Биопрепарат для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен биопрепарат для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна, включающий ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac – 2863D, дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y – 3045D и микроводорослей, Chlorella vulgaris IPPAS C-2024, взятых в соотношении 1:1:1:1:1 (по массе) с титром клеток заявленного препарата 10⁴ КОЕ/мл, приготовленный на питательной среде Чапека. Изобретение обеспечивает повышение эффективности очистки загрязненного грунта, щебеночного балласта, гравия железнодорожного полотна от нефтяных загрязнений. 1 ил., 5 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к очистке загрязненного грунта, щебеночного балласта, гравия железнодорожного полотна от нефтяных загрязнений, и может быть использовано во всех областях транспортной промышленности, в которых используются, транспортируются или хранятся нефть и нефтепродукты.

Известны изобретения, способствующие очистке загрязненного грунта железнодорожного полотна (щебеночного балласта) (Патент № 2 207 422, 2 199 620, 2 093 633, 2 3724 39). Недостатком их является недостаточная очистка грунта, очистка без применения биопрепаратов с образованием вторичных отходов.

Известен препарат для биологической очистки грунта, нефтешламов, жидких отходов и сточных вод от органических соединений и нефтепродуктов и способ его применения (три варианта) (Патент РФ № 2 367 530). Препарат содержит глауконитсодержащее вещество - 88,98-93,45 мас.%, биологически-активный ил - 1-5 мас.%, стимулятор роста - янтарную кислоту - 0,01-0,05 мас.%, азотсодержащий биогенный элемент - мочевину - 0,01-0,5 мас.% и воду - 10-1 мас.%. и повышение степени очистки путем увеличения активирующей способности препарата. Недостатком препарата является отсутствие информации по составу активного ила и возможность содержания в нем патогенных микроорганизмов и солей тяжелых металлов.

Известен биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (Патент РФ № 2 637 132). Биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами выполнен в виде сухой формы биопрепарата и включает водорастворимую защитную среду и микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти, содержащие бактерии рода Rhodococcus, в качестве бактерии рода Rhodococcus биопрепарат содержит штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1kp, а также дополнительно содержит штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kр.

Известен биопрепарат - консорциум микроорганизмов «Devouroil» для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем от загрязнений нефтепродуктами (патент РФ № 2 023 686). Данный биопрепарат имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как наличие в его составе бактерий рода Rhodococcus и дрожжей (дрожжевых клеток).

Известен экобиопрепарат для очистки воды от нефтепродуктов (Патент РФ № 2 393 215. Биопрепарат представляет собой культуру клеток биодеструктора, искусственно иммобилизованную на сорбенте-носителе. Причем в качестве сорбента-носителя он содержит полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм, с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, имеющие следующий состав (мас.%): SiO2 - 50÷60; Al2O3 - 25÷35; Fe2O3 - 1,8÷2,0; CaO - 1÷5; MgO - 0,5÷1,5; Na2O - 0,3÷1,5; K2O - 0,2÷2,9. А в качестве биодеструктора нефтепродуктов - штамм Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844. Способ получения данного биопрепарата включает глубинное культивирование штамма Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844 на жидкой питательной среде, подготовку вышеуказанного стерильного сорбента носителя и поверхностное культивирование биодеструкторов на данном сорбенте-носителе.

Недостатком биопрепаратов является отсутствие в их составе штаммов микроводорослей, усиливающих очистку за счет мобилизации молекулярного кислорода.

Технической проблемой, решаемой заявленным изобретением является получение активного ила для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна.

Технический результат достигается созданием ассоциации культур микроорганизмов, находящихся в синергетических отношениях, образующих активный ил для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна.

Для достижения технического результата были взяты культуры бактерий Pseudomonas yamanorum, Rhodococcus erythropolis, дрожжей Rhodotorula glutinis Rhodotorula toruloides и микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa.

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum выделен из загрязненного грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкаре Республики Коми. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - Пептон - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄х7H₂O - 0,5 г; температура - 15-25° С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Штамм характеризуется следующими признаками:

На среде МПА колонии точечные ∅ < 1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.

Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.

Данные молекулярно генетического анализа:

> S1-09.15 6SrRNA ,

AGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAaACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTwATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTtGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGcTAG

> S1-09.15 gyrase_subunit_B ,

aACTCCTATAAaGTATCCGGCGGTTTGCACGGTGTAGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTTTCTGAAGAGCTGATCCTGACTGTACGTCGTAGCGGCAAGATCTGGGAACAGACTTACGTTCATGGTGTTCCACAGGAACCGATGAAAATCGTCGGTGACAGCGAAAGCACTGGTACGCAGATTCACTTCAAGCCTTCGGCTGAAACCTTCAAGAACATCCACTTCAGCTGGGACATTCTGGCCAAGCGGATTCGTGAACTGTCTTTCCTGAACTCCGGTGTGGGTATCGTCCTCAAGGACGAACGCAGCGGCAAGGAAGAGCTGTTCAAGTACGAAGGCGGCCTGCGTGCGTTCGTTGAATACCTGAACACCAACAAGACCGCGGTCAATCAGGTGTTCCACTTCAACATCCAGCGTGAAGACGGCATCGGCGTAGAAATCGCCCTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGTTGTGCTTCACCAACAACATTCCTCAGCGCGATGGCGGTACTCACCTGGTGGGTTTCCGTTCTGCACTGACGCGTAACCTGAACACCTACATCGAAGCGGAAGGCCTGGCGAAGAAACACAAAGTCGCCACCACCGGTGACGATGCCCGCGAAGGCCTAACCGCCATTATCTCGGTCAAGGTTCCGGATCCGAAGTTCAGCTCCCAGACCAAAGACAAGCTGGTGTCCTCCGAAGTGAAGACAGCGGTCGAACAGGAAATGGGCAAGTACTTCTCCGACTTCCTGCTGGAAAACCCGAACGAAGCCAAGCTGGTTGTCGGCAAGATGATCGACGCAGCACGGGCTCGTGAAGCGGCGCGTAAAGCCCGTGAGATGACGCGTCGTAAAGGTGCGCTGGATATCGCCGGCCTGCCGGGCAAACTGGCTGACTGCCAGGAGAAAGACCCTGCCCTCTCCGAACTGTACCTGGTGGAAGGTGACTC

S1-09.15_gyrB (фрагмент белковой последовательности)

SYKVSGGLHGVGVSVVNALSEELILTVRRSGKIWEQTYVHGVPQEPMKIVGDSESTGTQIHFKPSAETFKNIHFSWDILAKRIRELSFLNSGVGIVLKDERSGKEELFKYEGGLRAFVEYLNTNKTAVNQVFHFNIQREDGIGVEIALQWNDSFNENLLCFTNNIPQRDGGTHLVGFRSALTRNLNTYIEAEGLAKKHKVATTGDDAREGLTAIISVKVPDPKFSSQTKDKLVSSEVKTAVEQEMGKYFSDFLLENPNEAKLVVGKMIDAARAREAARKAREMTRRKGALDIAGLPGKLADCQEKDPALSELYLVEGD

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на на 1000 мл воды - Пептон - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄х7H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis выделен из образца нефтезагрязненной почвы участка рекультивации в Западной Сибири, способный к окислению нефтепродуктов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Ac - 2863D.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: питательная среда, следующего состава: на 1000 мл воды - Пептон - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄×7H₂O - 0,5 г; температура - 15-25 °С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Характеристика штамма:

На среде МПА колонии округлые ∅ 1 - 2 мм, палевые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. Консистенция тягучая. На среде Раймонда колонии ∅ 1 - 2 мм, палевые, обильно колонизируют капли нефти, образуют слизь. На средах Чапека, Виноградского, КАА колонии точечные ∅ < 1 мм, белесые, непрозрачные, выпуклые. На голодном агаре не растет. Выделяемый в среду пигмент отсутствует. Каталазный тест положительный. Облигатный анаэроб. Глюкозу при температуре 37° С не ферментирует. Прямые или искривлённые с закруглёнными концами палочки, 1-5 × 0,5-1,0 мкм.

Данные молекулярно генетического анализа:

>L18-3 1369 bp

TTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCAGGTTGCATGACTTGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGAATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCCGTCGAA

>L18-3 1369 пн

TTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCAGGTTGCATGACTTGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGQTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGAATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCCGTCGAA

Таблица 1

Процент сходства последовательности гена 16S rRNA штамма L18-3 (1369 пн, пар нуклеотидов) с последовательностями типовых штаммов ближайших видов

Таксономическое название	Номер штамма	Авторы штамма	Номер последовательности в ГенБанке	% сходства	Кол-во несовпавших пн/ Кол-во пн последовательности
Rhodococcus erythropolis	NBRC 15567	(Gray and Thornton 1928) Goodfellow and Alderson 1979	BCRM01000055	100,0	0/1369
Rhodococcus qingshengii	JCM 15477	Xu et al. 2007	LRRJ01000016	99,3	9/1369
Rhodococcus degradans	CCM 4446	Svec et al. 2007	JQ776649	99,3	9/1369
Rhodococcus baikonurensis	GTC 1041	Li et al. 2004	AB071951	99,1	12/1302
Rhodococcus globerulus	NBRC 14531	Goosfellow et al. 1985	BCWX01000023	98,4	22/1369

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на на 1000 мл воды - Пептон - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄х7H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis выделен из пробы нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 20 г, NaNO₃-3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄х5H₂O - 0,5 г. 15-25° С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Характеристика штамма:

Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный. Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 X 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют. Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno. Сахара не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат. Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо). Крахмалоподобные вещества не образует. При +37°С не растет.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO₃-3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄х5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Штамм дрожжей Rhodotorula toruloides выделен из загрязненного щебеночного балласта железнодорожного полотна депо г. Сыктывкара, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y - 3045D.

Характеристика штамма:

На среде Чапека колонии круглые ∅ 2 - 3 мм, оранжевого цвета, непрозрачные, выпуклые, гладкие, блестящие. Консистенция тягучая. На средах МПА, Виноградского, колонии точечные ∅ < 1 мм, бледно-оранжевого цвета, непрозрачные, выпуклые. На среде КАА колонии точечные ∅ < 1 мм, белесые. На голодном агаре не растет. Выделяемый в среду пигмент отсутствует. Клетки преимущественно правильной овальной формы 8 × 3 мкм.

Каталазный тест отрицательный. Факультативный анаэроб. Глюкозу при температуре 37° С не ферментирует. штамм ассимилирует источники углерода: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, рафинозу, мелецитозу, D-арабинозу,этанол,глицерин, рибит; источники азота: нитраты, кадаверин, креатин. Температура роста штамма Rhodotorula toruloides от 21°С до 37 °С.

Данные молекулярно генетического анализа:

>4-1P(15)

GATATTAGGGTGTCCAACTTAACTTGGAACCCGACCCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTCTTGGGTAGTAGCTTGCGTCGGCGAGCGAATCCCATTTCACTTACAAACACAAAGTCTATGAATGTAACAAATTTATAACAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCACCTATTTCTTAGTGAATCAGGCGGTGTTTGGATTCTGAGCGCTGCTGGCCTCACGGCCTAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTGGTCTCTGACTGGAGCCGGGTGAGATTAAAGGAAGCTACTAATCCTCATGTCTATCTTGAGATTAGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTTGGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAGTGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTCTGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGATACCCCATTACACGGTGCGGACGC

Таблица 2

Процент сходства

Название культуры	GenBank number	Сходство, %
Rhodotorula toruloides CBS 6450	CBS database	100%
Rhodotorula toruloides CBS 7325	CBS database	100%
Rhodotorula toruloides CBS 7292	KY104916	99.8%
Rhodotorula toruloides CBS 14	AB049028	98.3%
Rhodotorula toruloides CBS 6016T	CBS database	98.3%

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO₃-3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄х5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr выделен из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению в почве. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Штамму присвоен номер IPPAS C-2024.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - KNO₃ - 5.0 г, MgSO₄×7H₂O - 2.5 г, KH₂PO₄×3H₂O - 1.25 г, FeSO₄ - 0.003 г в течение 7 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Характеристика штамма:

Форма клеток - шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - для подготовки биомассы с целевым использованием - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Тамия следующего состава: на 1000 см³ воды: агар-агар - 20 г, КNO₃ - 5 г, KH₂PO₄ × 3H₂O - 1.25 г, MgSO₄ ×7H₂O - 2.5 г, FeSO₄ - 0.003 г. Раствор микроэлементов среды Тамия: ZnSO₄×4H₂O (0.222 г/л), MnCl₂×4H₂O (1.81 г/л), MoO₃ (176.4 мг/10 л), Н₃ВО₃ (2.86 г/л) и NH₄VO₃ (229.6 мг/10 л). В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора - 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Активный ил (ассоциация синергетического комплекса) был получен из штаммов микроорганизмов Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac - 2863D, Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y - 3045D Chlorella vulgaris IPPAS C-2024 в соотношении 1:1:1:1:1.

Для получения эффективного активного ила, предназначенного для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна был проведен ряд экспериментов.

Пример 1.

Ассоциацию штаммов культивировали на следующих питательных средах:

- на среде Чапека следующего состава: на 0.1 дм³ воды - сахароза 3.0 г, NaNO₃ - 0.3 г; KH₂PO₄ - 0.1 г; KCl - 0.05 г; MgSO₄×7H₂O - 0.05 г;

- на среде М9 следующего состава: на 1 дм³ воды Na₂HPO₄ - 24.0 г, KH₂PO₄ - 12.0 г, NaCl - 2.0 г, NH₄Cl - 4.0 г, дизельное топливо - 1 г.

- на среде Ворошиловой-Диановой следующего состава (на 0.1 дм³ воды): K₂HPO₄ - 0.1 г, KH₂PO₄ - 0.1 г, NH₄NO₃ - 0.1 г, MgSO₄ - 0.02 г, CaCl₂×6H₂O - 0.001 г, FeCl₃×6H₂O - 3 капли, в присутствии 1% нефти.

- на среде МПБ следующего состава: на 1 дм³ воды - Пептон - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄×7H₂O - 0,5 г.

- на среде МПБ с гидролизатом куриного белка следующего состава: на 1 дм³ воды - гидролизат куриного белка - 20 г, NaCl - 3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄×7H₂O - 0,5 г.

- на водной вытяжке следующего состава: навеску сухого грунта тщательно растирали в фарфоровой ступке с толченым стеклом, количественно переносили в колбу Эрленмейера емкостью 1 дм3, заливали дистиллированной воды в пропорции 1 : 2 и нагревали на кипящей водяной бане 1 час. Смесь охладили, количественно перенесли в мерную колбу (1000 см3) и довели водой до метки. Содержимое колбы хорошо перемешали и профильтровали через складчатый бумажный фильтр.

Рост на различных питательных средах говорит о способности штаммов метаболизировать широкий спектр источников углерода. Способность к деградации нефтепродуктов в присутствии соли в среде (питательная среда Ворошиловой-Диановой), имеет существенное значение в разложении органо-минеральных загрязнений. Высокая биологическая активность, усиление процессов дегидрирования указывает на широкие окислительно-восстановительные функции активного ила.

Таблица 3

Биологическая активность образца активного ила

№	Штамм	Среда культивирования	Численность МО, ×107 КОЕ/см3	Дегидрогеназная активность, мг формазана/ см3
1	Образец активного ила	Чапека	56.8	29.77
2		МПБ	14.45	81.6
3		МПБ с гидролизатом куриного белка	75.1	85.7
4		М9	3.59	4.1
5		Ворошиловой-Диановой	32.7	3.2
6	Водная вытяжка	56.9	3.2

Биологическая активность образца активного ила была высокой при культивировании штаммов на питательной среде Чапека и МПБ и МПБ и гидролизатом куриного белка.

Пример 2.

Оценку способности микроорганизмов синтезировать биосурфактанты проводили по индексу эмульгирования Согласно, данным литературы микроорганизмы, имеющие индекс эмульгирования больше 50%, считаются перспективным продуцентами поверхностно-активных веществ [Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface active agents from two Bacillus species // Appl.Environ.Microbiol. - 1987 - Vol.53, № 2 - P. 224-229.].

Для повышения биодоступности гидрофобных поллютантов широко используют способность микробных метаболитов к эмульгированию. При этом биодобавки - микроорганизмы заменяют синтетические сурфактанты, представляющие собой токсичные вещества с низкой степенью деградабельности. Биосурфактанты (микроорганизмы) способны как эмульгировать углеводороды, переводя их в водную фазу, повышая биологическую доступность, так и модифицировать внешние поверхности бактерий путём гидрофобизации обеспечивая прямой контакт с молекулами углеводородов. Всё это делает актуальным поиск культур-продуцентов биоПАВ и исследование их свойств.

Продукция биоПАВ может быть связана с различными фазами роста микробиологической культуры. Культуры микроорганизмов увеличивают свою биомассу в течение первых-вторых суток роста с дальнейшей стабилизацией на протяжении стационарной фазы роста. Это означает, что определение оптимальной продолжительностью культивирования является предел 4 суток - к этому времени культуры достигают высокого уровня поверхностно-активных свойств, переходя в стационарную фазу роста, дальнейшее ферментирование может привести к спаду роста клеток и к их автолизу, т.е. экономически нецелесообразно.

Культуры микроорганизмов выращивали в течение нескольких суток в жидкой питательной среде. Далее культуральную среду смешивали с дизельным топливом марки «Л-0,2-40»в соотношении 3:2, суспензию интенсивно перемешивали на лабораторном встряхивателе при 1000 об./мин на протяжении 20 мин для получения устойчивой эмульсии. После этого пробирки с суспензией оставляли в вертикальном положении при комнатной температуре, эмульгирующую активность рассчитывали, как отношение объемов эмульсии через 24 часа к общему объёму, умноженное на 100 %. Результат выражали в процентах. Стабильность эмульсии определяли, как отношение объемов эмульсии через 48 часов и 24 часа, умноженное на 100 %

При культивировании активного ила (ассоциация Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac - 2863D, Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y - 3045D Chlorella vulgaris IPPAS C-2024) на водной вытяжке в качестве источника углерода для штаммов наблюдали увеличение количества синтезированных ПАВ. Индекс эмульгирования достигал 64 % при стабильности эмульсии 97 %. Ниже в ряду эмульгирующей активности находилась среда Чапека 50 % с сохранением высокой стабильности эмульсии. Культивирование биопрепарата на гидрофобных субстратах показало, что при достаточно высокой продукции биоПАВ (32-42 %) существенно снижается стабильность эмульсии (фиг. 1).

Пример 3.

Каталаза - фермент, обнаруженный почти во всех живых организмах. Основная его функция - катализировать реакцию разложения перекиси водорода до безвредных для организма веществ. Каталаза имеет большое значение для жизнедеятельности клеток, так как защищает их от разрушения активными формами кислорода. Наличие в микроорганизмах каталазы свидетельствует о повышенной способности штамма к окислению органического загрязнителя.

Каталазный тест проводили следующим образом: Посев производили в пробирках на скошенный мясо-пептонный агар или другую подходящую для культивирования среду. После инкубации вливали вниз по косяку 1 см³ 3%-ной перекиси водорода. Положительная реакция - сразу же и через 5 мин наблюдали за образованием пузырьков. Параллельно добавляли несколько капель 3%-ной перекиси водорода и к колониям на чашке или к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверхности полужидкой среды.

Каталазный тест активного ила (ассоциации Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac - 2863D, Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y - 3045D, Chlorella vulgaris IPPAS C-2024) показал положительный результат.

Пример 4.

Определяли снижение содержания нефтепродуктов в загрязненном грунте, отобранном с железнодорожного полотна при различных условиях систем аэрации, количества времени и концентрации активного ила. Эксперимент заключался в том, что загрязненный грунт помещали в емкость, обрабатывали активным илом с разным титром клеток и аэрировали. В конце эксперимента определяли массовую долю нефтепродуктов в загрязненном грунте и активном иле. Схема эксперимента и результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Массовая доля нефтепродуктов в загрязненном грунте, мг/кг

№	Описание	Использованное оборудование для аэрации	Время экспозиции	НП, мг/кг
0	Не загрязненный грунт	-	-	10±5
1	Контроль. Загрязненный грунт	-	-	4200±1500
Загрязненный грунт
2	Активный ил. Титр клеток 104 КОЕ/мл	Компрессор	15	2600±900
3	Активный ил. Титр клеток 104 КОЕ/мл		60	910±410
4	Активный ил. Титр клеток 1010 КОЕ/мл		15	830±370
5	Активный ил. Титр клеток 1010 КОЕ/мл	60	1500±500
6	Водопроводная вода	Ротор	15	2700±900
7	Активный ил. Титр клеток 104 КОЕ/мл		15	790±280
8	Активный ил Титр клеток 104 КОЕ/мл		60	360±130
9	Активный ил. Титр клеток 1010 КОЕ/мл		15	1700±600
10	Активный ил. Титр клеток 1010 КОЕ/мл	60	410±130

Титр клеток не влиял на процессы очистки загрязненного грунта. Наиболее эффективные результаты по снижению остаточного содержания нефтепродуктов были отмечены в варианте 8, в котором был использован активный ил с титром клеток 10⁴ КОЕ/мл, аэрация с одновременным перемешиванием щебеночного балласта с помощью ротора и временем экспозиции 60 минут. Эффективность очистки составила 91.4%.

Активный ил слили в одну емкость, измерили содержание нефтепродуктов и продолжили аэрировать. Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5

Массовая доля нефтепродуктов в активном иле после очистки загрязненного грунта, мг/дм³

Активный ил	Нефтепродукты, мг/дм3
Сразу после очистки	Спустя 5 суток
Ассоциация Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac - 2863D, Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y - 3045D, Chlorella vulgaris IPPAS C-2024	120±12	0.56±0.14

За 5 суток эффективность очистки активного ила от загрязнений, эмульгированных с загрязненного грунта составила 99.5 %.

Биопрепарат для очистки загрязненного грунта железнодорожного полотна, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов-нефтедеструкторов использует ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Rhodococcus erythropolis VKM Ac – 2863D, дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Rhodotorula toruloides VKM Y – 3045D и микроводорослей Chlorella vulgaris IPPAS C-2024, взятых в соотношении 1:1:1:1:1 (по массе) с титром клеток заявленного препарата 10⁴ КОЕ/мл, приготовленного на питательной среде Чапека.