Способ получения пептидов, содержащих липофильно модифицированную боковую цепь лизина

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения пептида с модифицированной боковой цепью лизина. Изобретение раскрывает способ получения аналога эксендина-4, модифицированного липофильным заместителем по аминокислотному остатку лизина, с применением твердофазного синтеза пептидов. Описанный способ получения модифицированного пептида с помощью конкретной последовательности стадий позволяет значительно уменьшить количество нежелательных побочных продуктов и увеличить выход целевого продукта. 12 з.п. ф-лы. 14 табл., 8 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу получения пептида с модифицированной боковой цепью лизина с применением твердофазного синтеза пептидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соединения, представляющие интерес, являются производными эксендина-4, содержащими липофильно модифицированную боковую цепь лизина. Эксендин-4 (SEQ ID NO. 3) представляет собой пептид из 39 аминокислот, который продуцируется слюнными железами ящерицы-ядозуба (Heloderma suspectum) (Eng, J. et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05, 1992). Эксендин-4 является активатором рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), в то же время он не активирует в значительной степени рецептор глюкагона. Модификация с помощью остатков, ацилированных жирными кислотами, в частности, в положении 14, как описано, например, в WO2013/186240, WO2014/056872, WO2014/096145, WO2014/096148, WO2014/096149, WO2014/096150, WO2015/155139, WO2015/155140 и WO2015/155141, приводит к образованию производных эксендина-4 с высокой активностью не только в отношении рецептора GLP-1, но также в отношении рецептора глюкагона по сравнению с соответствующими неацилированными производными эксендина-4.

Лираглутид (SEQ ID NO: 4) является представленным на рынке химически модифицированным аналогом GLP-1, в котором, среди прочих модификаций, жирная кислота присоединена к лизину в положении 20, что приводит к пролонгированной продолжительности действия (Drucker DJ et al., Nature Drug Disc. Rev. 9, 267-268, 2010; Buse, J.B. et al., Lancet, 374:39-47, 2009).

В EP 2460825 A1 раскрыты аналоги GLP-1, несущие C-концевой остаток лизина, который модифицирован липофильным заместителем формулы R₁-(CH₂)_n-CO-, при этом R₁ представляет собой метил или карбоксил, и n представляет собой целое число от 8 до 25. В отличие от настоящего изобретения, пептиды из EP 2460825 A1 синтезированы, исходя из C-концевого лизина, который липофильно модифицируют на первой стадии; после добавления липофильного заместителя добавляют оставшиеся аминокислоты требуемого пептида посредством SPPS. Далее удаляют защитную группу для лизина Mtt (4-метилтритил) с помощью одного этапа инкубации с 1% трифторуксусной кислотой (TFA)/дихлорметаном (DCM) после набухания высушенного остатка с помощью 500 мл диметилформамида (DMF) в течение 30 мин. (см. "Примеры"). Следует отметить, что оставшийся DMF обладает нейтрализующим эффектом в отношении 1% TFA в DCM, таким образом делая отщепление группы Mtt неполным.

WO 2008/023050 A1 относится к ряду ацилированных соединений на основе эксендина-4. В разделе "Примеры" данного документа описан синтез заявленных соединений. В соответствии с WO 2008/023050 A1, монометокситритил (Mmt)- или Mtt-защиту удаляют с применением раствора 2% TFA и 2-3% триизопропилсилана (TIS) в DCM, который является более сложным, чем раствор TFA в DCM, применяемый согласно настоящему изобретению. Кроме того, в WO 2008/023050 A1 ничего не сказано относительно предварительного высушивания смолы после завершения сборки аминокислотной последовательности.

Аналогично, в WO 2011/104378 A1, которая относится к пептидным модуляторам рецепторов меланокортина, и в WO 2013/167454 A1, которая относится к дважды ацилированным производным GLP-1, ацилированным по лизину в положении 26 (K26) и 37 (K37) по отношению к GLP-1(7-37) дикого типа, ничего не сказано о стадии предварительного высушивания смолы после сборки аминокислотной последовательности, и не раскрыт или даже не предположен раствор для отщепления, предназначенный для удаления защитных Mmt-/Mtt-групп, как заявлено в настоящем изобретении. В обеих заявках раствор для отщепления является более сложным.

WO 2015/155141 A1, которая включена посредством ссылки в данный документ, относится к пептидным двойным агонистам рецепторов GLP-1/глюкагона, полученным из эксендина-4, который содержит ацилированный лизин. Опять же, в этом документе не раскрыто или не предполагалось предварительное высушивание смолы или нейтрализация связанного со смолой пептида перед связыванием между собой пептида и липофильного фрагмента линкерным фрагментом.

Предпочтительный путь получения пептидов, которые могут содержать неприродные аминокислоты и модификации боковых цепей, например, ε-аминогрупп лизина, или δ-аминогруппы орнитина, или γ-аминогруппы 2,4-диаминомасляной кислоты, или β-аминогруппы 2,3-диаминопропионовой кислоты, представляет собой твердофазный синтез на подходящей смоле. Твердофазный синтез пептидов (SPPS) является проверенным способом синтетического получения пептидов (примеры приведены в: Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984).

Твердофазный синтез пептида, как правило, начинают с присоединения производного аминокислоты с защищенным N-концом к твердой подложке, несущей линкер. Твердая подложка может представлять собой любой полимер, который совместим с растворителями, применяемыми в SPPS, и обеспечивает связывание производного аминокислоты с помощью его карбоксигруппы к смоле (например, тритильной смоле, хлортритильной смоле, смоле Ванга, если требуется кислотная форма пептида, или смоле Ринка, смоле Зибера, если необходимо получить амидную форму пептида посредством применения Fmoc-стратегии). Полимерной подложке необходимо придать устойчивость в условиях, применяемых для удаления защитной группы с α-аминогруппы во время синтеза пептидов.

После того, как первую аминокислоту с защищенным N-концом связали с конструкцией линкера и смолы, N-концевую защитную группу отщепляют с помощью оснований, например, с помощью смеси пиперидина/диметилформамида (Fmoc-стратегия). Освобожденную аминогруппу вводят в реакцию с Fmoc-защищенным производным аминокислоты с применением реагентов для связывания, таких как, например, BOP (гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония), HBTU (гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния), HATU (гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N′,N′-тетраметилурония) вместе с третичным основанием, например, DIPEA (диизопропилэтиламином) или NMM (N-метилморфолином), или в качестве альтернативы с DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимидом)/гидратом HOBt (1-гидроксибензотриазола). Данную процедуру повторяют до получения требуемой аминокислотной последовательности.

Реакционноспособные функциональные группы боковых цепей производных аминокислот обычно являются заблокированными с помощью подходящих защитных групп, которые являются устойчивыми в условиях, применяемых для твердофазного синтеза пептидов. Их удаляют одновременно с отщеплением требуемого продукта от смолы в таких же условиях после того, как пептид был собран на твердой фазе. Защитные группы и процедуры для их введения можно найти в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd ed., Wiley & Sons, New York, 1999 или в Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1994.

Также существует возможность выборочно удалить защитные группы боковых цепей в SPPS с целью их модификации. Условия для удаления такой защитной группы должны быть такими, чтобы все другие защитные группы оставались невредимыми. Лизин можно защищать с помощью группы, представляющей собой 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил (ivDde) или 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил (Dde) (см. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, 1603, 1998), которая является неустойчивой в растворе гидразина в DMF. Как только N-концевая защитная группа, а также все защитные группы боковых цепей обеспечены кислотонеустойчивыми защитными группами, то ivDde- или Dde-защитные группы можно отщепить с помощью гидразина в DMF. Впоследствии освобожденную аминогруппу из боковой цепи лизина можно модифицировать, например, с помощью других Fmoc-аминокислот или жирных кислот. Ту же процедуру можно применять в отношении орнитина, 2,4-диаминомасляной кислоты или 2,3-диаминопропионовой кислоты.

Наконец, пептид можно отщепить от смолы одновременно со всеми защитными группами боковых цепей с применением смесей, содержащих трифторуксусную кислоту, например, смеси Кинга (King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990), содержащей трифторуксусную кислоту (TFA), фенол, воду, тиоанизол и 1,2-этандитиол (EDT). После определенного времени реакции смолу отфильтровывают и неочищенный пептид осаждают в эфире, например, диэтиловом эфире, метил-трет-бутиловом эфире или диизопропиловом эфире. Осадок можно отфильтровать или выделить из раствора с помощью центрифугирования.

При необходимости неочищенный пептид можно очищать с помощью препаративной хроматографии на C18-колонке. Для очистки может потребоваться несколько прогонов для получения чистоты >90% или даже больше. Обычно конечная прогонка будет представлять собой прогонку с солеобразованием, где будет определен требуемый противоион, например, ацетат. Фракции анализируют с помощью HPLC и объединяют в соответствии с определенными критериями. Растворитель может быть удален, например, с помощью перегонки, лиофилизации, распылительного высушивания или их комбинаций. В конце получают очищенный пептид.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предусмотрен новый способ твердофазного синтеза пептидов с модифицированной боковой цепью лизина. Данные пептиды, в частности, представляют собой производные эксендина-4, в котором по меньшей мере одна аминокислота, в частности метионин в положении 14, заменена на лизин, который дополнительно замещен неполярным липофильным остатком (например жирной кислотой необязательно в сочетании с линкером).

Было неожиданно обнаружено, что с помощью следующей конкретной последовательности стадий можно значительно уменьшить количество нежелательных побочных продуктов с получением увеличенного выхода требуемого продукта с более высокой степенью чистоты.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на способ получения выделенного пептида, содержащего липофильно модифицированную боковую цепь лизина, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности указанного пептида с защищенными реакционноспособными функциональными группами в боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина, подлежащей модификации, с помощью защитной группы на основе тритила, в частности, монометокситритила (Mmt) или 4-метилтритила (Mtt);

(ii) высушивания твердофазной смолы после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы несколько раз с помощью раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина, подлежащей модификации;

(iv) нейтрализации смолы;

(v) связывания по меньшей мере одного активированного линкерного фрагмента, связанного с 9-флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc), с боковой цепью лизина без защитной группы;

(vi) удаления защитной группы с концевой функциональной группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v);

(vii) связывания активированного липофильного фрагмента, в частности активированной жирной кислоты, с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы и

(ix) отщепления пептида от смолы.

В определенных вариантах осуществления выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44, в частности от 38 до 40 аминокислот, при этом предпочтительно (i) идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%, и/или (ii) идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и/или (iii) липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа. В определенных предпочтительных вариантах осуществления выделенное производное эксендина-4 имеет аминокислотную последовательность H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂ (SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления число обработок с помощью TFA в DCM на стадии (iii) регулируют таким образом, что выход модифицированной боковой цепи лизина на стадии (ix) составляет по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95%. Выход представлен в процентах по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина (т. е. выход 85% означает, что 85% пептида имеет модифицированную боковую цепь лизина и 15% пептида остается с немодифицированной боковой цепью лизина).

Например, на стадии (iii) высушенную смолу можно обрабатывать по меньшей мере семь раз в течение по меньшей мере 5 минут, в частности, девять раз в течение по меньшей мере 10 минут или девять раз в течение по меньшей мере 15 мин., с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM. Возможно применение TFA с концентрацией не более приблизительно 1,5% (об./об.). Однако концентрации, составляющие 2% (об./об.) TFA и выше, являются неблагоприятными, поскольку селективность отщепления в таком случае является сниженной; в частности, растворы, содержащие ≥ 2% (об./об.) TFA, обеспечивают отщепление не только, например, монометокситритильной защитной группы на боковой цепи лизина, представляющей интерес, но также, например, защитных Boc-групп на других аминокислотных остатках. Это может вызвать несколько нежелательных ацилирований на последующих стадиях процедуры.

В конкретных вариантах осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадии:

(viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) посредством отщепления тестового образца связанного со смолой пептида и

(viii-b) необязательно повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина.

В определенных вариантах осуществления осуществление анализа выхода удаления защитной группы может включать:

(viii-a1) удаление тестового образца смолы из общей реакционной партии и отщепление пептида от тестового образца при тех же условиях и с помощью той же смеси для отщепления, что и на стадии (ix); и

(viii-a2) определение содержания отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина, в частности, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) или комбинации HPLC и масс-спектрометрии (LC-MS).

В определенных вариантах осуществления отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

В определенных вариантах осуществления смесь для отщепления дополнительно содержит подходящее индольное соединение, в частности, 3-метилиндол.

В некоторых вариантах осуществления смесь для отщепления, в частности, состоит из 91-93% (об./об.) трифторуксусной кислоты, 1-6% (об./об.) фенола и 1-8% (об./об.) этандитиола. В других вариантах осуществления смесь для отщепления состоит из 96-98% (об./об.) трифторуксусной кислоты и 2-4% (об./об.) этандитиола.

В еще дополнительных вариантах осуществления отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 80% (вес/вес) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (вес/вес) 1,2-этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

В определенных вариантах осуществления смесь для отщепления состоит из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола.

Отщепление на стадии (ix), например, можно проводить при 5-15°C, 15-22°C и/или 22-30°C, в частности, при 25°C. Объем смеси для отщепления на грамм пептида на смоле может составлять, например, от 9,5 мл до 5,5 мл, в частности, от 7,0 мл до 6,0 мл. Отщепление на стадии (ix) можно, например, проводить в течение 2-3 часов, в частности, 2-3 часов или 2,0-2,5 часа, при 25°C или 1-1,5 часа при 30°C с перемешиванием.

В определенных вариантах осуществления высушивание смолы на стадии (ii) можно проводить в атмосфере инертного газа, например азота, при комнатной температуре после промывания пептида на смоле по меньшей мере один раз с применением алифатического спирта и по меньшей мере один раз с применением диалкилового эфира.

Нейтрализацию на стадии (iv), например, можно проводить с помощью по меньшей мере одного этапа инкубации с 1%-5% раствором третичного алкиламина в органическом полярном апротонном растворителе, например, диизопропилэтиламина (DIPEA) в дихлорметане, или N-метилморфолина (NMM) в дихлорметане, или триэтиламина в дихлорметане, в течение по меньшей мере 10 минут, необязательно с последующим определением pH смеси растворителей после стадии нейтрализации и промыванием пептида на смоле по меньшей мере один раз с помощью указанного растворителя и по меньшей мере один раз с помощью дополнительного полярного апротонного растворителя, например, диметилформамида (DMF).

В определенных вариантах осуществления удаление защитной группы на стадии (vi) можно проводить путем обработки пептида на смоле по меньшей мере один раз в течение по меньшей мере 5 минут с помощью основания с последующей по меньшей мере одной стадией промывания.

В определенных вариантах осуществления высушивание смолы на стадии (viii) можно проводить под вакуумом после промывания пептида на смоле, в частности под вакуумом ≤ 70 мбар.

Согласно некоторым вариантам осуществления заявленный способ дополнительно включает стадии:

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, содержащий диалкиловый эфир и гептан;

(xiii) перемешивания раствора с осадком;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка и

(xvi) высушивания влажного пептида.

В некоторых вариантах осуществления после стадии (x) фильтрационный осадок смолы можно ополаскивать по меньшей мере один раз, например, 3 раза, подходящим раствором для ополаскивания, например, TFA.

На стадии (xi) перегонку можно проводить, например, под вакуумом ≤ 50 мбар, при температуре ≤ 30°C.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антирастворитель, применяемый на стадии (xii), может представлять собой смесь, состоящую из диизопропилового эфира (DIPE) и н-гептана, в частности, смесь DIPE и н-гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.).

На стадии (xiii) раствор с осадком можно перемешивать, например, в течение 1-20 часов при 10-15°C.

На стадии (xv) осадок на фильтре после ополаскивания подходящим органическим растворителем, например, этилацетатом, можно промывать по меньшей мере один раз путем повторного суспендирования осадка в подходящем органическом растворителе, например, этилацетате, перемешивания полученной суспензии, например в течение 30-60 минут, и отфильтровывания органического растворителя. Данную процедуру можно повторять 1-5 раз, в частности, 2-4 раза, более конкретно 3-5 раз с применением этилацетата согласно некоторым вариантам осуществления.

В некоторых вариантах осуществления влажный пептид высушивают под вакуумом на стадии (xvi), например, при 20-25°C, в частности, под вакуумом ≤ 70 мбар при 20-25°C и продувке азотом.

В некоторых вариантах осуществления заявленный способ включает стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc-Glu-OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc-группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii-b) повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) и отщепления пептида от смолы при 25°C с применением смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

В некоторых вариантах осуществления заявленный способ включает стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc-Glu-OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc-группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii-b) повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) отщепления пептида от смолы с применением смеси для отщепления, состоящей из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-метилиндола;

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления при комнатной температуре;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом при ≤30°C;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, состоящий из DIPE и н-гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.);

(xiii) перемешивания раствора с осадком при 10-15°C в течение 1-18 часов;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка 4-5 раз посредством (xv-a) повторного суспендирования осадка в этилацетате, (xv-b) перемешивания полученной суспензии в течение 30-60 минут, и (xv-c) отфильтровывания этилацетата, и

(xvi) высушивания влажного пептида под вакуумом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вышеописанный способ согласно настоящему изобретению для получения выделенного пептида, содержащего липофильно модифицированную боковую цепь лизина, включает по меньшей мере девять стадий.

Первая стадия (стадия (i)) относится к синтезу представляющего интерес пептида посредством твердофазного синтеза пептидов (SPPS). Как указано выше, SPPS включает осуществление сборки аминокислотной последовательности пептида с защищенными реакционноспособными функциональными группами в боковых цепях поэтапным образом. Пептид содержит по меньшей мере один лизин, боковая цепь которого подлежит модификации. Боковая цепь этого по меньшей мере одного (например, одного, двух или трех) остатка лизина защищена с помощью защитной группы на основе тритила. В конкретных вариантах осуществления пептид содержит только одну модифицированную боковую цепь лизина. Защитные группы на основе тритила для конкретного применения в пределах настоящей заявки представляют собой монометокситритил (Mmt) и 4-метилтритил (Mtt). В определенных предпочтительных вариантах осуществления только Mmt применяют в качестве защитной группы на основе тритила для остатка(остатков) лизина, подлежащего(подлежащих) модификации.

Для SPPS согласно настоящему изобретению можно применять, в частности, различные амидные смолы Ринка, например, 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидонорлейциламинометиловую смолу или 4-[(2,4-диметоксифенил)(Fmoc-амино)метил]феноксиацетамидометиловую смолу. Нагрузки могут находиться в диапазоне от 0,1 до 1 ммоль/г, в частности, от 0,2 до 0,9 ммоль/г. В определенных вариантах осуществления нагрузки находятся в диапазоне от 0,25 до 0,6 ммоль/г. В других вариантах осуществления нагрузки находятся в диапазоне от 0,2 до 0,4 ммоль/г. Хотя, как правило, можно применять любую стратегию синтеза для SPPS, в контексте настоящего изобретения стратегия на основе 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), которая обеспечивает применение более мягких условий удаления защитной группы, является предпочтительной. Подходящее основание, например пиперидин, в частности в концентрации 20-50%, в диметилформамиде (DMF), применяют для удаления защитной группы (т. е. удаления Fmoc-группы с защищенной аминогруппы амидной смолы Ринка или, на более поздних стадиях, с α-аминогруппы соответствующей аминокислоты). Связывание каждой аминокислоты со смолой или предыдущей аминокислотой, соответственно, проводят согласно стандартным условиям с применением, например, гидрата 1-гидроксибензотриазола (HOBt) и N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC) в DMF в качестве реагентов для связывания. Периоды времени связывания для каждой аминокислоты могут изменяться и, как правило, находятся в диапазоне от 2 до 22 часов.

Производное Fmoc-лизина, которое применяют для SPPS, и боковая цепь которого будет модифицирована, в частности, представляет собой Fmoc-Lys(Mmt)-OH или Fmoc-Lys(Mtt)-OH.

α-Аминогруппа N-концевой аминокислоты предпочтительно защищена с помощью трет-бутилоксикарбонильной группы (Boc). После добавления N-концевой аминокислоты требуемого пептида пептид на смоле промывают. Перед продолжением далее проводят по меньшей мере одну и не более 10 стадий промывания, в частности, 4, 5, 6, 7 или 8 стадий промывания, более конкретно 6 стадий промывания. Подходящие жидкости для промывания предусматривают алифатический спирт, например, метанол, этанол, н-пропанол или изопропанол (IPA) и/или диалкиловый эфир, например, диэтиловый эфир, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир (DIPE) или диизобутиловый эфир. В определенных вариантах осуществления промывание проводят с помощью IPA и DIPE. В частности, пептид на смоле сначала промывают по меньшей мере один раз с помощью IPA и затем промывают по меньшей мере один раз с помощью DIPE. В определенных предпочтительных вариантах осуществления пептид на смоле сначала промывают три раза с помощью IPA и затем промывают три раза с помощью DIPE.

После промывания твердофазную смолу с пептидом высушивают (стадия (ii)). Высушивание можно проводить в атмосфере инертного газа, например азота, в частности, при непрерывном потоке азота (продувка азотом). Соответствующим образом стадию высушивания (ii) проводят в течение по меньшей мере одного часа, в частности, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 16 часов и не более 20 часов (например, в течение ночи). В некоторых вариантах осуществления стадию высушивания также можно проводить в течение не более 20 часов. В частности, высушивание проводят при комнатной температуре (18-24°C). В соответствии с уровнем техники, пептид на смоле не следует высушивать до того, как Mmt- или Mtt-группа не будет отщеплена от смолы. Как правило, считается, что смола должна быть хорошо набухшей на протяжении всего синтеза для обеспечения хорошей доступности N-конца пептида, в данном случае ε-аминогруппы лизина. Во время высушивания в соответствии со стадией (ii) способа по настоящему изобретению смола в значительной степени уменьшается в объеме, и нельзя было предвидеть, что все потенциальные реакционноспособные участки были все еще легкодоступны для дальнейших стадий. Более того, специалист в данной области техники опасался бы дополнительных недостатков, поскольку дополнительная стадия высушивания увеличивает продолжительность синтеза, и требовалось бы большее количество растворителя, что повышает затраты на процедуру. Однако неожиданно было обнаружено, что данная промежуточная стадия высушивания являлась преимущественной и безусловно превосходит ожидаемые недостатки. Например, стадия предварительного высушивания является преимущественной в отношении более полного удаления защитной группы на основе тритила для лизина.

Высушенную и уменьшившуюся в объеме смолу затем можно непосредственно обрабатывать несколько раз с помощью раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина, подлежащей модификации (стадия (iii)), или ее можно промывать, например, дихлорметаном перед обработкой с помощью TFA/DCM. Важно отметить, что набухание уменьшившейся в объеме смолы перед применением TFA/DCM не является необходимым. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что на данной стадии синтеза конечного пептида имеет место эффект масштабирования, т. е. количество нежелательных побочных продуктов, которые не обладают предполагаемой модификацией лизина, увеличивается выше среднего уровня при увеличении молярного масштаба синтеза. Неожиданно отрицательное влияние данного эффекта масштабирования можно было снизить в зависимости от числа повторений стадии (iii). Соответственно, в определенных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пептид, связанный со смолой, обрабатывают по меньшей мере пять раз, в частности, 7, 8, 9 или 10 раз, раствором TFA в DCM. Время каждой обработки составляет по меньшей мере пять минут, в частности, по меньшей мере 10 минут. Концентрация TFA в DCM составляет от 0,5 до 1,5% (об./об.), в частности приблизительно 1% (об./об.), более конкретно 1% (об./об.). Выбор таких концентраций обладает определенным преимущественными эффектами, в частности, в отношении синтеза пептидов, содержащих более одного остатка лизина. При более высоких концентрациях TFA, например, 2% TFA в DCM, отщепляются не только Mmt- или Mtt-защитные группы, но также частично другие защитные группы, применяемые для лизина, например, Boc, особенно при проведении нескольких (например, 6-12) повторов, тем самым обуславливая несколько нежелательных ацилирований различных лизинов в пептидной цепи. Этого можно избежать путем поддержания концентраций TFA в диапазоне от 0,5 до 1,5% (об./об.).

"Связанный со смолой пептид" в контексте настоящего изобретения относится к смоле, подходящей для твердофазного синтеза пептидов, с которой ковалентно связан пептид согласно настоящему изобретению.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления связанный со смолой пептид обрабатывают по меньшей мере семь раз в течение по меньшей мере 5 минут, в частности, девять раз в течение по меньшей мере 10 минут или девять раз в течение по меньшей мере 15 минут с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM. В соответствии с одним вариантом осуществления обработку проводят девять раз в течение 10 минут с помощью 1% (об./об.) TFA в DCM.

Число стадий обработки с помощью TFA в DCM, в частности, можно выбирать в зависимости от масштаба синтеза. Например, для масштабов не более 10 ммоль пять обработок с помощью приблизительно 1% TFA в DCM являются достаточными. Для масштабов ≥50 ммоль можно проводить по меньшей мере пять обработок. Для масштабов ≥100 ммоль можно проводить по меньшей мере семь обработок. Для масштабов ≥500 ммоль можно проводить по меньшей мере девять обработок. В качестве примера для масштаба 800 ммоль можно проводить девять обработок в течение 10 минут с помощью 1% (об./об.) TFA в DCM.

Принимая во внимание низкую точку кипения DCM, температуру во время стадии обработки устанавливают ниже данной точки. Преимущественно обработку начинают с охлаждения связанного со смолой пептида до приблизительно 0°C, например, 0-5°C. Во время обработки с помощью TFA/DCM температуру можно поднимать до не более 25°C. В иллюстративных вариантах осуществления первые стадии обработки проводят при температуре в диапазоне от 0 до 5°C, более поздние стадии обработки проводят при температуре от 5 до 15°C, и конечные стадии обработки проводят при температуре от 15 до 25°C. Например, если проводят девять стадий обработки с помощью TFA/DCM, три из них можно проводить при 0-5°C, три при 5-15°C и три при 15-25°C.

После завершения обработки с помощью TFA/DCM связанный со смолой пептид можно промывать, например, с помощью DCM. Затем связанный со смолой пептид нейтрализуют (стадия (iv)). Связанный со смолой пептид считается достаточно нейтрализованным при достижении значения pH ≥7, в частности, ≥7,5, более конкретно ≥8,0.

Нейтрализации достигают посредством по меньшей мере одного этапа инкубации связанного со смолой пептида с 1%-5% раствором третичного алкиламина в органическом полярном апротонном растворителе. Подходящие растворы для нейтрализации для применения в настоящей заявке представляют собой диизопропилэтиламин (DIPEA) в дихлорметане, или N-метилморфолин (NMM) в дихлорметане, или триэтиламин в дихлорметане. В частности, можно применять 2%-4% раствор, более конкретно 3% (об./об.) раствор DIPEA в DCM.

Нейтрализацию проводят по меньшей мере один раз, в частности, в течение по меньшей мере 10 минут, необязательно с последующим определением pH смеси растворителей после стадии нейтрализации. Было неожиданно обнаружено, что нейтрализация является необходимой для получения хорошего выхода в последующей реакции связывания, в частности, в случае больших масштабов. Было также неожиданно обнаружено, что остаточная TFA, присутствующая в смоле, является обычно недостаточно нейтрализованной с помощью одного этапа инкубации в нейтрализующем растворе. Следовательно, если pH смеси растворителей после первого этапа инкубации является слишком кислым, проводят по меньшей мере один дополнительный этап инкубации с раствором для нейтрализации. В определенных вариантах осуществления проводят более двух этапов инкубации связанного со смолой пептида с раствором для нейтрализации, например 3 этапа инкубации, в частности, 5 этапов инкубации, например, с 3% DIPEA в DCM. В некоторых вариантах осуществления проводят 6 этапов инкубации с раствором для нейтрализации, например, 3% DIPEA в DCM.

В иллюстративных вариантах осуществления нейтрализацию проводят при температуре в диапазоне от 0 до 25°C. Температуру можно поддерживать в конкретном узком диапазоне или постепенно увеличивать температуру. Например, если проводят более одной стадии нейтрализации, первую стадию нейтрализации можно проводить при температуре от 0 до 5°C, при этом последующие этапы инкубации для нейтрализации проводят при температуре от 5 до 15°C или даже от 15 до 25°C.

После нейтрализации пептид на смоле промывают по меньшей мере один раз с помощью органического полярного апротонного растворителя, применяемого при нейтрализации (без основания), и по меньшей мере один раз с помощью дополнительного полярного апротонного растворителя, например диметилформамида (DMF). В частности, DMF применяют, если последующее связывание предусматривает применение HBTU и DIPEA. Промывание с помощью дополнительного растворителя, проводят, в частности, более чем один раз, например, 3 раза.

На следующей стадии синтеза пептида, представляющего интерес, по меньшей мере один линкерный фрагмент, связанный с 9-флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc) активируют в соответствии со стандартной процедурой и связывают с боковой цепью лизина без защитной группы (стадия (v)).

"Линкерный фрагмент" согласно настоящему изобретению, как правило, представляет собой линейную короткоцепочечную молекулу, содержащую функциональные группы, подходящие для связывания со свободной аминогруппой боковой цепи лизина без защитной группы на одном конце и со свободной функциональной группой липофильного фрагмента (например, карбоксигруппой жирной кислоты) на другом конце. В частности, линкерный фрагмент представляет собой C₁-C₁₀алкильную цепь, содержащую концевые функциональные группы (т. е. одну функциональную группу на каждом конце), независимо выбранные из амино и карбокси, где один, два или три атома углерода в алкильной цепи могут быть заменены кислородом. Неограничивающие примеры "линкерного фрагмента" согласно настоящему изобретению представляют собой встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе аминокислоты, в частности, β-аланин (β-Ala), γ-глутаминовую кислоту (γE), γ-аминомасляную кислоту (GABA), аминоэтоксиэтоксиуксусную кислоту (AEEAc) и ε-аминогексановую кислоту (EACA) во всех их стереоизомерных формах.

Целый линкер между боковой цепью лизина и липофильной группой может состоять из одного или более таких линкерных фрагментов, в частности, одного, двух или трех идентичных или отличающихся линкерных фрагментов. В определенных вариантах осуществления целый линкер состоит из одного, двух или трех линкерных фрагментов, независимо выбранных из β-Ala, γE, GABA, AEEAc и EACA. Конкретные примеры целых линкеров представляют собой β-Ala, γE, GABA, AEEAc, EACA, β-Ala-β-Ala, γE-γE, γE-γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE и AEEAc-AEEAc-AEEAc. В определенных предпочтительных вариантах осуществления линкер представляет собой γE.

Функциональная группа линкера, с которой подлежит связыванию липофильный фрагмент (т. е. концевая функциональная группа, не связанная с боковой цепью лизина), защищена с помощью Fmoc. В определенных вариантах осуществления линкерный фрагмент, связанный с Fmoc, представляет собой Fmoc-Glu-OtBu. В иллюстративном варианте осуществления Fmoc-Glu-OtBu активирован с помощью 3 эквивалентов гексафторфосфата 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния (HBTU) и 6 эквивалентов DIPEA в DMF или гексафторфосфата O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N′,N′-тетраметилурония (HATU) и 6 эквивалентов DIPEA в DMF.

Смесь для связывания добавляют к смоле с боковой цепью лизина без защитной группы и инкубируют в течение достаточного количества времени, например, 3-4 часов. В частности, инкубацию проводят с перемешиванием (например, при 30-100 об./мин.). После завершения связывания смесь для связывания удаляют из смолы и связанный со смолой пептид промывают с помощью растворителя, применяемого для связывания, например, DMF. Если целый линкер состоит из более чем одного линкерного фрагмента, связывание повторяют после удаления защитной группы на первом линкерном фрагменте.

На последующей стадии (vi) защитную группу удаляют с концевой функциональной группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v). Условия удаления защитной группы для Fmoc, как правило, известны специалисту в данной области техники. В определенных вариантах осуществления удаление защитной группы на стадии (vi) можно проводить путем обработки пептида на смоле по меньшей мере один раз в течение по меньшей мере 5 минут с помощью основания с последующей по меньшей мере одной стадией промывания. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения удаление защитной Fmoc-группы можно проводить с помощью по меньшей мере одной обработки пиперидином при подходящей концентрации, например, 20% пиперидина в DMF. В частности, удаление защитной группы проводят на двух стадиях инкубации, например, в течение 5 и 20 минут с применением 20% пиперидина в DMF. После завершения удаления защитной группы, связанный со смолой пептид промывают растворителем по меньшей мере один раз перед продолжением далее.

Затем липофильный фрагмент активируют для подготовки к его связыванию с линкером без защитной группы, например, с помощью инкубации с гидратом гидроксибензотриазола (гидратом HOBt) и диизопропилкарбодиимидом (DIC). В определенных вариантах осуществления активацию осуществляют посредством инкубирования подлежащего применению липофильного фрагмента с эквивалентным количеством гидрата HOBt и DIC в течение, например, 10 минут в DMF.

Подходящие "липофильные фрагменты" согласно настоящему изобретению, в частности, представляют собой жирные кислоты. Среди жирных кислот можно преимущественно применять согласно настоящему изобретению, в частности, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и миристиновую кислоту. В конкретных вариантах осуществления пальмитиновая кислота выбрана в качестве липофильного фрагмента. В определенных предпочтительных вариантах осуществления пальмитиновая кислота связана с Lys(14) связанного со смолой пептида посредством γE.

Затем предварительно активированный липофильный фрагмент, в частности, предварительно активированную жирную кислоту, добавляют к связанному со смолой пептиду. Связывание активированного липофильного фрагмента с концевой функциональной группой линкера без защитной группы, т. е. стадия (vii) способа согласно настоящему изобретению, продолжается в течение по меньшей мере 2 часов, в частности, от 4 до 22 часов. В конкретных вариантах осуществления активированную жирную кислоту, например пальмитиновую кислоту, добавляют к связанному со смолой пептиду, содержащему аминогруппу без защитной группы в качестве концевой функциональной группы линкера, и связывают с применением гидрата HOBt/DIC. В определенных предпочтительных вариантах осуществления линкер, содержащий аминогруппу без защитной группы, представляет собой γE.

После завершения связывания раствор для связывания удаляют из смолы и смолу промывают по меньшей мере один раз с помощью растворителя из стадии связывания. Также можно проводить дополнительные промывки с помощью различных растворителей. В конкретных вариантах осуществления связанный со смолой пептид промывают по меньшей мере один раз с помощью растворителя, применяемого для стадии связывания, например DMF, по меньшей мере один раз с помощью алифатического спирта, например, метанола, этанола, н-пропанола или изопропанола (IPA), и по меньшей мере один раз с помощью диалкилового эфира, например, диэтилового эфира, трет-бутилметилового эфира, диизопропилового эфира (DIPE) или диизобутилового эфира. В иллюстративном варианте осуществления проводят следующие промывки: два раза с помощью DMF, три раза с помощью IPA, три раза с помощью DIPE. В дополнительном иллюстративном варианте осуществления проводят следующие промывки: три раза с помощью DMF, три раза с помощью IPA, три раза с помощью DIPE.

Промытый пептид на смоле на следующей стадии (стадия (viii)) высушивают. В определенных вариантах осуществления высушивание смолы можно осуществлять под вакуумом. В других вариантах осуществления высушивание проводят в атмосфере инертного газа, например, в непрерывном потоке азота (продувка азотом).

После завершения стадии (viii) пептид готов к отщеплению от смолы, что осуществляют на стадии (ix) способа согласно настоящему изобретению.

Чтобы удостовериться, что достаточная процентная доля пептида несет требуемую липофильную модификацию, в определенных вариантах осуществления не приступают непосредственно к реакции отщепления. Напротив, в таких вариантах осуществления выполняют "контроль в ходе технологического процесса". Соответственно, в таких вариантах осуществления после того, как связанный со смолой пептид был высушен на стадии (viii) способа согласно настоящему изобретению, анализируют выход удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида (стадия (viii-a)).

В определенных вариантах осуществления осуществление анализа выхода удаления защитной группы может включать:

(viii-a1) удаление тестового образца смолы из общей реакционной партии и отщепление пептида от тестового образца при тех же условиях и с помощью той же смеси для отщепления, что и на стадии (ix); и

(viii-a2) определение содержания отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина, в частности, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) или комбинации HPLC и масс-спектрометрии (LC-MS).

Исследуемый образец будет небольшим по сравнению с общей реакционной партией. Обычно будет достаточно, чтобы размер образца составлял не более 0,1% от общей реакционной партии.

В зависимости от результата анализа на стадии (viii-a) стадии (iii)-(viii-a) необязательно повторяют до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не будет достаточным. Достаточное содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, может составлять по меньшей мере 85%, в частности, по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% или даже >95%, например, 96, 97, 98 или 99% по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина. Например, если с помощью первого тестового отщепления показано содержание модифицированной боковой цепи лизина 50%, повторная обработка (т. е. повторение стадий (iii)-(viii-a)) является преимущественной с целью увеличения выхода. Если после повторной обработки содержание модифицированной боковой цепи лизина составляет, например, выше 85%, можно приступать к стадии (ix), т. е. отщеплению основной массы пептида от смолы. С другой стороны, если повторная обработка приводит к увеличению содержания модифицированной боковой цепи лизина лишь, например, до 60%, потребуется дополнительная повторная обработка. С помощью введения IPC в комбинации с повторной обработкой способ по настоящему изобретению становится независимым от эффектов масштабирования, поскольку стадии синтеза можно повторять или регулировать с целью оптимизации выхода и/или чистоты продукта.

Следовательно, в определенных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, отщепление Mmt проводят с помощью 1% TFA в DCM девять раз в течение по меньшей мере 10 минут, нейтрализацию проводят с контролем pH и применяют повторную обработку, в частности, в случае больших масштабов.

Было обнаружено, что одной конкретной мерой для увеличения выхода и/или чистоты требуемого пептида с модифицированной боковой цепью лизина является регулирование числа обработок с помощью TFA в DCM на стадии (iii) способа согласно настоящему изобретению. Например, если содержание модифицированной боковой цепи лизина в пептиде, представляющем интерес, является слишком низким, число обработок с помощью TFA/DCM может быть увеличено. Число обработок с помощью TFA в DCM на стадии (iii), в частности, регулируют так, что выход модифицированной боковой цепи лизина на стадии (ix) составляет по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% или даже >95%, например 96, 97, 98 или 99%.

Как только тестовое отщепление дает требуемый результат (т. е. только минимальное количество побочного продукта с немодифицированной боковой цепью лизина) или в случае отсутствия выполнения тестового отщепления, проводят отщепление пептида от смолы непосредственно после стадии (viii). В контексте настоящего изобретения отщепление проводят предпочтительно с применением специально разработанной смеси для отщепления, которая обладает преимуществами по сравнению с обычно применяемой смесью Кинга (King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990), содержащей трифторуксусную кислоту (TFA), фенол, воду, тиоанизол и 1,2-этандитиол (EDT).

Было обнаружено, что лучшего выхода, более высокого содержания и лучшей степени чистоты отщепляемого пептида можно достигнуть при применении смесей для отщепления, которые не содержат тиоанизола и этилметилсульфида. В частности, подходящие смеси для отщепления согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола и не содержат тиоанизола и этилметилсульфида. Дополнительные подходящие смеси для отщепления по настоящему изобретению не содержат тиоанизола и этилметилсульфида и содержат по меньшей мере 80% (вес/вес) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (вес/вес) 1,2-этандитиола. В контексте настоящего изобретения были проведены расчеты касательно плотности с получением значения 1,53 г/см³ (при 20°C) для трифторуксусной кислоты и 1,12 г/см³ (при 20°C) для 1,2-этандитиола. Например, такие значения можно применять для расчета массы TFA или EDT исходя из данного объема, например, для расчета соотношений вес-вес (вес/вес).

В иллюстративных вариантах осуществления применяют смесь для отщепления, состоящую из 91-93% (об./об.) трифторуксусной кислоты, 1-6% (об./об.) фенола и 1-8% (об./об.) этандитиола. В других вариантах осуществления применяют смесь для отщепления, состоящую из 96-98% (об./об.) трифторуксусной кислоты и 2-4% (об./об.) этандитиола.

Конкретные иллюстративные смеси для отщепления согласно настоящему изобретению представляют собой (i) раствор, состоящий из приблизительно 92,2% (об./об.) трифторуксусной кислоты, приблизительно 5,1% (об./об.) фенола и приблизительно 2,7% (об./об.) этандитиола, и (ii) раствор, состоящий из приблизительно 97,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты и приблизительно 2,9% (об./об.) этандитиола.

Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что посредством применения подходящего индольного соединения в качестве вспомогательного акцептора можно дополнительно улучшить заявленный способ, поскольку это способствует эффективному подавлению частоты образования конкретного нежелательного побочного продукта, образованного продуктом разрушения линкера Ринка и остатком триптофана пептида во время отщепления пептида от смолы. В Ogawa et al. (Chem. Pharm. Bull. 26(10) 3144-3149 (1978)) упоминается применение 3-метилиндола для подавления побочных реакций во время обработки Z(OMe)-Trp-OH или Boc-Trp-OH с помощью TFA. Однако 3-метилиндол применяется лишь как часть акцепторной системы вместе с анизолом и EDT, тиоанизолом и EDT или диметилсульфидом и EDT. Подходящие индольные соединения согласно настоящему изобретению представляют собой таковые, которые эффективно поглощают вышеуказанный нежелательный побочный продукт. Например, подходящие индольные соединения могут представлять собой индолы, несущие заместитель, представляющий собой низший (C₁-C₃)алкил или низший (C₁-C₃)ацил, на атоме углерода C3 или на атоме азота, в частности, N-ацетилиндол и 3-метилиндол (также известный как скатол). В определенных вариантах осуществления в качестве индольного соединения применяют 3-метилиндол.

Соответственно, дополнительные подходящие смеси для отщепления по настоящему изобретению не содержат тиоанизола и этилметилсульфида и содержат по меньшей мере 90% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, по меньшей мере 1% (вес/вес) 1,2-этандитиола и по меньшей мере 0,5% (вес/вес) подходящего индольного соединения, например, 3-метилиндола. В дополнительных иллюстративных вариантах осуществления применяют смесь для отщепления, состоящую из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты (TFA), 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола (EDT) и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола (3-MI), в частности, состоящую из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-метилиндола.

Дополнительные иллюстративные смеси для отщепления согласно настоящему изобретению представляют собой (iii) раствор, состоящий из приблизительно 97% (вес/вес) TFA, приблизительно 2% (вес/вес) EDT и приблизительно 1% 3-MI, и (iv) раствор, состоящий из приблизительно 96,9% (вес/вес) TFA, приблизительно 2,3% (вес/вес) EDT и приблизительно 0,8% (вес/вес) 3-MI.

Отщепление пептида от смолы можно осуществлять в относительно широком диапазоне температур. В частности, отщепление можно осуществлять при 5-15°C, 15-22°C и/или 22-30°C, в частности, при 25°C. В определенных вариантах осуществления отщепление проводят при комнатной температуре (18-24°C). Время инкубации предпочтительно является как можно более коротким. Обычно, инкубация в течение приблизительно 4 часов, в частности, 4 часов при комнатной температуре, является достаточной для получения приемлемого отщепления. Однако в определенных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения время отщепления можно сокращать до всего лишь 2 часов при осуществлении реакции отщепления при 25°C, что обладает преимуществом в том, что воздействие на пептид посредством TFA значительно снижается. Было неожиданно обнаружено, что несмотря на повышение температуры, образование нежелательных изомеров не увеличивается в значительной степени. В иллюстративных вариантах осуществления отщепление проводят в течение 2-3 часов, в частности, в течение 2-3 часов или 2,0-2,5 часа при 25°C, с перемешиванием (например, при 30-100 об./мин.). В других вариантах осуществления отщепление проводят в течение 1-1,5 часа при 30°C с перемешиванием (например, при 30-100 об./мин.).

В дополнение или в качестве альтернативы, объем смеси для отщепления на грамм пептида на смоле можно регулировать для облегчения дальнейшей обработки и очистки. Было неожиданно обнаружено, что можно уменьшить объем смеси для отщепления по сравнению с общепринятой процедурой на по меньшей мере 10%, в частности, на по меньшей мере 20% и не более чем на 30%. Принимая во внимание стандартный объем смеси Кинга, составляющий приблизительно 9 мл/г, например, 9,2 мл/г, объем можно сократить на приблизительно 24% в иллюстративных вариантах осуществления. В количественном масштабе это означает, что объем смеси для отщепления на грамм пептида на смоле может составлять, например, от 9,5 мл до 5,5 мл, в частности, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В определенных вариантах осуществления отщепление в соответствии со стадией (ix) способа согласно настоящему изобретению проводят с применением:

(a) смеси для отщепления, состоящей из 91-93% (об./об.) трифторуксусной кислоты, 1-6% (об./об.) фенола и 1-8% (об./об.) этандитиола, например, приблизительно 92,2% (об./об.) TFA, приблизительно 5,1% (об./об.) фенола и приблизительно 2,7% EDT,

(b) времени инкубации, составляющего 2,0-2,5 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и

(c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, составляющего, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления отщепление в соответствии со стадией (ix) способа согласно настоящему изобретению проводят с применением:

(a) смеси для отщепления, состоящей из 91-93% (об./об.) трифторуксусной кислоты, 1-6% (об./об.) фенола и 1-8% (об./об.) этандитиола, например, приблизительно 92,2% (об./об.) TFA, приблизительно 5,1% (об./об.) фенола и приблизительно 2,7% EDT,

(b) времени инкубации, составляющего лишь 2 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и

(c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, составляющего, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В других вариантах осуществления отщепление в соответствии со стадией (ix) способа согласно настоящему изобретению проводят с применением:

(a) смеси для отщепления, состоящей из 96-98% (об./об.) трифторуксусной кислоты и 2-4% (об./об.) этандитиола, например, приблизительно 97,1% (об./об.) TFA и приблизительно 2,9% (об./об.) EDT,

(b) времени инкубации, составляющего 2,0-2,5 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и

(c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, составляющего, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В других предпочтительных вариантах осуществления отщепление в соответствии со стадией (ix) способа согласно настоящему изобретению проводят с применением:

(a) смеси для отщепления, состоящей из 96-98% (об./об.) трифторуксусной кислоты и 2-4% (об./об.) этандитиола, например, приблизительно 97,1% (об./об.) TFA и приблизительно 2,9% (об./об.) EDT,

(b) времени инкубации, составляющего лишь 2 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и

(c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, составляющего, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В еще других предпочтительных вариантах осуществления отщепление в соответствии со стадией (ix) способа согласно настоящему изобретению проводят с применением:

(a) смеси для отщепления, состоящей из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола, в частности, состоящей из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-MI, например, приблизительно 97% (вес/вес) TFA, приблизительно 2% (вес/вес) EDT и приблизительно 1% 3-MI,

(b) времени инкубации, составляющего лишь 2,0-2,5 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и

(c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, составляющего, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению включает дополнительные стадии после отщепления пептида от смолы, т. е.:

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, содержащий диалкиловый эфир и гептан;

(xiii) перемешивания раствора с осадком;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка и

(xvi) высушивания влажного пептида.

Эти стадии способствуют дополнительной очистке пептида, представляющего интерес. Прежде всего, фильтрация (стадия (x)) продукта отщепления из стадии (ix) обеспечивает отделение липофильно модифицированного пептида от твердой подложки. Фильтрацию обычно проводят при комнатной температуре. Оставшийся фильтрационный осадок ополаскивают по меньшей мере один раз с помощью подходящего раствора для ополаскивания для полного выделения остаточного пептида с твердой подложки. Подходящим раствором для ополаскивания согласно настоящему изобретению является трифторуксусная кислота. Фильтрационный осадок можно ополаскивать с помощью TFA от одного до пяти раз, в частности, три раза.

Собранные фракции фильтратов (фильтрат после первой фильтрации и фильтраты после ополаскивания фильтрационного осадка) объединяют и подвергают перегонке под вакуумом на стадии (xi) с целью уменьшения объема. В некоторых вариантах осуществления применяют вакуум ≤ 50 мбар и температуру перегонки ≤ 30°C. В иллюстративном варианте осуществления раствор перегоняют в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 2,5 часа, например, 1,5-2 часа. Перегонка обеспечивает снижение объема содержащего пептид раствора до приблизительно одной третьей от объема до осаждения. Пептид остается в остаточной фракции, дистиллят главным образом содержит TFA.

После перегонки концентрированный содержащий пептид раствор добавляют к антирастворителю, содержащему диалкиловый эфир и гептан (стадия (xii)). В некоторых вариантах осуществления антирастворитель представляет собой смесь, состоящую из диизопропилового эфира (DIPE) и н-гептана. Соотношение DIPE и н-гептана может находиться, например, в диапазоне от 25:75 до 35:65 (об./об.). В иллюстративных вариантах осуществления соотношение DIPE/н-гептан составляет 25:75 (об./об.), или 30:70 (об./об.), или 35:65 (об./об.).

Сосуд, из которого переносят концентрированный содержащий пептид раствор, обычно ополаскивают один раз с помощью подходящего растворителя, например, TFA, с целью максимально увеличить выход.

В определенных вариантах осуществления антирастворитель предварительно охлаждают до приблизительно 0-5°C. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в данный предварительно охлажденный антирастворитель добавляют содержащий пептид раствор в течение периода от приблизительно 20 до приблизительно 60 минут.

Антирастворитель необходим для осаждения пептида, представляющего интерес, из содержащего пептид раствора. Осаждение также возможно при применении только диалкилового эфира. Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что антирастворитель содержащий, в частности, н-гептан, благоприятно влияет на время, необходимое для последующей фильтрации. Например, с помощью применения смеси DIPE/н-гептана в диапазоне от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.) время фильтрации после осаждения можно уменьшить на коэффициент, составляющий не более приблизительно 60, по сравнению с применением только DIPE в качестве антирастворителя (см. "Примеры").

После завершения добавления содержащего пептид раствора в антирастворитель полученную суспензию пептида доводят, например, до приблизительно 10-15°C. Затем осадок выдерживают (стадия (xiii)), т. е. его перемешивают, например, при 20-30 об./мин. и при температуре, например, 10-15°C, в течение определенного количества времени. Например, выдерживание проводят в течение 1-20 часов, например, 2-18 часов или 10-20 часов.

После завершения стадии выдерживания (xiii) раствор с осадком подвергают фильтрации (стадия (xiv)) с целью отделения требуемого пептида, т. е. осадка, от исходного раствора, состоящего в основном из DIPE, гептана и TFA. Осадок на фильтре затем можно ополаскивать с помощью подходящего органического растворителя, например, этилацетата.

Впоследствии осадок на фильтре промывают по меньшей мере один раз (стадия (xv)). В определенных вариантах осуществления промывание осадка на фильтре включает (xv-a) повторное суспендирование осадка в подходящем органическом растворителе, (xv-b) перемешивание полученной суспензии и (xv-c) отфильтровывание органического растворителя. Иллюстративный органический растворитель представляет собой этилацетат. Перемешивание можно проводить в течение, например, 30-60 минут. В некоторых вариантах осуществления осадок промывают по меньшей мере дважды или по меньшей мере три раза. В определенных вариантах осуществления осадок промывают с помощью этилацетата 1-5 раз, в частности, 2-4 раза, или 3-5 раз, или 4-5 раз.

После того, как раствор для промывания из последней промывки был отфильтрован, осадок, т. е. неочищенный влажный пептид, представляющий интерес, высушивают. Высушивание можно проводить под вакуумом, например, при 20-25°C. В некоторых вариантах осуществления высушивание проводят под вакуумом ≤ 70 мбар при 20-25°C и продувке азотом.

Выделенный пептид согласно настоящему изобретению, содержащий липофильно модифицированную боковую цепь лизина, представляет собой, в частности, производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44, более конкретно от 38 до 40 аминокислот, более конкретно 39 аминокислот, при этом предпочтительно (i) идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%, и/или (ii) идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и/или (iii) липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

В целях иллюстрации присвоение положений аминокислот эксендина-4 дикого типа (SEQ ID NO.: 3) представлено далее:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

H G E G T F T S D L S K Q M E E E A V R L F I

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

E W L K N G G P S S G A P P P S-NH₂

Идентичность, составляющая по меньшей мере 65%, в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина-4 дикого типа (wt) означает, что заменены максимум 4 аминокислоты по сравнению с эксендином-4 дикого типа. В частности, положения, подходящие для мутаций в данной области, представляют собой положения 1, 2, 3, 10, 12 и 13. В определенных предпочтительных вариантах осуществления область, соответствующая аминокислотам 1-13 эксендина-4 дикого типа (wt), содержит мутации в положениях 2 и 3. В определенных предпочтительных вариантах осуществления мутации представляют собой Gly2D-Ser (т. е. мутацию по типу замены глицина на D-серин в положении 2) и Glu3Gln (т. е. мутацию по типу замены глутамата на глутамин в положении 3).

Идентичность, составляющая по меньшей мере 70%, в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина-4 wt означает, что заменены максимум 5 аминокислот по сравнению с эксендином-4 wt. В частности, положения, подходящие для мутаций в данной области согласно настоящему изобретению, представляют собой положения 23, 24, 27, 28, 29 и 35. В определенных предпочтительных вариантах осуществления область, соответствующая аминокислотам 22-39 эксендина-4 дикого типа (wt), содержит мутацию в положении 28. В определенных предпочтительных вариантах осуществления мутация представляет собой Ala28Asn (т. е. мутация по типу замены аланина на аспарагин в положении 28).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4 и содержит только одну модифицированную боковую цепь лизина. Данный единственный модифицированный лизин расположен, в частности, в положении 14 по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

В конкретных вариантах осуществления выделенный пептид имеет длину 39 аминокислот, при этом идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%, идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

В дополнительных вариантах осуществления, выделенный пептид имеет длину 39 аминокислот, при этом идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 80% (т. е. содержит не более 2 мутаций), идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 90% (т. е. содержит не более одной мутации), и липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа. В определенных предпочтительных вариантах осуществления выделенный пептид по настоящему изобретению содержит точно две мутации в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, содержит точно одну мутацию в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, и липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)), каждое из которых по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления выделенный пептид имеет аминокислотную последовательность H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂ (SEQ ID NO: 1). В контексте настоящего изобретения "γE-Palm" представляет собой (S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирильный фрагмент и "dS" означает D-Ser.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Твердофазный синтез пептидов с применением амидной смолы Ринка

В первом примере аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 синтезировали посредством SPPS с применением амидной смолы Ринка и Fmoc-стратегии.

Загрузка смолы. Твердофазный синтез начинали с применения амидной смолы Ринка (4-[(2,4-диметоксифенил)(Fmoc-амино)метил]феноксиацетамидометильной смолы), у которой удаляли защитную группу дважды (в течение 5 и 20 минут) с помощью 20% пиперидина в DMF. Загрузка смолы может находиться в диапазоне 0,2-0,9 ммоль/г. Смолу тщательно промывали с помощью DMF. Затем связывали Fmoc-Ser(tBu)-OH с освобожденной аминогруппой на смоле Ринка с применением реагентов для связывания, представляющих собой гидрат HOBt и DIC в DMF, которые применяли в эквимолярном количестве относительно Fmoc-аминокислоты. Время связывания может находиться в диапазоне 18-22 ч. Затем смолу снова промывали с помощью DMF несколько раз.

Сборка пептида с линейной цепью. После того, как первая Fmoc-аминокислота была связана со смолой, Fmoc-группу снова удаляли с помощью 20% пиперидина в DMF (в течение 5 и 20 минут) с последующими тщательными промывками с помощью DMF и связыванием следующего Fmoc-аминопроизводного, которое представляет собой Fmoc-Pro-OH, с применением снова гидрата HOBt и DIC в DMF в качестве реагентов для связывания. В повторяющихся циклах синтезировали линейную последовательность до положения 2, где использовали Fmoc-D-Ser(tBu)-OH. Периоды времени связывания находились в диапазоне от 2 до 22 ч., эквиваленты структурных блоков и реагентов для связывания находятся в диапазоне от 2 до 3,5. Для положений 37/36 применяли дипептид Fmoc-Pro-Pro-OH. Для положения 1 связывали Boc-His(Trt)-OH. Стадии связывания и удаления защитной группы, а также стадии промывания можно выполнять при температуре в диапазоне от 10°C до 40°C.

Применяли следующие производные Fmoc-аминокислот: Fmoc-Ser(tBu)-OH для положений 39, 33, 32, 16, 11, 8; Fmoc-Pro-OH для положений 38 и 31; Fmoc-Pro-Pro-OH для положений 37 и 36; Fmoc-Ala-OH для положений 35, 19, 18; Fmoc-Gly-OH для положений 34, 30, 29, 4; Fmoc-Lys(Boc)-OH для положений 27, 17, 12; Fmoc-Leu-OH для положений 26, 10; Fmoc-Trp(Boc)-OH для положения 25; Fmoc-Glu(OtBu)-OH для положений 24, 15; Fmoc-Ile-OH для положения 23; Fmoc-Phe-OH для положений 22,6; FmocAsp(OtBu)-OH для положений 21, 9; Fmoc-Gln(Trt)-OH для положений 20, 13, 3; Fmoc-Lys(Mmt)-OH или, в качестве альтернативы, Fmoc-Lys(Mtt)-OH для положения 14; Fmoc-Thr(tBu)-OH для положений 7, 5; Fmoc-D-Ser(tBu)-OH для положения 2; Boc-His(Trt)-OH для положения 1.

Пример 2. Модификация боковой цепи Lys(14)

Пептид из примера 1 дополнительно модифицировали в положении 14, где согласно настоящему изобретению присоединяли липофильный фрагмент. Неожиданно было обнаружено, что наблюдается эффект масштабирования касательно отщепления Mmt.

Обработка связанного со смолой пептида с помощью TFA/DCM. Селективное и полное удаление Mmt-группы (монометокситритила) из боковой цепи Lys(14) представляет собой одну из центральных частей данного описания. Отщепление проводили с помощью 1% TFA в дихлорметане (DCM) в лабораторном масштабе (8 ммоль). Для отщепления Mmt-группы смолу промывали с помощью DCM и обрабатывали 3 раза с помощью 1% TFA в DCM. После этого Fmoc-Glu-OtBu связывали с освобожденной аминогруппой в 3-кратном избытке с применением 3 эквивалентов (экв.) HBTU и 6 экв. DIPEA в DMF. После нескольких промывок с помощью DMF Fmoc-группу отщепляли, смолу снова промывали и связывали с пальмитиновой кислотой с применением гидрата HOBt и DIC. После этого пептид отщепляли от смолы с помощью смеси Кинга и анализировали с помощью HPLC. Обнаружили требуемый продукт с SEQ ID NO: 1 с 4,3% SEQ ID NO:2, где боковая цепь на Lys(14) отсутствовала.

SEQ ID NO: 2

H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂

Наличие 4,3% SEQ ID NO: 2 можно объяснить неполным удалением Mmt-группы.

Твердофазный синтез повторяли в масштабе 36 ммоль с применением того же протокола, и было неожиданно обнаружено, что количество SEQ ID NO: 2 снизилось до 12,6%. Для следующего синтеза уже в полупромышленном масштабе (800 ммоль) применяли 5 обработок с помощью 1% TFA в DCM и выявили 28,7% SEQ ID NO: 2.

Такие неожиданные результаты обусловлены эффектом масштабирования.

Таблица 1. Увеличение содержания нежелательного побочного продукта с SEQ ID NO: 2 в зависимости от масштаба реакции (эффект масштабирования)

Масштаб реакции	8 ммоль	36 ммоль	800 ммоль
Процентная доля SEQ ID NO: 2	4,3%	12,6%	28,7%
Процедура для отщепления Mmt	3×1% TFA/DCM	3×1% TFA/DCM	5×1% TFA/DCM

Несколько дополнительных попыток предприняли для улучшения эффективности отщепления Mmt-группы. Число стадий отщепления увеличивали до 7 обработок, что привело к получению процентной доли SEQ ID NO: 2, составляющей 15,7% (масштаб=800 ммоль).

В следующем испытании смолу перед обработкой с помощью 1% TFA в DCM высушивали. Следовательно, линейный пептид на смоле промывали 3 раза изопропанолом и 3 раза диизопропиловым эфиром и высушивали при продувке азотом в течение >16 ч. Затем смолу непосредственно обрабатывали с помощью 1% TFA в DCM 7 раз с последующей одной промывкой с помощью DCM и стадиями нейтрализации, которые проводили с помощью 3% DIPEA в DCM, до достижения pH>8. Связывание Fmoc-Glu-OtBu и пальмитиновой кислоты проводили, как уже было описано. После отщепления пептида от смолы получали неочищенный продукт с процентной долей SEQ ID NO: 2, составляющей 12,5% (масштаб=680 ммоль).

Кроме того, проводили отщепление Mmt-группы 8 раз с применением стадий предварительного высушивания, указанных ранее. После отщепления пептида от смолы получали неочищенный продукт с процентной долей SEQ ID NO: 2, составляющей 8,4% (масштаб=680 ммоль).

Затем проводили отщепление 9 раз с применением стадий предварительного высушивания, указанных ранее. После отщепления пептида от смолы получали неочищенный продукт с процентной долей SEQ ID NO: 2, составляющей 3,6% (масштаб=680 ммоль).

Таблица 2. Уменьшение эффекта масштабирования посредством предварительного высушивания смолы (стадия (ii)), увеличения числа обработок с помощью TFA/DCM (стадия (iii)) и нейтрализации связанной с пептидом смолы перед дальнейшей обработкой

	800 ммоль	680 ммоль	680 ммоль	680 ммоль
Процентная доля SEQ ID NO: 2	15,7%	12,5%	8,4%	3,6%
Процедура для отщепления Mmt	7×1% TFA/DCM	7×1% TFA/DCM, предварительное высушивание, нейтрализация	8×1% TFA/DCM, предварительное высушивание, нейтрализация	9×1% TFA/DCM, предварительное высушивание, нейтрализация

Соответственно, наилучших результатов достигали с применением комбинации предварительного высушивания, девяти обработок с помощью TFA/DCM и последующей нейтрализации.

Стадия повторной обработки. С целью достижения независимости от дополнительных эффектов масштабирования, если масштаб подлежит дальнейшему увеличению (т. е. до >800 ммоль, возможно 4000-5000 ммоль), можно вводить стадию повторной обработки. Следовательно, будет выполнено тестовое отщепление SEQ ID NO: 1 от смолы (1 г), приводящее к получению неочищенного пептида с определенным количеством SEQ ID NO: 2. В зависимости от процентной доли SEQ ID NO: 2 можно проводить стадию повторной обработки. Для этого высушенный пептид на смоле обрабатывали 5 раз с помощью 1% TFA в DCM, нейтрализовали с помощью 3% DIPEA в DCM до достижения pH>8, промывали с помощью DCM и несколько раз с помощью DMF. Затем проводили связывание Fmoc-Glu-OtBu (3 экв.) с применением реагентов для связывания: HBTU (3 экв.) и DIPEA (6 экв.). После завершения связывания Fmoc-группу удаляли, как описано ранее, и связывали пальмитиновую кислоту с применением гидрата HOBt и DIC.

Следующая последовательность действий демонстрирует основную процедуру для отщепления Mmt с последующими этапами связывания без повторной обработки.

a) После связывания N-концевой аминокислоты (Boc-His(Trt)-OH) смолу промывают дважды с помощью диметилформамида (DMF).

b) Смолу промывают 3 раза с помощью изопропанола (IPA) и диизопропилового эфира (DIPE), смола уменьшается в объеме.

c) Смолу высушивают с помощью непрерывного потока азота в течение нескольких часов, предпочтительно в течение ночи.

d) Смолу обрабатывают 9 раз с помощью TFA (1% в DCM) в течение 10 минут каждый раз.

e) Промывание смолы с помощью DCM.

f) Несколько стадий нейтрализации путем обработки смолы диизопропилэтиламином (DIPEA, 3% в DCM) в течение 10 минут каждый раз, контроль pH раствора для промывания, конечная точка: pH>8.

g) Промывки с помощью DCM (1x) и DMF (3x).

h) Активация 3 экв. Fmoc-Glu-OtBu с помощью 3 экв. гексафторфосфата 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния (HBTU) и 6 экв. DIPEA в DMF. В качестве альтернативы, можно применять другие основные условия связывания или даже гидрат HOBt и DIC. Смесь для связывания добавляют к смоле. Связывание продолжается в течение 3-4 часов.

i) Смесь для связывания удаляют из смолы. Смолу дважды промывают с помощью DMF.

j) Обеспечивают отщепление Fmoc-группы с помощью 2 обработок пиперидином (20% в DMF) в течение 5 и 20 минут.

k) Раствор для отщепления вымывают из смолы и смолу промывают 6x с помощью DMF.

l) От 3 до 3,5 экв. пальмитиновой кислоты активируют с помощью от 3 до 3,5 экв. гидрата гидроксибензотриазола (гидрат HOBt) и от 3 до 3,5 экв. диизопропилкарбодиимида (DIC) в течение 10 минут в DMF. Предварительно активированную жирную кислоту подают в смолу. Связывание продолжается в течение 4-22 часов.

m) Раствор для связывания удаляют из смолы. Смолу дважды промывают с помощью DMF, 3 раза с помощью IPA и 3 раза с помощью DIPE и высушивают под вакуумом.

n) Пептид на смоле теперь готов к отщеплению с получением неочищенного пептида, в случае если с помощью тестового отщепления показано лишь минимальное количество SEQ ID NO: 2.

Следующая схема демонстрирует основную процедуру для отщепления Mmt с последующими этапами связывания.

Следующая последовательность действий демонстрирует основную процедуру повторной обработки для отщепления Mmt с последующими этапами связывания.

a) Высушенную смолу обрабатывают 5-9 раз с помощью TFA (1% в DCM) в течение 10 минут каждый раз.

b) Промывание смолы с помощью DCM.

c) Несколько стадий нейтрализации путем обработки смолы диизопропилэтиламином (DIPEA, 3% в DCM) в течение 10 минут каждый раз, контроль pH раствора для промывания, конечная точка: pH>8.

d) Промывки с помощью DCM (1x) и DMF (3x).

e) Активация 3 экв. Fmoc-Glu-OtBu с помощью 3 экв. гексафторфосфата 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния (HBTU) и 6 экв. DIPEA в DMF. В качестве альтернативы, можно применять другие основные условия связывания или даже гидрат HOBt и DIC. Смесь для связывания добавляют к смоле. Связывание продолжается в течение 3-4 часов.

f) Смесь для связывания удаляют из смолы. Смолу дважды промывают с помощью DMF.

g) Обеспечивают отщепление Fmoc-группы с помощью 2 обработок пиперидином (20% в DMF) в течение 5 и 20 минут.

h) Раствор для отщепления вымывают из смолы и смолу промывают 6x с помощью DMF.

i) От 3 до 3,5 экв. пальмитиновой кислоты активируют с помощью от 3 до 3,5 экв. гидрата гидроксибензотриазола (гидрат HOBt) и от 3 до 3,5 экв. диизопропилкарбодиимида (DIC) в течение 10 минут в DMF. Предварительно активированную жирную кислоту подают в смолу. Связывание продолжается в течение 4-22 часов.

j) Раствор для связывания удаляют из смолы. Смолу дважды промывают с помощью DMF, 3 раза с помощью IPA и 3 раза с помощью DIPE и высушивают под вакуумом.

k) Пептид на смоле теперь готов к отщеплению с получением неочищенного пептида.

Применение данной новой процедуры отщепления Mmt необязательно вместе с процедурой повторной обработки обеспечивает получение неочищенного пептида с небольшими количествами SEQ ID NO: 2.

Подводя итог, следующие ключевые стадии можно принимать для достижения высокого уровня модификации Lys(14): начало отщепления Mmt с применением предварительно высушенной смолы, проведение отщепления Mmt с помощью 1% TFA в DCM девять раз, проведение стадии нейтрализации с контролем pH, осуществление процедуры повторной обработки в случае больших масштабов, если отщепление Mmt не было полным.

Пример 3. Отщепление пептида от смолы

После завершения твердофазного синтеза пептид необходимо отщепить от смолы, а также необходимо удалить кислотонеустойчивые защитные группы боковых цепей. Эти параллельные реакции можно проводить с помощью смеси Кинга, которая состоит из 82,5% трифторуксусной кислоты (TFA), 5% воды, 2,5% 1,2-этандитиола (EDT), 5% тиоанизола и 5% фенола (King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990). Отщепление проводят при комнатной температуре (20°C) в течение 4 ч. Условия можно оптимизировать для каждого пептида, также для SEQ ID NO: 1. Однако было неожиданно обнаружено, что другие смеси для отщепления обеспечивают лучшие результаты, как представлено подробно ниже.

В первой серии экспериментов образцы пептида на смоле обрабатывали с помощью различных смесей для отщепления. Для 1 г образца в качестве эталона применяли 8,5 мл TFA, 0,5 мл воды, 0,25 мл EDT, 0,5 мл тиоанизола и 0,5 г фенола, время отщепления 4 ч, комнатная температура. Полученный пептид осаждали в диизопропиловом эфире и центрифугировали. Диизопропиловый эфир декантировали. Полученный пептидный осадок встряхивали с этилацетатом и снова центрифугировали. После дополнительной декантации данную процедуру повторяли 3 раза. Наконец пептид высушивали под вакуумом. Проводили анализ данных в отношении образца: чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (%) посредством HPLC, содержание согласно HPLC (%), выход в г/г пептида на смоле (строка 1 в таблице 3). Поэтапным образом исключали ингредиенты один за другим, затем два и, наконец, три. В следующей таблице (таблица 3) показаны результаты.

Таблица 3. Сравнение различных смесей для отщепления в отношении отщепления SEQ ID NO: 1 от смолы

Фенол	Вода	Тиоанизол	Этандитиол	HPLC-УФ (%)	Содержание согласно HPLC (%)	Выход в г/г смолы
+	+	+	+	65,1	37,1	0,16
+	-	+	+	63,3	35,2	0,16
-	+	+	+	64,9	36,4	0,16
+	+	+	-	62,2	34,8	0,15
+	+	-	+	70	41,1	0,18
+	-	+	-	59,7	28,8	0,14
+	-	-	+	70,1	38	0,19
-	-	+	+	62,6	33,2	0,16
-	-	-	+	70,1	38,1	0,18
+	Применяли
-	Не применяли

Наилучшие результаты получали, если исключали тиоанизол и если применяли EDT. Во второй группе экспериментов исследовали 3 смеси с течением времени при 20°C: смесь 1, состоящую из TFA, фенола, EDT, воды; смесь 2, состоящую из TFA, фенола, EDT; смесь 3, состоящую из TFA, EDT. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сравнение 3 смесей с течением времени при 20°C

		2 ч	3 ч	4 ч	5 ч
Смесь (1)	HPLC-УФ (%)	68,8	70,1	70	67,5
	Содержание согласно HPLC (%)	40,7	40,8	41,1	32,2
	Выход в г/г смолы	0,17	0,18	0,18	0,15
Смесь (2)	HPLC-УФ (%)	71,9	71,6	70,1
	Содержание согласно HPLC (%)	41,5	38,9	38
	Выход в г/г смолы	0,18	0,18	0,19
Смесь (3)	HPLC-УФ (%)	72	71,1	69,7	68
	Содержание согласно HPLC (%)	41,9	39,3	29,3	25,9
	Выход в г/г смолы	0,18	0,19	0,16	0,12

Результаты для смесей 2 и 3 одинаково хорошие. Четыре часа не являются необходимыми для полного отщепления пептида от смолы. Эксперименты для смесей 2 и 3 повторяли при 25°C и получили результаты, представленные в таблице 5.

Таблица 5. Сравнение смесей 2 и 3 при 25°C

		1,5 ч	2 ч	2,5 ч	3 ч	4 ч
Смесь (2)	HPLC-УФ (%)	68,1	67,6	66,3	65,5	63,1
	Содержание согласно HPLC (%)	43,8	42,1	41,9	38,2	38
	Выход в г/г смолы	0,18	0,18	0,19	0,17	0,17
Смесь (3)	HPLC-УФ (%)	68	67,1	66,2	64,9	65
	Содержание согласно HPLC (%)	43,1	42,3	41,7	37,8	35
	Выход в г/г смолы	0,18	0,19	0,19	0,18	0,15

Отщепление с помощью смесей 2 и 3 обеспечивало сравнимые результаты. Время отщепления можно было уменьшить до 2 ч при 25°C.

Кроме того, тестировали, можно ли уменьшить объем смесей на 20% и 30%. В таблице 6 показаны результаты с течением времени при 25°C.

Таблица 6. Уменьшение объема смесей для отщепления 2 и 3 на 20% и 30%

		1,5 ч	2 ч	2,5 ч	3 ч	4 ч
Смесь (2)	HPLC-УФ (%)	67,8	67,1	65,6	66	63,1
-20%	Содержание согласно HPLC (%)	44,4	43,6	42	38,9	27,1
	Выход в г/г смолы	0,19	0,19	0,19	0,18	0,13
Смесь (2)	HPLC-УФ (%)	67,4	66,9	66,6	65,6	63,5
-30%	Содержание согласно HPLC (%)	44,8	43,2	42,1	42,3	38,2
	Выход в г/г смолы	0,19	0,19	0,19	0,2	0,18
Смесь (3)	HPLC-УФ (%)	67,9	67	66,4	65,2	63,5
-20%	Содержание согласно HPLC (%)	44,2	43,2	41,9	39,9	31,9
	Выход в г/г смолы	0,2	0,2	0,2	0,19	0,16
Смесь (3)	HPLC-УФ (%)	67,9	66,7	65,6	64,7	63,1
-30%	Содержание согласно HPLC (%)	43,7	43,1	41,6	40,1	31,9
	Выход в г/г смолы	0,2	0,2	0,2	0,19	0,17

Как можно видеть в таблице 6, значительных отличий обнаружено не было. Во время уменьшения объема смеси для отщепления до 70% сложно было обеспечивать перемешивание во время реакции отщеплении по причине вязкости взвеси.

Для подтверждения этапов отщепления с помощью смеси Кинга отщепление с помощью смесей 2 и 3 повторяли в масштабе 10 г пептида на смоле. Объемы смесей для отщепления уменьшали с помощью перегонки перед осаждением пептида в диизопропиловом эфире.

Смесь Кинга. Смесь получали посредством смешивания с применением 5 г фенола, 5 мл тиоанизола, 2,6 мл EDT, 79,2 мл TFA и 5 мл воды. Подавали 10 г пептида на смоле в предварительно охлажденную смесь (10-15°C). Взвесь перемешивали в течение 4 ч при 17-23°C. Смолу отфильтровывали и промывали 4 раза с помощью 10,1 мл TFA каждый раз. Объединенные растворы перегоняли при пониженном давлении при температуре < 30°C с получением оставшегося объема 60 мл. Данный раствор подавали в 276 мл диизопропилового эфира в течение 30-60 минут при 0-5°C. Колбу промывали с помощью 3,4 мл TFA, которые также добавляли к диизопропиловому эфиру. Полученную взвесь перемешивали в течение по меньшей мере 10 ч при 10-15°C. Осадок выделяли с применением центрифугирования. После декантации осадок суспендировали в 66,2 мл этилацетата и снова центрифугировали. Данную процедуру повторяли еще три раза. Наконец, получали 4,20 г неочищенного пептида с чистотой 54,9% и содержанием 33,4%.

Смесь 2. Смесь получали посредством смешивания с применением 4 г фенола, 2 мл EDT и 68 мл TFA. Подавали 10 г пептида на смоле в предварительно охлажденную смесь (10°C). Взвесь перемешивали в течение 2 ч при 25°C. Смолу отфильтровывали и промывали 4 раза с помощью 8 мл TFA каждый раз. Объединенные растворы перегоняли при пониженном давлении при температуре < 30°C с получением оставшегося объема 35 мл. Данный раствор подавали в 276 мл диизопропилового эфира в течение 10 минут при 3°C. Колбу промывали с помощью 3,4 мл TFA, которые также добавляли к диизопропиловому эфиру. Полученную взвесь перемешивали в течение по меньшей мере 1 ч при 15°C. Осадок выделяли с применением центрифугирования. После декантации осадок суспендировали в 66,2 мл этилацетата и снова центрифугировали. Данную процедуру повторяли еще три раза. Наконец, получали 4,88 г неочищенного пептида с чистотой 64,2% и содержанием 37,1%.

Смесь 3. Смесь получали посредством смешивания с применением 2 мл EDT и 68 мл TFA. Подавали 10 г пептида на смоле в предварительно охлажденную смесь (10°C). Взвесь перемешивали в течение 2 ч при 25°C. Смолу отфильтровывали и промывали 4 раза с помощью 8 мл TFA каждый раз. Объединенные растворы перегоняли при пониженном давлении при температуре < 30°C с получением оставшегося объема 37 мл. Данный раствор подавали в 276 мл диизопропилового эфира в течение 10 минут при 3°C. Колбу промывали с помощью 3,4 мл TFA, которые также добавляли к диизопропиловому эфиру. Полученную взвесь перемешивали в течение по меньшей мере 1 ч при 15°C. Осадок выделяли с применением центрифугирования. После декантации осадок суспендировали в 66,2 мл этилацетата и снова центрифугировали. Данную процедуру повторяли еще три раза. Наконец, получали 5,10 г неочищенного пептида с чистотой 64,2% и содержанием 36,4%.

Таблица 7. Сравнительные результаты этапов отщепления с применением различных смесей при масштабе 10 г

	HPLC-УФ (%)	Содержание согласно HPLC (%)	Выход (г)
Смесь Кинга	54,9	33,4	4,20
Смесь (2)	64,2	37,1	4,88
Смесь (3)	64,2	36,4	5,10

Как продемонстрировано в таблице 7, было обнаружено, что применение смесей 2 и 3 обеспечивает намного лучшие результаты в отношении чистоты, содержания и выхода по сравнению с применением смеси Кинга.

Смесь 3 применяли для обработки 7,6 кг пептида на смоле в промышленном масштабе по причине того факта, что она обеспечивала наибольший выход и чистоту согласно HPLC-УФ (таблица 7). Всего получили 3,26 кг SEQ ID NO:1 с чистотой 68,7%.

Подводя итог, можно принимать следующие ключевые стадии: вместо применения сложной смеси Кинга для отщепления пептида от смолы используют только TFA и EDT, отщепление проводят в течение 2 ч при 25°C, объем смеси для отщепления/г пептида на смоле уменьшают.

Пример 4. Отщепление пептида от смолы

Проводили дополнительные эксперименты для оптимизации отщепления пептида от смолы. Конкретным фокусом таких экспериментов являлось поддержание на приемлемом минимуме частоты нежелательного побочного продукта, который может образовываться во время стадии отщепления между фрагментами триптофана пептида и продуктом разрушения линкера из смолы Ринка. Далее данный конкретный побочный продукт также называется "SP1". Очевидно нежелательный побочный продукт может образовываться, пока осаждается (стадия (xii)) пептид, представляющий интерес, например, SEQ ID NO:1. Например, при использовании смеси Кинга для отщепления побочный продукт может накапливаться до нескольких процентов на основании измерений чистоты, измеренной с использованием УФ-детектирования (HPLC).

Пример 4.1. Изменение доли EDT

В первой серии экспериментов образцы пептида на смоле (SEQ ID NO: 1) обрабатывали смесью для отщепления, состоящей из TFA и EDT, где долю EDT изменяли. Отщепление проводили в течение 2 часов при 25°C и каждый образец инкубировали при температуре окружающей среды в течение дополнительных двух часов. Через два или четыре часа образцы анализировали посредством HPLC.

Таблица 8. Изменение доли EDT в смеси для отщепления

Доля EDT*	0,0	1,0	2,0	3,1	6,2	9,3
Побочный продукт SP1**, 2 ч.	0,9	1,2	1,6	1,3	1,3	1,2
SEQ ID NO: 1**, 2 ч.	63,3	62,7	71,7	74,2	74,5	74,9
Побочный продукт SP1**, 4 ч.	1,3	2	3,3	3	2,8	2,6
SEQ ID NO: 1**, 4 ч.	60,8	57,7	66,1	69,5	70,5	70,4

* В % (об./об.) от смеси для отщепления

** В %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC)

Как можно видеть из таблицы 8, увеличение доли EDT имело лишь небольшое влияние на образование побочного продукта (SP1).

Пример 4.2. Добавление дополнительного акцепторного соединения

Проводили серию экспериментов, сходных с примером 4.1, где долю EDT поддерживали на постоянном уровне 3,1% (об./об.) смеси для отщепления и добавляли либо тиоанизол, либо 3-метилиндол в качестве дополнительного акцепторного соединения. Инкубация и анализ посредством HPLC были такими, как описано в примере 4.1.

Таблица 9. Добавление тиоанизола в смесь для отщепления

Доля EDT*	3,1
Доля тиоанизола*	2,5	5,0	7,5
	Побочный продукт SP1**	SEQ ID NO: 1**	Побочный продукт SP1**	SEQ ID NO: 1**	Побочный продукт SP1**	SEQ ID NO: 1**
2 часа	1,6	66,5	1,5	65,1	1,3	63,6
4 часа	2,6	64,4	2,4	63,2	2,2	63,0

* В % (об./об.) от смеси для отщепления

** В %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC)

Таблица 10. Добавление 3-метилиндола в смесь для отщепления

Доля TFA*	94,4	91,9	89,4
Доля EDT*	3,1
Доля 3-метилиндола**	2,5	5,0	7,5
	Побочный продукт SP1***	SEQ ID NO: 1***	Побочный продукт SP1***	SEQ ID NO: 1***	Побочный продукт SP1***	SEQ ID NO: 1***
2 часа	1,0	71,0	1,3	68,7	1,0	68,5
4 часа	1,3	66,2	1,3	64,6	1,3	63,0

* В % (об./об.) от смеси для отщепления

** В % (об./об.)() от смеси для отщепления; следует отметить: 3-метилиндол представляет собой твердое вещество при применяемой температуре; таким образом, предполагаемый объем рассчитывали на основе плотности 1,22 г/см³ (известной в литературе) для обеспечения получения значений в % (об./об.)

*** В %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC)

Соотношение (вес/вес) вышеуказанной смеси для отщепления составляло бы 95,57% (вес/вес) TFA, 2,36% (вес/вес) EDT и 2,07% (вес/вес) 3-MI. Как можно видеть из таблиц 9 и 10, добавление тиоанизола едва ли имело какой-либо эффект в отношении частоты образования побочного продукта SP1, тогда как путем добавления 3-метилиндола побочный продукт можно поддерживать на низком уровне даже через четыре часа общего времени инкубации.

Пример 4.3. Сравнение индольных соединений

В дополнительной серии экспериментов, сходных с примером 4.1, анализировали, демонстрирует ли дополнительное индольное соединение, N-ацетилиндол, подобный подавляющий эффект в отношении побочного продукта по сравнению с эффектом 3-метилиндола. Долю EDT поддерживали на постоянном уровне 3,1% (об./об.) от смеси для отщепления и либо не добавляли дополнительного соединения (контроль), либо добавляли 3,1% (об./об.) N-ацетилиндола (N-ацетилиндол представляет собой вязкую жидкость), либо 3,1% (об./об.) 3-метилиндола (расчет в % (об./об.), как описано в примечании в таблице 10). Инкубация и анализ посредством HPLC были такими, как описано в примере 4.1.

Таблица 11. Сравнение N-ацетилиндола и 3-метилиндола в смеси для отщепления

Смесь для отщепления	Побочный продукт SP1 (в %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC))	SEQ ID NO:1 (в %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC))
TFA/EDT/3-метилиндол
2 часа	0,9	72,6
4 часа	1,6	66,7
TFA/EDT/N-ацетилиндол
2 часа	0,9	70
4 часа	1,4	62,4
TFA/EDT (контроль)
2 часа	1,3	74,2
4 часа	3	69,5

Как показано в таблице 11, как 3-метилиндол, так и N-ацетилиндол являются эффективными в уменьшении образования нежелательного побочного продукта SP1.

Пример 4.4. Изменение доли 3-метилиндола

В дополнительной серии экспериментов, сходных с примером 4.1, количество добавляемого к смеси для отщепления 3-метилиндола изменяли с целью определения наиболее подходящих концентраций. Долю EDT поддерживали на постоянном уровне 3,1% (об./об.) от смеси для отщепления. Инкубация и анализ посредством HPLC были такими, как описано в примере 4.1.

Таблица 12. Изменение доли 3-метилиндола

Доля 3-метилиндола*	Побочный продукт SP1 (в %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC))	SEQ ID NO:1 (в %, чистота, измеренная с использованием УФ-детектирования (HPLC))
0,8% (об./об.) 3-метилиндола
2 часа	1	72
4 часа	1,4	68
1,7% (об./об.) 3-метилиндола
2 часа	0,9	71,1
4 часа	1,3	66,6
2,5% (об./об.) 3-метилиндола
2 часа	1	70,2
4 часа	1,3	65,5
5,0% (об./об.) 3-метилиндола
2 часа	1,3	68,7
4 часа	1,3	64,6
7,5% (об./об.) 3-метилиндола
2 часа	1,0	68,5
4 часа	1,3	63,0

* Расчет в % (об./об.), как описано в примечании к таблице 10

Как можно видеть из таблицы 12, количество 3-метилиндола, составляющее 0,8% (об./об.), является уже достаточным для подавления образования неприемлемых количеств побочного продукта.

В целом, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили возможность снижения частоты образования нежелательного побочного продукта до приемлемого количества. С помощью добавления подходящего индольного соединения, в частности, N-ацетилиндола или 3-метилиндола количество нежелательного побочного продукта можно уменьшать до всего лишь 1,0-1,3% чистоты, измеренной с использованием УФ-детектирования (HPLC), в неочищенном требуемом продукте. Индольное соединение, например 3-метилиндол, а также аддукты акцепторных молекул и защитных групп удаляют из требуемого пептида, в частности, во время промывания раствора осажденного пептида.

Пример 5. Тестовое отщепление SEQ ID NO: 1 от смолы (масштаб в килограммах)

Обрабатывают 6,5-7,5 кг связанного со смолой пептида смесью из 76,13 кг трифторуксусной кислоты (TFA), 1,8 кг 1,2-этандитиола и 0,656 кг 3-метилиндола в течение 2-2,5 ч при 25°C. Смолу отфильтровывают и промывают 3 раза с помощью 17,5 кг TFA каждый раз. Объединенные фазы TFA выпаривают до 1/3 от их исходного объема. Перегоночный остаток подают в 203 л смеси диизопропилового эфира и н-гептана (30:70 (об./об.)) при 0-5°C для осаждения пептида. Суспензию перемешивают в течение 10-20 ч при 10-15°C с последующим отделением пептида с помощью фильтрации. Полученный фильтрационный осадок промывают 5 раз с помощью 50 л этилацетата каждый раз. Наконец пептид на фильтре высушивают под вакуумом и получают 2,5-3,2 кг неочищенного пептида.

В конкретном эксперименте 7,24 кг SEQ ID NO:1 на смоле подвергали отщеплению и дополнительным стадиям промывания и выделения, перечисленным ниже, и получали 2,55 кг сухого неочищенного пептида. Продукт представлял собой порошок от белого до слегка желтоватого цвета с чистотой согласно HPLC, составляющей 68,2%, и содержанием нежелательного продукта разрушения линкера из смолы Ринка и остатка триптофана пептида, составляющим 1,2%. Для достижения таких результатов 7,24 кг SEQ ID NO: 1 обрабатывали смесью 73,2 кг TFA, 1,73 кг 1,2-этандитиола и 0,63 кг 3-метилиндола в течение 2,15 ч при 23-25°C. Смолу затем отфильтровывали и промывали 3 раза с помощью 17,4 кг TFA каждый раз. Объединенные фазы TFA (смесь для отщепления и промывки с помощью TFA) переносили для перегонки. Перегонку проводили при ≤ 50 мбар и температуре ≤ 30°C, пока не получали объем 29 л в течение 1 ч. Остальную часть подавали в смесь 60,9 л DIPE и 142,1 л н-гептана при 0-5°C в течение 35 минут, получали суспензию. Суспензию перемешивали при 10-15°C в течение приблизительно 17 ч. Неочищенный пептид отфильтровывали в течение 2,5 ч с последующими 5 промывками неочищенного пептида с помощью 49,4 л этилацетата каждый раз (добавление этилацетата, перемешивание в течение 30-60 минут, удаление растворителя). Влажный пептид высушивали в течение >96 ч при 20-25°C под вакуумом (< 100 мбар) с продувкой азотом. Наконец получали 2,55 кг неочищенного пептида.

Пример 6. Эффект концентрирования раствора пептида после отщепления в отношении времени фильтрации

В эксперименте с небольшой партией с применением 10 граммов смолы в каждом случае пептид, представляющий интерес (SEQ ID NO: 1) синтезировали с помощью SPPS, как описано в данном документе, и отщепляли от смолы с применением 67,8 мл TFA и 2,26 мл EDT при 25°C в течение 2 ч.

Раствор пептида фильтровали для удаления смолы и затем либо концентрировали с помощью перегонки под вакуумом при ≤ 80 мбар и ≤ 30°C до приблизительно одной третьей от его объема до осаждения, либо непосредственно осаждали (без концентрирования). Применяли диизопропиловый эфир в качестве антирастворителя. Осадок промывали три раза с помощью этилацетата. Записывали время, необходимое для фильтрации, после осаждения и после каждой из трех промывок этилацетатом.

Таблица 13. Значения времени фильтрации в DIPE с предварительным концентрированием раствора пептида и без него

Антирастворитель	Концентрирование пептида перед осаждением	Время (в мин), необходимое для фильтрации после
стадии осаждения	1-й промывки этилацетатом	2-й промывки этилацетатом	3-й промывки этилацетатом
DIPE	Да	65	35	45	55
DIPE	Нет	200	60	70	n.d.

n.d=не определено

Можно увидеть, что при проведении стадии концентрирования время, необходимое для фильтрации, в частности после первоначального осаждения, можно сильно сократить.

Пример 7. Осаждение неочищенного пептида в смесях DIPE и н-гептана

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что смеси диизопропилового эфира (DIPE) и н-гептана могут обеспечивать значительное сокращение времени, необходимого для фильтрации и последующего промывания этилацетатом.

Для оптимизации соотношения DIPE и н-гептана проводили эксперименты с небольшой партией с применением 10 граммов смолы. Пептид синтезировали посредством SPPS, как описано в данном документе, и отщепляли от смолы с применением 67,2 мл TFA, 2,1 мл EDT и 0,86 г 3-MI при 25°C в течение 2 ч.

Затем раствор пептида фильтровали для удаления смолы и концентрировали посредством перегонки под вакуумом при ≤ 80 мбар и ≤ 30°C до приблизительно одной третьей от его объема. Впоследствии концентрированный раствор пептида осаждали либо с помощью только DIPE, либо в смеси DIPE и н-гептана и фильтровали. Осадок промывали три раза с помощью этилацетата. Записывали время, необходимое для фильтрации, после осаждения и после каждой из трех промывок этилацетатом.

Таблица 14. Значения времени фильтрации в DIPE и смесях DIPE/н-гептан

Антирастворитель	Соотношение DIPE: н-гептан (об./об.)	Время (в мин), необходимое для фильтрации после
стадии осаждения	1-й промывки этилацетатом	2-й промывки этилацетатом	3-й промывки этилацетатом
DIPE	n/a	95	30	-	65
DIPE/н-гептан	20:80	0,3	3,2	3,8	5,1
DIPE/н-гептан	25:75	1,1	1,3	3,8	2,5
DIPE/н-гептан	30:70	1,5	2,7	4,5	5,3
DIPE/н-гептан	35:65	5,3	5,7	7,5	12,5
DIPE/н-гептан	40:60	7,7	7,2	10,7	14,5

n/a=не применимо

Как продемонстрировано с помощью результатов в таблице 14, время фильтрации снижается при увеличении количеств н-гептана в смеси. Однако при соотношениях DIPE:н-гептан выше 25:75 наблюдали, что пептид "плавится" на фильтрационной фритте. При соотношениях DIPE:н-гептан ниже 40:60 эффект в отношении сокращения времени менее выражен.

Дополнительный анализ образцов посредством HPLC показал, что после третьей промывки этилацетатом акцепторные соединения или аддукты акцепторов и защитных групп больше не являлись детектируемыми.

Пример 8. Тестовая очистка неочищенного пептида с применением DIPE/н-гептана в качестве антирастворителя (лабораторный масштаб)

Отщепляли 20 г пептида на смоле (пептид: SEQ ID NO:1) посредством инкубации со смесью для отщепления (198,8 г TFA, 4,7 г EDT, 1,72 г 3-MI) в течение 3 часов при 25°C. Отщепленный пептид удаляли посредством аспирации через фритту, а смолу, оставшуюся на фритте, промывали четыре раза с помощью 16 мл TFA в каждом случае.

Фильтрат концентрировали в роторном испарителе при 30°C и оставшийся раствор добавляли к 560 мл DIPE/н-гептана (30:70), который предварительно охлаждали до 5-10°C. Пептид осаждали и выдерживали в течение одного часа при 8°C. Суспензию затем удаляли посредством аспирации через D4-фритту, на что требовалось 3,6 минуты. Неочищенный продукт суспендировали в 520 мл этилацетата, перемешивали и удаляли посредством аспирации через ту же D4-фритту. Эту стадию промывания повторяли еще два раза. Впоследствии неочищенный продукт высушивали под вакуумом. Это приводило к получению 8,36 г неочищенного продукта с чистотой 66,6%.

Настоящее изобретение дополнительно характеризуется с помощью следующих пунктов.

1. Способ получения выделенного пептида, содержащего липофильно модифицированную боковую цепь лизина, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности указанного пептида с защищенными реакционноспособными функциональными группами в боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина, подлежащей модификации, с помощью защитной группы на основе тритила, в частности, монометокситритила (Mmt) или 4-метилтритила (Mtt);

(ii) высушивания твердофазной смолы после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы несколько раз с помощью раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина, подлежащей модификации;

(iv) нейтрализации смолы;

(v) связывания по меньшей мере одного активированного линкерного фрагмента, связанного с 9-флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc), с боковой цепью лизина без защитной группы;

(vi) удаления защитной группы с концевой функциональной группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v);

(vii) связывания активированного липофильного фрагмента, в частности активированной жирной кислоты, с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы и

(ix) отщепления пептида от смолы.

2. Способ по п. 1, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44 аминокислот, и при этом идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%.

3. Способ по п. 1 или п. 2, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44 аминокислот, и при этом идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44 аминокислот, и при этом липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 30 до 44 аминокислот, где идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%, идентичность последовательности с эксендином-4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22-39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и при этом липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 дикого типа.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину от 38 до 40 аминокислот.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину 39 аминокислот.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину 39 аминокислот, где последовательность в области, соответствующей аминокислотам 1-13 эксендина-4 wt, содержит не более 2 мутаций, область, соответствующая аминокислотам 22-39 эксендина-4 wt, содержит не более одной мутации, и при этом липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 wt.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина-4, имеющее длину 39 аминокислот, где область, соответствующая аминокислотам 1-13 эксендина-4 wt, содержит мутации в положениях 2 и 3, область, соответствующая аминокислотам 22-39 эксендина-4 wt, содержит мутацию в положении 28, и при этом липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина-4 wt.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где число обработок с помощью TFA в DCM на стадии (iii) регулируют таким образом, что выход модифицированной боковой цепи лизина на стадии (ix) составляет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (iii) высушенную смолу обрабатывают по меньшей мере семь раз в течение по меньшей мере 5 минут с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (iii) высушенную смолу обрабатывают девять раз в течение по меньшей мере 10 минут с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (iii) высушенную смолу обрабатывают девять раз в течение по меньшей мере 15 минут с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM.

14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (iv) пептид считают достаточно нейтрализованным, как только достигнуто значение pH ≥ 7, в частности, ≥ 7,5, более конкретно ≥ 8,0.

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (iv) пептид считают достаточно нейтрализованным, как только достигнуто значение ≥ 8,0.

16. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадию (viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида.

17. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадию (viii-b) повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, предусматривающего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина.

18. Способ по п. 16, где осуществление анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) в тестовом образце включает стадии:

(viii-a1) удаления тестового образца смолы из общей реакционной партии и отщепления пептида от тестового образца при тех же условиях и с помощью той же смеси для отщепления, что и на стадии (ix); и

(viii-a2) определения содержания отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина, в частности, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) или комбинации жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрии (LC-MS).

19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид имеет аминокислотную последовательность

H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂ (SEQ ID NO: 1).

20. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

21. Способ по п. 20, где смесь для отщепления дополнительно содержит подходящее индольное соединение, например, N-ацетилиндол или 3-метилиндол или их смеси.

22. Способ по п. 21, где подходящее индольное соединение представляет собой 3-метилиндол.

23. Способ по п. 20, где смесь для отщепления состоит из 91-93% (об./об.) трифторуксусной кислоты, 1-6% (об./об.) фенола и 1-8% (об./об.) этандитиола или состоит из 96-98% (об./об.) трифторуксусной кислоты и 2-4% (об./об.) этандитиола.

24. Способ по любому из пп. 1-19, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 80% (вес/вес) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (вес/вес) 1,2-этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

25. Способ по п. 24, где смесь для отщепления дополнительно содержит подходящее индольное соединение, например, N-ацетилиндол или 3-метилиндол или их смеси.

26. Способ по п. 25, где подходящее индольное соединение представляет собой 3-метилиндол.

27. Способ по любому из пп. 24-26, где смесь для отщепления состоит из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты (TFA), 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола (EDT) и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола (3-MI).

28. Способ по любому из пп. 24-27, где смесь для отщепления состоит из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-MI.

29. Способ по любому из пп. 24-28, где смесь для отщепления состоит из приблизительно 97% (вес/вес) TFA, приблизительно 2% (вес/вес) EDT и приблизительно 1% (вес/вес) 3-MI.

30. Способ по любому из пп. 24-29, где смесь для отщепления состоит из приблизительно 96,9% (вес/вес) TFA, приблизительно 2,3% (вес/вес) EDT и приблизительно 0,8% (вес/вес) 3-MI.

31. Способ по любому из пп. 20-30, где отщепление проводят при 5-15°C, 15-22°C и/или 22-30°C, в частности при 25°C.

32. Способ по любому из пп. 20-31, где объем смеси для отщепления на грамм пептида на смоле составляет от 9,5 мл до 5,5 мл, в частности от 7,0 мл до 6,0 мл.

33. Способ по любому из пп. 20-32, где отщепление проводят в течение 2-3 часов, в частности 2,0-2,5 часа, с перемешиванием.

34. Способ по любому из пп. 20-33, где отщепление проводят в течение 2-3 часов, в частности 2,0-2,5 часа, при 25°C с перемешиванием.

35. Способ по любому из пп. 20-33, где отщепление проводят в течение 1-1,5 часа при 30°C с перемешиванием.

36. Способ по любому из пп. 20-35, где отщепление проводят с применением (a) смеси для отщепления, состоящей из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола, в частности, состоящей из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-MI, например, из приблизительно 97% (вес/вес) TFA, приблизительно 2% (вес/вес) EDT и приблизительно 1% 3-MI, (b) времени инкубации, составляющего лишь 2 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и (c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, например, от 7,0 мл до 6,0 мл.

37. Способ по любому из пп. 20-36, где отщепление проводят с применением (a) смеси для отщепления, состоящей из 88,2-98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, 1-4,3% (вес/вес) 1,2-этандитиола и 0,7-7,5% (вес/вес) 3-метилиндола, в частности, состоящей из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-MI, например, из приблизительно 97% (вес/вес) TFA, приблизительно 2% (вес/вес) EDT и приблизительно 1% 3-MI, (b) времени инкубации, составляющего лишь 2 часа, при повышенной температуре, составляющей 25°C, и (c) сниженного объема смеси для отщепления на грамм пептида на смоле, например, от 7,0 мл до 6,0 мл, и при этом пептид имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

38. Способ по любому из предыдущих пунктов, где высушивание смолы на стадии (ii) проводят в атмосфере инертного газа, например азота, при комнатной температуре после промывания пептида на смоле по меньшей мере один раз с помощью алифатического спирта и по меньшей мере один раз с помощью диалкилового эфира.

39. Способ по п. 38, где алифатический спирт представляет собой изопропанол, и диалкиловый эфир представляет собой диизопропиловый эфир.

40. Способ по любому из предыдущих пунктов, где нейтрализацию на стадии (iv) проводят с помощью по меньшей мере одного этапа инкубации с 1%-5% раствором третичного алкиламина в органическом полярном апротонном растворителе в течение по меньшей мере 10 минут, необязательно с последующим определением pH смеси растворителей после стадии нейтрализации, и промывания пептида на смоле по меньшей мере один раз с помощью указанного растворителя и по меньшей мере один раз с помощью дополнительного полярного апротонного растворителя, например диметилформамида (DMF).

41. Способ по п. 40, где третичный алкиламин представляет собой диизопропилэтиламин (DIPEA), или N-метилморфолин (NMM), или триэтиламин, и при этом органический полярный апротонный растворитель представляет собой дихлорметан.

42. Способ по п. 40 или п. 41 с последующим определением pH смеси растворителей после стадии нейтрализации и промыванием пептида на смоле по меньшей мере один раз с помощью указанного растворителя и по меньшей мере один раз с помощью дополнительного полярного апротонного растворителя, например диметилформамида (DMF).

43. Способ по любому из предыдущих пунктов, где удаление защитной группы на стадии (vi) проводят с помощью обработки пептида на смоле по меньшей мере один раз в течение по меньшей мере 5 минут с помощью основания с последующей по меньшей мере одной стадией промывания.

44. Способ по п. 43, где основание представляет собой 20% (об./об.) пиперидин в DMF.

45. Способ по любому из предыдущих пунктов, где высушивание смолы на стадии (viii) проводят под вакуумом, в частности под вакуумом ≤ 70 мбар, после промывания пептида на смоле.

46. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc-Glu-OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc-группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) посредством отщепления тестового образца связанного со смолой пептида и

(viii-b) повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) отщепления пептида от смолы при 25°C с применением смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) 1,2-этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

47. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадии:

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, содержащий диалкиловый эфир и гептан;

(xiii) перемешивания раствора с осадком;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка и

(xvi) высушивания влажного пептида.

48. Способ по любому из предыдущих пунктов, где после стадии (x) фильтрационный осадок ополаскивают по меньшей мере один раз, например 3 раза, подходящим раствором для ополаскивания, например TFA.

49. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (xi) перегонку проводят при вакууме ≤ 50 мбар, при температуре ≤ 30°C.

50. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (xii) антирастворитель представляет собой смесь, состоящую из диизопропилового эфира (DIPE) и н-гептана, в частности смесь DIPE и н-гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.).

51. Способ по п. 50, где соотношение DIPE и н-гептана составляет 30:70 (об./об.).

52. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (xiii) раствор с осадком перемешивают в течение 1-20 часов при 10-15°C.

53. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (xv) осадок на фильтре после ополаскивания подходящим органическим растворителем, например этилацетатом, промывают по меньшей мере один раз путем повторного суспендирования осадка в подходящем органическом растворителе, например этилацетате, перемешивания полученной суспензии, например, в течение 30-60 минут и отфильтровывания органического растворителя.

54. Способ по п. 53, где осадок промывают с помощью этилацетата 1-5 раз, в частности, 2-4 раза, или 3-5 раз, или 4-5 раз.

55. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (xvi) влажный пептид высушивают под вакуумом, например, при 20-25°C, в частности под вакуумом ≤ 70 мбар при 20-25°C, и в потоке азота (продувка азотом).

56. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc-Glu-OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc-группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii-a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii-b) повторения стадий (iii)-(viii-a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) отщепления пептида от смолы с применением смеси для отщепления, состоящей из 96,0-97,5% (вес/вес) TFA, 1,7-2,6% (вес/вес) EDT и 0,7-1,5% (вес/вес) 3-метилиндола;

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления при комнатной температуре;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом при ≤30°C;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, состоящий из DIPE и н-гептана в соотношении от 25:75 до 35:65;

(xiii) перемешивания раствора с осадком при 10-15°C в течение 1-18 часов;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка 4-5 раз посредством (xv-a) повторного суспендирования осадка в этилацетате, (xv-b) перемешивания полученной суспензии в течение 30-60 минут, и (xv-c) отфильтровывания этилацетата, и

(xvi) высушивания влажного пептида под вакуумом.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Sanofi

<120> Способ получения пептидов, содержащих липофильно модифицированную

боковую цепь лизина

<130> 62509P WO / DE2016/059 WO PCT

<150> EP 16 306 332.4

<151> 2016-10-10

<160> 6

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог эксендина-4

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой D-Ser

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (14)..(14)

<223> Lys функционализирован по аминогруппе боковой цепи в виде

Lys((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил)

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (39)..(39)

<223> Ser модифицирован с помощью группы NH2

<400> 1

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser

1 5 10 15

Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 2

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог эксендина-4 (побочный продукт)

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой D-Ser

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (39)..(39)

<223> Ser модифицирован с помощью группы NH2

<400> 2

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser

1 5 10 15

Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 3

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Heloderma suspectum

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (39)..(39)

<223> Ser модифицирован с помощью группы NH2

<400> 3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 4

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (30)..(30)

<223> Arg модифицирован с помощью группы NH2

<400> 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 6

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Лираглютид

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (20)..(20)

<223> Lys функционализирован по аминогруппе боковой цепи в виде

Lys((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил)

<400> 6

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<---

1. Способ получения выделенного пептида, содержащего липофильно модифицированную боковую цепь лизина, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности указанного пептида с защищенными реакционноспособными функциональными группами в боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина, подлежащей модификации, с помощью защитной группы на основе тритила, в частности монометокситритила (Mmt) или 4–метилтритила (Mtt);

(ii) высушивания твердофазной смолы после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы несколько раз с помощью раствора от 0,5 до 1,5% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина, подлежащей модификации, где число стадий обработки с помощью TFA в DCM устанавливается таким, что выход модифицированной боковой цепи лизина на стадии (ix) составляет по меньшей мере 85% по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина;

(iv) нейтрализации смолы;

(v) связывания по меньшей мере одного активированного линкерного фрагмента, связанного с 9–флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc), с боковой цепью лизина без защитной группы;

(vi) удаления защитной группы с концевой функциональной группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v);

(vii) связывания активированного липофильного фрагмента, в частности активированной жирной кислоты, с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы и

(ix) отщепления пептида от смолы,

где выделенный пептид представляет собой производное эксендина–4, имеющее длину от 30 до 44, в частности от 38 до 40, аминокислот, где идентичность последовательности с эксендином–4 дикого типа (SEQ ID NO: 3) в области, соответствующей аминокислотам 1–13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%.

2. Способ по п. 1, где

(i) идентичность последовательности с эксендином–4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22–39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и/или

(ii) липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина–4 дикого типа.

3. Способ по п. 1 или 2, где на стадии (iii) высушенную смолу обрабатывают по меньшей мере семь раз в течение по меньшей мере 5 минут, в частности девять раз в течение по меньшей мере 10 минут или девять раз в течение по меньшей мере 15 мин, с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадии:

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) посредством отщепления тестового образца связанного со смолой пептида и

(viii–b) необязательно повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95%, по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид имеет аминокислотную последовательность

H–dS–Q–G–T–F–T–S–D–L–S–K–Q–K(γE–Palm)–E–S–K–A–A–Q–D–F–I–E–W–L–K–A–G–G–P–S–S–G–A–P–P–P–S–NH₂ (SEQ ID NO: 1).

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

7. Способ по п. 6, где смесь для отщепления дополнительно содержит подходящее индольное соединение, выбранное из индолов, несущих заместитель, представляющий собой (C₁–C₃)алкил или (C₁–C₃)ацил на атоме углерода C₃ или на атоме азота, в частности 3–метилиндол.

8. Способ по любому из пп. 1–5, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 80% (вес./вес.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (вес./вес.) 1,2–этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

9. Способ по п. 8, где смесь для отщепления состоит из 88,2–98,3% (вес./вес.) трифторуксусной кислоты, 1–4,3% (вес./вес.) 1,2–этандитиола и 0,7–7,5% (вес./вес.) 3–метилиндола.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадии:

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, содержащий диалкиловый эфир и гептан;

(xiii) перемешивания раствора с осадком;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка и

(xvi) высушивания влажного пептида.

11. Способ по п. 10, где на стадии (xii) антирастворитель представляет собой смесь, состоящую из диизопропилового эфира (DIPE) и н–гептана, в частности смесь DIPE и н–гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.).

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc–Glu–OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc–группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii–b) повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%; и

(ix) отщепления пептида от смолы при 25°C с применением смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc–Glu–OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc–группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii–b) повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) отщепления пептида от смолы с применением смеси для отщепления, состоящей из 96,0–97,5% (вес./вес.) TFA, 1,7–2,6% (вес./вес.) EDT и 0,7–1,5% (вес./вес) 3–метилиндола;

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления при комнатной температуре;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом при ≤30°C;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, состоящий из DIPE и н–гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.);

(xiii) перемешивания раствора с осадком при 10–15°C в течение 1–18 часов;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка 4–5 раз посредством (xv–a) повторного суспендирования осадка в этилацетате,

(xv–b) перемешивания полученной суспензии в течение 30–60 минут, и

(xv–c) отфильтровывания этилацетата, и

(xvi) высушивания влажного пептида под вакуумом.