Ингибитор репликации коронавируса sars-cov-2 на основе гуминовых веществ

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению водорастворимых гуминовых веществ из бурого угля или из чаги для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2. Применение водорастворимых гуминовых веществ из бурого угля, полученных в результате экзотермической реакции измельченного бурого угля в смеси 2% аммиака и перекиси водорода, с последующим осаждением и переосаждением гуминовых веществ соляной кислотой, разведением в воде при рН 7,0-8,0, высушиванием, с или без обработки трипсином, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, которые при концентрации в диапазоне 14,34-23,1 мкг/мл проявляют 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero. Применение водорастворимых гуминовых веществ из чаги - базидального гриба Inonotus obliquus, полученных в результате экзотермической реакции измельченной чаги в смеси 2% аммиака и перекиси водорода, с последующим осаждением и переосаждением гуминовых веществ соляной кислотой, разведением в воде при рН 7,0-8,0, высушиванием, обработкой трипсином, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, которые при концентрации 23,447 мкг/мл проявляют 50%-ную противовирусную ингибирующую дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero. Вышеописанное применение гуминовых веществ эффективно для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 8 пр.

 

Настоящее изобретение относится к ингибитору репликации нового коронавируса SARS-CoV-2 на основе гуминовых веществ природного происхождения.

Вспышка пандемии Covid-19, начавшаяся в конце 2019 г. в Китае и распространившаяся по всему миру, представляет угрозу для человечества, поэтому актуален поиск субстанций, ингибирующих репликацию вируса, для создания новых лекарственных средств.

Гуминовые вещества (ГВ)- необходимая и обязательная составляющая часть всех обменных процессов в биосфере, они представляют собой высокомолекулярные гетерополимеры и являются частью объектов природного происхождения. Все гуминовые вещества образуются из органических остатков. Этот процесс получил название гумификация. Одним из наиболее вероятных в биосфере механизмов гумификации может быть признан биосинтез бактериями и грибами меланинов - предшественников гуминовых веществ [Попов А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование / Под ред. Е.И. Ермакова. - СПб.: Изд-во С. - Петерб. ун-та, 2004. - 248 с.].

Известно, что гриб чага Inonotusobliquus, растущий на живых березах, содержит в черных наростах (склероциях) не только меланин, но и гуминовые вещества, которые во многом определяют лекарственные свойства этого гриба [Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги //Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М-Л., Наука, 1966. - С. 49-56; Шашкина Н.Я., Шашкин П.Н., Сергеев А.В. Химические и медико-биологические свойства чаги (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40. - №10. - С. 37-44].

Основная часть гуминовых веществ устойчива к биохимическому расщеплению, поэтому они накапливаются в почве, а также входят в состав торфов, бурых углей, сапропелей. Гуминовые вещества есть почти повсюду в природе. Их содержание в морских водах 0,1-3 мг/л, в речных - 20 мг/л, а в болотах - до 200 мг/л. В почвах гуминовых веществ 1-12%, при этом больше всего их в черноземах. Лидеры по содержанию этих соединений - органогенные породы, к которым относятся уголь, торф, сапропель, горючие сланцы. Обычно гуматы получают из окисленного бурого угля (его еще называют леонардитом), потому что в нем гуминовых веществ содержится до 85%. Еще этот уголь удобен тем, что у него низкая теплотворная способность, поэтому его обычно сгребают в отвалы. Получается, что основной источник гуминовых веществ - отходы добычи бурого угля, а это полностью соответствует основным принципам «зеленой химии». Запасы бурого угля в мире превышают 1 трлн.т [Перминова И.В. Гуминовые вещества - вызов химикам XXI века // Химия и жизнь. - 2008. - 1. - С. 50-55].

Гумификацию-процесс превращения органических остатков в гуминовые вещества, ученые считают одним из величайших изобретений природы. В природе частично идет минерализация остатков, СО₂ возвращается в атмосферу, вода - растениям. Многочисленность функций гуминовых веществ обусловлены многообразием их по составу, молекулярным массам, свойствам. Наличие в ГВ разнообразных функциональных групп обуславливает, во-первых, участие этих соединений в химических реакциях окисления-восстановления, а во-вторых, реакционную способность в целом, включая ионный обмен и образование хелатных соединений. Будучи коллоидами, ГВ проявляют поверхностно-активные и электро-поверхностные свойства [Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере. Соросовский образовательный Журнал. - 1997. - №2 - С. 56-63].

В настоящее время, как в России, так и за рубежом, широко применяются БАД на основе гуминовых веществ: «Гумивит», «Мумие очищенное алтайское», «Гимилан», «Фульвомил» (Россия), «Oxyhumatek» (ЮАР), «Avirol™» (США), «Humic&FulvicAcid» (США), «VitalityBoostHA» (США), «ColloidalMineralsXLwithFulvicAcid» (Австралия), «RF2 LiquidPlantMinerals» (Канада). Ученые изучают фармакологические свойства гуминовых соединений с целью разработки на их основе лекарственных препаратов. Разработка методологических основ стандартизации гуминовых веществ в ряду «сырье - субстанция - препарат» является актуальной задачей. [Савченко И.А. Дорнеева И.Н., Лукша Е.А., Пасечник К.К. Биологическая активность гуминовых веществ: перспективы и проблемы их применения в медицине (обзор). // Медиаль, 2019. - №1 (23). - С. 54-60].

Известны несколько групп гуминовых веществ: гуминовые кислоты, растворяемые только в щелочных растворах; гиматомелановые кислоты, извлекаемые из сырого остатка (геля) гуминовых кислот этиловым спиртом; фульвокислоты, растворимые в воде, щелочных и кислых растворах; гумин - практически нерастворимое и неизвлекаемое вещество.

Для гуминовых кислот характерны нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперстность. Структурные единицы гуминовых кислот представляют собой ароматические конденсированные системы с боковыми цепями и гетероциклами. Функциональными группами являются карбоксильные, карбонильные, фенольные и спиртовые гидроксиды, хиноидные группировки, метоксилы, амино- и амидогруппы, моно-, ди-, полисахариды, пептиды, минеральные компоненты. Биологическая активность гуминовых кислот может быть обусловлена наличием в этих соединениях разнообразных функциональных групп; коллоидными свойствами и компонентным составом. Гуминовые кислоты связывают в прочные комплексы ионы металлов и органических токсикантов в воде и почве. Связанные вещества не так опасны, поскольку теряют биодоступность. Гуминовые кислоты имеют высокую сорбционную способность. Адсорбция гуминовыми кислотами включает не только физическое, но и химическое взаимодействие.

Гуминовые вещества из морских и озерных донных отложений и воды фракционировали на гуминовые кислоты и фульвокислоты. Установлено антимикробное действие 12 препаратов из этих соединений в отношении 11 штаммов анаэробных и 8 штаммов аэробных бактерий, а также 2 штаммов дрожжеподобных грибов. Это свидетельствует об участии гуминовых соединений в самоочищении морских и озерных вод [Kupryszewski G., Pempkowiak J., Kedzia A. The effect of humic substances isolatedfrom a variety ofmarine and lacustrineenvironments on differentmicroorganisms//Oceanologia, 43 (2), 2001. - 3. pp. 257-261].

Американская компания LaubBioChemicalsCorp.(Ньюпорт-Бич, Калифорния) была основана в 1996 году доктором Р. Дж. Лаубом, в первую очередь, для разработки синтетических и природных гуминовых соединений торговой марки HEPSYL для лечения ВИЧ- инфекции и других вирусных заболеваний. Показана высокая степень ингибирования таких вирусов, как HSV-1 и HSV-2 (вирус герпеса 1-го и 2-го типов, патент US 6,524,566, 2003), вирусов гриппа (типа А и В, патент №US 6,576,229, 2003 г.),вируса геморрагической лихорадки (патент US 6,524,567,2003), вируса HIV - вирус иммунодефицита человека(патент US 6,534,049,2003). Известно противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина (марки "Полифепан", рег. N 80/1211/3 - неспецифического энтерального сорбента) путем его окисления при 150-170°С в течение 0,5-1,5 ч и давлении 2,0-2,5 МПа [патент РФ №2172176, МПК А61К 35/78, опубл. 20.08.2001 г.]. Препарат эффективен против вируса простого герпеса 2-го типа, вируса гриппа типа A (PR-8), а также вируса саркомы Рауса BH-RSV(RAV-l) серологической подгруппы А.

Гуминовые вещества, являясь гетерополимерами, могут служить источником структурных фрагментов органических макромолекул при биосинтезе, происходящем в живых организмах [Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 1. Биохимический аспект (обзор литературы)// Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №1. - С. 11-18].

Известно, что гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия: адаптогенным, антитоксическим, гепатопротекторным, противомикробным, диуретическим и противовоспалительным действием [Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект. Обзор литературы)// Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №5. - С. 9-15.

Было показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека [Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова А.В. и др. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов // Российский иммунологический журнал. 2010. Т. 4 (13), №3. С. 255-260]. Наиболее активные фракции гуминовых соединений обладали выраженной противовирусной активностью в отношении пандемического вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1 pdm09): ID50=3,75 Mg/ml, IS=266; высокопатогенного вируса гриппа птиц A/Commongull/Chany/06 (H5N1): ID50=9,5 Mg/ml, IS=105; против Herpes simplex virus (HSVII): ID50=3,5 Mg/ml, IS=285; против Human immunodeficiency virus I (HIVI): ID50=2,7 Mg/ml, IS=370. [Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M., Durymanov A.G., Ananko G.G., Kosogova T.A, Miloshenko T.P., Redkin B.A., Teplyakova T.V. Antiviral Activity of Humic Substances// Third International Conference of CISIHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference da Rostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture)) EQT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42].

Известно применение природных гуминовых кислот, выделенных из почвы, для лечения ВИЧ-инфекции [заявка США №20040137085, МПК А61К 35/78, опубл. 15.07.2004 г.]. Препарат изготавливается американской компанией Aldrich Chemical Company и упоминается в заявке как AVC. Подавление ВИЧ-инфекции происходит при контакте лейкоцитов ВИЧ-инфицированного человека с препаратом гуминовой кислоты. Заявлен также метод иммуностимуляции интерлейкина-2, метод усиления иммунного ответа на вакцинацию с использованием гуминовой кислоты в качестве адъюванта при вакцинации пациента с ВИЧ-инфекцией.

Однако в указанной заявке США рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных об их применении для лечения других вирусных заболеваний.

Известно средство против передачи ВИЧ/СПИД половым путем, выполненное в виде суппозитория, содержащего фармакологически приемлемую основу и активную субстанцию (патент РФ №2531945, МПК А61К 35/02, опубл. 27.07.2014 г.). В качестве активной субстанции с анти-ВИЧ-активностью используют фракцию гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля, а в качестве основы используется масло какао или твердый кондитерский жир и эмульгатор. Выделение фракции гуминовых кислот (НАС-1) осуществляют путем обработки бурого угля 1%-ным раствором гидроксида натрия (NaOH) и нагревании смеси в течение 2 часов на кипящей водяной бане (при температуре 80°С). После охлаждения продукты реакции центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают один - два раза 100 мл 1%-ого раствора гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до рН 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°С в сушильном шкафу.

Известен патент на противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из окисленного бурого угля [Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Казачинская Е.И., Носик Н.Н., Носик Д.Н., Лобач О.А., Киселева И.А., Противовирусное средство на основе гуминовых кислот: пат. 2678986 С1 Рос. Федерация. №20118110484, заявл. 23.03.2018; опубл. 05.02.2019, Бюл. №4]. Средство обладает активностью против вируса гриппа A/H1N1/California/2009 (в концентрации 3-4 мкг/мл); против вируса герпеса 1 типа (в концентрации 45-55 мкг/мл); вируса герпеса 2 типа (в концентрации 100-150 мкг/мл); вируса Западного Нила (в концентрации 4,2-5,4 мкг/мл); вируса иммунодефицита человека (в концентрации 45-55 мкг/мл).Техническим результатом данного изобретения является получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.

Однако активность против коронавируса SARS-CoV-2 указанного средства на основе гуминовых кислот не проверялась.

Известны природные соединения, такие как флавоноиды [https://bioflavit.ru/wp-content/uploads/Taxifolin-basel-rus2.pdf], которые ингибируют основную протеазу SARS-CoV-1, и их эффективность была продемонстрирована с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) [Pillaiyar, Т.; Manickam, М; Namasivayam, V.; Hayashi, Y.; Jung, S. H. An over view of severe acute respiratory syndrome - coronavirus (SARS-CoV) 3CL protease inhibitors: Peptidomimetic sand small molecule chemotherapy. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6595-6628.].

Кроме того, в экспериментах in vivo биофлавоноид (-) таксифолин (дигидрокверцетин) проявляет активность против других вирусов, таких как вирус Коксаки В4. Известно, что лиственница сибирская (Larixsibirica) вырабатывает (-) - таксифолин, являющийся природным ресурсом для его экстракции. Кроме того, пищевые препараты, содержащие (-) - таксифолин, легко доступны в аптеках и некоторых компаниях, обеспечивая прямой и быстрый доступ к потенциальному противовирусному препарату. Примечательно, что (-) - таксифолин переносит семь водородных связей, что является самым высоким показателем в выборе противовирусных соединений. Поскольку водородные связи являются ключевым фактором, определяющим особенность лекарственного средства (-) - таксифолин может являться природной альтернативой предлагаемым ингибиторам СР-1-CP-11 [Wade, R.C.; Goodford, P.J. The role of hydrogen-bonds in drug binding. Progress in clinical and biological research. 1989, 289, P. 433-444].

Известно также, что содержащийся в водорослях гепарин способен блокировать коронавирус SARS-CoV-2 лучше, чем, например, препарат "Ремдесивир", который активно используют в США для лечения COVID-19 [Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 inv itro/ PaulS. Kwon, HanseulOh, Seok-JoonKwon, WeihuaJin, FumingZhang, KeithFraser, JungJooHong, Robert J. Linhardt&Jonathans. Dordick.CellDiscovery, volume 6, Article number: 50 (2020)]. Ученые целенаправленно исследовали свойства гепарина - известного всем антикоагулянта. Было доказано, что это вещество обладает исключительным связывающим свойством к спайковому белку (S-белку) SARS-CoV-2 и снижает активность данного вируса.

Наиболее близким аналогом по назначению (прототипом) является ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV на основе водного растительного экстракта, проявляющего доза-зависимую активность против SARS-CoV в тестах на клеточных культурах [заявка США №20080038382, МПК А61Р 31/12, опубл. 14.02.2008 г.]. В качестве водного растительного экстракта он содержит водный экстракт многолетнего травянистого растения Scutellariaspp, (вид рода Шлемник) эффективный для лечения пациента с инфекцией SARS-CoV. Указанное средство ингибирует инфекционность SARS-CoV приблизительно на 50% при самой высокой использованной концентрации (200 мкг/мл). Эффект зависит от дозы, учитывая, что при испытанной более низкой дозе наблюдается меньшее ингибирование. Значительно ингибирование на более высоком уровне было больше, чем рибавирин (100 мкг/мл).

Однако указанный наиболее близкий аналог -ингибитор коронавируса SARS-CoV не исследовался на активность против нового коронавируса SARS-CoV-2.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового природного ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе гуминовых веществ природного происхождения и расширение спектра средств против указанного коронавируса.

Указанный технический результат достигается тем, что в ингибиторе репликации коронавируса на основе водорастворимых веществ природного происхождения, проявляющих доза-зависимую противовирусную активность в тестах на клеточных культурах, согласно изобретения, в качестве водорастворимых веществ природного происхождения он содержит водорастворимые гуминовые вещества, полученные из бурого угля, или базидального гриба Inonotus obliquus, или смеси в соотношении 1:1 гуминовых веществ из бурого угля и меланина, полученного из базидального гриба Inonotus obliquus, ингибирующий водный раствор которого в диапазоне 8,279-23,447 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную доза-зависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.

Изобретение поясняется чертежами, приведенными на фиг. 1, А, Б - результаты измерения ОП (соответственно для образцов 20-51,20-55 ингибитора) в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат. По оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения.

Ниже приведены варианты получения заявляемого ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водорастворимой фракции гуминовых веществ природного происхождения.

Пример 1.Получение водорастворимой фракции гуминовых веществ из бурого угля, образец 20-50.

Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др. (RU 2678986 С1, 2019), но без обработки трипсином.

Бурый уголь взят с ТЭЦ-5 г. Новосибирска, привезенный с разреза Бородинский им. М.И. Щадова, поставщик - Акционерное общество « СУЭК- Красноярск».

К 25 г бурого угля (помол 0,25 мм на мельнице универсальной MF-10 basik IKA) добавляют 50 мл 2%-ного аммиака и 40 мл перекиси водорода (29-32% ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). Перемешивают до завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены, центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин, осаждают гуминовые вещества соляной кислотой, последовательно переосаждают пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. Далее высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит гуминовых веществ в количестве 2 мг в 1 мл стерильной воды.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,1 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 2. Получение смеси гуминовой кислоты из бурого угля и меланина из природного сырья чаги, образец 20-51.

Для этого 10 мг гуминовой кислоты (IC₅₀=14,34 мкг/мл) и 10 мг меланина из чаги(IC₅₀=8,188 мкг/мл), смешивают в соотношении 1:1, растворяют в 10 мл стерильной воды. Образец для испытаний содержит смесь гуминовых веществ(гуминовой кислоты и меланина) в количестве 2 мг в 1 мл стерильной воды.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор смеси в соотношении 1:1 гуминовой кислоты из бурого угля и меланина из чаги, имеющей ингибирующую дозу в концентрации 8,279 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 3. Биологически активная добавка к пище (БАД) Гимилан, образец 20-53.

Биологически активная добавка к пище (БАД) Гимилан производится в ООО «Биотехнологии» (660052 г. Красноярск, ул. Затонская 46 ж). Свидетельство о регистрации № RU.77.99.11.003.Е.003421.03.14; состав: комплекс гуминовых и фульвовых кислот из бурого угля. Производится на основании технических условий ТУ-9197-003-38605220-14. Дата регистрации: 26.03.2014.

Препарат Гимилан в жидкой форме в количестве 40 мл высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,292 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 4. Получение водорастворимой фракции гуминовых кислот из бурого угля с обработкой трипсином для уменьшения токсических веществ, образец 20-55.

Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др. (RU 2678986 С1, 2019 г.). Бурый уголь доставлен из Красноярского края с разреза Бородинский им. М.И. Щадова, поставщик - Акционерное общество « СУ ЭК- Красноярск».

К 25 г бурого угля(помол 0,25 мм на мельнице универсальной MF-10 basik IKA) добавляют 50 мл 2%-ного аммиака и 40 мл перекиси водорода (29-32% ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). Смесь перемешивают до завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены. Продукт центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин, осаждают гуминовые вещества соляной кислотой с последующим переосаждением пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. Препарат сушат при +30°С.

С целью уменьшения токсических веществ далее препарат обрабатывают трипсином. Для этого 1 г сухих гуминовых кислот растворяют в 20 мл стерильной воды, добавляют 1 мл Трис основания (ТУ 6.09-42-92-76 XY 1М 1.21 г в 10 мл) и 30 мкл трипсина (Trypsin-EDTA (0,05%о) in DPBS(lx) производство CAPRICORN). Смесь выдерживают 5 часов в термостате при +37С. Далее осаждают гуминовые вещества соляной кислотой, центрифугируют на центрифуге (настольная, Centra CL3) 20 мин при 4000 об/мин, доводят рН до 7-8 ед. и высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 14,34 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 5. Получение гуминовых кислот из аптечной чаги, образец

20-61. (Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др., RU 2678986 С1, 2019 г.). К навеске 25 г сухого измельченного до 1 мм на мельнице (мельница универсальная MF-10 basik IKA) сырья аптечной чаги, добавляют 100 мл 2%-ного аммиака и 80 мл перекиси водорода (29-32%) ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). После завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены смесь фильтруют через два капроновых фильтра, осаждают гуминовые кислоты соляной кислотой, последовательно переосаждают пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. с последующей сушкой при +30°С.

Далее берут 2,5 г полученных сухих гуминовых кислот из чаги, растворяют в 50 мл стерильной воды, добавляют 2,5 мл Трис основания (ТУ 6.09-42-92-76 XY 1М 1.21 г в 10 мл) и 75 мкл трипсина (Trypsin-EDTA (0,05%о) in DPBS(lx) производство CAPRICORN). Смесь выдерживают 5 часов в термостате при +37С и осаждают гуминовые соединения соляной кислотой. Осадок центрифугируют на центрифуге (настольная Centra CL3) 20 мин при 4000 об/мин, доводят рН до 7-8 ед. и высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ в виде кислот, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,447 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 6. Определение противовирусной активности образцов в отношении коронавируса SARS-Cov-2в культурах клеток Vero.

Клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Монослой клеток выращивали в 96-луночных планшетах (по 0,1-0,15 мл/лунку клеточной суспензии с концентрацией 1,0-1,5×10⁵кл./мл) в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США) с добавлением пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (0,25 мкг/мл) (Antibiotic-Antimycotic (100Х), («Gibco», США). При культивировании клеток с вирусом в качестве поддерживающей среды использовали питательную среду DMEM с антибиотиками, без сыворотки.

Вирус SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 с инфекционным титром 5,0±0,29 lg ТЦД₅₀/МЛ получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Концентрацию вируса определяли путем титрования в культуре клеток Vero при культивировании в течении 3 суток при 37°С, 5% СО₂ и влажности 85-90%. Титры вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД₅₀/МЛ) и представляли в виде М±m (±I95) для 95%-го доверительного уровня (195) [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976; 598 с; Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro.AcademicPress. 1996; 374 p.].

Колориметрический метод определения цитотоксичности и противовирусной активности препаратов in vitro.

Исследование цитотоксичности и противовирусной эффективности препаратов проводили колориметрическим методом по изменению оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое [Oestereich L., Ltidtke A., Wurr S., Rieger Т., Munoz-Fontela С, GtintherS. Successful treatment of advanced Ebola virus infection with T-705 (favipiravir) in a small animal model//Antiviral Research, 2014., 105: 17-21; Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkey pox and other orthopox virus infections//Antiviral Research., 2003., 57:13-23; Paragas J., Whitehouse C. A., Endy T. P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus// Antiviral Research. 2004, 62:21-25].

Для оценки эффективности каждого использовали 8 последовательных 3-кратных разведений препаратов. Начальная концентрация экстрактов на планшетах при оценке цитотоксичности и противовирусной активности препаратов составляла 300 мкг/мл.

При оценке противовирусной активности препаратов в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток Vero вносили по 0,1 мл разведений экстрактов в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия), а через 2 ч инкубации при 37°С, 5% СО₂ вносили по 0,1 мл разведения вируса в среде DMEM без сыворотки с множественностью инфицирования (MOI) 0,1 ТЦД₅₀/клетку. При такой множественности заражения цитопатическое действие вируса на монослой клеток через 3 суток инкубирования достигает не менее90% (контроль вируса без внесения препарата). Кроме того, в качестве «контроля клеток» использовали интактный монослой (без внесения вируса и препаратов).

Через 3 суток инкубирования в лунки планшета с монослоем клеток Vero в культуральную среду вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный 0,05 мл на1,5 часа при 37°С. После этого монослой клеток промывали двукратно физраствором, вносили лизирующий буфер и через 30 мин определяли оптическую плотность (ОП).

Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного ридера «Multiskan FC» (ThermoScientific, USA). Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат (фиг. 1, А, Б). При этом по оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения. По показателям ОП рассчитывали 50%-ю токсическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ю ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препарата при помощи ПО SoftMaxPro-4.0. ТС₅₀ - это величина концентрации препарата в лунке планшета, разрушающая50% клеток в монослое. IC₅₀ - это концентрация препарата, которая ингибирует репликацию вируса и сохраняет 50% клеток жизнеспособными.

На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) препарата: SI=TC₅₀:IC₅₀ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М.: ОАО «Издательство «Медицина». 2005; 832 с; Методические рекомендации по изучению специфической активности индукторов интерферонов. Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть первая/Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с].

Пример 8. Результаты определения противовирусной активности водорастворимых фракций гуминовых веществ в отношении коронавируса SARS-Cov-2 на клетках Vero.

В таблице 1 представлены результаты по оценке противовирусной активности гуминовых веществ в отношении коронавируса, штамма nCov/Victoria/1/2020.

Лучшими образцами по ингибированию репликации коронавируса, штамм nCov/Victoria/1/2020, в клеточной культуре Vero являются образцы: 20-51 и 0-55. Образец 20-51 - смесь гуминовой кислоты из бурого угля с меланином из чаги. Возможно, здесь проявляется синергетический эффект.

Образцы 20-50, 20-53 и 20-61 имеют сходные результаты (IC₅₀ составляет 23,1; 23,292 и 23, 447 мкг/ мл соответственно). У этих препаратов низкая токсичность и высокая активность против коронавируса SARS-Cov-2.

1. Применение водорастворимых гуминовых веществ из бурого угля, полученных в результате экзотермической реакции измельченного бурого угля в смеси 2% аммиака и перекиси водорода, с последующим осаждением и переосаждением гуминовых веществ соляной кислотой, разведением в воде при рН 7,0-8,0, высушиванием, с или без обработки трипсином, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, которые при концентрации в диапазоне 14,34-23,1 мкг/мл проявляют 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero.

2. Применение водорастворимых гуминовых веществ из чаги - базидального гриба Inonotus obliquus, полученных в результате экзотермической реакции измельченной чаги в смеси 2% аммиака и перекиси водорода, с последующим осаждением и переосаждением гуминовых веществ соляной кислотой, разведением в воде при рН 7,0-8,0, высушиванием, обработкой трипсином, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, которые при концентрации 23,447 мкг/мл проявляют 50%-ную противовирусную ингибирующую дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero.