Способ определения наркотических средств в ротовой жидкости человека методом иммунохроматографии

Изобретение относится к медицине и описывает способ латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, при этом способ включает сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит : овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конъюгата используют аналит : белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равном 12-15, а в качестве конъюгата Ат-метки используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов, полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ. Описана возможность проведения мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов. Способ обеспечивает увеличение чувствительности, экспрессности и времени сохранения результатов анализов. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 12 пр.

 

Изобретение относится к области скрининговых методов анализа и позволит определять в динамике ситуацию, связанную со злоупотреблением конкретными видами наркотических средств, что обеспечит возможность оперативного контроля за наркоситуацией и своевременного целенаправленного воздействия на группы риска.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами (Ат), широко вошли в аналитическую практику и используются благодаря таким их особенностями, как высокая специфичность, чувствительность, воспроизводимость, экспрессность и относительная простота схемы анализа.

Метод конкурентного ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, появление окрашенной полосы в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг: белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Известен способ определения тетрагидроканнабинола (ТГК) в жидких образцах, (US 2009/0017555, МКИ G01N 33/53, опуб. 9 мая 2008г.), который включает: а) контакт образца с 1) конъюгатом 5-пентилрезорцинол/макромолекулярный носитель, где 5-пентилрезорцинол конъюгирован через гидроксильную группу или ее производное в бензольном кольце и 2) антителом, способным связать ТГК и вышеописанный конъюгат. И б) определение, уменьшается ли связывание антител с конъюгатом в присутствии образца.

Однако точность этого метода недостаточно удовлетворительна, т.к. он выявляет целый спектр метаболитов, а не основной метаболит ТГК-СООН.

Известен способ, принятый за прототип, (патент RU 2007142142, МКИ G01N 33/52 опубл. 27.06.2009г.) латеральной проточной иммунохроматографии для определения аналита в ротовой жидкости, включающий: сбор ротовой жидкости коллектором, и помещение ее в объем буфера для образцов с последующим помещением в получаемую смесь тест-полоски для латеральной проточной иммунохроматографии, и определении действительности теста путем наблюдения присутствия сигнала (окрашенной полосы) в контрольной зоне, в которой иммобилизованы антивидовые антитела, взаимодействующие с конъюгатом Ат-метка и дающие окрашенную полосу и определение присутствия аналита путем наблюдения сигнала ( окрашенной полосы) в тестовой зоне, в которой иммобилизован реагент, который специфически связывается с целевым аналитом (конъюгат аналит:белок).Аналит, подлежащий тестированию, выбран из антител против антигенов инфекционного заболевания, гормонов, факторов роста, терапевтических лекарств, лекарств, допускающих злоупотребление, и продуктов метаболизма лекарств, допускающих злоупотребление. Внизу тест-полоски, которую помещают в буфер с образцом слюны, и где происходит реакция с аналитом располагают конъюгат Ат-метка, представляющую собой частицы коллоидного золота. При этом буфер для образцов представляет собой буферный раствор фосфата калия с рН 7,2+/-0,2. Причем сигнал наблюдается в течение 20-45 минут через 15-60 мин от начала теста.

Однако чувствительность известного способа не удовлетворяет современным требованиям. Кроме того, время появления сигнала не удовлетворяет требованиям экспрессностии, а его время его сохранение достаточно мало.

Предлагаемое изобретение решает задачу увеличения чувствительности, экспрессности и времени сохранения результатов анализов, которые используется для диагностики потребления наркотиков.

Поставленная задача решается способом латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, включающий: сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит: овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конюгата использют аналит:белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равному 12-15. В качестве конъюгата Ат-метка используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ

Для мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов, амфетаминов и каннабиноидов тестовая зона состоит из 3 частей, расстояние между центрами линий которых, а также центрами зон конъюгата Ат-метки и контрольный, составляет 3-4 см, а Результаты определения оптимальных разведении конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют:

- разведение 1:4000-1:8000 для анти-Mop-Au (концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов);

- разведение анти-Амф-Au - 1:2000-1:6000, (концентрация Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов);

- разведение 1:3000-1:12000 для анти-Кан- Au и (концентрация от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов),

при этом разведение антивидовых антител составило 1:2000. -1:5000.

Конъюгат Ат-метка, представляющий собой специфические антитела к наркотику, меченные золотом наносится внизу тест-полски, связывается с аналитом (если присутствует наркотик), в виде иммунного комплекса поднимается по тест-полоски доходит до тестовой зоны, там происходит конкуренция между нанесенным конъюгатом аналит:белок и аналитом(наркотиком) уже связавшимся с конъюгат Ат-метка внизу. Если наркотика было много, то полоски не будет, места в антителах все заняты. Дальше вся эта конструкция движется в контрольную зону и обязательно всегда образует окрашенную полосу с антивидовыми антителами.

В таблице 1 приведены условия проведения иммобилизации антител и наночастиц коллоидного золота (НКЗ).

В таблице 2 приведены результаты определения предела обнаружения морфина в разработанной тест-системе ИХА опиатов (N=20).

В таблице 3 приведены результаты определения предела обнаружения амфетамина в разработанной тест-системе ИХА амфетамина (N=20).

В таблице 4 приведены результаты определения предела обнаружения кокаина в разработанной тест-системе ИХА кокаина (N=20).

В таблице 5 приведены результаты определения предела обнаружения Д⁹ -ТГКК в разработанной тест-системе ИХА каннабиноидов (N=20).

В таблице 6 приведены результаты медицинских испытаний в МНПЦ Наркологии:

Сопоставление результатов тестирования жидкости ротовой полости с помощью предлагаемого изобретения с результатами подтверждающего метода ВЭЖХ и клиническими диагнозами.

В таблице 7 приведены результаты медицинских испытания в НД №1:

Сопоставление результатов тестирования жидкости ротовой полости с помощью предлагаемого изобретения с результатами подтверждающего метода ВЭЖХ и клиническими диагнозами.

В таблице 8 приведены статистические характеристики метода ИХА опиатов, амфетамина, каннабиноидов и кокаина с помощью предлагаемого изобретения согласно медицинским испытаниям в МНПЦ Наркологии и НД № 1.

Приведенные примеры подтверждает, но не ограничивает предлагаемое изобретение. Вторичные антитела к моноклональным антителам мыши, использованные для сорбции в контрольной зоне тест-системы, получали на заказ в фирме «Биалекса», Россия.

Пример 1. Синтез конъюгированных антигенов морфина с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

Синтез конъюгированных антигенов морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола с овальбумином проводили с использованием карбодиимидного метода . Для этого гаптены 6-0-гемисукцинат морфина, d, 1- 1- фенил-2-карбоксиаминопропан, бензоилэкгонин, дельта-9-тетрагидроканнабинол, модифицированный реакцией азосчетания с п-аминобензойной кислотой (6-0-гемисукцинат морфина) непосредственно вводили в реакцию с белком (овальбумин), используя в качестве конденсирующего агента водорастворимый карбодиимид, глутаровый альдегид, изобутилхлорформиат. В синтезированных конъюгатах определение количества молей гаптена, связавшихся с белком-носителем, проводили с помощью спектрального анализа в ультрафиолетовой и видимой областях.

Конъюгированные антигены исследуемых веществ с белком овальбумином, использовали в качестве реагента для нанесения в тестовую зону полоски разрабатываемых тест-систем. Такие конъюгаты обладают наиболее оптимальными параметрами для связывания моноклональными специфическими антителами.

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл ДМФА, содержащего 15, 0 мг (0,039 ммоль) 6-сукцинилморфина, и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимда в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°С. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата М-ОВА., содержащего 5 молекул морфина на молекулу белка

Пример 2.Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

3.1 (1,1-1-фенил-2-аминопропан (5 мг; 0,112 ммоль) и (10 мг; 0,00022 ммоль) овальбумина растворяли в 3,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. По каплям при перемешивании, к реакционной смеси добавляли (70 мкл; моль) раствора глутарового альдегида при комнатной температуре. Постепенно реакционная смесь приобретала характерную желтую окраску, свидетельствующую об окончании реакции. Для остановки реакции к смеси добавляли 40 мкл 1М раствора лизина и инкубировали в течение 1 часа. Полученный конъюгат диализовали против фосфатного буфера в течение ночи при температуре 4°C. Выделение конъюгата проводили гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали. Получено 25 мг конъюгата, содержащего 12молекул амфетамина на молекулу белка.

Пример 3. Синтез конъюгированных антигенов кокаина с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

Конъюгат Кок-ОВА получали по методике 1.1. из 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина и 2,0 мг (0,005 ммоль) бензоилэкгонина.

Получено 29 мг конъюгата Кок-ОВА, содержащего 14 молекул кокаина на молекулу белка.

Пример 4. Синтез конъюгированных антигенов тетрагидроканнабинола с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

К раствору 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества дельта-9-тетрагидроканнабинол, модифицированного реакцией азосчетания с п-аминобензойной кислотой в 1 мл ДМФА, ожладили реакционную смесь до 0°C и, при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 12 мг конъюгата Д^ТТК-ОВА, содержащего 25 молекул гаптена на молекулу белка.

Пример 5. Синтез специфических (моноклональных) антител к наркотику, меченных золотом, для иммобилизации в зону конъюгат Ат-метки.

Для разработки иммунохроматографического метода анализа наркотических веществ в биологической жидкости человека (слюне) в целях обеспечения визуализации результата анализа были использованы специальные метки - частицы коллоидного золота. Преимущества этого красителя для электронной и оптической микроскопии обусловлены его уникальными оптическими свойствами, а также возможностью получать частицы определенного размера, что позволяет визуализировать объект при любых микроскопических условиях.

Синтезированные и охарактеризованные по количеству связавшегося с белковой матрицей гаптена конъюгированные антигены морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола с бычьим сывороточным альбумином (БСА) были использованы для наработки специфических антител. Для этой цели выбрана гибридомная технология получения моноклональных антител. Для наработки моноклональных антител к исследуемым антигенам были получены конъюгированные антигены Мор-БСА, Амф-БСА, Кок-БСА, Кан-БСА. В результате иммунизации получено по шесть образцов мышиных сывороток, содержащих моноклональные антитела к каждому исследуемому антигену (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан).

Для синтеза конъюгированных с коллоидным золотом моноклональных антител к исследуемому антигену (анти-Мор-Au, анти-Амф-AAu, анти-Кок-Au и анти-Кан-Au), нами были использованы наночастицы коллоидного золота (НКЗ) различного диаметра производства компании "ЭКОС-Сибирь". Синтез конъюгатов антител с НКЗ проводили по стандартной технологии. Для этого антитела (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) переводили в ЮмМ буфер со значением pH от 7,5 до 10,0. К НКЗ добавляли раствор антител, инкубировали при комнатной температуре и дополнительно стабилизировали раствором БСА. НКЗ с иммобилизованными молекулами антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) отделяли от несвязавшихся молекул антител центрифугированием. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 50мМ К-фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,1М раствором NaCl, содержащем 0,25% БСА и 0,25% Твин-20.

Для конъюгации с антителами было отобрано пять гомогенных (стандартное отклонение диаметра - до 22%) препаратов НКЗ со средним диаметром в диапазоне от 5 до 60 нм. Раствор коллоидного золота в этом диапазоне стабилен длительное время. Изменяя размер частиц, можно регулировать валентность конъюгата. Исходя из того, что одно антитело на поверхности НКЗ занимает 45 нм², содержание антител в конъюгатах с отобранными препаратами НКЗ может варьировать от 2 до 250.

Пример 6 . Выбор оптимальной концентрации конъюгированных антигенов для иммобилизации в тестовую зону.

Раствор конъюгатов Мор-Ова, Амф-Ова, Кок-Ова и Кан-Ова в 50 мМ К-фосфатном буфере, pH 7,4, в разных концентрациях (от 400 нг/мл до 0,2 нг/мл) в виде капель наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Затем полоски высушивали 15 мин. в сушильном шкафу при 37°C, наносили на них блокирующий раствор овальбумина в фосфатном буфере, сушили вновь 2 часа в сушильном шкафу при 37°C. Затем полоски были помещены в раствор соответствующих конъюгатов моноклональных антител с коллоидным золотом анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Au (с разведениями 1:4000, 1:2000, 1:6000, 1:4000 соответственно). Полоски инкубировались 30 минут при комнатной температуре, а затем были промыты 3 раза ФБСТ. Каждое исследование связывания было выполнено в 3-х повторах.. Минимально определяемая концентрация анти-Мор-Аu с помощью конъюгата анти-Мор-Аu составила 31 нг/мл. Концентрация, при которой пятно является ярким, составила 500 нг/мл. Дальнейший подбор оптимальной концентрации Мор-Ова следует проводить для концентраций, близкой к этому значению.

Минимально определяемая концентрация для ИХА амфетамина составила 62 нг/мл, для ИХА кокаина - 31 нг/мл, для ИХА каннабиноидов - 16 нг/мл, концентрации оптимальной яркости пятна - 1000, 500 и 250 нг/мл соотвественно.

Пример 7. Проверка оптимальной концентрации конъюгированных антигенов для иммобилизации в тестовую зону в конкурентной реакции.

Далее для определения оптимальной концентрации конъюгатов Аг-Ова, где Аг-определяемые наркотики, а Ова -овальбумин, а именно (Мор-Ова, Амф-Ова, Кок-Ова и Кан-Ова) проводили эксперимент на тест-полосках. Мембраны для конъгатов обрабатывали растворами конъюгатов анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Аu в фосфатном буфере с Ова в рабочих концентрациях. В зону контрольной линии наносили антивидовые антитела кролик-анти-мышь разведении 1:2000. В тестовую зону полосок наносили линии конъюгатов Аг-Ова в концентрациях 500, 1000 и 2000 нг/мл. Затем тетс-полоски помещали в растворы фосфатного буфера, содержащего различные концентрации морфина: 20, 40, 60, 100, 200 нг/мл. Результат определяли визуально по появлению линий бурого цвета в тестовой и контрольной зоне

Оптимальные концентрации для конъюгатов Аг-Ова составили: 1 мкг/мл для Мор-Ова, 2 мкг/мл - для Амф-Ова, 0,25 мкг/мл - для Кан-Ова и 1 мкг/мл - для Кок-Ова.

Пример 8. Оптимизация концентрации конъюгатов с коллоидным золотом. В тестовой зоне полосок наносились линии растворами указанных выше конъюгатов Аг-Ова в выбранных концентрациях. На нижнюю часть мембраны для конъюгата Ат-метка наносили растворы специфических моноклональных антител, меченных золотом (Ат-Аu): анти-Mop-Au, анти-Амф-Au, анти-Кан- Au, анти-Кок-Au, в 3-х разных разведениях для каждого вида ИХА. На данном этапе установили оптимальные разведения составляют: 1:4000 для анти-Мор-Аu (ИХА опиатов); анти-Амф-Аu 1:6000 (ИХА амфетаминов); 1:3000 для анти-Кан- Au (ИХА каннабиноидов; для анти-Кок-Аu разведение составило 1:2000 (ИХА кокаина). Разведение антивидовых антител составило 1:2000.

Пример 9 Создание мультианалитической иммунохроматограической полоски. ИХА для 3-х аналитов: опиатов, амфетаминов, и каннабиноидов объединен в одну тест-полоску. Для этого раствор, содержащий 3 конъюгата анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu и анти-Кан-Аu в рабочих разведениях диспергировали на мембрану для конъюгата. На хроматографическую мембрану в тестовой зоне наносили 3 полоски с растворами конъюгатов Амф-Ова, Мор-Ова и Кан-Ова в рабочих концентрациях. Расстояние между тестовыми линиями, а также между тестовой линией КАН (каннабиноиды) и контрольной линией было установлено равным 3,5 мм (расстояние между центрами линий).

При соединении 3-х видов ИХА на одной тест-полоски параметры анализа изменяются, т.к. мембрана для конъюгата оказывается «нагруженной» в 3 раза больше, чем при ИХА на один аналит. Через иммунохроматографическую мембрану проходит поток с большими концентрациями иммунореагентов, поэтому характеристики латерального потока изменяются. Результаты определения оптимальных разведении конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют: разведение 1:4000 -1:8000для анти-Мор-Аu (и концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов); анти-Амф-Аu - 1:2000-1:6000, Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов); 1:3000-1:12000 для анти-Кан- Au и от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов). Разведение антивидовых антител составило 1:2000. -1:5000

Пример 10. Иммобилизация в зону конъюгат Ат-метки специфических (моноклональных) антител к наркотику, меченных золотом.

Для каждого конъюгата (анти-Мор-Аи, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Аu) были подобраны условия иммобилизации, отличающиеся по концентрации антител и значениям pH. Концентрацию антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) выбирали с учетом количества белка, необходимого для стабилизации поверхности НКЗ. Характер адсорбции антител на поверхности НКЗ обуславливает их ориентацию на поверхности частицы, возможность взаимодействия с антигенными детерминантами и, соответственно, аффинность конъюгата. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Поскольку для растворения реагентов исключено применение буферов высокой ионной силы, а также многих консервантов (содержащих атомы меди и ртути), т.к. они вызывают разрушение конъюгатов, рекомендуют использовать низкомолярные буферы. Поэтому в качестве консерванта в работе был использован 0,1% азид натрия.

Пример 11. Определение предела обнаружения исследуемых наркотических веществ с помощью разработанной тест-системы.

Для приготовления стандартных растворов наркотических и психотропных веществ в слюне человека были использованы калибраторы, контроли и мульти-контроли фирмы «Abbott» (США), используемые для калибровки и проверки работы (контроля качества) наборов реагентов к ТДх, FLx-анализатору данной фирмы:

Вторичные антитела к моноклональным антителам мыши, использованные для сорбции в контрольной зоне тест-системы, получали на заказ в фирме «Биалекса», Россия.

Компоненты для производства иммунохроматографических тестов (пробоотборники, емкости для сбора и хранения слюны и пластиковый корпус для тест-полосок) были закуплены в фирме Surescreen, Великобритания. После отбора пробы из ротовой полости слюна помещалась емкости для сбора и хранения, из которых наносилась в количестве по три капли жидкости на тест полоски, обработанные в соответствии с предлагаемым изобретением. Через 10 мин визуально оценивались результаты реакции.

ОТРИЦАТЕЛЬНО: Наличие по одной линии темно-розового цвета на уровне маркировок МАРИХ( каннабиноиды), ОПИЙ (опиаты), АМФ( амфетамины), и КОК(кокаин), а также линия темно-розового цвета на уровне маркировки К (контроль) каждой полоски. Линии могут быть яркими или бледными.

ПОЛОЖИТЕЛЬНО: Отсутствие линий темно-розового цвета на уровне маркировок МАРИХ, ОПИЙ, АМФ и КОК и наличие одной линии темно-розового цвета на уровне маркировки К (контроль) каждой полоски. Линия может быть яркой или бледной.

ОШИБКА: Отсутствие линии темно-розового цвета на уровне маркировки К через 10 мин. после внесения образца. Анализ следует повторить с использованием другого планшета.

Для разработанного способа иммунохроматографических тест-систем проведено исследование основных аналитических характеристик - чувствительности и специфичности определения наркотических соединений.

При приготовлении стандартов наркотических и психотропных веществ для разведения использовалась слюна здоровых лиц. Концентрации определяемых веществ варьировали в широком диапазоне, от 0 нг/мл до 100 нг/мл.

Предел обнаружения устанавливали как минимальную концентрацию аналита, при которой он может быть достоверно обнаружен. Для каждого аналита готовили растворы определяемого вещества в ФБС( фосфатном буферном растворе) различных концентраций, близких к предполагаемому значению предела обнаружения. Каждый полученный стандартный раствор исследовали с помощью разработанного ИХА 20 раз. Для каждой концентрации определяли количество положительных и отрицательных результатов теста. Предел обнаружения определяли как концентрацию аналита, при которой процент положительных результатов теста равен или более 95%. Полученные результаты определения предела обнаружения морфина представлены в таблице 2. были использованы стандартные растворы в диапазоне концентраций от 10 до 100 нг/мл.

Результаты определения предела обнаружения амфетамина, кокаина и каннабиноидов представлены в таблицах 3-5.

Согласно полученным данным предел обнаружения наркотических веществ с помощью разработанного ИХА составляет: для опиатов - 40 нг/мл, для каннабиноидов - 4 нг/мл, для кокаина - 20 нг/мл и для амфетаминов - 50 нг/мл.

Пример 12. Определение кросс-реактивности синтезированных иммунореагентов для разработанной тест-системы.

Специфичность метода анализа, или его кросс-реактивность можно определить как степень влияния на результат исследования соединений, отличных по химической структуре от анализируемого вещества, используемого как калибратор или стандарт. Чувствительность и специфичность любого иммунохимического анализа зависит от чувствительности и специфичности используемых антител. Определение данных иммунохимических характеристик очень важно для оценки получаемых результатов иммунохимических исследований и соответствия их выполнению поставленных задач.

Определение кросс-реактивности синтезированных иммунореагентов проводили при добавлении в реакционную среду соединений, условно разделенных на 2 группы: вещества, являющиеся близкородственными к исследуемому веществу, и вещества, наиболее часто встречающиеся в наркологической практике. При этом было рассмотрено влияние различных концентраций исследуемых веществ в аналитах слюны при постоянной концентрации нанесенных на мембраны тест-системы реагентов.

Проведенные испытания показали, что антитела перекрестно реагируют с близкими по структуре соединениями. Вещества, отличающиеся по своей природе от исследуемых веществ, не ингибируют специфическую реакцию взаимодействия антител и антигена даже в высоких концентрациях.

Таким образом, апробация на модельных смесях биологических объектов разработанной тест-системы показала, что антитела обладают высокой специфичностью только для определяемых соединений (морфин, амфетамин, кокаин, каннабиноиды), поскольку не обнаружено перекрестной, реакции с наркотическими веществами других классов.

Апробация разработанных наборов реагентов и статистический анализ результатов

Медицинские испытания Наборов реагентов проводили согласно ГОСТ Р 15.013-94 в Московском Научно-практическом центре наркологии Департамента здравоохранения г.Москвы (МНПЦ Наркологии) и в Наркологическом диспансере №1 г.Москвы (НД №1). В соответствии со стандартом лабораторной практики в дальнейшем проводилась оценка достоверности результатов разработанного метода анализа. Для этого результаты, полученные при проведении анализа, сравнивались с результатами исследования референтным методом анализа - хромато-масс-спектрометрии, имеющего высокую аналитическую специфичность и надежность, что позволяет дать оценку отклонений получаемых результатов от наиболее вероятной величины.

В ходе испытаний в МНПЦ Наркологии Наборы реагентов были апробированы на 60 человеках, в том числе: на 50 пациентах, больных наркоманией, находящихся в состоянии наркотического опьянения и 10 здоровых донорах, не принимавших наркотики. Процедура анализа проходила согласно Инструкции. Затем собранные образцы жидкости ротовой полости анализировали с помощью подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("Милихром А-02", Россия). Результаты испытаний показаны в Таблице 6.

Медицинские испытания Набора реагентов в Наркологическом диспансере №1 включали обследование 40 человек, из них 32 пациентов, больных наркоманией, находящихся в состоянии наркотического опьянения и 8 здоровых доноров, не принимавших наркотики. Результат обследования также сопоставляли с результатом подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("Милихром А-02", Россия). Результаты испытаний представлены в Таблице 7.

В обоих случаях медицинские испытания прошли успешно. Согласно заключениям комиссий, Наборы реагентов соответствуют заявленным в Инструкции характеристикам; метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Сводные данные по количеству истинно положительных (ИП), истинно отрицательных (ИО), ложноположительных (ЛП) и ложноотрицательных (ЛО) результатов, а также данные по чувствительности (Ч) и специфичности (С) определения каждого класса наркотиков, приведены в Таблице 8. Характеристики метода рассчитывали по следующим формулам:

Чувствительность метода: .

Специфичность метода: .

Согласно результатам данного статистического анализа, чувствительность определения наркотических веществ с помощью разработанного согласно изобретению Набора реагентов ОРАНАРК составляет 95-100%, специфичность определения - 98-100%.

Таким образом, разработан иммунохроматографический метод анализа исследуемых наркотических веществ в биологической жидкости человека (слюне) с высокой чувствительностью, специфичностью и надежностью, предназначенный для экспресс определения наркотических веществ. Время проведения анализа составляет 10 минут, результат анализа сохраняется в течение нескольких часов. Разработанный метод позволит не только эффективно решать вопросы аналитической диагностики, но значительно снизить затраты на лечение за счет снижения ежегодного прироста заболеваемости на 10 % в год.

Таблица 1
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии.
Конъюгат антител с НКЗ	pH	Концентрация антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан), нг/мл
анти-Мор-Au	9,0	65
анти-Амф-Au	8,8	80
анти-Кок-Au	8,6	75
анти-Кан-Au	9,1	50
Таблица 2.
Концентрация морфина, нг/мл	Число положительных результатов теста	Число отрицательных результатов теста	% положительных результатов теста
0	0	20	0
10	0	20	0
20	6	14	30
40	19	1	95
60	20	0	100
100	20	0	100

Таблица 3.
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии
Концентрация амфетамина, нг/мл	Число положительных результатов теста	Число отрицательных результатов теста	% положительных результатов теста
0	0	20	0
10	0	20	0
30	4	16	20
50	20	0	100
70	20	0	100
100	20	0	100
Таблица 4.
Концентрация кокаина, нг/мл	Число положительных результатов теста	Число отрицательных результатов теста	% положительных результатов теста
0	0	20	0
5	0	20	0
10	5	15	25
20	19	1	95
50	20	0	100
100	20	0	100

Таблица 5.
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии
Концентрация Δ9-ТГКК, нг/мл	Число положительных результатов теста	Число отрицательных результатов теста	% положительных результатов теста
0	0	20	0
2	0	20	0
4	5	15	25
10	19	1	95
20	20	0	100
50	20	0	100

Таблица6.
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии.
Обследованные	Результат визуальной детекции	Результат подтверждающего теста	Клинический диагноз
больные	МОР	АМФ	КАН	КОК	МОР	АМФ	КАН	КОК
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
№ 1	+	—	—	—	+	-	-	-	Опийная наркомания
№2	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№4	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№7	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№9	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№ 10	+	—	—	—	+	_	-	-	Опийная наркомания
№ 13	+	—	-	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№ 15	+	—	—	—	+	-	—	—	Опийная наркомания
№ 19	—	—	—	—	+	-	-	-	Опийная наркомания
№24	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№27	+	—	-	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№31	+	—	—	-	+	-	—	-	Опийная наркомания
№33	+	—	—	-	+	-	-	—	Опийная наркомания
№39	+	-	-	-	+	-	-	—	Опийная наркомания
№41	+	—	-	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№42	+	-	-	+	+	-	-	-	Полинаркомания
№45	+	—	—	-	+	-	-	—	Полинаркомания
№47	+	+	-	-	+	-	—	—	Полинаркомания
№48	+	-	-	-	+	-	-	-	Полинаркомания
№49	+	-	-	-	+	-	-	-	Полинаркомания
№50	+	-	-	-	+	-	-	-	Полинаркомания
№11	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№14	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№18	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№20	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№23	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№29	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№35	-	+	+	-	-	+	-	-	Полинаркомания
№38	-	+	-	-	-	+	-	-	Полинаркомания
№43	-	+	-	-	-	+	-	—	Полинаркомания
№5	-	-	+	-	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№12	-	-	+	-	-	-	+	-	Гашишная наркомания

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
№16	—	—	+	—	-	-	+	-	Гашишная наркомания
№17	—	—	+	-	-	-	+	-	Гашишная наркомания
№22	—	—	—	—	-	-	+	-	Гашишная наркомания
№26	—	—	+	—	-	-	+	-	Гашишная наркомания
№30	—	—	+	—	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№32	—	—	+	+	-	-	+	-	Гашишная наркомания
№36	—	—	+	-	-	-	+	-	Полинаркомания
№37	-	-	+	—	-	—	+	-	Полинаркомания
№44	—	—	+	—	—	-	+	—.	Полинаркомания
№46	—	—	+	—	-	—	+	-	Полинаркомания
№3	—	—	+	-	-	-	—	+	Кокаиновая наркомания
№6	-	—	-	+	-	-	—	+	Кокаиновая наркомания
№8	-	—	—	+	-	—	—	+	Кокаиновая наркомания
№21	—	—	—	+	-	—	-	+	Кокаиновая наркомания
№25	-	-	-	+	-	-	-	+	Кокаиновая наркомания
№28	-	-	-	+	-	-	-	+	Кокаиновая наркомания
№34	-	-	-	+	-	-	—	+	Полинаркомания
№40	-	-	-	+	-	-	-	+	Полинаркомания
№51	-	-	—	-	-	—	-	—	Здоровый донор
№52	-	-	-	-	-	-	-	—	Здоровый донор
№53	—	—	—	—	—	—	—	—	Здоровый донор
№54	-	-	-	-	-	-	-	—	Здоровый донор
№55	-	-	-	-	-	-	—	—	Здоровый донор
№56	-	-	-	-	-	-	—	—	Здоровый донор
№57	-	-	-	-	-	-	-	—	Здоровый донор
№58	-	-	-	-	-	-	—	—	Здоровый донор
№59	-	-	-	-	-	-	—	—	Здоровый донор
№60	-	-	-	-	-	-	-	-	Здоровый донор

Таблица 7.
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии.
Обследованные больные	Результат метода ИХА	Результат метода ВЭЖХ
МОР	АМФ	КАН	КОК	МОР	АМФ	КАН	КОК	Клинический диагноз
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
№1	+	—	—	—	+	-	—	—	Опийная наркомания
№3	+	—	-	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№4	+	—	-	-	+	-	—	-	Опийная наркомания
№5	+	—	+	—	+	-	+	—	Опийная наркомания
№8	+	—	—	—	+	-	-	-	Опийная наркомания
№11	+	—	—	+	+	-	-	+	Опийная наркомания
№13	+	—	-	—	+	-	-	-	Опийная наркомания
№17	+	—	—	-	+	-	-	-	Опийная наркомания
№21	—	—	-	-	+	—	-	-	Опийная наркомания
№25	+	—	-	+ п	+	—	-	-	Опийная наркомания
№26	+	—	+	-	+	-	+	-	Опийная наркомания
№29	+	—	-	-	+	-	-	-	Полинаркомания
№30	+	+	-	-	+	+	-	—	Полинаркомания
№32	+	+	—	-	+	+	-	-	Полинаркомания
№6	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№10	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№15	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№18	-	+	-	+	-	+	-	+	Амфетаминовая наркомания
№19	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№22	-	+	-	-	-	+	-	-	Амфетаминовая наркомания
№23	-	+	+	-	-	+	+	—	Полинаркомания
№27	-	+	-	-	-	+	-	—	Полинаркомания
№31	-	+	+	-	-	+	-	—	Полинаркомания
№2	-	-	+	-	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№7	-	-	+	-	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№12	-	-	+	-	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№20	-	-	+	-	-	-	+	—	Гашишная наркомания
№24	-	+	+	-	-	-	+	-	Гашишная наркомания

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
№9	—	—	-	+	-	-	-	+	Кокаиновая наркомания
№14	—	—	+	+	-	-	+	+	Кокаиновая наркомания
№16	—	—	—	+	—	—	-	+	Кокаиновая наркомания
№28	—	—	—	+	-	-	-	+	Полинаркомания
№33	—	—	—	—	—	-	—	—	Здоровый донор
№34	-	—	—	-	-	-	-	—	Здоровый донор
№35	-	-	-	-	-	-	-	-	Здоровый донор
№36	-	-	-	-	-	-	-	-	Здоровый донор
№37	-	-	-	-	-	-	-	—	Здоровый донор
№38	-	-	-	-	-	-	-	-	Здоровый донор
№39	-	-	-	-	- ^	-	-	—	Здоровый донор
№40	-	-	-	-	-	-	-	-	Здоровый донор

Таблица 8.
Способ определения наркотических средств в биологической жидкости человека методом иммунохроматографии
Определяемая группа веществ	ИП	ИО	ЛП	ЛО	Ч, %	С, %
опиаты	33	65	0	2	95	100
амфетамины	18	80	2	0	100	98
каннабиноиды	17	80	2	1	95	98
кокаин	11	86	3	0	100	97

1. Способ латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, включающий: сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит : овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конъюгата используют аналит : белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равном 12-15, а в качестве конъюгата Ат-метки используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов, полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов, амфетаминов и каннабиноидов тестовая зона состоит из 3 частей, расстояние между центрами линий которых, а также центрами зон конъюгата Ат-метки и контрольной составляет 3-4 см, а результаты определения оптимальных разведений конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют:

- разведение 1:4000-1:8000 для анти-Мор-Аu (концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов);

- разведение анти-Амф-Аu - 1:2000-1:6000 (концентрация Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов);

- разведение 1:3000-1:12000 для анти-Кан-Аu и (концентрация от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов),

при этом разведение антивидовых антител составило 1:2000-1:5000.