большее полифенола грубой очистки, полученного из виноградных косточек.
[0018] Антивозрастной компонент из виноградных косточек, состоящий из полифенола из виноградных косточек, содержащийся в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению, получают на следующих этапах получения.
[0019] <Этап 1>
На этапе 1 предварительно обрабатывают виноградную косточку, чтобы вызвать прорастание, и высушивают прорастающие виноградные косточки.
[0020] Разновидность винограда для виноградных косточек, используемых в настоящем изобретении, представляет собой, без ограничения, например, один или более видов винограда, выбранных из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrasca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L.
[0021] Среди прочих предпочтительным виноградом является сорт винного винограда, такой как Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу, Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро д'Авола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау Мурведр, Менье, Мелон де Буришь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне. В частности, Каберне Совиньон, Мерло, Сира и Пино Нуар являются более предпочтительными.
[0022] В этом описании «вызвать прорастание» означает стимуляцию виноградной косточки до состояния, в котором она начинает прорастать. Более конкретно, это означает состояние, при котором зародышевая часть виноградной косточки слегка вздулась и набухла.
Степень вздутия представляет собой, без ограничения, например, состояние, при котором поверхность зародышевой части вздулась на 1-2 мм больше, чем у виноградной косточки до прорастания.
Кроме того, в настоящем изобретении виноградные косточки в состоянии проростка, при котором виноградная косточка образует почку, не являются предпочтительными, поскольку они имеют низкую тенденцию к антивозрастному эффекту по сравнению с виноградными косточками в состоянии прорастания.
[0023] В настоящем изобретении способ предварительной обработки виноградных косточек, чтобы вызвать прорастание виноградной косточки, включает без ограничения любые способы, обычно используемые для стимуляции прорастания семян растений, например, физические способы, такие как низкотемпературная обработка, обработка на теплой бане и механическое разрушение, а также химические способы, такие как обработка газом (ацетилен, эфир, газообразный водород и т.д.), обработка ауксином и обработка гиббереллином.
[0024] Как описано выше, в настоящем изобретении способ предварительной обработки виноградных косточек, чтобы вызвать прорастание виноградной косточки, конкретно не ограничен. Например, более конкретно, можно вызвать прорастание виноградных косточек при помощи следующего способа предварительной обработки.
Во-первых, виноградные косточки погружают в воду при 30-60°С
Время погружения предпочтительно составляет, без ограничения, от 20 до 80 часов.
Во-вторых, виноградные косточки, погруженные в воду при 30-60°С, извлекают из воды и естественным образом высушивают на воздухе. Температура естественной сушки предпочтительно составляет, без ограничения, от 10 до 50°С. Время естественной сушки предпочтительно составляет, без ограничения, от 1 до 10 часов.
[0025] Затем виноградные косточки, естественным образом высушенные на воздухе, погружают в воду при температуре 15-45°С.
Время погружения предпочтительно составляет, без ограничения, от 10 до 200 минут.
Во-вторых, виноградные косточки, погруженные в воду при 15-45°С, извлекают из воды и естественным образом высушивают на воздухе.
Температура естественной сушки предпочтительно составляет, без ограничения, от 10 до 50°С
Время естественной сушки предпочтительно составляет, без ограничения, от 3 до 12 часов.
[0026] Этап погружения виноградных косточек в воду при температуре 15-45°С и этап их естественной сушки на воздухе (т.е. периодическое погружение виноградных косточек в воду) повторяют до тех пор, пока зародышевая часть виноградной косточки слегка не вздуется и не набухнет после естественной сушки.
Когда зародышевая часть виноградных косточек слегка вздулась и набухла после естественной сушки, виноградные косточки извлекают и дополнительно сушат в течение 2-5 дней при температуре, достаточной для стерилизации различных патогенных микроорганизмов (80°С или меньше).
Это время сушки можно соответствующим образом изменить в зависимости от сезона, температуры окружающей среды или влажности.
[0027] Эта стимуляция обработкой для прорастания отщепляет молекулу фенола от тонкого слоя фенолов в виноградных косточках. Затем молекула многократно связывается с образованием полифенола.
Хотя ресвератрол, разновидность полифенола, имеет молекулярную массу приблизительно 250, этот недавно полученный компонент характеризуется крупной полимерной структурой, содержащей компонент с молекулярной массой 4000.
[0028] <Этап 2>
На этапе 2 измельчают в порошок виноградные косточки в состоянии прорастания, высушенные на этапе 1.
В способе измельчения в порошок можно использовать, без ограничения, стандартные способы, такие как измельчение в порошок с помощью мельницы.
[0029] <Этап 3>
На этапе 3 экстрагируют измельченные в порошок виноградные косточки растворителем.
На этом этапе 3 можно получить антивозрастной компонент из виноградных косточек, состоящий из полифенола из виноградных косточек.
В качестве растворителя можно использовать воду, этанол или смешанный растворитель из воды и этанола.
Экстракцию можно выполнить путем добавления 50-1000 частей по весу растворителя к 100 частей по весу измельченных в порошок виноградных косточек.
Как описано выше, антивозрастной компонент из виноградных косточек, состоящий из полифенола из виноградных косточек, содержит полимерный компонент с молекулярной массой приблизительно 4000 (3500-4500).
[0030] <Этап 4>
Затем антивозрастной компонент из виноградных косточек, состоящий из полифенола из виноградных косточек, полученного на этапе 3, сушат и получают.
В способе сушки предпочтительно применяют, без ограничения, декомпрессионную сушку.
В способе измельчения в порошок можно использовать, без ограничения, стандартные способы, такие как измельчение в порошок с помощью мельницы.
Вышеуказанные этапы могут обеспечить антивозрастной компонент из виноградных косточек, состоящий из полифенола, полученного из измельченных в порошок виноградных косточек.
[0031] Антивозрастной компонент из виноградных косточек, полученный на указанных выше этапах, содержит 50-80 вес. % полифенола грубой очистки.
С точки зрения обеспечения существенного антивозрастного эффекта необходимо, чтобы антивозрастной компонент из виноградных косточек содержал вес. % полифенола грубой очистки.
Полифенол, содержащийся в антивозрастном компоненте из виноградных косточек, представляет собой полифенол, содержащийся в семенах каждого сорта винограда, например, ресвератрол, танин и т.п.
50-80 вес. % полифенола, содержащегося в антивозрастном компоненте из виноградных косточек, составляет проантоцианидиновый полимер.
Авторами настоящего изобретения было подтверждено, что антивозрастной компонент из виноградных косточек, содержащий вышеуказанный компонент, обеспечивает антивозрастной эффект.
Термин «грубой очистки» в данном документе означает состояние, при котором экстракт только высушен и измельчен в порошок, содержит посторонние вещества, и не проводится такая обработка, как концентрирование. Антивозрастной компонент из виноградных косточек, полученный на этапах 1-4, является результатом грубой очистки.
[0032] Содержание антивозрастного компонента из виноградных косточек в продуктах лечебного питания может обеспечить антивозрастные продукты лечебного питания по настоящему изобретению.
Благодаря антивозрастному компоненту из виноградных косточек, содержащемуся в продуктах лечебного питания, можно легко и регулярно принимать антивозрастной компонент из виноградных косточек.
Антивозрастные продукты лечебного питания по настоящему изобретению можно изготовить обычным способом путем соответствующего добавления вспомогательных веществ, используемых в качестве обычного пищевого сырья, например глюкозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы, сорбита, стевиозида, рубусозида, кукурузного сиропа, лактозы, лимонной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, янтарной кислоты, молочной кислоты, L-аскорбиновой кислоты, d1-альфа-токоферола, эриторбата натрия, глицерина, пропиленгликоля, сложного эфира глицерина и жирных кислот, сложного эфира полиглицерина и жирных кислот, сложного эфира сахарозы и жирной кислоты, сложного эфира сорбитана и жирной кислоты, сложного эфира пропиленгликоля и жирных кислот, гуммиарабика, каррагенана, казеина, желатина, пектина, агара, витамина В, амида никотиновой кислоты, пантотената кальция, аминокислоты, соли кальция, пигмента, ароматизатора и консерванта.
[0033] Содержание антивозрастного компонента из виноградных косточек в косметических средствах может обеспечить антивозрастные косметические средства по настоящему изобретению.
Благодаря антивозрастному компоненту из виноградных косточек, содержащемуся в косметических средствах, можно регулярно наносить антивозрастной компонент из виноградных косточек.
Форма антивозрастного компонента из виноградных косточек, содержащегося в антивозрастных косметических средствах по настоящему изобретению, предпочтительно, но без ограничения, представляет собой многослойную микрокапсулу с точки зрения легкости проникновения через кожу.
Антивозрастные косметические средства по настоящему изобретению можно изготовить обычным способом путем соответствующего добавления обычно используемых вспомогательных веществ, таких как отбеливающее средство, средство для удаления активного кислорода, антиоксидант, ингибитор ультрафиолета и т.д.
[0034] Потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению предпочтительно, но без ограничения, составляет по меньшей мере 50 мг в день или больше с точки зрения обеспечения существенного антивозрастного эффекта.
Если потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению составляет менее 50 мг в день, антивозрастной эффект не может проявляться в достаточной степени, и, таким образом, потребление не желательно.
Более того, даже если потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению составляет более 7500 мг в день (на массу тела 60 кг), степень увеличения эффекта является небольшой.
Следовательно, потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению предпочтительно составляет 50-7500 мг в день.
В зависимости от применения в антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства по настоящему изобретению можно соответствующим образом добавить вспомогательное вещество, регулятор рН, консервант, хелатирующее средство, стабилизатор или т.п.
[0035] Кроме того, потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек, содержащегося в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению, предпочтительно, но без ограничения, составляет, например, 0,8-125 мг/кг/день с точки зрения обеспечения существенного антивозрастного эффекта.
Если потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению составляет менее 0,8 мг/кг/день, антивозрастной эффект не может проявляться в достаточной степени, и, таким образом, потребление не желательно.
К тому же, даже если потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению составляет более 125 мг/кг/день, это не вызывает дополнительного эффекта.
Следовательно, потребление антивозрастного компонента из виноградных косточек в антивозрастных продуктах лечебного питания и косметических средствах по настоящему изобретению предпочтительно составляет 0,8-125 мг/кг/день.
ПРИМЕРЫ
[0036] Антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства, а также антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению подробно описаны на основе следующих примеров, но способ получения антивозрастных продуктов лечебного питания и косметических средств и антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению не ограничивается этими примерами.
[0037] <Пример 1. Изготовление антивозрастного компонента из виноградных косточек>
Семена Каберне Совиньон погружали в воду приблизительно при 40°С на 45-60 часов, затем эти виноградные косточки извлекали из воды и естественным образом сушили на воздухе при комнатной температуре (приблизительно 25°С) в течение 3-5 часов (хранили в комнате).
Естественным образом высушенные виноградные косточки погружали в воду при 25-30°С на 60-80 минут, затем эти виноградные косточки извлекали из воды и естественным образом сушили на воздухе при комнатной температуре (приблизительно 25°С) в течение 3 часов (хранили в комнате).
Погружение в воду при 30°С и естественную сушку в течение 3 часов повторяли 3 раза, затем осматривали высушенные виноградные косточки. Подтверждено, что приблизительно 5-15% зародышевых частей виноградных косточек вздувались приблизительно на 1 мм. Вышеупомянутые процедуры называются обработкой для прорастания.
Процедуру для прорастания заканчивали, когда подтверждали вздутие зародышевой части виноградных косточек, и виноградные косточки дополнительно сушили при 45°С в течение 3 дней с помощью сушилки с длинноволновым инфракрасным излучением.
После сушки виноградных косточек в течение 3 дней семена измельчали в порошок в мельнице с получением порошка из виноградных косточек.
[0038] Затем 50 частей по весу порошка из виноградных косточек добавляли к 100 частей по весу воды и фракцию, растворенную в воде, экстрагировали с получением антивозрастного компонента из виноградных косточек.
После декомпрессионной сушки полученного антивозрастного компонента из виноградных косточек его измельчали в порошок в мельнице с получением измельченного в порошок антивозрастного компонента из виноградных косточек.
[0039] Общее количество полифенола, содержащегося в измельченном в порошок антивозрастном компоненте из виноградных косточек, определяли количественно.
Количественное определение проводили с использованием официального способа АОАС International (официальный способ АОАС 952.03, 15-е издание) (также называемый способом Фолина-Дени).
В способе Фолина-Дени количественно определяют общее количество полифенола путем измерения синего цвета (длина волны 700-770 нм) с помощью спектрофотометра, где синий цвет получают путем восстановления фосфорновольфрамовой кислоты и молибденовой кислоты фенольным гидроксилом в щелочных условиях.
В результате количественного определения было обнаружено, что антивозрастной компонент из виноградных косточек содержит 69 вес. % полифенола.
Также было подтверждено, что 71 вес. % полифенола, содержащегося в антивозрастном компоненте из виноградных косточек (т.е. 49 вес. % антивозрастного компонента из виноградных косточек), составлял проантоцианидиновый полимер.
[0040] В дальнейшем в качестве примера упоминается антивозрастной компонент из виноградных косточек, полученный в соответствии с этим примером, и ресвератрол (изготовленный SIGMA, продукт №: R5010), используемый в целях сравнения, упоминается как сравнительный пример.
В следующих примерах 3-5 исследовали антивозрастной эффект антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению.
[0041] <Пример 2. Получение нормальных фибробластов человека, примера и сравнительного примера>
Получение нормальных фибробластов человека
Нормальные фибробласты человека для каждого теста готовили вначале.
После инициации нормальные фибробласты человека (KURABO INDUSTRIES LTD., продукт № KF-4109) культивировали в базальной среде (DMEM (Nacalai Tesque, Inc., продукт №08456-65)), 10% FBS (BioWest, продукт №S1820, лот №516536) и 1% антибиотике (смешанный раствор пенициллин-стрептомицин (Nacalai Tesque, Inc., продукт №26253-84)) в CO2-инкубаторе (5% СО2, 37°C) до получения необходимого количества клеток.
После культивирования нормальные фибробласты человека высвобождали смесью трипсин/EDTA (раствор 2,5 г/л трипсина/1 ммоль/л EDTA (Nacalai Tesque, Inc., продукт №32777-44) и использовали для каждого теста после подсчета числа клеток.
[0042] Получение примера и сравнительного примера
Затем готовили пример и сравнительный пример.
Пример и сравнительный пример измеряли соответственно и растворяли в базальной среде до концентрации 1% (вес./об.).
После растворения пример и сравнительный пример, растворенные в базальной среде, центрифугировали соответственно (120000 об./мин (2000 с-1), 10 минут) для удаления нерастворимых материалов.
После разделения центрифугированием супернатант собирали, фильтровали и стерилизовали через стерилизующий фильтр для использования в каждом тесте.
[0043] <Пример 3. Тест на подтверждение антивозрастного эффекта>
Антивозрастной эффект примера и сравнительного примера тестировали путем измерения активности β-галактозидазы (ассоциированной со старением β-галактозидазы; SA-β-gal), обычно используемой в качестве маркера старения клеток.
Избыточную экспрессию SA-β-gal подтверждали в стареющих клетках. Было подтверждено, что процесс старения клеток, измеряемый с помощью маркера старения, происходит не только в культивируемых клетках, но и в организме.
Количество стареющих клеток, распознаваемое в тесте для подтверждения антивозрастного эффекта, наиболее конкретно указывает на антивозрастной эффект в качестве всеобъемлющего параметра.
[0044] (Процедура теста)
Нормальные фибробласты человека, полученные в базальной среде, высевали на 96-луночный планшет так, чтобы они составляли 1×104 клеток/0,1 мл/лунку (черный планшет для наблюдения флуоресценции (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., продукт № MS-8096F)), и культивировали в течение 24 часов.
После культивирования культуральный супернатант соответственно заменяли на указанные ниже среды с другими условиями и нормальные фибробласты человека снова культивировали.
[0045] Условия для каждой среды выглядят следующим образом. Каждая клетка, культивируемая со средами при каждом условии, упоминается как примеры 1-3, сравнительный пример 1 и контроль, соответственно.
Пример 1: базальная среда, содержащая 0,002 вес. % антивозрастных компонентов из виноградных косточек по настоящему изобретению.
Пример 2: базальная среда, содержащая 0,01 вес. % антивозрастных компонентов из виноградных косточек по настоящему изобретению.
Пример 3: базальная среда, содержащая 0,05 вес. % антивозрастных компонентов из виноградных косточек по настоящему изобретению.
Сравнительный пример 1: базальная среда, содержащая 0,0023 вес. % ресвератрола.
Контроль: базальная среда (не содержащая ни антивозрастных компонентов из виноградных косточек по настоящему изобретению, ни ресвератрола).
В дальнейшем вышеупомянутые примеры 1-3, сравнительный пример 1 и контроль также использовали в примерах 4-5.
Концентрацию ресвератрола в сравнительном примере 1 установили равной 0,0023 вес. %, поскольку некротические клетки слишком сильно увеличиваются, так что правильное измерение будет затруднено в упомянутом ниже измерительном тесте на некроз, если концентрация резвератрола установлена более 0,0023 вес. %.
[0046] Нормальные фибробласты человека культивировали в соответствии с условиями в течение 21 дня.
Среды заменяли каждые 2-3 дня.
После культивирования культуральный супернатант удаляли и клетки дважды промывали PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., продукт №05913).
К промытым нормальным фибробластам человека добавляли базальную среду, содержащую разбавленный в 1000 раз бафиломицин, и нормальные фибробласты человека культивировали при 37°С в течение 60 минут.
Затем к культуральному раствору добавляли базальную среду, содержащую разбавленный в 1000 раз рабочий раствор SPiDER-β Gal и разбавленный в 100 раз раствор Hoechst 33342 (DOJINDO LABORATORIES, продукт №346-07951) в качестве реагента, окрашивающего ядра, и нормальные фибробласты человека дополнительно культивировали при 37°С в течение 30 минут.
После культивирования нормальные фибробласты человека промывали в базальной среде.
После промывки базальную среду добавляли в нормальные фибробласты человека и окрашивали ядра (живых клеток) и окрашенные изображения стареющих клеток получали с помощью флуоресцентного микроскопа (Keyence Corporation, продукт № BZ-X7000).
Количество стареющих клеток рассчитывали на основе соответствующих флуоресцентных изображений.
Рабочие растворы бафиломицина А1 и SPiDER-P Gal были из набора для определения клеточного старения SPiDER-βGal (DOJINDO LABORATORIES, продукт № SG03).
[0047] (Результаты)
На фиг. 1 показан график, указывающий количество стареющих клеток, рассчитанное для примеров 1-3, сравнительного примера 1 и контроля.
На фиг. 1 (а) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня.
На фиг. 1, предполагая, что количество стареющих клеток в контроле составляет 100%, количество стареющих клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано в соотношении с количеством стареющих клеток в контроле.
[0048] Количество стареющих клеток в сравнительном Примере 1 при культивировании в течение 7 дней составляло 519% относительно контроля (см. фиг. 1(a)).
Количество стареющих клеток в примере 1 при культивировании в течение 7 дней составило 85%, количество стареющих клеток в примере 2 составило 137%, а количество стареющих клеток в примере 3 составило 73% относительно контроля (см. фиг. 1(a)).
Количество стареющих клеток в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 14 дней составило 102% относительно контроля (см. фиг. 1(b)).
Количество стареющих клеток в примере 1 при культивировании в течение 14 дней составило 11%, количество стареющих клеток в примере 2 составило 9%, а количество стареющих клеток в примере 3 составило 7% относительно контроля (см. фиг. 1(b)).
Количество стареющих клеток в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 21 дня составило 64% относительно контроля (см. фиг. 1(c)).
Количество стареющих клеток в примере 1 при культивировании в течение 21 дня составило 4%, количество стареющих клеток в примере 2 составило 3%, а количество стареющих клеток в примере 3 составило 2% относительно контроля (см. фиг. 1(c)).
[0049] Согласно этим результатам оказалось, что ресвератрол характеризовался большим числом стареющих клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, чем контроль, и способствовал старению клеток. Таким образом, считается, что ресвератрол обладает эффектом стимуляции старения в краткосрочной перспективе.
Кроме того, оказалось, что количество стареющих клеток в культуре клеток 21-го дня было подавлено приблизительно до 64% относительно контроля, таким образом, имеет место подавление старения клеток.
Хотя антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению представлял почти такое же количество стареющих клеток, что и контроль, в клетках, культивируемых в среднем в течение 7 дней, он подавлял количество стареющих клеток в культуре клеток 21-го дня приблизительно до 2-4% относительно контроля, таким образом подавляя старение клеток гораздо больше, чем ресвератрол.
Таким образом, антивозрастной компонент из виноградных косточек обладает лучшим антивозрастным эффектом, чем ресвератрол, а антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства, содержащие эти антивозрастные компоненты из виноградных косточек, также обладают существенным антивозрастным эффектом.
[0050] <Пример 4. Тест на измерение количества митохондрий и рабочей нагрузки определенного количества митохондрий>
После теста на подтверждение антивозрастного эффекта подтверждали влияние примера и сравнительного примера на количество митохондрий и рабочую нагрузку определенного количества митохондрий в клетках.
Традиционно считается, что ресвератрол оказывает влияние на количество митохондрий или рабочую нагрузку определенного количества митохондрий, обеспечивая свой антивозрастной эффект. Вследствие этого, подтверждали влияние антивозрастного компонента из виноградных косточек на количество митохондрий или рабочую нагрузку определенного количества митохондрий.
[0051] Количество митохондрий измеряли, используя митохондриально-селективные зонды Mito Tracker (Invitrogen, продукт № М7512), которые могут избирательно метить митохондрии в клетке.
Рабочую нагрузку определенного количества митохондрий измеряли при помощи анализа МТТ. Поскольку единственной целью анализа МТТ является дегидрогеназная активность митохондрий, результат анализа МТТ отражает рабочую нагрузку определенного количества митохондрий.
[0052] (Процедура теста)
После удаления супернатантов культуры нормальных фибробластов человека, культивированных в примере 2, нормальные фибробласты человека дважды промывали PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., продукт №05913).
К промытым клеткам добавляли базальную среду, содержащую разбавленный в 1000 раз раствор Hoechst 33342 (DOJINDO LABORATORIES, продукт №346-07951) и разбавленные в 2000 раз митохондриально-селективные зонды Mito Tracker (Invitrogen, продукт № М7512), и нормальные фибробласты человека культивировали при 37°С в течение 30 минут.
После культивирования культуральные супернатанты удаляли и нормальные фибробласты человека дважды промывали PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., продукт №05913).
После промывки PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., продукт №05913) снова добавляли в нормальные фибробласты человека и окрашивали ядра (живых клеток) и окрашенные изображения митохондрий получали с помощью флуоресцентного микроскопа (Keyence Corporation, продукт № BZ-X7000).
В дальнейшем каждую интенсивность флуоресценции измеряли с использованием флуоресцентного планшет-ридера (Thermo Fisher Scientific, продукт № VARIOSKAN FLASH) (Hoechst: длина волны возбуждения 356 нм, длина волны флуоресценции 465 нм, Mito Tracker: длина волны возбуждения 579 нм, длина волны флуоресценции 599 нм).
[0053] После измерения интенсивности флуоресценции супернатанты удаляли и нормальные фибробласты человека однократно промывали PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., продукт №05913).
После того, как нормальные фибробласты человека промывали, их заменяли на PBS (100 мкл/лунку), содержащим 0,5 мг/мл МТТ (тиазолиловый синий тетразолий бромид (SIGMA, продукт №M5655-1G)), и проводили реакцию при 37°С в течение 5 часов.
В дальнейшем 100 мкл 0,01 М HCl (SIGMA, продукт №13-1690) и 10% SDS (Wako Pure Chemical Corporation, продукт №191-07145) добавляли в каждую лунку и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 24 часов.
После реакции формазан из МТТ растворялся.
После растворения формазана измеряли оптическую плотность с использованием планшет-ридера (Thermo Fisher Scientific, продукт № VARIOSKAN FLASH) (длина волны измерения 550 нм, эталонная длина волны 660 нм).
[0054] (Результаты)
На фиг. 2 показан график, указывающий количество митохондрий, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле.
На фиг. 2 (а) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество митохондрий в клетках, культивируемых в течение 21 дня.
На фиг. 2, предполагая, что количество митохондрий в контроле составляет 100%, количество митохондрий в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано в соотношении с количеством митохондрий в контроле.
[0055] В сравнительном примере 1 при культивировании в течение 7 дней количество митохондрий составляло 191% относительно контроля (см. фиг. 2(a)).
Количество митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 7 дней составило 116% относительно контроля, количество митохондрий в примере 2 составило 126% и количество митохондрий в примере 3 составило 143% (см. фиг. 2(a)).
Количество стареющих клеток в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 14 дней составило 228% относительно контроля (см. фиг. 2(b)).
Количество митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 14 дней составило 123%, количество митохондрий в примере 2 составило 128% и количество митохондрий в примере 3 составило 172% относительно контроля (см. фиг. 2(b)).
Количество митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 21 дня составило 246% относительно контроля (см. фиг. 2(c)).
Количество митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 21 дня составило 115%, количество митохондрий в примере 2 составило 124% и количество митохондрий в примере 3 составило 178% относительно контроля (см. фиг. 2(c)).
[0056] Согласно этим результатам оказалось, что ресвератрол обладает эффектом увеличения количества митохондрий.
Также оказалось, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает эффектом увеличения количества митохондрий.
[0057] На фиг. 3 показан график, указывающий рабочую нагрузку определенного количества митохондрий, измеренную в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле.
На фиг. 3 (а) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 7 дней, (b) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показана рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в клетках, культивируемых в течение 21 дня.
На фиг. 3, предполагая, что рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в контроле составляет 100%, рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показана в соотношении с рабочей нагрузкой определенного количества митохондрий в контроле.
[0058] Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий составила 22% в отношении сравнительного примера 1 при культивировании в течение 7 дней (см. фиг. 3(a)).
Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 7 дней составила 74%, рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 2 составила 58% и рабочая нагрузка определенного количества митохондрий составила 38% в примере 3 относительно контроля (см. фиг. 3(a)).
Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 14 дней составила 20% относительно контроля (см. фиг. 3(b)).
Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 14 дней составила 77%, рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 2 составила 63% и рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 3 составила 34% относительно контроля (см. фиг. 3(b)).
Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 21 дня составила 49% относительно контроля (см. фиг. 3(c)).
Рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 1 при культивировании в течение 21 дня составила 88%, рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 2 составила 76% и рабочая нагрузка определенного количества митохондрий в примере 3 составила 62% относительно контроля (см. фиг. 3(c)).
[0059] Эти результаты показали, что ресвератрол обладает эффектом снижения рабочей нагрузки определенного количества митохондрий.
Более того, оказалось, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению также обладает эффектом снижения рабочей нагрузки определенного количества митохондрий.
[0060] Результат примера 4 показал, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает эффектом увеличения количества митохондрий и снижения рабочей нагрузки определенного количества митохондрий.
С увеличением количества митохондрий количество АТФ (а именно, рабочая нагрузка), которое должно продуцироваться в определенном количестве митохондрий, уменьшается. Считается, что уменьшение рабочей нагрузки определенного количества митохондрий, которое было подтверждено в примере 4, связано с увеличением количества митохондрий и уменьшением продукции АТФ на определенное количество митохондрий.
Это экономит «технические» способности митохондрий, уменьшает выработку активного кислорода, генерируемого митохондриями, и увеличивает выработку супероксиддисмутазы (SOD), являющейся ферментом для удаления активного кислорода, тем самым уменьшая количество активного кислорода, который приводит к повреждению митохондрий и клеток. Поскольку приблизительно 90% активного кислорода вырабатывается митохондриями, можно считать, что уменьшение количества активного кислорода, продуцируемого митохондриями, с помощью антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению может защитить клетки и органы и т.д., состоящие из клеток, от повреждений и привести к антивозрастному эффекту.
[0061] <Пример 5. Измерительный тест на апоптоз и некроз>
Затем подтвердили влияние на количество апоптотических клеток и количество некротических клеток в примерах и сравнительном примере.
Поскольку традиционно считалось, что ресвератрол обладает антивозрастным эффектом, вызывая апоптоз, подтверждали влияние антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению на количество апоптотических клеток.
Кроме того, также подтверждали влияние антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению на количество некротических клеток, что также представляет собой гибель клеток, как и апоптоз.
[0062] Количество апоптотических клеток измеряли с применением аннексина V, который обычно используют в качестве маркера апоптоза. Более подробно, количество апоптотических клеток измеряли путем селективного флуоресцентного окрашивания апоптотических клеток флуоресцентно меченным аннексином V, используя его свойство, заключающееся в том, что аннексии V связывается с фосфатидилсерином, часто появляющимся на поверхности апоптотических клеток.
Количество некротических клеток измеряли с применением гомодимера этидия III (EthD-III), который обычно используют в качестве маркера некроза. Более подробно, EthD-III представляет собой не проникающий через мембраны зонд на основе нуклеиновой кислоты, и количество некротических клеток измеряли с использованием его свойства, заключающегося в том, что ни жизнеспособные клетки, ни апоптотические клетки не окрашиваются с помощью EthD-III, но некротические клетки окрашиваются в ярко-красный цвет.
[0063] (Процедура эксперимента)
После удаления супернатантов культуры нормальных фибробластов человека, культивированных в примере 2, нормальные фибробласты дважды промывали PBS (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD., продукт №05913).
К промытым нормальным фибробластам человека добавляли 1х буфер для связывания, содержащий разбавленный в 1000 раз раствор Hoechst 33342 (DOJINDO LABORATORIES, продукт №346-079511), разбавленный в 20 раз FITC-аннексин V и разбавленный в 20 раз EthD-III. Затем нормальные фибробласты человека культивировали при 37°С в течение 30 минут.
Затем, после удаления супернатантов культуры, нормальные фибробласты человека дважды промывали в 1х буфере для связывания.
Новый 1х буфер для связывания добавляли к нормальным фибробластам человека после промывки и получали изображения окрашивания ядра (жизнеспособные клетки), окрашивания аннексином V (апоптоз) и окрашивания EthD-III (некроз) с помощью флуоресцентного микроскопа.
Количество апоптотических клеток и количество некротических клеток рассчитывали по флуоресцентным изображениям исследования.
Кроме того, FITC-аннексин V, EthD-III и 1х буфер для связывания, использованные в примерах, были из набора для определения апоптотических/некротических/здоровых клеток (Takara Bio, Inc., продукт № D25517).
[0064] (Результаты)
На фиг. 4 представлен график, показывающий количество апоптотических клеток, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле.
На фиг. 4 (а) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество апоптотических клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня. В данном документе на фиг. 4, предполагая, что количество апоптотических клеток в контроле составляет 100%, количество апоптотических клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано в соотношении с количеством апоптотических клеток в контроле.
[0065] По сравнению с контролем количество апоптотических клеток при культивировании в течение 7 дней в сравнительном примере 1 составило 2184% (см. фиг. 4 (а)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество апоптотических клеток при культивировании в течение 7 дней в примере 1 составило 164%, количество апоптотических клеток в примере 2 составило 102% и количество апоптотических клеток в примере 3 составило 483% (см. фиг. 4 (а)).
По сравнению с контролем количество апоптотических клеток при культивировании в течение 14 дней в сравнительном примере 1 составило 1400% (см. фиг. 4 (b)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество апоптотических клеток при культивировании в течение 14 дней в примере 1 составило 107%, количество апоптотических клеток в примере 2 составило 313% и количество апоптотических клеток в примере 3 составило 226% (см. фиг. 4 (b)).
По сравнению с контролем количество апоптотических клеток в сравнительном примере 1 при культивировании в течение 21 дня составило 4525% (см. фиг. 4 (с)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество апоптотических клеток при культивировании в течение 21 дня в примере 1 составило 59%, количество апоптотических клеток в примере 2 составило 558% и количество апоптотических клеток в примере 3 составило 668% (см. фиг. 4 (с)).
[0066] Эти результаты показали, что ресвератрол обладает эффектом увеличения количества апоптотических клеток.
Более того, оказалось, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению также обладает эффектом увеличения количества апоптотических клеток.
[0067] На фиг. 5 представлен график, показывающий количество некротических клеток, измеренное в примерах 1-3, сравнительном примере 1 и контроле.
На фиг. 5 (а) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 7 дней, (b) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 14 дней, и (с) показано количество некротических клеток среди клеток, культивируемых в течение 21 дня. Кроме того, на фиг. 5 количество некротических клеток в контроле составляет 100% и количество некротических клеток в примерах 1-3 и сравнительном примере 1 показано как процент от количества некротических клеток в контроле.
[0068] По сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 7 дней в сравнительном примере 1 составило 125% (см. фиг. 5 (а)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 14 дней в примере 1 составило 47%, количество некротических клеток в примере 2 составило 47% и количество некротических клеток в примере 3 составило 100% (см. фиг. 5 (а)).
По сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 14 дней в сравнительном примере 1 составило 801% (см. фиг. 5 (b)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 14 дней в примере 1 составило 109%, количество некротических клеток в примере 2 составило 108% и количество некротических клеток в примере 3 составило 95% (см. фиг. 5 (b)).
По сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 21 дня в сравнительном примере 1 составило 608% (см. фиг. 5 (с)).
С другой стороны, по сравнению с контролем количество некротических клеток при культивировании в течение 21 дня в примере 1 составило 55%, количество некротических клеток в примере 2 составило 28% и количество некротических клеток в примере 3 составило 24% (см. фиг. 5 (с)).
[0069] Эти результаты показали, что ресвератрол обладает эффектом увеличения количества некротических клеток во всех временных периодах.
С другой стороны, оказалось, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает эффектом уменьшения количества некротических клеток.
[0070] Результат примера 5 показал, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает эффектом увеличения количества апоптотических клеток и уменьшения количества некротических клеток.
Апоптоз - это механизм, который вызывает гибель клеток в отношении причиняющей вред клетки или ненужной для организма клетки и удаляет такие клетки, тем самым приводя к образованию новых клеток путем своевременного удаления старых и поврежденных клеток. Апоптоз обычно функционирует для удаления стареющих клеток, что приводит к увеличению количества здоровых клеток на клеточном уровне. Орган, состоящий из здоровых клеток, молод.
Кроме того, апоптоз также приводит к удалению иммунных клеток, вызывающих аутоиммунную реакцию, которая является механизмом аутоиммунных заболеваний, и можно ожидать снижения тяжести аутоиммунных заболеваний за счет их правильного функционирования.
С другой стороны, некроз оказывает неблагоприятное влияние на окружающие ткани, такое как воспалительная реакция, поскольку клетки разрываются без предварительной обработки внутриклеточными ферментами и т.д., что приводит к внеклеточному высвобождению содержимого клетки, содержащего ферменты и т.д. Это неблагоприятное влияние способствует разрушению клеток и вызывает воспаление в организме, которое увеличивается по мере старения. Таким образом, некроз вызывает повреждение клеток путем неблагоприятного воздействия на окружающие ткани, такого как воспалительная реакция.
Следовательно, некроз способствует старению клеток.
Следовательно, чрезвычайно эффективно стимулировать апоптоз и подавлять некроз, чтобы подавлять старение клеток.
По этой причине понятно, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению, обладающий эффектом стимуляции апоптоза и подавления некроза, характеризуется существенным антивозрастным эффектом.
С другой стороны, оказалось, что ресвератрол способствует не только апоптозу но и некрозу.
Как описано выше, подавление некроза требуется для подавления старения клеток. Следовательно, считается, что ресвератрол, способствующий не только апоптозу, но и некрозу, обладает меньшим антивозрастным эффектом, чем антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению.
[0071] <Пример 6. Тест на токсичность>
Чтобы подтвердить токсичность антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящему изобретению, проводили тест на острую пероральную токсичность (испытание на предельное содержание) (на основе руководства OECD по тестированию химических веществ 420 (2001)) с использованием самок мышей.
[0072] (Способ испытания)
Измельченный в порошок антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению суспендировали в воде для инъекций с получением тестового раствора 100 мг/мл.
Пятинедельных самок мышей линии ICR приобретали у Japanese SLC, Inc. и предварительно выращивали в течение приблизительно одной недели. После подтверждения того, что в общем состоянии не было отклонений, их использовали для теста.
По пять самок мышей, используемых для теста, содержали в поликарбонатной клетке, соответственно, и кормили в комнате для разведения при комнатной температуре (23°C±2°C) и времени освещения 12 часов в день.
Мышей кормили лабораторным кормом (Nosan Corporation, название продукта: lab MR stock (гранула для мыши, крысы)) и питьевой водой (водопроводная вода).
[0073] Сформировали тестовую группу, которой вводили 2000 мг/кг антивозрастного компонента из виноградных косточек, и контрольную группу, которой вводили воду для инъекций в качестве контроля с растворителем, и для каждой группы использовали по пять самок мышей, соответственно.
Самки мышей, использованные для теста, голодали в течение приблизительно 4 часов перед введением.
После измерения массы каждой самки мыши тестовой группе и контрольной группе вводили перорально тестовый раствор и воду для инъекций в однократной дозе 20 мл/кг, соответственно, с использованием желудочного зонда.
Самок мышей наблюдали в течение 14 дней после введения.
Самок мышей наблюдали часто в день введения и один раз в день, начиная со следующего дня.
Массу самок мышей измеряли на 7-й и 14-й день после введения, и группы сравнивали с помощью t-критерия на 5% уровне значимости.
Всех самок мышей вскрывали после окончания периода наблюдения.
[0074] (Результаты)
Ни в одной из групп введения не было зарегистрировано ни одного случая гибели в течение периода наблюдения.
Ни в одной из групп введения не было обнаружено отклонений в течение периода наблюдения.
В таблице 1 показан результат изменения массы тестовой группы и контрольной группы.
При измерении массы тела на 7-й и 14-й день после введения оказалось, что у тестовой группы не было значительного различия в массе по сравнению с контрольной группой.
У всех самок мышей при вскрытии после окончания периода наблюдения не было обнаружено никаких отклонений.
Масса показана как среднее значение ± стандартное отклонение (единица измерения: г).
Количество самок мышей, массу которых измерили, указано в скобках.
[0076] Эти результаты показали, что при однократном пероральном введении самкам мышей значение LD50 для антивозрастного компонента из виноградных косточек по настоящей заявке превышало 2000 мг/кг у самок мышей.
[0077] Результаты примеров 3-5 показали, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению увеличивает количество митохондрий, уменьшает рабочую нагрузку определенного количества митохондрий, увеличивает количество апоптотических клеток и уменьшает количество некротических клеток, и, таким образом, обладает существенным антивозрастным эффектом.
Кроме того, в результате сравнения с одним ресвератролом, который, как ожидается, обладает антивозрастным эффектом, оказалось, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает гораздо более существенным антивозрастным эффектом, чем один ресвератрол.
Кроме того, результат примера 6 показал, что антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению обладает более низкой цитотоксичностью и более существенным уровнем безопасности.
Таким образом, продукты лечебного питания и косметические средства, содержащие антивозрастной компонент из виноградных косточек по настоящему изобретению, обладают существенным антивозрастным эффектом и уровнем безопасности.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0078] Согласно настоящему изобретению, поскольку антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства содержат антивозрастной компонент из виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или больше полифенола грубой очистки, полученного из виноградных косточек, можно получить антивозрастные продукты лечебного питания и косметические средства, обладающие существенным антивозрастным эффектом.
Следовательно, настоящее изобретение применимо в качестве продуктов лечебного питания и косметических средств, обладающих антивозрастным эффектом.
1. Продукт питания, содержащий компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или более полифенола грубой очистки, полученного из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, при этом
компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек получен экстрагированием из виноградных косточек в состоянии прорастания,
виноградные косточки представляют собой одну или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L.,
продукт питания обеспечивает увеличение количества апоптотических клеток и уменьшение количества некротических клеток.
2. Продукт питания по п. 1, где указанная виноградная косточка представляет собой семя одного или более сортов винного винограда, выбранных из группы, состоящей из: Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу, Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро д'Авола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау, Мурведр, Менье, Мелон де Бургонь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне.
3. Косметическое средство, содержащее компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, содержащий 60 вес. % или более полифенола грубой очистки, полученного из стимулированных к прорастанию виноградных косточек, при этом
компонент из стимулированных к прорастанию виноградных косточек получен экстрагированием из виноградных косточек в состоянии прорастания,
виноградные косточки представляют собой одну или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L.,
косметическое средство обеспечивает увеличение количества апоптотических клеток и уменьшение количества некротических клеток.
4. Косметическое средство по п. 3, где указанная виноградная косточка представляет собой семя одного или более сортов винного винограда, выбранных из группы, состоящей из: Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу, Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро д'Авола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау, Мурведр, Менье, Мелон де Бургонь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне.
5. Способ получения компонента из стимулированных к прорастанию виноградных косточек для увеличения количества апоптотических клеток и уменьшения количества некротических клеток, включающий:
(этап 1) погружение одной или более виноградных косточек винограда вида, выбранного из группы, состоящей из Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L. и Vitis shiragai L., в воду при 30-60°С на 20-80 часов;
(этап 2) удаление из воды виноградных косточек, погруженных на указанном этапе 1, и естественное высушивание их на воздухе;
(этап 3) погружение виноградных косточек, естественным образом высушенных на указанном этапе 2, в воду при 15-45°С на 10-100 минут;
(этап 4) удаление из воды виноградных косточек, погруженных на указанном этапе 3, и естественное высушивание их на воздухе;
(этап 5) повторение указанных этапов 3 и 4 для стимулирования прорастания виноградных косточек до тех пор, пока зародышевая часть виноградных косточек, естественным образом высушенных на указанном этапе 4, слегка не вздуется и не набухнет;
(этап 6) высушивание стимулированных к прорастанию виноградных косточек при 35-60°С;
(этап 7) измельчение в порошок виноградных косточек, высушенных на указанном этапе 6;
(этап 8) получение экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек, путем погружения измельченных в порошок виноградных косточек, полученных на указанном этапе 7, в воду, этанол или смешанный растворитель из воды и этанола; и
(этап 9) высушивание и измельчение в порошок полученной на указанном этапе 8 экстрагированной фракции, содержащей полифенол, полученный из виноградных косточек.
6. Способ по п. 5, где указанная виноградная косточка представляет собой семя одного или более сортов винного винограда, выбранных из группы, состоящей из: Агиоргитико, Вионье, Каберне Совиньон, Каберне Фран, Гаме, Кариньян, Карменер, Ксиномавро, Гренаш, Гевюрцтраминер, Кернер, Коломбард, Кошу, Султана, Санджовезе, Шардоне, Шенин Блан, Сира, Зинфандель, Семильон, Совиньон Блан, Таннат, Цвайгельт, Темпранильо, Треббиано, Неббиоло, Неро д'Авола, Барбера, Пинотаж, Пино Нуар, Пино Гри, Пино Блан, Пти Вердо, Блэк Квин, Мускат Бэйли А, Мальбек, Мюллер-Тургау, Мурведр, Менье, Мелон де Бургонь, Мерло, Мускат, Яма-Совиньон, Рислинг и Руби Каберне.
