Анти-ох40 антитела и их применение

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены новые анти-OX40 антитела, которые специфически связываются и активируют OX40, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая эти антитела, вектор экспрессии, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты, эукариотическая клетка-хозяин для получения анти-OX40 антител, которая трансформирована вектором экспрессии, и способ получения анти-OX40 антитела. Данная группа изобретений применяется для эффективного лечения злокачественных опухолей различной этиологии. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 16 табл., 8 пр.

 

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 119(e) раздела 35 U.S.C. предварительной патентной заявки США № 62/434761, поданной 15 декабря 2016 года, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

2. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит "Список последовательностей", представленный в электронном виде в формате ASCII и полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 30 октября 2017 года, называется 381493-368WO_SL.txt и имеет размер 97999 байт.

3. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Настоящая заявка относится, среди прочего, к новым анти-OX40 антителам, композициям, содержащим эти антитела, нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела, и к способам их получения и применения.

4. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Терапия злокачественных опухолей включает широкий спектр терапевтических подходов, включая хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Несмотря на то, что различные подходы дают врачу-практику широкий выбор методов лечения злокачественных опухолей, существующие терапевтические средства имеют ряд недостатков, таких как недостаточная избирательность нацеливания на злокачественные клетки по сравнению с нормальными, здоровыми клетками и развитие устойчивости злокачественной опухоли к лечению.

[0005] Недавно разработанные подходы, основанные на нацеленной терапии, которая влияет преимущественно на клеточные процессы злокачественных клеток по сравнению с нормальными клетками, привели к созданию химиотерапевтических схем с меньшим количеством побочных эффектов по сравнению с ненацеленными вариантами терапии, такими как лучевая терапия.

[0006] Иммунотерапия злокачественных опухолей стала перспективным терапевтическим подходом, дополняющим существующие стандарты лечения. См., например, Miller et al. Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Такие подходы иммунотерапии включают созданеие антител, используемых для модуляции иммунной системы с целью уничтожения злокачественных клеток.

[0007] Противоопухолевые иммунные ответы у пациентов с солидными опухолями были усилены лечением биологическими препаратами. Например, существует два разрешенных и доступных на рынке моноклональных анти-PD-1 антитела: ниволумаб (OPDIVO®) и пембролизумаб (KEYTRUDA®), которые одобрены в США и Европейском союзе для лечения таких заболеваний, как неоперабельная или метастатическая меланома и метастатический немелкоклеточный рак легкого. Лечение пациентов этими препаратами приводило к противоопухолевым ответам, оцененным по улучшению выживаемости без прогрессирования и/или общей выживаемости.

[0008] Отсутствие замедляющего эффекта OPDIVO® на развитие прогрессирующего рака легкого в популяции пациентов, не получавших лечения, в недавно проведенном клиническом исследовании, в котором сравнивали OPDIVO® с обычной химиотерапией, подчеркивает необходимость в альтернативных подходах и дополнительных методах лечения злокачественных опухолей в дополнение к существующим терапевтическим стандартам лечения.

5. РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение относится к анти-OX40 антителам, которые специфически связываются и активируют OX40. Примеры аминокислотных последовательностей определяющих комплементарность областей (CDR), вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) и вариабельного домена легкой цепи (V_L) (то есть, цепей V_H и V_L, соответственно) и тяжелой и легкой цепей анти-OX40 антитела приведены в подробном описании ниже. Анти-OX40 антитела, представленные в настоящем описании, приводят к активации адаптивного иммунного ответа.

[0010] Анти-OX40 антитела могут включать модификации и/или мутации, которые изменяют свойства антител, например, увеличивают период полужизни, увеличивают или уменьшают антиген-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), как известно в данной области.

[0011] В описании также приведены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти-ОХ40-антитела по изобретению, а также векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Кроме того, в описании также представлены прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую описанное анти-OX40 антитело, а также эукариотические клетки-хозяева (такие как, клетки млекопитающих), сконструированные для экспрессии нуклеотидных последовательностей. Также предложены способы получения антител путем культивирования клеток-хозяев и выделения антител, которые описаны в подробном описании ниже.

[0012] В другом аспекте настоящее описание относится к композициям, содержащим анти-ОХ40-антитела, описанные в настоящем документе. Композиции, как правило, содержат одно или несколько анти-OX40 антител, как описано в настоящем документе, и один или несколько вспомогательных средств, носителей или разбавителей.

[0013] В настоящем описании раскрыты способы лечения индивидов, например людей, с диагнозом солидная опухоль, с помощью анти-OX40 антитела. Способ обычно включает введение индивиду определенного количества анти-OX40-антитела, описанного в настоящем документе, эффективного для обеспечения терапевтического эффекта. У индивида может быть диагностирована любая солидная опухоль, и она может быть впервые диагностирована, быть рецидивирующей или рефрактерно-рецидивирующей. Анти-OX40 антитело можно вводить внутривенно каждые две недели.

[0014] Анти-OX40 антитела можно вводить как самостоятельные терапевтических средства (монотерапия) или в дополнение к другим терапевтическими средствам или вместе с ними, как правило, но не обязательно, с такими средствами, которые используются для лечения солидной опухоли. Терапевтические средства обычно можно использовать в их принятой дозе, принятым путем введения и с утвержденной частотой введения.

[0015] Анти-OX40 антитела можно вводить различными путями или способами введения, включая, но не ограничиваясь ими, внутривенную инфузию и/или инъекцию и внутриопухолевую инъекцию. Вводимое количество зависит от пути введения, схемы дозирования, типа злокачественной опухоли, в отношении которой проводят лечение, стадии злокачественной опухоли, в отношении которой проводят лечение, и других параметров, таких как возраст и вес пациента, как хорошо известно в данной области.

6. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0016] На ФИГ.1A-1D изображена функциональная активация Т-клеток человека in vitro после обработки иллюстративным анти-OX40 антителом Hu3738. На ФИГ.1А показана пролиферация CD4+ Т-клеток периферической крови человека после обработки анти-ОХ40-антителом Hu3738 или антителом 11D4 или 18D8, описанным в литературе. На ФИГ.1В показано увеличение продукции интерферона-гамма (IFN-γ) CD4+ Т-клетками человека после обработки анти-ОХ40-антителом Hu3738 или антителом 11D4 или 18D8, описанным в литературе. На ФИГ.1C показана пролиферация CD4+ T-клеток периферической крови человека после обработки Hu3738 или антителом 1A7, описанным в литературе. На ФИГ.1D показано увеличение продукции IFN-γ CD4+ T-клетками человека после обработки Hu3738 или антителом 1A7, описанным в литературе.

[0017] На ФИГ.2А-2В показан эффект иллюстративного анти-ОХ40-антитела Hu3738 на супрессию, опосредованную Т-регуляторными (Treg) клетками человека in vitro. Анализ супрессии Treg проводили с использованием двух различных соотношений CD4+/CD25- отвечающих Т-клеток (Tresp) и CD4+/CD25+/CD127low T-регуляторных клеток (Treg). Бусы реагента Treg Suppress Inspector (Insp) добавляли в лунки для культивирования в пропорции 1:1 бусы к клеткам для стимуляции. Не закрашенная полоса на фигуре соответствует пролиферации клеток Tresp в присутствии Insp. Анти-OX40 и контрольные изотипические антитела IgG₁ человека тестировали в трех повторах при конечной концентрации 10 мкг/мл в отсутствие или в присутствии сшивающего реагента (F(ab')₂ козы против IgG человека, Fc-специфичный) в пропорции 1:4. Планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО₂ в течение четырех дней. Добавляли 1 мкКи/лунка ³H-тимидина и планшеты дополнительно инкубировали в течение 16 часов. На графиках показана пролиферация в импульсах в минуту (имп/мин). На ФИГ.2А показаны результаты Tresp к Treg в пропорции 2:1; на ФИГ.2B показаны результаты Tresp к Treg в пропорции 4:1.

[0018] На ФИГ.3 показано ингибирование связывания иллюстративного анти-OX40 антитела Hu3738 в присутствии растворимого лиганда OX40 (OX40L) человека. На графике показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) в зависимости от концентрации OX40L (мкг/мл). Клетки Jurkat, экспрессирующие OX40 человека, окрашивали титром немеченного растворимого OX40L и 0,2 мкг/мл Hu3738 или контрольным изотипическим антителом.

[0019] На ФИГ.4А показано выравнивание аминокислотной последовательности OX40 человека (SEQ ID NO:1) и OX40 мыши (SEQ ID NO:3). На ФИГ.4В показана активность связывания иллюстративного анти-OX40-антитела Hu3738 с молекулами OX40 человека, мыши или химеры человек-мышь, экспрессированными на поверхности клеток, где богатые цистеином домены (CRD) мыши заменены на соответствующие области человека. OX40 человека обозначен как «293s-huOX40», химерный OX40 человека с CRDI мыши обозначен как «293s-huOX40-muCRDI», химерный OX40 человека с CRDII мыши обозначен как «293s-huOX40-muCRDII», химерный OX40 человека с CRDIII мыши обозначен как «293s-huOX40-muCRDIII», химерный OX40 человека с CRDIV мыши обозначен как «293s-huOX40-muCRDIV», химерный OX40 человека с CRDII мыши и CRDIII мыши обозначен как «293s-huOX40-muCRDII+III» и OX40 мыши обозначен как «293s-muOX40».

[0020] На ФИГ.5 показана конкуренция за связывание с OX40 человека на клеточной поверхности иллюстративного анти-OX40 антитела Hu3738 или антитела (11D4, 18D8, 106-222, 119-122 или 1A7), описанного в литературе.

[0021] На ФИГ.6А показана активация NF-κB в линиях репортерных клеток Jurkat человека, трансфицированных OX40, при обработке иллюстративным анти-OX40 антителом Mu3738 или Hu3738, или антителом 11D4, 18D8, 106-222 или 119-122, описанным в литературе, или контролем с изотипом в отсутствии добавления сшивающего агента. На ФИГ.6B показана активация NF-κB в линиях репортерных клеток Jurkat человека, трансфицированных OX40, при обработке иллюстративным антителом против OX40 Hu3738, антителом 1A7, описанным в литературе, или контролем с изотипом в присутствии или в отсутствие добавления сшивающего агента.

[0022] На ФИГ.7 показана противоопухолевая активность иллюстративного анти-OX40-антитела Hu3738 на модели адоптивных опухолевых клеток PC3 человека у мышей NSG.

[0023] На ФИГ.8 показаны уровни интерлейкина-8 (IL-8), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора макрофагов (GM-CSF), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и гамма-интерферона (IFN-γ) в модели реакции трансплантант против хозяина (GVHD), опосредованной мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMC), у мышей NSG после обработки мышей 1 мг/кг Hu3738 или контролем с изотипом IgG₁ человека один раз каждые 7 дней в общей сложности в количестве 4 дозы.

7. РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0024] Настоящее описание к антителам и их фрагментам, которые специфически связываются с OX40, к композициям, содержащим антитела, полинуклеотидам, кодирующим анти-OX40 антитела, клеткам-хозяевам, способным продуцировать антитела, способам и композициям, подходящим для получения антител, и к различным способам их применения.

[0025] Специалистам в данной области понятно, что антитела и их фрагменты являются «модульными» по своей природе. На протяжении всего описания раскрыты различные конкретные варианты осуществления различных «модулей», составляющих анти-OX40 антитела или их связывающие фрагменты. В качестве конкретных неограничивающих примеров приведены различные конкретные варианты осуществления определяющих комплементарность областей (CDR) вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), цепи V_H, CDR вариабельного домена легкой цепи (V_L) и цепи V_L. Предполагается, что все конкретные варианты осуществления могут быть объединены друг с другом, как если бы каждая конкретная комбинация была описана отдельно.

7.1 Сокращения

[0026] Антитела, связывающие фрагменты и полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, в большом числе вариантов осуществления описаны посредством их соответствующих полипептидных или полинуклеотидных последовательностей. Если не указано иное, то полипептидные последовательности приведены в направлении N→C; полинуклеотидные последовательности приведены в направлении 5'→3'. Для полипептидных последовательностей можно использовать обычные трех- или однобуквенные сокращения для генетически кодируемых аминокислот, как указано в Таблице 1 ниже.

ТАБЛИЦА 1 Сокращения кодируемых аминокислот
Аминокислота	Трехбуквенное сокращение	Однобуквенное сокращение
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	С
Глутаминовая кислота	Glu	E
Глутамин	Gln	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	М
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

[0027] Некоторые последовательности определены структурными формулами, описывающими аминокислотные остатки, принадлежащие к определенным классам (например, алифатические, гидрофобные и тому подобное). Различные классы, к которым относятся генетически кодируемые аминокислоты, как используется в настоящем документе, указаны в ТАБЛИЦЕ 2 ниже. Некоторые аминокислоты могут принадлежать более чем одному классу. Цистеин, который содержит сульфгидрильную группу, и пролин, который конформационно ограничен, не относятся ни к одному классу.

Таблица 2 Классы кодируемых аминокислот
Класс	Аминокислоты
Алифатические	A, I, L, V
Ароматические	F, Y, W
Неполярные	M, A, I, L, V
Полярные	N, Q, S, T
Основные	H, K, R
Кислые	D, E
Низкомолекулярные	A,G

7.2 Определения

[0028] Если в настоящем документе не указано иное, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим описанием, имеют значения, которые обычно известны среднему специалисту в данной области.

7.3 Анти-OX40 антитела и связывающие фрагменты

[0029] OX40 является костимулирующей молекулой, которая играет критическую роль в усилении возникающих иммунных ответов и одновременно подавляет регуляторную активность Т-клеток. OX40, также известна как CD134 или член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 4 (TNFRSF4), представляет собой трансмембранный рецептор клеточной поверхности типа I суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), временно экспрессируемых на T-клетках сразу после их активации и конститутивно экспрессируемых на активированных T-регуляторных клетках. Внеклеточный лиганд-связывающий домен OX40 состоит из трех доменов, богатых цистеином (CRD), и четвертого частичного CDR домена (CRDI, CRDII, CRDIII и CRDIV, соответственно). Хотя OX40 в основном экспрессируется активированными CD4+ T-клетками, после активации он может экспрессироваться на B-клетках, CD8+ T-клетках и натуральных киллерах (NK) и натуральных Т-киллерах (NKT). Также сообщалось, что нейтрофилы экспрессируют OX40, и сигнальный путь через OX40 на нейтрофилах человека ингибирует апоптотическую гибель клеток. Лиганд OX40 (OX40L), также известен как лиганд суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли 4 (TNFSF4), CD252 или гликопротеин 34 (gp34), активируется активированными антиген-презентирующими клетками и В-клетками. Связывание лиганда с OX40 на антиген-активированных T-клетках приводит к ингибированию транслокации NF-κB и к активации пути AKT. Транслокация NF-κB ведет к активации молекул выживания, таких как Bcl-2, Bcl-XL, и к клеточному выживанию. Активирующие антитела, направленные на OX40, предназначены, по меньшей мере, частично для усиления антиген-специфических иммунных ответов путем удлинения активации и дифференцировки Т-эффекторных клеток.

[0030] Помимо воздействия на активированные антигеном Т-эффекторные клетки, нацеливание на OX40, которые экспрессируются Т-регуляторными клетками, также может способствовать этому предполагаемому механизму действия. Т-регуляторные клетки экспрессируют высокие уровни OX40 в опухолевом микроокружении. Было показано, что активация OX40 влияет на супрессорную способность T-регуляторных клеток и приводит к быстрому истощению OX40-позитивных T-регуляторных клеток в микроокружении опухоли.

[0031] В одном аспекте, изобретение относится к антителам, которые специфично связываются с OX40.

[0032] Как используется в настоящем документе, термин «антитело» (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с конкретным антигеном, в данном случае, с ОХ40. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40-антитела по настоящему изобретению связываются с OX40 человека (SEQ ID NO:1) (ссылочная последовательность NCBI NP003318) и, тем самым, модулируют иммунную систему. В результате ответ иммунной системы становится цитотоксичным для опухолевых клеток. Анти-OX40 антитела содержат определяющие комплементарность области (CDR), также известные как гипервариабельные области, как в вариабельном домене легкой цепи, так и в вариабельном домене тяжелой цепи. Более консервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Как известно в данной области, аминокислотное положение/граница, определяющая гипервариабельную область антитела, может изменяться в зависимости от контекста и различных определений, известных в данной области. Некоторые положения в вариабельной области могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения в том смысле, что эти положения могут считаться находящимися внутри гипервариабельной области по одному набору критериев, в то время как по другому набору критериев их считают находящимися вне гипервариабельной области. Одно или несколько из этих положений также можно найти в расширенных гипервариабельных областях. В описании представлены антитела, содержащие модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Вариабельные домены нативных легких и тяжелых цепей содержат по четыре области FR, преимущественно принимающих конфигурацию β-листа, соединенных тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие структуры β-листа, а в некоторых случаях, являющиеся их частью. CDR каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR, и вместе с CDR другой цепи способствуют образованию антиген-связывающего сайта антител. См. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Как используется в настоящем документе, нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина осуществляется по системе нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина Kabat et al., если не указано иное.

[0033] Антитела по изобретению могут быть поликлональными, моноклональными, полученным с помощью генной инженерии и/или иным образом модифицированными по своей природе, включая, но не ограничиваясь ими, химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. В некоторых вариантах осуществления константная область представляет собой изотип, выбранный из: IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE, IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄) и IgM. В конкретных вариантах осуществления анти-OX40 антитело, описанное в настоящем документе, содержит IgG₁. В других вариантах осуществления анти-OX40-антитела содержат IgG₂ или IgG₄. Используемый в настоящем документе термин «константная область» антитела включает природную константную область, аллотипы или природные варианты, такие как D356E и L358M, или A431G в IgG₁ человека. См., например, Jefferis and Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (Jul-Aug 2009).

[0034] Константная область легкой цепи анти-OX40 антитела может быть каппа (κ) или лямбда (λ). λ легкая цепь может быть любым из известных подтипов, например, λ₁, λ₂, λ₃ или λ₄. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит каппа (κ) легкую цепь.

[0035] Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Моноклональное антитело получают из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, любыми способами, доступными или известными в данной области. Моноклональные антитела, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием широкого спектра методов, известных в данной области, включая использование гибридомной, рекомбинантной технологии и методов фагового дисплея или их комбинации. Во многих вариантах применения настоящего изобретения, в том числе in vivo применение анти-OX40 антител у людей, можно использовать химерные, гуманизированные или человеческие антитела.

[0036] Используемый в настоящем документе термин «химерное» антитело относится к антителу, имеющему последовательности вариабельных областей, полученные из нечеловеческого иммуноглобулина, такого как антитело крысы или мыши, и константные области иммуноглобулина человека, обычно выбираемые по шаблону иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. См., например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №№ 5807715; 4816567; и 4816397.

[0037] «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, которые содержат минимальные последовательности, полученные из нечеловеческого иммуноглобулина. В целом, гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного, а обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям CDR иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, а все или по существу все FR области соответствуют FR областям последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (FC), обычно консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Способы гуманизации антител известны в данной области. См., например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693761; 5693762; и 6180370 Queen et al.; EP239400; публикация РСТ WO 91/09967; патент США № 5225539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; и патент США № 5565332.

[0038] «Антитела человека» включают антитела с аминокислотной последовательностью иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулина человека или животных, трансгенных одному или нескольким иммуноглобулинам человека, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Антитела человека могут быть получены различными способами, известными в данной области техники, включая методы фагового дисплея с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. патенты США №№ 4444887 и 4716111; и публикации PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; и WO 91/10741. Антитела человека также могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулинов человека. См., например, публикации РСТ WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; патенты США № 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771; и 5939598. Кроме того, такие компании, как LakePharma, Inc. (Belmont, CA) или Creative BioLabs (Shirley, NY) можно привлечь для получения антител человека против выбранного антигена, используя технологии, сходные технологиям, описанным выше. Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть получены с использованием методики, называемой «управляемый отбор». В этом подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например, мышиное антитело, используется для управляемого отбора полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (см. Jespers et al., 1988, Biotechnology 12: 899-903).

[0039] Также рассматриваются связывающие фрагменты анти-OX40 антитела. Связывающие фрагменты по настоящему изобретению включают фрагменты, которые способны специфически связываться с OX40. Примеры связывающих фрагментов антител, включают, например, но ими не ограничиваясь, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv) и однодоменные фрагменты.

[0040] Fab-фрагмент содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена CH1 тяжелой цепи, включая один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-фрагменты получают путем расщепления дисульфидной связи в цистеинах шарнирной области продукта расщепления пепсином F(ab')₂. Дополнительные химические сочетания фрагментов антител известны специалистам в данной области. Fab- и F(ab')₂-фрагменты лишены области кристаллизуемого фрагмента (Fc) интактного антитела, быстрее выводятся из кровообращения животных и могут обладать меньшим неспецифическим связыванием с тканью по сравнению с интактным антителом (см., например, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

[0041] Как хорошо известно в данной области, «Fc»-область представляет собой фрагмент константной области антитела, не содержащей антиген-специфическую связывающую область. В изотипах антитела IgG, IgA и IgD, Fc-область состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, полученных из второго и третьего константного доменов (CH2 и CH3 домены, соответственно) двух тяжелых цепей антитела. Fc-области IgM и IgE состоят из трех константных доменов тяжелой цепи (домены CH2, CH3 и CH4) в каждой полипептидной цепи.

[0042] Фрагмент «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит весь сайт распознавания и связывания мишени. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации (димер V_H-V_L). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют и образуют сайт связывания мишени на поверхности димера V_H-V_L. Зачастую шесть CDR придают антителу специфичность связывания с мишенью. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для мишени) может обладать способностью распознавать и связывать мишень, хотя и с более низкой аффинностью, чем полноразмерный сайт связывания.

[0043] «Одноцепочечный Fv-фрагмент» или «scFv-фрагмент» связывания антитела содержат домены V_H и V_L антитела, где эти домены присутствуют в общей полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv образовывать структуру, благоприятную для связывания с мишенью.

[0044] «Однодоменные фрагменты» состоят из единичных доменов V_H или V_L, которые проявляют достаточную аффинность в отношении OX40. В конкретном варианте осуществления изобретения однодоменный фрагмент является верблюжьим (см., например, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

[0045] Анти-OX40-антитела по изобретению включают производные антител. Например, производные антител обычно модифицируют гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидирование, присоединением известных защитных групп/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточным лигандом или другим белком. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными методами, включая, но не ограничиваясь ими, специфичное химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и тому подобное. Кроме того, производное может содержать одну или несколько неприродных аминокислот, например, используя технологию ambrx (см., например, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).

[0046] Анти-OX40 антитела могут быть антителами, последовательности которых модифицированы так, чтобы изменялась по меньшей мере одна биологическая эффекторная функция, опосредованная константной областью. Например, в некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело может быть модифицировано так, чтобы снижалась по меньшей мере одна биологическая эффекторная функция, по сравнению с немодифицированным антителом, например, уменьшалось связывание с одним или несколькими рецепторами Fc (FcγR), такими как FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и/или FcγRIIIB. Связывание с FcγR может быть уменьшено за счет мутации сегмента константной области иммуноглобулина антитела в определенных областях, необходимых для взаимодействия с FcγR (см., например, Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). Снижение способности антитела связываться с FcγR также может снижать другие эффекторные функции, которые зависят от взаимодействий с FcγR, такие как опсонизация, фагоцитоз и антиген-зависимая клеточная цитотоксичность («ADCC»). Как показано в иллюстративном примере, вариант домена CH2 с заменой V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S или V273Y в домене CH2 Fc-области может обладать пониженным сродством в отношении FcγRIIB по сравнению с соответствующей константой областью дикого типа.

[0047] Анти-OX40-антитело, описанное в настоящем документе, включает антитела, которые были модифицированы на приобретение или улучшение по меньшей мере одной опосредованной константной областью биологической эффекторной функции по сравнению с немодифицированным антителом, например, усиление взаимодействия с FcγR (см., например, патентную заявку США. № 2006/0134709). Например, анти-OX40 антитело по настоящему изобретению может иметь константную область, которая связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и/или FcγRIIIB с большей аффинностью, чем соответствующая константная область дикого типа. Как показано в иллюстративном примере, вариант домена CH2 с заменой V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S или V273Y в домене CH2 Fc-области может обладать большим сродством в отношении FcγRIIIА по сравнению с соответствующей константой областью дикого типа.

[0048] Таким образом, анти-OX40-антитела по изобретению могут быть изменены по биологической активности, что приводит к приводит к повышенной или пониженной опсонизации, фагоцитозу или ADCC. Такие изменения известны в данной области. Например, модификации антител, которые снижают активность ADCC, описаны в патенте США №5834597. Пример варианта с пониженным ADCC соответствует «мутанту 3» (также известен как «М3», показан на ФИГ.4 патента США №5834597), в котором остатки 234 и 237 (используя нумерацию ЕС) замещены аланинами. Вариант мутанта 3 (также известен как «М3») можно использовать в ряде изотипов антител, например, в М3 IgG₂ человека.

[0049] Дополнительные замены, которые могут модифицировать связывание FcγR и/или эффекторную функцию ADCC анти-OX40 антитела, включают замену K322A или двойную замену L234A и L235A в Fc-области, например, IgG₁ человека с двойной заменой L234A/L235A. Смотри, например, Hezareh, et al. J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).

[0050] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитела имеют низкие уровни фукозы или не имеют фукозу. Антитела, лишенные фукозы, коррелировали с повышенной активностью ADCC, особенно при низких дозах антитела. См. Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Способы получения антител без фукозы включают рост клеток миеломы YB2/0 крысы (ATCC CRL 1662). Клетки YB2/0 экспрессируют низкие уровни мРНК FUT8, которая кодирует α-1,6-фукозилтрансферазу, фермент, необходимый для фукозилирования полипептидов.

[0051] Анти-OX40 антитела могут содержать модифицированные (или варианты) домены CH2 или полноразмерные Fc-домены, которые включают аминокислотные замены, которые повышают связывание с FcγRIIB и/или снижают связывание с FcγRIIIA по сравнению со связыванием соответствующей области CH2 или Fc-области дикого типа. Варианты домена CH2 или варианты Fc-области описаны в заявке на патент США №2014/0377253. Вариант домена СН2 или вариант Fc-домена обычно содержит одну или несколько замен в положении 263, положении 266, положении 273 и положении 305, где нумерация остатков в Fc-домене соответствует нумерации ЕС по Kabat. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40-антитела содержат одну или несколько замен, выбранных из V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K и V305W, по сравнению с доменом CH2 дикого типа. В конкретных вариантах осуществления одна или несколько замен домена CH2 выбраны из V263L, V273E, V273F, V273M, V273S и V273Y по сравнению с доменом CH2 IgG₁ человека. Например, одна или несколько замен домена CH2 IgG₁ могут представлять собой V273E. В другом конкретном варианте осуществления анти-OX40-антитело по изобретению содержит вариант домена СН2 IgG₁, содержащий аминокислотную замену V263L.

[0052] Другие примеры вариантов домена CH2 или Fc-области, которые могут обеспечивать повышенное связывание с FcγRIIB и/или пониженное связывание с FcγRIIIA по сравнению со связыванием соответствующей области CH2 или Fc-области дикого типа, включают варианты, описанные Vonderheide et al. Clin. Cancer Res., 19(5), 1035-1043 (2013), например S267E или S267E/L328F в IgG₁ человека.

[0053] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40-антитела включают модификации, которые увеличивают или уменьшают их аффинность связывания с фетальным Fc-рецептором, FcRn, например, путем мутации константной области иммуноглобулина в определенных областях, связанных с взаимодействием с FcRn (см., например, WO2005/123780). В конкретных вариантах осуществления в анти-OX40 антителе класса IgG введены мутации, так, что по меньшей мере замещен один из аминокислотных остатков 250, 314 и 428 константной области тяжелой цепи замещен, или любые их комбинации, например положения 250 и 428, или положения 250 и 314 или положения 314 и 428, или положения 250, 314 и 428, положения 250 и 428 конкретной комбинации. Для положения 250 замещающий аминокислотный остаток может быть любым аминокислотным остатком, кроме треонина, включая, но не ограничиваясь ими, аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, валин, триптофан или тирозин. Для положения 314 замещающий аминокислотный остаток может представлять собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, включая, но ими не ограничиваясь, аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин. Для положения 428 замещающие аминокислотные остатки могут представлять собой любой аминокислотный остаток, отличный от метионина, включая, но не ограничиваясь ими, аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин. Примеры замены, известной для модификации эффекторной функции Fc, является замена M428L в Fc, которая может возникать в комбинации с заменой T250Q в Fc. Дополнительные конкретные комбинации подходящих аминокислотных замен указаны в Таблице 1 патента США №7217797. Такие мутации увеличивают связывание с FcRn, который что защищает антитело от деградации и повышает его период полураспада.

[0054] Анти-OX40 антитело может иметь одну или несколько аминокислот, встроенных в одну или несколько его CDR, например, как описано в Jung and 1997, Protein Engineering 10: 8, 959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; и патентная заявка США №2007/0280931.

[0055] Анти-OX40 антитела с высокой аффиностью к OX40 человека (SEQ ID NO:1) могут быть эффективны для терапевтического и диагностического применения. Соответственно, в настоящем документы раскрыты антитела с высокой аффинностью связывания с OX40 человека. В конкретных вариантах осуществления анти-OX40 антитела связывают OX40 человека с аффинностью, равной по меньшей мере примерно 100 нМ, но могут проявлять более высокую аффинность, равную, например, по меньшей мере примерно 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или даже выше. В некоторых вариантах осуществления антитела связывают OX40 человека с аффинностью связывания в диапазоне от примерно 1 пМ до примерно 100 нМ или с аффинностью связывания с любым из вышеуказанных значений, таким как, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,001 до 10 нМ, от 0,001 до 5 нМ, от 0,01 до 100 нМ, от 0,01 до 50 нМ, от 0,01 до 10 нМ, от 0,01 до 5 нМ или от 0,01 до 1 нМ.

Аффинность анти-OX40-антитела к OX40 человека может быть определена методами, хорошо известными в данной области или описанными в настоящем документе, такими как, например, но не ими не ограничиваясь, ELISA, изотермическая титрационная калориметрия (ITC), поверхностный плазмонный резонанс или флуоресцентный поляризационный анализ.

Анти-OX40 антитела, как правило, содержат тяжелую цепь, содержащую вариабельную область (V_H) с тремя определяющими комплементарность областями («CDR»), обозначенными в настоящем описании (в направлении N→C) как V_H CDR#1, V_H CDR#2 и V_H CDR#3, и легкую цепь, содержащую вариабельную область (V_L) с тремя определяющими комплементарность областями, обозначенными в настоящем описании (в направлении N→C) как V_L CDR#1, V_L CDR# и V_L CDR#3. В настоящем документе приведены аминокислотные последовательности характерных CDR, а также аминокислотные последовательности областей V_H и V_L тяжелой и легкой цепей характерного анти-OX40 антитела. Конкретные варианты осуществления анти-OX40 антител включают эти характерные последовательности CDR и/или последовательности V_H и/ или V_L, а также антитела, которые конкурируют за связывание с OX40 человека с такими антителами.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотные последовательности CDR анти-OX40 антитела имеют последовательности, выбранные из соответствующих последовательностей CDR V_H и V_L в ТАБЛИЦЕ 3 ниже.

ТАБЛИЦА 3 Примеры последовательностей CDR
CDR	Последовательность	Идентификатор
VH CDR#1:	GFTFSRYGMS GYSIASGYYWN GFNIKDTYMH GFSLTSYGVH	(SEQ ID NO:101) (SEQ ID NO:111) (SEQ ID NO:121) (SEQ ID NO:131)
VH CDR#2:	TINSNGGRTYYPDSVKG YISYDGSNNYNPSLG RIDPANGNTKYDPKFQG VIWSGGSTDYNAAFIS	(SEQ ID NO:102) (SEQ ID NO:112) (SEQ ID NO:122) (SEQ ID NO:132)
VH CDR#3:	EGITTAYAMDY TLPYYFDY GGPAWFVY EEFDY	(SEQ ID NO:103) (SEQ ID NO:113) (SEQ ID NO:123) (SEQ ID NO:133)
VL CDR#1:	KASQSVDYDGDSYMH RASQDISNYLN	(SEQ ID NO:104) (SEQ ID NO:114)
VL CDR#2:	AASILES YTSRLHS YTSRLRS	(SEQ ID NO:105) (SEQ ID NO:115) (SEQ ID NO:125)
VL CDR#3:	QQSNEDPRT QQGNTLPLT QQGNTLPWT QQGYTLPPT	(SEQ ID NO:106) (SEQ ID NO:116) (SEQ ID NO:126) (SEQ ID NO:136)

[0059] Конкретные примеры вариантов осуществления анти-OX40 антител с вышеуказанными CDR описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело имеет CDR с последовательностями SEQ ID NO:101, 102, 103, 104, 105 и 106. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело имеет CDR с последовательностями SEQ ID NO:111, 112, 113, 114, 115 и 116. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело имеет CDR с последовательностями SEQ ID NO:121, 122, 123, 114, 125 и 126. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело имеет CDR в последовательностями SEQ ID NO:131, 132, 133, 114, 115 и 136.

[0060] CDR, описанные в настоящем описании, образуют связывающие элементы в цепях V_H и V_L анти-OX40-антител по изобретению. В ТАБЛИЦАХ 4 и 5 ниже описаны V_H и V_L цепи, соответствующие примерам анти-OX40 антител, содержащим вышеуказанные CDR. CDR подчеркнуты ниже в ТАБЛИЦАХ 4 и 5. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью, как описано в ТАБЛИЦЕ 4.

ТАБЛИЦА 4 Примеры последовательностей VH
VH	Последовательность	Идентификатор
Mu3738 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGITTAYAMDYWGQGTSVTVSS	(SEQ ID NO:21)
Hu3738 VH.1b	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSS	(SEQ ID NO:22)
Mu3726 VH	NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSIASGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRISITRDTSKNQVFLKLNSVTTEDTATYYCVKTLPYYFDYWGQGTTLTVSS	(SEQ ID NO:23)
Hu3726 VH.1a	EVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSIASGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVYYCVKTLPYYFDYWGQGTTVTVSS	(SEQ ID NO:24)
Mu3739 VH	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTDVYYCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSA	(SEQ ID NO:25)
Hu3739 VH.1b	EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSS	(SEQ ID NO:26)
Mu3741 VH	QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYCCAREEFDYWGQGTTLTVSS	(SEQ ID NO:27)
HHu3741 VH.2b	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEFDYWGQGTTVTVSS	(SEQ ID NO:28)

и цепь V_L с аминокислотной последовательность, как описано в ТАБЛИЦЕ 5.

ТАБЛИЦА 5 Примеры последовательностей VL
VL	Последовательность	Идентификатор
Mu3738 VL	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK	(SEQ ID NO:31)
Hu3738 VL.1	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK	(SEQ ID NO:32)
Mu3726 VL	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGGGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK	(SEQ ID NO:33)
Hu3726 VL.1b	DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPLTFGQGTKLEIK	(SEQ ID NO:34)
Mu3739 VL	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK	(SEQ ID NO:35)
Hu3739 VL.1b	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK	(SEQ ID NO:36)
Mu3741 VL	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWFQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPPTFGGGTKLEIK	(SEQ ID NO:37)
Hu3741 VL.1c	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWFQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTLPPTFGGGTKVEIK	(SEQ ID NO:38)

[0061] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:21 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:31. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:23 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:33. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:25 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:35. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:27 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:37.

[0062] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело подходит для введения людям. В конкретном варианте осуществления анти-OX40 антитело является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:22 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:32. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:24 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:34. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:26 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:36. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит цепь V_H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28 и цепь V_L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:38.

[0063] Специалистам в данной области понятно, что определенные мутации в последовательности V_H или V_L анти-OX40-антитела, описанные в настоящей заявке, могут дать анти-OX40-антитела в рамках объема раскрытия. Мутации могут включать аминокислотные замены, добавления или делеции в последовательности V_H или V_L, как описано в настоящем описании, при этом сохраняя значительную активность против OX40. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит последовательность V_H, которая по меньшей мере 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой последовательности V_H, как показано в ТАБЛИЦЕ 4. Анти-OX40 антитело может содержать последовательность V_H с мутациями в количестве до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 по сравнению с любой из последовательностей V_H, показанных в ТАБЛИЦЕ 4. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело может содержать последовательность V_H с 5 или менее, с 4 или менее, с 3 или менее, с 2 или менее мутациями по сравнению с любой из последовательностей V_H, как показано в ТАБЛИЦЕ 4. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит последовательность V по меньшей мере 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей V_L, как показано в ТАБЛИЦЕ 5. Анти-OX40 антитело может содержать последовательность V_L с мутациями в количестве до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 по сравнению с любой из последовательностей V_L, как показано в ТАБЛИЦЕ 5. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело может содержать последовательность V_L с 5 или менее, с 4 или менее, с 3 или менее, с 2 или менее мутациями по сравнению с любой из последовательностей V_L, как показано в ТАБЛИЦЕ 5.

[0064] Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи обычно содержат описанную выше цепь V_H или V_L, связанную с соответствующей константной областью иммуноглобулина, например, IgG₁ человека или константой областью легкой цепи каппа. Могут возникать посттрансляционные модификации полноразмерных последовательностей анти-OX40-антитела, такие как отщепление одного или нескольких (например, 1, 2, 3 или более) аминокислотных остатков на С-конце тяжелой цепа антитела. Такие продукты с отщеплением могут включать некоторые или все анти-OX40 антитела при экспрессии.

[0065] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как описано в ТАБЛИЦЕ 6.

ТАБЛИЦА 6 Примеры последовательностей тяжелой цепи
Последовательность	Идентификатор
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	SEQ ID NO:41
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	SEQ ID NO:42
EVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSIASGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVYYCVKTLPYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	SEQ ID NO:43
EVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSIASGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVYYCVKTLPYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	SEQ ID NO:44
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	SEQ ID NO:45
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	SEQ ID NO:46
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	SEQ ID NO:47
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	SEQ ID NO:48

и аминокислотные последовательности легкой цепи, как описано в ТАБЛИЦЕ 7.

ТАБЛИЦА 7 Примеры последовательностей легкой цепи
Последовательность	Идентификатор
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	SEQ ID NO:51
DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	SEQ ID NO:52
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	SEQ ID NO:53
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWFQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTLPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	SEQ ID NO:54

где подчеркнутые аминокислоты представляют CDR, а выделенные курсивом аминокислоты представляют константные области.

[0066] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:41 или 42 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:51. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:43 или 44 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:52. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:45 или 46 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:53. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:47 или 48 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:54.

[0067] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична любой последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO:41-48. Анти-OX40 антитело может содержать последовательность тяжелой цепи с мутациями в количестве до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 по сравнению с любой последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO:41-48. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело может содержать последовательность тяжелой цепи с 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее мутациями по сравнению с любой последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO:41-48.

[0068] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична любой последовательности легкой цепи SEQ ID NO:51-54. Анти-OX40 антитело может содержать последовательность легкой цепи с мутациями в количестве до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 по сравнению с любой последовательностью легкой цепи SEQ ID NO:51-54. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело может содержать последовательность легкой цепи с 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее мутациями по сравнению с любой последовательностью легкой цепи SEQ ID NO:51-54.

[0069] Дополнительные посттрансляционные модификации анти-OX40-антитела могут включать гликозилирование. Обычные биантенные комплексы могут состоять из коровой структуры с двумя N-ацетилглюкозаминами (GlcNAc), тремя маннозами и двумя остатками GlcNAc, которые являются β-1,2 связанными с α-6-маннозой и α-3-маннозой с образованием двух антенн. К коровой структуре может быть присоединен один или несколько остатков фукозы (Fuc), галактозы (Gal), гликаны с высоким содержанием маннозы Man-5 или Man-9, разделенный пополам GlcNAc и сиаловая кислота, включая N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA) или N-гликолилнейраминовую кислоту (NGNA). N-связанные гликоформы могут включать G0 (белок с коровой биантенной гликозилированной структурой), G0F (фукозилированный G0), GlcNAc G0F, G1 (белок с коровой гликозилированной структурой и одним остатком галактозы), G1F (фукозилированный G1), G2 (белок с коровой гликозилированной структурой и двумя остатками галактозы) и/или G2F (фукозилированный G2).

[0070] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитела конкурируют за связывание с OX40 человека (SEQ ID NO:1) с эталонным антителом в анализах in vitro. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитела конкурируют за связывание с OX40 человека с клетками, экспрессирующими OX40 человека. Эталонное антитело может быть любым анти-OX40-антителом, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой антитело c V_H, указанным в ТАБЛИЦЕ 4, и V_L, указанным в ТАБЛИЦЕ 5. В конкретных вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой антитело мыши, содержащее V_H Mu3726 и V_L Mu3726 («Mu3726»), антитело мыши, содержащее V_H Mu3738 и V_L Mu3838 («Mu3738»), антитело мыши, содержащее V_H Mu3739 и V_L Mu3739 («Mu3739») или антитело мыши, содержащее V_H Mu3741 и V_L Mu3741 («Mu3741»). В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой гуманизированный вариант Mu3726, Mu3738, Mu3739 или Mu3741. В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:41 или 42 и легкую цепь SEQ ID NO:51 («Hu3738»), гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:43 или 44 и легкую цепь SEQ ID NO:52 («Hu3726»), гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:45 или 46 и легкую цепь SEQ ID NO:53 («Hu3739»), или гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:47 или 48 и легкую цепь SEQ ID NO:54 («Hu3741»).

[0071] Анти-OX40 антитела, описанные в настоящем документе, обычно специфически связываются с OX40 человека. Перекрестная реактивность антител в отношении связывания с OX40 других видов, например, обезьяны, например, яванского макака, может дать преимущества, такие как способность тестировать биологическую активность на моделях обезьян. Такое тестирование на животных моделях может быть использовано для скрининга анти-OX40 антител для выбора свойств, связанных с эффективностью, например, благоприятными фармакокинетическими свойствами, или свойствами, связанными с безопасностью, например, пониженной гепатотоксичностью. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело связывается с OX40 яванского макака (SEQ ID NO:2) (ссылочная последовательность NCBI XP005545179), а также с OX40 человека. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело не связывается с OX40 мыши (SEQ ID NO:3) (ссылочная последовательность NCBI NP037181).

[0072] Анализы конкуренции включают, но не ограничиваются ими, радиоактивно-меченный иммуноанализ (RIA), иммуноферментный анализ (ELISA), сэндвич-ELISA, сортировку клеток, активированных флуоресценцией (FACS), и анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса.

[0073] Анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) позволяет непосредственно измерить кинетику связывания двух белков, например, рецептора и антитела, таких как рецептор OX40 человека и анти-OX40 антитело, без необходимости в репортерном сигнале или метке. Как равновесная константа диссоциации K_D, мера аффинности связывания, так и два ее компонента - константы кинетической скорости связывания, k_a (M^-1-сек^-1) (константа ассоциации, k_on) и k_d (сек^-1) (константа диссоциации, k_koff) - могут быть определены с помощью SPR. Константы связаны следующим уравнением:

K_D=k_d/k_a.

[0074] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитела имеют K_D, равную по меньшей мере примерно 100 нМ, но могут проявлять более высокую аффинность, равную, например, по меньшей мере примерно 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или даже выше. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитела человека имеют K_D в диапазоне от примерно 1 пМ до примерно 100 нМ или с аффинностью связывания с любым из вышеуказанных значений, таким как, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,001 до 10 нМ, от 0,001 до 5 нМ, от 0,01 до 100 нМ, от 0,01 до 50 нМ, от 0,01 до 10 нМ, от 0,01 до 5 нМ или от примерно 0,01 до 1 нМ.

[0075] В некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антитело имеет константу диссоциации k_d, равную не более примерно 10 сек^-1, например, не более примерно 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 сек^-1 или даже меньше. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело имеет k_d в диапазоне от примерно 0,001 сек^-1 до примерно 10 сек^-1 или k_d в диапазоне между любыми из вышеуказанных значений, например, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,01 до 10 сек^-1, от 0,001 до 0,5 сек^-1, от 0,001 до 0,2 с^-1, от 0,001 до 0,1 с^-1, от 0,01 до 1 с^-1, от 0,001 до 0,05 с^-1 или от 0,001 до 1 с^-1.

[0076] В некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антитело имеет константу ассоциации k_a, равную не более примерно 10⁴ M^-1-сек^-1, например, по меньшей мере примерно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷ M^-1-сек^-1, или даже больше. В некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антитело имеет k_d в диапазоне от примерно 10⁴ M^-1-сек^-1 до примерно 10⁷ M^-1-сек^-1, или k_a в диапазоне любого вышеуказанного значения, например, но ими не ограничиваясь, от примерно 5×10⁴ до 1×10⁷ M^-1-сек^-1, 5×10⁴ до 5×10⁶ M^-1-сек^-1, или от примерно 1×10⁴ до 5×10⁶ M^-1-сек^-1.

[0077] Анти-OX40 антитело по настоящему изобретению может иметь K_D, k_d или k_a в диапазоне кинетических констант связывания, измеренных для любого иллюстративного анти-OX40 антитела, описанного в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антитело имеет константу диссоциации k_d в диапазоне от примерно в 0,01 до примерно в 100 раз выше, например, от примерно в 0,1 до примерно в 10 раз выше или от примерно в 0,5 до примерно в 5 раз выше k_d любого Hu3738, Hu3726, Hu3739 или Hu3741. В некоторых вариантах осуществления, анти-OX40 антитело имеет константу диссоциации k_a в диапазоне от примерно в 0,01 до примерно в 100 раз выше, например, примерно в 0,1 до примерно в 10 раз выше, или от примерно в 0,5 до примерно в 5 раз выше k_a любого Hu3738, Hu3726, Hu3739 или Hu3741.

[0078] При проведении анализа на конкурентное связывание антител между эталонным антителом и тестируемым антителом (независимо от вида или изотипа) сначала можно пометить эталонное антитело обнаруживаемой меткой, такой как флуорофор, биотин или ферментативная (или даже радиоактивная) метка, для последующей идентификации. В этом случае клетки, экспрессирующие OX40 человека, инкубируют с немеченым тестируемым антителом, добавляют меченое эталонное антитело и измеряют интенсивность связавшейся метки. Если тестируемое антитело конкурирует за связывание с меченым эталонным антителом, то связываясь с перекрывающимся эпитопом, интенсивность будет уменьшаться в сравнении с контрольной реакцией, проводимой без тестируемого антитела.

[0079] В конкретном варианте этого анализа сначала определяют концентрацию меченого эталонного антитела, которая дает 80% максимального связывания («конц_80%») в условиях анализа (например, при определенной плотности клеток), и проводят конкурентный анализ с 10х конц_80% немеченого тестируемого антитела и конц_80% меченого контрольного антитела.

[0080] Ингибирование может быть выражено как константа ингибирования или K_i, которая рассчитывается по следующей формуле:

K_i=IC₅₀/(1+[концентрация эталонного Ab]/K_d),

где IC₅₀ представляет собой концентрацию тестируемого антитела, которая дает 50% уменьшение связывания эталонного антитела, а K_d представляет собой константу диссоциации эталонного антитела, меру аффинности к OX40 человека. Антитела, которые конкурируют с анти-OX40-антителами, описанными в настоящем документе, могут иметь K_i от 10 пМ до 100 нМ в условиях анализа, описанных в настоящем документе.

[0081] В различных вариантах осуществления тестируемое антитело считается конкурирующим за связывание с эталонным антителом, если оно уменьшает связывание эталонного антитела по меньшей мере примерно на 20% или более, например, по меньшей мере примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже больше, или на процентное значение в диапазоне любого из вышеуказанных значений, при концентрации эталонного антитела, равной 80% от максимального связывания при конкретных условиях анализа, и при концентрация тестируемого антитела, которая в 10 раз выше концентрации эталонного антитела.

[0082] Анализ на специфичность связывания и условия анализа, эффективные для оценки того, конкурирует ли антитело за связывание с ОХ40 человека с эталонным антителом, как описано в настоящем документе, приведены в разделе 8.1.4.

[0083] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40-антитела по изобретению активируют OX40 человека (SEQ ID NO:1). Активация рецептора OX40 может происходить за счет ряда механизмов, например, посредством обеспечения лигандо-подобной активности в отношении рецептора OX40. В таких случаях анти-OX40 антитело конкурирует за связывание с рецептором OX40 с лигандом OX40 человека (OX40L, CD252; UniProtKB/Swiss-Prot Code P23510.1) (SEQ ID NO:4).

[0084] Анти-OX40-антитело по изобретению, как правило, может активировать рецептор OX40 в присутствии сшивающего агента. Анализ на специфичность и условия анализа, эффективные для оценки того, может ли анти-OX40 антитело активировать рецептор OX40, например, рецептор OX40 человека (SEQ ID NO:1) в присутствии сшивающего агента, приведены в разделе 8.1.8. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40 человека в присутствии сшивающего агента с EC₅₀ от примерно 1 пМ до примерно 500 нМ, например, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,01 до примерно 300 нМ, от примерно 0,01 до примерно 100 нМ, от примерно 0,01 до примерно 10 нМ, от примерно 0,01 до примерно 1 нМ, от примерно 0,1 до примерно 300 нМ, от примерно 0,1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 1 нМ до примерно 100 нМ или от примерно 0,1 до примерно 100 нМ. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело в концентрации 100 мкг/мл может активировать рецептор OX40 человека в присутствии сшивающего агента с активностью, по меньшей мере, примерно в 3 раза, например, от примерно 3 до примерно 1000 раз, например, примерно в 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 400, 500, 700, 800 или примерно в 1000 раз выше по сравнению с активностью рецептора OX40 человека в отсутствие анти-OX40 антитела.

[0085] Перекрестное связывание может обеспечиваться рядом способов, включая добавление экзогенного агента связывания, например, антител или фрагментов антител F(ab')2, специфичных для тяжелых, легких или вариабельных областей антител человека или гуманизированных антител; растворимого или иммобилизованного белка А; клеточных линий, трансфицированных рецептором Fc; клеточных линий, экспрессирующих эндогенный Fc-рецептор; путем непосредственного нанесения тестируемого антитела на пластиковые поверхности; пластиковых поверхностей, покрытых экзогенными антителами или Fc-рецепторами связывания; или бус, конъюгированных с любым из вышеперечисленных агентов. В иллюстративном примере антитела индивида могут быть конъюгированы с белком, таким как биотин, и в качестве агента связывания используется растворимый или иммобилизованный авидин или стрептавидин. В еще одном примере в лимфатических узлах человека in vivo подразумевается активация OX40 после связывания с анти-OX40-антителом после перекрестного связывания с рецептором на эндогенных антиген-презентирующих клетках FcγR+.

[0086] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело связывается и активирует рецептор OX40 человека в отсутствие связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40, например, рецептор OX40 человека (SEQ ID NO:1), в отсутствие OX40L, например, OX40L человека (SEQ ID NO:4). Конкретный анализ и условия этого анализа, использующиеся для оценки возможности активации рецептора OX40 антителом против OX40 без сшивающего агента, приведены разделе 8.1.8. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40 человека без сшивающего агента с ЕС₅₀, равным от примерно 1 пМ до примерно 500 нМ, например, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,01 до примерно 300 нМ, от примерно 0,01 до примерно 100 нМ, от примерно 0,1 до примерно 300 нМ, от примерно 0,1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 0,1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 1 до примерно 300 нМ, от примерно 1 до примерно 100 нМ, от примерно 1 до примерно 50 нМ или от примерно 10 до примерно 100 нМ. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело при концентрации 100 мкг/мл может активировать рецептор OX40 человека без сшивающего агента с активностью, которая по меньшей мере, примерно в 5 раза, например, примерно от 5 до примерно 1000 раз, например, примерно в 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 700 или примерно в 800 раз выше по сравнению с активностью рецептора OX40, активированного равным количеством изотипичного антитела. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело в концентрации 10 мкг/мл может активировать рецептор OX40 человека без перекрестного связывания с активностью, которая по меньшей мере, примерно в 3 раза, например, примерно от 3 до примерно 300 раз, например, примерно в 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 или примерно в 300 раз выше по сравнению с активностью рецептора OX40 человека, активированного эквивалентным количеством изотипичного антитела. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело в концентрации 1 мкг/мл может активировать рецептор OX40 человека без перекрестного связывания с активностью, которая по меньшей мере, примерно в 3 раза, например, примерно от 3 до примерно 150 раз, например, примерно в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100 или примерно в 150 раз выше по сравнению с активностью рецептора OX40 человека, дозированного эквивалентным количеством изотипического антитела.

[0087] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40, например, рецептор OX40 человека (SEQ ID NO:1), на более высоком уровне в присутствии сшивающего агента, чем в отсутствии сшивающего агента. Конкретный анализ и условия этого анализа, использующиеся для определения уровня при котором анти-OX40 антитело может активировать рецептор OX40 без перекрестного связывания, приведены разделе 8.1.8. Уровень активности может быть измерен, например, в единицах EC50 и/или наблюдаемой максимальной активации. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело в концентрации 100 мкг/мл активирует рецептор OX40, например, рецептор OX40 человека (SEQ ID NO:1), без перекрестного связывания от примерно 20% до примерно 95% активности NF-κB, например, примерно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или примерно 90%, по сравнению с активностью NF-κB без перекрестного связывания в анализе, приведенном в разделе 8.1.8.

[0088] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40 человека без перекрестного связывания со значением EC50 от примерно 0,1 нМ до примерно 500 нМ, например, но не ограничиваясь ими, от примерно 1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 0,1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 1 до примерно 300 нМ, от примерно 1 до примерно 100 нМ, от примерно 1 до примерно 50 нМ или от примерно 10 до примерно 100 нМ, в анализе, приведенном в разделе 8.1.8. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело в концентрации 10 мкг/мл может активировать рецептор OX40 человека без перекрестного связывания с активностью, которая по меньшей мере, примерно в 3 раза, например, примерно от 3 до примерно 300 раз, например, примерно в 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 или примерно в 300 раз выше по сравнению с активностью рецептора OX40 человека, активированного эквивалентным количеством изотипичного антитела. В некоторых таких вариантах осуществления анти-OX40 антитело активирует рецептор OX40 человека при поперечном связывании со значением EC50 от примерно 1 пМ до примерно 300 нМ, например, но не ограничиваясь ими, от примерно 0,01 до примерно 300 нМ, от примерно 0,01 до примерно 100 нМ, от примерно 0,01 до примерно 10 нМ, от примерно 0,01 до примерно 1 нМ, от примерно 0,1 до примерно 300 нМ, от примерно 0,1 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 1 нМ до примерно 100 нМ или от примерно 0,1 до примерно 100 нМ, в анализе, приведенном в разделе 8.1.8. В некоторых таких вариантах осуществления анти-OX40 антитело может активировать рецептор OX40 человека при перекрестном связывании при более низком значении EC50, например от примерно 1,5 до примерно 100 раз, например от примерно 1,5 до примерно 10 раз, например примерно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или примерно в 10 раз ниже по сравнению со значением ЕС50 антитела 1А7, описанного в публикации США 2015/0307617, в анализе, приведенном в разделе 8.1.8.

[0089] Анти-OX40 антитело по изобретению может активировать рецептор OX40 человека без перекрестного связывания со значением ЕС50 от примерно 1 нМ до примерно 100 нМ в анализе, приведенном в разделе 8.1.8, и может активировать рецептор OX40 человека при перекрестном связывании с более низким значением ЕС50, равным, например, примерно от 1,5 до примерно 10 раз ниже по сравнению со значением ЕС50 антитела 1А7, описанного в публикации США 2015/0307617, в анализе приведенном в разделе 8.1.8. Примеры анти-OX40-антител с вышеуказанными свойствами, включают Mu3738 и Hu3738, как описано в примерах 2-8 настоящего описания.

[0090] Обычно активация OX40 при обработке анти-OX40 антителом приводит к передаче сигнала, например, к повышению продукции цитокинов (например, интерферон-гамма (IFN-γ)) и/или к усилению пролиферации клеток, например, пролиферации CD4+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления продукция IFN-γ после обработки 1 мкг/мл анти-OX40 антителом увеличивается примерно в 1,5-50 раз, например, примерно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, В 10, 15, 20, 25, 30, 40 раз или примерно в 50 раз по сравнению с уровнем продукции IFN-γ после обработки эквивалентным количеством антитела того же изотипа. В некоторых вариантах осуществления пролиферация CD4+ T-клеток после обработки 1 мкг/мл анти-OX40-антителом увеличивается примерно в 1,5-20 раз, например, примерно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 раз или примерно в 20 раз по сравнению с уровнем пролиферации CD4+ Т-клеток после обработки эквивалентным количеством антитела того же изотипа. Анализы для определения уровней цитокинов или для определения уровней пролиферации клеток известны в данной области. Конкретный анализ и условия этого анализа для определения продукции IFN-γ и/или пролиферации CD4+ T-клеток приведены в настоящем описании в разделе 8.1.12.

7.4 Полинуклеотиды, кодирующие анти-OX40 антитела, системы экспрессии и способы их получения

[0091] Настоящее описание включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гены легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина анти-OX40 антител, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, способные продуцировать анти-OX40 антитела по настоящему изобретению.

[0092] Анти-OX40-антитело по изобретению может быть получено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для экспрессии антитела рекомбинантным образом, клетку-хозяин трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые легкие и тяжелые цепи антитела, так что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, необязательно, секретируются в среду, в которой культивируются клетки-хозяева, из которой можно извлечь антитела. Стандартные методики рекомбинантной ДНК используют для получения генов тяжелых и легких цепей антител, включения этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева, например, как описано в Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) и в патенте США 4816397.

[0093] Для получения нуклеиновых кислот, кодирующих такие анти-OX40 антитела, сначала получают фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Эти ДНК могут быть получены путем амплификации и модификации ДНК или кДНК зародышевой линии, кодирующих вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепи, например, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека известны в данной области (см., например, базу данных последовательностей зародышевой линии человека «VBASE»; см. также Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; и Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).

[0094] После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты V_H и V_L анти-OX40-антитела, с этими фрагменты ДНК можно проводить дополнительные манипуляции стандартными методами рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерных цепей антитела, в гены Fab-фрагментов или в ген scFv. При этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий V_L или V_H, фунционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, например, константную область антитела или гибкий линкер. Термин «функционально связанный», используемый в данном контексте, предназначен для обозначения того, что два фрагмента ДНК объединены так, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.

[0095] Выделенная ДНК, кодирующая область V_H, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем фунционального связывания ДНК, кодирующей V_H, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2, CH3 и, необязательно, CH4). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, включающие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но в некоторых вариантах осуществления представляет собой IgG1 или IgG4. Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента, ДНК, кодирующая V_H, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область CH1 тяжелой цепи.

[0096] Выделенная ДНК, кодирующая область V_L, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания ДНК, кодирующей V_L, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, включающие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда, но в некоторых вариантах осуществления представляет собой константную область каппа. Для создания гена scFv, фрагменты ДНК, кодирующие V_H и V_L, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly₄~Ser)₃ (SEQ ID NO:60), например так, чтобы последовательности V_H и V_L могли экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями V_L и V_H, связанными гибким линкером (см., например, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).

[0097] Для экспрессии анти-OX40-антител по настоящему изобретению, ДНК, кодирующие часть или всю легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано выше, встраивают в векторы экспрессии, так чтобы гены были функционально связаны с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте под термином «функционально связанный» следует понимать, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности внутри вектора выполняли предназначенную для них функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы или, как правило, оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии.

[0098] Гены антитела встраивают в вектор экспрессии стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела или векторе, или лигированием тупого конца, если сайты рестрикции отсутствуют). До введения последовательностей легкой или тяжелой цепи анти-ОX40 антитела, вектор экспрессии может уже нести последовательности константной области антитела. Например, один из подходов к преобразованию последовательностей V_H и V_L моноклонального анти-OX40 антитела в гены полноразмерных антител заключается в их встраивании в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи, соответственно, так, чтобы сегмент V_H был функционально связан с сегментом(ами) СН в векторе, а сегмент V_L был функционально связан с сегментом CL в векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в векторе таким образом, что сигнальный пептид был связан в рамке считывания с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (то есть сигнальным пептидом белка, не являющегося иммуноглобулином).

[0099] Кроме генов цепи антител, рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению нести регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Под термином «регуляторная последовательность» следует понимать промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, желаемый уровень экспрессии белка и тому подобное. Подходящие регуляторные последовательности экспрессии клеток-хозяев млекопитающих включают вирусные элементы, которые контролируют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, например промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (например, промотор/энхансер CMV), вирус обезьяны 40 (SV40)) (например, промотор/энхансер SV40), аденовирус (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Дополнительное описание регуляторных элементов вирусов и их последовательностей приведено, например, в патенте США №5168062, Stinski, патенте США №4510245, Bell et al., и патенте США №4968615, Schaffner et al.

[0100] Кроме генов цепей антител и регуляторных последовательностей, рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точку начала репликации) и маркерные гены селекции. Маркерный ген селекции облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, Axel et al.). Например, обычно используемый маркерный ген селекции придает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, устойчивость к лекарствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Подходящие маркерные гены селекции включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в клетках-хозяевах DHFR с селекцией/амплификацией метотрексатом) и ген neo (для селекции G418). Для экспрессии легкой и тяжелой цепей, вектор(ы) экспрессии, кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяин стандартными методами. Предполагается, что различные варианты термина «трансфекция» включают широкий спектр методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например электропорацию, липофекцию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию DEAE-декстраном и тому подобное.

[0101] Анти-OX40-антитела по настоящему изобретению можно экспрессировать либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах. В некоторых вариантах осуществления экспрессия антител осуществляется в эукариотических клетках, например клетках-хозяевах млекопитающих, с оптимальной секрецией правильно свернутого и иммунологически активного антитела. Примеры клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению, включают клетки яичнка китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки DHFR-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используя маркером селекции DHFR, например, как описано в Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в период, достаточный для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды стандартными методами очистки белка. Клетки-хозяева также можно использовать для получения анти-OX40-связывающих фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Понятно, что варианты вышеописанной процедуры входят в рамки настоящего раскрытия. Например, может быть желательным трансфицировать клетку-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) анти-OX40 антитела по настоящему изобретению.

[0102] Технология рекомбинантной ДНК также может быть использована для удаления части или всей ДНК, кодирующей одну или обе легкие и тяжелые цепи, которые не требуются для связывания с OX40 человека. Молекулы, экспрессируемые из таких усеченных молекул ДНК, также относятся к антителам по изобретению.

[0103] Для рекомбинантной экспрессии анти-OX40-антитела по изобретению, клетка-хозяин может быть подвергнута трансфекции одновременно двумя векторами экспрессии по настоящему изобретению, причем первый вектор кодирует полипептид тяжелой цепи, а второй вектор кодирует полипептид легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные маркеры селекции или каждый из них может содержать отдельный маркер селекции. Альтернативно, можно использовать один вектор, который кодирует полипептиды как тяжелой, так и легкой цепи.

[0104] После получения нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько частей анти-OX40 антитела, в кодирующую последовательность могут быть внесены дополнительные изменения или мутации, например, для получения нуклеиновых кислот, кодирующих антитела с различными последовательностями CDR, антитела с пониженной аффинностью к Fc-рецептору или антитела разных подклассов.

[0105] Анти-OX40-антитела по изобретению также могут быть получены химическим синтезом (например, способами, описанными в Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Варианты антител также могут быть получены с использованием бесклеточной платформы (см., например, Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) и Murray et al., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420-426).

[0106] Если анти-OX40-антитело по изобретению получено рекомбинантной экспрессией, то его можно очистить любым способом, известным в данной области, для очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ионный обмен, аффиннная колонка и колонка с разделением по размеру), центрифугированием, дифференциальной растворимостью или любым другим стандартным способом очистки белков. Кроме того, анти-OX40-антитела по настоящему изобретению могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в настоящем документы, или с известными в данной области для облегчения очистки.

[0107] После выделения анти-OX40 антитело может, если необходимо, быть дополнительно очищено, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (см., например, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980), or by gel filtration chromatography on a SuperdexTM 75 column (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden).

7.5 Фармацевтические композиции

[0108] Анти-OX40 антитела, описанные в настоящем документе, могут находится в форме композиций, содержащих антитело и один или несколько носителей, вспомогательных агентов и/или разбавителей (все указаны в настоящем документе как «носители»), то есть, буферные агенты, стабилизирующие агенты, консерванты, изотонические агенты, неионные детергенты, антиоксиданты и другие различные добавки. См., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Композиции могут быть составлены для конкретного применения, например, для применения в ветеринарии или для фармацевтического применения у людей. Форма композиции (например, сухой порошок, жидкая композиция и тому подобное) и используемые носители зависят от предполагаемого применения антитела и, в случае терапевтического применения, от способа введения.

[0109] Для терапевтического применения композиции могут быть представлены как часть стерильной фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция может быть в любой подходящей форме (в зависимости от желаемого способа введения ее пациенту). Фармацевтическую композицию можно вводить пациенту различными путями, такими как внутривенный, внутриопухолевый или интратекальный путь. Наиболее подходящий путь введения в любом конкретном случае зависит от конкретного антитела, индивида, а также от природы и тяжести заболевания и физического состояния индивида. Как правило, фармацевтическую композицию вводят внутривенно.

[0110] Фармацевтические композиции могут быть для удобства представлены в единичных лекарственных формах, содержащих заранее определенное количество анти-ОХ40-антитела, описанного в настоящем документе, на дозу. Количество анти-OX40 антитела, входящего в состав стандартной формы, зависит от заболевания, в отношении которого проводят лечение, а также от других факторов, известных в данной области. Такие стандартные дозы могут находится в форме лиофилизированного сухого порошка, содержащего количество антитела, подходящее для однократного введения, или в форме жидкости. Единичные лекарственные формы в виде сухого порошка могут быть упакованы в набор со шприцем, подходящим количеством носителя и/или других компонентов, подходящих для введения. Единичные формы в жидкой форме могут быть для удобства представлены в форме шприца, предварительно заполненного количеством анти-OX40 антитела, подходящим для однократного введения.

[0111] Фармацевтические композиции также могут находится в партии, содержащей количество анти-OX40 антитела, подходящее для многократного введения.

[0112] Фармацевтические композиции могут быть получены для хранения в виде лиофилизированных составов или водных растворов путем смешивания антитела с желаемой степенью чистоты и необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, обычно используемыми в данной области. Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

[0113] Например, для внутривенного введения композиция может быть в форме лиофилизированного порошка, который после разведения стерильной водой или другим раствором, подходящим для инъекции или инфузии (например, 0,9% физиологический раствор, раствор Рингера, раствор Рингера с лактатом и тому подобное) дает водную композицию.

7.6 Способы применения

7.6.1 Терапевтический эффект

[0114] Представленные в настоящем документе данные демонстрируют, что описанные анти-OX40 антитела активируют рецептор OX40 в присутствии злокачественных клеток и проявляют сильную противоопухолевую активность против злокачественных новообразований in vivo. Соответственно, анти-OX40-антитела и/или фармацевтические композиции, содержащие анти-OX40-антитела, могут быть использованы в терапии злокачественных новообразований.

[0115] В некоторых вариантах осуществления, злокачественное новообразование представляет собой солидную опухоль. Солидные опухоли, которые можно лечить антителом против OX40, включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы (например, тройной негативный рак молочной железы), рак головы и шеи, рак почки (например, почечно-клеточный рак), рак печени (например, гепатоцеллюлярная карцинома, холангиокарцинома), рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, мелкоклеточный рак легкого), меланому (например, неоперабельная или метастатическая меланома, прогрессирующая злокачественная меланома), рак кожи (например, карцинома из клеток Меркеля), рак яичников, рак желудка и опухоли с признаками дефекта репарации ошибочно спаренных нуклеотидов в ДНК. Рак может состоять из опухолей, содержащих OX40-экспрессирующие клетки; состоят из опухолей, некоторые из которых содержат OX40-экспрессирующие клетки, а некоторые не содержат; или состоять из опухолей, в которых отсутствуют OX40-экспрессирующие клетки. Рак может быть впервые диагностированным и наивным для лечения, или может быть рецидивирующим, рефрактерным или рефрактерно-рецидивирующим, или метастатической формой солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль наивна в отношении средства, нацеленного на PD-1 или PD-L1. В других вариантах осуществления солидная опухоль является рецидивирующей или рефрактерной после лечения средством, нацеленным на PD-1 или PD-L1. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака почки, рака легкого, меланомы и рака желудка. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из меланомы (например, неоперабельной или метастатической меланомы), рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого) и почечно-клеточного рака (например, прогрессирующего почечно-клеточного рака). В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из тройного негативного рака молочной железы, рака яичника, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, мелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы, холангиокарциномы, карциномы Меркеля и опухолей с признаками дефекта репарации ошибочно спаренных нуклеотидов в ДНК. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой метастатический немелкоклеточный рак легкого с прогрессированием при проведении или после проведения химиотерапии на основе платины. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой местно-распространенный или метастатический немелкоклеточный рак легкого, который не отвечает на терапию на основе платины и терапию средством, нацеленным на PD-1 или PD-L1. В некоторых вариантах осуществления рак головы и шеи представляет собой рецидивирующую плоскоклеточную карциному головы и шеи, которая не подходит для куративного лечения местной или системной терапией, или метастатическую (диссеминированную) плоскоклеточную карциному головы и шеи полости рта, ротоглотки, нижней части гортани и гортань, которая считается неизлечимой при местной терапии.

[0116] Как обсуждалось выше, описанные настоящем документе анти-ОХ40-антитела модулируют иммунологический ответ. Соответственно, пациенты с нарушенной иммунной системой могут быть исключены из лечения. В некоторых вариантах осуществления пациент исключается в случае соответствия одному или нескольким следующим критериям: (1) Активное или ранее зарегистрированное аутоиммунное заболевание (включая, но не ограничиваясь, воспалительное заболевание кишечника, целиакия, синдром Вегенера) в течение последних 2 лет. (Пациенты с атопией или астмой в детстве, витилиго, алопецией, синдромом Хашимото, болезнью Грейвса или псориазом, у которых не требуется проведения системного лечения (в течение последних 2 лет), не исключаются); (2) С первичным иммунодефицитом, трансплантацией костного мозга, хроническим лимфоцитарным лейкозом, трансплантацией твердых органов в анамнезе или у которых ранее был клинически диагностирован туберкулез; (3) С коагулопатией или тромбоцитарным нарушением в анамнезе; (4) С подтвержденным положительным результатом теста на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или индивиды с хроническим или активным гепатитом B или C. (Сюда также можно отнести индивидов с гепатитом B или C в анамнезе, у которых было зарегистрировано излечение после проведения антивирусной терапии); (5) С иммунно-опосредованной нейротоксичностью или пневмонией, развивающейся на фоне иммунотерапии с предварительной оценкой ≥3 (включая, но ими не ограничиваясь, средства, нацеленные на CTLA-4, PD-L1 или PD-1). Кроме того, любое другое иммуноопосредованное неблагоприятное событие при иммунотерапии, которое не прошло или стало бессимптомным в течение 3 месяцев и имеющее предварительную оценку ≥ 3; (6) Являются реципиентами живой аттенуированной вакцины в течение 28 дней перед первой дозой анти-OX40 антитела.

[0117] Анти-OX40-антитело по изобретению можно вводить самостоятельно (монотерапия) или в дополнение к другим противоопухолевыми терапевтическими средствами и/или с мишеневыми или немишеневыми противоопухолевыми средствами или вместе с ними. При монотерапии анти-OX40 можно использовать одно или несколько антител. Независимо от того проводится ли монотерапия или дополнительная терапия к другим, вместе с другим методам лечения или средствами, количество анти-OX40 антитела вводится так, что общая схема лечения давала терапевтический эффект.

[0118] Под терапевтическим эффектом понимают любой показанный клинический эффект у пациента при использовании анти-OX40-антител по сравнению с отсутствием терапии (если подходит) или по сравнению с известным стандартом лечения. Клинический эффект может быть оценен любым способом, известным специалисту в данной области. В одном из вариантов осуществления клинический эффект оценивают по проценту пациентов с объективным ответом (ORR) (определяется с помощью RECIST, версия 1.1), продолжительности ответа (DOR), выживаемости без прогрессирования (PFS) и/или общей выживаемости (OS). В некоторых вариантах осуществления полный ответ указывает на терапевтический эффект. В некоторых вариантах частичный ответ указывает на терапевтический эффект. В некоторых вариантах стабильное заболевание указывает на терапевтический эффект. В некоторых вариантах осуществления увеличение общей выживаемости указывает на терапевтический эффект. В некоторых вариантах осуществления терапевтический эффект представляет собой увеличение временного промежутка до прогрессирования заболевания и/или улучшение симптомов или качества жизни. В других вариантах осуществления терапевтический эффект не относится к увеличению периода контроля над заболеванием, а, скорее, заметно уменьшает количество симптомов, что приводит к улучшению качества жизни. Специалистам в данной области будет очевидно, что терапевтический эффект можно наблюдать при использовании только анти-ОХ40-антител (монотерапия) или при в дополнение к другим противоопухолевым методам или/или мишеневыми или немишеневыми противоопухолевым средствам.

[0119] Как правило, терапевтический эффект оценивают, используя стандартные клинические тесты, разработанные для измерения ответа на новое лечение злокачественного новообразования. Для оценки терапевтического эффекта анти-OX40-антител, описанных в настоящем документе, можно использовать один или комбинацию следующих тестов: (1) критерий оценки ответа при солидных опухолях (RECIST), версия 1.1, (2) иммунно-связанный RECIST (irRECIST) ), (3) общее состояние по критериям Восточной объединенной группы онкологов (ECOG), (4) критерий иммунного ответа (irRC), (5) оценку заболевания по опухолевым антигенам, (6) по достоверной шкале результатов ответа у пациентов, и/или (7) по оценке Каплана-Мейера общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования заболевания.

[0120] Оценка изменения опухолевой нагрузки является важным признаком клинической оценки противоопухолевой терапии. Как уменьшение опухоли (объективный ответ), так и время до прогрессирования заболевания являются важными конечными точками в клинических испытаниях злокачественных новообразований. Стандартизированные критерии ответа, известные как RECIST (критерии оценки ответа солидных опухолей), были опубликованы в 2000 году. Обновление (RECIST 1.1) было выпущено в 2009 году. Критерии RECIST обычно используются в клинических испытаниях, если объективный ответ является первичной конечной точкой исследования, а также в испытаниях, в которых проводится оценка стабильного заболевания, прогрессирования опухоли или анализа времени до прогрессирования, поскольку эти показатели основаны на оценке анатомической опухолевой нагрузки и на изменении в ходе испытания. В ТАБЛИЦЕ 8 приведены определения критериев ответа, используемые для определения объективного ответа опухоли на тестируемое лекарственное средство, такое как анти-OX40 антитела, описанные в настоящем документе.

ТАБЛИЦА 8
Ответ	Критерий
Полный ответ (CR)	Исчезновение всех целевых поражений. Любые патологические лимфатические узлы (целевые или нецелевые) должны уменьшаться в диаметре до <10 мм.
Частичный ответ (PR)	Уменьшение суммы диаметров целевых поражений по меньшей мере 30%, принимая за основу базовые диаметры суммы.
Прогрессирующее заболевание (PD)	Увеличение по меньшей мере на 20% суммы диаметров целевых поражений, принимая за основу наименьшую сумму при исследовании (включая базовую сумму, если она наименьшая при исследовании). Помимо относительного увеличения на 20%, сумма также должна иметь абсолютное увеличение по меньшей мере на 5 мм. (Примечание: появление одного или нескольких новых поражений также считается прогрессированием).
Стабильное заболевание (SD)	Отсутствие значительного уменьшения, чтобы считаться PR, отсутствие достаточного увеличения, чтобы считаться PD, принимая за основу во наименьшую сумму диаметров во время исследования.

[0121] Вторичные показатели, которые можно использовать для определения терапевтического эффекта анти-OX40-антител, описанных в настоящем документе, включают в себя процент пациентов с объективным ответом (ORR), выживаемость без прогрессирования (PFS), общее выживание (OS), длительность общего ответа (DOR) и степень ответа (DpR). ORR определяется как процент участников, которые дали полный ответ (CR) или частичный ответ (PR). PFS определяется как время от даты первой дозы анти-OX40 антитела до прогрессирования заболевания или смерти, в зависимости от того, что наступит раньше. OS определяется как промежуток времени от даты постановки диагноза до начала лечения заболевания, если диагностированные пациенты живы. DOR определяется как время от начального CR или PR до момента прогрессирования заболевания. DpR определяется как процент уменьшения опухоли, наблюдаемый в точке максимального ответа по сравнению с исходной опухолевой нагрузкой. Клинические точки для ORR и PFS могут быть определены на основе критериев RECIST 1.1, описанных выше.

[0122] Дополнительные критерии, которые можно использовать для клинической оценки, специфичной для онкологических больных, проходящих курс иммунотерапии, включают стандартизированные иммуно-связанные критерии RECIST (irRECIST). См., например, Nishino, M. et al. Eur. J. Radiol., 84(7), pages 1259-1268 (2015 July). Эти руководящие принципы изменили критерии RECIST 1.1, указанные выше, с учетом потенциальных иммуномодулирующих эффектов. В ТАБЛИЦЕ 9 приведены определения критериев ответа, используемые для определения объективного ответа опухоли на иммуномодулирующее лекарственное средство, такое как анти-OX40 антитела, описанные в настоящем документе.

ТАБЛИЦА 9
Ответ	Критерий
Полный ответ (irCR)	Полное исчезновение всех измеримых и неизмеримых поражений. Лимфатические узлы должны уменьшаться до <10 мм по наименьшему диаметру.
Частичный ответ (irPR)	Снижение общей измеренной опухолевой нагрузки на ≥ 30% по сравнению с исходными нецелевыми поражениями представляет собой irNN, и нет однозначного прогрессирования новых неизмеримых поражений
Прогрессирующее заболевание (irPD)	Увеличение по меньшей мере на 20% и абсолютное увеличение TMTB по меньшей мере на 5 мм по сравнению с nadir или irPD для нецелевых или новых неизмеримых поражений. Подтверждение прогрессирования рекомендуется проводить по крайней мере через 4 недели после первой оценки irPD.
Не-irCR или не-irPD (irNN)	В начале исследования не было выявлено целевого заболевания, и при последующем наблюдении пациент не соответствовал критериям irCR или irPD.
Стабильное заболевание (irSD)	Отсутствие значительного уменьшения, чтобы считаться irPR, отсутствие достаточного увеличения, чтобы считаться irPD, принимая за основу во наименьшую сумму диаметров во время исследования.
irNE	Используется в исключительных случаях, если данных не достаточно.

[01023] Шкала общего состояния ECOG, показанная в ТАБЛИЦЕ 10, используется для описания общего функционального состояния пациента с точки зрения его способности заботиться о себе, осуществлять повседневную активность и физические способности. Шкала была разработана Восточной объединенной группой онкологов (ECOG), в настоящее время входящей в состав исследовательской группы ECOG-ACRIN, и опубликована в 1982 году

ТАБЛИЦА 10
Степень	Общее состояние по ECOG
0	Полностью активен, способен выполнять все действия, без ограничений, как и раньше, до болезни
1	Ограничен в физической активности, но наблюдается амбулаторно и может выполнять легкую или сидячую работу, например, работу по дому, работу в офисе
2	Наблюдается амбулаторно и способен к самообслуживанию, но не способен выполнять какую-либо работу; и вплоть или примерно до 50% от времени бодрствования
3	Способен только к ограниченному самообслуживанию; более 50% времени бодрствования прикован к кровати или креслу
4	Полностью инвалидизирован; не может заниматься самообслуживанием; лежачий или сидячий
5	Мертв

[0124] Еще один набор критериев, которые можно использовать для полной характеристики и определения ответа на иммунотерапевтические средства, такие как средства при терапии антителами злокачественных опухолей, представляет собой критерии иммунного ответа (irRC), которые были разработаны для измерения солидных опухолей в 2009 году, с обновлением в 2013 году (Wolchok, et al. Clin. Cancer Res., 2009; 15(23): 7412-7420 и Nishino, et al. Clin. Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943). Обычно для оценки эффекта иммунотерапевтического средства, такого как анти-OX40-антитело, описанное в настоящем документе, на опухолевую нагрузку используют обновленные критерии irRC, и ответ определяют в соответствии с ТАБЛИЦЕЙ 11.

ТАБЛИЦА 11
Ответ	Критерий
Полный ответ (CR)	Исчезновение всех целевых поражений в двух последовательных наблюдениях с интервалом не менее 4 недель
Частичный ответ (PR)	Уменьшение суммы максимальных диаметров целевых поражений по меньшей мере 30%, принимая за основу базовые диаметры суммы.
Прогрессирующее заболевание (PD)	Увеличение по меньшей мере на 20% суммы диаметров целевых поражений, принимая за основу наименьшую сумму при исследовании (включая базовую сумму, если она наименьшая при исследовании). (Примечание: появление одного или нескольких новых поражений не считается прогрессированием. Измерение новых поражений включается в сумму измерений).
Стабильное заболевание (SD)	Отсутствие значительного уменьшения, чтобы считаться PR, отсутствие достаточного увеличения, чтобы считаться PD, принимая за основу во наименьшую сумму диаметров во время исследования.

[0125] Одним из примеров терапевтического эффекта, возникающего в результате использования анти-OX40 антител, описанных в настоящем документе, для лечения солидных опухолей, независимо от того, применяют ли их как монотерапию или в дополнение к другим вариантам терапии или средствам, является полный ответ. Еще одним примером терапевтического эффекта, возникающего в результате применения анти-OX40 антител для лечения солидных опухолей, независимо от того, применяют ли их как монотерапию или как дополнение к другим вариантам терапии или средствам, является частичный ответ.

[0126] Достоверная шкала результатов лечения, сообщаемых пациентами, также может использоваться для отметки ответа, представляемого каждым пациентом через определенную систему отчетности. Вместо того, чтобы фокусироваться на заболевании, такие шкалы результатов лечения касаются сохранения активности при лечении хронического заболевания. Одним из неограничивающих примеров достоверных шкал результатов лечения, сообщаемых пациентами, является PROMIS® (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) Национального института здравоохранения США. Например, по PROMIS® Physical Function Instrument для взрослых онкологических больных, может проводить самооценку способности и функции верхних конечностей (например, ловкости), нижних конечностей (например, ходьба или подвижность) и центральных областей (например, подвижность шеи и спины) и включает повседневную активность, например выполнение поручений.

[0127] Кривые Каплана-Мейера (Kaplan и Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53 (282): 457-481) также можно использовать для оценки общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования заболевания у онкологических больных, получающих терапию антителами против OX40, по сравнению со стандартом лечения.

7.6.2 Дополнительная терапия

[0128] Анти-OX40 антитела могут быть использованы в дополнение к другим средствам или способам лечения, обладающим противораковыми свойствами, или вместе с ними, включая стандартные методы лечения, такие как терапия антителами против PD-1. При дополнительном использовании анти-ОХ40-антитело и другое средство(а) могут быть объединены вместе в одном комбинированном фармацевтическом составе или могут быть объедены и введены по отдельности, либо в едином согласованном режиме дозирования, либо в разных режимах дозирования. Средства, вводимые в дополнение к анти-OX40-антителам или вместе с ними, обычно будут иметь взаимодополняющую активность для анти-OX40-антител, так что антитела и другие агенты не будут оказывать неблагоприятного воздействия друг на друга.

7.7 Дозы и схемы введения

[0129] Количество вводимых анти-OX40-антител зависит от множества факторов, включая, но не ограничиваясь этим, конкретный тип онкологического заболевания, стадию такого заболевания, способ введения, частоту введения, желаемое терапевтическое воздействие, эффект и другие параметры, такие как возраст, вес и другие параметры пациента и тому подобное. Определение доз, эффективных для терапевтического эффекта при конкретных режимах и частоте введения, находится в пределах компетенции специалистов в данной области.

[0130] Дозы, эффективные для достижения терапевтического эффекта, могут быть первоначально оценены на животных моделях in vivo. Подходящие животные модели для широкого спектра заболеваний известны в данной области.

[0131] Анти-OX40-антитела, раскрытые в настоящем описании, могут вводиться любым путем, подходящим для состояния, подлежащего лечению. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело представляет собой любое гуманизированное антитело с тяжелой цепью с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41-48, и легкой цепью с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51-54. В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41 или 42 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51. Анти-OX40 антитело обычно вводят парентерально, то есть инфузией, внутривенно (IV), интратекально, болюсно, внутриопухолево или эпидурально (Shire et al., 2004, J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402). В одном из вариантов осуществления, анти-OX40 антитело находится в виде лиофилизированного порошка во флаконе. Перед введением лиофилизированный порошок восстанавливают стерильной водой для инъекций (SWFI) или другой подходящей средой для получения раствора, содержащего анти-OX40 антитело. В некоторых вариантах осуществления полученный восстановленный раствор также разбавляют физиологическим раствором или другой подходящей средой для инфузии и вводят посредством внутривенной инфузии один раз каждые две недели, то есть каждые 13, 14 или 15 дней.

[0132] В некоторых вариантах осуществления анти-OX40 антитело вводят в виде внутривенной инфузии один раз каждые две недели в дозе 0,01 мг/кг, 0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг.

[0133] При введении в дополнение или вместе с другими средствами, такими как другие химиотерапевтические средства, анти-OX40 антитела можно вводить по той же схеме, по которой вводят другие средства, или согласно другой схеме. При введении по той же схеме анти-OX40-антитело можно вводить перед, после или одновременно с другим средством.

[0134] Как понятно специалистам в данной области, рекомендуемые дозы для различных средств, описанных выше, могут нуждаться в корректировке для получения оптимального ответа пациента и максимального терапевтического эффекта.

ПРИМЕРЫ

[0135] Следующие примеры, которые подчеркивают определенные признаки и свойства вариантов осуществления анти-OX40 антител, описанных в настоящем документе, предоставлены для иллюстрации, а не ограничения.

Пример 1. Материалы и методы

8.1.1. Связывание анти-OX40 антитела с OX40 человека в анализе ELISA

[0136] 96-луночные планшеты Immunolon 4xHB (Thermo Scientific) покрывали 1 мкг/мл OX40-Fс человека (R&D Systems) при 4°С в течение ночи. Планшеты блокировали фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем трижды промывали PBST (PBS с 0,1% Tween 20), используя устройство для промывания планшетов. Затем планшеты, покрытые ОХ40, инкубировали с указанными концентрациями тестируемого антитела при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты четыре раза промывали PBST и затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 100 мкл козлиных анти-человеческие Fab-фрагментов, связанных с биотином (Jackson ImmunoResearch), приготовленного до разведения 1:5000 в PBS, содержащем 1% BSA. Затем планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл стрептавидин-пероксидаза хрена (HRP) в разведении 1:1000 (Thermo Scientific) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл однокомпонентного TMB (Surmodics) и инкубировали при комнатной температуре (КТ) до появления цвета (приблизительно 5-10 минут). Оптическую плотность (OD) считывали при 650 нм (Molecular Devices Spectromax190).

8.1.2. Связывание анти-OX40 антитела с OX40 яванского макака в анализе ELISA

[0137] 96-луночные планшеты Immunolon 4xHB (Thermo Scientific) покрывали 1 мкг/мл слитого белка OX40-Fс яванского макака при 4°С в течение ночи. Планшеты блокировали PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), в течение 30 минут при КТ, а затем трижды промывали PBST (PBS с 0,1% Tween 20). Затем планшеты, покрытые ОХ40, инкубировали с указанными концентрациями анти-OX40 антитела при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты четыре раза промывали PBST и затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 100 мкл козлиными анти-человеческими Fab-фрагментами, связанными с биотином (Jackson ImmunoResearch), приготовленного до разведения 1:5000 в PBS, содержащем 1% BSA. Затем планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл стрептавидин-HRP (Thermo Scientific) в разведении 1:1000 и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл однокомпонентного TMB (Surmodics) и инкубировали при комнатной температуре до появления цвета (приблизительно 5-10 минут). Оптическую плотность (OD) считывали при 650 нм (Molecular Devices Spectromax190).

8.1.2. Связывание анти-OX40 антитела с OX40 макака-резус в анализе проточной цитометрии

[0138] OX40 макака-резуса (Macaca mulatta) идентична OX40 яванского макака (Macaca flavicularis) (SEQ ID NO:2) на аминокислотном уровне. Репортерную клеточную линию 293 NF-κB, экспрессирующую OX40 макака-резус, культивировали в среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин/стрептомицин. Для анализа связывания клетки ресуспендировали в количестве 5 миллионов клеток на мл. 50 мкл (250000 клеток)/лунка переносили в каждую лунку полипропиленового 96-луночного планшета с объемом 500 мкл (Nunc). В отдельном планшете готовили 2х маточный раствор тестируемого анти-OX40-антитела или моноклонального контрольного изотипического антитела для разведения при 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 нМ в культуральной среде. Моноклональные антитела (50 мкл/лунка) переносили в соответствующие лунки планшета для анализа. Клетки инкубировали с первичными антителами в течение 30 минут при 4°С и дважды промывали 250 мкл/лунка PBS центрифугированием при 800 об/мин в течение 3 минут. Связанное антитело детектировали с помощью ослиного Cy5 против IgG человека (H+L) (Jackson ImmunoResearch), разведенного до 2 мкг/мл (50 мкл/лунка) в PBS в течение 30 минут при 4°С. Клетки промывали один раз 250 мкл/лунка PBS, ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формальдегид, и анализировали на двойном лазере FACSCalibur (Becton Dickinson).

8.1.4. Аффинность связывания анти-OX40 антитела с OX40 человека и макака-резуса в анализе поверхностного плазмонного резонанса

[0139] Кинетику связывания анти-OX40-антитела с рекомбинантным растворимым ECD (внеклеточный домен) OX40 определяли измерениями на основе поверхностного плазмонного резонанса, проведенными на приборе Biacore T200 (GE Healthcare) при 25°C, используя анализа захвата Fc. Приобретали рекомбинантные внеклеточные домены (ECD) OX40 человека (остатки 1-216) и макака-резус OX40 (остатки 28-214) (Creative Biomart) и дополнительно очищали гель-фильтрацией на Superdex200 (GE Healthcare) в 10 мМ 4-(2)-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоте (HEPES), pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (EDTA). OX40 макака-резуса (Macaca mulatta) идентична OX40 яванского макака (Macaca flavicularis) (SEQ ID NO: 2) на аминокислотном уровне. Готовили чипы и проводили кинетические измерения в буфере для анализа HBS-EP+ (10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Твин 20). Для получения чипа для захвата Fc, около 2000 резонансных единиц (RU) поликлонального козлиного анти-человеческого Fc IgG (Thermo Fisher Scientific Inc.), разведенного до 25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5) непосредственно иммобилизировали на биосенсорную микросхему CM5, используя стандартный набор для связывания в соответствии с инструкциями и методиками производителя. Непрореагировавшие молекулы на поверхности биосенсора блокировали этаноламином. Для измерения кинетики связывания каждый цикл анализа состоял из следующих этапов: 1) захват тестируемого анти-OX40 антитела только на тестовой поверхности; 2) инъекция аналита (OX40 ECD или только буфер) на контрольную и тестовую поверхность, 240 мкл при 80 мкл/мин, затем контроль диссоциацию в течение 900 секунд при 80 мкл/мин; 3) регенерация поверхности захвата инъекциями 10 мМ глицин-HCl, pH 1,5 как на контрольной, так и на тестовой поверхности. Во время анализа все измерения сопоставляли с измерениями на поверхности захвата (то есть без захвата тестируемого антитела), и инъекции только буфера использовали для двойного контроля. Инъекции ОХ40 изменяли от концентрации 900 нМ или 300 нМ до 11,11 нМ в рандомизированной 9- или 3-кратной серии разведений, соответственно. Данные обрабатывали и глобально адаптировали к модели связывания 1:1, используя программное обеспечение Biacore T200 Evaluation для определения констант кинетической скорости связывания, k_a (M^-1с^-1) и k_d (с^-1), а также равновесной константы диссоциации K_D (M).

8.1.5. Блокирование лиганда OX40 анти-OX40 антителом

[0140] Клетки Jurkat, стабильно трансфицированные OX40 человека, культивировали в 2×10⁵ клеток/лунка, одновременно инкубировали с 0,2 мкг/мл тестируемого анти-OX40 антитела и титровали растворимый OX40L человека (R&D systems) в PBS, содержащем 1% BSA в 96-луночном планшете с круглым дном в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки дважды промывали и инкубировали в течение еще 30 минут с 100 мкл козлиным анти-человеческим Fc PE (Jackson ImmunoResearch) на лунку в разведении 1:500. Затем клетки дважды промывали и обнаруживали с помощью FACSCanto (BD Biosciences) и анализировали с помощью FACSDiva.

8.1.6. Связывание анти-OX40 антитела с OX40 человека, экспрессируемого на клеточной поверхности

[0141] Репортерную клеточную линию Jurkat NF-κB, экспрессирующую белок OX40 человека, культивировали в DMEM, содержащей 10% FBS и пенициллин/стрептомицин (пен./стрепт.). Для анализа связывания каждую клеточную линию ресуспендировали в количестве 5 миллионов клеток на мл. 50 мкл (250000 клеток)/лунка переносили в каждую лунку полипропиленового 96-луночного планшета с объемом 500 мкл (Nunc). В отдельном планшете готовили 2х маточный раствор тестируемого анти-OX40-антитела или контрольного изотипического mAb для разведения при 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 нМ в культуральной среде. Каждое антитело (50 мкл/лунка) переносили в соответствующие лунки планшета для анализа. Клетки инкубировали с тестируемым анти-OX40-антителом или контрольными изотипическими антителами в течение 30 минут при 4°С и дважды промывали 250 мкл/лунка PBS, центрифугируя при 800 об/мин в течение 3 минут. Связанное антитело детектировали с помощью ослиного Cy5 против IgG человека (H+L) (Jackson ImmunoResearch), разведенного до 2 мкг/мл (50 мкл/лунка) в PBS в течение 30 минут при 4°C. Клетки промывали один раз 250 мкл/лунка PBS, ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формальдегид, и анализировали на двухчастотном лазере FACSCalibur (Becton Dickinson).

8.1.7. Связывание анти-ОХ40 антитела с химерным рецептором ОХ40

[0142] Получали трансфектанты на основе 293 для экспрессии химерных вариантов молекулы OX40 человека с помощью OX40-богатых цистеином доменов (CRD) мыши, в каждом случае с заменой на соответствующие CRD человека. После отбора G418 выжившие клетки сортировали по экспрессии на проточном цитометре MoFlo (Beckman): 293s-huOX40, 293s-huOX40-muCRD1, 293s huOX40 muCRDII, 293s-huOX40-muCRDIII, 293s-huOX40-muCRDIV, 293s huCRDIV, 293s III и 293s-muOX40. В общей сложности 2×10⁵ каждого химерного трансфектантна OX40 на основе 293s на лунку добавляли в полипропиленовые 96-луночные планшеты объемом 500 мкл (Nunc). После посева клеток 50 мкл Hu3738 или изотипического контрольного антитела в концентрации 2 мкг/мл добавляли в соответствующие лунки в двух повторах для каждой клеточной линии и оставляли инкубироваться на льду в течение 30 минут. После инкубации в каждую лунку добавляли 200 мкл физиологического раствора Дульбекко с фосфатным буфером (DPBS) и планшеты центрифугировали при 1000 об/мин в течение трех минут. Супернатанты из каждой лунки удаляли и добавляли 50 мкл вторичного антитела ослиного CyG против IgG человека (Jackson ImmunoResearch) в разведении 1:250, а затем инкубировали в течение 30 минут на льду в темноте. После периода инкубации добавляли 200 мкл DPBS, а затем центрифугировали планшет при 1000 об/мин в течение трех минут. Супернатанты удаляли и каждую лунку повторно суспендировали вместе с 100 мкл DPBS+1% формальдегида. Образцы анализировали на двухчастотном лазерном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson).

8.1.8. Репортерная флуоресцентная активность NF-κB в отношении OX40 человека и макака-резус

[0143] Репортерные клеточные линии Jurkat-NF-κB-huOX40 и 293-NF-κB-RhOX40, NF-κB, экспрессирующие белки OX40 человека и макака-резуса, соответственно, поддерживали в культуральной среде, содержащей DMEM, содержащей 10% FBS и пенициллин/стрептомицин (100 Ед/мл). Для репортерного анализа NF-κB клеточную линию Jurkat-NF-κB-huOX40 ресуспендировали в среде для роста (идентична культуральной среде) при 1 млн/мл (в итоге 50000 клеток/лунка) и клеточную линию 293 NF-κB RhOX40 ресуспендировали в питательной среде при 0,5 млн/мл (в итоге 25000 клеток/лунка). 50 мкл/лунка переносили во внутренние 60 лунок 96-луночного аналитического планшета с белым/прозрачным дном (Costar 3903). В отдельном 96-луночном планшете для разведения с U-образным дном (Becton Dickinson) готовили 3х маточный раствор следующих антител: анти-PD-1 антитело, используемое в качестве отрицательного контроля, и анти-OX40 антитело. Серия разведений для тестирования активности антител без экзогенного связывающего агента включала 2000, 500, 125, 31,25, 7,812, 1,953, 0,488, 0,122, 0,0305, 0,00762 нМ в культуральной среде. Серия разведений для проверки эффекта связующего агента на активность анти-OX40 антитела включала 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305, 0,000762 нМ антитела. 50 мкл/лунка антитело переносили в соответствующие лунки планшета для анализа с двукратным повтором. В планшеты только с антителом добавляли 50 мкл/лунка среды во внутренние 60 лунок. Для серии разведений с связывающим агентом антитело козы против Fc IgG человека (Jackson ImmunoResearch) разводили до 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305 нМ и 50 мкл/лунка и переносили во внутренние 60 лунок для поддержания пропорции 4:1 анти-ОХ40-антитела и связывающего агента. Среду для роста (150 мкл) добавляли во внешние лунки для того, чтобы предотвратить испарение во внутренних 60 лунках. Планшеты инкубировали при 37°С в течение приблизительно 18 часов. Активность люциферазы определяли количественно с помощью BriteLite Plus (Perkin Elmer). Вкратце, субстрат растворяли в 10 мл предоставленного поставщиком буфера и 75 мкл субстрата/лунка добавляли во внутренние 60 лунок каждого планшета. Планшеты анализировали на Victor5 (Molecular Devices) с использованием настроек люминесценции.

8.1.9. ADCC-рептортерный анализ

[0144] Эффекторные клетки ADCC, экспрессирующие FcγRIII человека (Promega), оттаивали и выращивали в соответствии с рекомендациями протокола. Клетки разделяли дважды перед использованием. В качестве клеток-мишеней использовали клетки HEK293, стабильно трансфицированные либо OX40 человека, либо OX40 макака-резуса. Эти клетки размножали в HyClone TM DMEM с 10% FBS, инактивированной нагреванием (Sigma) и 5 мкг/мл бластицидина (Gibco Life Technologies).

[0145] За день до анализа клетки-мишени HEK293, экспрессирующие OX40, собирали с помощью 0,25% трипсина (Gibco Life Technologies). Клетки промывали, подсчитывали и высевали при 10000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты Costar (Corning). Планшеты инкубировали при 37°С в течение ночи в DMEM 10% FBS. Для анализа использовали эффекторные клетки биоанализа ADCC, протокол размножения G7102. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 7,5:1. Люминесценцию измеряли с помощью EnSpire Alpha reader (Perkin Elmer), используя программное обеспечение EnSpireManager. Антитела, которые тестировали в этом анализе, включали контрольное изотипическое антитело и анти-OX40 антитела.

8.1.10. Связывание анти-OX40 антитела с активированными CD4+ T-клетками человека

[0146] РВМС человека выделены из лейкоцитарных фракций, приобретенных в Стэнфордском Центре Крови (Пало-Альто, Калифорния). Вкратце, лейкоцитарные фракции разбавляли в пропорции 1:1 с PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare). Разбавленную кровь (30 мл) наслаивали на 15 мл 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), полученный в PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare), содержащегося в пробирках SepMate (Stemcell Technologies). Пробирки вращали при 1200 g в течение 10 минут. Промежуточную фазу собирали и дважды промывали в 1х PBS. CD4+ Т-клетки выделяли, используя набор для обогащения CD4 Stemcell Technologies (Stem Cell Technologies). Клетки ресуспендировали до 2×10⁶ клеток/мл в RPMI/10% FBS. Гранулы Dynal CD3/28 (Life Technologies) добавляли в пропорции 1:1. Клетки инкубировали на ротаторе вертикального типа в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки культивировали в 6-луночных планшетах в течение 24 часов при 37°С.

[0147] Через 24 часа бусы удаляли магнитом. Клетки подсчитывали и ресуспендировали до 1,5×10⁶/мл. Брали аликвоту клеточной суспензии (100 мкл) для каждого окрашивания. Тестируемое антитело титровали в серии 4-кратных разведений, начиная с 1 мкг/мл. Клетки окрашивали в течение 30 минут и дважды промывали. Разведение 1:250 (4 мкг/мл) козлиные анти-человеческие Fc PE/лунка (Jackson ImmunoResearch) добавляли к 100 мкл/лунка PBS, содержащего 1% BSA. Клетки окрашивали еще 30 минут и дважды промывали, переносили в пробирки и собирали, используя проточный цитометр BD LSR Fortessa, и анализировали с использованием программного обеспечения для анализа FACSDiva версии 8.0.1.

8.1.11. Связывание анти-OX40 антитела с активированными T-клетками яванского макака

[0148] Цельную кровь яванского макака приобретали у Worldwide Primates. Для выделения РВМС цельную кровь разводили в пропорции 1:1 с PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare). Разбавленную кровь (30 мл) наслаивали под 13 мл 95% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), полученного в PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare) в конических пробирках по 50 мл. Пробирки вращали при 1000 g в течение 25 минут. Промежуточную фазу собирали и дважды промывали в 1х PBS. Клетки ресуспендировали до 2×10⁶ клеток/мл в RPMI/10% FBS. Клетки инкубировали в течение 72 часов с 10 мг/мл фитогемагглютинина (PHA) (Sigma) и 100 Ед/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человекка (IL-2) (Proleukin®, Prometheus) в 6-луночных планшетах. Через 24 часа клетки промывали, считали и ресуспендировали до 2×10⁶/мл. 100 мкл клеток использовали для каждого окрашивания. Тестируемое анти-OX40 антитело титровали в серии 4-кратных разведений, начиная с 1 мкг/мл. Клетки окрашивали в течение 30 минут и дважды промывали. В каждую лунку добавляли антитело козы против IgG Fc человека-PE (Jackson ImmunoResearch) в разведении 1:250 (4 мкл/мл) в 100 мкл PBS, содержащем 1% BSA. Клетки окрашивали еще 30 минут и дважды промывали, переносили в пробирки и собирали, используя проточный цитометр BD LSR Fortessa, и анализировали с использованием программного обеспечения для анализа FACSDiva версии 8.0.1.

8.1.12. Активированная пролиферация Т-клеток человека и индукция IFN-γ

[0149] Лейкоцитарные фракции приобретали в Стэнфордском центре крови (Пало-Альто, Калифорния). Для выделения РВМС человека, лейкоцитарные пленки разводили в пропорции 1:1 с PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare). Разбавленную кровь (30 мл) наслаивали на 15 мл 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), полученный в PBS без добавления магния и кальция (GE Healthcare), содержащегося в пробирках SepMate (Stemcell Technologies). Пробирки вращали при 1200 g в течение 10 минут. Промежуточную фазу собирали и дважды промывали в 1х PBS. CD4+ Т-клетки выделяли из РВМС, используя набор для обогащения Т-клеток EasySep CD4+ (Stemcell Technologies). CD4+ Т-клетки культивировали при 2×10⁶ клеток/мл в RPMI +10% FCS плюс 2 мкг/мл PHA (Sigma) и 20 IU/мл рекомбинантного IL-2 человека (Proleukin®, Prometheus) в 6-луночных планшетах в течение 72 ч.

[0150] Планшеты контроля активации T-клеток Biocoat 96-луночные планшеты (Corning) покрывали 2 мкг/мл козлиными анти-мышиными Fc IgG (Jackson ImmunoResearch) и 2 мкг/мл козлиными анти-человеческими IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch) в 100 мкл/лунка PBS в течение ночи при 4°C. Планшеты блокировали 200 мкл/лунка 1% BSA (Rockland) в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали 200 мкл/лунка PBS. 4 нг/мл анти-CD3 человека OKT3 (eBioscience) добавляли в 100 мкл/лунка PBS и инкубировали в течение 90 минут при 37°C. Планшеты дважды промывали 200 мкл/лунка PBS. В планшеты с 100 мкл PBS добавляли 3-кратные серии разведений анти-OX40-антитела и изотипического контрольного моноклонального антитела, начиная с 5 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Планшеты дважды промывали 200 мкл/лунка PBS. В каждую лунку добавляли CD4+T-клетки (2×10⁵), промытые PHA и активированные IL-2.

[0151] Через 48 часов культивирования при 37°С, 30 мкл супернатанта каждого повтора объединяли для анализа IFN-γ с помощью Luminex (Millipore) и анализировали на Bioplex Manager 6.0 (BioRad). В планшеты вводили 0,25 мкКи 3H-тимидина (Perkin Elmer) в течение ночи и собирали на следующее утро на Filtermats (Perkin Elmer) с 5 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold (Perkin Elmer). Фильтры считали на счетчике 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).

8.1.13. Анализы супрессии регуляторных Т-клеток человека

[0152] Свежие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от AllCells или Stemcell Technologies. Клетки центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в 1х PBS и снова центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатанты удаляли и затем клетки ресуспендировали в буфере RoboSep (Stemcell Technologies). Жизнеспособность клеток и количество клеток определяли, используя счетчик клеток Vi-Cell XR Beckman Coulter. 100-150 миллионов клеток было отложено для обогащения CD4+ Т-клеток с помощью набора для обогащения CD4+ Т-клеток Stemcell EasySep Human. Обогащенные CD4+ Т-клетки затем истощали по CD25+, используя набор для селекции CD25+ Stemcell EasySep Human. В результате этого процесса были получены очищенные CD4+/CD25-отвечающие Т-клетки (Tresp). Остальные РВМС использовали для выделения регуляторных Т-клеток (Treg) в соответствии с инструкциями из набора Stemcell EasySep Human CD4+/CD127low/CD49d- набор для обогащения регуляторных Т-клеток. После выделения CD4+/CD25-Tresp и Treg клетки ресуспендировали с RPMI 1640 с 10% инактивированной нагреванием FBS и 0,01 мМ 2-меркаптоэтанолом при 1×10⁶ клеток/мл и 5×10⁵ клеток/мл, соответственно.

[0153] Анализ подавления Treg проводили с использованием двух различных пропорций Tresp к Treg, 2:1 и 4:1. Для пропорции 2:1, 5×10⁴ клеток Tresp и 2,5×10⁴ клеток Treg добавляли в 96-луночные U-донные планшеты. Для пропорции 4:1, в 96-луночный планшет добавляли 5×10⁴ клеток Tresp и 1,25×10⁴ клеток Treg. Реагент на основе бус для контроля подавления Treg (Miltenyi Biotec) также добавляли в лунки в пропорции 1:1 гранул к клеткам для стимуляции. Анти-OX40 антитело и контрольное изотипическое IgG1 человека тестировали в трех экземплярах при конечной концентрации 10 мкг/мл в отсутствие или в присутствии козлиного F(ab')₂ против (GxHu) IgG человека, Fc-специфичного (Jackson ImmunoResearch) в пропорции 1:4. Планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение четырех дней. Планшеты обрабатывали 1 мкКи/лунка 3H-тимидином и дополнительно инкубировали в течение еще 16 часов при 37°С в 5% СО₂. После инкубации планшеты собирали и измеряли пролиферацию с использованием сцинтилляционной жидкости Ultima Gold (Perkin Elmer) и сцинтилляционного счетчика 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).

8.1.14. Модель опухоли мыши PC-3 с трансплантированными иммунными клетками человека

[0154] В день инокуляции Т-клетки человека, аутологичные moDC человека (дендритные клетки, полученные из моноцитов) и клетки РС-3 подсчитывали с помощью Vi-Cell XR (Beckman Coulter) и объединяли для доставки с помощью подкожной инъекции 1×10⁷. PC-3,1×10⁶ Т-клеток и 5×10⁵ moDC на каждую мышь NSG (мышь NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ) в 100 мкл физиологического раствора Дульбекко с фосфатным буфером (DPBS) (GE Lifesciences). Группы обработки (n=8 мышей/группа) из 10 мг/кг контрольного изотичного моноклонального антитела и 10 мг/кг Hu3738 получали в 200 мкл DPBS для внутрибрюшинной инъекции. Одну дозу антитела вводили во время инокуляции смеси клеток. Измерение роста опухоли оценивали стандартным измерением штангенциркулем и рассчитывали объем роста опухоли (длина×ширина×высота/2).

8.1.15. Модель GVHD с PBMC человека у мышей NSG

[0155] Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) приобретали у AllCells (Oakland, CA). Иммунодефицитным мышам NSG (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ) инокулировали 2×10⁷ PBMC человека внутрибрюшинно в 1-ый день. Анти-OX40 антитело Hu3738 или контроль с изотипом вводили внутрибрюшинно один раз в неделю, начиная с первого дня. После того, как у мышей проявились поведенческие признаки болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD) (например, сгорбленная поза, взъерошенный мех), брали образцы сыворотки и определяли уровни цитокинов в сыворотке в анализе с бусами Luminex (Millipore).

Пример 2. Получение и гуманизация мышиных антител против ОХ40.

[0156] Мышей иммунизировали в соответствии со способами, известными в данной области (E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). Изотип каждого моноклонального антитела определяли с использованием набора для изотипирования мыши (Roche). Клоны гибридомы, продуцирующие представляющие интерес антитела, очищали и дополнительно характеризовали на аффинность с помощью поверхностного плазмонного резонанса и конкуренцию лигандов с помощью FACS.

[0157] Клонирование и конструирование вектора экспрессии осуществляли способами, известными в данной области, для экспрессии рекомбинантных моноклональных антител.

[0158] Гуманизацию V-области антитела осуществляли, как описано Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86:10029-10033). Канонические структуры CDR определяли в соответствии с Huang et al. (Methods, 2005; 36:35-42). Были идентифицированы вариабельные последовательности зародышевой линии человека с одинаковыми или наиболее сходными каноническими структурами CDR, и были выбраны подходящие последовательности человеческого сегмента VH, VL и J, чтобы обеспечить каркас для вариабельной области анти-OX40. В положениях каркасой области, в которых компьютерная модель предполагала значительный контакт с CDR, аминокислоты из V-областей мышиного анти-OX40 были заменены исходными человеческими каркасными аминокислотами (обратные мутации).

[0159] Анти-OX40 антитела мыши, Mu3726, Mu3738, Mu3739 и Mu3741, гуманизировали в соответствии со способом, описанным выше. Гуманизированный вариант Mu3726 VH соответствовал Hu3726 VH.1a, где каркасные области VH4-28 человека имели семь обратных мутаций I48M, V67I, M69I, V71R, F78V, A93V и R94K. Hu3726 VH.1а, объединяли с соответствующей гуманизированной легкой цепью Hu3726 VL.1b, где каркасные области VK1-39 человека имели две обратные мутации Y48F и F71Y. Гуманизированный вариант Mu3738 VH соответствовал Hu3738 VH.1b, где каркасные области VH человека 3-7 имели одну обратную мутацию W47L. Hu3738 VH.1b объединяли с соответствующей гуманизированной легкой цепью Hu3738 VL.1, где каркасная область человека VK4-1 не имела обратных мутаций. Гуманизированный вариант Mu3739 VH соответствовал Hu3739 VH.1b, где каркасные области VH1-69 человека имели четыре обратные мутации M48I, V67A, E73T и S76N. Hu3739 VH.1b объединяли с соответствующей гуманизированной легкой цепью Hu3739 VL.1b, где каркасные области VK1-39 человека имели две обратные мутации V58L и F71Y. Гуманизированный вариант Mu3741 VH соответствовал Hu3741 VH.2b, где каркасные области VH3-66 человека имели семь обратных мутаций A24V, V48L, S49G, F67L, R71K, N76S и L78V. Hu3741 VH.2b объединяли с соответствующей гуманизированной легкой цепью Hu3741 VL.1с, где каркасные области VK1-39 человека имели две обратные мутации Y36F и F71Y.

Пример 3. Аффинное связывание анти-OX40 антител

[0160] На таблице 3-1 ниже показаны данные in vitro связывания иллюстративного анти-OX40 антитела Hu3738, или анти-OX40 антител 11D4 или 18D8, описанных в патенте США №7960515. Каждое антитело 11D4 и 18D8 относится к IgG₁ человека с каппа легкой цепью.

[0161] Как используется в настоящем документе, 11D4 имеет V_H c аминокислотной последовательностью:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:61), и

V_L с аминокислотной последовательностью:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:62).

[0162] 18D8 имеет V_H c аминокислотной последовательностью: EVQLVESGGGLVQPGRLSRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:63), и

V_L с аминокислотной последовательностью:

EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:64).

[0163] Антитело Hu3738 показало сильные связывающие свойства в отношении OX40 человека в анализе поверхностного плазмонного резонанса или при трансфекции репортерных клеток Jurkat NF-κB, экспрессирующих OX40 человека, как измерено в анализе Примера 1, и высокую связывающую аффинность в анализе SPR по сравнению с антителами Hu3739 or Hu3741.

Таблица 3-1 Связывающие свойства иллюстративных антител против OX40 человека
Антитело	KD (M)*	kd (1/сек)*	Связывание на поверхности клеток Jurkat, EC50 (нг/мл)
11D4	1,6E-09	2,7E-04	55
18D8	9,1E-09	1,1E-01	258
Hu3738	4,2E-08	4,2E-02	75
Hu3739	3,6E-07	1,6E-02	Н.О.
Hu3741	3,0E-06	3,1E-01	Н.О,

*как определено поверхностным плазмонным резонансом согласно Примеру 1; показано экспоненциальное представление (например, 3,0E-09=3,0×10^-9); Н.О.=не определяется.

[0164] Иллюстративное анти-OX40 антитело Hu3738 показало перекрестную реактивность в отношении OX40 яванского макака или макака-резуса, но не показал значимого связывания с OX40 крысы или мыши. Связывающая активность Hu3738 в отношении рекомбинантного OX40 человека или яванского макака (cyno), или в отношении OX40 человека или макака-резус, расположенных на поверхности, как определено в анализах, описанных в Примере 1, суммирована в Таблице 3-2.

Таблица 3-2 Связывающие свойства Hu3738 в отношении OX40 человека, яванского макака и макака-резус
Анализ	EC50 (нM)
ELISA	Человек	0,044
Cyno	0,039
Клетки Jurkat NF-κB	Человек	0,50
Макака-резус	2,1

Пример 4. Биологическая активность in vitro анти-OX40 антитела Hu3738

[0165] Для оценки связывания Hu3738 с эндогенно экспрессируемым OX40 человека, активированные CD4+ T-клетки и нестимулированные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) исследовали с помощью проточной цитометрии. В Таблице 4-1 суммированы данные связывания Hu3738 с OX40 на клеточной поверхности CD4+ T-клетках человека, активированных гранулами CD3/CD28, или на CD4+ T-клетках яванского макака, активированных фитогемагглютинином (PHA) и интерлейкином-2 (IL-2), согласно анализам, описанным в Примере 1. Как показано в Таблице 4-1, антитело Hu3738 сильно связывается с OX40 на активированных CD4+ Т-клетках в культурах Т-клеток человека и яванского макака.

Таблица 4-1 Связывание CD4+ T-клеток иллюстративным антителом Hu3738
Вид OX40	EC50 (нM)
Человек	0,053
Яванский макак	0,024

[0166] Субнаномолярное связывание OX40 человека антителом Hu3738 обеспечивало функциональную активацию, о чем свидетельствует повышенная пролиферация CD4+ T-клеток периферической крови человека и повышенная продукция интерферона-γ CD4+ T-клетками человека после обработки in vitro Hu3738 согласно анализам, описанным в разделе 8.1.12. (ФИГ.1А, 1В). Как показано в иллюстративном эксперименте, изображенном на ФИГ.1А, антитело Hu3738 вызывало повышенную пролиферацию CD4+ Т-клеток периферической крови человека примерно в 1,5-6 раз по сравнению с контрольным изотипическим huIgG1, который был сопоставим или больше, чем повышение пролиферации, наблюдаемое при введении Т-клеткам в эквивалентной дозе анти-ОХ40 антител 11D4 или 18D8, описанным в литературе. Hu3738 показал EC₅₀=0,11 нМ (16 нг/мл) в среднем в опытах c восьмью донорами.

[0167] На ФИГ.1C показано, что пролиферация CD4+ T-клеток периферической крови человека после обработки in vitro Hu3738 была аналогична пролиферации анти-OX40-антитела 1A7, описанного в литературе, в широком диапазоне концентраций антител от примерно 0,001 до примерно 1 мкг/мл, при тестировании каждого в соответствии с анализе пролиферации Т-клеток, описанном в разделе 8.1.12.

[0168] Антитело 1A7, описанное в публикации США №2015/0307617, относится к IgG₁ человека с легкими цепями каппа и имеет V_H с аминокислотной последовательностью:

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSYMSWVKQSHGKTLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFREKVTLTVDKSSTTAYMEFRSLTSEDSAVYYCVLAPRWYFSVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO:69), и

V_L с аминокислотной последовательностью:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGKDYFLTISNLEQEDVAAYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:70).

[0169] Как показано в иллюстративном эксперименте, изображенном на ФИГ.1B, продукция IFN-γ повышалась в CD4+ T-клетках человека в диапазоне от примерно 2 до примерно 10 раз при обработке Hu3738 в тестированном диапазоне концентраций. Что касается продукции IFN-γ, антитело Hu3738 показало EC₅₀=0,16 нм (24 нг/мл) в среднем значении от девяти доноров. Анти-OX40 антитела 11D4 и 18D8, описанные в литературе, также продемонстрировали аналогичный эффект на продукцию IFN-γ в условиях этого анализа.

[0170] На ФИГ.1D показано, что Hu3738 дает более высокую продукцию IFN-γ в CD4+ Т-клетках человека по сравнению с анти-OX40 человека 1А7, описанным в литературе, если каждое было протестировано согласно анализe продукции IFN-γ Т-клетками, как описано в разделе 8.1.12.

[0171] Кроме ингибирования сигнальной активности, что приводит к увеличению пролиферации CD4+ Т-клеток и повышению продукции IFN-γ, иллюстративное анти-OX40 антитело Hu3738 также ингибирует активность регуляторных Т-клеток человека in vitro, предполагая, что регуляторные Т-клетки в солидной опухоли, которые могут ингибировать иммунологический ответ организма на атаку опухоли, могут быть подавлены при введении антитела Hu3738.

[0172] Эффект Hu3738 на регуляторную активность Т-клеток оценивали in vitro согласно анализу, описанному в разделе 8.1.13. Аутологичные отвечающие CD4+/CD25- Т-клетки (Tresp) совместно культивировали с регуляторными CD4+/CD25+/CD127low Т-клетками (Treg) и активаторными бусами (Insp) в пропорции 2:1 или 4:1 Tresp: Treg (ФИГ.2A, 2B). В отсутствие Treg, клетки Tresp пролиферировали в ответ на активаторные бусы. В присутствии Treg, пролиферация ингибировалась. Введение 10 мкг/мл Hu3738 в культуральную среду не оказывало влияния на опосредованную Treg супрессию. Контроль с изотипом, используемый для этого анализа супрессии регуляторных Т-клеток, представлял собой huIgG₁ с вариантами константных областей L234A и L235A. Отдельные эксперименты, проведенные с использованием изотипического контроля huIgG₁ с сшивающим агентом, показали отсутствие эффекта.

[0173] Напротив, в присутствии экзогенного сшивающего агента, антитело Hu3738 полностью восстанавливало пролиферацию Tresp (ФИГ.2A и 2B). Антитело Hu3738 в присутствии сшивающего агента усиливало пролиферацию в этом анализе выше уровня ответа Tresp только на активаторные шарики. Этот результат предполагает, что сигналы OX40 могут преодолевать супрессию, опосредованную регуляторными Т-клетками, и могут усиливать антиген-специфические ответы, что согласуется с результатами, приведенными выше.

[0174] Активность ADCC, опосредованная Hu3738, оценивали с использованием коммерчески доступного репортерного анализа ADCC, как описано в разделе 8.1.9. В этом анализе в качестве эффекторных клеток использовали сконструированные клетки Jurkat, экспрессирующие FcyRIIIa человека и ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT). Клетки HEK 293, экспрессирующие OX40 человека, использовались в качестве клеток-мишеней, и ожидалось, что анти-OX40 антитело будет связываться с OX40, экспрессированным на клетках-мишенях. Кроме того, предполагалось, что Fc-область Hu3738 будет связываться с рецепторами FcyRIIIa на поверхности репортерных клеток. Эти события связывания привели бы к многократному сшиванию двух типов клеток, и к активации репортерной активности ADCC, эффект чего измеряли посредством считывания люминесценции как результат активации пути NFAT. По сравнению с изотипическим контролем, антитело Hu3738 повышало активность репортерного ADCC с EC₅₀=0,51 нм (77 нг/мл).

Пример 5. Классификация эпитопов иллюстративных анти-OX40 антител

8.5.1. Связывание Hu3738 с химерным OX40 человек/мышь

[0175] Растворимый OX40L блокировал связывание Hu3738 с OX40 с IC₅₀=67 пМ (10 нг/мл) в анализе с клетками Jurkat, экспрессирующими OX40 человека, как описано в разделе 8.1.5 (ФИГ.3), что предполагает связывание антитела Hu3738 с OX40 человека в лиганд-связывающей области молекулы.

[0176] Для более детального эпитопного картирования связывания антитела Hu3738 была создана серия клеточных линий, экспрессирующих молекулы OX40, богатые цистеином, человек/мышь (CRD). Этот метод основан на наблюдении, что Hu3738 не связывается с мышиным OX40 (ФИГ.4B). Выравнивание последовательности OX40 человека (SEQ ID NO:1) и OX40 мыши (SEQ ID NO:3) показано на ФИГ.4А. На базе анализа последовательностей была получена серия трансфектантов 293s, экспрессирующих химерные варианты рецептора OX40 человека с заменами последовательностей CRD мыши и окрашенные Hu3738.

[0177] Аминокислотные последовательности (включая сигнальные последовательности) химерного рецептора OX40 человека и мыши, с заменами мышиных областей, указаны подчеркиванием. Химерный OX40 человека с заменами CDRI человека на CRDi мыши имеет аминокислотную последовательность:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:5),

химерный OX40 человека с заменой CRDII человека на CRDII мыши имеет аминокислотную последовательность:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:6),

химерный OX40 человека с заменой CRDIII человека на CRDIII мыши имеет аминокислотную последовательность:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:7),

Химерный OX40 человека с заменой CRDIV человека на CRDIV мыши имеет аминокислотную последовательность:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:8),

и химерный OX40 человека с заменой CRDII и CRDIII человека на CRDII и CRDIII мыши имеет аминокислотную последовательность:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:9).

[0178] Определение связывания Hu3738 с этой серией химерных вариантов проводили согласно анализу, описанному в разделе 8.1.7, для локализации сайта связывания определенных областей CRD. Потеря связывания указывает на то, какие CRD были критическими для распознавания OX40 конкретным антителом. В этом случае отсутствие детектируемого связывания с специфической заменой CRD области у мыши предполагает область рецептора OX40 человека, распознаваемую Hu3738. Было показано, что анти-OX40-антитело Hu3738 теряет способность связываться, если CRDII человека заменен на соответствующий CRDII мыши, что согласуется с связыванием Hu3738 с CRDII OX40 человека (ФИГ.4B).

8.5.2. Конкурентный анализ с иллюстративным анти-OX40 антителом Hu3738 человека, связывающимся с OX40 человека

[0179] Были взяты дополнительные описанные в литературе гуманизированные анти-OX40-антитела для сравнения с иллюстративными анти-OX40-антителами по изобретению. Антитела 106-222 и 119-122, описанные в публикации США №2013/0280275, относятся к IgG1 человека с легкими цепями каппа.

[0180] Антитело 106-222 имеет V_H с аминокислотной последовательностью:

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:65), и

V_L с аминокислотной последовательностью:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:66).

[0181] Антитело 119-122 имеет V_H с аминокислотной последовательностью:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:67), и

V_L с аминокислотной последовательностью:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:68).

[0182] Было показано, что связывание Hu3738 с экспрессируемым на клеточной поверхности OX40 конкурирует с некоторыми, но не всеми описанными в литературе анти-OX40 антителами, в исследованиях с прямой конкуренцией. Как показано на ФИГ.5, клетки Jurkat-NF-κB-huOX40, обработанные титром дозы антител, описанных в литературе, затем подвергали воздействию 2 мкг/мл флуоресцентного ALEXA FLUOR® 647-меченного Hu3738 для определения конкуренции связывания. Анализ проводили методом проточной цитометрии. Описанные в литературе анти-OX40-антитела 106-222 или 1A7 была конкурентоспособными с Hu3738. Однако антитела 11D4, 18D8 или 119-122 не конкурировали с Hu3738 до 100 мкг/мл.

Пример 6. Активация OX40 иллюстративным анти-OX40 антителом Hu3738

[0183] Данные для клеток Jurkat NF-κB подчеркивают активирующую способность иллюстративного анти-OX40 антитела Hu3738 даже в отсутствие сшивающего агента (ФИГ.6A, 6B). Как показано на ФИГ.6A, единственными анти-OX40 антителами, которые продемонстрировали значительную сигнальную активность NF-κB в диапазоне концентраций от примерно 0,001 до примерно 100 мкг/мл, было антитело Hu3738 и соответствующее антитело Mu3738 мыши. Описанные в литературе анти-OX40-антитела 11D4, 18D8, 106-222 и 119-122 не обладали значительным сигнальным эффектом NF-κB вплоть до примерно 100 мкг/мл.

[0184] Активность Hu3738 в отсутствие экзогенного сшивающего агента контрастирует с отсутствием активности других описанных в литературе анти-OX40 антител в тех же условиях анализа. Сводка данных о передаче сигналов NF-κB показана в Таблицах 6-1 и 6-2. Примечательно, что хотя Hu3738 конкурировал за связывание с OX40 человека с описанными в литературе анти-OX40 антителами 106-222 и 1A7, Hu3738 проявлял другую функциональную активность по сравнению с каждым из антител в отсутствие сшивающего агента.

Таблица 6-1 Передача сигналов NF-κB в клетках Jurkat-NF-κB-huOX40
Антитело	EC50 без сшивающего агента (нM)	EC50 со сшивающим агентом (нM)
Hu3738	20	0,088
11D4	Н.З.*	0,94
18D8	Н.З.*	0,50
106-222	Н.З.*	0,63
119-122	Н.З.*	0,34
Изотип	Н.З.*	Н.З.*

* Н.З.=не значимая передача сигнала NF-κB вплоть до 100 мг/мл антитела; Н.О.=не определялся

[0185] Кроме способности воздействовать на передачу сигналов NF-κB в отсутствие экзогенного сшивающего агента в клетках Jurkat-NF-κB-huOX40, антитело Hu3738 также продемонстрировало более высокую активность, измеренную с помощью EC₅₀ со сшивающим агентом, по сравнению с описанными в литературе анти-OX40 антителами 11D4, 18D8, 106-222 и 119-122 (Таблица 6-1).

[0186] Подобранное сравнение Hu3738 с 1A7 приведено на ФИГ.6B и суммировано в таблице 6-2 ниже. Кроме отсутствия передачи сигналов NF-κB в отсутствие экзогенного сшивающего агента в клетках Jurkat-NF-κB-huOX40, каждое из описанных в литературе анти-OX40-антител, указанных выше, также демонстрировало более низкое EC₅₀ по сравнению с Hu3738.

Таблица 6-2 Передача сигнала NF-κB в клетках Jurkat-NF-κB-huOX40
Антитело	EC50 без сшивающего агента (нM)	EC50 со сшивающим агентом (нM)
Hu3738	22	0.020
1A7	Н.З.*	0.066
Изотип	Н.З.*	Н.З*

* Н.З.=не значимая передача сигнала NF-κB вплоть до 100 мг/мл антитела; Н.О.=не определялся

Пример 7. Противоопухолевая активность Hu3738 на модели мыши с переносом клеток человека

[0187] Антитело Hu3738 продемонстрировало противоопухолевую активность на модели с мышами NSG in vivo после однократной инокуляции клетками РС3 человека, Т-клетками и дендритными клетками из аутологичных моноцитов (moDC), согласно протоколу, описанную в разделе 8.1.14 (ФИГ.7). В день инокуляции Т-клетки человека, клетки moDC и PC3 вводили подкожной инъекцией каждой мыши NSG. Моноклональное антитело изотипического контроля или Hu3738 (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно каждому животному в каждой группе лечения (n=8), причем дозу антитела вводили во время инокуляции. Измерение роста опухоли оценивали стандартным измерением штангенциркулем и рассчитывали объем роста опухоли (длина×ширина×высота/2).

[0188] Как показано на ФИГ.7, антитело Hu3738 значительно ингибировало рост опухоли PC3 у мышей NSG через 17 дней после инокуляции по сравнению с эквивалентной дозой контрольного изотипического антитела.

Пример 8. Иммунная активация in vivo на модели GVHD c РВМС человека

[0189] Мышей NSG инокулировали PBMC человека внутрибрюшинно. Затем мышей обрабатывали 1 мг/кг Hu3738 или контролем с изотипом huIgG1 q7d×4 (то есть, один раз каждые 7 дней, всего 4 доз), причем первую дозу вводили в 1-ый день сразу после инокуляции клетками человека. На 22-й день мышей умерщвляли и определяли уровни цитокинов в сыворотке крови с использованием анализа на бусинках Luminex (Millipore).

[0190] Результаты на ФИГ.8 показали, что после введения дозы анти-OX40-антитела Hu3738 наблюдали увеличение уровня интерлейкина-8 (IL-8), колониестимулирующего фактора гранулоцитарных макрофагов (GM-CSF), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерферона-гамма (IFN-γ) по сравнению с изотипом, что свидетельствует об усилении иммунологического ответа у мыши благодаря Hu3738.

[0191] Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, цитированные в настоящем документе, включены в качестве ссылки во всем объеме для всех целей в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент или другой документ включена в настоящий документ и включена в качестве ссылки для всех целей.

[0192] Несмотря на то, что были проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления, следует понимать, что могут быть сделаны различные изменения без отклонения от сущности и объема изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭББВИ БАЙОТЕРАПЬЮТИКС ИНК.

<120> АНТИ-OX40 АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 381493-368WO

<140>

<141>

<150> 62/434,761

<151> 2016-12-15

<160> 136

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 277

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 2

<211> 277

<212> Белок

<213> Macaca fascicularis

<400> 2

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Ala Leu Ala Lys Ile

275

<210> 3

<211> 272

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 3

Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr

20 25 30

Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met

35 40 45

Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu

50 55 60

Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys

65 70 75 80

Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr

85 90 95

Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg

100 105 110

Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro

115 120 125

Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn

130 135 140

Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu

145 150 155 160

Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu

165 170 175

Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val

180 185 190

Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro

195 200 205

Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu

210 215 220

Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp

225 230 235 240

Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr

245 250 255

Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

260 265 270

<210> 4

<211> 183

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 5

<211> 277

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 5

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu Asn Cys Val

20 25 30

Lys His Thr Tyr Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro

35 40 45

Gly His Gly Met Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys

50 55 60

His Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 6

<211> 277

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 6

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Glu Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr

65 70 75 80

Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys

85 90 95

Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 7

<211> 279

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 7

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val

115 120 125

Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys

130 135 140

Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala

145 150 155 160

Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr

165 170 175

Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln

180 185 190

Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro

195 200 205

Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly

210 215 220

Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr

225 230 235 240

Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala

260 265 270

His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 8

<211> 277

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 8

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp

145 150 155 160

Ser Leu Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 9

<211> 279

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 9

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Glu Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr

65 70 75 80

Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys

85 90 95

Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val

115 120 125

Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys

130 135 140

Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala

145 150 155 160

Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr

165 170 175

Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln

180 185 190

Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro

195 200 205

Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly

210 215 220

Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr

225 230 235 240

Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala

260 265 270

His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 10

<400> 10

000

<210> 11

<400> 11

000

<210> 12

<400> 12

000

<210> 13

<400> 13

000

<210> 14

<400> 14

000

<210> 15

<400> 15

000

<210> 16

<400> 16

000

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<400> 20

000

<210> 21

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 23

Asn Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Thr Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 24

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Asn Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Thr Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 26

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 27

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Cys Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 28

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<400> 30

000

<210> 31

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 31

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 34

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<400> 40

000

<210> 41

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 42

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 43

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 43

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Asn Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Thr Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 44

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 44

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Asn Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Thr Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 45

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 46

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 47

<211> 443

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 48

<211> 442

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 49

<400> 49

000

<210> 50

<400> 50

000

<210> 51

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 52

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 53

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 54

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид»

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 55

<400> 55

000

<210> 56

<400> 56

000

<210> 57

<400> 57

000

<210> 58

<400> 58

000

<210> 59

<400> 59

000

<210> 60

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 60

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 61

<211> 118

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 124

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Leu Ser Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 64

<211> 106

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 64

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 65

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 120

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 111

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 68

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 117

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 69

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Thr Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Glu Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<400> 71

000

<210> 72

<400> 72

000

<210> 73

<400> 73

000

<210> 74

<400> 74

000

<210> 75

<400> 75

000

<210> 76

<400> 76

000

<210> 77

<400> 77

000

<210> 78

<400> 78

000

<210> 79

<400> 79

000

<210> 80

<400> 80

000

<210> 81

<400> 81

000

<210> 82

<400> 82

000

<210> 83

<400> 83

000

<210> 84

<400> 84

000

<210> 85

<400> 85

000

<210> 86

<400> 86

000

<210> 87

<400> 87

000

<210> 88

<400> 88

000

<210> 89

<400> 89

000

<210> 90

<400> 90

000

<210> 91

<400> 91

000

<210> 92

<400> 92

000

<210> 93

<400> 93

000

<210> 94

<400> 94

000

<210> 95

<400> 95

000

<210> 96

<400> 96

000

<210> 97

<400> 97

000

<210> 98

<400> 98

000

<210> 99

<400> 99

000

<210> 100

<400> 100

000

<210> 101

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 101

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 102

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 102

Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 103

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 103

Glu Gly Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 104

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 104

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 105

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 105

Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ser

1 5

<210> 106

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 106

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr

1 5

<210> 107

<400> 107

000

<210> 108

<400> 108

000

<210> 109

<400> 109

000

<210> 110

<400> 110

000

<210> 111

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 111

Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn

1 5 10

<210> 112

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 112

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gly

1 5 10 15

<210> 113

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 113

Thr Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 114

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 114

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 115

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 115

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 116

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 117

<400> 117

000

<210> 118

<400> 118

000

<210> 119

<400> 119

000

<210> 120

<400> 120

000

<210> 121

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 121

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 122

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 122

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 123

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 123

Gly Gly Pro Ala Trp Phe Val Tyr

1 5

<210> 124

<400> 124

000

<210> 125

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 125

Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser

1 5

<210> 126

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 126

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 127

<400> 127

000

<210> 128

<400> 128

000

<210> 129

<400> 129

000

<210> 130

<400> 130

000

<210> 131

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 131

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 132

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 132

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 133

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 133

Glu Glu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 134

<400> 134

000

<210> 135

<400> 135

000

<210> 136

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /заметка=«Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид»

<400> 136

Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro Thr

1 5

<---

1. Анти-OX40 антитело, содержащее тяжелую цепь с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41 или 42; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51.

2. Анти-OX40 антитело, содержащее тяжелую цепь с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:43 или 44; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52.

3. Анти-OX40 антитело, содержащее тяжелую цепь с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:45 или 46; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53.

4. Анти-OX40 антитело, содержащее тяжелую цепь с любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47 или 48; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:54.

5. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-OX40 антитело по любому из пп.1-4.

6. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.5.

7. Эукариотическая клетка-хозяин для получения анти-OX40 антитела по любому из пп.1-4, которая трансформирована вектором экспрессии по п.6.

8. Эукариотическая клетка-хозяин по п.7, которая представляет собой клетку млекопитающего.

9. Способ получения анти-OX40 антитела, включающий: (a) культивирование эукариотической клетки по п.7 или 8 и (b) восстановление анти-OX40 антитела.