Иммуногенные продукты, полученные на основе аминокислотных последовательностей мутеинового амилоида β (aβ), и способы их применения

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен иммуногенный продукт, который представляет собой усеченный мутеиновый олигомер Aβ для индуцирования иммунного ответа против амилоидоза, и композиция для лечения или предупреждения амилоидоза, содержащая такой продукт. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии болезни Альцгеймера или синдрома Дауна. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 табл., 13 пр.

 

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который подан в электронном виде в формате ASCII и во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Указанная ASCII-копия была создана 27 августа 2015 под названием ABV12075WOO1_SL.txt и имеет размер 14095 байтов.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к иммуногенным продуктам, полученным на основе аминокислотных последовательностей мутеинового амилоида β (Аβ), а в частности, к олигомерам мутеинов Аβ и к применению указанных продуктов в целях диагностики, лечения и предупреждения таких состояний, как амилоидоз, и для идентификации агентов, способных связываться с указанными продуктами.

Предшествующий уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой нейродегенеративное расстройство, характеризующееся прогрессирующей потерей когнитивных функций и характерными нейропатологическими признаками, включая отложение амилоидного пептида бета (Αβ), присутствие нейрофибриллярных клубков и потерю нервных тканей в нескольких отделах головного мозга (Hardy and Selkoe, Science 297: 353, 2002; Mattson, Nature 431: 7004, 2004). Отложение амилоида в коре головного мозга и нарушение когнитивных функций, очень напоминающие указанные признаки, наблюдаемые при болезни Альцгеймера, также являются характерными признаками синдрома Дауна (трисомия по хромосоме 21), который встречается приблизительно у 1 из 800 новорожденных.

Пептид Αβ образуется из амилоидного белка-предшественника (APP) посредством протеолитического процессинга. Этот процесссинг осуществляется благодаря общей активности нескольких протеаз, называемых α-, β- и γ-секретазами, и приводит к образованию ряда специфических фрагментов различной длины. Отложения пептида Αβ состоят, в основном, из пептидов, длина которых составляет 40 или 42 аминокислоты (Αβ(1-40), Αβ(1-42)). Этот белок, который имеет тенденцию к полимеризации в водной среде, может присутствовать в очень разнообразных молекулярных формах, включая нерастворимые формы, такие как фибриллы Αβ, а также растворимые формы, такие как олигомеры Αβ.

Простая корреляция между отложением нерастворимого белка, возникновением или прогрессированием деменции, такой как, например, болезнь Альцгеймера, пока остается неясной (Terry et al., Ann. Neurol. 30: 572-580, 1991; Dickson et al., Neu- robiol. Aging 16: 285-298, 1995). В противоположность этому, потеря синапсов и когнитивного восприятия, очевидно, в большей степени коррелирует с растворимыми формами Αβ (Lue et al., Am. J. Pathoi 155: 853-862, 1999; McLean et ai., Ann. Neurol. 46: 860-866, 1999).

Растворимые олигомеры Αβ были получены путем синтеза (Barghorn et al., J. Neurochem 95: 834-847, 2005), собраны из APP-трансфецированных клеточных культур (Walsh et al., Nature 416: 535-539, 2002) и выделены из головного мозга APP-трансгенных мышей (Lesne et al., Nature 440: 352-357, 2006). В заявке WO 2004/067561 описаны глобулярные олигомеры («глобуломеры») пептида Αβ(1-42) и способ их получения. В заявке WO 2006/094724 описаны не-диффиузные глобулярные олигомеры β(Χ - 38.. 43), где X выбран из группы, состоящей из чисел 1.. 24. В заявках WO 2004/067561 и WO 2006/094724 также указывается, что ограниченный протеолиз глобуломеров приводит к образованию усеченных вариантов указанных глобуломеров, таких как глобуломеры Αβ(20-42) или Αβ(12-42). В заявке WO 2007/064917 описаны клонирование, экспрессия и выделения рекомбинантных форм амилоидного пептида β (далее обозначаемого N-Met Αβ(1-42)) и его глобуломерных форм.

Полученные данные позволяют предположить о наличии независимого от фибрилл амилоидного пути укладки Αβ и их сборки в олигомеры Αβ, которые имеют один или более уникальных эпитопов (далее называемых глобуломерными эпитопами). Указанные глобуломерные эпитопы были детектированы в головном мозге пациентов с БА и у APP-трансгенных мышей, и было обнаружено, что глобуломер Αβ специфически связывается с нейронами и блокирует длительное потенцирование гиппокампа. Было обнаружено, что растворимый глобуломер Αβ осуществляет свое негативное действие, главным образом, посредством взаимодействия с пресинаптическим кальциевым каналом типа P/Q, и что ингибиторы такого взаимодействия могут быть использованы для лечения амилоидоза, такого как болезнь Альцгеймера (WO 2008/104385).

Моноклональные антитела, способные дифференцировать растворимые глобуломеры Αβ от других молекул Αβ, таких как мономеры и фибриллы, были описаны ранее, например, в WO 2007/062852. Было обнаружено, что моноклональные антитела, которые являются селективными по отношению к глобуломерам Αβ, предупреждают патлогические эффекты олигомеров Αβ in vitro и in vivo (Hillen et al., J. Neurosci. 30(31): 10369-10379, 2010). Полученные результаты показали, что осуществляемая антителами нейтрализация глобуломеров Αβ является эффективной в преклинической модели с БА и может также оказаться эффективной для лечения и предупреждения БА и других амилоидозов.

В исследовании БА, помимо моноклональных анти-Αβ антител, используемых для пассивной иммунизации, были применены препараты Αβ, используемые для активной иммунизации. Результаты такого исследования показали, что терапевтический индекс вакцины на основе олигомера Αβ зависит от ее способности вырабатывать иммунные ответы, специфичные к патогенным молекулам Αβ. Важное значение такой специфичности подтверждалось результатами ранее проведенных исследований по вакцинации. Использование предварительно агрегированного Αβ(1-42) в клиническом испытании по активной иммунизации пациентов с болезнью Альцгеймера, например, приводило к возникновению серьезных побочных эффектов (минингоэнцефалита, геморрагии) у некоторых пациентов, поскольку образующиеся антитела также распознают формы Αβ(1-42), которые, предположительно, ответственны за выстилку клеток, что приводит к воспалительным реакциям (D. Schenk.; Nat. Rev. Neurosci. 3, 824-828 (2002)).

Вакцина на основе олигомера Αβ должна не только предотвращать вырабатывание аутоантител, связывающихся с формами Αβ, не являющимися патогенными, но также, в основном, не должна индуцировать образование аутоантител, способных продуцировать патогенные перекрестные реакции. Однако, было обнаружено, что в некоторых случаях, моноклональные антитела, идентифицированые с использованием препаратов олигомеров Αβ дикого типа, могут индуцировать перекрестную реакцию с тромбоцитарным фактором 4 (PF-4). PF-4 связывается с гепарином, что приводит к образованию нео-эпитопов. Это может приводить к индуцированию иммунного ответа и, тем самым, к развитию тромботического расстройства, известного как индуцированная гепарином тромбоцитопения (ИГТ). Известно, что ИГТ развивается после лечения гепарином. Тем не менее, симптомы ИГТ, тромбоцитопении и тромбоза, а также наличие анти-PF-4 аутоантител наблюдались у пациентов, которым ранее не вводился гепарин (Warkentin et al., Am. J. Med. 121(7): 632-6, 2008).

Разработка вакцины на основе олигомера Αβ представляет собой очень трудную задачу, поскольку необходимо получить такую терапевтическую вакцину, которая могла бы быть эффективной для лечения болезни Альцгеймера и родственных расстройств, но, при этом, не вызывала бы каких-либо негативных и возможно летальных побочных эффектов, таких как патологические аутоимунные ответы в организме пациента. Такая необходимость, в частности, продиктована увеличением продолжительности жизни населения в целом, что, в частности, связано с увеличением числа пациентов, у которых ежегодно диагностируется болезнь Альцгеймера или родственные расстройства.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение удовлетворяет указанным требованиям благодаря получению нового иммуногеного продукта, способного продуцировать антисыворотку, специфически связывающуюся с эпитопами глобуломера Αβ, но, при этом, не обладающую перекрестной реактивностью или обладающую низкой перекрестной реактивностью с тромбоцитарным фактором 4(PF-4). В соответствии с этим был получен новый иммуногенный продукт, содержащий один или более эпитопов, распознаваемых глобуломер-специфическими антителами. Моноклональными антителами, связывающимися с такими эпитопами, являются антитела 7C6, 4D10 и 5F7, которые были описаны в заявке WO 2007/062852, и которые могут быть получены из гибридом, имеющихся в Американской коллекции типовых культур под депозитарными номерами PTA-7240, PTA-7405 и PTA-7241, соответственно.

Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуногенному продукту, содержащему аминокислотную последовательность амилоида β (Αβ), которая на 62,5% или более идентична аминокислотной последовательности:

V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃ [SEQ ID NO:2; Αβ(18-33)], где указанный продукт

i) реагирует с моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из моноклонального антитела 7C6, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7240; моноклонального антитела 4D10, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7405, или моноклонального антитела 5F7, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7241; и

ii) обладает способностью продуцировать поликлональную антисывороту, не обладающую перекрестной реактивностью или обладающую низкой перекрестной реактивностью с тромбоцитарным фактором 4 (PF-4).

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей описанный здесь иммуногенный продукт.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предупреждения амилоидоза у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение этому индивидууму описанного здесь иммуногенного продукта. В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к описанному здесь иммуногенному продукту, применяемому для лечения или предупреждения амилоидоза.

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики амилоидоза, где указанный способ включает взатие образца у индивидуума с подозрением на амилоидоз; контактирование этого образца с описанным здесь иммуногенным продуктов в течение определенного периода времени и в условиях, достаточных для образования комплекса, содержащего такой продукт и такое антитело, где присутствие данного комплекса указывает на наличие амилоидоза у индивидуума. В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к описанному здесь иммуногенному продукту, применяемому для диагностики амилоидоза.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации агента, способного связываться с описанным здесь иммуногенным продуктом, где указанный способ включает стадии: a) взаимодействия одного или более представляющих интерес агентов в течение определенного периода времени и в условиях, достаточных для связывания одного или более агентов с продуктом; и b) идентификации агентов, которые связываются с этим продуктом.

В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения антитела, способного связываться с описанным здесь иммуногенным продуктом, где указанный способ включает:

i) получение антигена, содержащего продукт;

ii) обработку антител определенного репертуара указанным антигеном; и

iii) отбор антитела из указанных антител определенного репертуара, которое связывается с данным продуктом.

Настоящее изобретение также относится к молекуле, содержащей аминокислотную последовательность, которая идентична части (X-Y) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈A₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:13; Αβ(1-43)F19A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:14; Αβ(1-43)F20A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:15; Αβ(1-43)E22A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁F₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:16; Αβ(1-43)E22F]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁V₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:17; Αβ(1-43)E22V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:18; Αβ(1-43)E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂K₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:19; Αβ(1-43)D23K]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂L₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:20; Αβ(1-43)D23L];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄V₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:21; Αβ(1-43)G25V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉G₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:22; Αβ(1-43)A30G];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉G₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:23; Αβ(1-43)F20G E22A];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀A₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:24; Αβ(1-43)F20A I31A];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉C₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀C₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:25; Αβ(1-43)F2°C I31C];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:26; Αβ(1-43)A21Q E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀L₂₁Q₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:27; Αβ(1-43)A21L E22Q]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁E₂₂N₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:28; Αβ(1-43)A21Q D23N]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄A₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:29; Αβ(1-43)E22A G25A]; и D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅A₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:30; Αβ(1-43)E22A S26A],

где X выбран из группы, состоящей из чисел 1.. 18, 4.. 18, 12.. 18, или равен 18, а Y выбран из группы, состоящей из чисел 33.. 43, 33.. 42, 33.. 41 или 33.. 40; или представляет собой его перекрестносвязанное производное, где по меньшей мере 2 не-смежных остатка аминокислотной последовательности ковалентно связаны друг с другом.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлена хроматограмма, полученная с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭХ) на сефарозе 12 HR 10/300 GL для A) глобуломера дикого типа Αβ(20-42); B) усеченного мутеинового олигомера Αβ E22A; и C) усеченного мутеинового олигомера Αβ F20G E22A.

На фигуре 2 представлена таблица, где указано, что усеченные формы перечисленных мутеиновых олигомеров Αβ могут реагировать с мышиными моноклональными антителами m7C6 и m4D10, реагирующими с глобуломером Αβ(20-42) в ELISA (+++: сильная реакция; ++: хорошая реакция; +: средняя реакция; +/-: отсутствие реакции или слабая реакция).

Подробное описание настоящего изобретения

Если это не оговорено особо, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значения, в основном, понятные среднему специалисту в области, к которой относится изобретение. Значения и объем терминов должны быть понятны специалиcтам в данной области, однако, в случае возникновения каких-либо скрытых разночтений, следует отдать предпочтение определениям, данным в настоящей заявке, а не тем определениям, которые приводятся в словарях или в других источниках. Кроме того, если это не противоречит контексту настоящего описания, то существительные, употребляемые в единственном числе, могут означать и существительные во множественном числе, и наоборот. В настоящей заявке, употребление слова «или» означает «и/или», если это не оговорено особо. Кроме того, термин «включающий», а также другие его формы, такие как «включать» или «включенный» является неограничивающим. Такие термины, как «элемент» или «компонент» охватывает как элементы, так и компоненты, включающие одну единицу и элементы и компоненты, которые включают более, чем одну субъединицу, если это не оговорено особо.

В общих чертах, номенклатура и способы, относящиеся к клеточным и тканевым культурам, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетике, химии белков и нуклеиновых кислот и к гибридизации белка и нуклеиновых кислот, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Настоящее изобретение обычно осуществляют стандартными методами, хорошо известными специалистам и описанными в различных общих руководствах и в специальной научной литературе, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании, если это не указано особо. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителей, обычно рекомендуемыми специалистам или предложенными в настоящей заявке. Используемая номенклатура и лабораторные процедуры, а также методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской фармацевтической химии, описанные в настоящей заявке, хорошо известны и широко применяются специалистами. Для химического синтеза, химического анализа, приготовления фармацевтических препаратов, составления их рецептуры, их доставки в организм, и для лечения пациентов применяются стандартные методы.

Настоящее изобретение относится к иммуногенному продукту, который, с одной стороны, способен реагировать с антителами, связывающимися с глобуломерными эпитопами, такими как моноклональное антитело 7C6, моноклональное антитело 4D10 или моноклональное антитело 5F7, и, с другой стороны, способен вырабатывать поликлональную антисывороту, не обладающую перекрестной реактивностью или обладающую низкой перекрестной реактивностью с PF-4.

PF-4 представляет собой небольшой цитокин, состоящий из 70 аминокислот и принадлежащий к семейству хемокинов CXC, а также известный как лиганд хемокина (мотив C-X-C) 4 (CXCL4). PF-4 высвобождается из альфа-гранул активированных тромбоцитов в процессе их агрегации и стимулирует свертывание крови путем опосредования эффектов гепарин-подобных молекул. Было предсказано, что благодаря этим функциям, PF-4 участвует в заживлении ран и в воспалительных процессах (Eismann et al., Blood 76(2): 336-44, 1990). PF-4 обычно присутствует в комплексе с протеогликаном и может образовывать комплексы с антикоагулянтом гепарином, который применяется в качестве фармакологического средства для лечения тромбоза. Он обладает хорошо описанной патологической функцией при индуцированной гепарином тромбоцитопении (ИГТ), то есть, идиосинкратической аутоимунной реакции на введение антикоагулянта гепарина (Warkentin, N. Engl. J. Med. 356(9): 891-3, 2007), где комплекс «гепарин:PF4» представляет собой антиген. Аутоантитела против PF4 были также обнаружены у пациентов с тромбозом и другими заболеваниями, напоминающими ИГТ, но еще до введения гепарина (Warkentin et al., Am. J. Med. 121(7): 632-6, 2008). Индуцированная гепарином тромбоцитопения характеризуется развитием тромбоцитопении (низким числом тромбоцитов), и кроме того, ИГТ может вызывать тромбоз. Принимая во внимание эти функции и участие PF-4 в патологических процессах, можно сделать вывод, что введение антигенов (например, вакцин), которые вырабатывают поликлональную антисыворотку, связывающуюся (например, перекрестно реагирующую) с PF-4, присутствующим у индивидуума, может негативно влиять на указанные функции PF-4 и таким образом вызывать негативные (побочные) эффекты. Степень и природа таких побочных эффектов могут варьироваться в зависимости от таких параметров как, местоположение и размер эпитопа на PF-4, сила связывания и природа соответствующей антисыворотки.

Иммуногенный продукт согласно изобретению способен продуцировать поликлональную антисывороту, не обладающую перекрестной реактивностью или обладающую низкой перекрестной реактивностью с тромбоцитарным фактором 4 (PF-4). Таким образом, с использованием иммуногенного продукта согласно изобретению, применяемого для активной иммунизации индивидуума, можно предотвратить возникновение побочных реакций, таких как ИГТ, которые могут быть продуцированы после иммунизации продуктами, обладающими перекрестной реактивностью с PF-4.

В одном из аспектов изобретения, поликлональной антисывороткой, которая не обладает перекрестной реактивностью или обладает низкой перекрестной реактивностью с PF-4, индуцируемой описанным здесь иммуногенным продуктом, является поликлональная антисыворотка, происходящая от мышей или кроликов. Предпочтительной поликлональной антисывороткой является аффинно очищенная антисыворотка, обогащенная антителами, связывающимися с продуктом.

В других аспектах изобретения, PF-4 выбран из PF-4, присутствующего в плазме собакоподобных обезьян, и PF-4, присутствующего в человеческой плазме.

Способность иммуногенного продукта продуцировать поликлональную антисыворотку, которая не обладает перекрестной реактивностью или обладает низкой перекрестной реактивностью с тромбоцитарным фактором 4 (PF-4), может быть протестирована стандартными методами, хорошо известными специалистам. Так, например, иммуногенный продукт может быть использован для иммунизации мышей или кроликов с последующим вырабатыванием у них поликлональной антисыворотки. Как, в основном, известно специалистам, каждые отдельные антисыворотки могут варьироваться по количеству антител, направленных против иммуногеного продукта, используемого для иммунизации. Для предотвращения получения ложноотрицательных результатов в анализе на реактивность PF-4, поликлональная антисыворотка может быть обогащена антителами, связывающимися с иммуногенным продуктом. Такое обогащение может быть осуществлено стандартными методами аффинной очистки, которые, например, включают иммобилизацию иммуногенного продукта на твердом носителе (например, на сефарозных сферах); контактирования носителя с антисывороткой для связывания антител с иммобилизованным иммуногенным продуктом, и элюирование связанных антител с носителя (например, с использованием кислотного элюирующего буфера), где элюатом является аффинно очищенная антисыворотка, обогащенная антителами, связывающимися с иммуногенным продуктом. Если иммобилизованным продуктом является (усеченный) мутеиновый олигомер Aβ, то мутеин Aβ, содержащийся в иммуногенном продукте, может быть также, но необязательно, иммобилизован на носителе в мономерной форме для гарантии того, что все анти-Aβ антитела будут аффинно очищены и смогут также связываться с не-олигомерными формами Aβ, такими как мономерные или фибриллярные формы.

В конкретном аспекте изобретения, перекрестную реактивность определяют как связывание поликлональной антисыворотки с PF-4 плазмы, где указанная поликлональная антисыворотка была иммобилизована, например, посредством связывания с иммобилизованным анти-IgG антителом. Связанный PF-4 может быть детектирован как анти-PF-4 антитело, связанное с указанным PF-4. Анти-PF-4 антителом может быть моноклональное антитело или поликлональная антисыворотка, которые, в частности, реагируют с PF-4, имеющим аминокислотную последовательность EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:12). Анти-PF-4 антитело может представлять собой меченное антитело, и это антитело может быть детектировано по сигналу, передаваемому меткой. Альтернативно, связанное анти-PF-4 антитело может быть детектировано как меченное анти-IgG антитело, связанное с анти-PF-4 антителом, и такое детектирование может быть осуществлено по сигналу, передаваемому меткой.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения, перекрестная реакция PF-4 с антисывороткой, вырабатываемой иммуногенным продуктом согласно изобретению, означает отношение величин AUC для указанной антисыворотки и эталонного анти-PF 4 антитела, измеряемое путем (i) осуществления комплексного «сэндвич»-ELISA плазмы человека или собакоподобных обезьян и серийного разведения связывающегося белка и эталонного анти-PF-4 антитела, (ii) построения графика зависимости детектируемого сигнала (ось y) от логарифмических концентраций антисыворотки или эталонного анти-PF-4 антитела (ось x), и (iii) определения площади под кривой (AUC или общей площади пиков) по данным, не относящимся к данным для построения кривой в измеряемом интервале.

Используемый здесь термин «эталонное анти-PF-4 антитело» означает антитело, а в частности, моноклональное антитело, которое специфически связывается с PF-4, а в частности, с человеческим PF-4 (HPF4). Такое антитело получают путем продуцирования антигена, содержащего человеческий PF-4, например, человеческий PF-4, имеющий аминокислотную последовательность EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:12); и обработки антитела определенного репертуара указанным антигеном, а затем отбора из указанного антигена антител определенного репертуара, которые специфически связываются с человеческим PF-4. Это антитело может быть, но необязательно, аффинно очищено с использованием иммуногена (человеческого PF-4). Такие эталонные анти-PF4 антитела являются коммерчески доступныыми, например, таким антителом является моноклональное анти-HPF4 антитело, Abcam cat. no.: ab49735.

В конкретном аспекте настоящего изобретения, описанный здесь иммуногенный продукт обладает способностью продуцировать поликлональную антисыворотку, перекрестно реагирующую с PF-4 на уровне, который по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз ниже уровня перекрестной реактивности эталонного анти-PF-4 антитела с PF-4.

Кроме того, иммуногенные продукты согласно изобретению характеризуются способностью реагировать с конкретными антителами. Такими антителами являются, в частности, антитела, связывающиеся с глобуломерными эпитопами, а в частности, антитела, у которых аффинность связывания с глобуломером Aβ(20-42) превышает аффинность связывания с глобуломером Aβ(1-42).

Антитела, у которых аффинность связывания с глобуломером Aβ(20-42) превышает аффинность связывания с глобуломером Aβ(1-42), описаны в заявке WO 2007/062852, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки, и такими антителами являются, например, моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 7C6, 4D10 и 5F7.

Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, иммуногенный продукт согласно изобретению подвергают реакции взаимодействия с моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из моноклонального антитела 7C6, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7240; моноклонального антитела 4D10, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7405, или моноклонального антитела 5F7, получаемого из гибридомы, имеющейся в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7241.

В одном из аспектов изобретения, моноклональное антитело 7C6 связывается с описанным здесь иммуногенным продуктом с высокой аффинностью, например, с K_D 1×10^-6 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-7 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-8 M с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-8 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-9 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-9 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-10 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-10 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-11 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-11 M или с более высокой аффинностью.

В другом аспекте изобретения, моноклональное антитело 4D10 связывается с описанным здесь иммуногенным продуктом с высокой аффинностью, например, с K_D 1×10^-6 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-7 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-8 M с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-8 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-9 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-9 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-10 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-10 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-11 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-11 M или с более высокой аффинностью.

В другом аспекте изобретения, моноклональное антитело 5F7 связывается с описанным здесь иммуногенным продуктом с высокой аффинностью, например, с K_D 1×10^-6 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-7 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-8 M с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-8 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-9 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-9 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-10 M или с более высокой аффинностью, с K_D 1×10^-10 M или с более высокой аффинностью, например, с K_D 3×10^-11 M или с более высокой аффинностью или с K_D 1×10^-11 M или с более высокой аффинностью

Иммуногенные продукты согласно изобретению, которые реагируют с глобуломер-специфическими антителами, очевидно, имеют по меньшей мере один глобуломерный эпитоп. Следовательно, иммуногенные продукты согласно изобретению обладают способностью вырабатывать иммунный ответ, имеющий такой же профиль, как и иммунный ответ, вырабатываемый в случае, когда в качестве иммуногена используются глобуломеры Aβ(20-42) или другие усеченные глобуломеры.

Термин «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или с Т-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорил или сульфонил, а в некоторых вариантах осуществления изобретения, они могут обладать специфическими трехмерными структурными свойствами и/или специфическими зарядовыми свойствами. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается со связывающимся белком, а в частности, антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что связывающийся белок или антитело специфически связываются с антигеном, если они преимущественно распознают антиген-мишень в комплексной смеси белков и/или макромолекул.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, иммуногенные продукты согласно изобретению характеризуются способностью вырабатывать конкретный иммунный ответ, например, после иммунизации млекопитающего, например, кролика или мыши, иммуногенным продуктом согласно изобретению.

Иммунный ответ может рассматриваться как вырабатывание смеси антител в результате стимуляции хозяина (иммунизации хозяина) антигеном (иммуногеном). Указанная смесь антител может быть взята у хозяина, и такая смесь называется здесь поликлональной антисывороткой.

В одном аспекте изобретения, такой конкретный иммунный ответ, то есть, продуцирование соответствующей поликлональной антисыворотки, характеризуется тем, что она содержит антитело, обладающее аффинностью связывания с иммуногенным продуктом согласно изобретению или глобуломером Aβ, которая превышает аффинность связывания антитела по меньшей мере с одной формой Aβ, выбранной из группы, состоящей из мономерной формы Aβ(1-42), мономерной формы Aβ(1-40), мономерной формы Aβ(20-42), фибрилломерной формы Aβ(1-42) и фибрилломерной формы Aβ(1-40), а предпочтительно, со всеми указанными формами Aβ.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, иммунный ответ, то есть, продуцирование соответствующей поликлональной антисыворотки, характеризуется тем, что ее аффинность связывания с иммуногенным продуктом согласно изобретению или глобуломером Aβ по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антисыворотки по меньшей мере с одной формой Aβ, выбранной из группы, состоящей из мономерной формы Aβ(1-42), мономерной формы Aβ(1-40), мономерной формы Aβ(20-42), фибрилломерной формы Aβ(1-42) и фибрилломерной формы Aβ(1-40), а предпочтительно, со всеми указанными формами Aβ.

В родственных аспектах изобретения, указанный глобуломер Aβ выбран из группы, состоящей из глобуломера Aβ(1-42), глобуломера Aβ(12-42) и глобуломера Aβ(20-42).

Используемый здесь знак многоточия «A.. B» означает ряд всех натуральных чисел от A до B, включительно, например, «17.. 20» означает группу чисел 17, 18, 19 и 20. Дефис означает непрерывную аминокислотную последовательность, то есть, «X-Y» включает последовательность от аминокислоты X до аминокислоты Y, включительно. Так, например, «A.. B-C.. D» включает все возможные комбинации чисел этих двух множеств, например, «17.. 20-40.. 42» означает все следующие множества: 17-40, 17-41, 17-42, 18-40, 18-41, 18-42, 19-40, 19-41, 19-42, 20-40, 20-41 и 20-42. Если это не оговорено особо, то все числа относятся к зрелому пептиду, то есть, цифра 1 означает N-концевую аминокислоту.

Используемый здесь термин «Aβ(X-Y)» означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, начиная от аминокислоты в положении Х до аминокислоты в положении Y человеческого амилоидного белка бета (Aβ), включая X и Y, а в частности, аминокислотную последовательность, начиная от аминокислоты в положении Х до аминокислоты в положении Y аминокислотной последовательности D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO:1) (соответствующей положениям аминокислот 1-43 человеческого белка Aβ) или его мутеина.

Используемые здесь термины «мономер Aβ(X-Y)» или «мономерная форма Aβ(X-Y)» означают выделенную форму пептида Aβ(X-Y), а предпочтительно, форму пептида Aβ(X-Y), которая, по существу, не связана нековалентными связями с другими пептидами Aβ. Практически, мономер пептида Aβ(X-Y) обычно получают в форме водного раствора. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, водный раствор мономера содержит от 0,05% до 0,2%, а более предпочтительно, приблизительно 0,1% NH₄OH. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, водный раствор мономера содержит от 0,05% до 0,2%, а более предпочтительно, приблизительно 0,1% NaOH. При использовании этого раствора (например, для определения аффинности связывания антител согласно изобретению) может оказаться желательным разведение указанного раствора соответствующим способом. Кроме того, обычно указанный раствор используют через 2 часа, в частности, через 1 час, а предпочтительно, через 30 минут после его приготовления.

Более конкретно, используемый здесь термин «мономер Aβ(1-40)» означает препарат мономера Aβ(1-40), описанный здесь в Сравнительном примере 1, а термин «мономер Aβ(1-42)» означает препарат мономера Aβ(1-42), описанный здесь в Сравнительном примере 2.

Используемый здесь термин «фибрилла» означает молекулярную структуру, включающую набор из нековалентно связанных отдельных пептидов Aβ(X-Y), которые, как было определено под электронным микроскопом, имеют фибриллярную структуру, связанную с Конго красным, и обнаруживают двойное лучепреломление в поляризованном свете, и которые, как показала рентгенография, имеют структуру из поперечных β-связей.

В другом аспекте изобретения, фибриллой является молекулярная структура, полученная способом, который включает аутоиндуцированную полимерную агрегацию подходящего пептида Aβ в отсутствии детергентов, например, в 0,1 M HCl, с образованием агрегатов из более, чем 24, а предпочтительно, более, чем 100 звеньев. Этот способ хорошо известен специалистам. Фибриллы Aβ(X-Y) желательно использовать в форме водного раствора. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, водный фибриллярный раствор получают путем растворения пептида Aβ в 0,1% NH₄OH, а затем разведения 1:4 20 мM NaH₂PO₄, 140 мM NaCl, pH 7,4, с последующим доведением pH до 7,4, инкубированием раствора при 37°C в течение 20 часов, центрифугированием при 10000× g в течение 10 минут и ресуспендированием в 20 мM NaH₂PO₄, 140 мM NaCl, pH 7,4.

Используемый здесь термин «фибрилла Aβ(X-Y)» означает фибриллу, по существу, состоящую из субъединиц Aβ(X-Y), где в среднем по меньшей мере 90% субъединиц, предпочтительно, представляют собой Aβ(X-Y), а более предпочтительно, по меньшей мере 98% субъединиц, предпочтительно, представляют собой Aβ(X-Y), а наиболее предпочтительно, если содержание пептидов, не являющихся Aβ(X-Y), составляет ниже порога детектирования.

Более конкретно, используемый здесь термин «фибрилла Aβ(1-42)» означает препарат фибриллы Aβ(1-42), описанный здесь в Сравнительном примере 6.

В другом аспекте изобретения, иммунный ответ характеризуется тем, что он индуцируется антителом, обладающим аффинностью связывания с иммуногенным продуктом согласно изобретению или глобуломером Aβ(20-42), которая превышает аффинность связывания антитела с глобуломером Aβ(1-42) или с глобуломером Aβ(12-42).

В соответствии с другим аспектом изобретения, описанный здесь иммуногенный продукт обладает способностью продуцировать поликлональную антисыворотку, характеризующуюся тем, что ее аффинность связывания с иммуногенным продуктом согласно изобретению или глобуломером Aβ(20-42), по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антисыворотки по меньшей мере с одним глобуломером Aβ, выбранным из группы, состоящей из глобуломера Aβ(1-42) и глобуломера Aβ(12-42).

Аффинности связывания антител (моноклональных или поликлональных антител) с указанным антигеном (таким как иммуногенные продукты согласно изобретению) могут быть оценены с помощью стандартных иммуноанализов in vitro, таких как ELISA, дот-блот-анализ или анализ методом поверхностного плазмонного резонанса. Используемый здесь термин «поверхностный плазмонный резонанс» означает оптический феномен, позволяющий проанализировать в реальном времени биоспецифические взаимодействия посредством детектирования изменения концентраций белка на биосенсорной матрице, например, с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Более подробное описание можно найти в публикациях Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, используемый здесь термин «аффинность» определен как величины, полученные методом дот-блот-анализа, описанного в настоящей заявке, и оцененные с помощью денситометрического анализа. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, определение аффинности связывания методом дот-блот-анализа включает нанесение на нитроцеллюлозную мембрану пятна, а именно, некоторого количества антигена (например, иммуногенного продукта согласно изобретению; олигомера Aβ(X-Y), мономера Aβ(X-Y) или фибриллы Aβ(X-Y), как определено выше), или предпочтительно, его соответствующего разведения, например, в 20 мM NaH₂PO₄, 140 мM NaCl, pH 7,4, 0,2 мг/мл BSA до концентрации антигена, например, 100 пмоль/мкл, 10 пмоль/мкл, 1 пмоль/мкл, 0,1 пмоль/мкл и 0,01 пмоль/мкл, с последующим блокированием этой мембраны молоком для предупреждения неспецифического связывания и промывкой, а затем контактированием этой мембраны с представляющими интерес антителом или антисывороткой и детектированием антитела или антисыворотки с использованием конъюгированного с ферментом «второго» антитела и проведением колориметрической реакции, где при определенных концентрациях антитела, количество связанного антитела позволяет определить уровень аффинности. Таким образом, относительная аффинность связывания двух различных антител или антисывороток с одним антигеном или аффинность связывания одного антитела или антисыворотки с двумя различными антигенами определена здесь как отношение соответствующих количеств связанного с антигеном антитела, наблюдаемое при двух комбинациях антитело/антисыворотка-антиген, в условиях, почти идентичных условиям проведения дот-блот-анализа. Дот-блот-анализ, в отличие от аналогичного метода, проводимого на основе вестерн-блот-анализа, позволяет определить аффинность связывания антитела с указанным антигеном в его природной конформации, и в отличие от ELISA-анализа, дот-блот-анализ не зависит от различий в аффинностях между различными мишенями и матрицами, что позволяет проводить более точные сравнения различных антигенов.

Используемый здесь термин «более высокая аффинность» означает степень взаимодействия, где равновесие между несвязанным антителом и несвязанным иммуногенным продуктом или глобуломером, с одной стороны, и комплексом антитело-иммуногенный продукт/глобуломер, с другой стороны, предпочтительно, сдвинуто в сторону комплекса. Аналогичным образом, используемый здесь термин «более низкая аффинность» означает степень взаимодействия, где равновесие между несвязанным антителом и несвязанным иммуногенным продуктом или глобуломером, с одной стороны, и комплексом антитело-иммуногенный продукт/глобуломер, с другой стороны, предпочтительно, сдвинуто в сторону несвязанного антитела и несвязанного иммуногенного продукта/глобуломера. Термин «более высокая аффинность» является синонимом термина «повышенная аффинность», а термин «более низкая аффинность» является синонимом термина «пониженная аффинность».

Используемый здесь термин «K_D» (также «K_d» или «KD») означает «константу равновесной диссоциации» и имеет величину, полученную путем равновесного титрования или деления константы скорости диссоциации (k_off) на константу скорости ассоциации (k_on). Константа скорости ассоциации (k_on), константа скорости диссоциации (k_off) и константа равновесной диссоциации (K_D) используются для определения аффинности связывания связывающегося белка (например, антитела) с антигеном. Методы определения констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо известны специалистам. Флуоресцентные методы обладают высокой чувствительностью и позволяют проводить анализ образцов в физиологических буферах в условиях равновесия. При этом могут быть применены и другие экспериментальные методы и инструменты, такие как анализ BIAcore® (анализ посредством биомолекулярного взаимодействия) (например, оборудование для этого анализа поставляется компанией BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Кроме того, может быть также проведен анализ KinExA® (анализ на кинетическое исключение), разработанный Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, иммуногенные продукты согласно изобретению являются растворимыми, а в частности, растворимыми в водной среде (например, в водном растворе 5 мM NaH₂PO₄ и 35 мM NaCl, а более конкретно в водном растворе 5 мM NaH₂PO₄ и 35 мM NaCl, содержащем амфипатический агент в концентрации, указанной ниже, или в водном растворе 5 мM NaH₂PO₄ и 35 мM NaCl, имеющем pH от 8 до 10, от 8,0 до 9,5 или от 8,0 до 9,0). Предпочтительной является растворимость по меньшей мере 0,1, 1 или 5 мг белка на миллилитр раствора. Растворимость может быть оценена путем центрифугирования. Иммуногенный продукт является растворимым, если он не осаждается после центрифугирования при 10000 × g и при температуре в пределах от 10 до 40°C, например, при 37°C.

Кроме того, предпочтительно, чтобы иммуногенный продукт согласно изобретению содержал множество, например, от 2 до 28 описанных здесь аминокислотных последовательностей Aβ.

Таким образом, иммуногенный продукт согласно изобретению, в частности, представляет собой олигомер мутеинов Aβ, который может быть, но необязательно, усеченным и/или перекрестно связанным.

Используемые здесь термины «олигомер Aβ» или «олигомер мутеина Aβ» означают растворимые (в отсутствии сопряженных перекрестных связей) нековалентно связанные полипептиды Aβ и мутеины Aβ, описанные выше. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, олигомеры Aβ представляют собой стабильные нефибриллярные комплексы полипептидов Aβ (мутеинов), которые могут быть получены путем инкубирования с анионными детергентами. Используемый здесь термин «глобуломер Aβ» означает олигомер Aβ, имеющий трехмерную шарообразную структуру («расщепленную шарообразную структуру», см. Barghorn et al., J. Neurochem 95: 834-847, 2005). Олигомеры Aβ (мутеины) могут быть охарактеризованы по одному или более из нижеследующих признаков:

- по меньшей мере частичной отщепляемости N-концевых аминокислот X-24 под действием неспецифических протеаз (таких как термолизин или эндопротеиназа GluC) с образованием усеченных форм олигомеров Aβ (мутеина);

- недоступности C-концевых аминокислот 25-Y для неспецифических протеаз и антител;

- сохранению усеченными формами этих олигомеров 3-мерной коровой структуры указанных олигомеров с более высокой доступностью коровых эпитопов Aβ(18-33).

Используемые здесь термины «усеченный олигомер Aβ» или «усеченный олигомер мутеина Aβ» означают усеченную форму олигомера Aβ (мутеина), которая может быть получена путем лимитирующего протеолитического расщепления олигомера Aβ. Более конкретно, усеченными олигомерами Aβ(X-Y) (мутеина) являются N-концевые усеченные формы, где X выбран из группы, состоящей из чисел 2.. 24, а Y является таким, как он был определен в настоящем описании, где указанные формы могут быть получены путем усечения олигомеров Aβ(X-Y) (мутеина) посредством обработки соответствующими протеазами. Так, например, олигомер Aβ(20-42) может быть получен путем протеолиза олигомера Aβ(1-42) под действием термолизина, а олигомер Aβ(12-42) может быть получен путем протеолиза олигомера Aβ(1-42) под действием эндопротеиназы GluC. По мере достижения нужной степени протеолиза, протеазу инактивируют методом, по существу, известным специалистам. Полученные олигомеры могут быть затем выделены в соответствии с уже описанным здесь процедурами и дополнительно процессированы, если это необходимо, путем проведения последующих стадий обработки и очистки.

Олигомеры согласно изобретению могут быть получены путем олигомеризации соответствующего пептида мутеина Aβ, содержащего аминокислотную последовательность Aβ. Олигомеризация включает нековалентную агрегацию мономерного пептида мутеина Aβ с получением олигомеров согласно изобретению, состоящих из множества пептидов мутеина Aβ.

Исходный материал, то есть, пептид мутеина Aβ может быть получен известными методами пептидного синтеза или рекомбинантными методами. Кроме того, некоторые из этих белков являются коммерчески доступными. В конкретном варианте осуществления изобретения, пептид мутеина Aβ представляет собой синтетичекий пептид мутеина Aβ.

Указанный пептид может быть получен путем химического синтеза с применением различных твердофазных методов, таких как методы, описанные в публикациях G. Barany and R.B. Merrifield, ʺThe Peptides: Analysis, Synthesis, Biologyʺ; Volume 2 - ʺSpecial Methods in Peptide Synthesis, Part Aʺ, pp. 3-284, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; and in J. M. Stewart and J. D. Young, ʺSolid-Phase Peptide Synthesisʺ, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984. Эта стратегия основана на использовании группы Fmoc (9-флуоренилметил-метилоксикарбонила) для временной защиты α-аминогруппы в комбинации с трет-бутильной группой для временной защиты аминокислотных боковых цепей (см., например, E. Atherton and R. C. Sheppard, ʺThe Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Groupʺ, in ʺThe Peptides: Analysis, Synthesis, Biologyʺ; Volume 9 -ʺSpecial Methods in Peptide Synthesis, Part Cʺ, pp. 1-38, S. Undenfriend and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987).

Пептиды могут быть синтезированы постадийно на нерастворимом полимерном носителе (также называемом «смолой»), начиная с С-конца пептида. Синтез начинают путем присоединения С-концевой аминокислоты пептида к смоле посредством образования амидной или сложноэфирной связи. Это позволяет, в конечном счете, высвобождать полученный пептид в виде С-концевого амида или карбоновой кислоты, соответственно. Альтернативно, в случае, если присутствует С-концевой аминоспирт, то С-концевой остаток может быть присоединен к описанной здесь смоле на основе 2-метокси-4-алкоксибензилового спирта (SASRIN™, Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA), и после завершения реакции сборки пептидной последовательности, полученный пептидный спирт высвобождают с использованием LiBH₄ в ТГФ (см. J. M. Stewart and J. D. Young, supra, p. 92).

При этом, необходимо, чтобы С-концевая аминокислота и все остальные аминокислоты, используемые в синтезе, содержали α-аминогруппы, а функциональные группы боковой цепи (если они присутствуют) должны быть защищены различными защитными группами так, чтобы α-амино-защитная группа могла быть селективно удалена в процессе синтеза. Присоединение аминокислоты осуществляют путем активации ее карбоксильной группы в виде активного сложного эфира и реакции взаимодействия этого сложного эфира с неблокированной α-аминогруппой N-концевой аминокислоты, присоединенной к смоле. Реакцию снятия защиты и присоединение последовательности α-аминогруппы повторяют до тех пор, пока не будет получена полноразмерная пептидная последовательность. Затем пептид высвобождают из смолы путем снятия защиты с функциональных групп боковой цепи, обычно в присутствии соответствующих акцепторов для предотвращения побочных реакций. И наконец, полученный пептид очищают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для синтеза пептидильных смол, необходимых в качестве предшественников конечных пептидов, используют коммерчески доступные перекрестносвязанные полистироловые полимерные смолы (Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA). Предпочтительными твердыми носителями являются смола на основе 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетил-п-метилбензгидриламина (смола MBHA на основе амида Rink); 9-Fmoc-аминоксантил-3-илокси-смола Меррифилда (смола на основе амида Sieber); 4-(9-Fmoc)аминометил-3,5-диметоксифенокси)валерил-аминометил-смола Меррифилда (смола PAL), для C-концевых карбоксамидов. Присоединение первой и последующих аминокислот может быть осуществлено с использованием активных сложных эфиров HOBT или HOAT, продуцированных из DIC/HOBT, HBTU/HOBT, BOP, PyBOP, или из DIC/HOAT, HATU/HOAT, соответственно. Предпочтительными твердыми носителями являются 2-хлортритилхлоридная смола и 9-Fmoc-аминоксантил-3-илокси-смола Меррифилда (смола на основе амида Sieber) для защищенных пептидных фрагментов. Загрузку первой аминокислоты на 2-хлортритилхлоридную смолу лучше всего осуществлять посредством реакции взаимодействия Fmoc-защищенной аминокислоты со смолой в дихлорметане и DIEA. Если это необходимо, то для облегчения растворения аминокислоты может быть добавлено небольшое количество ДМФ.

Синтез может быть осуществлен на пептидном синтезаторе, таком как усовершенствованный многофункциональный пептидный синтезатор Chemtech (MPS396) или на пептидном синтезаторе Applied Biosystems Inc. (ABI 433a).

Альтернативно, специалистам в данной области известны и различные другие подходящие мотодики, включая: 1) синтез множества копий нужного пептида, разделенных соответствующими сайтами расщепления пептидных связей посредством химического или ферментативного гидролиза с получением нужного пептида; 2) рекомбинантную экспрессию APP в любой системе, известной специалистам и содержащей аминокислотную последовательность, с последующим ферментативным или химическим процессингом с получением нужного пептида; 3) рекомбинантную экспрессию нужного пептида в виде гибридного белка в любой системе, известной специалистам; 4) рекомбинантную экспрессия нужного пептида непосредственно в любой системе, известной специалистам.

Рекомбинантная экспрессия амилоидных β-пептидов описана в WO2007/064917. Кроме того, общие методы экспрессии гетерологичных белков в рекомбинантных хозяевах, химический синтез полипептидов и in vitro трансляция хорошо известны специалистам и более подробно описаны в руководствах Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. ; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken 1. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187 ; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957; и Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing).

Затем полученный пептид подвергают реакции в условиях, способствующих образованию олигомера. Условия, подходящие для образования олигомера, описаны, например, в заявке WO 2004/067561; в заявке WO 2006/094724; в публикации S. Barghorn et al., J. Neurochem. 95, 834 (2005) и в заявке WO 2007/064917, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

В первой стадии, мономерный пептид мутеина Aβ растворяют в растворителе. Предпочтительным растворителем является агент, разрывающий водородную связь. Целью такой обработки является получение раствора неуложенного пептида.

Подходящие агенты, разрывающие водородную связь, известны специалистам. Такими агентами являются органические соединения, такие как 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP) и водные растворы оснований, таких как гидроксид натрия, гидроксид калия, муравьиная кислота, 2,2,2-трифторэтанол (TFE), мочевина и хлорид гуанидиния.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, агентом, разрывающим водородную связь, является HFIP.

Для облегчения растворения пептида мутеина Aβ в агенте, разрывающем водородную связь, смесь может быть подвергнута помешиванию, например, встряхиванию. Время растворения, составляющее от нескольких минут до нескольких часов, например, от 15 минут до 5 часов, является достаточным при температуре от 22°C до 50°C. Так, например, пептид может быть, предпочтительно, растворен путем его встряхивания в HFIP в течение приблизительно 2,5 часа приблизительно при 37°C.

Количество пептида мутеина Aβ может быть скорректировано так, чтобы 2 мг/мл - 50 мг/мл, 5 мг/мл - 40 мг/мл или 5 мг/мл - 30 мг/мл пептида растворялись в агенте, разрывающем водородную связь. Так, например, концентрация пептида мутеина Aβ, растворенного в агенте, разрывающем водородную связь, может быть, предпочтительно, доведена приблизительно до 6 мг/мл в HFIP.

Желательно, чтобы прозрачный раствор был получен путем растворения пептида мутеина Aβ в агенте, разрывающем водородную связь.

Затем агент, разрывающий водородную связь, удаляют, например, путем выпаривания, и остаток ресуспендируют в подходящем растворителе, например, в ДМСО. Количество пептида мутеина Aβ может быть скорректировано так, чтобы 1 мМ - 10 мМ, 2 мМ - 8 мМ или 4 мМ - 6 мМ пептида было ресуспендировано в растворителе. Так, например, концентрация ресуспендированого пептида мутеина Aβ может быть, предпочтительно, доведена приблизительно до 5 мМ в ДМСО.

В другой стадии, к раствору пептида мутеина Aβ в агенте, разрывающем водородную связь, добавляют амфипатический агент. Добавление амфипатического агента индуцирует олигомеризацию пептида, что приводит к образованию олигомеров.

Амфипатическими агентами являются жирные кислоты или детергенты, и некоторые из них перечислены в заявке WO2007064917, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Так, например, в способе согласно изобретению, в качестве амфипатического агента могут быть, предпочтительно, использованы сульфаты, а в частности, алкилсульфаты и сульфаты алкилового эфира; сульфонаты, например, додецилсульфат натрия (ДСН); карбоновые кислоты, такие как жирные кислоты, например, лауриновая кислота; саркозины, например, N-лауроилсаркозин (также известный как саркозил NL-30 или Gardol^®); полиоксиэтиленовые эфиры алкиларилового спирта, такие как полиоксиэтиленовые эфиры октилфенола, например, трет-октилфенол × 9-10EO (также известный как Triton^® X100) или полиоксиэтиленовые эфиры алкиларилнонилфенола, например, нонилфенол × 20EO (также известный как Tergitol^® NP-40), 3-(3-холамидопропилдиметиламмоний-1-пропансульфонат (CHAPS), додецил-N,N-диметил-3-амино-1-пропансульфонат (DDAP), и амины, а в частности, алкиламины, например, додециламин. Кроме того, в способе согласно изобретению, в качестве амфипатического агента могут быть, предпочтительно, использованы поверхностно-активные вещества ряда сахаров, а в частности, полиэтоксилированные сложные эфиры сорбита, такие как, например, полиэтоксилированные сложные эфиры сорбита и жирной кислоты, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (также известный как полисорбат 80 или Tween^® 80).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, амфипатический агент добавляют в виде водного раствора, содержащего амфипатический агент. Указанный раствор может быть забуференным. pH, предпочтительно, составляет в пределах от 6,0 до 10,0, от 6,5 до 9,5, или от 7,0 до 9,0. Так, например, предпочтительно, использовать забуференный водный раствор, имеющий рН приблизительно 7,4. Подходящие забуференные водные растворы известны специалистам. Так, например, предпочтительно, использовать водный раствор, содержащий 5 мМ NaH₂PO₄ и 35 мМ NaCl.

Пептид мутеина Aβ разводят путем добавления водного раствора. При этом, предпочтительно, чтобы количество добавленного водного раствора в 5-50, 7-30 или 8-25 раз превышало объем ресуспендированного пептида мутеина Aβ. Так, например, предпочтительно, чтобы количество добавленного водного раствора приблизительно в 10 раз превышало объем ресуспендированного пептида мутеина Aβ.

Концентрация выбранного амфипатического агента зависит от типа этого агента. Если используется ДСН, то, предпочтительно, чтобы его концентрация в смеси для инкубирования составляла в пределах от 0,05 до 0,7 масс.%, от 0,075 до 0,4 масс.%, или от 0,1 до 0,3 масс.%. Так, например, предпочтительно, использовать забуференный водный раствор, содержащий приблизительно 0,2 масс.% ДСН. При использовании лауриновой кислоты или N-лауроилсаркозина, предпочтительными являются более высокие концентрации, составляющие, например, от 0,1 до 1,0 масс.%, от 0,25 до 0,75 масс.% или от 0,4 до 0,6 масс.%. Так, например, предпочтительно, использовать забуференный водный раствор, содержащий приблизительно 0,5 масс.% лауриновой кислоты или N-лауроилсаркозина. При использовании полиоксиэтиленсорбитанмоно-олеата (например, Tween^® 80), предпочтительная концентрация в смеси для инкубирования составляет в пределах от 0,05 до 1 масс.%, от 0,075 до 0,5 масс.% или от 0,1 до 0,3 масс.%.

Обычно, ресуспендированный пептид мутеина Aβ и забуференный водный раствор смешивают, предпочтительно, путем перемешивания, например, вихревого перемешивания.

Сначала смесь инкубируют до образования полного олигомера, и это может оказаться предпочтительными для удаления твердых веществ из смеси.

Время инкубирования до образования олигомера может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Период времени от 1 часа до 48 часов, от 2 часов до 36 часов или от 5 часов до 24 часов является достаточным при температуре инкубирования 15-50°C, 18-45°C или 20-40°C. Так, например, завершение образования олигомера происходит при инкубировании смеси приблизительно в течение 24 часов при температуре приблизительно 37°C.

Инкубирование, предпочтительно, осуществляют в две стадии, то есть, после первого периода инкубирования, препарат разбавляют (например, водой), а затем проводят вторую стадию инкубирования.

Время инкубирования в первой стадии может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Период времени от 1 часа до 24 часов, от 2 часов до 12 часов или от 4 часов до 8 часов является достаточным при температуре инкубирования 15-50°C, 18-45°C или 20-40°C. Так, например, смесь инкубируют приблизительно в течение 6 часов при температуре приблизительно 37°C.

Разведение смеси для инкубирования может быть осуществлено известным per se способом. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, разведение включает добавление воды. Предпочтительно, чтобы смесь для инкубирования имела приблизительно 2-20-кратное разведение, 3-15-кратное разведение или 4-10-кратное разведение, например, 4-кратное разведение (1:3).

Время инкубирования во второй стадии образования олигомера может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Период времени от 1 часа до 36 часов, от 2 часов до 24 часов или от 4 часов до 18 часов является достаточным при температуре инкубирования 15-50°C, 18-45°C или 20-40°C. Так, например, завершение образования олигомера происходит при инкубировании смеси приблизительно в течение 18 часов при температуре приблизительно 37°C.

После завершения образования олигомера может оказаться предпочтительным центрифугирование смеси для инкубирования с получением супернатанта центрифугированной смеси для инкубирования. Так, например, центрифугирование предпочтительно, проводят приблизительно в течение 20 минут и со скоростью приблизительно 3000× g.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, супернатант центрифугированной смеси для инкубирования может быть затем подвергнут замораживанию. Так, например, супернатант центрифугированной смеси для инкубирования может быть, предпочтительно, заморожен при -30°C в течение 30 минут. Затем замороженный супернатант может быть оттаян, после чего оттаянный супернатант может быть, но необязательно, снова подвергнут центрифугированию (например, в течение 10 минут при 10000× g) с получением супернатанта центрифугированной смеси.

Олигомерный препарат, полученный этим способом, может быть использован в чистом виде, либо он может быть подвергнут дополнительной обработке, например, для концентрирования и/или очистки олигомеров.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, способ согласно изобретению включает стадию концентрирования смеси для инкубирования.

Концентрирование смеси для инкубирования может быть осуществлено известным per se способом. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, концентрирование осуществляют путем ультрацентрифугирования. Ультрацентрифугирование представляет собой метод, хорошо известный специалистам. Ультрацентрифугирование предпочтительно проводят с отсечкой молекулярной массы от 10 до 100, от 20 до 80 или от 25 до 50 кДа. Так, например, олигомеры согласно изобретению могут быть предпочтительно подвергнуты концентрированию путем ультрацентрифугирования с отсечкой молекулярной массы приблизительно 30 кДа.

Ультрацентрифугирование приводит к снижению объема смеси для инкубирования, но сохраняет количество олигомера, присутствующего в смеси для инкубирования. Так, например, объем, предпочтительно, снижают до 1-40%, 2-35% или 4-33%. Так, например, объем смеси для инкубирования может быть, предпочтительно, снижен приблизительно до 32%, 10% или 5% путем ультрацентрифугирования.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, способ согласно изобретению включает стадию снижения концентрации соли в смеси для инкубирования или в концентрированной смеси для инкубирования.

Снижение концентрации соли (и амфипатического агента, где такое снижение концентрации является особенно важным для активной иммунизации) может быть осуществлено известным per se способом. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, концентрацию соли снижают путем диализа смеси для инкубирования или концентрированной смеси для инкубирования. Диализ представляет собой метод, хорошо известный специалистам. Так, например, диализ смеси для инкубирования или концентрированной смеси для инкубирования может быть, предпочтительно, осуществлен против раствора, содержащего 5 мМ NaH₂PO₄ и 35 мМ NaCl. Этот раствор может также содержать подходящее количество амфипатического агента. Во время диализа может оказаться предпочтительной замена раствора свежим раствором.

Диализ осуществляют до снижения концентрации соли. Так, например, диализ, предпочтительно, осуществляют приблизительно в течение 2,5 часа при температуре приблизительно 22°C.

Может также оказаться предпочтительным центрифугирование диализата с получением супернатанта центрифугированного диализата. Так, например, центрифугирование, предпочтительно, осуществляют приблизительно в течение 10 минут приблизительно при 10000× g.

Таким образом, в соответствии со своим конкретным вариантом, настоящее изобретение относится к способу получения олигомера мутеина Aβ, где указанный способ включает:

(i) растворение мономерного пептида мутеина Aβ в агенте, разрывающем водородную связь;

(ii) добавление амфипатического агента, смешивание и инкубирование;

(iii) разведение и инкубирование; и

(iv) необязательно, одну или более из нижеследующих процедур, таких как центрифугирование, снижение концентрации соли и/или амфипатического агента путем диализа, концентрирование путем ультрацентрифугирования и

(v) получение супернатанта.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, иммуногенным продуктом является усеченный олигомер мутеина Aβ.

Указанный усеченный олигомер мутеина Aβ может быть получен способом продуцирования олигомера мутеина Aβ, где указанный способ также включает стадию (d) протеолитического расщепления олигомера. При этом, предпочтительными являются эндопептидазы, например, ферменты, выбранные из группы, состоящей из трипсина, химотрипсина, термолизина, эластазы, папаина и эндопротеиназы GluC. Условия, подходящие для протеолитического расщепления олигомера, описаны, например, в заявках WO 2004/067561; WO 2006/094724 и WO 2007/064917, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Конкретные усеченные олигомеры согласно изобретению получают путем обработки термолизином.

Иммуногенный продукт согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность Aβ, которая на 62,5% или более инентична аминокислотной последовательности Aβ(18-33), представленной в SEQ ID NO:1. В соответствии с этим, описанный здесь иммуногенный продукт содержит аминокислотную последовательность Aβ, которая на 62,6% или более, 68,75% или более, 75% или более, 81,25% или более, 87,5% или более, или 93,75% или более идентичны аминокислотной последовательности V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃ [SEQ ID NO:2; Aβ(18-33)].

Термин «идентичность» означает сходство двух последовательностей по их аминокислотам в конкретном «окне сравнения» или сегменте. Таким образом, идентичность определяют как степень сходства, соответствия или эквивалентности двух аминокислотных последовательностей. «Процент идентичности последовательностей» вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по всей конкретной области и определения числа положений, в которых присутствуют идентичные аминокислоты в обеих последовательностях, с получением числа соответствующих положений, которое затем делят на общее число положений в сравниваемом сегменте, и полученный результат умножают на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей может быть осуществлено с помощью алгоритма Смита и Уотермана (Smith & Waterman), Appl. Math. 2: 482, 1981, алгоритма Нидлмана и Вюнша (Needleman & Wunsch), J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, методом Пирсона и Липмана (Pearson & Lipman), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444, 1988, и с помощью компьютерных программ, разработанных на основе соответствующих алгоритмов (например, Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153, 1989), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402, 1997), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) или GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI)).

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, аминокислотная последовательность, содержащаяся в иммуногенном продукте согласно изобретению, отличается тем, что она имеет конкретную вторичную структуру, содержащую петлю (синоним: виток). Используемый здесь термин «петля» (или «виток) определяют по близкому расположению по меньшей мере двух α-атомов С (обычно <7Å).

Подходящими петлями являются α-, β-, γ- и π-петли. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, петлей является β-петля. Используемый здесь термин «β-петля» определяют как петлю, которая характеризуется наличием водородной(ых) связи(ей), где донорные и акцепторные остатки разделены тремя остатками (i ® i ± 3H-связь).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, петлей является β-шпилечная петля. Используемый здесь термин «β-шпилечная петля» означает петлю, в которой направление пептидного остова является обратным, и в которой происходит взаимодействие фланкирующих элементов вторичной структуры.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, петля, которая может, предпочтительно, представлять собой β-шпилечную петлю, содержит последовательность, выбранную из V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇ [SEQ ID NO:10; Aβ(24-27)] и D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ [SEQ ID NO:11; Aβ(23-28)].

В частности, аминокислотная последовательность описанного здесь иммуногенного продукта образует внутримолекулярную антипараллельную β-складку. Используемый здесь термин «антипараллельная β-складка» означает набор по меньшей мере двух β-цепей, латерально соединенных тремя или более водородными связями, с образованием, по существу, закрученной β-складчатой структуры. β-цепь представляет собой аминокислотные фрагменты, содержащие обычно 3-10 аминокислот, пептидный остов которых является почти целиком выступающим.

В родственном аспекте настоящего изобретения, описанный здесь иммуногенный продукт содержит аминокислотную последовательность, в которой β-цепи, образующие антипараллельную β-складку, соединены друг с другом посредством петли, а предпочтительно, посредством β-шпилечной петли, определенной в настоящем описании.

В соответствии с конкретным вариантом указанного аспекта изобретения, части аминокислотной последовательности продукта, соответствующего F₁₉F₂₀A₂₁ [SEQ ID NO:8; Aβ(19-21)] и A₃₀I₃₁I₃₂ [SEQ ID NO:9; Aβ(30-32)], имеют антипараллельную ориентацию.

Олигомеры пептидов мутеина Aβ могут также характеризоваться конкретными взаимодействиями между двумя или более пептидами мутеина Aβ.

В одном из аспектов настоящего изобретения, описанный здесь иммуногенный продукт содержит аминокислотную последовательность Aβ, которая на 72% или более, 77% или более, 81% или более, 86% или более, 90% или более, или 95% или более идентична аминокислотной последовательности V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉ [SEQ ID NO:3; Aβ(18-39)].

В родственном аспекте изобретения, указанный иммуногенный продукт содержит первую аминокислотную последовательность L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈ [SEQ ID NO:5; Aβ(34-38)], которая находится в параллельной ориентации по отношению ко второй аминокислотной последовательности L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈ (SEQ ID NО:5). В этом случае, межпротонное расстояние по меньшей мере для одной пары атомов, выбранных из группы, состоящей из M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(NH), G^A₃₇(NH)-G^B₃₈(NH), L^A₃₄(NH)-L^B₃₄(C_δH₃)_, M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(CγH₃), может составлять от 1,8 до 6,5 Ангстрем.

В другом родственном аспекте изобретения, указанный иммуногенный продукт содержит первую аминокислотную последовательность G^A₃₃L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈V^A₃₉ [SEQ ID NO:6; Aβ(33-38)], которая находится в параллельной ориентации по отношению ко второй аминокислотной последовательности G^B₃₃L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈V^B₃₉ (SEQ ID NО:6). В этом случае, межпротонное расстояние по меньшей мере для одной пары атомов, выбранных из группы, состоящей из G^A₃₃(NH)-G^B₃₄(NH), M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(NH), G^A₃₇(NH)-G^B₃₈(NH), L^A₃₄(NH)-L^B₃₄(C_δH₃)_, M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(CγH₃), G^A₃₈(NH)-V^B₃₉(CγH₃) и V^A₃₉(NH)-V^B₃₉(CγH₃), может составлять от 1,8 до 6,5 Ангстрем.

В другом родственном аспекте изобретения, указанный иммуногенный продукт содержит межмолекулярную параллельную β-складку, расположенную между двумя аминокислотными последовательностями Aβ. В конкретном аспекте изобретения, указанная межмолекулярная параллельная β-складка содержит первую аминокислотную последовательность G^A₃₃L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈V^A₃₉ [SEQ ID NO:7; Aβ(33-39)] и вторую аминокислотную последовательность G^B₃₃L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈V^B₃₉ (SEQ ID NО:7). В этом случае, пары атомов G^A₃₃(CO)-L^B₃₄(N), L^B₃₄(CO)-M^A₃₅(N), M^A₃₅(CO)-V^B₃₆(N), V^B₃₆(CO)-G^A₃₇(N), и G^B₃₇(CO)-G^A₃₈(N) могут быть расположены на расстоянии 3,3 ± 0,5 Å, где CO означает атом кислорода остова, где углы фи (ϕ) остатков составляет от -180 до -30, а углы пси (φ) остатков составляют приблизительно от 60 до 180 или приблизительно от -180 до -150.

Межпротонные расстояния, определяющие структуру антипараллельной β-складки, могут быть определены путем оценки внутримолекулярных ядерных эффектов Оверхаузера (NOE) между амидами остова и между амидами и боковыми цепями остова.

Межпротонные расстояния, определяющие структуру параллельной β-складки, могут быть определены путем оценки внутримолекулярных NOE между NH-NH остова и между NH остова и метильными группами боковых цепей.

Внутримолекулярных и межмолекулярные NOE могут быть идентифицированы с использованием различных меченных изотопом образцов, как описано, например, в заявке WO2007/064917, а в частности, в Примере V, части G, в описании ЯМР, где указанная заявка вводится в настоящее описание посредством ссылки.

С использованием пределов расстояний по оценке эффектов NOE, определенных с помощью анализа данных ЯМР, могут быть вычислены структуры, например, с помощью программы CNX [A.T. Brunger, et al., Acta Crystallogr. D54 (Pt 5), 905-21, (1998)] в соответствии с моделированным протоколом отжига [M. Nilges, et al., FEBS Lett. 229, 317-324, (1988)], в результате чего может быть получена дополнительная информация о внутримолекулярных и/или межмолекулярных расстояниях между двумя атомами.

В одном из аспектов изобретения, описанный здесь иммуногенный продукт содержит аминокислотную последовательность Aβ, которая на 62,5% или более, 64% или более, 67% или более, 71% или более, 75% или более, 78% или более, 82% или более, 85% или более, 89% или более, 92% или более, или 96% или более идентична части (X-Y) аминокислотной последовательности V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉ [SEQ ID NO:4; Aβ(12-39)],

где X выбран из группы, состоящей из чисел 12.. 18, а Y выбран из группы, состоящей из чисел 33.. 39.

В родственном аспекте изобретения, по меньшей мере 2 несмежных остатка указанной аминокислотной последовательности ковалентно связаны друг с другом, например, посредством прямой ковалентной связи или посредством линкера. В частности, по меньшей мере один из аминокислотных остатков, соответствующих V₁₂, H₁₃, H₁₄, Q₁₅, K₁₆, L₁₇, V₁₈, F₁₉, F₂₀, A₂₁ E₂₂ или D₂₃ [остаткам 2-12 SEQ ID NO:4; Aβ(12-39)] и по меньшей мере один из аминокислотных остатков, соответствующих K₂₈, G₂₉, A₃₀, I₃₁, I₃₂, G₃₃, L₃₄, M₃₅, V₃₆, G₃₇, G₃₈, V₃₉ [остаткам 17-28 SEQ ID NO:4; Aβ(12-39)], ковалентно связаны друг с другом.

Ковалентная связь между двумя аминокислотными остатками может быть введена различными хорошо известными способами, например, посредством образования дисульфидных мостиков или поперечных связей. В частности, боковые цепи аминокислотных остатков могут быть связаны друг с другом. В частности, боковые цепи, имеющие функциональную группу, например, тиоловую группу, амногруппу, карбоксильную группу или гидроксильную группу, могут быть непосредственно связаны друг с другом, например, посредством двух цистеиновых остатков, образующих дисульфидный мостик, или посредством линкера. В соответствии с этим, аминокислотный остаток, ковалентно связанный с другими аминокислотными остатками, может, в частности, представлять собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из цистеина, лизина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

Перекрестное связывание белков уже давно известно специалистам, и его исчерпывающее описание можно найти во многих опубликованных изданиях. Для образования положение-специфических поперечных связей, описанных в настоящем изобретении, может быть применена любая известная методика, позволяющая вводить специфические ковалентные поперечные связи между природными или неприродными аминокислотными боковыми цепями. Некоторые примеры такой методики приводятся ниже.

Специалистам известно большое число химических перекрестносвязывающих агентов. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительными перекрестносвязывающими агентами являются гомобифункциональные и гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, причем, предпочтительными являются гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, что обусловлено их способностью к постадийному связыванию аминокислот.

Кроме того, гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры позволяют вводить связи по более специфичному механизму, что будет снижать вероятность нежелательных побочных реакций.

Специалистам известен широкий ряд гетеробифункциональных перекрестносвязывающих линкеров.

Такими линкерами являются гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, образующие связи между двумя аминогруппами (-NH₂), одной аминогруппой и одной тиоловой группой (или сульфгидрильной группой, то есть, -SH), или двумя тиоловыми группами.

Одной из реакционноспособных групп, используемых как часть гетеробифункционального перекрестносвязывающего линкера, является группа, реагирующая с амином. Стандартными группами, реагирующими с амином, являются N-гидроксисукцинимидоэфиры (NHS). NHS-эфиры специфически реагируют со свободными аминами (например, в лизиновых остатках) в течение нескольких минут в условиях от слабокислотных до нейтральных (pH 6,5-7,5).

Следует отметить, что перекрестносвязывающие агенты, имеющие N-гидроксисукцинимидные группы, могут быть также использованы в форме N-гидроксисукцинимидных аналогов, которые, по существу, имеют более высокую растворимость в воде.

Другой реакционноспособной группой, используемой как часть гетеробифункционального перекрестносвязывающего линкера, является группа, реагирующая с тиолом. Стандартными группами, реагирующими с тиолом, являются малеимиды, галогены и пиридилдисульфиды. Малеимиды специфически реагируют со свободными тиоловыми группами (например, в цистеиновых остатках) в течение нескольких минут в условиях от слабокислотных до нейтральных (pH 6,5-7,5). Галогены (имеющие иодацетильные функциональные группы) реагируют с группами -SH при физиологических рН. Обе эти реакционноспособные группы способствуют образованию стабильных тиоэфирных связей.

Так, например, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) или сульфо-SMCC могут быть использованы для введения поперечных связей между амином, например, боковой цепи Lys и свободной группой -SH, например, боковой цепи Cys. Реагирующий с амином N-гидроксисукцинимидоэфир (NHS) будет реагировать с аминогруппой (например, с группой остатка Lys) с образованием стабильной амидной связи. Полученный пептид, активированный малеимидом, будет реагировать с сульфгидрильной группой того же самого пептида (например, с группой остатка Cys) с образованием дисульфидной связи, и тем самым ковалентной связи. Этот химический метод хорошо описан в литературе, см., например: Uto, I., et al. (1991). J. Immunol. Methods 138, 87-94; Bieniarz, C., et al. (1996). Extended Length Heterobifunctional Coupling Agents for Protein Conjugations. Bioconjug. Chem. 7, 88-95; Chrisey, L.A., et al. (1996). Nucleic Acids Res. 24(15), 3031-3039; Kuijpers, W.H., et al. (1993). Bioconjug. Chem. 4(1), 94-102; Brinkley, M.A. (1992). A survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens and crosslinking reagents. Bioconjugate Chem. 3, 2-13; Hashida, S., et al. (1984). More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab to horseradish peroxidase through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6, 56-63; Mattson, G., et al. (1993). A practical approach to crosslinking. Molecular Biology Reports 17, 167-183; Partis, M.D., et al. (1983). Crosslinking of proteins by omega-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimide esters. J. Protein. Chem. 2, 263-277; Samoszuk, M.K., et al. (1989). A peroxide-generating immunoconjugate directed to eosinophil peroxidase is cytotoxic to Hodgkin's disease cells in vitro. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 2, 37-45; Yoshitake, S., et al. (1982). Mild and efficient conjugation of rabbit Fab and horseradish peroxidase using a maleimide compound and its use for enzyme immunoassay. J. Biochem. 92, 1413-1424.

Аналогичнным образом, могут быть использованы и другие гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, например, ([N-ε-малеимидокапроилокси]сукцинимидоэфир, N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимидоэфир, N-[κ-малеимидоундеканоилокси]сульфосукцинимидоэфир, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидоэфир (MBS), или их сульфосукцинимидные аналоги (например, сульфо-MBS).

Другим примером гетеробифункционального перекрестносвязывающего линкера, который может быть использован для введения поперечных связей между амином, например, боковой цепи Lys и свободной группой -SH, например, боковой цепи Cys, является сукцинимидил-6-[(3-(2-пиридилдитио)пропионат]гексаноат (LC-SPDP) или сульфо-LC-SPDP. Реагирующий с амином N- гидроксисукцинимидоэфир (NHS) будет реагировать с аминогруппой (например, с группой остатка Lys) с образованием стабильной амидной связи. Полученный пептид, имеющий пиридилдисульфидную группу, будет реагировать с сульфгидрильной группой того же самого пептида (например, с группой остатка Cys) с образованием дисульфидной связи, и тем самым ковалентной связи. Этот химический метод хорошо описан в литературе, см., например: Carlsson, J., et al. (1978) Biochem. J. 173, 723-737; Stan, R.V. (2004) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H1347-H1353; Mader, C., et al. (2004) J. Bacteriol. 186, 1758-1768.

Аналогичнным образом, могут быть использованы и другие гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, например, 4-сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT) или сульфо-SMPT, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) или сульфо-SPDP.

Другим примером гетеробифункционального перекрестносвязывающего линкера, который может быть использован для образования поперечной связи между амином, например, боковой цепи Lys и свободной группой -SH, например, боковой цепи Cys, является N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA) или сульфо-SATA. Реагирующий с амином N-гидроксисукцинимидоэфир (NHS) будет реагировать с аминогруппой (например, с группой остатка Lys) с образованием стабильной амидной связи. Защищенная группа -SH полученного пептида может быть впоследствии удалена путем обработки гидроксиламином с образованием свободной группы -SH, которая будет реагировать с сульфгидрильной группой того же самого пептида (например, с группой остатка Cys) с образованием дисульфидной связи, и тем самым ковалентной связи.

Аналогичнным образом, могут быть использованы и другие гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры, например, N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или его сульфосукцинимидный аналог.

Другими подходящими гетеробифункциональными перекрестносвязывающими линкерами являются N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат (SIAB) или сульфо-SIAB.

Специфические постадийные поперечные связи могут быть также образовываны между аминогруппой (-NH₂) и карбоксигруппой (-COOH).

Так, например, для образования поперечной связи между амином, например, боковой цепи Lys и свободной COOH кислотной боковой цепи может быть использован гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). Карбодиимид, реагирующий с карбоксигруппой, будет реагировать с карбоксигруппой (например, с карбоксигруппой Asp, Glu, Dab (2,4-диаминомасляной кислоты), Dap (2,4-диаминопропионовой кислоты) или орнитинового остатка) с образованием нестабильного сложного эфира o-ацилизомочевины. Реакционноспособный сложный эфир o-ацилизомочевины будет затем реагировать с аминогруппой того же самого пептида (например, остатка Lys) с образованием амидной связи, и тем самым ковалентной связи. Альтернативно, реакционноспособный сложный эфир o-ацилизомочевины может реагировать с N-гидроксисукцинимидом, N-гидроксисульфосукцинимидом или сульфо-N- гидроксисульфосукцинимидом с образованием полустабильного реагирующего с амином NHS-эфира, который будет затем реагировать с аминогруппой того же самого пептида (например, остатка Lys) с образованием амидной связи, и тем самым ковалентной связи. Этот химический метод хорошо описан в литературе, см., например, DeSilva, N.S. (2003) Interactions of Surfactant Protein D with Fatty Acids. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29, 757-770; Grabarek, Z. and Gergely, J. (1990) Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135; Sinz, A. (2003). J. Mass Spectrom. 38, 1225-1237. Staros, J.V., Wright, R.W. and Swingle, D.M. (1986) Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal. Biochem. 156, 220-222; Taniuchi, M., et al. (1986). Induction of nerve growth factor receptor in Schwann cells after axotomy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA83, 4094-4098.

Гетеробифункциональные перекрестносвязывающие линкеры также участвуют в реакции взаимодействия Lys(N3) и аминокислот, таких как пропаргилглицин. Эта реакция взаимодействия может быть осуществлена в растворе или на смоле (как описано, например, в публикации Jiang, S., (2008) Curr. Org. Chem. 12, 1502-1542 и в цитируемых там работах).

В конкретный класс перекрестносвязывающих линкеров, а в частности, гетеробифункциональных перекрестносвязывающих линкеров входят фотореактивные перекрестносвязывающие линкеры.

Так, например, для образования поперечной связи между амином, например, боковой цепи Lys и амином другой боковой цепи Lys может быть использован SDA. Реагирующий с амином N-гидроксисукцинимидоэфир (NHS) будет реагировать с аминогруппой (например, с группой остатка Lys) с образованием стабильной амидной связи. Полученный пептид имеет фотолабильную диазириновую группу, которая, после УФ-облучения, будет реагировать с аминогруппой того же самого пептида (например, остатка Lys) с образованием стабильной связи, и тем самым ковалентной связи.

Другими подходящими фотореактивными перекрестносвязывающими линкерами являются бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED) и N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (SANPAH).

Помимо гетеробифункциональных перекрестносвязывающих линкеров могут быть использованы различные другие перекрестносвязывающие линкеры, включая гомобифункциональные перекрестносвязывающие линкеры.

Эти гомобифункциональные перекрестносвязывающие линкеры служат для образования связей между двумя аминогруппами (-NH₂).

Так, например, для образования поперечной связи между амином, например, боковой цепи Lys и амином, например, другой боковой цепи Lys может быть использован дисукцинимидилсуберат (DSS). Реагирующий с амином N-гидроксисукцинимидоэфир (NHS) будет реагировать с аминогруппой (например, с группой остатка Lys) с образованием стабильной амидной связи. Полученный пептид будет затем реагировать с аминогруппой того же самого пептида (например, остатка Lys) с образованием дополнительной стабильной амидной связи, и тем самым ковалентной связи.

Другими подходящими гомобифункциональными перекрестносвязывающими линкерами являются бисмалеимидогексан (BMH) и диметилпимелимидат (DMP).

Другими подходящими гомобифункциональными перекрестносвязывающими линкерами являются метилендитиоэфирная связь между двумя цистеинами. Реакция взаимодействия пептида с TBAF (фторидом тетрабутиламмония) может быть осуществлена на смоле, содержащей частично деблокированный пептид, с последующими его отщеплением (см., например, Ueki et al., (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett., 9, 1767-1772, и Ueki et al. in Peptide Science, 1999, 539-541).

Другими подходящими системами образования гомобифункциональных перекрестных связей являются реакции метатезиса с замыканием кольца между аллиглицинами (см., например, Wels, B. et al., (2005) Bioorg. Med. Chem. 13, 4221-4227) или модифицированными аминокислотами, например, (S)-Fmoc-α(2'-пентенил)аланином (см., например, Walensky, L.D., et al., (2004) Science 305, 1466-1470; Schafmeister, C.E., et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892; Qiu, W., et al., (2000) Tetrahedron 56, 2577-2582; Belokon, Y.N., et al., (1998) Tetrahedron: Asymmetry, 9, 4249-4252); Qiu W., (2008) Anaspec poster at 20th American Peptide Society Annual Meeting). Эти реакции могут быть осуществлены в растворе на защищенном пептидном фрагменте или на смоле, соответственно.

Гомо- и гетеробифункциональный перекрестносвязывающий линкер может содержать спейсерную группу или мостик. Мостиком является структура, соединяющая два реакционноспособных конца. Наиболее характерным признаком мостика является его влияние на стерическое затруднение. В некоторых случаях, более длинный мостик может легче охватывать расстояние, необходимое для связывания двух аминокислотных остатков.

Хотя одна ковалентная связь между 2 несмежными аминокислотными остатками может обеспечивать достаточный уровень стабилизации, однако, иммуногенные продукты согласно изобретению могут содержать более, чем одну ковалентную связь.

Очевидно, что условия образования связи зависят от типа этой связи и могут быть легко определены специалистом. Описание связей и химических методов их образования можно найти в литературе.

Образование олигомера и образование связей могут быть независимо осуществлены для гарантии того, что иммуногенные продукты согласно изобретению будут иметь нужную вторичную структуру. Таким образом, настоящее изобретение относится к олигомерам мутеина Aβ, имеющим такие связи, и к мономерным пептидам мутеина Aβ, имеющим такие связи.

Кроме того, образование олигомера и образование связей могут быть осуществлены для гарантии того, что иммуногенный продукт согласно изобретению будет иметь нужную вторичную структуру. Так, например, образование связей может стимулировать «правильное» образованием олигомера и наоборот.

В принципе, образование олигомера может наблюдаться до образования связи. Это может оказаться предпочтительным, если предварительно образованный олигомер регулирует или стимулирует образование связей. Альтернативно, образование связи может наблюдаться до образования олигомера. Это может оказаться предпочтительным, если предварительно образованные связи регулируют или стимулируют образование олигомера. Образование олигомера и связей могут также происходить одновременно.

Пептид мутеина Aβ и олигомер могут быть получены с использованием пептида, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотной последовательности иммуногенного продукта. Так, например, исходный пептид может содержать дополнительные аминокислоты у С- и/или N-конца, и такие аминокислоты могут быть затем удалены в процессе синтеза, например, посредством протеолитического расщепления.

В одном из вариантов осуществления изобретения, олигомеры получают с использованием пептида, а затем стабилизируют посредством образования одной или более внутрипептидных ковалентных связей.

В другом варианте осуществления изобретения, олигомеры получают с использованием пептида, а затем стабилизируют посредством образования одной или более внутрипептидных ковалентных связей, после чего их подвергают процессингу химическими или ферментативными способами с получением усеченной формы, которая лучше представляет релевантные структурные элементы. Альтернативно, олигомеры получают с использованием пептида, а затем подвергают процессингу химическими или ферментативными способами с получением усеченной формы, которая лучше представляет релевантные структурные элементы, после чего эти олигомеры стабилизируют посредством образования одной или более внутрипептидных ковалентных связей.

В еще одном варианте осуществления изобретения, пептид используют для образования релевантных структурных элементов, где указанный пептид поддерживают в «правильной» конформации посредством одной или более внутрипептидных ковалентных связей, но не посредством взаимодействия со смежными пептидами в олигомере. Было обнаружено, что эти иммуногенные продукты, стабилизированные соответствующими внутрипептидными ковалентными связями, будут представлять релевантные структурные элементы в виде мономера.

Используемый здесь термин «мутеин Aβ» означает вариант полипептида Aβ, который отличается от человеческого амилоидного белка бета (Aβ) присутствием одной или более аминокислотных замен. В частности, мутеин Aβ представляет собой Aβ, отличающийся от указанного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, наличием одной, двух, трех, четырех, пяти, шести или более точковых мутаций. Указанные точковые мутации, предпочтительно, локализуются в «горячих» точках в Aβ(18-33), Aβ(18-25), Aβ(19-24), а наиболее предпочтительно, в Aβ(20-22).

Репрезентативные аминокислотные замены, которые могут присутствовать в аминокислотных последовательностях Aβ, содержащихся в описанных здесь иммуногенных продуктах, систематизированы в таблице 1.

Таблица 1: Репрезентативные аминокислотные замены, присутствующие в аминокислотных последовательностях Aβ согласно изобретению. Аминокислотные замены, которые являются предпочтительными в соответствующей «горячей» точке, показаны жирным шрифтом.

Аминокислотная замена в «горячей» точке (указана как соответствующая аминокислота SEQ ID NO:1)	Заменена аминокислотами
V18	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, P, F, Y, W
F19	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, A, G, P, V, L, M, I
F20	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, P, A, G, V, L, M, I
A21	H, R, K, G, P, D, E, F, Y, W
E22	V, L, M, I, F, Y, W, A, C, N, S, T, P, Q
D23	H, R, K, V, L, M, I, F, Y, W, P, C, N, S, T, Q
V24	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, P, F, Y, W
G25	H, R, K, V, L, M, I, F, Y, W, P, D, E
S26	H, R, K, P, D, E, F, Y, W
N27	H, R, K, V, L, M, I, F, Y, W, P, D, E
K28	D, E, A, G, V, L, M, I, F, Y, W, P, C, N, S, T, Q
G29	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, V, L, M, I, F, Y, W, P
A30	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, G, V, L, M, I, F, Y, W, P
I31	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, P, F, Y, W
I32	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, P, F, Y, W
G33	H, R, K, D, E, C, N, S, T, Q, V, L, M, I, F, Y, W, P

В одном из аспектов изобретения, аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, представляет собой вариант Aβ(18-33), аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью аминокислотными заменами. Указанные аминокислотные замены могут быть выбраны из точковых мутаций, представленных в таблице 1. Так, например, если аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 двумя аминокислотными заменами, то одна или обе этих аминокислотных замены могут быть выбраны из точковых мутаций, представленных в таблице 1. Указанные аминокислотные замены, предпочтительно, присутствуют в «горячих» точках, соответствующих положениям аминокислот E22/G25, F20/E22, F20/I31, A21/E22, A21/D23 и E22/S26 SEQ ID NO:2, а в частности, в «горячих» точках, соответствующих положениям аминокислот E22/G25 и F20/E22. Если аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, тремя, четырьмя, пятью или шестью аминокислотными заменами, то одна или более аминокислотных замен или все эти аминокислотные замены могут быть выбраны из точковых мутаций, представленных в таблице 1.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 одной аминокислотной заменой, выбранной из E22A и E22V.

В других вариантах осуществления изобретения, аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 двумя аминокислотными заменами, выбранными из двойных мутаций F20G/E22A и E22A/G25A.

В родственном аспекте изобретения, аминокислотная последовательность Aβ, содержащаяся в описанном здесь иммуногенном продукте, отличается от аминокислотной последовательности V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃ (SEQ ID NO:2; Aβ(18-33)]) одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью аминокислотными заменами. Примерами указанных аминокислотных последовательностей являются аминокислотные последовательности, где:

аминокислота, соответствующая V₁₈, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая F₁₉, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, аланина, глицина, пролина, валина, лейцина, метионина и изолейцина;

аминокислота, соответствующая F₂₀, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, аланина, глицина, валина, лейцина, метионина и изолейцина;

аминокислота, соответствующая A₂₁, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, глицина, пролина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая E₂₂, выбрана из группы, состоящей из валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аланина, цистеина, аспарагина, серина, треонина, пролина и глутамина;

аминокислота, соответствующая D₂₃, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, цистеина, аспарагина, серина, треонина и глутамина;

аминокислота, соответствующая V₂₄, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая G₂₅, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

аминокислота, соответствующая S₂₆, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, пролина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая N₂₇, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

аминокислота, соответствующая K₂₈, выбрана из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аланина, глицина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, цистеина, аспарагина, серина, треонина и глутамина;

аминокислота, соответствующая G₂₉, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана и пролина;

аминокислота, соответствующая А₃₀, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, глициан, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана и пролина;

аминокислота, соответствующая I₃₁, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая I₃₂, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагин, серина, треонина, глутамина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая G₃₃, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана и пролина;

аминокислота, соответствующая F₂₀, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, аланиан, глицина, валина, лейцина, метионина и изолейцина; а аминокислота, соответствующая E₂₂, выбрана из группы, состоящей из аланина, валина, пролина, фенилаланина, метионина, изолейцина, триптофана, цистеина, аспарагина, серина, треонина, тирозина и лейцина;

аминокислота, соответствующая F₂₀, представляет собой глицин, а аминокислота, соответствующая E₂₂, представляет собой аланин;

аминокислота, соответствующая F₂₀, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, аланина, глицина, валина, лейцина, метионин и изолейцина; а аминокислота, соответствующая I₃₁, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, пролина, фенилаланина, тирозина и триптофана;

аминокислота, соответствующая А₂₁, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, глицина, пролина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, тирозина и триптофана; а аминокислота, соответствующая E₂₂, выбрана из группы, состоящей из аланина, валина, пролина, фенилаланина, метионина, изолейцина, триптофана, цистеина, аспарагина, серина, треонина, тирозина и лейцина;

аминокислота, соответствующая А₂₁, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, глицина, пролина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, тирозина и триптофана; а аминокислота, соответствующая D₂₃, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, цистеина, аспарагина, серина, треонина и глутамина;

аминокислота, соответствующая E₂₂, выбрана из группы, состоящей из валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аланина, цистеина, аспарагина, серина, треонина, пролина и глутамина; а аминокислота, соответствующая G₂₅, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; или

аминокислота, соответствующая E₂₂, выбрана из группы, состоящей из валина, лейцина, метионина, изолейцина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аланина, цистеина, аспарагина, серина, треонина, пролина и глутамина; а аминокислота, соответствующая S₂₆, выбрана из группы, состоящей из гистидина, аргинина, лизина, пролина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, тирозина и триптофана.

Более конкретно, иммуногенные продукты согласно изобретению содержат аминокислотную последовательность амилоида β (Aβ), идентичную части (X-Y) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈A₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:13; Aβ(1-43)F19A]; ₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:14; Aβ(1-43)F20A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:15; Aβ(1-43)E22A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁F₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:16; Aβ(1-43)E22F]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁V₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:17; Aβ(1-43)E22V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:18; Aβ(1-43)E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂K₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:19; Aβ(1-43)D23K]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂L₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:20; Aβ(1-43)D23L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄V₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:21; Aβ(1-43)G25V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉G₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:22; Aβ(1-43)A30G]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉G₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:23; Aβ(1-43)F20G E22A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ A₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:24; Aβ(1-43)F20A I31A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉C₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ C₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:25; Aβ(1-43)F2°C I31C]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:26; Aβ(1-43)A21Q E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀L₂₁Q₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:27; Aβ(1-43)A21L E22Q]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁E₂₂N₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:28; Aβ(1-43)A21Q D23N]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄A₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:29; Aβ(1-43)E22A G25A]; и D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅A₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:30; Aβ(1-43)E22A S26A],

где X выбран из группы, состоящей из чисел 1.. 18, 4.. 18, 12.. 18, или равен 18, а Y выбран из группы, состоящей из чисел 33.. 43, 33.. 42, 33.. 41, или 33.. 40. В конкретном варианте осуществления изобретения, (X-Y) выбран из группы, состоящей из (1-42), (4-42), (12-42) или (18-42).

Иммуногенные продукты согласно изобретению, в частности, представляют собой олигомеры, содержащие множество аминокислотных последовательностей конкретного амилоида β (Aβ), определенных выше.

Настоящее изобретение также относится к очищенным иммуногенным продуктам согласно изобретению. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, очищенным иммуногенным продуктом является иммуногенный продукт, чистота которого составляет более, чем 80% по массе всего пептида Aβ, а предпочтительно, более, чем 90% по массе всего пептида Aβ, а более предпочтительно, более, чем 95% по массе всего пептида Aβ.

Может оказаться желательным, чтобы иммуногенные продукты согласно изобретению содержали, помимо аминокислотной последовательности амилоида β, одну или более других групп. Так, например, для диагностики, может потребоваться мечение иммуногенных продуктов. Кроме того, при активной иммунизации может оказаться предпочтительным присоединение групп, которые являются эффективными при их применении в целях активной иммунизации.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к определенным здесь иммуногенным продуктам, содержащим ковалентно связанную группу, облегяающую детектирование, а предпочтительно, флуорофор, например, флуоресцеин-изотиоцианат, фикоэритирин, Alexa-488, флуоресцентный белок Aequorea victoria, флуоресцентный белок Dictyosoma или любую комбинацию их флуоресцентно активных производных; хромофор; хемолюминофор, например, люциферазу, а предпочтительно, люциферазу Photinus pyralis, люциферазу Vibrio fischeri или любую комбинацию их хемилюминесцентно активных производных; ферментативно активную группу, например, пероксидазу, например, пероксидазу хрена, или любое их ферментативно активное производное; электронно-плотную группу, например, группу, содержащую тяжелый металл, например, группу, содержащую золото; гаптен, например, гаптен, происходящий от фенола; в высокой степени антигенную структуру, например, пептидную последовательность, которая была предсказана как антигенная в соответствии с алгоритмом Kolaskar и Tongaonkar; молекулу, стимулирующую вырабатывание иммунного ответа на иммуногенные продукты, например, сывороточный альбумин, овальбумин, гемоцианин лимфы улитки, тироглобулин, бактериальный токсоид, такой как столбнячный токсоид и дифтерийный токсоид; природный Т-клеточный эпитоп, природный эпитоп хелперных Т-клеток; искусственный Т-клеточный эпитоп, такой как эпитоп всех DR («PADRE»; WO 95/07707), или другой иммуностимулирующий агент, например, маннан, трипальмитоил-S-глицерин-цистеин и т.п.; аптамер для другой молекулы; хелатообразующую группу, например, гексагистидинил; природную белковую структуру или происходящую от нее белковую структуру, опосредующую другие специфические белок-белковые взаимодействия, например, член пары fos/jun; магнитную группу, например, ферромагнитную группу, или радиоактивную группу, например, группу, содержащую ¹H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I или любые их комбинации. Для предотвращения нежелательного провоспалительного иммунного ответа по Th1-пути, желательно получить иммуногенные продукты, содержащие молекулу, способную вырабатывать иммунный ответ на противовоспалительный путь (Th2-пути), например, молекулы, содержащие B-клеточный эпитоп, такой как PADRE, которые, как ожидается, будут особенно предпочтительными для активной иммунизации (см., также Petrushina I., et al., The Journal of Neuroscience 2007, 27(46): 12721-12731; Woodhouse A., et al., Drugs Aging 2007; 24(2): 107-119).

Такие группы и методы их присоединения к иммуногенным продуктам известны специалистам.

Иммуногенные продукты согласно изобретению могут быть применены во многих целях. Так, например, они могут быть применены: 1) для терапевтического вмешательства путем иммунизации (например, иммуногенные продукты могут быть применены в целях активной иммунизации для лечения или предупреждения амилоидоза); 2) для диагностических анализов (например, иммуногенные продукты могут быть использованы для диагностики амилоидоза); 3) для получения агентов, таких как антитела и аптамеры, которые связываются с иммуногенными продуктами; и 4) для кристаллографических или ренгеноструктурных ЯМР-анализов в целях получения агентов, таких как антитела и аптамеры, которые связываются с иммуногенными продуктами.

Было обнаружено, что глобуломер Aβ(20-42), используемый для активной иммунизации, является эффективным для устранения когнитивных дефектов у трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера. Иммуногенные продукты согласно изобретению обладают способностью вырабатывать иммунный ответ, профиль которого аналогичен профилю иммунного ответа, вырабатываемого глобуломером Aβ(20-42).

Таким образом, настоящее изобретение также относится к определенным здесь иммуногенным продуктам, применяемым в терапии.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанный здесь иммуногенный продукт, а в частности, к композиции, которая представляет собой вакцину, то есть, вакцину, которая может быть использована для активной иммунизации. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, указанными композициями являются фармацевтические композиции, которые также содержат фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда (CFA) или адъювант, содержащий соль алюминия.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предупреждения амилоидоза у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение эффективного количества описанного здесь иммуногенного продукта индивидууму. Предпочтительно, указанный продукт используют для активной иммунизации.

В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к описанному здесь иммуногенному продукту, используемомму для лечения или предупреждения амилоидоза, а в частности, для активной иммунизации.

Используемый здесь термин «амилидоз» означает ряд расстройств, характеризующихся аномальной укладкой, агглютинацией, агрегацией и/или аккумуляцией конкретных белков (амилоидов, фибриллярных белков и их предшественников) в различных тканях организма. При болезни Альцгеймера и при синдроме Дауна поражается нервная ткань, а при церебральной амилоидной ангиопатии (ЦАА) поражаются кровеносные сосуды. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, амилоидоз выбран из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (БА) и синдрома Дауна.

В случае активной иммунизации, особенно предпочтительно, чтобы иммуногенный продукт не попадал в ЦНС пациента в больших количествах.

Кроме того, это может оказаться особенно предпочтительным, если фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный продукт, будет индуцировать сильный иммунный ответ против олигомеров Aβ, а предпочтительно, сильный иммунный ответ только против олигомеров Aβ, а еще более предпочтительно, сильный не-воспалительный гуморальный иммунный ответ в виде вырабатывания антител только против олигомеров Aβ. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения, фармацевтическая композиция содержит иммунологический адъювант, а предпочтительно, адъювант и сигнал-передающую молекулу, например, цитокин, который регулирует не-воспалительный гуморальный иммунный ответ. Такие адъюванты и сигнал-передающие молекулы хорошо известны специалистам.

Это может оказаться особенно предпочтительным, если фармацевтическая композиция, используемая для активной иммунизации, будет введена способом, выбранным из группы, состоящей из внутривенного введения, внутримышечного введения, подкожного введения, интраназального введения и введения путем ингаляции. Это также может оказаться особенно предпочтительным, если такая композиция будет введена методом, выбранным из инъекции, вливания ударной дозы и непрерывного вливания, где каждый из этих методов может быть осуществлен один раз, повторно или периодически через определенные интервалы времени.

В конкретном варианте осуществления изобретения, длительное непрерывное вливание может быть достигнуто с помощью имплантированного устройства. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, указанную композицию вводят в виде имплантируемого депо-препарата для пролонгированного или регулируемого высвобождения. Подходящие препараты и устройства известны специалистам. Конкретный метод, применяемый для любого из таких введений, зависит от стадии и тяжести заболевания и от общих медицинских показаний для индивидуума, и предпочтительно, он может быть выбран индивидуально в соответствии с назначениями врача или ветеринара.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, фармацевтическая композиция для активной иммунизации содержит одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых консервантов, фармацевтически приемлемых красителей, фармацевтически приемлемых протективных коллоидов, фармацевтически приемлемых рН-регуляторов и фармацевтически приемлемых регулятров осмотического давления. Такие вещества описаны в литературе.

Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество терапевтического средства, достаточное для снижения или ослабления тяжести и/или течения расстройства или одного или более его симптомов, предупреждения прогрессирования расстройства, стимуляции ремиссии расстройства, предупреждения рецидива, развития, начала развития или прогрессирования одного одного или более симптомов, ассоциированных с этим расстройством; для диагностики расстройства или для усиления или повышения профилактического(их) или терапевтического(их) эффекта(ов) другой терапии (например, проводимой с использованием профилактического или терапевтического средства).

Согласно глобуломерной гипотезе, очевидно, что у индивидуумов, страдающих амилоидозом, вырабатывается иммунный ответ против эндогенных глобуломерных эпитопов. Поскольку иммуногенные продукты согласно изобретению реагируют с антителами, которые специфически связываются с указанными эпитопами, то очевидно, что олигомеры будут представлять тот же самый или почти аналогичный эпитоп.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к определенным здесь иммуногенным продуктам, используемым в диагностических целях.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способу диагностики амилоидоза, где указанный способ включает взятие образца у индивидуума с подозрением на амилоидоз, контактирование этого образца с описанным здесь иммуногенным продуктом в течение определенного периода времени и в условиях, подходящих для образования комплекса, содержащего продукт и антитело, где присутствие такого комплекса указывает на наличие у индивидуума амилоидоза. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одну стадию контактирования образца осуществляют ex vivo, а в частности, in vitro.

В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к описанному здесь иммуногенному продукту, используемому для диагностики амилоидоза.

Таким образом, иммуногенные продукты согласно изобретению могут быть использованы в различных диагностических методах и анализах.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, способ диагностики амилоидоза у пациента с подозрением на такое заболевание включает стадии: a) взятия биологического образца у пациента; b) контактирования этого биологического образца с иммуногенным продуктом согласно изобретению в течение определенного периода времени и в условиях, подходящих для образования комплексов «антитело/продукт»; c) добавления конъюгата к полученным комплексам «антитело/продукт» в течение определенного периода времени и в условиях, подходящих для связывания конъюгата со связанным антителом, где указанный конъюгат содержит антитело, присоединенное к сигнал-генерирующему соединению, способному передавать детектируемый сигнал; и d) детектирования присутствиея антител, которые могут находиться в биологическом образце, путем обнаружения сигнала, передаваемого сигнал-генерирующим соединением, где такой сигнал указывает на наличие амилоидоза у пациента. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одну из стадий b), c) и d) осуществляют ex vivo, а в частности, in vitro. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения, указанный способ не включает стадию а).

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, способ диагностики амилоидоза у пациента с подозрением на такое заболевание включает стадии: a) взятия биологического образца у пациента; b) контактирования этого биологического образца с антиидиотипическим антителом, специфичным к антителам, присутствующим в этом образце, в течение определенного периода времени и в условиях, подходящих для образования комплексов «антиидиотипическое антитело/антитело»; b) добавления конъюгата к полученным комплексам «антиидиотипическое антитело/антитело» в течение определенного периода времени и в условиях, подходящих для связывания конъюгата со связанным антителом, где указанный конъюгат содержит иммуногенный продукт согласно изобретению, присоединенный к сигнал-генерирующему соединению, способному передавать детектируемый сигнал; и с) детектирования присутствия сигнала, генерируемого сигнал-генерирующим соединением, где такой сигнал указывает на наличие амилоидоза у пациента. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одну из указанных стадий b) и c) осуществляют ex vivo, а в частности, in vitro. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения, указанный способ не включает стадию а).

Более конкретно, поскольку иммуногенные продукты согласно изобретению представляют глобуломерный эпитоп, который, очевидно, является эндогенным антигеном, вызывающим эндогенный иммунный ответ, то диагноз амилоидоза может быть установлен путем определения присутствия аутоантител, которые специфически связываются с иммуногенными продуктами согласно изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению определенных здесь иммуногенных продуктов в целях приготовления композиции для детектирования у индивидуума аутоантител, связывающихся с иммуногенным продуктом. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу детектирования аутоантител у индивидуума, где указанный способ включает введение указанному индивидууму определенного здесь иммуногенного продукта и детектирование комплекса, образованного антителом и иммуногенным продуктом, где присутствие этого комплекса указывает на присутствие аутоантител. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одну стадию контактирования образца осуществляют ex vivo, а в частности, in vitro. В конкретном варианте осуществления изобретения, указанным индивидуумом является индивидуум, страдающий любой формой амилоидоза, например, болезнью Альцгеймера, а детектирование аутоантител осуществляют для подтверждения присутствия или отсутствия у индивидуума любой формы амилоидоза, например, болезни Альцгеймера.

Используемый здесь термин «образец» употребляется в самом широком смысле. Используемый здесь термин «биологический образец» включает, но не ограничивается ими, любое количество вещества, взятого у живого или неживого организма. Такими живыми организмами являются, но не ограничиваются ими, человек, мыши, крысы, обезьяны, собаки, кролики и другие животные. Такими образцами являются, но не ограничиваются ими, кровь, сыворотка, моча, синовиальная жидкость, клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфоузлы и селезенка.

Подходящими образцами являются, в частности, биологические жидкости, которые могут быть проанализированы описанными здесь методами. Такими образцами являются плазма, цельная кровь, осушенная цельная кровь, сыворотка, цереброспинальная жидкость или водные или водно-органические экстракты тканей и клеток.

Взятие таких образцов является особенно предпочтительным в случае, если индивидуумом с подозрением на амилоидоз является индивидуум, страдающий амилоидозом, или индивидуум с повышенным риском развития амилоидоза.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, детектирование описанных здесь аутоантител также включает предварительную обработку препарата (образца), приводящую к диссоциации комплексов «аутоантитело/антиген». Следовательно, способ включающий такую предварительную обработку, может быть применен для определения общего количества аутоантител, присутствующих в препарате (в образце), а способ, не включающий указанную обработку, может быть применен для определения количества аутоантител, которые могут связываться с антигеном. Кроме того, оба этих способа позволяют опосредованно определить количество комплексов, содержащих аутоантитела.

Условия, подходящие для индуцирования диссоциации комплексов «аутоантитело/антиген», известны специалистам. Так, например, может оказаться предпочтительной обработка препарата (образца) кислотой, например, с использованием буфера для доведения рН полученного препарата (образца) до 1-5, предпочтительно, до 2-4, а в частности, до 2-3. Подходящими буферами являются соли в физиологической концентрации, например, NaCl и уксусная кислота. Метод разделения комплексов «антитело/антиген» описан в заявке WO2005/037209, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Вкратце, диссоциация антитела из антигена в комплексе «антитело/антиген» включает стадии: контактирования образца, содержащего комплекс «антитело/антиген», с буфером для диссоциации; инкубирования образца и, необязательно, концентрирования образца.

Буфером для диссоциации может быть буфер PBS, имеющий pH в указанных здесь пределах. Так, например, подходящим является буфер PBS, содержащий приблизительно 1,5% BSA и 0,2M ацетата глицина, pH 2,5, или 140 мМ NaCl и 0,58% уксусной кислоты.

Подходящее время инкубирования составляет несколько минут, например, от 10 до 30 минут, например, 20 минут при температуре 20-40°C.

Концентрирование может быть достигнуто известным per se способом, например, путем пропускания образца через концентратор Centriprep YM30 (Amincon Inc.).

В одном из вариантов осуществления изобретения, иммуногенные продукты согласно изобретению наносят на твердую фазу. Затем образец (например, цельную кровь, цереброспинальную жидкость, сыворотку и т.п.) подвергают контактированию с твердой фазой. Если антитела, например, аутоантитела, присутствуют в образце, то такие антитела подвергают связыванию с иммуногенным продуктом на твердой фазе, а затем детектируют прямым или непрямым методом. Прямой метод включает простое детектирование присутствия комплекса и тем самым, присутствия антител. В непрямом методе, к связанному антителу добавляют конъюгат. Конъюгат содержит «второе» антитело, которое связывается с «первыми» связанными антителами, присоединенными к сигнал-передающему соединению или метке. После связывания «второго» антитела со связанным «первым» антителом, сигнал-передающее соединение генерирует измеряемый сигнал. Затем по этому сигналу определяют присутствие «первых» антител в образце.

Примерами твердых фаз, используемых в диагностических иммуноанализах, являются пористые и непористые материалы, латексные частицы, магнитные частицы, микрочастицы (см., патент США No. 5705330), сферы, мембраны, лунки микротитрационных планшетов и пластиковые пробирки. Выбор твердофазного материала и метода мечения антигена или антител, присутствующих в конъюгате, если это необходимо, определяется исходя из рабочих характеристик нужного формата анализа.

Как упоминалось в настоящей заявке, конъюгат (или реагент-индикатор) содержит антитело (или, вероятно, антиидиотипические антитела, в зависимости от типа анализа), связанное с сигнал-передающим соединением или «меткой». Это сигнал-передающее соединение или метка сами по себе являются детектируемыми, либо они могут быть подвергнуты реакции взаимодействия с одним или более дополнительными соединениями с получением детектируемого продукта. Примеры сигнал-передающих соединений описаны в настоящей заявке, а в частности, такими соединениями являются хромофоры, радиоизотопы (например, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³H, ³⁵S и ¹⁴C), хемилюминесцентные соединения (например, акридиний), частицы (видимые или флуоресцентные), нуклеиновые кислоты, комплекс-образующие агенты или катализаторы, такие как ферменты (например, щелочная фосфатаза, кислая фосфатаза, пероксидаза хрена, бета-галактозидаза и рибонуклеаза). В случае использования ферментов (например, щелочной фосфатазы или пероксидазы хрена), добавление хромогенного, флуорогенного или люмогенного субстрата приводит к генерированию детектируемого сигнала. При этом, могут быть также применены и другие системы детектирования, такие как времяпролетная флуоресценция, флуоресценция внутренного отражения, амплификация (например, полимеразная цепная реакция) и Рамановская спектроскопия.

В объем настоящего изобретения также входят наборы. Более конкретно, настоящее изобретение включает наборы для определения присутствия антител, таких как аутоантитела у индивидуума. В частности, набор для определения присутствия указанных антител в образце включает a) определенный здесь иммуногенный продукт и, необязательно, b) конъюгат, содержащий антитело, присоединенное к сигнал-генерирующему соединению, способному передавать детектируемый сигнал. Набор может также содержать контроль или калибратор, включающий реагент, который связывается с антигеном.

Настоящее изобретение также включает набор другого типа для детектирования антител, таких как аутоантитела в образце. Этот набор может включать a) антиидиотипическое антитело, специфичное к представляющему интерес антителу и b) определенный здесь иммуногенный продукт. Может быть также включен контроль или калибратор, содержащий реагент, который связывается с иммуногенным продуктом. Более конкретно, набор может содержать a) антиидиотипическое антитело, специфичное к аутоантителу и b) конъюгат, содержащий иммуногенный продукт, где указанный конъюгат присоединен к сигнал-генерирующему соединению, способному передавать детектируемый сигнал. И в этом случае, набор может также содержать контроль или калибратор, включающий реагент, который связывается с антигеном.

Набор может также включать один контейнер, такой как сосуд, бутыль или индикаторную полоску, где каждый контейнер уже содержит твердую фазу, и другие контейнеры, содержащие соответствующие конъюгаты. Эти наборы могут также включать сосуды или контейнеры с другими реагентами, необходимыми для проведения анализа, такие как реагенты для промывки, реагенты для обработки и реагенты-индикаторы.

Иммуногенные продукты согласно изобретению могут быть также использованы для получения агентов, способных связываться с иммуногенными продуктами. Такими агентами являются, например, антитела (далее также называемыми антителом против продукта), не-антительные связывающиеся молекулы (такие как агенты, имитирующие аффинные антитела (реагенты Affibodies), молекулы аффилина, аднектины, антикалины, ДАРФины, доменные антитела, антитела против глиадина, кнотины, домены типа Кунитца, максиантитела, тетранектины, транс-антитела и V(NAR), описанные, например, в руководстве Handbook of Therapeutic Antibodies, ed. by Stefan Dübel, Volume II, Chapter 7, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007), аптамеры или низкомолекулярные соединения.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к применению иммуногенных продуктов для скрининга агентов, способных связываться с иммуногенными продуктами. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу идентификации агента, способного связываться с описанным здесь иммуногенным продуктом, где указанный способ включает: a) обработку одного или более представляющих интерес агентов продуктом в течение определенного периода времени и при определенных условиях, подходящих для связывания одного или более агентов с данным продуктом; и b) идентификацию агентов, которые связываются с данным продуктом.

Указанный агент может быть выбран из группы, состоящей из антитела; связывающейся молекулы, не являющейся антителом; аптамера; или низкомолекулярного соединения.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению иммуногенных продуктов для обогащения препарата, содержащего данный агент, агентом, способным связываться с иммуногенным продуктом. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу обогащения таким агентом препарата, содержащего указанный агент, где указанный способ включает стадии: a) обработки иммуногенным продуктом препарата, содержащего агент, способный связываться с иммуногенным продуктом, в течение определенного периода времени и при определенных условиях, подходящих для связывания агента с данным иммуногенным продуктом; и b) получения агента в обогащенной форме. Более конкретно, иммуногенный продукт может быть иммобилизован (например, на смоле) для захвата агента. Получение агента в обогащенной форме может включать десорбцию иммобилизованного агента, предпочтительно, так, чтобы десорбция иммобилизованного агента включала контактирование этого иммобилизованного агента с буфером, имеющим высокую концентрацию соли, или с кислотным раствором. Этот способ может быть, например, применен для обгащения описанных здесь аутоантител путем обработки коммерчески доступных препаратов иммуноглобулина типа IVIG или Octagam® (Octapharma Inc. Vienna, Austria) этим методом. Очевидно, что эти препараты иммуноглобулина содержат аутоантитела против Aβ, и введение индивидуумам этих препаратов будет способствовать увеличению уровней анти-Aβ антител в организме. Предполагается, что препарат, обогащенный указанными аутоантителами, будет более эффективным.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение также относится к применению иммуногенных продуктов для получения антител, которые связываются с иммуногенными продуктами. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к способу получения антитела, способного связываться с иммуногенным продуктом согласно изобретению, где указанный способ включает:

i) получение антигена, содержащего продукт;

ii) обработку антител соответствующего репертуара указанным антигеном; и

iii) отбор из антител соответствующего репертуара антитела, которое связывается с данным продуктом.

Следует отметить, что используемый здесь термин «антитело с предполагаемым репертуаром» означает любую библиотеку, набор, комплекс или ряд аминокислот и соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот или любой генератор такой библиотеки, набора, комплекса или ряда аминокислотных последовательностей, которые могут быть использованы для продуцирования антитела с определенным репертуаром in vivo или in vitro. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, таким генератором является адаптивная иммунная система животного, а в частности, антиген-продуцирующая часть иммунной системы млекопитающего, которая генерирует разнообразие антител посредством рекомбинантных механизмов, хорошо известных специалистам. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, таким генератором является система для получения множества рандомизированных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые могут быть затем использованы для продуцирования антител определенного репертуара in vitro путем встраивания этих последовательностей в подходящую каркасную область антитела.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело с определенным репертуаром или с предполагаеммы репертуаром обрабатывают антигеном in vivo путем иммунизации организма указанным антигеном. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело с предполагаеммы репертуаром представляет собой библиотеку подходящих нуклеиновых кислот, которые обрабатывают антителом посредством аффинного скрининга in vitro как описано в литературе, например, посредством фагового представления и системы пэннинга.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с определенными здесь иммуногенными продуктами.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело получают способом, включающим отбор антитела из антител с определенным или предполагаемым репертуаром, как описано в настоящей заявке.

В соответствии со своим особенно предпочтительным вариантом, настоящее изобретение относится к антителам, специфичным к иммуногенным продуктам. Такими антителами являются, в частности, антитела, обладающие сравнительно более низкой аффинностью по отношению к мономерным и фибрилломерным формам пептида Aβ, чем к иммуногенному продукту согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если оно, предпочтительно, распознает антиген-мишень в комплексной смеси белков и/или макромолекул.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аффинность связывания антитела с иммуногенным продуктом по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антитела с мономерным Aβ(1-42).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аффинность связывания антитела с иммуногенным продуктом по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антитела с мономерным Aβ(1-40).

При этом, предпочтительно, чтобы антитело согласно изобретению связывалось с одним или, более предпочтительно, с обоими мономерами с низкой аффинностью, а наиболее предпочтительно, с K_D 1×10^-8 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-8 M или с более низкой аффинностью, с K_D 1×10^-7 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-7 M или с более низкой аффинностью, с K_D 1×10^-6 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-5 M или с более низкой аффинностью или с K_D 1×10^-5 M или с более низкой аффинностью.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аффинность связывания антитела с иммуногенным продуктом по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антитела с фибрилломерным Aβ(1-42).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аффинность связывания антитела с иммуногенным продуктом по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз, или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антитела с фибрилломерным Aβ(1-40).

При этом, предпочтительно, чтобы антитело согласно изобретению связывалось с одним или, более предпочтительно, с обеими фибриллами с низкой аффинностью, а наиболее предпочтительно, с K_D 1×10^-8 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-8 M или с более низкой аффинностью, с K_D 1×10^-7 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-7 M или с более низкой аффинностью, с K_D 1×10^-6 M или с более низкой аффинностью, например, с K_D 3×10^-5 M или с более низкой аффинностью или с K_D 1×10^-5 M или с более низкой аффинностью.

Используемый здесь термин «антитело», в своем широком смысле», означает любую молекулу иммуноглобулина (Ig), состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей (Н) и двух легких цепей (L), или любые их функциональные фрагменты, мутанты, варианты или производные, сохраняющие основные эпитоп-связывающие свойства молекулы Ig. Такие функциональные фрагменты, мутанты, варианты или производные антител известны специалистам. Неограничивающие варианты таких антител обсуждаются ниже. Используемый здесь термин «полноразмерное антитело» означает молекулу Ig, содержащую четыре полипептидных цепи, то есть, две тяжелых цепи и две легких цепи. Эти цепи обычно связаны друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (также называемой здесь «вариабельной тяжелой цепью» или сокращенно HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CHl, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (также называемой здесь «вариабельной легкой цепью» или сокращенно LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть также подразделены на гипервариабельные области, называемые комплементарность-определяющими областями (CDR), которые чередуются с областями, являющимися более консервативными и называющимися каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в напревлении от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулами иммуноглобулина могут быть молекулы любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Используемый здесь термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») «антигенсвязывающая молекула антитела» (или просто «молекула антитела»), означает один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (то есть, с иммуногенным продуктом согласно изобретению), то есть, являются функциональными фрагментами антитела. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть реализована благодаря одному или более фрагментам полноразмерного антитела. Такие варианты антител могут быть также биспецифическими, иметь «двойную» специфичность или быть мультиспецифическими, то есть, специфически связываться с двумя или более различными антигенами. Примерами связывающихся фрагментов, входящих в объем термина «антигенсвязывающая часть» антитела, являются (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHl; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CHl; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одной ветви антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989, Winter et al., публикация заявки WO 90/05144Al, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), который содержит один вариабельный домен; и (vi) изолированная гипервариабельная область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, однако они могут быть присоединены друг к другу рекомбинантными методами посредством синтетического линкера, который позволяет создать одну белковую цепь, где области VL и VH спариваются, образуя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); см. например, Bird et al. Science 242:423-426, 1988; и Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883, 1988). Такие одноцепочечные антитела также входят в объем термина «антигенсвязывающая часть» антитела. В объем этого термина также входят и другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Диантитела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но соединены посредством линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи, а поэтому домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448, 1993; Poljak, RJ., et al. Structure 2:1121-1123, 1994). Такие антигенсвязывающие части антитела известны специалистам (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering Springer-Verlag. New York. 790 pp., 2001, ISBN 3-540-41354-5).

Используемый здесь термин «антитело» также включает конструкции антитела. Используемый здесь термин «конструкция антитела» означает полипептид, содержащий одну или более антигенсвязывающих частей согласно изобретению, связанных с линкерным полипептидом или с константным доменом иммуноглобулина. Линкерные полипептиды содержат два илди более аминокислотных остатков, связанных пептидными связями и используемых для связывания одной или более антигенсвязывающих частей. Такие линкерные полипептиды хорошо известны специалистам (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure 2: 1121-1123, 1994).

Термин «константный домен иммуноглобулина» означает константный домен тяжелой или легкой цепи. Аминокислотные последовательности константного домена тяжелой цепи и легкой цепи человеческого IgG известны специалистам.

Кроме того, связывающийся белок согласно изобретению (например, антитело) может представлять собой часть более крупной молекулы иммуноадгезина, образованной посредством ковалентной или нековалентной связи связывающегося белка согласно изобретению с одним или более другими белками или пептидами. Примерами таких молекул иммуноадгезина являются коровая область стрептавидина, используемая для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101, 1995), и цистеиновый остаток, маркерный пептид и C-концевая полигистидиновая метка, используемые для получения двухвалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31: 1047-1058, 1994). Части антитела, такие как Fab- и F(ab')₂-фрагменты, могут быть получены из целых антител стандартными методами, такими как гидролиз целых антител папаином или пепсином, соответственно. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезина могут быть получены стандартными методами рекомбинантных ДНК, описанными в настоящей заявке.

Используемый здесь термин «выделенное антитело» означает антитело, которое, по существу, не содержит других антител, обладающих различными антигенными свойствами. Однако, выделенное антитело, которое специфически связывается с иммуногенным продуктом согласно изобретению, может перекрестно реагировать с другими антигенами, такими как глобуломеры Aβ, например, глобуломер Aβ(20-42) или другие формы Aβ. Кроме того, выделенное антитело может, по существу, не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ и/или любых других нужных форм Aβ.

Используемый здесь термин «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не принадлежащие последовательностям иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (например, в них могут быть введены мутации посредством неспецифического или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, такие остатки могут присутствовать в СDR, а в частности, в CDR3. Однако, используемый здесь термин «человеческое антитело» не включает антитела, в которых последовательности СDR, происходящие от зародышевой линии млекопитающих других видов, таких как мышь, были присоединены к человеческим каркасным последовательностям.

Используемый здесь термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие антитела, которые были получены, экспрессированы, сконструированы или выделены рекомбинантными методами, например, антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфецированного в клетку-хозяина (как более подробно описано ниже в разделе В), антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител (Hoogenboom, TIB Tech. 15: 62-70, 1997; Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem. 35: 425-445, 2002; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), антитела, выделенные у животных (например, мышей), которые являются трансгенными по генам человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) или антитела, которые были получены, экспрессированы, сконструированы или выделены другими методами, включающими сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с образованием других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако, в некоторых вариантах изобретения, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используется животное, которое является трансгенным по отношению к последовательностя человеческого Ig, то его подвергают соматическому мутагенезу in vivo), и таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, если они происходят от последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и являются родственными этим последовательностям, обычно не входят в репертуар человеческих антител зародышевой линии in vivo.

Термин «химерное антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, происходящие от одного вида, и последовательности константной области, происходящие от других видов, такие как антитела, имеющие мышиные вариабельные области тяжелой и легкой цепи, присоединенные к человеческим константным областям.

Термин «CDR-привитое антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, которые происходят от одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких СDR-областей VH и/или VL заменены последовательностями СDR других видов, таких как антитела, имеющие мышиные CDR (например, CDR3), в которых одна или более вариабельных областей тяжелой и легкой цепи мышиного антитела были заменены человеческими последовательностями вариабельной области тяжелой и легкой цепи.

Используемые здесь термины «нумерация по Кэбату», «определение по Кэбату» и «мечение по Кэбату» являются синонимами. Эти термины, известные специалистам, означают систему нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (то есть, гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 и, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Для вариабельной области тяжелой цепи, гипервариабельная область простирается в пределах от аминокислотного положения 31 до аминокислотного положения 35 для CDRl, от аминокислотного положения 50 до аминокислотного положения 65 для CDR2, и от аминокислотного положения 95 до аминокислотного положения 102 для CDR3. Для вариабельной области легкой цепи, гипервариабельная область простирается в пределах от аминокислотного положения 24 до аминокислотного положения 34 для CDRl, от аминокислотного положения 50 до аминокислотного положения 56 для CDR2, и от аминокислотного положения 89 до аминокислотного положения 97 для CDR3.

Используемые в настоящем описании термины «акцептор» и «акцепторное антитело» относятся к последовательности антитела или нуклеиновой кислоты, имеющей или кодирующей по меньшей мере 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или более каркасных областей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, термин «акцептор» относится к аминокислотной последовательности антитела или к последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей или кодирующей константную(ые) область(и). В еще одном варианте осуществления изобретения, термин «акцептор» относится к к аминокислотной последовательности антитела или к последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей или кодирующей каркасные области и константную(ые) область(и). В конкретном варианте осуществления изобретения, термин «акцептор» относится к человеческой аминокислотной последовательности антитела или к последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей или кодирующей по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, или 100% аминокислотных последовательностей одной или более каркасных областей. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения, акцептор может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, которые не присутствуют в одном или более конкретных положениях человеческого антитела. Акцепторная каркасная область и/или акцепторная(ые) константная(ые) область(и) могут быть, например, продуцированы или получены из гена антитела зародышевой линии, гена зрелого антитела, функционального антитела (например, антитела, хорошо известного специалистам в данной области, антитела, находящегося в процессе разработки, или коммерчески доступных антител).

Используемый здесь термин «CDR» означает «гипервариабельную область» в вариабельных последовательностях антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи присутствуют три CDR, которые, для каждой вариабельной области, обозначаются «CDR1», «CDR2» и «CDR3». Используемый здесь термин «набор CDR» означает группу из трех CDR, которые присутствуют в одной вариабельной области, обладающей способностью связываться с антигеном. Точные границы этих CDR были определены различным образом в зависимости от различных систем. Система, описанная Кэбатом (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) имеет не только однозначную систему нумерации остатков, применяемую к любой вариабельной области антитела, но также и точные границы остатков, определяющие три СDR. Эти CDR могут называться «СDR по Кэбату». Чотия и сотрудники (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) и Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) обнаружили, что некоторые субположения в СDR по Кэбату приобретают почти идентичную конформацию пептидного остова, несмотря на то, что они имеют значительные различия на уровне аминокислотной последовательности. Такие подобласти были обозначены L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где «L» и «H» означают области легкой и тяжелой цепи, соответственно. Такие области, которые имеют границы, перекрывающиеся с СDR по Кэбату, могут называться «СDR по Чотия». Другие границы, определяющие перекрывание СDR с СDR по Кэбату, были описаны в публикации Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) и MacCallum (J. Mol. Biol. 262(5):732-45 (1996)). Другие определения границ CDR могут, но не строго, соответствовать одной из описанных здесь систем, но тем не менее, эти границы перекрываются с СDR по Кэбату, хотя эти области могут быть короче или длиннее, как это было предсказано или получено из экспериментальных данных, которые указывают на то, что конкретные остатки или группы остатков или даже полноразмерные СDR не оказывают значительного влияния на связывание с антигеном. В описанных здесь способах могут использоваться СDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, хотя в некоторых вариантах используются СDR, определенные по Кэбату или Чотия.

Используемый здесь термин «канонический» остаток означает остаток в CDR или в каркасной области, который определяет конкретную каноническую структуру CDR, как определено по Чотия и др. (см. публикации J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Как описано у Чотия и др., критические части CDR многих антител имеют почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большое разнообразие их аминокислотных последовательностей. Каждая каноническая структура определяется, главным образом, набором торсионных углов пептидного остова для смежного сегмента аминокислотных остатков, образующих петлю.

Используемые здесь термины «донор» и «донорное антитело» относятся к антителу, содержащему одну или более CDR. В одном из вариантов осуществления изобретения, донорное антитело представляет собой антитело вида, отличающегося от антитела, от которого были получены или происходят каркасные области. В случае гуманизованного антитела, термин «донорное антитело» означает не-человеческое антитело, имеющее одну или более CDR.

Используемые здесь термины «каркасная область» или «каркасная последовательность» могут означать остальные последовательности вариабельной области минус СDR. Поскольку точное определение последовательности СDR может быть дано исходя из других систем, то термин «каркасная последовательность» может иметь, соответственно, другую интерпретацию. Шесть CDR (CDR-L1, -L2 и -L3 легкой цепи и CDR-H1, -H2 и -H3 тяжелой цепи) также разделяют каркасные области в легкой цепи и в тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, где СDR1 расположена между FR1 и FR2; CDR2 расположена между FR2 и FR3; а CDR3 расположена между FR3 и FR4. Не претендуя на точное определение подобластей, таких как FRl, FR2, FR3 или FR4, авторы лишь отмечают, что каркасная область, как было определено в других источниках, представляет собой объединенные FR в вариабельной области в одной природной цепи иммуноглобулина. Используемый здесь термин «область FR» означает одну из четырех подобластей, а термин «области FR» означает две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.

Акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человеческого антитела известны специалистам.

Используемые здесь термины «ген антитела зародышевой линии» или «генный фрагмент» означают последовательность иммуноглобулина, кодируемую нелимфоидными клетками, которые не подвергались процессу созревания, приводящему к генетической реаранжировке и мутации, для экспрессии конкретного иммуноглобулина. (См., например, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30 (2001)). Одно из преимуществ различных вариантов настоящего изобретения заключается в том, что гены антитела зародышевой линии с большей вероятностью, чем гены зрелого антитела, будут сохранять основные структуры аминокислотной последовательности, характерные для индивидуумов данного вида, а следовательно, менее вероятно, что они будут распознаваться как последовательности, происходящие из чужеродного источника, при их терапевтическом применении в данных видах.

Используемый здесь термин «ключевые остатки» означает некоторые остатки в вариабельной области, которые оказывают более сильное воздействие на специфичность связывания и/или аффинность антитела, в частности, гуманизованного антитела. Ключевыми остатками являются, но не ограничиваются ими, один или более из нижеследующих остатков: остаток, который является смежным с CDR; потенциальный сайт гликозилирования (может представлять собой сайт N- или O-гликозилирования); редкий остаток; остаток способный взаимодействовать с антигеном; остаток, способный взаимодействовать с CDR; канонический остаток; контактный остаток, расположенный между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи; остаток в зоне Верньера; и остаток в области, которая перекрывается с CDR1 вариабельной области тяжелой цепи по Чотию, и с каркасной областью первой тяжелой цепи по Кэбату.

Используемый здесь термин «гуманизованное антитело» означает антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с представляющим интерес антигеном и содержат каркасную область (FR) имеющую, в основном, аминокислотную последовательность человеческого антитела и гипервариабельную область (СDR) имеющую, в основном, аминокислотную последовательность не-человеческого антитела. Используемый здесь термин «в основном», относящийся к CDR, означает, что CDR имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности СDR не-человеческого антитела. Гуманизованное антитело включает, в основном, все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена (Fab, Fab', F(ab')₂, FabC, Fv), в которых все или, в основном, все области CDR соответствуют не-человеческому иммуноглобулину (то есть, донорному антителу), и все или, в основном, все каркасные области представляют собой области, имеющие консенсусную последовательность человеческого иммуноглобулина. В соответствии с одним из аспектов изобретения, гуманизованное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), а обычно, человеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гуманизованное антитело содержит легкую цепь, а также по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Такое антитело также может включать область CH1, шарнирную область и области CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гуманизованное антитело содержит только гуманизованную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гуманизованное антитело содержит только гуманизованную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления изобретения, гуманизованное антитело содержит только гуманизованный вариабельный домен легкой цепи и/или тяжелой цепи.

Гуманизованное антитело может быть выбрано из иммуноглобулинов любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE и любого изотипа, включая, но не ограничиваясь ими, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизованное антитело может содержать последовательности, происходящие от антител более, чем одного класса или изотипа, а конкретные константные домены могут быть выбраны для оптимизации нужных эффекторных функций методами, хорошо известными специалистам.

Каркасные области и CDR гуманизованного антитела необязательно должны точно соответствовать родительским последовательностям; так, например, CDR донорного антитела или консенсусная каркасная область могут быть подвергнуты мутагенезу путем замены, инсерции и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка так, чтобы CDR или каркасный остаток в этом сайте не соответствовали остатку донорного антитела или консенсусной каркасной области. В одном из вариантов осуществления изобретения, такие мутации не должны быть избыточными. Обычно, остатки гуманизованного антитела по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% соответствуют остаткам последовательностей родительских FR и CDR. Используемый здесь термин «консенсусная каркасная область» означает каркасную область в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Используемый здесь термин «консенсусная последовательность иммуноглобулина» означает последовательность, происходящую от наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей иммуноглобулина (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). В семействе иммуноглобулинов, каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, наиболее часто встречающейся в этом положении указанного семейства. Если две аминокислоты встречаются с одинаковой частотой, то в консенсусной последовательности может присутствовать любая из этих аминокислот.

Используемый здесь термин «зона Верньера» относится к подгруппе каркасных остатков, которые могут осуществлять корректировку структуры CDR и тонкую настройку для адаптации этих остатков к данному антигену, как описано в публикации Foote и Winter (1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Остатки зоны Верньера образуют слой, лежащий в основе CDR, и могут влиять на структуру CDR и аффинность антитела.

Используемый здесь термин «антитело» также включает поливалентные связывающиеся белки. Используемый здесь термин «поливалентный связывающийся белок» означает связывающийся белок, содержащий два или более антигенсвязывающих сайтов. Поливалентный связывающийся белок конструируют так, чтобы он содержал три или более антигенсвязывающих сайтов и, по существу, не содержал природного антитела. Термин «мультиспецифический связывающийся белок» означает связывающийся белок, способный связываться с двумя или более родственными или неродственными мишенями. Используемый здесь термин «связывающиеся белки с двумя вариабельными доменами» (DVD) означает связывающиеся белки, содержащие два или более антигенсвязывающих сайтов и четырехвалентные или поливалентные связывающиеся белки. Такие DVD могут быть моноспецифическими, то есть, они могут связываться с одним антигеном, или мультиспецифическими, то есть, они могут связываться с двумя или более антигенами. Связывающиеся DVD-белки, содержащие два DVD-полипептида тяжелой цепи и два DVD-полипептида легкой цепи, обозначаются здесь как «DVD-Ig». Каждая половина DVD-Ig содержит DVD-полипептид тяжелой цепи и DVD-полипептид легкой цепи и два антигенсвязывающих сайта. Каждый связывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи вместе со всеми 6 CDR, участвующими в связывании с антигеном, на один антигенсвязывающий сайт. Связывающиеся DVD-белки и методы их получения описаны в заявке на патент США No. 11/507050, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Используемый здесь термин «меченный связывающийся белок» означает связывающийся белок, содержащий метку, включенную для идентификации связывающегося белка. Аналогичнным образом, используемый здесь термин «меченное антитело» означает антитело с меткой, включенной в него в целях идентификации указанного антитела. В одном из аспектов изобретения, меткой является детектируемый маркер, включенный, например, посредством введения радиоактивно меченной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильных групп, которые могут быть детектированы помеченным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или обладающим ферментативной активностью, которая может быть детекрирована оптическими или колориметрическими методами). Примерами меток для полипептидов являются, но не ограничиваются ими, радиоизтопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm); флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, флуоресцирующие вещества лантанидной группы), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, люцифераза, щелочная фосфатаза); хемилюминесцентные маркеры; биотинильные группы; предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательностями пары «лейциновая молния», сайтами связывания со «вторыми» антителами, металл-связывающими доменами, эпитопными метками); и магнитные агенты, такие как хелатные комплексы гадолиния.

Используемый здесь термин «антитело» также включает конъюгаты антител. Термин «конъюгаты антитела» означает связывающийся белок, такой как антитело, химически связанное со второй химической группой, такой как терапевтическое средство.

Антитела согласно изобретению могут быть получены любыми известными методами.

Моноклональные антитела могут быть получены с примененем методов широкого ряда, известных специалистам, включая применение гибридомных технологий, рекомбинантных методов и методов фагового представления или их комбинаций. Так, например, моноклональные антитела могут быть продуцированы гибридомными методами, включая методы, известные специалистам и описанные, например, в публикации Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(указанные публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Используемый здесь термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителами, продуцируемыми с примененим гибридомной технологии. Термин «моноклональное антитело» означает антитело, происходящее от одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, независимо от метода, которым оно было получено.

Методы продуцирования и скрининга специфических антител с применением гибридомных методов являются рутинными и хорошо известны специалистам. В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способам получения моноклональных антител, а также антител, полученных способом, включающим культивирование гибридомных клеток, секретирующих антитело согласно изобретению, где, например, гибридому получают путем слияния спленоцитов, выделенных у мышей, иммунизованных антигеном согласно изобретению, с миеломными клетками, а затем скрининг гибридом, полученных в результате такого слияния, на гибридомные клоны, секретирующие антитело, способное связываться с полипептидом согласно изобретению. Вкратце, мыши могут быть иммунизованы иммуногенным продуктом согласно изобретению. В конкретном варианте осуществления изобретения, антиген вводят вместе с адъювантом для стимуляции иммунного ответа. Такими адъювантами являются полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамил-дипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептиды от быстрого диспергирования посредством их секвестрации в определенном участке, либо они могут содержать вещества, стимулирующие у хозяина секрецию факторов, которые являются хемотаксическими по отношению к макрофагам и другим компонентам иммунной системы. При введении полипептида, предпочтительно, чтобы схема иммунизации включала два или более введений полипептида с интервалами в несколько недель.

После иммунизации животного иммуногенным продуктом согласно изобретению, у этого животного могут быть выделены антитела и/или антитело-продуцирующие клетки. Сыворотку, содержащую антитело против продукта, выделяют у животного путем забора крови или после его умерщвления. Эта сыворотка может быть использована в том виде, в котором она была взята у животного, а затем из этой сыворотки может быть выделена фракция иммуноглобулина, либо из этой сыворотки могут быть получены антитела против данного продукта путем очистки. Сыворотка или иммуноглобулины, полученные этим способом, являются поликлональными, а поэтому, они имеют гетерогенный ряд свойств.

После детектирования иммунного ответа, например, антитела, специфичные к иммуногенному продукту согласно изобретению, детектируют в мышиной сыворотке, а затем у мышей выделяют селезенку и спленоциты. После этого, спленоциты подвергают слиянию с любыми подходящими миеломными клетками, например, клетками, происходящими от клеточной линии SP20, имеющейся в ATCC, хорошо известными методами. Гибридомы отбирают и клонируют путем лимитирующего разведения. Затем гибридомнеы клоны анализируют известными методами на наличие клеток, секретирующих антитела, способные связываться с иммуногенным продуктом согласно изобретению. Асцитная жидкость, которая, в основном, содержит высокие уровни антител, может быть получена путем иммунизации мышей позитивными гибридомными клонами.

В другом варианте осуществления изобретения, антитело-продуцирующие иммортализованные гибридомы могут быть получены у иммунизованного животного. После иммунизации, животное умерщвляют, а затем В-клетки селезенки подвергают слиянию с иммортализованными миеломными клетками хорошо известным методом (см., например, Harlow and Lane, см. выше). В конкретном варианте осуществления изобретения, миеломные клетки не секретируют полипептиды иммуноглобулина (несекреторная клеточная линия). После слияния и отбора на антибиотики, гибридомы скринируют с использованием иммуногенного продукта согласно изобретению или его части, или с использованием клеток, экспрессирующих иммуногенный продукт согласно изобретению. В конкретном варианте осуществления изобретения, первичный скрининг осуществляют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммуноанализа (РИА). Пример ELISA-скрининга опсиан в заявке WO 00/37504, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Гибридомы, продуцирующие антитело против продукта, отбирают, клонируют, а затем скринируют на нужные свойства, включая устойчивый рост гибридомы, высокий уровень продуцирования антитела и желаемые свойства антитела, подробно обсуждаемые ниже. Гибридомы могут быть культивированы и размножены in vivo у сингенных животных, у животных с отсутствием иммунной системы, например, у «голых» мышей, или в клеточной культуре in vitro. Методы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны специалистам в данной области.

В конкретном варианте осуществления изобретения, гибридомами являются мышиные гибридомы, описанные выше. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, гибридомы получают у животных, не являющихся человеком и мышами, таких как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте осуществления изобретения, гибридомами являются человеческие гибридомы, а в частности, человеческие несекреторные миеломы, слитые с человеческими клетками, экспрессирующими антитело против продукта.

Фрагменты антитела, распознающие специфические эпитопы, могут быть получены известными методами. Так, например, Fab- и F(ab')₂-фрагменты согласно изобретению могут быть получены путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин (с образованием Fab-фрагментов) или пепсин (с образованием F(ab')₂-фрагментов). F(ab')₂-фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и CH1-домен тяжелой цепи.

В другом аспекте изобретения, рекомбинантные антитела получают из одиночных выделенных лимфоцитов в соответствии с процедурой, называемой специалистами методом отбора антитело-продуцирующих лимфоцитов (SLAM), описанным в патенте США No. 5627052, в публикации заявки PCT WO 92/02551 и в публикации Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. В этом методе идентифицируют одиночные клетки, секретирующие представляющие интерес антитела, например, лимфоциты, происходящие от любого одного из иммунизованных животных, как описано в разделе 1 с помощью анализа антиген-специфических гемолитических бляшек, где иммуногенный продукт согласно изобретению или его субъединицу подвергают связыванию с клеткми овечьих эритроцитов посредством линкера, такого как биотин, и используют для идентификации одиночных клеток, секретирующих антитела, специфичные к иммуногенному продукту согласно изобретению. После идентификации представляющих интерес антитело-специфических клеток, из этих клеток высвобождают кДНК вариабельной области тяжелой и легкой цепи с помощью ПЦР с обратной транскриптазой, после чего такие вариабельные области могут быть экспрессированы в окружении соответствующих константных областей иммуноглобулинов (например, человеческих константных областей) в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки COS или CHO. Эти клетки-хозяева, трансфецированные амплифицированными последовательностями иммуноглобулина, происходящими от in vivo отобранных лимфоцитов, могут быть подвергнуты дополнительному анализу и отбору in vitro, например, путем пэннинга трансфецированных клеток в целях выделения клеток, экспрессирующих антитела против глобуломера Aβ(20-42). Амплифицированные последовательности иммуноглобулина могут быть модифицированы in vitro, например, методами аффинного созревания in vitro, такими как методы, описанные в публикации заявки PCT WO 97/29131 и в публикации заявки PCT WO 00/56772.

В другом варианте осуществления изобретения, антитела получают путем иммунизации животного, не являющегося человеком и имеющего некоторые или все локусы человеческих иммуноглобулинов, иммуногенным продуктом, то есть, антигеном. В конкретном варианте осуществления изобретения, животным, не являющимся человеком, является трансгенная мышь XENOMOUSE, то есть, искусственно сконструированный штамм мыши, который содержит крупные фрагменты локусов человеческого иммуноглобулина и является дефицитным по продуцированию мышиного антитела. См., например, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) и патенты США №№ 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 и 6130364. См. также заявку WO 91/10741, опубликованную 25 июля 1991, заявку WO 94/02602, опубликованную 3 февраля, 1994, заявки WO 96/34096 и WO 96/33735, опубликованные 31 октября, 1996, заявку WO 98/16654, опубликованную 23 апреля 1998, заявку WO 98/24893, опубликованную 11 июня, 1998, заявку WO 98/50433, опубликованную 12 ноября 1998, заявку WO 99/45031, опубликованную 10 сентября 1999, заявку WO 99/53049, опубликованную 21 октября 1999, заявку WO 00/09560, опубликованную 24 февраля 2000 и заявку WO 00/037504, опубликованную 29 июня 2000. Трансгенная мышь XENOMOUSE продуцирует репертуар полностью человеческих антител, подобных антителам взрослого человека, и генерирует антигенспецифические человеческие моноклональные антитела. Трансгенная мышь XENOMOUSE содержит приблизительно 80% репертуара человеческих антител, что обусловлено введением фрагментов локусов человеческой тяжелой цепи и х локусов человеческой легкой цепи, имеющих размер мегаоснований и конфигурацию зародышевых линий YAC. См. публикацию Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green & Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), описание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Методы in vitro могут быть также применены для получения антител согласно изобретению, где указанную библиотеку антител скринируют для идентификации антитела, обладающего нужной специфичностью связывания. Методы такого скрининга библиотек рекомбинантных антител хорошо известны специалистам и включают методы, описанные, например, Ladner et al. в патенте США No. 5223409; Kang et al. в публикации заявки PCT WO 92/18619; Dower et al. в публикации заявки PCT No. WO 91/17271; Winter et al. в публикации заявки PCT No. WO 92/20791; Markland et al. в публикации заявки PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. в публикации заявки PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. в публикации заявки PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. в публикации заявки PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, в публикации заявки на патент США 20030186374, и в публикации заявки PCT No. WO97/29131, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Библиотека рекомбинантных антител может быть выделена у индивидуума, иммунизованного иммуногенным продуктом согласно изобретению или частью иммуногенного продукта согласно изобретению. Альтернативно, библиотека рекомбинантных антител может быть получена от индивидуума, не участвующего в эксперименте, то есть, от индивидуума, который не был иммунизован иммуногенным продуктом согласно изобретению, например, библиотека человеческих антител может быть взята у человека, который не был иммунизован иммуногенным продуктом согласно изобретению. Антитела согласно изобретению отбирают путем скрининга библиотеки рекомбинантных антител с использованием пептида, содержащего иммуногенный продукт согласно изобретению, для последующего отбора антител, распознающих иммуногенный продукт согласно изобретению и позволяющих дифференцировать другие формы Aβ, такие как мономер Aβ(1-40) и Aβ(1-42), Aβ-фибриллы и sAPPα. Методы проведения такого скрининга и отбора хорошо известны специалистам и описаны в предыдущем паракрафе.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к выделенному антителу или к его антигенсвязывающей части, которые связываются с иммуногенным продуктом согласно изобретению и позволяют дифференцировать мономер Aβ(1-40) и Aβ(1-42), Aβ-фибриллы и sAPPα. В соответствии с одним из аспектов изобретения, антителом является нейтрализующее антитело. В различных вариантах осуществления изобретения, антителом является рекомбинантное антитело или моноклональное антитело.

Так, например, антитела согласно изобретению могут быть также получены различными методами фагового представления, известными специалистам. В методах фагового представления, функциональные домены антител представляют на поверхности фаговых частиц, которые несут полинуклеотидные последовательности, кодирующие эти домены. В частности, такой фаг может быть использован для представления антигенсвязывающих доменов, экспрессированных из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных антител). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывается с представляющим интерес антигеном, может быть отобран или идентифицирован с использованием антигена, например, меченного антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или сферой или иммобилизованного на этой поверхности или сфере. Фагом, используемым в этих методах, обычно является нитчатый фаг, включающий связывающие домены фагов fd и M13, экспрессируемые из фага, имеющего домены Fab-фрагмента, Fv-фрагмента или стабилизированного дисульфидом Fv-фрагмента антител, рекомбинантно присоединенные к белку фагового гена III или VIII. Репрезентативными методами фагового представления, которые могут быть применены для получения антител согласно изобретению, являются методы, описанные Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); в заявке PCT No. PCT/GB91/01134; в публикациях заявок PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и в патентах США NN 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Как описано в цитируемых выше работах, после отбора фага, антитело-кодирующие области фага могут быть выделены и использованы для получения полноразмерных антител, включая человеческие антитела или любой другой нужный антигенсвязывающий фрагмент, и экспрессированы в любом нужном хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, например, подробно описанные ниже. Так, например, способы рекомбинантного продуцирования Fab-, Fab'- и F(ab')₂-фрагментов могут быть также осуществлены с применением методов, известных специалистам, таких как методы, описанные в публикации заявки РСТ WO 92/22324; и в публикациях Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); и Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); и Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)(указанные работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Примерами методов, которые могут быть применены для продуцирования одноцепочечных Fv-фрагментов и антител, являются методы, описанные в патентах США 4946778 и 5258498, и в публикациях Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); и Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

В качестве альтернативы скринингу библиотек рекомбинантных антител методом фагового представления, используемому для идентификации родительских антител, могут быть применены и другие методы, известные специалистам в области скрининга крупных комбинаторных библиотек. Одним из типов альтернативной экспрессионной системы является система, в которой библиотеку рекомбинантных антител экспрессируют в виде гибрида «РНК-белок», как описано в публикации заявки PCT WO 98/31700, Szostak и Roberts, и в публикации Roberts, R. W. и Szostak, J. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. В этой системе, ковалентное связывание осуществляют между мРНК и пептидом или белком, кодируемыми этой мРНК, посредством in vitro трансляции синтетических мРНК, несущих, у своего 3'-конца, пуромицин, то есть, антибиотик-акцептор пептидила. Таким образом, специфическая мРНК может быть обогащена из комплексной смеси мРНК (например, комбинаторной библиотеки) исходя из свойств кодируемого пептида или белка, например, антитела или его части, таких как способность антитела или его части к связыванию с антигеном с двойной специфичностью. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их части, выявленные путем скрининга указанных библиотек, могут быть экспрессированы описанными здесь рекомбинантными методами (например, в клетках-хозяевах млекопитающих), и кроме того, они могут быть подвергнуты последующему аффинному созреванию путем проведения либо дополнительных раундов скрининга гибридов мРНК-пептид, в которых в их первоначально отобранную(ые) последовательность(и) были введены мутации, либо другими методами аффинного созревания рекомбинантных антител in vitro, описанными выше.

В другом подходе, антитела согласно изобретению могут быть также получены методами дрожжевого представления, известными специалистам. В методах дрожжевого представления, для связывания доменов антител со стенками дрожжевых клеток и их представления на поверхности дрожжей применяются генетические методы. В частности, такие дрожжи могут быть использованы для представления антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных антител). Репрезентативными методами дрожжевого представления, которые могут быть применены для получения родительских антител, являются методы, описанные Wittrup, et al., в патенте США № 6699658, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Антитела согласно изобретению могут быть получены любыми методами, известными специалистам. Так, например, экспрессию в клетках-хозяевах, в которые был(и) переносен(ы) экспрессионный(е) вектор(ы), кодирующий(ие) тяжелую и легкую цепи DVD, осуществляют стандартными методами. Различные формы термина «трансфекция» охватывают широкий ряд методов, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, например, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую DEAE-декстраном и т.п. Антитела согласно изобретению могут экспрессироваться в прокариотических или эукариотических клетках-хозаевах. В соответствии с конкретным аспектом изобретения, экспрессию антител осуществляют с использованием эукариотических клеток, например, клеток-хозяев млекопитающих, поскольку такие эукариотические клетки (а в частности, клетки млекопитающих) с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, будут подвергаться сборке и секретировать «правильно» уложенное и иммунологически активное антитело.

В соответствии с одним из аспектов изобретения, клетками-хозяевами млекопитающих, используемыми для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению, являются клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO) (включая клетки dhfr-CHO, описанные Urlaub и Chasin, ((1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220) и используемые с DHFR-селективным маркером, например, как описано R.J. Kaufman и P.A. Sharp ((1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. После введения рекомбинантных экспрессионных векторов, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или секреции антител в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды стандартными методами очистки белков.

Клетки-хозяева могут быть также использованы для продуцирования функциональных фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Следует отметить, что варианты вышеуказанных процедур входят в объем настоящего изобретения. Так, например, может оказаться желательной трансфекция клетки-хозяина ДНК, кодирующей функциональные фрагменты легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела согласно изобретению. Для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих любые или обе легкие и тяжелые цепи, которые не являются необходимыми для связывания с представляющими интерес антигенами, может быть также применен метод рекомбинантных ДНК. Молекулы, экспрессируемые из таких усеченных молекул ДНК, также входят в объем термина «антитела» согласно изобретению. Кроме того, могут быть продуцированы бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая цепь и одна легкая цепь представляют собой антитело согласно изобретению, а другие тяжелая и легкая цепи являются специфичными к антигену, не являющемуся представляющим интерес антигеном, и такие антитела могут быть получены путем перекрестного связывания антитела согласно изобретению со «вторым» антителом стандартными химическими методами перекрестного связывания.

В конкретной системе рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части согласно изобретению, рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, встраивают в клетки dhfr-СHO методом трансфекции, опосредуемой фосфатом кальция. В рекомбинантном экспрессионном векторе, гены тяжелой и легкой цепи антитела функционально присоединены к регуляторным элементам «энхансер CMV/промотор AdMLP», что приводит к запуску транскрипции генов на высоком уровне. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет ген DHFR, что позволяет проводить отбор клеток CHO, трансфецированных вектором, путем их культивирования в присутствии метотрексата/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, и из культуральной среды выделяют интактное антитело. Для получения рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения белка антитела из культуральной среды применяют стандартные методы молекулярной биологии. Настоящее изобретение также относится к способу синтеза рекомбинантного антитела согласно изобретению путем культивирования клеток-хозяев согласно изобретению в подходящей культуральной среде с получением рекомбинантного антитела согласно изобретению. Этот способ может также включать выделение рекомбинантного антитела из культуральной среды.

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела происходят от животных различных видов, и такие антитела имеют вариабельную область, происходящую от мышиного моноклонального антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина. Методы продуцирования химерных антител известны специалистам и подробно обсуждаются в литературе. См., например, публикацию Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; и патенты США NN. 5807715; 4816567 и 4816397, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, могут быть применены методы продуцирования «химерных антител» (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, и эти публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки) путем сплайсинга генов мышиной молекулы антитела, имеющей соответствующую специфичность связывания с антигеном, вместе с генами молекулы человеческого антитела, обладающей соответствующей биологической активностью.

CDR-привитые антитела согласно изобретению содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи человеческого антитела, где одна или более областей CDR V_H и/или V_L заменены последовательностями CDR мышиных антител согласно изобретению. Каркасная последовательность любого человеческого антитела может служить в качестве матрицы для присоединения СDR. Однако, прямая замена цепи в такой каркасной последовательности часто приводит к некоторой потере аффинности связывания с антигеном. Чем выше гомология человеческого антитела исходному мышиному антителу, тем меньше вероятность того, что объединение мышиных CDR с человеческой каркасной последовательностью будет нарушать структуру СDR, что может снижать аффинность антитела. Поэтому, человеческая вариабельная каркасная последовательность, выбранная для замены мышиной вариабельной каркасной последовательности, помимо СDR, имеет последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична каркасной последовательности вариабельной области мышиного антитела. Человеческие и мышиные вариабельные области, помимо СDR, имеют по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80% идентичность последовательностей. Методы продуцирования химерных антител известны специалистам и подробно описаны ниже (см. также EP 239400; публикацию заявки PCT WO 91/09967; патенты США NN 5225539; 5530101 и 5585089), и такими методами являются методы «отделки» или «покрытия» (EP 592106; EP 519596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)) и перестановки цепи (патент США No. 5565352).

Гуманизованными антителами являются молекулы антител, происходящих от не-человечесих антител и связывающихся с нужным антигеном (CDR), где указанные антитела имеют одну или более гипервариабельных областей, происходящих от животных, не являющихся человеком, и каркасных областей, происходящих от молекулы человеческого иммуноглобулина.

Известные последовательности человеческого Ig описаны, например, на сайтах: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; рathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;

www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito/Elisa.html;

www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; антитело.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html., в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Такие «импортные» последовательности могут быть использованы для снижения иммуногенности или для снижения, повышения или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих свойств, известных специалистам.

Каркасные остатки в человеческих каркасных областях могут быть заменены соответствующим остатком донорного антитела с СDR в целях изменения, а предпочтительно, улучшения связывания с антигеном. Такие каркасные замены идентифицируют методами, хорошо известными специалистам, например, путем моделирования взаимодействий СDR и каркасных остатков в целях идентификации каркасных остатков, играющих важную роль в связывании с антигеном, и сравнения последовательностей в целях идентификации редко встречающихся каркасных остатков в конкретных положениях. (См., например, публикации Queen et al., патент США No. 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулина. Анализ таких представлений позволяет определить вероятную роль этих остатков в функционировании последовательности-кандидата иммуноглобулина, то есть, выявить остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны из консенсусных последовательностей и «импортных» последовательностей и объединены так, чтобы получить антитело с желаемыми свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)-мишени(ям). В общих чертах, остатки CDR непосредственно и в самой высокой степени влияют на связывание с антигеном. Антитела могут быть гуманизованы различными методами, известными специалистам, такими как, но не ограничивающихся ими, методы, описанные в публикациях Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol.. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); в публикации PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, в патентах США NN. 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки, включая цитируемые там работы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. В соответствии с одним из аспектов изобретения, константной областью тяжелой цепи является константная область тяжелой цепи IgG1 или константная область тяжелой цепи IgG4. В соответствии с другим аспектом изобретения, антитело содержит константную область легкой цепи, то есть, константную область легкой цепи каппа или константную область легкой цепи лямбда. В соответствии с одним из аспектов изобретения, антитело содержит константную область легкой цепи каппа. Частью антитела может быть, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.

Замены аминокислотных остатков в Fc-части, вводимые для изменения эффекторной функции антитела, известны специалистам (Winter, et al., патенты США №№ 5648260 и 5624821). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, индуцирование цитокинов, ADCC, фагоцитоз, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), время полужизни/скорость клиренса антитела и образование комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях желательно, чтобы терапевтическое антитело обладало этими эффекторными функциями, а в других случаях, в зависимости от терапевтического применения, такие функции могут необязательными или даже нежелательными. Некоторые изотипы человеческих IgG, а в частности, IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC посредством связывания с FcγR и с комплементом C1q, соответственно. Fc-рецепторы у новорожденных (FcRn) представляют собой важные компоненты, определяющие время полужизни антител в кровотоке. В другом варианте изобретения, по меньшей мере один аминокислотный остаток в константной области антитела, например, в Fc-области антитела, заменяют так, чтобы это приводило к изменению эффекторных функций антитела.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к меченному антителу, где указанное антитело согласно изобретению дериватизировано другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком) или связано с такой молекулой. Так, например, меченное антитело согласно изобретению может быть дериватизировано путем функционального присоединения антитела согласно изобретению (путем химического взаимодействия, генетического слияния, нековалентного связывания или т.п.) к одной или нескольким другим молекулам, таким как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диантитело), детектируемый агент, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые могут опосредовать связывание антитела с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Подходящими детектируемыми агентами, которыми может быть деритиватизировано антитело согласно изобретению, являются флуоресцентные соединения. Репрезентативными детектируемыми флуоресцентными агентами являются флуоресцеин, флуоресцеин-изоционат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и т.п. Антитело может быть также дериватизировано детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозо-оксидаза и т.п. Если антитело дериватизировано детектируемым ферментом, то оно может быть детектировано путем добавления вспомогательных реагентов, которые используются ферментом для продуцирования детектируемого реакционного продукта. Так, например, если таким детектируемым агентом является пероксидаза хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного реакционного продукта, который является детектируемым. Антитело может быть также дериватизировано биотином и детектировано путем непрямого измерения уровня связывания с авидином или стрептавидином.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к кристаллизованному антителу. В соответствии с одним из своих аспектов, настоящее изобретение относится к кристаллам полноразмерных антител против глобуломера Aβ(20-42) и их фрагментов, описанных в настоящей заявке, а также к препаратам и композициям, содержащим такие кристаллы. В другом аспекте изобретения, кристаллизованное антитело имеет более длительное время полужизни in vivo, чем его растворимый аналог. В другом аспекте изобретения, антитело сохраняет биологическую активность после кристаллизации.

Кристаллизованное антитело согласно изобретению может быть получено методами, известными специалистам и описанными в заявке WO 02/072636, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к гликозилированному антителу, где указанное антитело содержит один или более углеводных остатков. Растущая цепь белка при его продуцировании in vivo может затем подвергаться процессингу, известному как посттрансляционная модификация. В частности, сахарные (гликозильные) остатки могут быть присоединены ферментативно, то есть, способом, известным как гликозилирование. Полученные белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины.

Антитела представляют собой гликопротеины с одним или более углеводными остатками в Fc-домене, а также в вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc-домене играют важную роль в эффекторной функции Fc-домена, и при этом, оказывают незначительное влияние на связывание с антигеном или на время полужизни антитела (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). В противоположность этому, гликозилирование вариабельного домена может оказывать влияние на антигенсвязывающую активность антитела. Гликозилирование в вариабельном домене может оказывать негативное воздействие на аффинность связывания с антителом, что, вероятно, обусловлено стерическим затруднением (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), или приводит к повышению аффинности связывания с антигеном (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к получению мутантных сайтов гликозилирования, в которых сайт O- или N-связанного гликозилирования антитела был мутирован. Специалист в данной области может получить такие мутанты хорошо известными стандартными методами. Мутантные сайты гликозилирования, которые сохраняют биологическую активность, но обладают повышенной или пониженной активностью связывания, являются другим объектом настоящего изобретения.

В другом варианте изобретения, гликозилирование антитела согласно изобретению является модифицированным. Так, например, может быть получено негликозилированное антитело (то есть, антитело, не имеющее сайтов гликозилирования). Гликозилирование может быть модифицировано, например, в целях повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем модификации одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Так, например, могут быть сделаны одна или несколько аминокислотных замен, приводящих к элиминации одного или более сайтов гликозилирования в вариабельной области, и тем самым, к элиминации гликозилирования в этом сайте. Такое отсутствие гликозилирования может приводить к повышению аффинности антитела к антигену. Этот подход более подробно описан в публикации Международной заявки № WO 03/016466A2 и в патентах США №№ 5714350 и 6350861, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Дополнительно или альтернативно, может быть получено модифицированное антитело согласно изобретению, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее уменьшенное количество фукозильных остатков или антитело, имеющее улучшенные структуры, разделенные напополам молекулой GlcNAc. Было продемонстрировано, что такие измененные профили гликозилирования приводят к повышению антитело-зависмой клеточной цитотоксичности (ADCC) антител. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в литературе и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются и, тем самым, продуцируются рекомбинантные антитела согласно изобретению с измененным характером гликозилирования. См., например, публикацию Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также Европейский патент No: EP 1176195; и публикации заявок PCT WO03/035835 и WO99/5434280, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Гликозилирование белков зависит от аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, а также от клеток-хозяев, в которых экспрессируется такой белок. Различные организмы могут продуцировать различные гликозилирующие ферменты (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и имеют различные доступные субстраты (нуклеотид-сахара). Благодаря этим факторам, характер гликозилирования белков и состав гликозильных остатков могут варьироваться в зависимости от типа системы-хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильными остатками, используемыми в настоящем изобретении, могут быть, но не ограничиваются ими, глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, N-ацетилглюкозамин и сиаловая кислота. В соответствии с одним из аспектов изобретения, гликозилированное антитело содержит гликозильные остатки, характерные для человека.

Специалисту в данной области известно, что изменение характера гликозилирования белка может приводить к изменению свойств белка. Так, например, эффективность терапевтического белка, продуцированного в микроорганизме-хозяине, таком как дрожжи, и гликозилированного по эндогенному дрожжевому пути, может быть ниже, чем эффективность того же самого белка, экспрессируемого в клетках млекопитающих, таких как клеточная линия СНО. Такие гликопртеины могут быть также иммуногенными для человека и имеют уменьшенное время полужизни in vivo после введения. Специфические рецепторы у человека и других животных могут распознавать специфические гликозильные остатки и стимулировать быстрое выведение белка из кровотока. Другими побочными эффектами могут быть изменение укладки белка, его растворимости, чувствительности к протеазам, переноса, транспорта, компартментализации, секреции, распознавания другими белками или факторами, а также антигеннности или аллергенности. В соответствии с этим, практический врач может выбрать терапевтический белок, имеющий конкретный состав и характер гликозилирования, например, белок, в котором состав и характер гликозилирования идентичны или по меньшей мере аналогичны составу или характеру гликозилирования белка, продуцированного в человеческих клетках или в видоспецифических клетках рассматриваемого животного.

Экспрессия гликозилированных белков, отличающихся от белков клеток-хозяев, может быть достигнута путем генетической модификации клеток-хозяев, осуществляемой так, чтобы эти клетки-хозяева экспрессировали гетерологичные гликозилирующие ферменты. С использованием известной технологии, специалист-практик может самостоятельно получить антитела, имеющие характер гликозилирования, присущий человеческому белку. Так, например, дрожжевые штаммы были генетически модифицированы для экспрессии не-природных гликозилирующих ферментов, так, чтобы гликозилированные белки (гликопротеины), продуцируемые этими лрожжевыми штаммами, имели характер гликозилирования, идентичный характеру гликозилирования в клетках животных, а в частности, в человеческих клетках (публикации заявок на патенты США 20040018590 и 20020137134 и заявки WO 05/100584).

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к антиидиотипическому (анти-Id) антителу, специфичному к антителам согласно изобретению. Анти-Id антителом является антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-Id антитело может быть получено путем иммунизации животного антителом или его СDR-содержащей областью. У иммунизованного животного будут распознаваться идиотипические детерминанты для иммунизующего антитела и будет наблюдаться ответ на такие детерминанты, в результате чего будет продуцироваться анти-Id антитело. Анти-Id антитело может быть также использовано в качестве «иммуногена» для индуцирования иммунного ответа у еще одного животного, продуцирующего так называемое анти-анти-Id антитело.

Кроме того, следует отметить, что представляющий интерес белок может быть экспрессирован с использованием библиотеки клеток-хозяев, генетически сконструированных для экспрессии различных гликозилирующих ферментов, так, чтобы член библиотеки клеток-хозяев мог продуцировать представляющий интерес белок с различными паттернами гликозилирования. Затем специалист-практик может выбрать и выделить представляющий интерес белок с конкретными новыми паттернами гликозилирования. В соответствии с другим аспектом изобретения, белок, имеющий конкретно выбранный новый паттерн гликозилирования, обладает улучшенными или измененными биологическими свойствами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение также относится к применению иммуногенных продуктов согласно изобретению для получения аптамера, который связывается с иммуногенным продуктом (далее этот аптамер также называется «аптамером против продукта»). В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу получения аптамера, способного специфически связываться с описанным здесь иммуногенным продуктом, где указанный способ включает, по меньшей мере стадии:

а) получения связывающейся мишени, содержащей иммуногенный продукт;

b) обработки аптамера соответствующего репертуара или предполагаемого репертуара указанной связывающейся мишенью; и

c) отбора аптамера из аптамеров соответствующего репертуара, который специфически связывается с указанным иммуногенным продуктом.

Используемый здесь термин «аптамер» означает молекулы олигонуклеиновой кислоты или пептида, обладающие способностью к специфическому нековалентному связыванию с мишенью. Термин «аптамер», предпочтительно, включает пептид, последовательность ДНК или РНК, а более предпочтительно, пептид, последовательность ДНК или РНК, состоящие приблизительно из 3-100 мономеров, которые, у своего одного или у своих обоих концов, могут быть присоединены к более крупной молекуле, а предпочтительно, к более крупной молекуле, опосредующей биохимические функции, еще более предпочтительно, к более крупной молекуле, индуцирующей инактивацию и/или расщепление, а наиболее предпочтительно, к убихитину, или, предпочтительно, к более крупной молекуле, способствующей деструкции, а более предпочтительно, к ферменту или флуоресцентному белку.

Следует отметить, что используемый здесь термин «аптамер с предполагаемым репертуаром» означает любую библиотеку, набор, комплекс или ряд аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот или любой генератор такой библиотеки, набора, комплекса или ряда аминокислотных последовательностей, которые могут быть использованы для продуцирования аптамера с определенным репертуаром in vivo или in vitro.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение также относится к аптамерам, которые связываются с определенными здесь иммуногенными продуктами.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аптамер получают способом, включающим отбор аптамера из аптамеров соответствующего репертуара или аптамеров предполагаемого репертуара, описанных в настоящей заявке.

В соответствии со своем особенно предпочтительным вариантом, настоящее изобретение относится к аптамерам, специфичным к иммуногенному продукту. Такими аптамерами являются, в частности, аптамеры, обладающие сравнительно меньшей аффинностью по отношению к мономерным и фибрилломерным формам пептида Aβ, чем к иммуногенному продукту согласно изобретению.

Агенты, способные связываться с иммуногенным продуктом согласно изобретению, могут быть также использованы во многих целях, некоторые из которых описаны ниже. Эти агенты являются особенно подходящими для их использования в терапевтических и диагностических целях.

Настоящее изобретение также относится к молекуле, содержащей аминокислотную последовательность, которая идентична части (X-Y) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈A₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:13; Αβ(1-43)F19A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:14; Αβ(1-43)F20A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:15; Αβ(1-43)E22A]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁F₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:16; Αβ(1-43)E22F]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁V₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:17; Αβ(1-43)E22V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:18; Αβ(1-43)E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂K₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:19; Αβ(1-43)D23K]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂L₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:20; Αβ(1-43)D23L];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄V₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:21; Αβ(1-43)G25V]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉G₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:22; Αβ(1-43)A30G];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉G₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:23; Αβ(1-43)F20G E22A];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉A₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀A₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:24; Αβ(1-43)F20A I31A];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉C₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀C₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:25; Αβ(1-43)F2°C I31C];

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:26; Αβ(1-43)A21Q E22L]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀L₂₁Q₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:27; Αβ(1-43)A21L E22Q]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀Q₂₁E₂₂N₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:28; Αβ(1-43)A21Q D23N]; D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄A₂₅S₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:29; Αβ(1-43)E22A G25A]; и D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅A₂₆N₂₇K₂₈G₂₉A₃₀ I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ [SEQ ID NO:30; Αβ(1-43)E22A S26A],

где X выбран из группы, состоящей из чисел 1.. 18, 4.. 18, 12.. 18, или равен 18, а Y выбран из группы, состоящей из чисел 33.. 43, 33.. 42, 33.. 41 или 33.. 40; или представляет собой его перекрестносвязанное производное, где по меньшей мере 2 не-смежных остатка аминокислотной последовательности ковалентно связаны друг с другом.

В конкретных вариантах указанной молекулы или ее перекрестносвязанного производного, (X-Y) выбран из группы, состоящей из (1-42), (4-42), (12-42) или (18- 42).

ПРИМЕРЫ

Пептиды мутеина Aβ были синтезированы стандартными методами.

Пример 1: Получение олигомера мутеина Aβ

a) Олигомер мутеина Aβ(1-42) E22A:

Пептид Aβ(1-42) E22A, который был получен путем пептидного синтеза (MoBiTec GmbH, Göttingen, Germany), суспендировали в 100% 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (HFIP) при 6 мг/мл и инкубировали для полной солюбилизации при встряхивании в течение 2,5 часа при 37°C. HFIP действует как агент, разрывающий водородную связь, а поэтому он был использован для устранения уже имеющихся структурных несоответствий в пептиде Aβ. HFIP удаляли путем выпаривания в SpeedVac и Aβ(1-42) E22A ресуспендировали при концентрации 5 мМ в диметилсульфоксиде и обрабатывали ультразвуком в течение 20 секунд. Aβ(1-42) E22A, предварительно обработанный HFIP, разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH 7,4) до концентрации 400 мкM и добавляли 1/10 объема 2% додецилсульфата натрия (ДСН) (в H₂O) (в конечной концентрации 0,2% ДСН). Раствор инкубировали в течение 6 часов при 37°C. Затем, раствор снова разводили тремя объемами H₂O и инкубировали в течение 18 часов при 37°C с получением олигомера мутеина Aβ(1-42) E22A. После центрифугирования при 3000× g в течение 20 минут, образец два раза диализовали при комнатной температуре против 0,5 литра буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ NaCl, pH 7,4) в диализной трубке в течение 2,5 часа. Диализат 15-кратно концентрировали путем ультрафильтрации (с отсечкой 30 кДа), центрифугировали при 10000× g в течение 5 минут, и супернатант, содержащий олигомер мутеина Aβ(1-42) E22A, удаляли.

b) Усеченный олигомер мутеина Aβ E22A:

30 мкл 1 мг/мл раствора термолизина (Sigma) в H₂O добавляли к 0,8 мл препарата олигомера мутеина Aβ(1-42) E22A, полученного как описано в Примере 1a. Реакционную смесь встряхивали при 30°C в течение 20 часов. Затем добавляли 4 мкл 100 мМ раствора EDTA, pH 7,4, в воде, и содержание ДСН в смеси доводили до 0,1% путем добавления 8 мкл 10%-го раствора ДСН. Реакционную смесь встряхивали в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем диализовали при комнатной температуре против 0,5 литра буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ NaCl, 0,1% ДСН, pH 7,4) в диализной трубке в течение 6 часов, после чего буфер для диализа заменяли, и диализ проводили еще 20 часов. После этого диализат удаляли и смесь хранили при 80°C вплоть до ее использования.

с) Усеченный олигомер мутеина Aβ E22A, осажденный этанолом:

Для использования антигена в активной иммунизации, усеченный олигомер мутеина Aβ E22A, описанный в примере 1b, осаждали этанолом. Для этой цели, одну часть (об./об.; например, 1 мл) усеченного олигомера мутеина Aβ в концентрации 0,5-10 мг/мл оттаивали при комнатной температуре. Затем к образцу добавляли 8 частей (об./об., например, 8 мл) охлажденного льдом этанола. Образец быстро смешивали и добавляли 1 часть (об./об., исходя из первоначального объема усеченного олигомера мутеина Aβ; например, 1 мл) 10×PBS (Fa. Gibco, cat.no. 14200-067). Затем образец снова быстро перемешивали и инкубировали в течение 30 минут на ледяной бане. Образец центрифугировали в течение 20 минут при 3000× g и супернатант отбрасывали. Оставшийся осадок суспендировали в соответствующем объеме 5 мМ NaH₂PO₄, 35 мМ NaCl, pH 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл. После охлаждения на ледяной бане в течение 10 минут, образец обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом устройстве (UP 200s Dr. Hielscher GmbH) в течение 5 × 3 секунд при 0°C на ледяной бане (с периодическим охлаждением в течение 10 секунд на льду) на 50% максимальной мощности. После завершения этой стадии, образец разделяли на аликвоты и замораживали при -80°C до последующего использования.

Были получены олигомеры мутеина Aβ, перечисленные ниже в таблице 2, которые подвергали протеолитическому расщеплению и осаждали из этанола в соответствии с процедурами, описанными в примерах 1a, 1b и 1c.

Пример 2: Полуколичественная оценка пептидной композиции усеченных олигомеров мутеина Aβ, проводимая с помощью масс-спектрометрии путем лазерно-десорбционной ионизации с поверхностной активацией

1 мкл усеченного олигомера мутеина Aβ E22A, полученного как описано в примере 1b, разводили 249 мкл 50% ацетонитрила; 0,5% TFA (500 мкл ацетонитрила+500 мкл 1% TFA). 1 мкл образца наносили пятнами на чип с массивом белков H4 (BioRad; Cat. no. C57-30028). Эти пятна сушили на пластине термоинкубатора при 40°C. CHCA-раствор получали следующим образом: 5 мг CHCA (BioRad; Cat. no. C30-00001) растворяли в маточном растворе, содержащем 150 мкл ацетонитрила+150 мкл 1% TFA (хранившимся при 20°C). 10 мкл маточного раствора разводили 20 мкл ацетонитрила и 20 мкл 1% TFA с получением рабочего CHCA-раствора. 2 мкл рабочего CHCA-раствора наносили на пятна. Эти пятна сушили на пластине термоинкубатора при 40°C и анализировали с помощью SELDI-MS (масс-спектрометрии путем лазерно-десорбционной ионизации с поверхностной активацией; редактирование проводили на белковом чипе, встроенном в систему SELDI) с использованием следующих параметров: масса в пределах от 500 до 10000 Да; фокусная масса: 2220 Да; аттенюированная матрица: 500 Да; скорость взятия образцов: 400 МГц; данные быстрого скрининга при нагревании: 2 образца с энергией 1100 нДж; данные быстрого скрининга: 10 образцов с энергией 1000 нДжоулей; распределение 1 из 3. Усеченные формы других олигомеров мутеина Aβ, перечисленные в таблице 2, подвергали той же самой процедуре обработки.

Было обнаружено, что состав пептидных композиций усеченных олигомеров мутеина Aβ варьируется. В таблице 2 указано количество характерных пептидных фрагментов Aβ для каждого усеченного олигомера мутеина Aβ.

Таблица 2: Seldi-MS-анализ различных усеченных олигомеров мутеина

Мутеин	Seldi-MS
Aβ(1-42) V18A	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) F19A	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) F20A	прибл. 5% Aβ4-42
Aβ(1-42) A21G	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) E22A	>50% Aβ24-42
Aβ(1-42) D23A	>80% Aβ23-42
Aβ(1-42) V24A	<5% Aβ24-42
Aβ(1-42) G25A	прибл. 10% Aβ4-42
Aβ(1-42) S26A	60% Aβ20-42; 40% Aβ24-42
Aβ(1-42) N27A	<5% Aβ24-42
Aβ(1-42) K28A	прибл. 10% Aβ4-42
Aβ(1-42) G29A	прибл. 5% Aβ20-42; прибл. 5% Aβ4-42
Aβ(1-42) A30G	прибл. 20% Aβ24-42; прибл.10% Aβ4-42
Aβ(1-42) I31A	прибл. 40% Aβ4-42
Aβ(1-42) I32A	прибл. 10% Aβ4-42
Aβ(1-42) G33A	прибл. 15% Aβ24-42
Aβ(1-42) A21Q	прибл. 15% Aβ24-42
Aβ(1-42) A21L	Прибл.50% Aβ21-42, <5% Aβ4-30
Aβ(1-42) E22G	<5% Aβ24-42
Aβ(1-42) E22Q	прибл. 20% Aβ4-42 (старая процедура)
Aβ(1-42) E22K	прибл. 20% Aβ4-42
Aβ(1-42) E22D	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) E22L	>80% Aβ22-42; 20% Aβ4-30+Aβ4-33
Aβ(1-42) D23N	>50% Aβ24-42
Aβ(1-42) D23L	>80% Aβ23-42; 20% Aβ4-30+Aβ4-33
Aβ(1-42) E22F	10% Aβ20-42; 60% Aβ22-42; 30% Aβ24-42
Aβ(1-42) E22V	20% Aβ22-42; 20% Aβ24-42; 60% различных неизвестных пиков
Aβ(1-42) D23K	30% Aβ24-42
Aβ(1-42) D23V	Пики не детектировались
Aβ(1-42) G25V	60% Aβ20-42; 40% Aβ24-42
Aβ(1-42) G25T	70% Aβ20-42; 30% Aβ24-42
Aβ(1-42) S26L	20% Aβ24-42
Aβ(1-42) A21G, E22Q	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) A21G, E22K	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) A21Q, E22L	>80% Aβ22-42; 20% Aβ4-30+Aβ4-29
Aβ(1-42) A21L, E22Q	>50% Aβ21-42; 30% Aβ24-42
Aβ(1-42) A21G, D23N	<5% Aβ4-42
Aβ(1-42) F20A, I31A	20% Aβ4-42; 30% Aβ19-42 и Aβ2042; 20% Aβ17-42
Aβ(1-42) F20G, E22A	10% Aβ4-42; 20% Aβ20-42 и Aβ24-42; 50% Aβ21-42
Aβ(1-42) E22A, D23A	-
Aβ(1-42) E22A, G25A	40% Aβ20-42; 60% Aβ24-42
Aβ(1-42) E22A, S26A	40% Aβ20-42; 60% Aβ24-42
Aβ(1-42) G25A, S26A	40% Aβ20-42; 60% Aβ24-42
Aβ(1-42) F20C, I31C	>80% Aβ12-42

Пример 3: Эксклюзионная хроматография усеченных олигомеров мутеина Aβ

Эксклюзионную хроматографию осуществляли на ЭХ-колонке с Superose 12 HR 10/300 GL (GE Health Care, catalogue no. 17-5173-01) при скорости потока 0,5 мл/мин. Подвижная фаза представляла собой 20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, 0,5% ДСН, pH 7,4. 30 мкг усеченного олигомера мутеина Aβ, полученного как описано в примере 1b, разводили подвижной фазой с получением 150 мкл раствора в концентрации 200 мкг/мл. 100 мкл этой смеси загружали на колонку. Был детектирован пептид с коэффициентом экстинкции 215 нм.

На полученной эксклюзионной хроматограмме (фиг. 1B) для усеченного олигомера мутеина Aβ E22A наблюдался главный пик при 11,37 мл, соответствующий 26 кДа, и малые пики, соответствующие 45 кДа, 120 кДа и 4 кДа. Усеченный олигомер мутеина Aβ F20G, E22A (фиг. 1C) обнаруживал более однородное распределение по размерам и имел главный пик при концентрации 10,83 мл, соответствующий 32 кДа, и только небольшой пик, соответствующий 5 кДа. Для сравнения, эксклюзионная хроматограмма для глобуломера Aβ(20-42) дикого типа (фиг. 1A) указывала на главный двойной пик при концентрациях 11,04 мл и 11,85 мл, соответствующих 30 кДа и 21 кДа, соответственно, и малые пики, соответствующие 150 кДа и 4 кДа. В целом, эксклюзионная хроматография подтвердила, что по своей олигомерной природе, усеченные олигомеры мутеина Aβ имеют сходство с глобуломером Aβ(20-42) дикого типа.

Пример 4: Прямой ELISA-анализ усеченных олигомеров мутеина Aβ

Иммунореактивность усеченных олигомеров мутеина Aβ, описанных в примере 1b, дополнительно охарактеризовывали с использованием мышиных моноклональных антител m7C6 и m4D10, реагирующих с глобуломером Aβ(20-42), для предсказания способности усеченных олигомеров мутеина Aβ индуцировать нежелательную перекрестную реакцию поликлонального антитела с PF-4. Было показано, что антитело m7C6 перекресно реагирует с PF-4, а m4D10, как было обнаружено, не вступает в перекрестную реакцию с PF-4.

Протокол прямого ELISA-анализа для определения распознавания усеченного олигомера мутеина Aβ:

Реагенты:

1 Планшет F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Cat.No.: 439454

2. Антиген: усеченный олигомер мутеина Aβ, описанный в примере 1b

3. Буфер для нанесения покрытия: 100 мМ бикарбоната натрия; pH 8,2

4. Блокирующий реагент для ELISA; Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 1112589

5. PBST-Буфер: 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl; 0,05% твин 20; pH 7,4

6. PBST+0,5% BSA-буфер: 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl; 0,05% твин 20; pH 7,4+0,5% BSA; Serva cat.11926

7. «Первые» антитела:

Анти-Aβ mAb, клон 7C6; концентрация: 2,83 мг/мл, OD 280 нм; хранение при -80°C

Анти-Aβ mAb, клон 4D10; концентрация: 8,60 мг/мл, OD 280 нм; хранение при -80°C

8. Реагент для мечения: конъюгат антимышиное антитело-POD; Jackson ImmunoResearch Ltd. Cat. No.: 715-035-150

9. Окрашивание: TMB; Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 92817060; 42 мМ в ДМСО; 3% H₂O₂ в воде; 100 мМ ацетат натрия, pH 4,9

10. Раствор для прекращения реакции: 2M сульфоновая кислота

Метод получения реагентов:

1. Раствор антигена:

12 мкг усеченного олигомера мутеина Aβ разводили 12 мл буфера для нанесения покрытий до 1 мкг/мл.

2. Блокирующий реагент:

Блокирующий реагент растворяли в 100 мл воды для получения блокирующего маточного раствора, и 10 мл-аликвоты хранили при температуре -20°C. Для блокирования каждого планшета, 3 мл блокирующего маточного раствора разводили 27 мл воды.

3. Разведение «первого» антитела:

A) Анти-Aβ mAb, клон 7C6 разводили в PBST+0,5% BSA до концентрации: 100 нг/мл (= маточный раствор А).

B) Анти-Aβ mAb, клон 4D10 разводили в PBST+0,5% BSA до концентрации: 100 нг/мл (= маточный раствор В).

Кривые для «первых» антител (построенные для A) клона 7C6 и B) клона 4D10):

Nо	Маточный раствор A) или B)	PBST+0,5% BSA	Конечная концентрация
1	2 мл 100 нг/мл	0 мл	100 нг/мл
2	0,633 мл (1)	1,367 мл	31,6 нг/мл
3	0,633 мл (2)	1,367 мл	10 нг/мл
4	0,633 мл (3)	1,367 мл	3,16 нг/мл
5	0,633 мл (4)	1,367 мл	1 нг/мл
6	0,633 мл (5)	1,367 мл	0,316 нг/мл
7	0,633 мл (6)	1,367 мл	0,1 нг/мл
8	0 мл	2 мл	0,0 нг/мл

4. Реагент для мечения:

Лиофилизат конъюгата «антимышиное антитело-POD» разводили в 0,5 мл воды. Затем добавляли 500 мкл глицерина, и 100 мкл-аликвоты хранили при -20°C до использования. Концентрированный реагент для мечения разводили 1/10000 в PBST-буфере. Этот реагент использовали сразу после его получения.

5. Раствор TMB:

20 мл 100 мМ ацетата натрия, pH 4,9, смешивали с 200 мкл раствора TMB и 29,5 мкл 3% раствора H₂O₂. Этот раствор использовали сразу после его получения.

Панель антител на стандартном планшете. Числа означают конечную концентрацию антитела в нг/мл. Стандарт для каждого антитела представлен в дубликате.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	m7C6	m4D10
A	100	100	100	100
B	31,6	31,6	31,6	31,6
C	10	10	10	10
D	3,16	3,16	3,16	3,16
E	1	1	1	1
F	0,316	0,316	0,316	0,316
G	0,1	0,1	0,1	0,1
H	0,0	0,0	0,0	0,0

Процедура:

1. Добавляли 100 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C.

2. Раствор антигена отбрасывали и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

3. Добавляли 265 мкл блокирующего раствора на лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

4. Блокирующий раствор отбрасывали и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

5. После построения кривых для антител, в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл серийных разведений. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

6. Раствор антитела отбрасывали и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

7. Добавляли 200 мкл раствора в каждую лунку для мечения и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

8. Раствор для мечения отбрасывали и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

9. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора TMB и инкубировали в течение 5-15 минут при комнатной температуре.

10. Затем наблюдали окрашивание и в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора для завершения реакции.

11. Измеряли оптическую плотность на 450 нм.

Результаты:

При введении одной или двух аминокислотных точковых мутаций в область аминокислотных положений 20-23 наблюдалось снижение уровня распознавания полученных усеченных олигомеров мутеина Aβ антителом m7C6, тогда как уровень распознавания антителом m4D10 не снижался или снижался только до определенной степени (см. фигуру 2). В противоположность этому, уровень распознавания олигомеров Aβ(20-42) антителом 4D10, которое не вступало в перекрестную реакцию с PF-4, снижался при введении точковых мутаций, главным образом, в область аминокислотных положений 27-30, хотя картирование эпитопа не было таким уж точным. Область со сниженным уровнем распознавания антителом m7С6, но с обычным уровнем распознавания антителом m4D10 может быть интерпретирована как область, содержащая «горячие» точки, которые являются подходящими для вырабатывания поликлонального иммунного ответа после иммунизации соответствующим олигомером мутеина Aβ(20-42), который не вступает в перекрестную реакцию с PF-4.

Пример 5: Усеченный олигомер мутеина Aβ E22A индуцирует иммунный ответ, специфичный к глобуломеру Aβ

Антигенность реакции олигомеров мутеина Aβ тестировали посредством активной иммунизации грызунов (кроликов, мышей). Поликлональную антисыворотку, взятую у указанных животных, подвергали аффинной очистке, а затем тестировали на специфичность к различным формам Aβ методом дот-блот-анализа. Отдельные формы Aβ подвергали блоттингу в серийных разведениях и инкубировали с соответствующей мышиной антисывороткой, подвергнутой аффинной очистке и содержащей анти-Aβ антитела, продуцированные в иммунной реакции. Отдельные дот-блоты соответствовали различным иммунизованным грызунам.

Пример 5A: Активная иммунизация мышей усеченным олигомером мутеина E22A

Мышам (Balb/c) подкожно на день 0 вводили 30 мкг осажденного этанолом усеченного олигомера мутеина Aβ E22A, полученного как описано в примере 1c, и смешивали с полным адъювантом Фрейнда, с квасцами, либо вообще не смешивали с адъювантом. Мышам вводили бустер-инъекцию по следующей схеме: бустер-инъекция 1 на день 17, бустер-инъекция 2 на день 35 и бустер-инъекция 3 на день 52. Для определения титра, через 7-10 дней после бустер-инъекций 2 и/или 3 брали плазму.

Получение адъювантов:

Получение квасцов в качестве адъюванта:

1 мл 1,4 M раствора NaCl, pH7,4 добавляли к 9 мл геля гидроксида алюминия (Sigma; cat.no.A8222-250ml). Эту смесь инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре до ее использования.

Полный адъювант Фрейнда (CFA):

CFA получали в виде готового раствора адъюванта и использовали для первой иммунизации. Для всех последующих бустер-иммунизаций использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA).

Приготовление раствора без адъюванта:

В этом случае, вместо адъюванта использовали ¼ PBS-буфера (5 мМ NaH₂PO₄; 35 мМ NaCl; pH 7,4).

До проведения активной иммунизации, 100 мкл усеченного олигомера мутеина Aβ (антигена) смешивали с равным объемом соответствующих адъювантов. Смесь антигена/адъюванта инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и быстро встряхивали. Затем, в шейный отдел мыши подкожно инъецировали общий объем 200 мкл. Если в качестве адъюванта использовали CFA или IFA, то растворы антигена и адъювантов CFA или IFA смешивали до образования суспензии, которую затем сразу вводили путем инъекции.

Пример 5B-1: Аффинная очистка поликлональных антител из проб мышиной плазмы на сефарозных сферах

Иммобилизация олигомера мутеина Aβ(20-42) на сефарозных сферах.

Реагенты:

30% изопропанола в 1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане)

1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденной при 0°C на ледяной бане)

50 мМ NaHCO₃; pH 7,5 (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане)

50 мМ NaHCO₃/250 мМ этаноламина; pH 7,5

¼ PBS (5 мМ NaH₂PO₄; 35 мМ NaCl; pH 7,4)

NHS-активированные сефарозные сферы (Fa. GE #17-0906-01) в 100% изопропаноле

TBS: (25 мМ Трис; 150 мМ NaCl; pH 7,5)

Процедура:

2 мл NHS-активированных сефарозных сфер (=2,8 мл суспензии в изопропаноле) 4 раза промывали 10 мл 30% изопропанола в 1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане), 4 раза промывали 1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденной при 0°C на ледяной бане) и 4 раза промывали 10 мл 50 мМ NaHCO₃; pH 7,5 (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане). 0,2 мг усеченного олигомера мутеина Aβ, описанного в примере 1b, разводили 50 мМ NaHCO₃ pH 7,5+0,1% ДСН до 0,5 мг/мл. Раствор усеченного олигомера мутеина Aβ добавляли к 0,2 г промытых NHS-активированных сефарозных сфер, и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После центрифугирования при 3000× g в течение 5 минут, к сефарозным сферам добавляли 1 мл 50 мМ NaHCO₃/250 мМ этаноламина, pH 7,5+0,1% ДСН, и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Образец переносили в хроматографическую колонку PolyPrep (Fa. Biorad #731-1550) и 5 раз промывали 1 мл PBS (5 мМ NaH₂PO₄; 35 мМ NaCl; pH7,4)+0,1% ДСН, а затем 5 раз промывали 1 мл TBS. После проведения последней стадии промывки, сефарозные сферы, несущие иммобилизованный олигомер мутеина Aβ(20-42), переносили в 1,5 мл-пробирку и хранили при 6°C до их использования.

Иммобилизация мономера Aβ(1-42) на сефарозных сферах:

Реагенты: См. выше

Процедура:

2 мл NHS-активированных сефарозных сфер (=2,8 мл суспензии в изопропаноле) 4 раза промывали 10 мл 30% изопропанола в 1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане), 4 раза промывали 1 мМ HCl в H₂O (предварительно охлажденной при 0°C на ледяной бане) и 4 раза промывали 10 мл 50 мМ NaHCO₃; pH 7,5 (предварительно охлажденного при 0°C на ледяной бане). 0,81 мг синтетического пептида Aβ(1-42) (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) растворяли в 80 мкл 0,1% NaOH в H₂O. 50 мкл этого 10 мг/мл раствора мономера Aβ(1-42) разводили 950 мкл 50 мМ NaHCO₃; pH 7,5, до концентрации 0,5 мг/мл. Раствор мономера Aβ(1-42) добавляли к 0,5 г промытых NHS-активированных сефарозных сфер, и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После центрифугирования при 3000× g в течение 5 минут, к сефарозным сферам добавляли 1 мл 50 мМ NaHCO₃/250 мМ этаноламина, pH 7,5, и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Образец переносили в хроматографическую колонку PolyPrep и 5 раз промывали 1 мл PBS (5 мМ NaH₂PO₄; 35 мМ NaCl; pH 7,4), а затем 5 раз промывали 1 мл TBS. После проведения последней стадии промывки, сефарозные сферы, несущие мономер Aβ(1-42), переносили в 1,5 мл-пробирку и хранили при 6°C до их использования.

Аффинная очистка поликлональных антител из проб мышиной плазмы:

Реагенты:

TBS (25 мМ триса; 150 мМ NaCl; pH 7,5)

Состав: Таблетки коктейля ингибиторов протеазы; Roche, cat.no.11697498001

1/10 TBS (2,5 мМ триса; 15 мМ NaCl; pH 7,5)

Элюирующий буфер: 0,58% CH₃COOH/140 мМ NaCl

Нейтрализующий буфер: 2 M триса/HCl; pH 8,5

Сефарозные сферы, несущие иммобилизованный усеченный олигомер мутеина Aβ

Сефарозные сферы, несущие мономер Aβ(1-42).

Антиген-специфические антитела, полученные путем иммунизации мышей усеченным олигомером мутеина Aβ, подвергали аффинной очистке с использованием смеси соответствующим образом усеченного олигомера мутеина Aβ и мономерного пептида Aβ(1-42) в качестве белков для аффинного захвата. Мономерный пептид Aβ(1-42) был использован для гарантии того, чтобы все анти-Aβ антитела, включая антитела, связывающиеся с не-глобуломерными эпитопами, например, антитела против sAPPα, мономерного или фибриллярного пептида Aβ, которые могут присутствовать в антисыворотке, были аффинно очищенными.

Процедура

250 мкл каждой пробы мышиной плазмы смешивали с 250 мкл TBS+1/50 готового препарата (1 таблетка, растворенная в 1 мл H₂O), и раствор центрифугировали в течение 10 минут при 10000× g. Супернатант удаляли и добавляли 50 мкл сефарозных сфер, несущих усеченный олигомер мутеина Aβ, соответствующий антигену, используемому для иммунизации мышей. После 5-минутного встряхивания при комнатной температуре добавляли 12,5 мкл сефарозных сфер, несущих усеченный мономер Aβ(1-42). Смесь встряхивали в течение 20 часов при комнатной температуре и при 1100 об/мин в термомиксере Эппендорфа (Eppendorf Thermomixer Comfort). Затем, сефарозные сферы переносили с использованием 2 × 100 мкл TBS в хроматографическую колонку PolyPrep, 4 раза промывали 250 мкл TBS и 2 раза промывали 250 мкл 1/10 TBS. После проведения последней стадии промывки, сферы два раза элюировали 100 мкл, а затем один раз 120 мкл 0,58% CH₃COOH/140 мМ NaCl. Элюат (приблизительно 250-270 мкл) собирали в 1,7 мл-пробирку, предварительно заполненную 22 мкл 2M триса/HCl, pH 8,5. После проведения стадии элюирования, образец сразу смешивали, а затем хранили при -80°C до его использования. Концентрацию белка аффинно очищенных поликлональных антител, выделенных из мышиной плазмы, определяли путем измерения уровня абсорбции каждого аффинно очищенного элюата на 280 нм по сравнению с TBS, который использовали в качестве эталонного контроля. Связывание аффинно очищенных поликлональных антител с глобуломером Aβ подтверждали с помощью прямого анализа ELISA.

Пример 5B-2: Аффинная очистка поликлональных антител из проб мышиной плазмы на магнитных сферах Dynabeads.

Иммобилизация усеченного олигомера мутеина Aβ на активированных тозилом сферах Dynabeads

Реагенты:

Сферы Dynabeads M-280, активированные тозилом, Invitrogen, cat.no.142-04; 2 × 1E09 сфер/мл

100 мМ бората натрия, pH 9,5

100 мМ бората натрия, pH 9,5+0,5% BSA

PBS (20 мМ NaH₂PO_4, 140 мМ NaCl, pH7,4)

PBS (20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH7,4)+0,1% BSA

PBS (20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH7,4)+0,1% BSA+0,02% азида натрия.

Процедура:

Маточную суспензию сфер Dynabeads гомогенизировали путем осторожного встряхивания для предотвращения образования пены. Затем брали 66 мкл суспензии и переносили в реакционный 1,5 мл-сосуд. Сферы Dynabeads промывали 2×2 минут 200 мкл 100 мМ бората натрия, pH 9,5. При проведении промывки, супернатант осторожно удаляли, а сферы Dynabeads иммобилизовали на стенках реакционного сосуда с использованием настольного магнитного сепаратора (MSS). Промытые сферы Dynabeads инкубировали со 100 мкг усеченного олигомера мутеина Aβ в 100 мМ бората натрия, pH 9,5. Образец встряхивали в течение 20 минут при 37°C. Затем, образец разводили 1:2 100 мМ бората натрия, pH 9,5+0,5% BSA, и встряхивали в течение ночи при 37°C. Сферы Dynabeads, несущие иммунизованный усеченный олигомер мутеина Aβ, промывали 2 × 5 минут (снова с использованием MSS) 200 мкл PBS и 2 × 5 минут 200 мкл PBS, 0,1% BSA, и наконец, ресуспендировали в 0,2 мл PBS, 0,1% BSA, 0,02% азида натрия, а затем быстро центрифугировали. Промытые сферы Dynabeads, несущие иммунизованный усеченный олигомер мутеина Aβ, хранили при 4°C до их использования.

Аффинная очистка pMAb из проб мышиной плазмы:

Реагенты:

PBS (20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH7,4)

PBST (PBS+0,05% твин 20)

PBST+0,5% BSA

Элюирующий буфер: 0,58% CH₃COOH/140 мМ NaCl

Нейтрализующий буфер: 2 M триса/HCl; pH 8,5

Сферы Dynabeads, несущие иммобилизованный усеченный олигомер мутеина Aβ.

Процедура:

10 мкл пробы мышиной плазмы разводили 80 мкл PBST+0,5% BSA. После этого добавляли 10 мкл сфер Dynabeads, несущих иммобилизованный усеченный олигомер мутеина Aβ. Иммунопреципитацию осуществляли путем встряхивания в течение ночи (~20 часов) при комнатной температуре. Сферы Dynabeads были иммобилизованы с использованием MSS. Супернатант осторожно удаляли и отбрасывали, и сферы Dynabeads промывали 1 × 5 минут 500 мкл PBST, 1 × 5 минут 500 мкл PBS и 1 × 3 минуты 500 мкл 2 мМ NaH₂PO₄, 14 мМ NaCl, pH 7,5. После последнего удаления промывочного буфера, реакционные сосуды снова один раз центрифугировали, а затем оставшуюся жидкость осторожно и тщательно удаляли. Сферы Dynabeads суспендировали в 25 мкл элюирующего буфера и встряхивали в течение 2 минут при комнатной температуре. Реакционные сосуды центрифугировали в течение 15 секунд при 4000 об/мин, снова возвращали в MSS, и супернатант (то есть, элюат) осторожно удаляли и добавляли к 975 мкл PBST+0,5% BSA. После этого добавляли 1 мкл нейтрализующего буфера, и образец сразу перемешивали приблизительно в течение 2-3 секунд. Связывание аффинно очищенных поликлональных антител с глобуломером Aβ подтверждали с помощью прямого ELISA.

Пример 5C: Анализ на селективность антител с помощью дот-блоттинга

Для оценки селективности иммунного ответа, индуцированного глобуломером мутеина Aβ(20-42), аффинно очищенную поликлональную антисыворотку анализировали на связывание с различными формами Aβ. Для этой цели получали серийные разведения отдельных форм Aβ в пределах от 100 пмоль/мкл до 0,00001 пмоль/мкл PBS, в который было добавлено 0,2 мг/мл BSA. 1 мкл каждого разведения подвергали блоттингу на нитроцеллюлозной мембране. Детектирование осуществляли путем инкубирования с соответствующими аффинно очищенными поликлональными антителами (0,2 мкг/мл) с последующим иммунологическим окрашиванием IgG, конъюгированным с пероксидазой (POD) (POD-конъюгированным антимышиным антителом, выделенным из мышиной сыворотки, и POD-конъюгированным антикроличьим антителом, выделенным из кроличьей сыворотки), и субстратом пероксидазы, используемым в качестве синего красителя BM (Roche).

Aβ-стандарты для дот-блот-анализа:

1. Глобуломер Aβ(12-42)

Глобуломер Aβ(12-42) получали как описано в Сравнительном примере 4.

2. Глобуломер Aβ(1-42)

Глобуломер Aβ(1-42) получали как описано в Сравнительном примере 3.

3. Глобуломер Aβ(20-42)

Глобуломер Aβ(20-42)получали как описано в Сравнительном примере 5.

4. Мономер Aβ(1-40), 0,1% NaOH

Мономер Aβ(1-40) получали как описано в Сравнительном примере 1.

5. Мономер Aβ(1-42), 0,1% NaOH

Мономер Aβ(1-42), 0,1% NaOH, получали как описано в Сравнительном примере 2.

6. Фибриллы Aβ(1-42), 0,1% NaOH

Фибриллы Aβ(1-42), 0,1% NaOH, получали как описано в Сравнительном примере 6.

7. sAPPα

sAPPα получали как описано в Сравнительном примере 7.

Материалы для дот-блот-анализа:

Серийное разведение Aβ-стандартов (см. выше 1-7) в 20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH 7,4+0,2 мг/мл BSA до концентраций: 100 пмоль/мкл, 10 пмоль/мкл, 1 пмоль/мкл, 0,1 пмоль/мкл, 0,01 пмоль/мкл, 0,001 пмоль/мкл, 0,0001 пмоль/мкл и 0,00001 пмоль/мкл;

Нитроцеллюлоза: Среда для переноса блота, чистая нитроцеллюлозная мембрана (0,2 мкм); BIO-RAD;

POD-конъюгированное антимышиное антитело: cat no: 715-035-150 (Jackson Immuno Research);

Детектирующий реагент: Субстрат POD BM, используемый в качестве синего преципитирующего красителя, cat no:11442066001 (Roche);

Альбумин бычьей сыворотки (BSA): cat no: 11926 (Serva);

Блокирующий реагент: 5% молоко с низким содержанием жира в TBS.

Буферные растворы:

Буфер TBS: 25 мМ Трис/HCl, pH 7,5+150 мМ NaCl;

Буфер TTBS: буфер 25 мМ Трис/HCl, pH 7,5+150 мМ NaCl+0,05% твин 20;

Буфер PBS+0,2 мг/мл BSA: 20 мМ NaH₂PO₄ pH 7,4+140 мМ NaCl+0,2 мг/мл BSA;

Раствор антитела I: 0,2 мкг/мл антитела в 20 мл 1% молока с низким содержанием жира в TBS.

Антитела:

Мышиное моноклональное анти-Aβ антитело, клон 6E10; концентрация: 1 мг/мл; cat. no.: SIG-39320 (Covance); хранение при 80°C;

Аффинно очищенные мышиные поликлональные анти-Aβ антитела, описанные в примере 5B-1, хранение при 80°C;

Раствор антитела II: для детектирования мышиных антител: разведение 1:5000 POD-конъюгированного антимышиного антитела в 1% молока с низким содержанием жира в TBS.

Дот-блот-анализ:

1) 1 мкл каждой из 8 концентраций различных Aβ-стандартов (полученных путем серийного разведения) наносили пятнами на нитроцеллюлозную мембрану на расстоянии приблизительно 1 см друг от друга.

2) Пятна Aβ-стандартов сушили на нитроцеллюлозной мембране на воздухе по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре (= дот-блот)

3) Блокирование: Дот-блот инкубировали с 30 мл 5% молока с низким содержанием жира в TBS в течение 1,5 часа при комнатной температуре

4) Промывка: Блокирующий раствор отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TTBS в течение 10 минут при комнатной температуре.

5) Раствор антитела I: Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали с раствором антитела I в течение 2 часов при комнатной температуре.

6) Промывка: Раствор антитела I отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TTBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TTBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TBS в течение 10 минут при комнатной температуре.

7) Раствор антитела II: Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали с раствором антитела II в течение 1 часа при комнатной температуре.

8) Промывка: Раствор антитела II отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TTBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TTBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промывочный буфер отбрасывали, и дот-блот инкубировали при встряхивании с 20 мл TBS в течение 10 минут при комнатной температуре.

9) Проявление окраски: Промывочный буфер отбрасывали. Окраску дот-блота проявляли в течение 5 минут с использованием 7,5 мл субстрата POD BM, дающего синюю окраску. Проявление окраски прекращали путем интенсивной промывки дот-блота водой (H₂O), pH 5,3 (pH корректировали путем добавления кристаллов дигидрофосфатной соли натрия).

10) Количественную оценку осуществляли с помощью денситометрического анализа интенсивности пятна на денситометре GS800 (BioRad) и с помощью пакета программ Quantity Оne, Version 4.5.0 (BioRad). Оценивали только те пятна, относительная плотность которых более, чем на 20% превышала относительную плотность последнего идентифицированного пятна глобуломера Aβ(20-42) с четко установленными оптическими свойствами. Это пороговое значение определяли независимо для каждого дот-блота. Вычисленное значение указывало на взаимосвязь между распознаванием глобуломера Aβ(20-42) и соответствующей формы Aβ для данного антитела.

Дот-блот-анализ осуществляли с использованием различных мышиных моноклональных (m6E10) и поликлональных анти-Aβ антител. Поликлональные анти-Aβ антитела получали путем активной иммунизации мышей усеченными олигомерами мутеина Aβ с последующей аффинной очисткой этих антител (см. пример 5). Отдельные формы Aβ добавляли в серийных разведениях и инкубировали с соответствующими антителами для иммунной реакции (1=глобуломер Aβ(1-42); 2=глобуломер Aβ(20-42); 3=мономер Aβ(1-40), 0,1%NaOH; 4=мономер Aβ(1-42), 0,1% NaOH; 5=фибриллярный препарат Aβ(1-42); 6=sAPPα (Sigma) (первое пятно: 1 пмоль); 7=глобуломер Aβ(12-42)). Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3: Данные количественного дот-блот-анализа мышиных поликлональных антител

A) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22A

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3	4
Глобуломер Aβ(1-42)	0,86	>10	>100	>100
Глобуломер Aβ(12-42)	2,82	1,97	1,98	2,61
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	76,55	>10	>100	>100
Мономер Aβ(1-42)	36,45	>10	>100	>100
Фибрилла Aβ(1-42)	269,51	>10	>100	>100
sAPPα	1,01	>10	>1	>1

B) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22A

(мышь, без адъюванта)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3	4
Глобуломер Aβ(1-42)	>1000	>1000	>10	>10
Глобуломер Aβ(12-42)	2,43	2,54	1,23	0,79
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>1000	>1000	>10	>10
Мономер Aβ(1-42)	1950,71	>1000	>10	>10
Фибрилла Aβ(1-42)	>1000	>1000	>10	>10
sAPPα	>10	>10	1-10	>0,38

C) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ F20G,E22A

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3
Глобуломер Aβ(1-42)	4,91	0,01	0,05
Глобуломер Aβ(12-42)	1,61	0,30	0,23
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>10	2,81	13,41
Мономер Aβ(1-42)	>10	>10	0,44
Фибрилла Aβ(1-42)	>10	15,56	>10
sAPPα	0,29	1-10	0,001

D) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ G25V

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2
Глобуломер Aβ(1-42)	>100	>10
Глобуломер Aβ(12-42)	>100	0,72
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>100	>10
Мономер Aβ(1-42)	>100	>10
Фибрилла Aβ(1-42)	>100	>10
sAPPα	>1	1-10

E) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22A

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3	4
Глобуломер Aβ(1-42)	3,51	1,27	233,46	49,86
Глобуломер Aβ(12-42)	0,68	1,82	3,65	4,99
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	286,00	>100	>100	>100
Мономер Aβ(1-42)	19,78	31,74	272,33	>100
Фибрилла Aβ(1-42)	172,65	125,59	>100	>100
sAPPα	0,092	0,039	1	>1

F) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22A, G25A

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3	4
Глобуломер Aβ(1-42)	1323,08	2171,70	>1000	1864,35
Глобуломер Aβ(12-42)	1,74	5,32	2,75	1,92
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>1000	3203,50	3899,23	3119,49
Мономер Aβ(1-42)	1063,72	395,32	4406,81	724,17
Фибрилла Aβ(1-42)	>1000	2687,77	>1000	2896,99
sAPPα	43,11	31,29	45,86	72,75

G) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22A, S26A

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2	3	4
Глобуломер Aβ(1-42)	4,45	0,09	76,46	>1
Глобуломер Aβ(12-42)	0,46	0,18	2,12	1,39
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>10	5,96	>100	>1
Мономер Aβ(1-42)	9,98	0,40	408,41	>1
Фибрилла Aβ(1-42)	2,37	0,01	>100	>1
sAPPα	1-10	0,0047	>1	10-100

H) Иммунизация усеченным олигомером мутеина Aβ E22F

(мышь, адъювант квасцы)

Антиген	Мышиные поликлональные антитела #
1	2
Глобуломер Aβ(1-42)	350,78	3116,21
Глобуломер Aβ(12-42)	1,35	1,57
Глобуломер Aβ(20-42)	1	1
Мономер Aβ(1-40)	>1000	528,23
Мономер Aβ(1-42)	>1000	812,97
Фибрилла Aβ(1-42)	87,19	11,56
sAPPα	8,58	83,83

Результаты дот-блот-анализа показали, что иммунизация мышей усеченными олигомерами мутеина Aβ стимулирует в высокой степени селективный иммунный ответ на эпитоп глобуломера Aβ, который также ранее наблюдался для глобуломера Aβ(20-42) дикого типа. В дот-блот-анализе, распознавание поликлонального иммунного ответа тестировали для глобуломера Aβ(20-42) дикого типа, который представляет собой глобуломерный эпитоп, присутствующий в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Авторам настоящего изобретения было высказано предположение, что усеченные олигомеры мутеина Aβ не присутствуют в организме человека. Однако, иммунизация усеченными олигомерами мутеина Aβ приводит к вырабатыванию иммунного ответа, который, при желании, может быть использован для распознавания эпитопа глобуломера Aβ дикого типа. Таким образом, как и предполагалось, активная иммунизация усеченными олигомерами мутеина Aβ может оказаться эффективной для устранения когнитивных дефектов у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера, поскольку профиль дот-блотов поликлональной антисыворотки, вырабатывающей гуморальный ответ, сравним с профилем ответа, вырабатываемого посредством активной иммунизации глобуломером Aβ(20-42) дикого типа, что указывает на распознавание глобуломерных эпитопов in vivo. Было подтверждено, что это свойство позволяет устранять когнитивные дефекты у индивидуума, участвующего в тесте на узнавание объекта.

Пример 6: Определение перекрестных реакций с PF-4 в плазме собакоподобных обезьян с помощью комплексного анализа «сэндвич»-ELISA

Пример 6A: Способность мышиных поликлональных антител, аффинно очищенных с использованием сефарозных сфер, перекрестно реагировать с PF-4

Материалы:

Планшет: F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate cat. no. 439454

Связывающие антитела, используемые в эксперименте:

- поликлональные антитела, аффинно очищенные с использованием сефарозных сфер и выделенные из проб мышиной плазмы после иммунизации различными усеченными олигомерами мутеина Aβ, описанными в примере 5B-1;

- коммерчески доступное эталонное анти-PF4 антитело: моноклональное анти-HPF4 антитело (Abcam cat. no.: ab49735).

Буфер для нанесения покрытия: 100 мМ бикарбоната натрия; pH 9,6;

Блокирующий реагент для ELISA; Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 1112589;

PBST-Буфер: 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl; 0,05% твин 20; pH 7,4;

PBST+0,5% BSA-буфер: 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl; 0,05% твин 20; pH 7,4+0,5% BSA; Serva cat.11926;

Плазма собакоподобных обезьян: EDTA-пул плазмы собакоподобных обезьян, взятой у 13 различных доноров и хранящейся при 30°C;

Ингибитор трипсина: Sigma cat. no.T7902;

Сравниваемое антитело: антимышиный IgG (Fc-специфический; продуцируемый у коз; Sigma cat. no.: M3534; 2,3 мг/мл; хранение при -20°C);

Детектирующее антитело: поликлональное кроличье анти-PF-4 антитело pRAb-HPF4; 0,5 мг/мл; Abcam cat. no.ab9561;

Реагент для мечения: конъюгат антимышиное антитело-POD; Jackson ImmunoResearch Ltd. Cat. No.: 111-036-045;

Окрашивающий раствор: 42 мМ TMB (Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 92817060) в ДМСО; 3% H₂O₂ в воде; 100 мМ ацетат натрия, pH 4,9;

Раствор для прекращения реакции: 2M сульфоновая кислота;

Получение реагентов:

Сравниваемое антитело: Сравниваемое антитело разводили до концентрации 10 мкг/мл в буфере для нанесения покрытий.

2. Блокирующий раствор:

Блокирующий реагент растворяли в 100 мл воды для получения блокирующего маточного раствора, и 10 мл-аликвоты хранили при температуре -20°C. Для блокирования каждого планшета, 3 мл блокирующего маточного раствора разводили 27 мл воды.

Каждое связывающее антитело разводили буфером PBST+0,5% BSA до концентрации 3,16 мкг/мл (маточный раствор). Серийное разведение каждого аффинно очищенного препарата поликлонального антитела получали как описано ниже:

No	Объем разведения антитела	Объем буфера PBST+0,5% BSA	Конечная концентрация антитела
1	250 мкл маточного раствора	0 мл	3160 нг/мл
2	79 мкл (1)	171 мкл	1000 нг/мл
3	79 мкл (2)	171 мкл	316 нг/мл
4	79 мкл (3)	171 мкл	100 нг/мл
5	79 мкл (4)	171 мкл	31,6 нг/мл
6	79 мкл (5)	171 мкл	10 нг/мл
7	79 мкл (6)	171 мкл	3,16 нг/мл
8	0 мкл	250 мкл	Только буфер

Плазма собакоподобных обезьян:

5 мл пула плазмы собакоподобных обезьян центрифугировали в течение 10 минут при 10000× g. Затем брали 4,5 мл супернатанта и разводили 40,5 мл PBST+0,5% BSA (= разведению 1:10). Затем добавляли 450 мкл 10 мг/мл ингибитора трипсина в H₂O. После инкубирования в течение 10 минут при комнатной температуре, образец фильтровали через 0,22 мкм-фильтр (Millipore cat. no. SLGS0250S).

Реагент для мечения

Лиофилизованное POD-конъюгированное антикроличье антитело разводили в 0,5 мл воды. Затем добавляли 500 мкл глицерина, и 100 мкл-аликвоты хранили при -20°C до последующего использования. Концентрированный реагент для мечения разводили в буфере PBST. Коэффициент разведения составлял 1:5000. Реагент использовали сразу после его получения.

Панель связывающих антител на стандартном планшете. Числа означают конечную концентрацию связывающего антитела в нг/мл. Каждая концентрация каждого связывающего антитела представлена в дубликате.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Поликлональное антитело	Поликлональное антитело	Поликлональное антитело	Поликлональное антитело	Поликлональное антитело	Поликлональное антитело
A	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160	3160
B	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000
C	316	316	316	316	316	316	316	316	316	316	316	316
D	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
E	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6	31,6
F	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
G	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16	3,16
H	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0

Процедура:

1. Добавляли 100 мкл раствора сравниваемого антитела на лунку и инкубировали в течение ночи при 6°C.

2. Раствор антитела отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

3. Добавляли 265 мкл блокирующего раствора на лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

4. Блокирующий раствор отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

5. После получения серийных разведений для каждого связывающего антитела, в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл этих разведений антитела. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

6. Растворы антитела отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

7. Добавляли 100 мкл разведения 1:10 плазмы собакоподобных обезьян на лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

8. Раствор плазмы отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

9. Добавляли 100 мкл раствора «первого» антитела на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

10. Раствор «первого» антитела отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

11. Добавляли 200 мкл реагента для мечения на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

12. Реагент для мечения отбрасывали, и лунки три раза промывали 250 мкл PBST-буфера.

13. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора TMB.

14. По мере появления окраски проводили мониторинг интенсивности окрашивания планшета (5-15 минут при комнатной температуре), и реакцию завершали путем добавления 50 мкл/лунку раствора для прекращения реакции при появлении соответствующей окраски.

15. Измеряли оптическую плотность на 450 нм.

Анализ данных:

Концентрации связывающего антитела (X-величины) подвергали логарифмическому преобразованию по формуле: X=log(X). Затем строили график по данным логарифмических X-величин, где на оси X откладывали количество антител (выраженное в нг/мл). Полученные величины OD(450 нм) для соответствующего PBST-контроля, представленные в ряду H, вычитали из величин серийных разведений поликлонального мышиного антитела, представленных в каждом столбце рядов A-G. Полученные скорректированные по фону величины OD(450 нм) откладывали на графике по оси Y. Кривые зависимости эффекта концентрации строили по данным путем подбора кривой с использованием «четырехпараметрического логистического уравнения» методом «наименьших квадратов (стандартным методом)» (этот метод идентичен методу построения кривой «сигмоидальной кривой доза-ответ» (с «переменной угла наклона кривой») путем анализа данных с помощью компьютерной программы GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.). Построение кривой осуществляли лишь в целях визуализации данных, но не в целях использования этой кривой для последующих вычислений, то есть, не для вычисления площади под кривой. Площадь под кривой (AUC или общую площадь под пиком) определяли не по данным построенной кривой, а по логарифмическим X-величинам и величинам OD (450 нм) в определенном интервале (конечных разведений плазмы от 3,16 нг/мл до 3160 нг/мл). Нижеследующие вычисления проводили при анализе данных, осуществляемом с помощью компьютерной программы GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.):

- Базовое значение устанавливали на Y=0,0.

- Минимальная высота пика: пики, которые находились на расстоянии менее, чем 10% от минимума до максимума на оси Y, не учитывали

- Направление пика: по определению, все пики должны превышать базовые значения.

Для каждого отдельного антитела, коэффициент дискриминации PF4 вычисляли с использованием коммерчески доступного анти-HPF4 антитела (Abcam cat. no.: ab49735) как эталонного антитела для распознавания PF4, где

Результаты примера 6A представлены в таблицах 4A, 4B и 4C.

Таблицы 4A-C: AUC (или общая площадь пиков), вычисленная по логарифмическим данным

A
Эксперимент 1	Адъювант	AUC	Средняя AUC анти-HPF4	Отношение AUC
анти-HPF4 антитело	н.a.	2,939	2,79	1,00
анти-HPF4 антитело	н.a.	2,631
mMAb 7C6	н.a.	1,577		1,77
mMAb 4D10	н.a.	0,127		21,93
мышиный 1 (дик.типа.)	CFA	0,512		5,44
мышиный 2 (дик.типа)	CFA	0,610		4,57
мышиный 3 (дик.типа)	CFA	2,993		0,93
мышиный 4 (дик.типа)	CFA	0,675		4,13
мышиный 37 (E22A)	CFA	0,115		24,15
мышиный 38 (E22A)	CFA	0,053		52,33
мышиный 39 (E22A)	CFA	0,097		28,57
мышиный 40 (E22A)	CFA	0,083		33,57
мышиный 73 (E22A)	CFA	0,017		159,23
мышиный 74 (E22A)	CFA	0,002		1274,02
мышиный 75 (E22A)	CFA	0,013		217,58
мышиный 76 (E22A)	CFA	0,036		76,36
мышиный 41 (D23A)	CFA	0,356		7,83
мышиный 42 (D23A)	CFA	0,110		25,41
мышиный 43 (D23A)	CFA	0,098		28,28
мышиный 44 (D23A)	CFA	0,045		61,71
мышиный 49 (S26A)	CFA	3,099		0,90
мышиный 50 (S26A)	CFA	0,696		4,00
мышиный 51 (S26A)	CFA	0,352		7,92
мышиный 52 (S26A)	CFA	0,143		19,43

B
Эксперимент 1	Адьювант	AUC	Отношение AUC
анти-HPF4 антитело	н.a.	3,784	1,00
mMAb 7C6	н.a.	2,882	1,31
mMAb 4D10	н.a.	0,243	15,57
m13 WT	Квасцы	1,287	2,94
m14 WT	Квасцы	3,557	1,06
m15 WT	Квасцы	3,999	0,95
Эксперимент 2
анти-HPF4	н.a.	3,844	1,00
m17 E22A	Квасцы	0,150	25,70
m18 E22A	Квасцы	0,228	16,88
m19 E22A	Квасцы	0,100	38,44
m20 E22A	Квасцы	0,069	55,61
m21 E22A	Квасцы	0,040	96,80
Эксперимент 3
анти-HPF4 антитело	н.a.	3,868	1,00
m22 E22A	Квасцы	0,112	34,66
m23 E22A	Квасцы	0,168	23,04
m24 E22A	Квасцы	0,152	25,43
m25 G25A	Квасцы	2,929	1,32
m26 G25A	Квасцы	0,250	15,47
Эксперимент 4
анти-HPF4 антитело	н.a.	3,637	1,00
mMAb 7C6	н.a.	2,997	1,21
mMAb 4D10	н.a.	0,248	14,64
m28 G25A	Квасцы	2,779	1,31
m29 G25A	Квасцы	1,167	3,12
m31 G25A	Квасцы	0,557	6,53

C
Эксперимент 1	Адьювант	AUC	Отношение AUC
анти-HPF4 антитело	н.a.	3,043	1,00
m1 дикого типа	Квасцы	0,065	47,00
m2 дикого типа	Квасцы	0,063	48,21
m3 дикого типа	Квасцы	2,288	1,33
m4 дикого типа	Квасцы	0,254	11,96
m5 E22A	Квасцы	0,018	167,66
m6 E22A	Квасцы	0,084	36,40
m7 E22A	Квасцы	0,029	104,00
m8 E22A	Квасцы	0,047	65,27
m9 E22A - Квасцы	Квасцы	0,064	47,47
m10 E22A - Квасцы	Квасцы	0,019	161,95
m11 E22A - Квасцы	Квасцы	0,125	24,40
m12 E22A - Квасцы	Квасцы	0,024	125,54
m13 F20G,E22A	Квасцы	0,057	53,42
m14 F20G,E22A	Квасцы	0,001	4642,97
m15 F20G,E22A	Квасцы	0,039	78,77
m17 G25T	Квасцы	0,076	40,11
m18 G25T	Квасцы	1,639	1,86
m19 G25T	Квасцы	0,026	116,46
m20 G25T	Квасцы	1,657	1,84
m21 G25V	Квасцы	0,022	140,75
m22 G25V	Квасцы	0,031	99,77
m23 G25V	Квасцы	0,020	148,87
Эксперимент 2
анти-HPF4 антитело	н.a.	2,862	1,00
m24 G25V	Квасцы	0,012	247,15
m25 E22V	Квасцы	0,053	54,39
m26 E22V	Квасцы	0,066	43,59
m27 E22V	Квасцы	0,061	47,21
m28 E22V	Квасцы	0,053	53,88
m29 E22A,G25A	Квасцы	0,040	70,82
m30 E22A,G25A	Квасцы	0,037	78,28
m31 E22A,G25A	Квасцы	0,101	28,22
m32 E22A,G25A	Квасцы	0,012	238,90
m33 G25A,S26A	Квасцы	0,141	20,37
m34 G25A,S26A	Квасцы	0,004	751,18
m35 G25A,S26A	Квасцы	0,043	66,56
m36 G25A,S26A	Квасцы	0,092	30,99
m37 E22A,S26A	Квасцы	0,047	61,06
m38 E22A,S26A	Квасцы	0,155	18,49
m39 E22A,S26A	Квасцы	0,039	74,03
m40 E22A,S26A	Квасцы	0,022	132,38
m41 D23K	Квасцы	0,112	25,67
m43 S26L	Квасцы	0,022	130,86
m44 S26L	Квасцы	0,328	8,72
m45 E22F	Квасцы	0,066	43,12
m46 E22F	Квасцы	0,041	70,04

Пример 6В: Способность мышиных поликлональных антител, аффинно очищенных с использованием магнитных сфер Dynabeads, перекрестно реагировать с PF-4

Материалы и препараты реагентов были такими же как в примере 6А, за исключением того, что в данном эксперименте использовали связывающие антитела:

- поликлональные антитела, аффинно очищенные с использованием активированных сфер Dynabeads и выделенные из проб мышиной плазмы после иммунизации различными усеченными олигомерами мутеина Aβ, описанными в примере 5B-2

- коммерчески доступное эталонное анти-PF4 антитело: моноклональное анти-HPF4 антитело (Abcam cat. no.: ab49735)

Образцы, полученные как описано в примере 5B-2 после аффинной очистки мышиной плазмы на магнитных сферах Dynabeads, предварительно разводили 1:100. Этот аффинно очищенный маточный раствор плазмы использовали здесь для последующих серийных разведений. Серийные разведения каждого аффинно очищенного препарата поликлонального антитела приготавливали как описано ниже:

No	Объем разведения антитела	Объем буфера PBST+0,5% BSA	Промежуточный коэффициент разведения плазмы	Конечный коэффициент разведения плазмы
1	250 мкл маточного раствора (предварительно разведенного 1:100)	0 мл	Использовали в исходном разведении	1:100
2	50 мкл (1)	200 мкл	1:5	1:500
3	50 мкл (2)	200 мкл	1:25	1:2500
4	50 мкл (3)	200 мкл	1:125	1:12500

Плазму собакоподобных обезьян и реагент для мечения получали как описано в примере 6A.

Панель связывающих антител на стандартном планшете. Числа означают разведения связывающих антител. Каждая концентрация каждого связывающего антитела представлена в дубликате.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Поликлональное антитело

Поликлональное антитело

Поликлональное антитело

Поликлональное антитело

Поликлональное антитело

Поликлональное антитело

A

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

B

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

C

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

D

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

E

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

1:100

PBST

PBST

F

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

1:500

PBST

PBST

G

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

1:2500

PBST

PBST

H

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

1:12500

PBST

PBST

Процедуру проводили как описано в примере 6A.

Анализ данных:

Коэффициенты разведения связывающих антител (X-величины) подвергали логарифмическому преобразованию по формуле: X=log(X). Затем строили график по данным логарифмических X-величин, где на оси X откладывали разведение плазмы (1:Х). Полученные величины OD(450 нм) для соответствующего PBST-контроля, представленные в ряду H, вычитали из величин серийных разведений плазмы, представленных в каждом столбце. Полученные скорректированные по фону величины OD(450 нм) откладывали на графике по оси Y. Кривые зависимости эффекта разведения строили по данным путем подбора кривой с использованием «четырехпараметрического логистического уравнения» методом «наименьших квадратов (стандартным методом)» (этот метод идентичен методу построения кривой «сигмоидальной кривой доза-ответ» (с «переменной угла наклона кривой») путем анализа данных с помощью компьютерной программы GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.). Построение кривой осуществляли лишь в целях визуализации данных, но не в целях использования этой кривой для последующих вычислений, то есть, не для вычислений площади под кривой. Площадь под кривой (AUC или общую площадь под пиком) определяли не по данным построенной кривой, а по логарифмическим X-величинам и величинам OD (450 нм) в определенном интервале (конечных коэффициентов разведений плазмы от 1:100 до 1:12500). Нижеследующие вычисления проводили при анализе данных, осуществляемом с помощью компьютерной программы GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.):

- Базовое значение устанавливали на Y=0,0.

- Минимальная высота пика: пики, которые находились на расстоянии менее, чем 10% от минимума до максимума на оси Y, не учитывали

- Направление пика: По определению, все пики должны превышать базовые значения.

Сравнительный пример 1

Мономер Aβ(1-40) (0,1% NaOH)

1 мг Aβ(1-40) (Bachem Inc., cat. no. H-1194) растворяли в 232,6 мкл 0,1% NaOH в H₂O (в свежеприготовленном растворе) (= 4,3 мг/мл=1 нмоль/1 мкл) и сразу встряхивали в течение 30 секунд при комнатной температуре с получением прозрачного раствора. Образец хранили при -20°C до последующего использования.

Сравнительный пример 2

Мономер Aβ(1-42) (0,1% NaOH)

1 мг Aβ(1-42) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) растворяли в 222,2 мкл 0,1% NaOH в H₂O (в свежеприготовленном растворе) (= 4,5 мг/мл=1 нмоль/1 мкл) и сразу встряхивали в течение 30 секунд при комнатной температуре с получением прозрачного раствора. Образец хранили при -20°C до последующего использования.

Сравнительный пример 3

Глобуломер Aβ(1-42)

Синтетический пептид Aβ(1-42) (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) суспендировали в 100% 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (HFIP) при 6 мг/мл и инкубировали для полной солюбилизации при встряхивании в течение 1,5 часа при 37°C. HFIP действует как агент, разрывающий водородную связь, а поэтому он был использован для устранения уже имеющихся структурных несоответствий в пептиде Aβ. HFIP удаляли путем выпаривания в SpeedVac и Aβ(1-42) ресуспендировали при концентрации 5 мМ в диметилсульфоксиде, а затем обрабатывали ультразвуком в течение 20 секунд. Aβ(1-42), предварительно обработанный HFIP, разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (20 мМ NaH₂PO4, 140 мМ NaCl, pH 7,4) до концентрации 400 мкM и добавляли 1/10 объема 2% додецилсульфата натрия (ДСН) (в H₂O) (в конечной концентрации 0,2% ДСН). После инкубирования в течение 6 часов при 37°C сразу получали глобуломер Aβ(1-42) с отсечкой молекулярной массы 16/20 кДа. Глобуломер Aβ(1-42) с отсечкой молекулярной массы 38/48 кДа получали путем последующего разведения тремя объемами H₂О и инкубировали в течение 18 часов при 37°C. После центрифугирования при 3000× g в течение 20 минут, образец концентрировали путем ультрафильтрации (с отсечкой молекулярной массы 30 кДа), диализовали против 5 мМ NaH₂PO₄, 35 мМ NaCl, pH 7,4, центрифугировали при 10000× g в течение 10 минут, и супернатант, содержащий глобуломер Aβ(1-42) с отсечкой молекулярной массы 38/48 кДа, удаляли.

Сравнительный пример 4

Глобуломер Aβ(12-42)

2 мл препарата глобуломера Aβ(1-42), полученного как описано в сравнительном примере 3, смешивали с 38 мл буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ хлорида натрия, pH 7,4) и 150 мкл 1 мг/мл эндопротеиназы GluC (Roche) в воде. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре, и добавляли еще 150 мкл of a 1 мг/мл эндопротеиназы GluC (Roche) в воде. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 16 часов, а затем добавляли 8 мкл 5 M раствора DIFP. Реакционную смесь концентрировали приблизительно до 1 мл в центрифужной 15 мл-пробирке Centriprep с отсечкой молекулярной массы 30 кДа. Концентрат смешивали с 9 мл буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ хлорида натрия, pH 7,4) и снова концентрировали до 1 мл. Концентрат диализовали при 6°C против 1 л буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ NaCl) в диализной трубке в течение 16 часов. Диализат доводили до концентрации ДСН=0,1% путем добавления 1%-го раствора ДСН в воде. Образец центрифугировали при 10000× g в течение 10 минут, и супернатант глобуломера Aβ(12-42) удаляли.

Сравнительный пример 5

Глобуломер Aβ(20-42)

1,59 мл препарата глобуломера Aβ(1-42), полученного как описано в сравнительном примере 3, смешивали с 38 мл буфера (50 мМ MES/NaOH, pH 7,4) и 200 мкл 1 мг/мл раствора термолизина (Roche) в воде. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. После этого добавляли 80 мкл 100 мМ раствора EDTA, pH 7,4, в воде, и смесь доводили до концентрации ДСН=0,01% путем добавления 400 мкл 1%-го раствора ДСН. Реакционную смесь концентрировали приблизительно до 1 мл в центрифужной 15 мл-пробирке Centriprep с отсечкой молекулярной массы 30 кДа. Концентрат смешивали с 9 мл буфера (50 мМ MES/NaOH, 0,02% ДСН, pH 7,4) и снова концентрировали до 1 мл. Концентрат диализовали при 6°C против 1 л буфера (5 мМ фосфата натрия, 35 мМ NaCl) в диализной трубке в течение 16 часов. Диализат доводили до концентрации ДСН=0,1% путем добавления 2%-го раствора ДСН в воде. Образец центрифугировали при 10000 × g в течение 10 минут, и супернатант глобуломера Aβ(20-42) удаляли.

Сравнительный пример 6

Фибриллы Aβ

1 мг Aβ(1-42) (Bachem Inc. Catalog Nr.: H-1368) растворяли в 500 мкл водного 0,1% NH₄OH (в пробирке Эппендорфа), и образец перемешивали в течение 1 минуты при комнатной температуре. Образец центрифугировали в течение 5 минут при 10000× g и супернатант удаляли. 100 мкл этого свежеприготовленного раствора Aβ(1-42) нейтрализовали 300 мкл 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl, pH 7,4. pH доводили до 7,4 путем добавления 1% HCl. Образец инкубировали в течение 24 часов при 37°C и центрифугировали (10 минут при 10000× g). Супернатант отбрасывали и фибриллярный осадок два раза промывали 400 мкл 20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH 7,4, и наконец, ресуспендировали с 400 мкл 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl, pH 7,4, путем вихревого перемешивания в течение 1 минуты.

Сравнительный пример 7

sAPPα

Этот препарат поставлялся компанией Sigma (cat. no. S9564; 25 мкг в 20 мМ NaH₂PO₄; 140 мМ NaCl; pH 7,4). sAPPα разводили 20 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH 7,4, 0,2 мг/мл BSA до концентрации 0,1 мг/мл (= 1 пмоль/мкл).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ABBVIE DEUTSCHLAND GMBH & CO. KG

<120> Иммуногенные продукты, полученные на основе аминокислотных

последовательностей мутеинового амилоида β(aβ), и способы их применения

<130> ABV12075WOO1

<140> PCT/EP2015/065362

<141> 2015-07-06

<150> 62/021,308

<151> 2014-07-07

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 2

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 3

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly

1 5 10 15

Leu Met Val Gly Gly Val

20

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 4

Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn

1 5 10 15

Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val

20 25

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 5 Leu Met Val Gly Gly

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213>

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 6

Gly Leu Met Val Gly Gly Val

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 7

Gly Leu Met Val Gly Gly Val

1 5

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 8

Phe Phe Ala

1

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 9

Ala Ile Ile

1

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 10

Val Gly Ser Asn

1

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 11

Asp Val Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 12

<211> 70

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 12

Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr

1 5 10 15

Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala

20 25 30

Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly

35 40 45

Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile

50 55 60

Lys Lys Leu Leu Glu Ser

65 70

<210> 13

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность e

<220>

<221> Источник

<223> примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 13

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Ala Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 14

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 14

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Ala Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 15

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 15

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Ala Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 16

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 16

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Phe Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 17

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 17

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Val Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 18

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 18

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Leu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 19

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 19

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Lys Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 20

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 20

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Leu Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 21

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 21

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Val Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 22

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 22

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Gly Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 23

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 23

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Gly Ala Ala Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 24

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 24

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Ala Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ala Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 25

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 25

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Cys Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Cys Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 26

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 26

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Gln Leu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 27

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 27

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Leu Gln Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 28

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 28

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Gln Glu Asn Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 29

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 29

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Ala Asp Val Ala Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 30

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> / примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 30

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Ala Asp Val Gly Ala Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> /примечание= «Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 31

His His His His His His

1 5

<---

1. Иммуногенный продукт, который представляет собой усеченный мутеиновый олигомер Aβ для индуцирования иммунного ответа против амилоидоза и содержит усеченную на N-конце форму олигомера Aβ-мутеина, которую получают путем ограниченного протеолитического расщепления неусеченного олигомера мутеина Aβ, при этом неусеченный олигомер мутеина Aβ содержит множество аминокислотных последовательностей, полученных из последовательности Aβ согласно SEQ ID NO: 1 одной или двумя заменами аминокислот:

i) где

– одиночный мутант содержит единственную мутацию в положении F20, A21, E22, D23, V24, G25 или S26, и

- двойной мутант содержит две мутации в положениях (F20/E22), (E22/G25), (E22/S26) или (G25/S26),

где заместители выбраны из следующих значений:

Аминокислота	Замещена с помощью
F20	C, A, G
A21	G, L, Q
E22	V, L, F, A, Q, G, K, D
D23	K, V, L, N, A
V24	A
G25	V, T, A
S26	A, L

и

ii) реагирует с моноклональным антителом 4d10, получаемым из гибридомы, обозначенной в Американской коллекции типовых культур под депозитарным номером PTA-7405, где моноклональное антитело предпочтительно связывает продукт с K_D 1x10^-6 М или более высокой аффинностью.

2. Продукт по п. 1, который содержит аминокислотные замены, выбранные из:

- одиночного мутанта E22A, E22F, E22V, D23A, D23K, G25A, G25V, G25T, S26A и S26L, и

- двойного мутанта, выбранного из: (F20G, E22A), (E22A, G25A), (E22A, S26A) и (G25A, S26A).

3. Продукт по п. 1 или 2, способный продуцировать поликлональную антисыворотку, где поликлональная антисыворотка обладает аффинностью связывания с глобуломером Aβ, которая по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антисыворотки по меньшей мере с одной формой Aβ, выбранной из группы, состоящей из мономерной формы Aβ(1-42), мономерной формы Aβ(1-40), фибрилломерной формы Aβ(1-42) и фибрилломерной формы Aβ(1-40);

где глобуломер Aβ предпочтительно выбран из глобуломеров Aβ(1-42), глобуломеров Aβ(12-42) и глобуломеров Aβ(20-42).

4. Продукт по любому из пп. 1-3, способный продуцировать поликлональную антисыворотку, где поликлональная антисыворотка обладает аффинностью связывания с глобуломером Aβ(20-42), которая по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, а предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, например, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 50 раз, а более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, например, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз или по меньшей мере в 500 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз, например, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз или по меньшей мере в 5000 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 10000 раз, например, по меньшей мере в 20000 раз, по меньшей мере в 30000 раз или по меньшей мере в 50000 раз, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100000 раз превышает аффинность связывания антисыворотки по меньшей мере с одним глобуломером Aβ, выбранным из группы, состоящей из глобуломера Aβ(1-42) и глобуломера Aβ(12-42).

5. Продукт по любому из пп. 1-4, который также отличается одним из нижеперечисленных признаков:

(а) по меньшей мере часть указанной аминокислотной последовательности образует петлю, а предпочтительно β-шпилечную петлю;

(b) части аминокислотной последовательности продукта, соответствующего F₁₉F₂₀A₂₁ (SEQ ID NO: 8) и A₃₀I₃₁I₃₂ (SEQ ID NO: 9), присутствуют а антипараллельной ориентации;

(c) часть аминокислотной последовательности образует петлю, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇ (SEQ ID NO: 10) и D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈ (SEQ ID NO: 11).

6. Продукт по любому из пп. 1-5, который представляет собой олигомер, содержащий от 2 до 28 указанных аминокислотных последовательностей Aβ.

7. Продукт любому из пп. 1-6, который получают способом, включающим следующие стадии:

(a) растворения мутантного пептида Aβ, содержащего указанную мутантную аминокислотную последовательность Aβ, в растворителе;

(b) добавления амфипатического агента к раствору мутантного пептида Aβ; и

(c) инкубирования полученной смеси с образованием олигомера;

(d) протеолитического расщепления олигомера.

8. Продукт любому из пп. 1-7, который дополнительно характеризуется одним или более из нижеследующих признаков:

(а) первая аминокислотная последовательность L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈ (SEQ ID NO: 5) находится в параллельной ориентации по отношению ко второй аминокислотной последовательности L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈ (SEQ ID NО: 5), где межпротонное расстояние по меньшей мере для одной пары атомов, выбранных из группы, состоящей из M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(NH), G^A₃₇(NH)-G^B₃₈(NH), L^A₃₄(NH)-L^B₃₄(C_δH₃)_, M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(CγH₃), составляет от 1,8 до 6,5 ангстрем,

(b) первая аминокислотная последовательность G^A₃₃L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈V^A₃₉ (SEQ ID NO: 6) находится в параллельной ориентации по отношению ко второй аминокислотной последовательности G^B₃₃L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈V^B₃₉ (SEQ ID NO: 6), где межпротонное расстояние по меньшей мере для одной пары атомов, выбранных из группы, состоящей из G^A₃₃(NH)-G^B₃₄(NH), M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(NH), G^A₃₇(NH)-G^B₃₈(NH), L^A₃₄(NH)-L^B₃₄(C_δH₃)_, M^A₃₅(NH)-V^B₃₆(CγH₃), G^A₃₈(NH)-V^B₃₉(CγH₃) и V^A₃₉(NH)-V^B₃₉(CγH₃), составляет от 1,8 до 6,5 ангстрем;

(с) продукт содержит межмолекулярную параллельную β-складку, расположенную между двумя аминокислотными последовательностями Aβ, где межмолекулярная параллельная β-складка содержит первую аминокислотную последовательность G^A₃₃L^A₃₄M^A₃₅V^A₃₆G^A₃₇G^A₃₈V^A₃₉ (SEQ ID NO: 7) и вторую аминокислотную последовательность G^B₃₃L^B₃₄M^B₃₅V^B₃₆G^B₃₇G^B₃₈V^B₃₉ (SEQ ID NО: 7) и где предпочтительно пары атомов G^A₃₃(CO)-L^B₃₄(N), L^B₃₄(CO)-M^A₃₅(N), M^A₃₅(CO)-V^B₃₆(N), V^B₃₆(CO)-G^A₃₇(N) и G^B₃₇(CO)-G^A₃₈(N) могут быть расположены на расстоянии 3,3 ± 0,5 ангстрем, где CO означает атом кислорода остова, где углы фи (ϕ) остатков составляют от -180 до -30, а углы пси (φ) остатков составляют приблизительно от 60 до 180 или приблизительно от -180 до -150.

9. Продукт по любому из пп. 1-8, где мутантная аминокислотная последовательность Αβ является идентичной части (X-Y) мутантной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 15),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁F₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 16),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁V₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 17),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁L₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 18),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂K₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 19),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂L₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 20),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁E₂₂D₂₃V₂₄V₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 21),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉G₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 23),

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄A₂₅S₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 29) и

D₁A₂E₃F₄R₅H₆D₇S₈G₉Y₁₀E₁₁V₁₂H₁₃H₁₄Q₁₅K₁₆L₁₇V₁₈F₁₉F₂₀A₂₁A₂₂D₂₃V₂₄G₂₅A₂₆N₂₇K₂₈

G₂₉A₃₀I₃₁I₃₂G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉V₄₀I₄₁A₄₂T₄₃ (SEQ ID NO: 30),

где X выбран из группы, состоящей из чисел 4..18 или 12..18, или равен 18; а Y выбран из группы, состоящей из чисел 33..43, 33..42, 33..41 или 33..40, или представляет собой его перекрестносвязанное производное, где по меньшей мере 2 несмежных остатка аминокислотной последовательности ковалентно связаны друг с другом.

10. Продукт по п. 9, где (X-Y) предпочтительно выбран из группы, состоящей из (1-42), (4-42), (12-42) или (18-42).

11. Композиция для лечения или предупреждения амилоидоза, содержащая продукт, как определено в любом из пп. 1-10, где композиция предпочтительно представляет собой вакцину и, необязательно, содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, например адъювант, такой как Complete Freund’s Adjuvant (CFA), или адъювант, содержащий соль алюминия.

12. Продукт, как определено по любому из пп. 1-10, для применения при лечении или предупреждения амилоидоза, где продукт используется для активной иммунизации.

13. Продукт, как определено в любом из пп. 1-10, для применения в диагностике амилоидоза.

14. Продукт для применения по п. 12 или 13, где амилоидоз представляет собой болезнь Альцгеймера или синдром Дауна.