4-изопропил-6-r-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3(4h)-оны, обладающие антибактериальной активностью в отношении neisseria gonorrhoeae

Изобретение относится к 4-изопропил-6-R-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-онам, являющимся антибактериальными агентами, активными в отношении грамотрицательных бактерий Neisseria gonorrhoeae, представляющие собой соединения формулы 1, в которой R представляет H (1а), изопропилтио (1b), бензилтио (1c). Технический результат: получены новые 4-изопропил-6-R-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-оны, обладающие антибактериальной активностью относительно Neisseria gonorrhoeae и которые могут быть использованы при создании лекарственных средств для лечения болезней им вызванных. 2 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается 6-замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-онов, содержащих в 6-ом положении в качестве заместителей водород или S-изопропил- или S-бензил. Указанные вещества расширяют арсенал биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью относительно облигатного патогена Neisseria gonorrhoeae и могут быть использованы при создании лекарственных средств для лечения болезней им вызванных.

Уровень техники

В настоящее время для мировой практической медицины актуальны проблемы, связанные с распространением лекарственно устойчивых штаммов различных бактерий и отсутствием эффективных средств для борьбы с ними. Проблемы, связанные с резистентностью к разным антибиотикам, существуют и при лечении болезней, вызванных гонококковой инфекцией. Согласно последним данным [P. Stefanelli, A. Carannate //Sexully Transmitted Infections 2020, pp.363-374; Maduna LD, Kock MM, van der Veer BMJW et all //Antimicrob Agents Chemother. 2020 Aug 31:AAC.00906-20. doi: 10.1128/AAC.00906-20; Harris SR, Cole MJ, Spiteri G et all // Euro-GASP study group. Lancet Infect Dis. 2018, 18(7), pp.758-768.], в ряде стран Европы, Южной Африки, Канаде, Японии, Китае и др., с каждым годом увеличивается число зафиксированных случаев неэффективности в лечении гонококковой инфекции фторхинолонами, азитромицином, а также цефалоспоринами, которые являются препаратами III поколения антибиотиков пенициллинового ряда. В РФ тоже наблюдаются однонаправленные тенденции роста устойчивости к пенициллинам, тетрациклинам, фторхинолонам, азитромицину. Очевидно, что преодоление проблем в дерматовенерологии, урологии, акушерстве и гинекологии в связи с появлением множественной лекарственной устойчивости, является задачей первостепенной важности. В схемах лечения больных гонококковой инфекцией в России, основными лекарственными препаратами являются цефтриаксон, цефиксим, цефотаксим и спектиномицин [Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем, 5-е изд., перераб. и доп. М.: Деловой экспресс, 2016, с.674]. Все они действуют, угнетая синтез клеточной стенки микроорганизмов, однако, при этом обладают целым рядом побочных действий для пациента, таких как нарушение функции почек, дисбактериоз, лейкоцитоз, тромбоцитопения, анафилактический шок, бронхоспазм и др. Все вышесказанное предполагает поиск новых подходов и новых мишеней для лекарств следующего поколения и актуальность создания новых антибактериальных средств, в том числе и против бактерий Neisseria gonorrhoeae, не вызывает никаких сомнений.

Раскрываемые в настоящем изобретении соединения являются новыми, не описанными ранее производными имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-онов и представляют собой вещества общей формулы:

где: R = водород (1a), изо-пропилтио (1b), бензилтио (1c).

Аналогом заявляемых соединений по строению является 3-метокси-5-метил-2-(4-метилфенил)имидазо[1,2-b]пиридазин-6(5Н)-он (А), аналогом по действию 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(изопропилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (B). Препаратом сравнения по действию являются спектиномицин (SPEC). Новые соединения, раскрываемые в настоящем изобретении, отличаются от известного и близкого по структуре соединения А тем, что в азольной части гетероциклической системы вместо арильного заместителя находится атом водорода, а вместо метокси-группы реализуются или водород, или изопропилсульфанильный, или бензилсульфанильный фрагмент. Азиновый цикл заявляемых соединений содержит вместо метила при атоме азота изо-пропильный заместитель и отличается от аналога А наличием еще двух циклических атомов азота вместо атомов углерода. Раскрываемые в настоящем изобретении соединения 1a-c отличаются от аналога по действию В наличием изо-пропильного заместителя при атоме азота в азиновом цикле и вместо остатка гуанидина, присоединенного через гетероатом N, присутствует окси-группа, связанная с гетероциклом через атом кислорода.

Синтез аналога по строению А опубликован [Eur. J. Med. Chem. 1996, 3I, 65I-662], антибактериальная активность для него неизвестна. Получение соединения В и его активность в отношении Neisseria gonorrhoeae описаны [Известия АН. Серия химическая, 2018, 11, с.2081-2087].

Аналог по назначению – спектиномицин (SPEC) является антибактериальным препаратом и используется в медицинской практике для лечения заболеваний, вызванных штаммами грамотрицательных бактерий Neisseria gonorrhoeae. Недостатками этого препарата являются различные побочные эффекты при применении, такие как головная боль, головокружение, бессонница, уменьшение диуреза, лихорадка, озноб, кожные высыпания и т.д. [М.Д. Машковский, Лекарственные средства, 15-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: РИА «Новая волна»: издатель Умеренков, 2007, c. 821].

Структуры представленных в изобретении новых соединений подтверждены данными спектроскопии ЯМР ¹Н, (спектрометр Avance DRX-400 (Bruker) с рабочей частотой 400 МГц), элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (Perkin Elmer), масс-спектрометрии (масс-спектрометр maXis impact HD (Bruker)).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

4-Изопропилимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3(4H)-он (1a)

К 1 ммоль 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, полученного по описанной методике [Изв. АН. Сер. хим., 2011, 5, с.961-967], в 10 мл ацетонитрила прибавили 1 мл 1н водного раствора NaOH, выдержали при 60°С в течение 5 часов. Растворитель удалили при 90°С и пониженном давлении. Остаток перекристаллизовали из этанола, получив натриевую соль 3-гидрокси-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина. Выход 144 мг (88%). Т.пл. 310-313°С. Найдено, %: C 29.65; H 1.38; N 42.54. С₄H₂N₅NaO*0,25H₂O. Вычислено, %: C 29.37; H 1.54; N 42.81. Спектр ЯМР ¹H (DMSO-d₆) d: 7.45 (д, J=0.7 Гц, 1 Н, СН); 7.50 (д, J=0.7 Гц, 1 Н, СН).

К полученной натриевой соли 3-гидрокси-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина добавили 3 мл ДМФА и 541 мг (4.4 ммоль, 5 экв) 2-бромпропана. Выдержали при 130°С в течение 5 часов. Растворитель удалили при пониженном давлении. Соединение 1а выделили колоночной хроматографией (элюент бензол-ацетонитрил 1:1, R_f = 0.5). Выход 27 мг (17%). Т. пл. 154-155°С. Найдено,%: C 46.74; H 5.01; N 39.28. C₇H₉N₅O. Вычислено,%: C 46.92; H 5.06; N 39.09. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃), d: 1.54 (д, 6 Н, J=6.6 Гц, 2 CH₃); 5.46 (сп, J=6.6 Гц, 1H, CH в Prⁱ); 7.90, 8.45 (оба с, по 1H, C(6)H, С(7)Н).

Пример 2

4-Изопропил-6-изопропилтиоимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3(4H)-он (1b)

Синтезировали аналогично примеру 1 из 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-изопропилтиоимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, полученного по описанной методике [Eur. J. Med. Chem. 2019, 178, 39-47].

Натриевая соль 3-гидрокси-6-изопропилтиоимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина. Выход 201 мг (80%). Т. пл. 158-161°С. Найдено,%: C 33.36; H 4.02; N 27.58. С₇H₈N₅NaOS*H₂O. Вычислено,%: C 33.46; H 4.01; N 27.87. Спектр ЯМР ¹H (DMSO-d₆), d: 1.15 (д, J=6.7 Гц, 6 Н, 2 СН₃); 3.49 (сп, J=6.7 Гц, 1 Н, СН); 7.59 (с 1 Н, С(7)Н).

Алкилирование натриевой соли 2-бромпропаном проводили в течение 10 часов. Соединение 1b выделили колоночной хроматографией (элюент бензол-ацетонитрил 1:1, R_f = 0.75). Выход 50 мг (25%). Т. пл. 112-113°С. LCMS высокого разрешения.  Найдено m/z: 254.1068 [M+H]⁺. C₁₀H₁₅N₅OS. Вычислено m/z: 254.1070.  Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃) d: 1.33 (д, J=6.7 Гц, 6 Н, 2 CH₃); 1.54 (д, J=6,2 Гц, 6 Н, 2 CH₃); 3.65 (сп, J=6.7 Гц, 1Н, СН в Prⁱ); 5.42 (сп, J=6,2 Гц, 1Н, СН в Prⁱ); 8.24 (с, 1 Н, С(7)Н).

Пример 3

6-Бензилтио-4-изопропилимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3(4H)-он (1c)

Синтезировали аналогично примеру 1 из 6-бензилтио-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, полученного по описанной методике [Eur. J. Med. Chem. 2019, 178, 39-47].

Натриевая соль 6-бензилтио-3-гидроксиимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина. Выход 270 мг (85%). Т.пл. 123°С (разл.). Найдено, %: C 41.78; H 3.54; N 22.10. С₁₁H₈N₅NaOS*2H₂O. Вычислено,%: C 41.64; H 3.81; N 22.07. Спектр ЯМР ¹H (DMSO-d₆), d: 4.13 (с, 2 Н, СН₂); 7.07-7.11 (м, 2Н, Ph); 7.16-7.25 (м, 3Н, Ph); 7.33 (с, 1 Н, С(7)Н).

Алкилирование натриевой соли 2-бромпропаном проводили в течение 10 часов. Соединение 1с выделили колоночной хроматографией (элюент этилацетат-гексан 1:1, R_f = 0.5). Выход 87 мг (33%). Т. пл. 149-150°С. Найдено, %: C 54.62; H 5.17; N 22.57. C₁₄H₁₅N₅OS*0,5H₂O. Вычислено, %: C 54.18; H 5.20; N 22.56. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃) d: 1.52 (д, J=6,6 Гц, 6 Н, 2 СН₃); 4.44 (с, 2 Н, СН₂); 5.44 (сп, J=6,6 Гц, 1 Н, СН в Prⁱ); 7.27-7.30 (м, 5Н, Ph); 8.15 (с, 1 Н, С(7)Н).

Изучение антибактериальной активности in vitro заявляемых соединений Ia-c

Антибактериальную активность химических соединений в отношении облигатного патогена N. gonorrhoeae определяют методом двукратных серийных разведений в агаре (золотой стандарт). В качестве ростовой среды используют питательную среду – гонококковый агар «Комплегон» (Россия). Разведения АБП в агаре проводят в 24 луночных планшетах, рабочий объем лунки 2 мл.

Для каждого химического соединения готовят не менее 12 точек с разведениями: 250 мкг/мл – 0,122 мкг/мл. Растворитель – ДМСО, разбавители дистиллированная стерильная вода (для инъекций), ростовая среда на агаровой основе. Посевная доза (конечная концентрация) инокулюма из суточной культуры N. gonorrhoeae – 10⁵ КОЕ/мл. Инкубируют планшеты при условиях Т=37°С, [СО₂= 5%]. Оценку результатов проводят через 18-24 часа. Критерии интерпретации результатов: новые химические соединения считают перспективными для дальнейшего изучения, если значения МИК in vitro для тест-штаммов не превышают 10—20 мкг/мл [Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010; Методические указания по изучению противомикробной активности фармакологических веществ. С.265]. В исследованиях используют эталонный штамм: Neisseria gonorrhoeae NCTC 12700 /ATCC 49226.

В качестве аналога по действию для сравнения применяют чистое химическое соединение (субстанцию) спектиномицин (Sigma-Aldrich, USA; Lot Number 102K05447V). Полученные результаты представлены в табл. 1.

Дополнительно для всех заявляемых соединений Ia-с, были определены минимальные ингибирующие концентрации в отношении следующих эталонных штаммов клинически-значимых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из международных коллекций АТСС и Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ, Россия):

Грамотрицательные палочки (энтеробактерии):

Escherichia coli ATCC 8739

Citrobacter braakii ATCC 101/57

Shigella flexneri 1a8516

Proteus vulgaris ГКПМ 160125 (222)

Serratia marcescens ATCC 13880

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Неферментатирующие грамотрицательные палочки:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Грамположительные кокки:

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Антибактериальную активность химических соединений в отношении клинически-значимых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводят методом последовательных микроразведений – референсным методом, регламентированным международным стандартом ISO 20776-1:2006. В Российской Федерации действует Национальный Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010, идентичный международному стандарту: в стерильных 96-луночных планшетах готовят разведения препаратов в бульоне Мюллера-Хинтон (Mueller Hinton Broth (HiMedia, Индия). Готовят инокулюмы контрольных штаммов, в соответствии со стандартом 0,5 ЕД по МакФарланду (что соответствует 1,5х10⁸ КОЕ/мл, затем разбавляют в 100 раз до концентрации 10⁶ КОЕ/мл. В каждую лунку горизонтального ряда вносят по 50 мкл инокулюма соответствующего штамма (в т.ч. и в контрольную). Инкубация планшета в термостате при 37°С 18-24 часа. Учет результатов визуально или спектрофотометрически. Последняя лунка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в отношении данного штамма.

Результаты скрининга представлены в таблице 2.

4-Изопропил-6-R-имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-оны, являющиеся антибактериальными агентами, активными в отношении грамотрицательных бактерий Neisseria gonorrhoeae, представляющие собой соединения формулы:

где R = H (1а), изопропилтио (1b); бензилтио (1c).