Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи

Авторы патента:

Зуков Руслан Александрович (RU)

Слепов Евгений Владимирович (RU)

Мазаев Андрей Владимирович (RU)

Черняев Денис Владимирович (RU)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2756255:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря, и касается способа раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи. Способ включает: забор первой утренней порции мочи обследуемого, центрифугирование ее при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; слив супернатанта, добавление к осадку 2 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин и повторное центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки проводят дважды; слив супернатанта, к осадку добавление 0,5 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин. Далее к полученной клеточной взвеси добавляют моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 в объеме 20 мкл, перемешивают на персональном вортексе в течение 20 сек, добавляют моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином в объеме 20 мкл, перемешивают на персональном вортексе в течение 20 сек и помещают в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводят при комнатной температуре на протяжении 15 минут; после инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлоурометре BD FACSCanto II, полученные данные анализируют в программном обеспечении FACSDiva по светорассеянию, количеству CD45⁺ событий и количеству CD326⁺ событий; при количестве CD45^-CD326⁺ клеток, меньшем либо равном 2,65%, злокачественное новообразование мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений не предполагают; при количестве CD45^-CD326⁺ клеток выше 2,65% предполагают наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений. Изобретение является эффективным, точным, простым в выполнении, неинвазивным обнаружением бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326. Предлагаемый способ с высокой диагностической точностью (98,1%) позволяет выявить наличие рака мочевого пузыря без клинических проявлений на ранних стадиях. 2 пр., 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря.

В связи с объективными трудностями в выявлении начальных этапов опухолевого процесса в мочевом пузыре (отсутствие клинических проявлений заболевания, отсутствие визуально идентифицируемых опухолевых очагов), существующие способы ранней диагностики рака мочевого пузыря относятся к направлению лабораторной диагностики.

Известны способы микроскопической и цитологической диагностики рака мочевого пузыря (Руководство по цитологической диагностике опухолей человека / под ред. А.С. Петрова. - М.: Медицина, 1976. - 304 с.) и способы, их оптимизирующие (Патент РФ №2547567 от 26.02.2014 и пр.). (Суть способов заключается в исследовании цитологического мазка на содержание морфологически атипичных клеток после различных процедур, например, биопсии.) Несмотря на достаточно высокую эффективность таких способов при выявлении злокачественных новообразований мочевого пузыря, их осуществление сопровождается трудностями, связанными со сложностью получения материала для исследования, инвазивностью указанных методов и значительным объемом трудозатрат. Кроме этого, непосредственное осуществление инвазивных процедур способно вызвать проявление некоторых клинических симптомов (например, микрогематурию), не связанных с онкологическим заболеванием.

Известны способы определения в биологических жидкостях (моче, крови, плазме, сыворотке) концентраций различных биомаркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря (Патент US 9892229 от 01.04.20; Патент РФ №2718284 от 01.04.20 и пр.). Данные методы используют различные технологии иммунохимических методов исследования и их чувствительность и специфичность зависят от типа используемого для проведения исследования оборудования. Применимость данной группы методов ранней диагностики заболевания существенно ограничивается фактом того, что до настоящего времени не выявлено ни одного органоспецифического биохимического маркера для рака мочевого пузыря. Кроме того, использование комплекса маркеров существенно повышает стоимость процедуры анализа.

Известны способы исследования молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря. Так, в способе диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря (Патент РФ №2456607 от 20.07.2012 и пр.) используется FISH-анализ с применением коммерческого ДНК-зонда «UroVysion» (ABBOTT), что делает этот способ доступным для широкого использования. Особенности метода позволяют получать достоверные результаты на меньшем количестве клеточного материала (по сравнению с цитологическими исследованиями) на более ранних стадиях рака мочевого пузыря. Известны способы анализа полиморфизма различных генов или их продуктов методами генетического анализа (Патент РФ №2393772 от 23.03.2009, Патент РФ №2469323 от 28.01.2011 и пр.). Такие способы диагностики позволяют оценить различные этапы канцерогенеза. Однако особенности методов требуют наличия специфических расходных материалов, значимая часть которых отсутствует в коммерческом доступе и должна быть синтезирована в лаборатории. Это накладывает довольно серьезное ограничение, связанное с межсерийной сопоставимостью данных, что отражается на точности проводимых оценок. Кроме того, все связанные с генетической диагностикой способы, сопровождаются высокими финансовыми затратами и должны выполняться специалистами с узкой специализацией.

Известен способ диагностики рака мочевого пузыря на основании клеточного цикла осадка мочи методом проточной цитофлуорометрии (Разрешение на применение новой медицинской технологии серия АА №0001899 ФС №2009/114 от 27 мая 2009 г.). Данный способ позволяет оценить плоидность и соотношение клеток в различных фазах клеточного цикла. Однако, в связи с тем, что клеточный цикл не является опухолеассоциированным явлением и на результат могут оказать влияние различные факторы физиологической (менструальный цикл, половое поведение и пр.), патологической (наличие сопутствующей инфекционной или воспалительной патологии) или терапевтической (проведение лечебных процедур) природы. Таким образом, высокая эффективность такого способа может быть достигнута только при предварительном отборе пациентов в группу с высоким риском развития рака мочевого пузыря.

Задача предлагаемого способа состоит в эффективном обнаружении бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326.

Поставленную задачу решали следующим образом. Первую утреннюю порцию мочи обследуемого субъекта центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 (РегСР-Су5-5 - при возбуждении лазером 488 нм дает максимум флуоресценции на 695 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на вортексе (устройстве для перемешивания жидкостей за счет встряхивания емкости) в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином (АРС - при возбуждении лазером 633 нм дает максимум флуоресценции на 650 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).

Для получения результата проводили анализ не менее 1000 событий. После окончания анализа осуществляли работу с полученными скатерограммами в программном обеспечении FACSDiva (BectonDickinson, США).

Первым шагом является гейтирование (установление порогового значения какого-либо параметра на основе контуров вероятности для выбора подмножества собранных событий для дальнейшего анализа) всех событий на скатерограмме (диаграмма, состоящая из образующих «облако» точек, где каждая точка соответствует конкретным сочетаниям параметров), прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния (фиг. 1). Это проводится для исключения из дальнейшего анализа крупных конгломератов клеток и коньюгатов красителей.

Следующим шагом является гейтирование CD45⁺ событий (фиг. 2). Клетки, экспрессирующие на своей мембране рецептор CD45 являются по своей природе лейкоцитами и исключаются из дальнейшего анализа.

Заключительным этапом является гейтирование CD326⁺ событий (фиг. 3). Анализ проводится только для популяции клеток, не экспрессирующих CD45 (то есть СБ45-негативных). Обосновано это фактом того, что экспрессия CD326 на поверхности клеток лейкоцитарного ряда не наблюдается. CD326 (рецептор ЕрСАМ) экспрессируется только на поверхности эпителиоцитов, которые являются ключевой популяцией клеток для оценки роста эпителиальных опухолей.

Этапы проведения исследования указаны на Фиг. 4.

При оценке количества CD45^-CD326⁺ клеток у различных обследуемых субъектов были обнаружены различия, используемые для решения поставленной задачи (Табл. 1).

Способ осуществляют следующим образом:

Для оценки наличия злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у обследуемых субъектов забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи CD45^-CD326⁺ клеток. Если количество CD45^-CD326⁺ клеток меньше либо равно 2,65%, то злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у такого обследуемого не предполагается. Если количество CD45^-CD326⁺ клеток превышает 2,65%, то предполагается наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений. В зависимости от совокупности клинических признаком врач рекомендует усиленное наблюдение за таким пациентом или дополнительное обследование иными методами инструментальной и/или лабораторной диагностики.

Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 74,3%, специфичность - 92,1%, диагностическая точность - 98,1%.

Пример №1

Пациент А., 50 лет

При проведении периодического профосмотра выявлена микрогематурия. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45^-CD326⁺ клеток в клеточном осадке мочи - 0,62%. Согласно предлагаемому способу наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях не предполагается. При дополнительном инструментальном обследовании выявлено заболевание мочевого пузыря воспалительной природы (цистит), проведены мероприятия по терапевтическому лечению воспаления.

До настоящего момента (в течение 30 месяцев) пациент находится под наблюдением специалистов, признаков рака мочевого пузыря не наблюдается.

Пример №2

Пациент Б., 66 лет

При проведении периодического профосмотра взята порция мочи. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45^-CD326⁺ клеток в клеточном осадке мочи - 22,1%. Согласно предлагаемому способу у пациента предполагается наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях. В связи с тем, что клинических и лабораторных признаков заболевания не наблюдалось, пациенту рекомендовалось наблюдение у специалиста каждые 3 месяца. На 3 визит (через 9 месяцев) появились клинические признаки заболевания (микрогематурия). Пациенту проведена цистоскопия, показавшая наличие атипичных клеток. УЗИ органов малого таза показало мышечно-неинвазивную опухоль задней стенки мочевого пузыря. Пациенту проведена трансуретральная резекция.

Нами разработан метод скрининга бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326. Его достоинствами являются: отсутствие инвазивности для пациента, простота получения материала для исследования, низкий объем трудозатрат, высокая диагностическая точность. Выявление наличия рака мочевого пузыря без клинических проявлений на ранних стадиях снижает смертность больных и улучшает качество и продолжительность их жизни. Метод доступен для широкого применения в амбулаторно-поликлиническом звене здравоохранения. Для использования предлагаемого метода необходимо лишь наличие проточного цитофлуориметра и расходных материалов к нему (моноклональные антитела CD45 и CD326, промывочные растворы). Простота исследования не требует наличия узкой специализации исследователя, оно может быть выполнено средним медицинским персоналом (с верификацией результатов врачом).

Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи, включающий забор первой утренней порции мочи обследуемого, центрифугирование ее при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; затем сливают супернатант, к осадку добавляют 2 мл PBS, осадок ресуспендируют пипетированием на протяжении 1-2 мин и повторно центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки проводят дважды; затем супернатант сливают, к осадку добавляют 0,5 мл PBS, ресуспендируют пипетированием на протяжении 1-2 мин; отличающийся тем, что к полученной клеточной взвеси добавляют моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 в объеме 20 мкл, перемешивают на вортексе в течение 20 сек, добавляют моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином в объеме 20 мкл, перемешивают на вортексе в течение 20 сек и помещают в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводят при комнатной температуре на протяжении 15 минут; после инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлоурометре BD FACSCanto II, полученные данные анализируют в программном обеспечении FACSDiva по светорассеянию, количеству CD45⁺ событий и количеству CD326⁺ событий; при количестве CD45^-CD326⁺ клеток, меньшем либо равном 2,65%, злокачественное новообразование мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений не предполагают; при количестве CD45^-CD326⁺ клеток выше 2,65% предполагают наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений.

Изобретение относится к медицине, а именно к предоперационной дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных опухолей околощитовидных желез (ОЩЖ). Определяют комплекс диагностически значимых показателей: уровень кальция ионизированного в крови, уровень паратгормона в крови, объем опухоли по данным УЗИ околощитовидной железы, пол пациента и возраст, наличие осложнений со стороны почек: хроническая болезнь почек и/или нефролитиаз; наличие осложнений со стороны костной системы: остеопороз и/или наличие низкоэнергетических переломов; уровень фосфора в крови, наибольший диаметр опухоли по данным УЗИ околощитовидной железы.

Способ прогнозирования развития гетеротопической оссификации после операций на локтевом суставе // 2755378

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования возникновения гетеротопической оссификации у больных после оперативного лечения последствий травм локтевого сустава. На 1–14 день после оперативного лечения последствий травм локтевого сустава определяют концентрацию лактата, активность тартратрезистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови, а также уровень гемоглобина в крови.

Способ прогнозирования преждевременных родов у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе // 2755269

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования преждевременных родов у женщин с угрожающим выкидышем в сроке 5–12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе. Сущность способа: в периферической венозной крови беременных с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе в сроке 5-12 недель гестации до назначения сохраняющей терапии определяют относительное содержание IL-4 позитивных моноцитов.

Способ прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода // 2754956

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода, являющихся уроженками Центрального Черноземья русской национальности и не имеющих отягощенного семейного анамнеза по преэклампсии. Из периферической венозной крови выделяют ДНК.

Определение фенотипа на основе неполных генетических данных // 2754884

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен компьютерно-реализуемый способ определения фенотипа пользователя в условиях отсутствия полной генетической информации, выполняемый при помощи по крайней мере одного процессора.

Способ иммунологического мониторинга животных // 2754633

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и предназначено для диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма по биологическому тесту. В качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов и готовят реагирующие смеси.

Способ иммунологического мониторинга животных // 2754633

Способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта (сор) // 2754295

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и дифференциальной диагностики предраковых заболеваний слизистой оболочки рта (СОР) и плоскоклеточного рака СОР (ПР СОР). Для этого осуществляют прямое флуоресцентное иммуноцитохимическое (ФИЦХ) исследование биоматериала пациента, который получен путем самостоятельного смыва пациентом в течение 1 минуты из ротовой полости 5% раствором глюкозы после ополаскивания полости рта дистиллированной водой.

Способы и системы калибровки и использования камеры для определения аналита в пробе // 2754208

Изобретение относится к способу для калибровки камеры с целью определения аналита в пробе. Способ включает в себя: а) обеспечение набора систем цветовых координат; б) обеспечение набора (122) проверочных проб; в) нанесение проверочных проб (124) на набор (126) тест-элементов (128), каждый из которых имеет по меньшей мере одно тестовое поле (130), содержащее индикаторный реагент; г) получение посредством камеры (116) изображений окрашенных тестовых полей (130); д) генерирование цветовых координат для изображений окрашенных тестовых полей (130), выполняемое посредством систем цветовых координат из набора систем цветовых координат, в результате чего создают набор цветовых координат для проверочных проб (124) и для систем цветовых координат; е) обеспечение набора функций кодирования; ж) преобразование набора цветовых координат, сгенерированного на шаге д), в набор измеренных концентраций, выполняемое посредством набора функций кодирования; и з) сравнение набора измеренных концентраций с известными концентрациями в проверочных пробах (124) из набора (122) проверочных проб и определение наиболее подходящей системы цветовых координат.

Центильные шкалы для оценки содержания химических элементов в шерсти грызунов // 2754119

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к животноводству, токсикологии, может быть использовано в качестве способа оценки метаболизма химических элементов у домашних и диких животных отряда грызунов Rodentia, обитающих в Центральном Федеральном округе, заключающегося в том, что определяют содержание цинка, меди, железа, свинца, кадмия и мышьяка в шерсти грызунов, которую забирают с участка спины животного ниже проекции лопаток площадью 1 см2 и массой 1-3 г , далее по центильным шкалам оценивают содержание цинка, меди, железа, свинца, кадмия и мышьяка в шерсти и при значении концентрации хотя бы одного из указанных химических элементов от 25 до 75 центильного значения уровень химического элемента оценивают как нормальный, ниже 25 до 10 центильного значения оценивают как ниже среднего; выше 75 до 90 центильного значения уровень оценивают как выше среднего; ниже 10 до 5 центильного значения оценивают как низкое; выше 90 до 95 центильного значения оценивают как высокое; ниже 5 до 0 центильного значения оценивают как очень низкое; выше 95 до 100 центильного значения оценивают как очень высокое.

Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции // 2756764

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции. Способ определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции включает проведение реакции лизиса эритроцитов человека группы А системы АВ0 (Е(А)), сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами (Е(А)мАт) и сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS2+), инкубирование полученной пробы, далее оценивают реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мАт турбидиметрически, по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАт при длине волны 620 нм определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль Е(А)мАт представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса Е(А)мАт - 100% лизис, при определенных условиях, при этом повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента человека отмечают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную и при степени лизиса менее 30% как пониженную функциональную активность системы комплемента человека. Вышеописанный способ позволяет повысить точность метода исследования функциональной активности классического пути системы комплемента, а также упростить регистрацию результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях и адаптации способа для скрининг-исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий. 5 ил., 2 табл., 2 пр.