Связывающие молекулы, а именно антитела, способные связываться с l1cam (cd171)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, который способен специфично связываться с L1CAM человека, а также к содержащему его конъюгату и фармацевтической композиции. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный полипептид. Изобретение также относится к применению вышеуказанного конъюгата в качестве диагностического агента in vitro. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение или профилактику опухолевого заболевания. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 пр.

 

Настоящее изобретение предлагает молекулу, связывающуюся с L1, которая способна связываться с эпитопом L1, распознаваемым моноклональным антителом L1-OV52.24, и/или которая способна конкурировать с моноклональным антителом L1-OV52.24 за связывание с L1, где вариабельный домен легкой цепи L1-OV52.24 содержит последовательность, описанную как SEQ ID NO: 1, или где легкая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 3, и где вариабельный домен тяжелой цепи L1-OV52.24 содержит последовательность, описанную как SEQ ID NO: 2, или где тяжелая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 4, нуклеиновые кислоты, кодирующие связывающие молекулы, их применение и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы.

Моноклональные антитела (mAb) являются новой и важной основой противораковой терапии [1]. За последние два десятилетия молекулярная биология предоставила средства для создания химерных, гуманизированных или полностью человеческих антител для лечения основных злокачественных заболеваний [2]. На сегодняшний день многие антитела и конъюгаты антител разрешены для применения в качестве противораковых терапевтических средств в Европе и Соединенных Штатах [3, 4]. Они включают немодифицированные антитела, конъюгаты антитело-лекарственное средство, а также конъюгаты с радионуклидами и биспецифические антитела [5]. Однако хорошо известно, что моноклональные антитела против конкретного ракового антигена могут отличаться по их способности к направленному взаимодействию с раковыми клетками.

В сделанной в последнее время работе авторы настоящего изобретения показали, что L1САМ (также называемый L1) может служить превосходной молекулой-мишенью, специфичной для раковых опухолей человека. Повышенная экспрессия L1CAM наблюдается при многих злокачественных опухолях человека, свидетельствует о плохом прогнозе, увеличении подвижности клеток, инвазии и метастазировании. Результаты, полученные с использованием ксенотрансплантатов [6] и мышиных [7] моделей, трансгенных по человеческому L1CAM, позволяют предположить, что mAb L1-9.3 против L1CAM (также называемое mAb 9.3) можно использовать как перспективное средство для лечения рака. Указанное mAb связывается с 1. Ig-подобным доменом молекулы L1CAM и эффективно выполняет ADCC-функции [6]. Недавно полученные результаты демонстрируют, что указанное mAb в его IgG2a-версии обладает высокой способностью к активации иммунной системы и рекрутингу иммунных эффекторных клеток, приводя к устранению раковых клеток [6, 7]. Таким образом, существует достаточно доказательств того, что указанное mAb участвует в ADCC-зависимых эффекторных механизмах, которые составляют важную часть mAb-зависимой противоопухолевой терапии.

В WO 2008/151819 [12] описано антитело против L1 9.3, которое связывается с эпитопом, находящимся в первом Ig-домене L1.

Несмотря на последние достижения в области конъюгатов антитело-лекарственное средство, существует потребность в mAb, способных к быстрой интернализации. Хорошо известно, что связывание специфических антител с L1CAM приводит к интернализации L1CAM с последующей утилизацией или деградацией молекулы-мишени [8]. Интернализация молекулы L1САМ имеет общие черты с интернализацией многих других молекул клеточной поверхности. Известно, что интернализация L1CAM на самом деле необходима для передачи сигнала и регулирования L1CAM-опосредованной клеточной адгезии [9-11].

Антитело-индуцированная интернализация L1CAM описана в ряде публикаций (как правило, на основе данных, полученных с использованием поликлональных антител), однако систематические исследования с использованием mAb не проводились. Следовательно, в настоящее время неизвестно, обуславливает ли взаимодействие с разными эпитопами на молекуле L1CAM разную скорость интернализации. К настоящему моменту авторы получили L1CAM-специфическое mAb, способное связываться с FNIII-4-5, и назвали его mAb L1-OV52.24 (или OV52.24). Авторы неожиданно обнаружили, что данное mAb интернализуется с гораздо более высокой скоростью, чем ранее охарактеризованное mAb L1-9.3. Кроме того, авторы также неожиданно обнаружили, что mAb L1-OV52.24 интернализуется с гораздо более высокой скоростью, чем моноклональные антитела против L1CAM 5G3 и UJ127.11, соответственно. Уникальные свойства L1-OV52.24 позволяют повысить эффективность и ускорить доставку лекарств к раковым клеткам.

Даже если некоторые характерные признаки антитела L1-OV52.24 настоящего изобретения частично уже были описаны, см. [6], само антитело или последовательности гипервариабельных участков (CDR) антитела настоящего изобретения никогда не были опубликованы или сделаны доступными для общественности.

Многие терапевтически активные средства действуют только в клетке. При этом возникает проблема, например, если терапевтически активное средство не может проникнуть в клетку в немодифицированном виде. Следовательно, существует потребность в связывающих средствах, таких как моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны эффективно интернализироваться в опухолевые клетки, и, следовательно, могут направлять связанные с ними средства в опухолевую клетку.

Неожиданно было обнаружено, что моноклональное антитело L1-OV52.24 способно к быстрой и эффективной интернализации в клетки млекопитающих, несущие L1, что подтверждают результаты микроскопического анализа и проточной цитометрии таких клеток, инкубированных с L1-OV52.24 в течение 40, 60, 70 или 90 минут, соответственно, как показано в примерах.

Таким образом, такие моноклональные антитела или другие связывающие молекулы, такие как антитела, связывающиеся с L1, и способные связываться с эпитопом L1, распознаваемым L1-OV52.24, обладают большими преимуществами при применении в области биотехнологических исследований, диагностики или терапии. В частности, связывающая молекула настоящего изобретения может быть связана с активным средством, которое может проникать в клетку путем интернализации. Затем такое активное средство может оказывать желательный эффект в клетке, такой как цитотоксический или цитостатический эффект.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает молекулу, связывающуюся с L1, которая способна связываться с эпитопом L1, распознаваемым моноклональным антителом L1-OV52.24, где вариабельный домен легкой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность, описанную как SEQ ID NO: 1, или где легкая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 3, и где вариабельный домен тяжелой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность, описанную как SEQ ID NO: 2, или где тяжелая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 1 относится к домену VJ, т.е. к вариабельному участку легкой цепи L1-OV52.24. Константный домен легкой цепи известен в данной области, а мышиная последовательность его кДНК показана ниже.

SEQ ID NO: 2 относится к области VDJ, т.е. к вариабельному участку тяжелой цепи L1-OV52.24. Константный домен тяжелой цепи известен в данной области, а мышиная последовательность его кДНК показана ниже.

L1, также известный как L1CAM, представляет собой трансмембранный белок; он представляет собой молекулу адгезии нейронных клеток, являющуюся членом семейства белков L1 размером 200-220 кДа, участвует в аксональном наведении и миграции клеток, играя важную роль в развитии устойчивых к лечению видов рака. L1, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляет собой белок L1 млекопитающих, более предпочтительно, или мышиный белок L1. Человеческий белок L1 зарегистрирован в GenBank под номером NP_000416, а мышиный белок L1 зарегистрирован в GenBank под номером NP_032504. L1CAM также обозначают CD171.

Эпитоп представляет собой часть антигена, которая распознается антителами или родственными связывающими молекулами. Например, эпитоп представляет собой конкретный участок антигена, с которым связывается антитело. Эпитопы могут представлять собой конформационные эпитопы или линейные эпитопы. Конформационный эпитоп состоит из пространственно разделенных участков аминокислотной последовательности антигена. Такие эпитопы взаимодействуют с паратопом благодаря поверхностным 3-мерным элементам и форме, или благодаря третичной структуре антигена. Доля конформационных эпитопов неизвестна.

В примерах показано, что L1-OV52.24 распознает и связывает эпитоп в домене фибронектина III 4-5 L1. Методы определения эпитопа, связываемого и распознаваемого связывающей молекулой, описаны на предыдущем уровне техники (Wolterink et. al., Cancer Res. (2010), 70: 2504-2515) и в примерах. Как показано в примерах, распознаваемый эпитоп предпочтительно определяют путем конструирования ряда белков L1-Fc, несущих разные домены Ig. Для тонкого картирования, в соответствии с примерами, можно использовать рекомбинантные фрагменты L1, меченные V5, как описано, например, в Gouveia et al. (Protein Expr. Purif. (2007) 52: 182-193). Картирование эпитопов можно проводить методами ELISA или вестерн-блоттинга с использованием рекомбинантных белков. mAb L1-OV52.24 взаимодействует с доменом 4-5FNIII L1. Как правило, методы определения эпитопа конкретного антитела известны в данной области и включают получение синтетических линейных пептидов из представляющего интереса участка и последующее тестирование связывания антитела с указанными пептидами (см. Epitope Mapping, A practical approach, Oxford University Press 2001, Editors: Olwyn Westwood and Frank Hay). Альтернативно можно получить разные рекомбинантные белки, охватывающие представляющий интерес участок и тестировать их на связывание с антителом (Oleszewski, M., Gutwein, P.,von der Lieth,W., Rauch,U., Altevogt,P. Characterization of the L1-neurocan binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. J.Biol.Chem. 275: 34478-34485 (2000)).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает связывающую молекулу, способную конкурировать с моноклональным антителом L1-OV52.24 за связывание с L1, где вариабельный домен легкой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 1, или где легкая цепь кодируется SEQ ID NO: 3, и где тяжелая цепь L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 2, или где тяжелая цепь кодируется SEQ ID NO: 4.

Конкуренцию можно анализировать с помощью методов, известных специалистам в данной области, таких как конкурентные анализы связывания.

Легкая цепь (домен VJ, без константного домена, т.е. вариабельный участок) L1-OV52.24 имеет следующую белковую последовательность:

1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG TNVAWYQQKP GHSPKALIYS

51 TSYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTIRNVQS EDLAEYFCQQ YNTYPYTFGG

101 GTKLEIK (SEQ ID NO: 1)

CDR легкой цепи (домен VJ) L1-OV52.24 в соответствии с Kabat имеют следующие последовательности:

CDR-L1 (или LCDR1): KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5)

CDR-L2 (или LCDR2): STSYRYS (SEQ ID NO: 6)

CDR-L3 (или LCDR3): QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7)

Тяжелая цепь (домен VDJ, без константного домена, т.е. вариабельный участок) L1-OV52.24 имеет следующую белковую последовательность:

1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCKASGFNIK DYYMQWVKQR PEQGLEWIGW

51 IDPENGKTVF DPKFRGKASI SADTSSNTAY LQLSSLTSED TAVYYCARWN

101 PLAFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 2)

Последовательности CDR в соответствии с Kabat выделены подчеркиванием.

CDR тяжелой цепи (домен VDJ) L1-OV52.24 в соответствии с Kabat имеют следующие последовательности:

CDR-H1 (или HCDR1): FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8)

CDR-H2 (или HCDR2): WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9)

CDR-H3 (или HCDR3): WNPLAF (SEQ ID NO: 10)

кДНК иммуноглобулиновых генов, кодирующих моноклональное антитело L1-OV52.24 имеет следующую последовательность:

Код: 5'UTR (частичный, то есть секвенированный участок), лидер, IGKV/IGKJ или IGHV/IGHD/IGHJ, IGKC или IGHC

Тяжелая цепь

CTGCCtCATGAATATGcAAACATGAGtCTGTGATTATAAATACAgagATATCCAtACCAAACAACtTATGAgCACTGTTTTCTCTACAGTCACTGAATCTCAAgGTCCTTACA ATGcAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAAAACAGTTTTTGACCCGAAGTTCCGGGGCAAGGCCAGTATATCAGCGGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGAACCCCCTTGCCTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO: 4)

Легкая цепь

TTTGATGACTGCTTTGCATAGATCCCTAGAGGCCAGCCCAGCTGCCCATGATTTATAAACCAGGTCTTTGCAGTGAGATCTGAAATACATCAGATCAGCATGGGCATCAAG ATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGA GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCACTCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTACTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 3)

В предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Связывающая молекула представляет собой полипептид, способный специфически связываться с указанной мишенью. В соответствии с настоящим изобретением, мишень представляет собой белок L1. Таким образом, связывающие молекулы настоящего изобретения способны специфически связываться с L1. Предпочтительно связывающая молекула представляет собой иммуноглобулин-содержащую молекулу, т.е. молекулу, которая содержит, по меньшей мере, один домен Ig или антитело против L1.

Термин "специфическое связывание" означает, что связывающая молекула связывается с L1, по меньшей мере, в 50 раз, предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз сильнее, чем с контрольным белком, таким как альбумин, что определяют, например, методом вестерн-блоттинга или ELISA.

Термин "антитело против L1" в настоящем описании относится к любому полипептиду, структурно подобному природному антителу и способному связываться с L1, где специфичность связывания определяют CDR полипептида. Следовательно, термин "антитело против L1" относится к структуре иммуноглобулинового происхождения, способной связываться с L1. Антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полипептид, который содержит, по меньшей мере, один антигенсвязывающий фрагмент полноразмерного антитела. Антигенсвязывающие фрагменты содержат, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, расположенные таким образом, что оба домена вместе способны связываться с конкретным антигеном.

Моноклональные антитела представляют собой моноспецифические антитела, которые являются идентичными, поскольку они продуцируются иммунными клетками одного типа, являющимися клонами одной исходной клетки.

"Моноклональные антитела" и способы получения моноклональных антител известны в данной области техники. Как правило, моноклональные антитела получают, например, с помощью известного способа Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299). Альтернативно можно использовать гибридомы, секретирующие моноклональные антитела, в данном способе моноклональное антитело, направленное против полипептида настоящего изобретения, можно идентифицировать и выделить путем скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных иммуноглобулинов (например, фаговой библиотеки антител) с использованием представляющего интерес полипептида. Наборы для получения и скрининга фаговых библиотек являются коммерчески доступными (например, набор, поставляемый Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, № по каталогу 27-9400-01; и набор для получения фаговых дисплеев Stratagene SurfZAP, № по каталогу 240612). Кроме того, примеры способов и реагентов, предпочтительно используемых для получения и скрининга библиотек антител, можно найти, например, в патенте США № 5223409; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9:1370 1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81 85; Huse et al., 1989, Science 246:1275 1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725 734.

Термин "полноразмерные" или "полные" антитела относится к белкам, состоящих из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, соединенных между собой дисульфидными связями, которые содержат: (1) вариабельный участок тяжелой цепи и константный участок тяжелой цепи, который состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3; и (2) вариабельный участок легкой цепи и константный участок легкой цепи, который состоит из одного домена, C_L. Термин "полное антитело" относится к любому антителу, которое имеет типичную полнодоменную структуру природного антитела (т.е. содержит тяжелую цепь, состоящую из трех или четырех константных доменов, и легкую цепь, состоящую из одного константного домена, а также соответствующие вариабельные домены), при этом каждый домен может содержать дополнительные модификации, такие как мутации, делеции или вставки, которые не изменяют полнодоменную структуру. Например, mAb L1-OV52.24 представляет собой полноразмерное антитело.

"Антигенсвязывающий фрагмент" моноклонального антитела представляет собой фрагмент моноклонального антитела, который выполняет практически такую же функцию, и обладает такой же специфичностью, как и полноразмерное моноклональное антитело, из которого получен фрагмент. Ограниченное протеолитическое расщепление папаином приводит к получению трех фрагментов исходного Ig. Два идентичных аминоконцевых фрагмента, каждый из которых содержит одну полноразмерную L-цепь и примерно половину Н-цепи, являются антигенсвязывающими фрагментами (Fab). Третий фрагмент, имеющий подобный размер, но содержащий карбоксиконцевые половины обоих тяжелых цепей, связанные межцепочечной дисульфидной связью, представляет собой фрагмент, способный кристаллизоваться (Fc). Fc содержит углевод-связывающий, комплемент-связывающий и FcR-связывающий участки. Ограниченное расщепление пепсином дает один фрагмент F(аb')₂, содержащий оба фрагмента Fab и шарнирный участок с межцепочечной H-H дисульфидной связью. F(ab')₂ представляет собой двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент. Дисульфидную связь F(ab')₂ можно расщепить с получением Fab'. Кроме того, вариабельные участки тяжелых и легких цепей можно соединить с получением одноцепочечного вариабельного фрагмента (ScFv).

Поскольку полноразмерные антитела первого поколения имеют ряд недостатков, многие из антител второго поколения содержат только фрагменты антител. Вариабельные домены (Fv) представляют собой наименьшие фрагменты, содержащие интактный антигенсвязывающий домен, состоящий из одного V_L и одного V_H. Такие фрагменты, содержащие только связывающие домены, можно получить с помощью ферментативных методов или путем экспрессии соответствующих фрагментов гена, например в бактериальных и эукариотических клетках. С помощью разных способов можно получить, например, либо отдельный фрагмент Fv, либо фрагменты 'Fab', содержащие одно из верхних плечей "Y", которое, в свою очередь, содержит Fv плюс первый константный домен. Указанные фрагменты, как правило, стабилизируют путем введения полипептидной связи между двумя цепями, что приводит к получению одноцепочечного Fv (ScFv). Альтернативно можно использовать дисульфид-связанные фрагменты Fv (dsFv). Связывающие домены фрагментов можно объединить с любыми константными доменами с получением полноразмерных антител, или их можно гибридизовать с другими белками и полипептидами.

Рекомбинантный фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (ScFv). Как правило, он обладает высоким сродством к антигену и может экспрессироваться в организмах разных хозяев. Благодаря этим и другим свойствам фрагменты ScFv можно использовать не только в медицинской, но и в биотехнологической области. Как подробно описано выше, во фрагменте ScFv домены V_H и V_L соединены гидрофильным и гибким пептидным линкером, который повышает экспрессию и эффективность укладки. Обычно используют линкеры, содержащие примерно 15 аминокислот, среди которых наиболее часто используют линкер (Gly₄Ser)₃. Молекулы ScFv могут легко подвергаться протеолитический деградации, в зависимости от используемого линкера. С развитием методов генной инженерии появилась возможность преодолеть указанные ограничения посредством исследований, сфокусированных на улучшении функционирования и стабильности. Примером является получение дисульфид-стабилизированных (или дисульфид-связанных) фрагментов Fv, где димер V_H-V_L стабилизируется в результате образования межцепочечной дисульфидной связи. Остатки цистеина, введенные на границе раздела между доменами V_L и V_H, образуют дисульфидный мостик, который удерживает вместе два домена.

Диссоциация scFv приводит к образованию мономерных scFv, которые могут образовывать димеры (диатела), тримеры (триатела) или более крупные агрегаты, такие как TandAb и Flexibodies.

Антитела, содержащие два связывающих домена, можно получить либо путем соединения двух ScFv посредством простой пептидной связи (ScFv)₂, либо путем димеризациюи двух мономеров (диатела). Самое простое строение имеют диатела, содержащие два функциональных антигенсвязывающих домена, которые могут быть одинаковыми или подобными (двухвалентные диатела), или они могут быть специфичными к разным антигенам (биспецифические диатела).

Кроме того, разработаны форматы антител, содержащие четыре вариабельных домена тяжелой цепи и четыре вариабельных домена легкой цепи. Их примеры включают четырехвалентные биспецифические антитела (TandAb и Flexibodies, Affimed Therapeutics AG, Heidelberg, Germany). В отличие от биспецифического диатела, биспецифический TandAb представляет собой гомодимер, состоящий только из одного полипептида. Вследствие наличия двух разных цепей, диатело может образовать три разных димера, из которых только один является функциональным. Поэтому проще и дешевле получить и очистить этот гомогенный продукт. Кроме того, TandAb обычно обладает улучшенными связывающими свойствами (вследствие присутствия удвоенного числа участков связывания) и повышенной стабильностью in vivo. Flexibodies представляют собой сочетание ScFv с мотивом мультимера диатела, образующее поливалентную молекулу с высокой степенью гибкости, обеспечивающей соединение двух молекул, весьма удаленных друг от друга на поверхности клетки. Если присутствует более двух функциональных антигенсвязывающих доменов и если они обладают специфичностью к разным антигенам, антитело является мультиспецифическим.

Таким образом, специфические иммуноглобулины, в которые могут быть вставлены отдельные раскрытые последовательности, или, альтернативно, в которых такие последовательности составляют существенную часть молекулы, включают, без ограничения, нижеследующие связывающие молекулы, которые образуют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения: Fab (моновалентный фрагмент, содержащий вариабельный участок легкой цепи (V_L), вариабельный участок тяжелой цепи (V_H), константный участок легкой цепи (C_L) и константный участок тяжелой цепи 1 (C_H1)), F(ab')₂ (двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком или, альтернативно, по шарнирному участку), Fv (домены V_L и V_H), ScFv (одноцепочечный Fv, где V_L и V_H соединены посредством линкера, такого как пептидный линкер), молекула биспецифического антитела (молекула антитела, содержащего описанный здесь полипептид, связанный со вторым функциональным фрагментом, обладающим специфичностью связывания, отличной от специфичности антитела, и включающим, без ограничения, другой пептид или белок, такой как антитело или лиганд рецептора), биспецифический одноцепочечный димер Fv, диатело, триатело, тетратело, минитело (ScFv, присоединенный к C_H3).

Некоторые связывающие молекулы или антигенсвязывающие фрагменты моноклональных антител, включающие, без ограничения, Fv, ScFv, молекул диател или доменные антитела (Domantis), можно стабилизировать путем включения дисульфидных мостиков, удерживающих домены VH и VL. Биспецифические антитела можно получить с помощью традиционных технологий, среди которых конкретные способы включают химические методы получения или методы, в которых используют гибридомы, а также другие технологии, включающие, без ограничения, технологии BiTE™ (с использованием молекул, содержащих антигенсвязывающие участки разной специфичности и пептидный линкер) и технологии "выступ-во-впадину".

Соответственно, связывающая молекула, или антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела, может представлять собой Fab, Fab', F(ab')2, Fv, дисульфид-связанный Fv, ScFv, (ScFv)₂, двухвалентное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело, диатело, триатело, тетратело или минитело.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула представляет собой человеческое антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Химерное антитело представляет собой антитело, которое можно получить с помощью рекомбинантных методов путем соединения, по меньшей мере, одного участка иммуноглобулина одного вида с участком иммуноглобулина другого вида, с целью уменьшения иммуногенности антитела. Например, мышиные участки V_L и V_H можно присоединить к остальной части человеческого иммуноглобулина. Конкретным типом химерных антител являются гуманизированные антитела. Гуманизированные антитела получают путем соединения ДНК, кодирующей CDR нечеловеческого антитела, с ДНК, кодирующей человеческое антитело. Затем полученную конструкцию ДНК можно использовать для экспрессии и продукции антител, которые, как правило, являются не такими иммуногенными, как нечеловеческое исходное антитело, или химерное антитело, поскольку только CDR являются нечеловеческими. Кроме того, антитело может быть человеческим.

Для применения в организме человека, например, для профилактики, лечения или диагностики in vivo, предпочтительно использовать человеческое или, по меньшей мере, гуманизированное антитело.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения связывающая молекула, такая как моноклональное антитело, содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, включающей: константный домен человеческого IgM, константный домен человеческого IgG1, константный домен человеческого IgG2, константный домен человеческого IgG3, константный домен человеческого IgG4, константный домен человеческого IgE и константный домен человеческого IgA.

Как подробно описано выше в отношении к связывающей молекуле, предпочтительно представляющей собой моноклональное антитело настоящего изобретения, каждая тяжелая цепь природного антитела содержит два домена, константный домен и вариабельный домен. Существует пять типов тяжелых цепей иммуноглобулинов млекопитающих: γ, δ, α, μ и ε, которые определяют классы иммуноглобулинов IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно.

Существует четыре подкласса IgG (IgG1, 2, 3 и 4) в организме человека, перечисленные в порядке уменьшения их содержания в сыворотке (IgG1 являются наиболее распространенными). Хотя сходство Fc-участков подклассов IgG составляет примерно 95%, структура шарнирных участков различается относительно сильно. Данные участки, находящиеся между плечами Fab (антигенсвязывающие фрагменты) и двумя карбокси-концевыми доменами CH₂ и СН₃ обеих тяжелых цепей, определяют гибкость молекул. Верхний шарнирный (по направлению к амино-концу) сегмент обеспечивает изменчивость угла между плечами Fab (гибкость Fab-Fab), а также вращательную подвижность каждого отдельного Fab. Гибкость нижнего шарнирного участка (по направлению к карбокси-концу) непосредственно определяет положение Fab-плечей по отношению к Fc-участку (гибкость Fab-Fc). Шарнир-зависимая Fab-Fab и Fab-Fc гибкость может играть важную роль в инициации эффекторных функций, таких как активация комплемента и связывание рецептора Fc. Соответственно, структура шарнирных участков обеспечивает уникальный биологический профиль каждого из четырех классов IgG.

Длина и гибкость шарнирного участка варьирует среди подклассов IgG. Шарнирный участок IgG1 содержит аминокислоты 216-231 и, вследствие высокой гибкости, фрагменты Fab могут вращаться вокруг своих осей симметрии и двигаться внутри сферы, центр которой находится в первом из двух дисульфидных мостиков, соединяющих тяжелые цепи. Шарнирный участок IgG2 более короткий, чем шарнирный участок IgG1, он содержит 12 аминокислотных остатков и четыре дисульфидных мостика. В шарнирном участке IgG2 отсутствует остаток глицина, он является относительно коротким и содержит жесткую поли-пролиновую двойную спираль, стабилизированную дополнительными дисульфидными мостиками между тяжелыми цепями. Указанные признаки ограничивают гибкость молекулы IgG2. IgG3 отличается от других подклассов уникально длинным шарнирным участком (который примерно в четыре раза длиннее, чем шарнирный участок IgG1), содержащим 62 аминокислотных остатка (в том числе 21 остаток пролина и 11 остатков цистеина) и образующим негибкую поли-пролиновую двойную спираль. В IgG3 фрагменты Fab находятся относительно далеко от фрагмента Fc, обеспечивая более высокую гибкость молекулы. Удлиненный шарнирный участок IgG3 также обуславливает более высокую молекулярную массу по сравнению с другими подклассами. Шарнирный участок IgG4 короче, чем шарнирный участок IgG1, а его гибкость является промежуточной между гибкостью IgG1 и IgG2.

Таким образом, в следующем предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула выбрана из группы, включающей одноцепочечное антитело, предпочтительно выбранное из scFv и мультимера scFv, такого как диатело, триатело или тетратело, фрагмент антитела, предпочтительно Fab, TandAb, Flexibody и биспецифическое антитело.

В следующем предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Как может видеть из примеров, эпитоп антитела L1-OV52.24 находится в фибронектиновом домене III 4-5 L1. Следовательно, и эпитоп связывающих молекул настоящего изобретения, таких как моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предпочтительно находится в фибронектиновом домене III 4-5 L1.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления эпитоп находится в фибронектиновом домене III 4-5 (FN III 4-5) L1.

L1-OV52.24 содержит следующие последовательности CDR: KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9), и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10).

Указанные выше последовательности соответствуют участкам CDR моноклонального антитела L1-OV52.24, определенным с помощью широко известного в данной области метода Kabat.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, где, по меньшей мере, один из гипервариабельных участков (CDR) моноклонального антитела против L1, или антигенсвязывающего фрагмента

a) содержит одну из последовательностей, выбранных из KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), или

b) содержит последовательность, которая, по сравнению с последовательностями, указанными в пункте а), имеет, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену.

Такое моноклональное антитело настоящего изобретения, или его антигенсвязывающий фрагмент, можно получить, например, путем прививки CDR, или путем продукции антитела с использованием рекомбинантных методов. Такие способы известны в данной области (см., например, Queen, патент США N 5585089, Winter, US 5225539, и Cabilly, US 4816567).

Кроме того, последовательности CDR можно изменить, предпочтительно путем консервативных аминокислотных замен.

Как правило, манипуляции, которые могут приводить к изменениям участков FR и CDR, включают замены, делеции и вставки остатков. Изменения можно осуществлять путем случайного или направленного мутагенеза. Для отбора мутантов с заданными и/или улучшенными свойствами можно использовать описанную выше систему фагового дисплея антител.

В предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, и содержит гипервариабельные участки (CDR) QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10) и, необязательно, одну или несколько консервативных аминокислотных замен.

SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность LCDR3, а SEQ ID NO: 10 представляет собой последовательность HCDR3 L1-OV52.24. Известно, что LCDR3 и HCDR3 оказывают большое влияние на связывающие свойства антитела.

В более предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит гипервариабельные участки (CDR) KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), в которых необязательно присутствуют одна или несколько консервативных аминокислотных замен.

В предпочтительном варианте осуществления консервативные аминокислотные замены отсутствуют.

В еще более предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит гипервариабельные участки (CDR) KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10), в которых необязательно присутствуют одна или несколько консервативных аминокислотных замен.

В предпочтительном варианте осуществления консервативные аминокислотные замены отсутствуют.

В другом предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело против L1, или антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой антитело IgG1, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения содержит:

а) по меньшей мере, одну из последовательностей, выбранных из KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), или

b) содержит последовательность, которая, по сравнению с последовательностями, указанных в пункте а), имеет, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения содержит последовательности QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), в которых необязательно присутствуют одна или несколько консервативных аминокислотных замен.

В еще более предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения содержит последовательности KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), в которых необязательно присутствуют одна или несколько консервативных аминокислотных замен.

В предпочтительном варианте осуществления, консервативные аминокислотные замены отсутствуют.

В предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело против L1, содержащее гипервариабельные участки (CDR) KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), или его антигенсвязывающий фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело против L1, содержащее гипервариабельные участки (CDR) KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10), или его антигенсвязывающий фрагмент.

Предпочтительно связывающая молекула настоящего изобретения обладает сильным сродством к L1. Обнаружено, что сродство L1-OV52.24 к L1 характеризуется значением KD(M)=2,41×10⁹.

Сродство к L1 можно определить с помощью известных в данной области способов, таких как, например, метод поверхностного плазмонного резонанса. Анализ связывания L1-OV52.24 проводят с использованием BIAcore 3000, оборудованного сенсорным чипом CM5. Коротко говоря, чип BIAcore CM5 активируют EDC/NHS, после чего на активированной поверхности улавливают разные уровни L1-Fc. Оставшиеся активные участки блокируют смесью этаноламин/HCl. Проводят связывание L1-OV52.24 с поверхностью, содержащей L1-Fc, и затем оставляют диссоциировать в течение определенного времени. Фазы ассоциации и диссоциации для каждой инъекции при каждой поверхностной плотности подвергают кинетическому анализу.

Следовательно, в следующем предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения, предпочтительно представляющая собой моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает L1 со сродством (KD), составляющим, по меньшей мере, 10^-9, предпочтительно, по меньшей мере, 10^-10 или 10^-11.

Неожиданно было обнаружено, что L1-OV52.24 эффективно интернализуется в клетки SKOV3ip после инкубации в течение 40, 60, 70 или 90 минут, как показано в примерах и на чертежах, тогда как контрольное антитело против L1, моноклональное антитело 9.3, интернализуется лишь в небольшой степени. Интернализацию можно определять с использованием связывающей молекулы, к которой присоединено подходящее диагностическое соединение, например, флуоресцентное соединение. В примерах в качестве флуоресцентного красителя используют Alexa488. Количественное определение интернализации можно проводить либо путем микроскопического анализа и подсчета, либо путем визуализации результатов проточной цитометрии, как описано в примерах. С помощью обоих методов было установлено, что L1-OV52.24 интернализуется в каждой анализируемой временной точке, по меньшей мере, в 4 раза более эффективно, чем антитело 9.3. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что L1-OV52.24 интернализуется более эффективно, чем коммерчески доступные моноклональных антител против L1 CAM 5G3 и UJ127.11 в моменты времени 60' и 90' (фигура 6). Определенные в примерах превосходные и неожиданные характеристики интернализации L1-OV52.24 показаны на фигуре 7. Неожиданно было обнаружено, что интернализация L1-OV52.24 в момент времени 90' значительно превышает интернализацию любого из существующих моноклональных антител против L1CAM 9.3, 5G3 и UJ127.11, со значением р≤0,01, соответственно. Таким образом, L1-OV52.24, или его антигенсвязывающие фрагменты, или связывающие молекулы, распознающие такой же эпитоп, что и L1-OV52.24, особенно подходят для доставки терапевтически активных средств (лекарственных средств), или для доставки диагностического соединения, например, с целью визуализации.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения интернализуется в клетку млекопитающего, экспрессирующую L1, предпочтительно, в клетку, представляющую собой опухолевую клетку млекопитающего, экспрессирующую L1, более предпочтительно, клетку SKOV3ip.

В предпочтительном варианте осуществления интернализацию в клетку млекопитающего, экспрессирующую L1, предпочтительно, в клетку, представляющую собой клетку SKOV3ip, определяют путем микроскопического анализа и количественной оценки, или путем визуализации результатов проточной цитометрии. Указанные методы предпочтительно проводят по способу, описанному в примерах. В другом предпочтительном варианте осуществления интернализация, по меньшей мере, в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 4 раза, более предпочтительно, по меньшей мере, в 7 раз, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 10 раз превышает интернализацию моноклонального антитела 9.3, как описано в заявке WO 2008/151819, после инкубации в течение 40, 60, 70 или 90 минут. В следующем предпочтительном варианте осуществления интернализация, по меньшей мере, в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 4 раза превышает интернализацию моноклонального антитела 5G3 после инкубации в течение 60 или 90 минут. В другом предпочтительном варианте осуществления интернализация, по меньшей мере, в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 4 раза превышает интернализацию моноклонального антитела UJ127.11 после инкубации в течение 60 или 90 минут.

В еще более предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело L1-OV52.24, где вариабельный домен легкой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 1, или где легкая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 3, и где вариабельный домен тяжелой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 2, или где тяжелая цепь кодируется последовательностью SEQ ID NO: 3, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно, имеет последовательность SEQ ID NO: 1, а вариабельный домен тяжелой цепи L1-OV52.24 содержит, предпочтительно, имеет последовательность SEQ ID NO: 2.

Последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 относятся к домену VJ; т.е. вариабельному домену легкой цепи L1-OV52.24 и домен VDJ; т.е. вариабельному домену тяжелой цепи L1-OV52.24, соответственно, как показано выше.

Таким образом, данное изобретение в одном из вариантов осуществления относится к моноклональному антителу L1-OV52.24, или его антигенсвязывающему фрагменту. Моноклональное антитело L1-OV52.24 раскрывается здесь посредством описания последовательностей соответствующих вариабельных доменов его тяжелой и легкой цепей (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1, соответственно) и/или кДНК, кодирующих тяжелую и легкую цепи (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно).

В особенно предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула настоящего изобретения, присоединенная к терапевтически активному средству, обеспечивает его интернализацию.

Терапевтически активное средство в соответствии с настоящим изобретением представляет собой соединение, которое оказывает терапевтический или профилактический эффект в организме животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно, человека.

В более предпочтительном варианте осуществления терапевтически активное средство оказывает терапевтический или профилактический эффект в организме животного, нуждающегося в лечении или профилактике опухолевого заболевания и/или заболевания, связанного с экспрессией L1.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтически активное средство представляет собой соединение, используемое в химиотерапии, т.е. химиотерапевтическое соединение. В предпочтительном варианте осуществления терапевтически активное средство представляет собой цитотоксическое или цитостатическое соединение.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающей молекуле настоящего изобретения, присоединенной к терапевтически активному средству,

которое предпочтительно представляет собой

химиотерапевтическое соединение, предпочтительно выбранное из алкилирующего средства, противоопухолевого антибиотика, антиметаболита и производного природного соединения,

цитотоксическое соединение,

цитостатическое соединение,

цитокин, наночастицу, или

радионуклид.

Подходящие цитокины включают, например, TNF-альфа, IL-2 и IL-12.

Подходящие химиотерапевтические соединения известны в данной области техники. Эти соединения можно подразделить на несколько разных категорий, включающих, например, алкилирующие средства, противоопухолевые антибиотики, антиметаболиты и производные природных соединений.

Примеры алкилирующих средств, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают бусульфан, кароплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид (т.е. цитоксан), дакарбазин, ифосфамид, ломустин, мехоларетамин, мелфалан, прокарбазин, стрептозоцин и тиотепу.

Примеры противоопухолевых антибиотиков включают блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, митомицин (например, митомицин C), митоксантрон, пентостатин и пликамицин.

Примеры антиметаболитов включают фтордезоксиуридин, кладрибин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, фторурацил (например, 5-фторурацил (5FU)), гемцитабин, гидроксимочевину, меркаптопурин, метотрексат и тиогуанин.

Примеры производных природных соединений включают доцетаксел, этопозид, иринотекан, таксаны (например, паклитаксел), тенипозид, топотекан, винбластин, винкристин, винорелбин, преднизон и тамоксифен.

Другие примеры химиотерапевтических средств, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают аспарагиназу и митотан.

Кроме того, можно использовать керамид С2.

Термин "присоединенный" в соответствии с настоящим изобретением относится к образованию как ковалентной, так и нековалентной связи, предпочтительно, ковалентной связи. В варианте осуществления, относящемся к ковалентной связи, связывающая молекула настоящего изобретения может быть присоединена к терапевтическому активному средству или диагностическому соединению непосредственно, или через подходящую линкерную молекулу. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения связывающую молекулу присоединяют к терапевтически активному средству или диагностическому соединению через линкер. Подходящие линкеры известны в данной области техники.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления связывающую молекулу ковалентно присоединяют к терапевтически активному средству и/или диагностическому соединению, необязательно через линкер.

Подходящие радионуклиды включают ^67/64Cu, ¹³¹I, ¹²⁴I или ⁹⁰Y. Такие радионуклиды можно присоединить к связывающей молекуле настоящего изобретения посредством комплексообразующих фрагментов, или, в случае йода, путем образования непосредственной ковалентной связи. Предпочтительно комплексообразующие фрагменты ковалентно присоединены к связывающей молекуле, необязательно посредством линкера.

Такие конъюгаты антител известны в данной области (Wu AM, Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin treatment of cancer. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, WO 90/12592, WO 2007/030642, WO 2004/067038, WO 2004/003183, US 2005/0074426, WO 94/04189).

В более предпочтительном варианте осуществления терапевтически активное вещество представляет собой

химиотерапевтическое соединение, или цитотоксическое соединение, или цитостатическое соединение, выбранное из средства, повреждающего ДНК, такого как актиномицин D, митомицин C, цисплатин, доксорубицин, этопозид, верапамил, подофиллотоксин, 5-FU, производное природного соединения и таксан, предпочтительно паклитаксел и карбоплатин.

Кроме того, может быть предпочтительным присоединение связывающей молекулы настоящего изобретения к диагностическому соединению.

Диагностическое соединение представляет собой соединение, способное продуцировать сигнал, который можно обнаружить при непосредственной или косвенной детекции. В одном предпочтительном варианте осуществления соединение является пригодным для введения животному, такому как млекопитающее, более предпочтительно, человек. В этом варианте осуществления присоединенная связывающая молекула может быть пригодна для применения как in vitro, так и in vivo. В другом предпочтительном варианте осуществления соединение не подходит для введения животному, такому как млекопитающее, более предпочтительно, человек. В этом варианте осуществления присоединенную связывающую молекулу можно использовать для применения in vitro. Диагностическое соединение можно детектировать непосредственно или косвенно. Диагностические соединения, позволяющие осуществлять непосредственную детекцию и пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть выбраны из любых известных детектируемых маркерных групп, таких как хромогены, флуоресцентные группы, хемилюминесцентные группы (например, сложные эфиры акридиния или диоксетаны), электрохемилюминесцентные соединения, катализаторы, ферменты, субстраты ферментов, красители, флуоресцентные красители (например, флуоресцеин, кумарин, родамин, оксазин, резоруфин, цианин и их производные), коллоидные металлические и неметаллические частицы, а также частицы органического полимерного латекса. Другие примеры диагностических соединений включают люминесцирующие комплексы металлов, такие как комплексы рутения или европия, и радиоизотопы.

Косвенные системы детекции включают, например, применение партнеров из биоаффинной связывающейся пары. Примеры подходящих связывающихся пар включают гаптен или антиген/антитело, биотин или аналоги биотина, такие как аминобиотин, иминобиотин или дезтиобиотин/авидин или стрептавидин, сахар/лектин, нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты/комплементарная нуклеиновая кислота и рецептор/лиганд, например, рецептор стероидного гормона/стероидный гормон.

Таким образом, в следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающей молекуле, присоединенной к диагностическому соединению, предпочтительно выбранному из радионуклида, хемолюминесцентного соединения, флуоресцентного соединения, красителя или фермента.

Как показано в примерах, моноклональное антитело L1-OV52.24 можно успешно присоединить к флуоресцентному соединению или флуоресцентному красителю, а именно, к красителю Alexa (Alexa488).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гибридомной клетке, которая продуцирует моноклональное антитело настоящего изобретения против L1.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте,

(i) которая кодирует связывающую молекулу настоящего изобретения, и/или

(ii) которая кодирует, по меньшей мере, одну цепь связывающей молекулы настоящего изобретения, и/или

(iii) которая содержит последовательность SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4, и/или

(iv) которая содержит последовательность (последовательности), кодирующую, по меньшей мере, одну из последовательностей KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10).

В более предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота настоящего изобретения является частью вектора. Такой вектор предпочтительно представляет собой вектор, обеспечивающий экспрессию в бактериях, таких как E. coli, в дрожжевых клетках, в клетках насекомых или клетках млекопитающих. Предпочтительно нуклеиновые кислоты настоящего изобретения находятся в векторе под контролем соответствующих регуляторных последовательностей, таких как промоторы или энхансеры, обеспечивающих экспрессию в клетке-хозяине. Предпочтительно векторы содержат последовательности, обеспечивающие репликацию в клетке-хозяине.

Предпочтительно связывающую молекулу, присоединенную к диагностическому соединению, можно использовать для диагностических целей in vitro и, следовательно, она является важным инструментом для биотехнологических исследований. Так, например, с помощью связывающих молекул настоящего изобретения, как правило, можно анализировать биопсийные образцы пациентов или телесные образцы. Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению связывающей молекулы настоящего изобретения в качестве диагностического средства in vitro или в качестве биотехнологического средства in vitro. В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению связывающей молекулы настоящего изобретения, присоединенной к диагностическому соединению, в качестве диагностического средства in vitro, или в качестве биотехнологического средства in vitro. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению связывающей молекулы настоящего изобретения, присоединенной к терапевтически активному средству, в качестве биотехнологического средства in vitro.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающей молекуле настоящего изобретения, предназначенной для применения в качестве лекарственного или диагностического средства.

В особенно предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства, представляет собой связывающую молекулу, присоединенную к терапевтически активному средству, как описано выше. Связывающая молекула доставляет терапевтически активное средство в опухолевую клетку, где связывающая молекула, присоединенная к терапевтически активному средству, может оказывать терапевтическое действие.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтически активное вещество вводят в терапевтически эффективном количестве.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула, предназначенная для применения в качестве диагностического средства, представляет собой связывающую молекулу, присоединенную к диагностическому соединению. С помощью таких связывающих молекул настоящего изобретения можно проводить визуализацию организма пациента целью диагностики, например, для определения прогноза или отслеживания результатов лечения. Таким образом, связывающая молекула настоящего изобретения, присоединенная к диагностическому соединению, предпочтительно является диагностическим партнером связывающей молекулы настоящего изобретения, присоединенной к терапевтически активному средству.

Связывающие молекулы настоящего изобретения предпочтительно входят в состав фармацевтической композиции.

Соединение может представлять собой и диагностическое соединение, и терапевтически активное вещество. Примером такого соединения являются некоторые радионуклиды, такие как ¹³¹I, которые можно использовать как для визуализации in vivo, так и для лечения опухолей.

Как правило, фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат терапевтически эффективное количество связывающей молекулы настоящего изобретения и, необязательно, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В конкретном варианте осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства, или правительства штата, или занесенный в фармакопею США, или другую общепризнанную фармакопею, как препарат для применения у животных, более конкретно, у людей. Термин "носитель" относится к разбавителям, вспомогательным средствам, наполнителям или средам, в смеси с которыми вводят лекарственное средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, например, нефтепродукты, масла животного, растительного или синтетического происхождения, включающие, без ограничения, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем, если фармацевтическую композицию вводят перорально. Физиологический раствор и водный раствор декстрозы являются предпочтительными носителями, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно используют в качестве жидких носителей для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция при необходимости также может содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих средств, или забуферивающих средств. Указанные композиции могут находиться в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и т.п. Композиция также может находиться в виде суппозиториев, содержащих традиционные связующие средства и носители, такие как триглицериды. Пероральная композиция может содержать стандартные носители фармацевтической степени чистоты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и др. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество терапевтического средства, предпочтительно в очищенной форме, и носитель в количестве, подходящем для получения формы для надлежащего введения пациенту. Композиция должна соответствовать способу введения.

В предпочтительном варианте осуществления композицию получают с помощью рутинных процедур в виде фармацевтической композиции, предназначенной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция также может содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лидокаин, чтобы уменьшить боль в участке инъекции. Как правило, ингредиенты предоставляют либо по отдельности, либо в смеси друг с другом в виде стандартной лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения путем инфузии, она может находиться в инфузионном флаконе, содержащем стерильную воду или стерильный физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. Если композиция предназначена для введения путем инъекции, может предоставляться ампула со стерильной водой или физиологическим раствором для инъекций, чтобы смешивать ингредиенты перед введением.

Терапевтические средства настоящего изобретения могут находиться в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные свободными карбоксильными группами, такие как соли, образованные соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотой и т.д., соли, образованные свободными аминогруппами, такие как соли, образованные изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д., и соли, образованные гидроксидами натрия, калия, аммония, кальция, железа и др.

Количество терапевтического средства настоящего изобретения, эффективное для лечения конкретного расстройства или состояния, зависит от природы расстройства или состояния, и может быть определено с помощью стандартных клинических методов. Кроме того, для определения оптимальных диапазонов доз можно использовать анализы in vitro. Точная доза для применения в композиции также зависит от способа введения и тяжести заболевания или расстройства, и должна устанавливаться в соответствии с мнением практикующего врача и обстоятельств каждого пациента. Однако подходящие диапазоны доз для внутривенного введения, как правило, составляют примерно 20-500 мкг активного соединения на килограмм массы тела. Подходящие диапазоны доз для интраназального введения, как правило, составляют примерно от 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Эффективные дозы можно определить путем экстраполяции кривых доза-ответ, полученных в результате тестирования с использованием систем in vitro или на животных моделях. Как правило, содержание активного ингредиента в суппозиториях может находиться в диапазоне от 0,5% до 10% по массе; пероральные композиции предпочтительно содержат от 10% до 95% активного ингредиента.

Известны разные способы доставки, которые можно использовать для введения терапевтических средств настоящего изобретения, такие как инкапсуляция в липосомы, микрочастицы и микрокапсулы, применение рекомбинантных клеток, способных экспрессировать терапевтическое средство, применение рецептор-опосредованного эндоцитоза (например, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); конструирование терапевтической нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения включают, без ограничения, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное, интраназальное, эпидуральное и пероральное введение. Соединения можно вводить любым удобным способом, например, путем инфузии, путем болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные оболочки (например, через слизистую оболочку полости рта, прямой кишки, кишечника и т.д.), кроме того, их можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным. Иногда желательно вводить фармацевтические композиции настоящего изобретения в центральную нервную систему с помощью любого подходящего способа, включающего внутрижелудочковые и интратекальные инъекции; внутрижелудочковые инъекции можно проводить с помощью внутрижелудочкового катетера, например, прикрепленного к резервуару, такому как резервуар Оммайя. Также можно использовать легочное введение, например, с помощью ингалятора или распылителя с использованием композиции, содержащей аэрозольное средство.

В конкретном варианте осуществления иногда желательно вводить фармацевтические композиции настоящего изобретения локально в участок, нуждающийся в лечении. Такое введение можно осуществить, в качестве примера, но не ограничения, путем местной инфузии во время хирургической операции, путем местного применения, например, в сочетании с раневой повязкой после операции, путем инъекции, с помощью катетера, с использованием суппозиториев или имплантата, причем указанный имплантат может быть изготовлен из пористого, непористого или желатинового вещества, включающего мембраны, такие как силиконовые мембраны, или волокна. В одном варианте осуществления введение можно осуществлять путем непосредственной инъекции в участок (или бывший участок) злокачественной опухоли или опухолевой, или предопухолевой ткани.

В другом варианте осуществления терапевтическое средство может быть доставлено в везикуле, такой как липосома (Langer, 1990, Science 249: 1527-1533), более конкретно, катионная липосома (WO 98/40052).

В следующем варианте осуществления терапевтическое средство можно доставлять посредством системы с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления можно использовать насос (Langer, выше). В другом варианте осуществления систему с регулируемым высвобождением можно поместить вблизи терапевтической мишени, при этом требуется только часть системной дозы.

В контексте данного аспекта настоящее изобретение также предлагает способ лечения или профилактики опухолевого заболевания у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы настоящего изобретения, предпочтительно моноклонального антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента.

Используемый на протяжении данного описания термин "эффективное количество" означает, что конкретную молекулу, или конкретное соединение вводят в количестве, достаточном для достижения желаемого терапевтического эффекта. В данном описании введение двух соединений в терапевтически эффективном количестве означает, что одно из соединений, или каждое соединение вводят в субтерапевтическом количестве, т.е., в таком количестве, которое для каждого отдельно вводимого соединения не является достаточным для того, чтобы обеспечить терапевтический эффект, но при введении соединений в сочетании обеспечивает достижение желаемого терапевтического эффекта. Однако настоящее изобретение также охватывает введение каждого из соединений по отдельности в терапевтически эффективном количестве.

В соответствии с настоящим изобретением термин "лечение опухолевого заболевания" включает уничтожение опухолевых клеток, уменьшение пролиферации опухолевых клеток (например, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 50% или, по меньшей мере, на 90%), а также полное ингибирование пролиферации опухолевых клеток у пациента, страдающего от опухолевого заболевания. Кроме того, данный термин включает предотвращение онкогенного заболевания, например, путем уничтожения клеток, которые могут стать опухолевыми в будущем, или имеют тенденцию становиться опухолевыми, а также образования метастазов.

В свете настоящего изобретения специалисту в данной области будет понятно, что используемая индивидуальная терапия зависит, например, от физического состояния пациента, или от тяжести заболевания, и должна корректироваться от случая к случаю.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или связывающую молекулу настоящего изобретения. Все описанные выше варианты осуществления также применимы к такой фармацевтической композиции.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающей молекуле настоящего изобретения, предпочтительно представляющей собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенной для лечения или профилактики опухолевого заболевания, где опухолевое заболевание предпочтительно представляет собой эпителиальное опухолевое заболевание, и/или выбрано из группы, включающей астроцитому, олигодендроглиому, менингиому, нейрофиброму, глиобластому, эпендимому, шванному, нейрофибросаркому, медуллобластому, меланому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак легкого, рак яичников, рак эндометрия, рак почки, нейробластому, плоскоклеточный рак, медуллобластому, гепатому, рак толстой кишки, мезотелиому и плоскоклеточный рак.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу настоящего изобретения и, необязательно, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, описанных выше.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекуле, связывающей L1, где связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело против L1, или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором, по меньшей мере, один из гипервариабельных участков (CDR) моноклонального антитела против L1, или его антигенсвязывающего фрагмента

a) содержит одну из последовательностей KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), или

b) имеет последовательность, которая, по сравнению с последовательностями, указанных в пункте а), содержит, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекуле, связывающей L1, где связывающая молекула содержит

a) по меньшей мере, одну из последовательностей, выбранных из KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5), STSYRYS (SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (SEQ ID NO: 10), или

b) последовательность, которая, по сравнению с последовательностями, указанными в пункте а), содержит, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену.

Такие моноклональные антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, или связывающие молекулы настоящего изобретения можно получить, например, путем прививки CDR, или путем продукции антитела с помощью рекомбинантных методов. Такие способы известны в данной области (см., например, Queen, патент США № 5585089, Winter, US 5225539, Cabilly, US 4816567).

Описанные здесь предпочтительные варианты осуществления изобретения применимы ко всем связывающим молекулам и моноклональным антителам настоящего изобретения, а также к их антигенсвязывающим фрагментам.

Ссылки

1. Galluzzi L, Vacchelli E, Fridman WH, Galon J, Sautes-Fridman C, Tartour E, Zucman-Rossi J, Zitvogel L, Kroemer G: Trial Watch: Monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology 2012, 1(1):28-37.

2. Presta LG: Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Curr Opin Immunol 2008, 20(4):460-470.

3. Reichert JM: Marketed therapeutic antibodies compendium. MAbs 2012, 4(3).

4. Reichert JM: Antibodies to watch in 2014: mid-year update. mAbs 2014, 6(4):799-802.

5. Reichert JM: Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs 2011, 3(1):76-99.

6. Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.

7. Doberstein K, Harter PN, Haberkorn U, Bretz NP, Arnold B, Carretero R, Moldenhauer G, Mittelbronn M, Altevogt P: Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT. International journal of cancer Journal international du cancer 2014.

8. Novak-Hofer I, Amstutz HP, Morgenthaler JJ, Schubiger PA: Internalization and degradation of monoclonal antibody chCE7 by human neuroblastoma cells. International journal of cancer Journal international du cancer 1994, 57(3):427-432.

9. Schaefer AW, Kamiguchi H, Wong EV, Beach CM, Landreth G, Lemmon V: Activation of the MAPK signal cascade by the neural cell adhesion molecule L1 requires L1 internalization. The Journal of biological chemistry 1999, 274(53):37965-37973.

10. Long KE, Asou H, Snider MD, Lemmon V: The role of endocytosis in regulating L1-mediated adhesion. The Journal of biological chemistry 2001, 276(2):1285-1290.

11. Schaefer AW, Kamei Y, Kamiguchi H, Wong EV, Rapoport I, Kirchhausen T, Beach CM, Landreth G, Lemmon SK, Lemmon V: L1 endocytosis is controlled by a phosphorylation-dephosphorylation cycle stimulated by outside-in signaling by L1. The Journal of cell biology 2002, 157(7):1223-1232.

12. WO 2008/151819

Чертежи

Фигура 1: Измерение поглощения mAb против L1CAM 9.3 клетками Skov3ip.

Клетки Skov3ip инкубируют в течение разных периодов времени с Alexa488-конъюгированным mAb против L1CAM L1-9.3. Затем образцы фиксируют и детектируют антитело, связанное с клеточной поверхностью, используя в качестве вторичного антитела козье антитело против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированное с Alexa647. В момент времени 0' клетки инкубируют на льду, чтобы избежать интернализации антитела. Образцы прочитывают с помощью визуализирующего проточного цитометра Amnis ISX, собирают 3000 клеток и анализируют с помощью программного обеспечения IDEAS Amnis. В секции (А) показаны типичные изображения полученных клеток в моменты времени 0 минут, 60 минут (B) и 90 минут (C). На нижней панели приведены графики, демонстрирующие соответствующие результаты количественных анализов образцов. В секции (D) приведены результаты для момента времени 0', (Е) - 60' и (F) - 90'. На оси y откладывают нормализованные значения частоты, а на оси x откладывают соответствующие значения интенсивности внутриклеточной флуоресценции Alexa488-конъюгированного mAb 9.3 против L1CAM по отношению к общей интенсивности флуоресценции в клетке. В приведенной под графиками таблице показано число клеток, используемых для анализа (число клеток) и среднее значение на графике (среднее). Эксперимент повторяют трижды, показан типичный результат.

Фигура 2: Измерение поглощения антитела против L1CAM mAb OV52.24 клетками Skov3ip.

Клетки Skov3ip инкубируют в течение разных периодов времени с Alexa488-конъюгированным mAb против L1 OV52.24. Затем образцы фиксируют и детектируют антитело, связанное с клеточной поверхностью, используя в качестве вторичного антитела козье антитело против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированное с Alexa647. В момент времени 0' клетки инкубируют на льду, чтобы избежать интернализации антитела. Образцы прочитывают с помощью визуализирующего проточного цитометра Amnis ISX, собирают 3000 клеток и анализируют с помощью программного обеспечения IDEAS Amnis. В секции (А) показаны типичные изображения полученных клеток в моменты времени 0 минут, 60 минут (B) и 90 минут (C). На нижней панели приведены графики, демонстрирующие соответствующие результаты количественных анализов образцов. В секции (D) приведены результаты для момента времени 0', (Е) - 60' и (F) - 90'. На оси y откладывают нормализованные значения частоты, а на оси x откладывают соответствующие значения интенсивности внутриклеточной флуоресценции Alexa488-конъюгированного mAb OV52.24 против L1 по отношению к общей интенсивности флуоресценции в клетке. В приведенной под графиками таблице показано число клеток, используемых для анализа (число клеток) и среднее значение на графике (среднее). Эксперимент повторяют трижды, показан типичный результат.

Фигура 3: Измерение поглощения mAb 9.3 и OV52.24 против L1CAM клетками Skov3ip.

На данной фигуре приведены результаты анализа данных, показанных на фигуре 1 и на фигуре 2. В верхней панели приведены графики, полученные для mAb 9.3 против L1CAM, а в нижней панели приведены графики, полученные для mAb OV52.24 против L1CAM, в разные моменты времени, а именно 0', 60' и 90'.

Фигура 4: Измерение поглощения mAb 9.3 и OV52.24 против L1CAM клетками Skov3ip методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Клетки Skov3ip инкубируют в течение 70 минут с Alexa488-конъюгированными mAb 9.3 или OV52.24 против L1CAM. Затем образцы фиксируют и детектируют антитело, связанное с клеточной поверхностью, используя в качестве вторичного антитела козье антитело против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированное с Alexa647. После этого образцы визуализируют с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica SP5 II. Z-срезы получают в подобных Z-положениях. Для количественного определения каждого антитела используют n=30 клеток. (А) Изображения анализируют с помощью Fiji (ImageJ) и используют для построения графика в виде гистограммы, демонстрирующей интенсивность внутриклеточный флуоресценции Alexa488-конъюгированных mAb 9.3 и L1-OV52.24 против L1 по отношению к общей интенсивности флуоресценции в клетках (B). Эксперимент повторяют трижды, показан типичный результат. Левая колонка соответствует результатам, полученным в моменты времени 40 мин и 90 мин для mAb 9.3. Правая колонка соответствует результатам, полученным в моменты времени 40 мин и 90 мин для mAb OV52.24.

Фигура 5: Подтверждение поглощения mAb 5G3 и UJ127.11 против L1CAM клетками Skov3ip методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Клетки Skov3ip инкубируют в течение 70 минут с Alexa488-конъюгированными mAb 5G3 и UJ127.11 против L1CAM. Затем образцы фиксируют и детектируют антитело, связанное с клеточной поверхностью, используя в качестве вторичного антитела козье антитело против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированное с Alexa647. После этого образцы визуализируют с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica SP5 II. Z-срезы получают в подобных Z-положениях. Для каждого антитела используют n=30 клеток. Показан типичный результат.

Фигура 6: Измерение и сравнение поглощения mAb против L1CAM 9.3, OV52.24, 5G3 и UJ127.11 клетками Skov3ip.

Клетки Skov3ip инкубируют в течение разных периодов времени с Alexa488-конъюгированными mAb против L1. Затем образцы фиксируют и детектируют антитело, связанное с клеточной поверхностью, используя в качестве вторичного антитела козье антитело против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированное с Alexa647. В момент времени 0' клетки инкубируют на льду, чтобы избежать интернализации антитела. Образцы прочитывают с помощью визуализирующего проточного цитометра Amnis ISX, собирают 5000 клеток и анализируют с помощью программного обеспечения Amnis IDEAS. Левая панель графиков соответствует временной точке 0 минут, средняя панель соответствует временной точке 60 минут, а правая панель соответствует временной точке 90 минут. На оси y откладывают нормализованные значения частоты, а на оси x откладывают соответствующие значения интенсивности внутриклеточной флуоресценции Alexa488-конъюгированных mAb против L1 по отношению к общей интенсивности флуоресценции в клетке. Среднее значение относительной интенсивности внутриклеточной флуоресценции для каждого условия приведено на графике. Эксперимент повторяют трижды, показан типичный результат.

Фигура 7: Сравнение поглощения mAb против L1CAM 9.3, OV52.24, 5G3 и UJ127.11 клетками Skov3ip.

На данной фигуре в обобщенном виде приведены результаты типичных анализов, показанных на фигуре 6. Результаты трех разных независимых экспериментов приведены в виде графиков, построенных с использованием средних значений относительной внутриклеточной интенсивности, полученных в каждом эксперименте для каждого mAb против L1CAM. Для построения гистограмм используют средние значения±SD. Чтобы определить вероятность статистически значимого увеличения или уменьшения интернализации разных mAb против L1CAM, результаты трех независимых экспериментов анализируют с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента. Значение p<0,05 рассматривается как статистически значимое. Звездочки соответствуют следующим значениям: * р<0,05; ** р<0,01; *** P≤0,001.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии

Клетки карциномы яичника человека SKOV3ip получают из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Клеточные линии проверяются Немецким центром ресурсов биологического материала (Braunschweig, Germany) и на протяжении культивирования исследователями путем оценки типичной морфологии. Отсутствие микоплазмы в культурах подтверждают с помощью еженедельных тестов. Клетки культивируют в среде DMEM (Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS) (Biochrom, Berlin, Germany), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и 1 мМ пируват натрия (Invitrogen). Все клетки держат во влажной атмосфере при температуре 37°С и 5% СО₂.

Моноклональные антитела

mAb L1-9.3 против человеческого L1CAM описано ранее [6, 12].

L1-OV52.24 получают путем иммунизации мышей человеческим белком L1-Fc, содержащим эктодомен L1, или с использованием клеток SKOV3ip для иммунизации.

Последовательность кДНК иммуноглобулинового гена, кодирующего моноклональное антитело L1-OV52.24, определена и показана выше (легкая цепь: SEQ ID NO: 3 и тяжелая цепь: SEQ ID NO: 4).

Кроме того, определена белковая последовательность тяжелой и легкой цепей (домены VDJ или VJ, соответственно, без константного домена) L1-OV52.24 (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1). Также определены последовательности CDR L1-OV52.24 по номенклатуре Kabat. L1-OV52.24 содержит следующие последовательности CDR: KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID №: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10).

Оба mAb относятся к изотипу IgG1.

Изотипическое контрольное mAb получают от Bio X Cell ((West Lebanon, NH). Конъюгирование mAb против L1CAM с Alexa488 проводят с помощью набора для мечения (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко говоря, 100 мкг антитела смешивают с одним флаконом реагента для мечения, инкубируют в течение одного часа и затем очищают на колонке. Определяют степень мечения, чтобы гарантировать сходную эффективность мечения.

Константы связывания

Равновесный анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Анализ связывания проводят с использованием BIAcore 3000, оборудованным сенсорным чипом CM5. Коротко говоря, чип BIAcore CM5 активируют EDC/NHS и улавливают на активированной поверхности разные уровни L1-Fc. Оставшиеся активные участки блокируют смесью этаноламин/HCl. Проводят связывание L1-mAb с поверхностью, содержащей L1-Fc, и затем оставляют диссоциировать в течение определенного времени. Фазы ассоциации и диссоциации для каждой инъекции при каждой поверхностной плотности подвергают кинетическому анализу.

Распознаваемый эпитоп

Чтобы определить эпитопную специфичность авторы изобретения конструируют ряд белков L1-Fc, несущих разные Ig домены (как описано в [6]). Для тонкого картирования можно использовать недавно описанные рекомбинантные фрагменты L1, меченные V5 (Gouveia RM, Morais VA, Peixoto C, et al. Production and purification of functional truncated soluble forms of human recombinant L1 cell adhesion glycoprotein from Spodoptera frugiperda Sf9 cells. Protein Expr Purif 2007;52:182-93). Картирование эпитопов проводят методами ELISA или вестерн-блоттинга с использованием рекомбинантных белков.

Анализы поглощения антител

Метод визуализирующей проточной цитометрии (ImageStream)

Клетки Skov3ip отсоединяют с помощью смеси трипсин/EDTA, повторно суспендируют в культуральной среде, считают и делят на аликвоты, содержащие равное число клеток (200000 клеток). Клетки инкубируют при 37°С в течение периодов времени, соответствующих разным временным точкам, в непрерывном присутствии меченого антитела (10 мкг/мл), или на льду для временной точки 0 минут. В каждый момент времени, соответствующий определенной временной точке, клетки осаждают при 800 g, промывают один раз охлажденным на льду PBS и фиксируют 4% PFA (Thermo Fischer) в течение 15 мин на льду. Фиксированные клетки дважды промывают PBS и инкубируют с используемым в качестве вторичного антитела конъюгатом козье антитело против мышиных Ig-Alexa-647 в концентрации 25 мкг/мл (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) в течение 20 минут, после чего дважды промывают PBS.

Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

25000 клеток высевают и выращивают в 8-луночных μ-слайдах (Ibidi, Munich, Germany) в течение 24 часов. Клетки инкубируют при 37°С в течение разных периодов времени в непрерывном присутствии меченого антитела (10 мкг/мл). В каждый момент времени, соответствующий определенной временной точке, клетки промывают один раз охлажденным на льду PBS и фиксируют 4% PFA (Thermo Fischer) в течение 15 мин на льду. Фиксированные клетки дважды промывают PBS и инкубируют с используемым в качестве вторичного антитела конъюгатом козье антитело против мышиных Ig-Alexa-647 в концентрации 25 мкг/мл (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) в течение 20 минут, после чего дважды промывают PBS.

Визуализирующая проточная цитометрия и анализ

Образцы прочитывают на Amnis ImageStreamX (ISX) (Amnis Corp., Seattle, USA), используя лазер, излучающий при 488 нм, установленный на 100%, и лазер, излучающий при 561 нм, установленный на 80%, с объективом 60× и активированной опцией повышенная глубина резкости (EDF). Регистрируют результаты, полученные в каналах 2 и 5, а также светлопольное изображение в канале 1, и собирают 4000 клеток на образец. Аликвоты клеток для каждого антитела берут после фиксации и перед контрастным окрашиванием конъюгатом антитело против мышиных Ig-Alexa647 в качестве компенсаторных контролей для mAb против L1CAM, конъюгированных с Alexa488. Клетки окрашивают на льду соответствующими неконъюгированными mAb против L1 в такой же концентрации, что и конъюгированные антитела, и подвергают контрастному окрашиванию с использованием в качестве вторичного антитела такого же конъюгата антитело против мышиных Ig-Alexa647, который может служить компенсаторным контролем при контрастном окрашивании конъюгатом антитело против мышиных Ig-Alexa647. Компенсаторные контроли прочитывают при соответствующих компенсаторных настройках ISX.

Анализ результатов ISX проводят с помощью программного обеспечения IDEAS (Amnis Corp., Seattle, USA). Открывают файлы изображений RAW и генерируют матрицу компенсации с использованием соответствующих файлов компенсации. Полученные клетки подвергают отбору для выявления клеток в фокусе и затем отдельных клеток с использованием светлопольных изображений для управления отбором. "Маску клеточной поверхности" получают с использованием изображения канала 5, ограничивая интенсивность нижним пределом 200, при этом верхний предел оставляют неизменным на уровне 4095, чтобы устранить фон и оптимизировать сигнал. Во 2 канале отсечение по нижнему пределу интенсивности устанавливают на 150, при этом верхний предел оставляют неизменным на уровне 4095, и называют "канал 2". Оба параметра определяют исходя из результатов контрольного окрашивания изотипическим контролем для mAb против L1CAM, или только вторичным антителом. Кроме того, "маску клеточной поверхности" расширяют на один пиксель, чтобы включить соседние пиксели на канале 2. Генерируют другую маску, называемую "внутриклеточный сигнал", которую определяют как "канал 2, а не маска клеточной поверхности". И, наконец, генерируют объединенный параметр под названием "относительная внутриклеточная интенсивность", который определяют как "внутриклеточный сигнал/(интенсивность_MC_Ch02×100)". Строят соответствующую гистограмму и определяют среднее значение. Аналогичную процедуру применяют ко всем измеряемым образцам.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и анализ

Образцы прочитывают на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica SP5 II (Leica microsystems, Wetzlar, Germany), оборудованном детекторами HyD. Alexa-488-конъюгированные mAb против L1 возбуждают с помощью аргонового лазера, излучающего при 488 нм, а лазерную линию HeNe, излучающую при 633 нм, используют для возбуждения Alexa-647. Z-срезы получают в аналогичных z-положениях. Для каждого антитела собирают n=30 клеток и проводят количественный анализ. Изображения анализируют с помощью Fiji (ImageJ, NIH, Bethesda, USA), где сигнал контрастного окрашивания клеточной поверхности конъюгатом антитело против мышиных Ig-Alexa-647 используют для сегментирования и определения границ отдельных клеток, после чего определяют интенсивность внутриклеточной флуоресценции и общую интенсивность в клетке. Результаты приводят в виде гистограммы, демонстрирующей интенсивность внутриклеточной флуоресценции Alexa488-конъюгированных mAb L1-9.3 и L1-OV52.24 по отношению к общей интенсивности флуоресценции в клетке, полученной с помощью Excel (Microsoft, Redmond, USA).

Результаты

mAb L1-9.3 и L1-OV52-54 связываются с разными эпитопами молекулы клеточной поверхности L1CAM. mAb 9.3 явно взаимодействует с гибридным белком, состоящим из первого Ig домена (1.Ig-L1-Fc; [12]). Результаты анализа методом вестерн-блоттинга подтверждают, что mAb L1-OV52.24 распознает домен 4-5FNIII L1. mAb L1-9.3 связывается с первым Ig доменом, тогда как L1-OV52.24 связывается с эпитопом в домене 4-5.FNIII. mAb 9.3 обладает сродством к L1, характеризующимся KD(M)=8,5×10^-11 ([6]), тогда как mAb L1-OV52.24 обладает сродством к L1, характеризующимся KD(M)= 2,41×10^-9. Обнаружено, что L1-OV52.24 можно успешно использовать в анализах, проводимых с помощью методов вестерн-блоттинга и FACS, а также иммуногистохимии (IHC).

Авторы проводят анализы интернализации в клетки SKOV3ip с использованием Alex-488-конъюгированных mAb, как описано выше в разделе Материалы и методы. Интернализацию измеряют с помощью анализа Imagestream^X, который сочетает в себе FACS и флуоресцентный анализ и позволяет количественно оценить тысячи клеток. Результаты анализируют с помощью программного обеспечения IDEAS. Анализ L1-9.3 свидетельствует о медленной интернализации в моменты времени 0 мин, 60 мин и 90 мин (фиг.1А-F) со средним значением 7,8% в конечный момент времени. И наоборот, интернализация mAb L1-OV52.24 протекает намного быстрее и достигает среднего значения 40% в конечный момент времени (фиг.2А-F). Непосредственное сравнение результатов показано на фиг. 3.

Для подтверждения полученных результатов авторы проводят подобный анализ с прикрепленными клетками. Клетки SKOV3ip выращивают на покровных стеклах и оставляют для интернализации Alexa-конъюгированных антител. Количественное определение проводят методом лазерной сканирующей микроскопии с визуальным подсчетом клеток. Примеры окрашивания показаны на фиг. 4А, а полученные результаты приведены на фиг. 4В. Полученные результаты подтверждают данные, полученные с помощью анализа ImageStream, и демонстрируют, что скорость интернализации mAb L1-OV52.24 почти в десять раз выше. Данные результаты являются неожиданными и позволяют предположить, что mAb L1-OV52.24 можно использовать для доставки конъюгатов антитело-лекарственное средство.

Пример 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии

Клетки карциномы яичника человека SKOV3ip получают из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Клеточные линии проверяются Немецким центром ресурсов биологического материала (Braunschweig, Germany) и на протяжении культивирования исследователями путем оценки типичной морфологии. Отсутствие микоплазмы в культурах подтверждают с помощью еженедельных тестов. Клетки культивируют в среде DMEM (Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS) (Biochrom, Berlin, Germany), 2 мМ L-глутамин (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и 1 мМ пируват натрия (Invitrogen). Все клетки держат во влажной атмосфере при температуре 37°С и 5% СО₂.

Моноклональные антитела

mAb L1-9.3, 5G3 и UJ127.11 против человеческого L1CAM описаны выше [6].

L1-OV52.24 получают путем иммунизации мышей человеческим белком L1-Fc, содержащим эктодомен L1, или с использованием клеток SKOV3ip для иммунизации.

Последовательность кДНК иммуноглобулинового гена, кодирующего моноклональное антитело L1-OV52.24, определена и показана выше (легкая цепь: SEQ ID NO: 3 и тяжелая цепь: SEQ ID NO: 4).

Кроме того, определена белковая последовательность тяжелой и легкой цепей (домены VDJ или VJ, соответственно, без константного домена) L1-OV52.24 (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1). Также определены последовательности CDR L1-OV52.24 по номенклатуре Kabat. L1-OV52.24 содержит следующие последовательности CDR: KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID №: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10).

mAb L1-9.3, L1-OV52.24 и UJ127.11 относятся к изотипу IgG1. mAb 5G3 относится к изотипу IgG2a. Соответствующие изотипические контрольные mAb получают от Bio X Cell ((West Lebanon, NH). Конъюгирование mAb против L1CAM с Alexa488 проводят с помощью набора для мечения (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко говоря, 100 мкг антитела смешивают с одним флаконом реагента для мечения, инкубируют в течение одного часа и затем очищают на колонке. Определяют степень мечения, чтобы гарантировать сходную эффективность мечения. mAb 5G3, конъюгированное с Alexa488, получают от Novus Biologicals (Littleton, USA).

Анализы поглощения антител

Метод визуализирующей проточной цитометрии (ImageStream)

Клетки Skov3ip отсоединяют с помощью смеси трипсин/EDTA, повторно суспендируют в культуральной среде, считают и делят на аликвоты, содержащие равное число клеток (200000 клеток). Клетки инкубируют при 37°С в течение периодов времени, соответствующих разным временным точкам, в непрерывном присутствии меченого антитела (10 мкг/мл), или на льду для временной точки 0 минут. В каждый момент времени, соответствующий определенной временной точке, клетки осаждают при 800 g, промывают один раз охлажденным на льду PBS и фиксируют 4% PFA (Thermo Fischer) в течение 15 мин на льду. Фиксированные клетки дважды промывают PBS и инкубируют с используемым в качестве вторичного антитела конъюгатом козье антитело против мышиных Ig-Alexa-647 в концентрации 25 мкг/мл (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) в течение 20 минут, после чего дважды промывают PBS.

Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

25000 клеток высевают и выращивают в 8-луночных μ-слайдах (Ibidi, Munich, Germany) в течение 24 часов. Клетки инкубируют при 37°С в течение разных периодов времени в непрерывном присутствии меченого антитела (10 мкг/мл). В каждый момент времени, соответствующий определенной временной точке, клетки промывают один раз охлажденным на льду PBS и фиксируют 4% PFA (Thermo Fischer) в течение 15 мин на льду. Фиксированные клетки дважды промывают PBS и инкубируют с используемым в качестве вторичного антитела конъюгатом козье антитело против мышиных Ig-Alexa-647 в концентрации 25 мкг/мл (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) в течение 20 минут, после чего дважды промывают PBS.

Визуализирующая проточная цитометрия и анализ

Образцы прочитывают на Amnis ImageStreamX (ISX) (Amnis Corp., Seattle, USA), используя лазер, излучающий при 488 нм, установленный на 100%, и лазер, излучающий при 561 нм, установленный на 80%, с объективом 60× и активированной опцией повышенная глубина резкости (EDF). Регистрируют результаты, полученные в каналах 2 и 5, а также светлопольное изображение в канале 1, и собирают 10000 клеток на образец. Аликвоты клеток для каждого антитела берут после фиксации и перед контрастным окрашиванием конъюгатом антитело против мышиных Ig-Alexa647 в качестве компенсаторных контролей для mAb против L1CAM, конъюгированных с Alexa488. Клетки окрашивают на льду соответствующими неконъюгированными mAb против L1 в такой же концентрации, что и конъюгированные антитела, и подвергают контрастному окрашиванию с использованием в качестве вторичного антитела такого же конъюгата антитело против мышиных Ig-Alexa647, который может служить компенсаторным контролем при контрастном окрашивании конъюгатом антитело против мышиных Ig-Alexa647. Компенсаторные контроли прочитывают при соответствующих компенсаторных настройках ISX.

Анализ результатов ISX проводят с помощью программного обеспечения IDEAS (Amnis Corp., Seattle, USA). Открывают файлы изображений RAW и генерируют матрицу компенсации с использованием соответствующих файлов компенсации. Полученные клетки подвергают отбору для выявления клеток в фокусе и затем отдельных клеток с использованием светлопольных изображений для управления отбором. "Маску клеточной поверхности" получают с использованием изображения канала 5, ограничивая интенсивность нижним пределом 200, при этом верхний предел оставляют неизменным на уровне 4095, чтобы устранить фон и оптимизировать сигнал. Во 2 канале отсечение по нижнему пределу интенсивности устанавливают на 150, при этом верхний предел оставляют неизменным на уровне 4095, и называют "канал 2". Оба параметра определяют исходя из результатов контрольного окрашивания изотипическим контролем для mAb против L1CAM, или только вторичным антителом. Кроме того, "маску клеточной поверхности" расширяют на один пиксель, чтобы включить соседние пиксели на канале 2. Генерируют другую маску, называемую "внутриклеточный сигнал", которую определяют как "канал 2, а не маска клеточной поверхности". И, наконец, генерируют объединенный параметр под названием "относительная внутриклеточная интенсивность", который определяют как "внутриклеточный сигнал/(интенсивность_MC_Ch02×100)". Строят соответствующую гистограмму и определяют среднее значение. Аналогичную процедуру применяют ко всем измеряемым образцам.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Образцы прочитывают на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica SP5 II (Leica microsystems, Wetzlar, Germany), оборудованном детекторами HyD. Alexa-488-конъюгированные mAb против L1 возбуждают с помощью аргонового лазера, излучающего при 488 нм, а лазерную линию HeNe, излучающую при 633 нм, используют для возбуждения Alexa-647. Z-срезы получают в аналогичных z-положениях. Для каждого антитела используют n=30 клеток. Показаны типичные изображения.

Статистика

Вероятность статистически значимого увеличения или уменьшения показателей, определяемых, по меньшей мере, в трех независимых экспериментах, анализируют с помощью критерия Стьюдента. Проводят двусторонние непарные t-тесты. Результаты приводят на гистограммах в виде средних значений±SD. Значение p<0,05 рассматривается как статистически значимое. Значимость на графиках иллюстрируют с помощью звездочек. Звездочки соответствуют следующим значениям: * р<0,05; ** р<0,01; *** P≤0,001.

Результаты

Результаты примера 2 показаны на фигурах 5-7. Авторы проводят анализы интернализации в клетки SKOV3ip с использованием Alex-488-конъюгированных mAb, как описано выше в разделе Материалы и методы. Интернализацию измеряют с помощью анализа Imagestream^X, который сочетает в себе FACS и флуоресцентный анализ и позволяет количественно оценить тысячи клеток. Результаты анализируют с помощью программного обеспечения IDEAS. Анализ демонстрирует, что моноклональные антитела предшествующего уровня техники L1-9.3, 5G3 и UJ127.11 медленно интернализуются в моменты времени 0 мин, 60 мин и 90 мин (фигура 6). И наоборот, интернализация mAb L1-OV52.24 настоящего изобретения протекает намного быстрее и достигает среднего значения 41,7% в конечный момент времени (фиг. 6). Результаты приведены на фиг. 7. Неожиданно было обнаружено, что интернализация L1-OV52.24 в момент времени 90' статистически выше, чем интернализация любого из моноклональных антител предшествующего уровня техники против L1 9.3, 5G3 и UJ127.11, со значением р≤0,01, соответственно.

Для подтверждения полученных результатов авторы проводят подобный анализ с прикрепленными клетками. Клетки SKOV3ip выращивают на покровных стеклах и оставляют для интернализации Alexa-конъюгированных антител. Количественное определение проводят методом лазерной сканирующей микроскопии с визуальным подсчетом клеток. Примеры окрашивания показаны на фиг. 5. Полученные результаты подтверждают данные, полученные с помощью анализа ImageStream, и демонстрируют, что скорость интернализации mAb L1-OV52.24 гораздо выше, чем скорость интернализации антител предыдущего уровня техники против L1CAM. Данные результаты являются неожиданными и позволяют предположить, что mAb L1-OV52.24 можно использовать для доставки конъюгатов антитело-лекарственное средство.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen

Rechts

<120> Новая молекула, связывающаяся с L1

<130> D69332PC

<150> EP 14003383.8

<151> 2014-09-30

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> домен VJ легкой цепи L1-OV52.24

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 115

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> домен VDJ тяжелой цепи L1-OV52.24

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Lys Thr Val Phe Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Ser Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asn Pro Leu Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 816

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> последовательность легкой цепи

<400> 3

tttgatgact gctttgcata gatccctaga ggccagccca gctgcccatg atttataaac 60

caggtctttg cagtgagatc tgaaatacat cagatcagca tgggcatcaa gatggagtca 120

cagactcagg tctttgtata catgttgctg tggttgtctg gtgttgatgg agacattgtg 180

atgacccagt ctcaaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc 240

aaggccagtc agaatgtggg tactaatgtg gcctggtatc aacagaaacc aggtcactct 300

cctaaagcac tgatttactc gacatcctac cggtacagtg gagtccctga tcgcttcaca 360

ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatccgca atgtgcagtc tgaagacttg 420

gcagagtact tctgtcagca atataacacc tatccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 480

ctggaaataa aacgggctga tgctgcacca actgtatcca tcttcccacc atccagtgag 540

cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg tgcttcttga acaacttcta ccccaaagac 600

atcaatgtca agtggaagat tgatggcagt gaacgacaaa atggcgtcct gaacagttgg 660

actgatcagg acagcaaaga cagcacctac agcatgagca gcaccctcac gttgaccaag 720

gacgagtatg aacgacataa cagctatacc tgtgaggcca ctcacaagac atcaacttca 780

cccattgtca agagcttcaa caggaatgag tgttag 816

<210> 4

<211> 1490

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> последовательность тяжелой цепи

<400> 4

ctgcctcatg aatatgcaaa catgagtctg tgattataaa tacagagata tccataccaa 60

acaacttatg agcactgttt tctctacagt cactgaatct caaggtcctt acaatgcaat 120

gcagctgggt catcttcttc ctgatggcag tggttacagg ggtcaattca gaggttcagc 180

tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg tcctgcaaag 240

cttctggctt caacattaaa gactactata tgcagtgggt gaagcagagg cctgaacagg 300

gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa aacagttttt gacccgaagt 360

tccggggcaa ggccagtata tcagcggaca catcctccaa cacagcctac ctgcagctca 420

gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatggaac ccccttgcct 480

tctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacgacaccc ccatctgtct 540

atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg 600

tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg 660

gtgtgcacac cttcccagct gtcctggagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga 720

ctgtcccctc cagccctcgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca 780

gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag ccttgcatat 840

gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca 900

ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg 960

aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc 1020

gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg 1080

actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca 1140

tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc 1200

cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact 1260

tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca 1320

agaacactca gcccatcatg aacacgaatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg 1380

tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc 1440

tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1490

<210> 5

<211> 11

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> LCDR1

<400> 5

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> LCDR2

<400> 6

Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> LCDR3

<400> 7

Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> HCDR1

<400> 8

Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Gln

1 5

<210> 9

<211> 17

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> HCDR2

<400> 9

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Lys Thr Val Phe Asp Pro Lys Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 6

<212> Белок

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> HCDR3

<400> 10

Trp Asn Pro Leu Ala Phe

1 5

<---

1. Полипептид, который способен специфично связываться с L1CAM человека, содержащий по меньшей мере один домен Ig,

где полипептид представляет собой моноклональное анти-L1CAM антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, или

где полипептид выбран из группы, состоящей из одноцепочечного антитела и антигенсвязывающего фрагмента антитела, или

где полипептид является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека или его антигенсвязывающим фрагментом,

отличающийся тем, что полипептид содержит определяющие комплементарность области (CDR): KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10).

2. Полипептид по п.1, где одноцепочечное антитело выбрано из scFv и мультимера scFv, такого как диатело, триатело или тетратело, или где антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой Fab.

3. Полипептид по п.1, который представляет собой моноклональное анти-L1CAM антитело человека, содержащее определяющие комплементарность области (CDR) KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10), или его антигенсвязывающий фрагмент.

4. Полипептид по любому из пп.1-3,

(i) который связывается с L1CAM человека с аффинностью (KD), равной по меньшей мере 10^-9 М, и/или

(ii) который интернализуется клеткой млекопитающего, экспрессирующей L1CAM человека.

5. Полипептид по п.4, где указанный полипептид связывается с L1CAM человека с аффинностью (KD), равной по меньшей мере 10^-10 М.

6. Полипептид по п.4, где клетка млекопитающего является клеткой SKOV3ip.

7. Полипептид по п.1, который представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельная часть легкой цепи указанного антитела содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или где легкая цепь кодируется SEQ ID NO: 3, и где вариабельная часть тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность SEQ ID NO: 2 или где тяжелая цепь кодируется SEQ ID NO: 4.

8. Полипептид по п.7, который представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельная часть легкой цепи указанного антитела имеет последовательность SEQ ID NO: 1 или где легкая цепь кодируется SEQ ID NO: 3, и где вариабельная часть тяжелой цепи указанного антитела имеет последовательность SEQ ID NO: 2 или где тяжелая цепь кодируется SEQ ID NO: 4.

9. Конъюгат полипептида по любому из пп.1-8, связанного с (а) терапевтически активным веществом и/или (b) диагностическим соединением для доставки.

10. Конъюгат по п.9, где

(а) терапевтически активным веществом является:

химиотерапевтическое соединение,

цитотоксическое соединение,

цитостатическое соединение,

цитокин,

наночастица или

радионуклид и/или

(b) диагностическое соединение выбрано из радионуклида, хемолюминесцентного соединения, флуоресцентного соединения, красителя и фермента.

11. Конъюгат по п.10, где химиотерапевтическое соединение выбрано из алкилирующего агента, противоопухолевого антибиотика, антиметаболита и производного природного соединения.

12. Конъюгат по п.10, где терапевтически активное вещество представляет собой химиотерапевтическое соединение, или цитотоксическое соединение, или цитостатическое соединение.

13. Конъюгат по п.12, где химиотерапевтическое соединение, или цитотоксическое соединение, или цитостатическое соединение является ДНК-повреждающим средством или таксаном.

14. Конъюгат по п.13, где ДНК-повреждающее средство представляет собой актиномицин-D, митомицин C, цисплатин, доксорубицин, этопозид, верапамил, подофиллотоксин или 5-FU.

15. Конъюгат по п.13, где таксан выбран из паклитаксела и карбоплатина.

16. Конъюгат по любому из пп.9-15, где полипептид ковалентно связан с терапевтически активным веществом и/или диагностическим соединением через линкер.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1-8,

(i) содержащая последовательность SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и/или,

(ii) содержащая последовательность, кодирующую последовательности CDR KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID NO: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID NO: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID NO: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID NO: 9) и WNPLAF (HCDR3; SEQ ID NO: 10).

18. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1-8, содержащая последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

19. Нуклеиновая кислота по п.17 или 18, которая является частью вектора.

20. Применение конъюгата полипептида, который способен специфично связываться с L1CAM человека, содержащим по меньшей мере один домен Ig, по любому из пп.1-8, связанного с диагностическим соединением, в качестве диагностического агента in vitro.

21. Применение конъюгата полипептида, который способен специфично связываться с L1CAM человека, содержащим по меньшей мере один домен Ig, по любому из пп.1-8, связанного с терапевтически активным веществом, в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики опухолевого заболевания, где опухолевое заболевание представляет собой эпителиальный рак и/или выбрано из группы, состоящей из астроцитомы, олигодендроглиомы, менингиомы, нейрофибромы, глиобластомы, эпендимомы, шванномы, нейрофибросаркомы, медуллобластомы, меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака легкого, рака яичников, рака эндометрия, рака почки, нейробластомы, плоскоклеточного рака, гепатомы, рака толстой кишки, мезотелиомы и плоскоклеточного рака.

22. Применение конъюгата полипептида, который способен специфично связываться с L1CAM человека, содержащим по меньшей мере один домен Ig, по любому из пп.1-8, который связан с диагностическим соединением, в качестве диагностического средства для детекции опухолевого заболевания, где опухолевое заболевание представляет собой эпителиальный рак и/или выбрано из группы, состоящей из астроцитомы, олигодендроглиомы, менингиомы, нейрофибромы, глиобластомы, эпендимомы, шванномы, нейрофибросаркомы, медуллобластомы, меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака легкого, рака яичников, рака эндометрия, рака почки, нейробластомы, плоскоклеточного рака, гепатомы, рака толстой кишки, мезотелиомы и плоскоклеточного рака.

23. Фармацевтическая композиция для лечения опухолевого заболевания, содержащая эффективное количество полипептида, который специфически связывается с L1CAM человека, содержащего по меньшей мере один домен Ig, по любому из пп.1-8 или конъюгат по любому из пп.9-16 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, где опухолевое заболевание представляет собой эпителиальный рак и/или выбрано из группы, состоящей из астроцитомы, олигодендроглиомы, менингиомы, нейрофибромы, глиобластомы, эпендимомы, шванномы, нейрофибросаркомы, медуллобластомы, меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака легкого, рака яичников, рака эндометрия, рака почки, нейробластомы, плоскоклеточного рака, гепатомы, рака толстой кишки, мезотелиомы и плоскоклеточного рака.