Частицы, содержащие производное билирубина и металл

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая частицу для лечения и/или диагностики воспалительного заболевания, содержащую билирубин, конъюгированный с гидрофильной молекулой; и атом металла, соединенный посредством координационных связей с по меньшей мере одной группой, выбранной из карбоксильной группы, лактамной группы и пиррольного кольца указанного билирубина, применение вышеуказанной частицы для лечения рака, применение вышеуказанной частицы в качестве контрастного агента для диагностики при помощи изображения и применение вышеуказанной частицы для обнаружения активных форм кислорода (АФК). В одном из вариантов реализации частица содержит атом металла, выбранный из Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Zn, Gd, Mo, Ni, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra и лантаноида. Изобретение расширяет арсенал средств, содержащих билирубин, для лечения воспалительных заболеваний. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 34 ил., 1 табл., 8 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение было разработано при поддержке Министерства науки и информационно-коммуникационных технологий в рамках проекта № 2018M3A9B5023527, который был реализован в рамках программы под названием «Программа развития биологических и медицинских технологий» в рамках проекта «Разработка платформенной технологии нацеливания на опухолевую микросреду и доставки лекарственного средства» Института перспективных научно-технических исследований Республики Корея под руководством Национального исследовательского фонда Республики Корея с 1 апреля 2018 года по 31 декабря 2020 года.

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Республики Корея № 10-2017-0059597, поданной в Ведомство по интеллектуальной собственности Республики Корея 12 мая 2017 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к частицам, содержащим производное билирубина и металл, их применению и способу их получения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Встречающиеся в природе структурные элементы, состоящие из металлоорганических координационных комплексов, долгое время служат катализатором научной мысли. Например, координация определенных металлов и органических лигандов играет ключевую роль в выполнении биологических функций, примером чего служат металлопротеины при фотосинтезе (Mg(II)-порфирин) и переносе (Cu(II)-гем) и прикреплении кислорода (Fe(III)-фенолы). Эти металлоорганические комплексы демонстрируют потенциал не только в биомедицинских, но и в химических областях, включая сенсоры, процессы разделения и каталитические воздействия. Однако их применение было очень ограничено из-за проблем с токсичностью и длительности этапов их производства.

Билирубин, который является конечным продуктом метаболизма гема в нашем организме, представляет собой природный металлоорганический координационный материал. Образование камней в желчном пузыре, которое является патологическим явлением, возникающим на пути дренирования желчных путей, вдохновило авторов настоящего изобретения на создание стратегии настоящего изобретения по применению билирубина в качестве металлоорганического координационного материала. Желчные камни - это камни, которые образуются в желчных протоках в результате сочетания желчной кислоты с металлами вследствие нарушения метаболизма желчи. Билирубин выделяется в желчную кислоту, и черные пигментированные желчные камни известны как конечные продукты комплексов, состоящих из билирубина и меди и/или билирубина и кальция в желчной кислоте. Билирубин богат функциональными группами, которые по своей природе имеют неспаренные электроны или несвязывающие электронные пары и таким образом может взаимодействовать с катионами металлов даже без внешних линкеров, в результате чего образуются металлорганические координационные комплексы. Однако билирубин плохо растворяется в растворителе, поскольку он очень гидрофобен, и, следовательно, билирубин сложно применять для химических целей.

Для решения проблемы применения билирубина, обусловленной его гидрофобностью, и для применения билирубина для различных целей авторы настоящего изобретения разработали наночастицы билирубина, состоящие из комплекса билирубина и гидрофильного полимера. На эти наночастицы билирубина был получен патент Республики Корея № 10-1681299, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

В настоящем описании приведены ссылки на многие документы и патентные документы. Содержание цитируемых документов и патентных документов включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для описания уровня техники настоящего изобретения, и для того, чтобы более четко описать содержание настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

В одном аспекте настоящее изобретение относится к частице производного билирубина, содержащей производное билирубина и металл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к контрастному агенту для диагностики при помощи изображения, содержащему частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и диагностики рака, содержащей указанные частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и диагностики воспалительного заболевания, содержащей указанные частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения указанной частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения активных форм кислорода (АФК), содержащей указанные частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к сенсору для обнаружения активных форм кислорода (АФК), содержащему указанные частицы производного билирубина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для обнаружения активных форм кислорода (АФК) за счет применения указанных частиц производного билирубина.

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания изобретения, формулы изобретения и фигур.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает изобретения 1-17 ниже:

1. Частица производного билирубина, содержащая производное билирубина и металл.

2. Частица производного билирубина по изобретению 1, отличающаяся тем, что указанная частица производного билирубина сконфигурирована при помощи координационной связи указанного производного билирубина и указанного металла.

3. Частица производного билирубина по изобретению 1, отличающаяся тем, указанная координационная связь образована между указанным металлом и карбоксильной группой, лактамной группой или пиррольным кольцом указанного производного билирубина.

4. Частица производного билирубина по любому из изобретений 1-3, отличающаяся тем, что указанный металл представляет собой ион или соединение металла, выбранного из группы, состоящей из Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Mn, Zn, Gd, Mo, Ni, Fe, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra и лантаноидов.

5. Частица производного билирубина по любому из изобретений 1-3, отличающаяся тем, что указанный металл представляет собой суперпарамагнитную наночастицу оксида железа (SPION) или наночастицу золота.

6. Частица производного билирубина по изобретению 5, отличающаяся тем, что указанная частица производного билирубина сконфигурирована в форме, в которой указанный металл расположен в центре, а указанное производное билирубина окружает указанный металл.

7. Частица производного билирубина по изобретению 6, отличающаяся тем, что указанный металл находится в форме одной металлической частицы или кластеризованных металлических частиц.

8. Частица производного билирубина по любому из изобретений 1-3, отличающаяся тем, что указанный металл представляет собой ион платины (Pt) или противораковое лекарственное средство на основе платины, выбранное из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, недаплатина и гептаплатина.

9. Частица производного билирубина по любому из изобретений 1-3, отличающаяся тем, что указанный металл представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный из группы, состоящей из 64Cu, 68Ga, 82Rb, 89Zr, 90Y, 99mTc, 111In и 201TI.

10. Частица производного билирубина по любому из изобретений 1-9, отличающаяся тем, что указанное производное билирубина представляет собой производное, в котором гидрофильная молекула конъюгирована с билирубином.

11. Частица производного билирубина по изобретению 10, отличающаяся тем, что указанная гидрофильная молекула выбрана из группы, состоящей из декстрана, карбодекстрана, полисахарида, циклодекстрана, плюроника, целлюлозы, крахмала, гликогена, углевода, моносахарида, бисахарида и олигосахарида, полифосфагена, полилактида, сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактона, полиангидрида, полималеиновой кислоты и производных полималеиновой кислоты, полиалкилцианоакрилата, полигидроксибутилата, поликарбоната, полиортоэфира, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, полигликолида, полиметакрилата, поливинилпирролидона, полиакрилата, полиакриламида, полимера сложного винилового эфира, полимера винилового спирта, полистирола, полиоксида, полиэлектролита, поли[1-нитропропилена], поли[N-винилпирролидона], поли[виниламина], поли[бета-гидроксиэтилметакрилата], полиэтиленоксида, поли[этиленоксид-b-пропиленоксида], полилизина и пептида.

12. Частица производного билирубина по изобретению 11, отличающаяся тем, что указанная гидрофильная молекула представляет собой полиэтиленгликоль (PEG).

13. Частица производного билирубина по изобретению 12, отличающаяся тем, что указанный PEG выбран из группы, состоящей из метоксиполиэтиленгликоля (PEG), сукцинимида PEG пропионовой кислоты, сукцинимида PEG бутановой кислоты, разветвленного PEG-NHS, сукцинимидилсукцината PEG, сукцинимида карбоксиметилированного PEG, бензотриазолкарбоната PEG, PEG-глицидилового эфира, PEG-оксикарбонилимидазола, PEG-нитрофенилкарбонатов, PEG-^{альдегида}, PEG-сукцинимидилкарбоксиметилового эфира и PEG-сукцинимидилового эфира.

14. Частица производного билирубина по изобретению 12, отличающаяся тем, что средняя молекулярная масса PEG составляет 200-20000 Да.

15. Композиция, содержащая частицы производного билирубина по любому из изобретений 1-9.

16. Композиция по изобретению 15, представляющая собой композицию контрастного агента для диагностики при помощи изображения.

17. Композиция по изобретению 16, отличающаяся тем, что указанная композиция контрастного агента для диагностики при помощи изображения предназначена для магнитно-резонансной (МР) диагностики, диагностике при помощи компьютерной томографии (КТ), диагностики при помощи позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или оптической диагностики.

18. Композиция по изобретению 15, представляющая собой фармацевтическую композицию для лечения рака.

19. Композиция по изобретению 18, отличающаяся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака прямой кишки и рака шейки матки.

20. Композиция по изобретению 15, представляющая собой фармацевтическую композицию для лечения и диагностики воспалительного заболевания.

21. Способ получения частицы производного билирубина, содержащей металл и производное билирубина, включающий стадии:

(а) конъюгирование билирубина с гидрофильной молекулой с получением производного билирубина; и

(b) координирование указанного производного билирубина и металла с получением частицы производного билирубина, содержащей инкапсулированный металл.

22. Способ по изобретению 21, отличающийся тем, что стадия (b) включает в себя следующие стадии:

(b-1) получение частицы, состоящей из указанного производного билирубина; и

(b-2) инкапсулирование указанного металла в указанную частицу, состоящую из указанного производного билирубина.

23. Способ по изобретению 21, отличающийся тем, что на стадии (b) указанное получение указанной частицы, состоящей из указанного производного билирубина, и указанное инкапсулирование указанного металла проводят одновременно.

24. Способ по изобретению 15, отличающийся тем, что указанная композиция предназначена для обнаружения активных форм кислорода (АФК).

25. Способ по изобретению 24, отличающийся тем, что указанная композиция представляет собой композицию контрастного агента.

26. Способ по изобретению 24, отличающийся тем, что указанные активные формы кислорода выбраны из группы, состоящей из супероксида (O^2-), пероксида водорода (H₂O₂), гидроксирадикала (OH), синглетного кислорода (¹O₂), органического гидропероксида (ROOH), алкоксирадикала (RO.), пероксирадикала (ROO.) или озона (O₃) и диоксида азота (NO²).

27. Сенсор для обнаружения активных форм кислорода (АФК), содержащий частицы производного билирубина по любому из изобретений 1-14.

28. Способ обнаружения активных форм кислорода, включающий следующие стадии:

(а) приведение суспензии, содержащей частицы производного билирубина по любому из изобретений 1-13, в контакт с образцом, содержащим активные формы кислорода; и

(b) сравнение и анализ изменения суспензии до и после контакта с образцом с контрольной группой.

29. Способ по изобретению 28, отличающийся тем, что изменение суспензии на стадии (b) выбрано из группы, состоящей из наличия или отсутствия осаждения частиц производного билирубина, поглощения в зависимости от длины волны, прозрачности суспензии, концентрации ионов металлов в суспензии и интенсивности сигнала МРТ-изображения.

30. Способ диагностики при помощи изображения, включающий стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина, по любому из изобретений 1-14.

31. Способ лечения рака, включающий стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина, по любому из изобретений 1-14.

32. Способ лечения и диагностики воспалительного заболевания, включающий стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина, по любому из изобретений 1-14.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к частице производного билирубина, содержащей производное билирубина и металл.

Авторы настоящего изобретения использовали в качестве вдохновляющего примера камни, образующиеся в желчном пузыре, которые представляют собой комплексы, образованные медью (Cu) и билирубином в качестве органического лиганда в организме человека; и авторы стремились разработать наночастицы, которые позволили бы использовать свойство координационного связывания билирубина для различных применений. В результате авторы настоящего изобретения получили следующее: водорастворимые производные билирубина, образованные введением гидрофильных молекул в билирубин; частицы производного билирубина, образованные при самосборке производного билирубина, и подтвердили его хелатирующие эффекты в отношении различных металлов и применимость в качестве контрастных агентов для диагностики при помощи изображения и терапевтических агентов для воспалительных заболеваний и раковых заболеваний.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения частица производного билирубина по настоящему изобретению образует комплекс с металлом при помощи координационной связи с металлом.

В настоящем описании «металлический комплекс» относится к единому атомному телу, образованному за счет трехмерной координации нескольких других ионных молекул или атомных групп с направленностью, сконцентрированной по меньшей мере на одном атоме или ионе металла. В настоящем описании ионные молекулы или атомные группы, координированные с атомом или ионом металла в качестве центра, называют лигандами. В частице производного билирубина по настоящему изобретению производное билирубина представляет собой лиганд, а металл, связывающийся с производным билирубина, является центральным металлом.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения, координационная связь образуется между ионом металла и карбоксильной группой, пиррольным кольцом или лактамной группой производного билирубина.

Участки в молекуле билирубина, на которых может быть образована координационная связь, указаны пунктирными кружками в химической формуле 1 ниже.

[Химическая формула 1]

Согласно варианту реализации настоящего изобретения металл, содержащийся в производном билирубина по настоящему изобретению посредством координационной связи, может представлять собой ион или соединение металла, выбранного из группы, состоящей из Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Mn, Zn, Gd, Mo, Ni, Fe, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra и лантаноидных металлов, но не ограничивается ими.

Согласно определенному варианту реализации настоящего изобретения производное билирубина по настоящему изобретению связывается с различными частицами металла, включая суперпарамагнитную наночастицу оксида железа (SPION, англ. «superparamagnetic iron oxide nanoparticle») и наночастицу золота AuNP.

Как подтверждено приведенным ниже примером, производное билирубина по настоящему изобретению связывается с суперпарамагнитной наночастицей оксида железа (SPION) с образованием наночастицы (фиг. 6a-6c), и такие связанные с SPION частицы производного билирубина демонстрировали превосходную релаксивность по сравнению с Феридексом (Feridex), существующим Т2-взвешенным контрастным агентом, клинически используемым для МР, таким образом, его успешно можно применять для в качестве контрастного агента для усиления контрастности МРТ (фиг. 7).

Согласно варианту реализации настоящего изобретения частицы производного билирубина по настоящему изобретению могут поглощать активные формы кислорода. Как подтверждено приведенным ниже примером, частица производного билирубина по настоящему изобретению, содержащая SPION, агрегирует в ответ на обработку гипохлоритом в качестве генератора активных форм кислорода (АФК) (фиг. 8) и, таким образом, ее можно применять для лечения воспаления путем поглощения активных форм кислорода в ткани воспаления.

Следовательно, частицы производного билирубина по настоящему изобретению также можно выгодно применять в качестве фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания.

Кроме того, частицы производного билирубина по настоящему изобретению также можно выгодно применять в качестве фармацевтической композиции для лечения ракового заболевания или ангиогенного заболевания благодаря противораковому действию и ангиогенному ингибирующему действию частиц производного билирубина как таковых, как описано в патенте Республики Корея № 10-1681299.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения частицу производного билирубина получают в форме, в которой указанный металл расположен в центре, а указанное производное билирубина окружает указанный металл.

В соответствии с определенным вариантом реализации настоящего изобретения частицу производного билирубина, содержащую металл, по настоящему изобретению можно получить в двух различных формах частиц: в форме кластеризованных металлических частиц, где несколько металлических частиц образуют кластер; и в форме однородных металлических частиц, где соответствующие металлические частицы равномерно распределены.

Как подтверждено приведенным ниже примером, авторы настоящего изобретения применили для конфигурации наночастиц оксида железа, покрытых PEG-билирубином два метода для исследования того, можно ли получать частицы производного билирубина по настоящему изобретению в указанных двух формах. В результате авторы настоящего изобретения с помощью ПЭМ-изображений подтвердили, что два типа частиц были успешно получены с использованием оболочек из PEG-билирубина (фиг. 6с).

Согласно определенному варианту реализации настоящего изобретения металл, включенный в частицу производного билирубина по настоящему изобретению, представляет собой противораковое лекарственное средство на основе платины, выбранное из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, недаплатина и гептаплатина. Как подтверждено приведенным ниже примером, в частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно эффективно загружать цисплатин (фиг. 15). Ожидаемая форма связывания между цисплатином и частицей производного билирубина по настоящему изобретению показана на фиг. 16.

В соответствии с определенным вариантом реализации настоящего изобретения частица производного билирубина, содержащая противораковое лекарственное средство на основе платины по настоящему изобретению, может высвобождать загруженное противораковое лекарственное средство в окружающую среду при стимуляции светом, активными формами кислорода или кислотным рН (фиг. 17а и 17b).

Следовательно, частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно применять в качестве активного ингредиента для лечения рака благодаря вышеупомянутым противораковым/ангиогенным ингибирующим действиям самого производного билирубина, а также характеристикам загрузки и высвобождения противоракового лекарственного средства на основе платины в производном билирубина.

Используемый в настоящем документе термин «производное билирубина» относится к гидрофильному или амфифильному соединению, образованному при конъюгировании билирубина с гидрофильной молекулой. Производное билирубина по настоящему изобретению образует координационную связь с металлическим компонентом с получением частицы производного билирубина по настоящему изобретению.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения гидрофильная молекула конъюгирована с карбоксильной группой билирубина с получением гидрофильного или амфифильного производного билирубина (см.: Amphiphiles: Molecular Assembly and Applications (ACS Symposium Series) 1st Edition by Ramanathan Nagarajan and Various Self-Assembly Behaviors of Amphiphilic Molecules in Ionic Liquids By Bin Dong and Yanan Gao, DOI:10.5772/59095). Карбоксильная группа билирубина конъюгируется с аминогруппой гидрофильной молекулы посредством конъюгации амина (например, реакция EDC/NHS) или гидроксильной группой гидрофильной молекулы посредством реакции этерификации. (см.: Conjugated Chitosan as a Novel Platform for Oral Delivery of Paclitaxel, Lee et al., J. Med. Chem., 2008, 51 (20), p.6442-6449, DOI: 10.1021/jm800767c). Билирубин, с которым конъюгирована гидрофильная молекула, обладает амфифильными свойствами и является растворимым в водном растворителе и, таким образом, пригоден для химической обработки, и такой билирубин самопроизвольно самособирается с получением частицы и, следовательно, его можно применять как для гидрофобных, так и для гидрофильных составов. В примере настоящего изобретения авторы настоящего изобретения получили пегилированный билирубин (PEG-BR, PEG-билирубин) в виде производного билирубина в соответствии с настоящим изобретением посредством простого взаимодействия, в котором амидная связь образуется у соли карбоновой кислоты, с использованием полиэтиленгликоля (PEG, ПЭГ) в виде гидрофильного соединения.

Примеры гидрофильной молекулы, которую можно применять в настоящем изобретении, могут включать декстран, карбодекстран, полисахарид, циклодекстран, плюроник, целлюлозу, крахмал, гликоген, углевод, моносахарид, бисахарид и олигосахарид, полифосфаген, полилактид, сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, полиангидрид, полималеиновую кислоту и производные полималеиновой кислоты, полиалкилцианоакрилат, полигидроксибутилат, поликарбонат, полиортоэфир, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиэтиленимин, поли-L-лизин, полигликолид, полиметакрилат, поливинилпирролидон, полиакрилат, полиакриламид, полимер сложного винилового эфира, полимер винилового спирта, полистирол, полиоксид, полиэлектролит, поли[1-нитропропилен], поли[N-винилпирролидон], поли[виниламин], поли[бета-гидроксиэтилметакрилат], полиэтиленоксид, поли[этиленоксид-b-пропиленоксид], полилизин и пептид.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный гидрофильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль или его производное. Примеры производного полиэтиленгликоля могут включать метоксиполиэтиленгликоль (PEG), сукцинимид PEG пропионовой кислоты, сукцинимид PEG бутановой кислоты, разветвленный PEG-NHS, сукцинимидилсукцинат PEG, сукцинимид карбоксиметилированного PEG, бензотриазолкарбонат PEG, PEG-глицидиловый эфир, PEG-оксикарбонилимидазол, PEG-нитрофенилкарбонаты, PEG-альдегид, PEG-сукцинимидилкарбоксиметиловый эфир и PEG-сукцинимидиловый эфир (см.: PEGylated polymers for medicine: from conjugation to self-assembled systems, Jorlemon et al., Chem. Commun., 2010, 46, 1377-1393).

Согласно определенному варианту реализации настоящего изобретения средняя масса молекулы полиэтиленгликоля составляет 200-20000 Да.

Еще один пример гидрофильного полимера, применяемого в настоящем изобретении, может включать пептид, состоящий из двух или более (например, 2-50) аминокислот. Указанные аминокислоты могут включать природные аминокислоты и неприродные аминокислоты. Гидрофильные аминокислоты включают глутамин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, треонин, аспарагин, аргинин и серин, а гидрофобные аминокислоты включают фенилаланин, триптофан, изолейцин, лейцин, пролин, метионин, валин и аланин. Примеры некодированной гидрофильной аминокислоты могут включать Cit и hCys. Специалист в данной области может легко синтезировать гидрофильные пептиды, основываясь на этой информации и методах синтеза пептидов, для применения гидрофильных пептидов для получения наночастиц билирубина.

Гидрофильный полимер включает не только вышеупомянутые полимеры, но также их производные. Более конкретно, гидрофильные молекулы могут содержать аминогруппу или гидроксильную группу или могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать аминогруппу или гидроксильную группу. Специалисту в данной области будет очевидно, что карбоксильная группа билирубина по настоящему изобретению очень легко может быть конъюгирована с аминогруппой гидрофильных молекул через амидную группу или с гидроксильной группой посредством реакции этерификации.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к контрастному агенту для диагностики при помощи изображения, содержащему частицы производного билирубина, содержащие металл.

В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения указанный контрастный агент для диагностики при помощи изображения можно применять для диагностики при помощи магнитного резонанса (МР), диагностики при помощи компьютерной томографии (КТ), диагностики при помощи позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или оптической диагностики.

Применение для оптической диагностики согласно настоящему изобретению включает фотоакустическую диагностику и способ диагностики (применение) при помощи флуоресцентного изображения. Фотоакустический диагноз был подтвержден примером настоящего изобретения путем связывания метала цисплатина с производным билирубина. Для флуоресцентного изображения используются свойства флуоресценции лантаноидных металлов, таких как Eu (III) и Tb (III). Волновой диапазон флуоресценции или интенсивность у лантаноидных металлов контролируются путем связывания производного билирубина с лантаноидными металлами, так что визуализация возможна путем обнаружения флуоресценции, испускаемой лантаноидными металлами.

В частности, частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно применять для радионуклидного сканирования (⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹mTc, ¹¹¹In и ²⁰¹TI), МРТ (Gd, Mn и Fe) и компьютерной томографии (Au) путем введения различных ионов металлов в производные билирубина без внешних линкеров. В частности, в обычных контрастных агентах, используемых в магнитно-резонансной томографии или компьютерной томографии, манипуляции с лигандами производят при помощи внешних линкеров, в то время как производные билирубина по настоящему изобретению могут быстро и эффективно связываться с металлами без отдельных линкеров.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и диагностики рака, содержащей указанные частицы производного билирубина, содержащие металл.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный рак может представлять собой рак желудка, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак печени, рак бронхов, рак носоглотки, рак гортани, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, рак прямой кишки и рак шейки матки.

Частицы производного билирубина по настоящему изобретению проявляют антиангиогенную активность и, следовательно, их можно применять для предотвращения и лечения рака. В частности, когда частицы производного билирубина, в которые загружено противоопухолевое лекарственное средство на основе платины, такое как цисплатин, вводят в организм, указанные частицы производного билирубина накапливаются в опухолевой ткани благодаря эффекту EPR. Когда опухолевую ткань облучают внешним светом, гидрофобный слой билирубина превращается в гидрофильный слой, содержащий гидрофильный фотоизомер, что приводит к разборке (разрушению) наночастиц, и, таким образом, противораковое лекарственное средство, содержащееся в наночастицах, высвобождается в опухолевую ткань, что обеспечивает лечение рака. В то же время, мономеры, выделяющиеся из наночастиц, связываются с альбумином, и, таким образом, в опухолевой ткани возникает флуоресценция, что позволяет получать изображения опухолевой ткани при помощи флуоресценции.

Как подтверждено в приведенном ниже примере, производные билирубина по настоящему изобретению эффективно образуют координационные комплексы с ⁶⁴Cu, суперпарамагнитной наночастицей оксида железа (SPION), наночастицей золота (GNP, англ. «gold nanoparticle»), ионом металла, такого как Ni, Mn, Gd, Mg, Ca и Fe, и противораковым лекарственным средством на основе платины и, таким образом, производные билирубина могут образовывать хелаты с различными металлами и могут иметь различные применения (фиг. 5a и 5b).

Между тем, частицы производного билирубина по настоящему изобретению избирательно накапливаются в опухолевых тканях и производят фототермический эффект за счет сильного нагрева при облучении с заданной длиной волны света и, таким образом, их можно применять при лечении раковых заболеваний.

Как показано в примере ниже, авторы настоящего изобретения впервые применили частицы производного билирубина с цисплатином для фотоакустической визуализации in vivo модели ксенотрансплантата опухоли у мышей, и в результате было подтверждено, что фотоакустический сигнал постепенно увеличивался после внутривенной инъекции (фиг. 18), и температура поверхности опухоли быстро повышалась до 55-60°С в течение 5 минут после воздействия света 808 нм, так что частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно применять для фотоакустической визуализации, а также для фототермотерапии (ФТТ) (фиг. 19).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и диагностики воспалительного заболевания, содержащей указанные частицы производного билирубина, содержащие металл.

Наночастицы билирубина по настоящему изобретению можно применять в качестве АФК-чувствительного материала для диагностики и лечения воспалительных заболеваний. В частности, частицы производного билирубина, которые парентерально вводят в организм, могут воздействовать на участок воспаления за счет эффекта EPR.

Кроме того, частицы производного билирубина могут поглощать аномальные уровни активных форм кислорода в месте воспаления, тем самым проявляя противовоспалительную активность, и, таким образом, могут лечить воспаление.

Примеры воспалительного заболевания, для которых можно применять настоящее изобретение, могут включать воспалительное заболевание кишечника, атопический дерматит, отек, дерматит, аллергию, астму, конъюнктивит, периодонтит, ринит, средний отит, атеросклероз, фаринголарингит, тонзиллит, пневмонию, язву желудка, гастрит, болезнь Крона, колит, геморрой, подагру, анкилозирующий спондилоартрит, ревматическую лихорадку, волчанку, фибромиалгию, псориатический артрит, остеоартрит, ревматоидный артрит, периартрит плеча, тендинит, тендосиновит, миозит, гепатит, цистит, нефрит, синдром Шегрена и рассеянный склероз, но не ограничиваясь этим.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения частица производного билирубина по настоящему изобретению может быть скоордин6ирована с ионом металла. Скоординированная с ионом металла частица производного билирубина по настоящему изобретению вступает в реакцию с активными формами кислорода, такими как гипохлорит, что приводит к разрушению частицы и высвобождению иона металла. Согласно определенному варианту реализации настоящего изобретения частица производного билирубина, скоординированная с ионом марганца (Mg²⁺), взаимодействует с активными формами кислорода, такими как гипохлорит, тем самым повторно высвобождая ионы марганца. Следовательно, изменение значения T1 иона марганца на изображениях, полученных при помощи магнитного резонанса, когда ион марганца координируется производным билирубина, и когда ион марганца высвобожден, приводит к изменению яркости изображений МРТ, что позволяет обнаружить активные формы кислорода.

Композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию и содержит фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель обычно используется во время приготовления, и его примеры могут включать, но не ограничиваются ими, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, камедь акации, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазывающий агент, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и тому подобное, в дополнение к вышеуказанным ингредиентам.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять посредством парентерального введения, которое может представлять собой, например, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, подкожное введение или местное введение. Кроме того, возможно пероральное введение, ректальное введение, ингаляционное введение, интраназальное введение или тому подобное.

Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от таких факторов, как способ приготовления, форма введения, возраст пациента, масса тела, пол, серьезность заболевания, рацион, время введения, способ введения, скорость выведения и чувствительность к ответу, и обычный специалист может легко определить и назначить дозу, эффективную для желаемого лечения или предотвращения.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества в соответствии со способом, который легко может осуществить специалист в данной области, к которой относится настоящее изобретение, и композицию по настоящему изобретению можно приготовить в виде единичной дозированной формы или ее можно помещать в контейнер, содержащий несколько доз. В настоящем документе лекарственная форма может представлять собой раствор, суспензию или эмульсию в масляной или водной среде и может дополнительно содержать диспергирующий агент или стабилизатор.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения частицы производного билирубина, содержащей металл и производное билирубина, причем указанный способ включает стадии:

(а) конъюгирование билирубина с гидрофильной молекулой с получением производного билирубина; и

(b) координирование указанного производного билирубина и металла с получением частицы производного билирубина, содержащей инкапсулированный металл.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения стадия (b) может включать в себя следующие стадии:

(b-1) получение частиц, состоящих из указанного производного билирубина; и

(b-2) инкапсулирование указанного металла в указанную частицу, состоящую из указанного производного билирубина.

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения получение частицы, состоящей из производного билирубина, и капсулирование металла можно выполнять одновременно на стадии (b).

Ниже будет поэтапно списан способ получения частиц, содержащих производное билирубина и металл по настоящему изобретению.

(а) Конъюгирование билирубина с гидрофильной молекулой с получением производного билирубина.

Билирубин конъюгируют с гидрофильной молекулой с получением гидрофильного или амфифильного билирубина. В частности, карбоксильные группы билирубина активируются с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) или EDC/NHS и осуществляется конъюгирование билирубина с гидрофильной молекулой, содержащей аминогруппу (-NH₂), через амидную связь. Гидрофильная молекула, конъюгированная с билирубином, содержит описанные выше гидрофильные молекулы и может содержать аминогруппу или ее можно модифицировать так, чтобы она содержала аминогруппу.

Также карбоксильная группа билирубина конъюгируется посредством этерификации с гидроксильной группой гидрофильной молекулы.

В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения билирубин растворяют в органическом растворителе (например, диметилсульфоксиде (ДМСО)), и для активации карбоксильной группы билирубина для желаемого взаимодействия добавляют EDC с последующим взаимодействием в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого добавляют гидрофильную молекулу, содержащую на конце аминогруппу (например, полиэтиленгликоль), с последующим взаимодействием в течение некоторого времени с получением конъюгированного с гидрофильной молекулой производного билирубина. Наконец, конечное производное билирубина, содержащее амидную связь, образованную в результате взаимодействия между карбоксильной группой и аминной группой, чисто отделяют и экстрагируют из побочного продукта при помощи колонки с диоксидом кремния.

(b) Координирование указанного производного билирубина и металла с получением частицы производного билирубина, содержащей инкапсулированный металл.

На данной стадии получают пригодные к употреблению формы наночастиц путем индуцирования координационного связывания амфифильного производного билирубина (например, ПЭГилированного билирубина), экстрагированного на стадии (а), с различными металлическими частицами или ионами металла. Следующий определенный способ получения приведен только для иллюстрации, но не ограничивает объем настоящего изобретения.

(b-1) Получение наночастицы билирубина, состоящей из производного билирубина.

В частности, конъюгированное с гидрофильной молекулой амфифильное производное билирубина растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ или диметилсульфоксид, с последующей сушкой в газообразном азоте, чтобы тем самым получить слой липидной пленки. После этого полученный слой липидной пленки производного билирубина гидратируют водным раствором, чтобы тем самым получить самособирающиеся наночастицы билирубина.

(b-2) Инкапсулирование металлической частицы или иона металла в частицу, состоящую из производного билирубина.

Когда различные водные растворы металлических частиц или ионов металла смешивают для взаимодействия с водным раствором наночастиц билирубина, полученных на стадии (b-1), желаемые металлы инкапсулируются в производные билирубина или образуются комплексы без других добавок, таких как хелаторы или линкеры. Непрореагировавшие ионы металлов и тому подобное можно удалить с помощью колонки для исключения по размеру или диализа, что в конечном итоге приводит к получению желаемых продуктов реакции.

Стадия инкапсулирования металла в частицу производного билирубина по настоящему изобретению (b-2) можно осуществлять одновременно со стадией получения наночастицы билирубина, состоящей из производного билирубина (b-1).

То есть, вместо гидратации слоя липидной пленки производного билирубина водным раствором с получением наночастиц билирубина (стадия (b-1)) и последующего смешивания с ними водного раствора ионов металлов (стадия (b-2)), слой липидной пленки производного билирубина непосредственно смешивают и гидратируют водным раствором ионов металлов, так что ион металла инкапсулируется в частицу производного билирубина, как в случае, когда стадии (b-1) и (b-2) выполняют последовательно. Однако превосходной эффективности инкапсуляции ионов металлов можно достичь в том случае, когда при последовательном выполнении стадий (b-1) и (b-2) получают водный раствор наночастиц билирубина, а затем смешивают с ним водный раствор ионов металлов с получением комплекса.

Способ покрытия металлических наночастиц (например, наночастиц железа, наночастиц золота и т. д.) производным билирубина требует несколько иной процедуры, чем метод инкапсуляции ионов металлов.

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения можно получить частицу, в которой ион металла покрыт одним слоем производного билирубина по настоящему изобретению.

В частности, что касается способа покрытия наночастиц железа одним слоем производного билирубина, в водный раствор наночастиц билирубина, полученных на этапе (b), добавляют гексановый раствор, содержащий растворенные в нем наночастицы железа (SPION), с получением поверхности раздела между водным слоем и слоем органического растворителя, а затем поверхность раздела подвергают воздействию искусственного давления, используя ультразвуковой аппарат для смешивания двух слоев, так что слой олеиновой кислоты, который первоначально был нанесен на наночастицы железа (SPION), отделяют методом обмена лигандов, и вместо этого наночастицы золота покрываются посредством реакции хелатирования карбоксильной группы производного билирубина (например, пегилированного билирубина) с центральной частью наночастицы железа (SPION).

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения можно получить частицу, в которой кластеризованные металлические частицы покрыты производным билирубина по настоящему изобретению.

В частности, производное билирубина (например, пегилированный билирубин), растворенное в органическом растворителе (например, хлороформе), смешивают с SPION, растворенными в метаноле, и затем органический растворитель сушат в газообразном азоте с получением слоя липидной пленки. Образующийся слой липидной пленки гидратируется с образованием кластерной формы SPION.

После вышеуказанных процедур можно выделить чистые SPION в качестве конечного продукта реакции с помощью метода выделения с помощью магнита.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения, что касается способа покрытия наночастиц золота производным билирубина, производное билирубина, полученное на стадии (а), растворяют в воде, но не в органическом растворителе, с последующим прямым взаимодействием с водным раствором, содержащим растворенные наночастицы золота, в течение заданного периода времени. Подобно покрытию SPION, наночастицу золота покрывают производным билирубина вместо цитрата, первоначально нанесенного на наночастицу золота.

Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для обнаружения активных форм кислорода (АФК), содержащей частицы производного билирубина по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем документе термин «активные формы кислорода» относится к различным формам кислорода, которые являются более реакционноспособными и имеют более высокую активность по сравнению с обычно присутствующим триплетным кислородом в основном состоянии (³O₂).

Согласно варианту реализации настоящего изобретения активные формы кислорода включают супероксид (O^2-), пероксид водорода (H₂O₂), гидроксирадикал (OH) и синглетный кислород (¹O₂). Кроме того, активные формы кислорода включают органический гидропероксид (RCOO), алкоксирадикал (RO), пероксирадикал (ROO.) или озон (O₃) и диоксид азота (NO₂).

Другой аспект настоящего изобретения относится к сенсору для обнаружения активных форм кислорода (АФК), содержащему частицы производного билирубина по настоящему изобретению.

В соответствии с определенным вариантом реализации настоящего изобретения сенсор для обнаружения конкретно не ограничен и может представлять собой любое устройство, которое может обнаруживать физико-химическое изменение, обусловленное контактом между частицами производного билирубина по настоящему изобретению и активными формами кислорода, и может применяться в данной области техники, как описано ниже.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу обнаружения активных форм кислорода, включающему:

(а) приведение суспензии, содержащей частицы производного билирубина по настоящему изобретению в контакт с образцом, содержащим активные формы кислорода; и

(b) сравнение и анализ изменения суспензии до и после контакта с образцом с контрольной группой.

Способ обнаружения активных форм кислорода по настоящему изобретению будет описан постадийно.

(а) Приведение суспензии, содержащей частицы производного билирубина по настоящему изобретению, в контакт с образцом, содержащим активные формы кислорода.

На этой стадии суспензию, содержащую частицы производного билирубина по настоящему изобретению, приводят в контакт с образцом, в котором необходимо провести обнаружение активных форм кислорода, чтобы произошло взаимодействие между частицами производных билирубина в суспензии и активными формами кислорода. Производное билирубина по настоящему изобретению вступает во взаимодействие с активными формами кислорода. Следовательно, когда производное билирубина в суспензии приводят в контакт с активными формами кислорода в образце, указанное производное билирубина, образующее оболочку металлической частицы, отделяется от указанной металлической частицы вследствие взаимодействия производного билирубина с активными формами кислорода. В результате гидрофобные металлические частицы встречаются друг с другом с образованием агрегата или осадка.

В настоящем документе образец включает, но не ограничивается ими, мочу человека или животных, слюну, кровь (плазму, сыворотку, клетки крови) и ткани (поврежденные ткани, такие как печень, поджелудочная железа и кожа). Образец также включает другие вещества, такие как раствор, содержащий соединение, генерирующее активные формы кислорода.

(b) Сравнение и анализ изменения суспензии до и после контакта с образцом с контрольной группой.

На этой стадии сравнивают изменение суспензии, возникшее в результате взаимодействия производного билирубина с активными формами кислорода в образце, и анализируют в сравнении с контрольной группой. Под контрольной группой подразумевают изменения суспензии в соответствии с видом и концентрацией активных форм кислорода, при этом указанные изменения i) были измерены ранее или ii) измеряются одновременно со стадией (а) для разных видов и различных концентраций активных форм кислорода.

В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения изменение суспензии на стадии (b) включает присутствие или отсутствие осаждения частиц производного билирубина, поглощение в зависимости от длины волны, прозрачность суспензии, концентрацию ионов металла в суспензии и интенсивность сигнала МР-изображения, но не ограничивается этим.

В способе по настоящему изобретению обычно применяют описанные выше частицы производного билирубина по настоящему изобретению и композицию или устройство, содержащие указанные частицы, и, таким образом, перекрывающиеся описания опущены, чтобы избежать чрезмерного усложнения настоящего описания.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу диагностики при помощи изображения, включающему стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения рака, включающему стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и диагностики воспалительного заболевания, включающему стадию введения субъекту композиции, содержащей частицы производного билирубина.

Используемый в настоящем документе термин «введение» или «вводить» относится к прямому введению терапевтически или диагностически эффективного количества композиции по настоящему изобретению субъекту (объекту), нуждающемуся в указанной композиции, таким образом, такое же количество композиции оказывается в теле субъекта.

Термин «терапевтически эффективное количество» композиции относится к содержанию композиции, которое является достаточным для оказания терапевтического или профилактического эффекта на субъект, которому будет введена композиция, и, таким образом, термин имеет значение, включающее «профилактически эффективное количество». Термин «диагностически эффективное количество» указанной композиции относится к содержанию композиции, которое является достаточным для обеспечения диагностического эффекта у субъекта, которому будет введена композиция.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» включает, но не ограничивается ими, людей, мышей, крыс, морских свинок, собак, кошек, лошадей, коров, свиней, обезьян, шимпанзе, бабуинов или макак-резусов. В частности, субъектом настоящего изобретения является человек.

Способ диагностики при помощи изображения, способ лечения рака и способ лечения и диагностики воспалительного заболевания по настоящему изобретению включают стадию введения композиции по каждому назначению, при этом указанная композиция содержит частицы производного билирубина в соответствии с аспектом изобретения, и, таким образом, перекрывающиеся описания для различных аспектов опущены, чтобы избежать чрезмерного усложнения настоящего документа из-за повторяющихся описаний.

Полезные эффекты

Ниже приведено обобщение особенностей и полезных эффектов настоящего изобретения.

(i) Настоящее изобретение относится к частицам гидрофильного производного билирубина, содержащим металл, их применению и способу их получения.

(ii) Частицы производного билирубина согласно настоящему изобретению образуют координационные связи с различными металлами и таким образом их можно применять в МР-диагностике, КТ-диагностике, фотоакустической диагностике, ПЭТ-диагностике или оптической диагностике.

(iii) Частицы производного билирубина по настоящему изобретению помимо диагностического применения, проявляют противовоспалительную активность и противораковую активность, обусловленную антиоксидантной активностью и противоопухолевой активностью самого билирубина, и, таким образом, воплощают концепцию тераностики, согласно которой частицы производного билирубин можно применять в терапевтических целях для лечения как воспалительных, так и раковых заболеваний.

(iv) Наночастицы билирубина по настоящему изобретению разлагаются под воздействием легких или активных форм кислорода с высвобождением заключенного в них лекарственного средства.

Кроме того, частицы производного билирубина по настоящему изобретению вступают во взаимодействие с активными формами кислорода и, таким образом, их можно применять в качестве композиции, сенсора, набора, контрастного агента или устройства для определения типа и концентрации активных форм кислорода.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 показаны примеры применения частиц производного билирубина по настоящему изобретению.

На фиг. 2 показана процедура получения частиц производного билирубина по настоящему изобретению и процедура мечения при помощи радиоактивного изотопа ⁶⁴Cu для применения в ПЭТ-визуализации.

На фиг. 3 показана эффективность мечения при определенных значениях pH и температуры для исследования условий реакции для оптимизации эффективности радиоактивного мечения.

На фиг. 4 показаны репрезентативные микро-ПЭТ изображения опухолей PC-3 у мышей (желтые стрелки) через 1, 3 и 6 часов после внутривенного введения частиц ⁶⁴Cu-билирубина (осевые изображения на верхней панели и коронарные изображения на нижней панели).

Фиг. 5a иллюстрирует колориметрическое измерение реакции PEG-билирубина и ионов металлов, приведены изображения суспензии частиц билирубина до (верхняя панель) и после (нижняя панель) реакции с определенными ионами металлов.

Фиг. 5b иллюстрирует колориметрическое измерение реакции PEG-билирубина и ионов металлов, приведены УФ/Видимая область спектры для суспензии частиц билирубина до и после взаимодействия с определенными ионами металлов.

На фиг.6а показано получение МР-зонда на основе оксида железа с применением PEG-билирубина. (1) В способе с липидной пленкой (левая сторона) частицы производного билирубина, содержащие инкапсулированный в них металл, по настоящему изобретению, получают таким образом, что кластеризованный оксид железа располагается в центре, а слой PEG-билирубина окружает указанный оксид железа. (2) В способе обработки ультразвуком (правая сторона) получают однородные наночастицы оксида железа, покрытые слоем PEG-билирубина.

На фиг. 6b показан принцип координационного связывания PEG-билирубина и суперпарамагнитного оксида железа.

На фиг.6с представлены репрезентативные ПЭМ изображения, показывающие наночастицы кластеризованного оксида железа с оболочкой из PEG-билирубина (левая сторона) и наночастицы равномерно распределенного оксида железа с оболочками из PEG-билирубина (правая сторона).

На фиг.7 приведены свойства SPION, покрытых PEG-билирубином, и представлены Т2-взвешенные фантомные МР-изображения SPION с покрытием PEG-билирубина в водном растворе и скорость релаксации Т2 как функция концентрации ионов.

На фиг. 8 приведены признаки SPION с покрытием PEG-билирубина и представлены ПЭМ-изображения SPION с покрытием PEG-билирубина, до и после стимуляции АФК.

На фиг.9а приведены признаки SPION с покрытием PEG-билирубина и представлены последовательные фантомные МР-изображения АФК-чувствительности в зависимости от концентрации АФК для SPION с покрытием PEG-билирубина.

На фиг.9b приведены признаки SPION с покрытием PEG-билирубина и представлен график изменения величины Т2 релаксации в зависимости от концентрации АФК в SPION с покрытием PEG-билирубина.

На фиг. 10 приведен уровень экспрессии гена Nox2 макрофагов, измеренный с помощью RT_qPCR.

На фиг. 11a приведены результаты наблюдения с помощью оптического микроскопа уровня фагоцитоза макрофагов в группах, обработанных SPION с покрытием PION-DSPE и SPION с покрытием PEG-BR, в условиях производства АФК.

На фиг.11b показано сравнение в фантомном МРТ эксперименте уровня фагоцитоза макрофагов в группах, обработанных SPION с покрытием PION-DSPE и SPION с покрытием PEG-BR, нацеленных на макрофаги, собранные из брюшной полости мыши.

На фиг. 12 показано, что, когда наночастицы золота с покрытием PEG-BR вступают во взаимодействие с активными формами кислорода, покрытие PEG-BR отслаивается, что приводит к агрегации наночастиц золота, тем самым вызывая мощный фототермический эффект в ближней инфракрасной (NIR) области.

На фиг. 13 показаны результаты компьютерной томографии мышей с применением наночастиц золота с покрытием PEG-BR.

На фиг. 14 показано отрицательно окрашенное ПЭМ изображение частиц билирубина, загруженных цисплатином.

На фиг. 15 показано хелатирование цисплатина и приведено изображение суспензий (левая сторона) и график УФ/Vis спектров (правая сторона) частиц билирубина (BRNP) и частиц билирубина, вступающих во взаимодействие с цисплатином (BRNP + цисплатин).

На фиг. 16 показан предполагаемый механизм взаимодействия частицы PEG-билирубина и цисплатина.

На фиг. 17a и 17b показаны схемы высвобождения цисплатина в разных условиях (pH и АФК) в зависимости от времени в частицах PEG-билирубина с инкапсулированным цисплатином.

На фиг. 18 показаны фотоакустические изображения in vivo с течением времени после инъекции в ксенотрансплантат опухоли голой мыши и полуколичественный анализ значений пикселей в соответствующей опухоли.

На фиг. 19 показаны инфракрасные тепловые изображения в разные промежутки времени мыши с ксенотрансплантатом опухоли, подвергшейся воздействию ближнего инфракрасного (NIR) лазера с выходной мощностью 800 мВт/см².

На фиг. 20 и 21 показаны результаты наблюдения в период, когда частицы ПЭГ-билирубина с инкапсулированным цисплатином инъецировали в ксенотрансплантата опухоли голой мыши, а затем проводили фототермическую терапию на голой мыши с использованием света.

На фиг. 22 показано изменение водного раствора наночастиц железа, покрытых пегилированным билирубином, согласно настоящему изобретению в зависимости от концентрации активных форм кислорода.

На фиг. 23 показано изменение водного раствора наночастиц железа, - покрытых пегилированным билирубином, согласно настоящему изобретению в зависимости от концентрации NaOCl в качестве активных форм кислорода.

На фиг. 24 показано изменение водного раствора наночастиц железа покрытых пегилированным билирубином, согласно настоящему изобретению в зависимости от концентрации 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (AAPH) в качестве активных форм кислорода.

На фиг. 25 показано изменение водного раствора наночастиц железа покрытых пегилированным билирубином, согласно настоящему изобретению в зависимости от концентрации воды с перекисью водорода в качестве активных форм кислорода.

На фиг. 26 показаны видимые изменения водного раствора наночастиц золота, покрытых пегилированным билирубином (PEG-BR GNP) по настоящему изобретению до и после взаимодействия с соответствующими типами активных форм кислорода (H₂O₂, NaOCl и AAPH).

На фиг. 27 показаны изменения поглощения водного раствора наночастиц золота, покрытых пегилированным билирубином (наночастицы золота с PEG-билирубином) по настоящему изобретению до и после взаимодействия с соответствующими типами активных форм кислорода (H₂O₂, NaOCl и AAPH).

На фиг. 28 показаны изменения поглощения водного раствора наночастиц золота, покрытых пегилированным тиолом, в качестве контрольной группы для PEG-илированного билирубина по настоящему изобретению до и после взаимодействия с соответствующими типами активных форм кислорода (H₂O₂, NaOCl и AAPH).

На фиг. 29 приведена принципиальная схема частицы производного билирубина, полученной координацией с ионами марганца (Mn2⁺).

На фиг. 30 показан процесс получения наночастиц производного билирубина, координированного с ионом марганца (Mn²⁺) в качестве парамагнитного элемента для применения в МРТ-визуализации. PEG-билирубин используется для получения наночастиц, которые затем смешивают с ионами марганца, чтобы получить частицы, координированные ионами марганца.

На фиг. 31 представлено схематическое изображение, показывающее, что частицы по настоящему изобретению, содержащие производное билирубина и металл, могут обнаруживать или диагностировать активные формы кислорода. В частности, когда координированное ионом марганца производное билирубина вступает во взаимодействие с активными формами кислорода, гидрофобный билирубин превращается в гидрофильный биливердин или разлагается на фрагменты билирубина, что приводит к ослаблению связывания и разрушению наночастиц. В результате координированные ионы марганца отделяются, что приводит к улучшению изображения МРТ.

На фиг. 32 приведена схема, в которой частицы производного билирубина, координированного ионами марганца, высвобождают ионы марганца при стимуляции активными формами кислорода.

На фиг. 33 приведены ПЭМ изображения до и после того, как наночастицы производного билирубина (PEG-BR), координированного иона марганца, были обработаны гипохлоритом в качестве генератора активных форм кислорода.

На фиг. 34 приведены T1-взвешенные МРТ изображения до и после обработки наночастиц билирубина, координированного ионами марганца, активными формами кислорода (гипохлоритом).

Режим осуществления настоящего изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры. Эти примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение частиц производного билирубина (PEG-BR) по настоящему изобретению

1-1. Получение производного билирубина (PEG-BR)

Авторы настоящего изобретения получили производное билирубина, в котором полиэтиленгликоль в качестве гидрофильной молекулы конъюгирован с билирубином, в качестве предварительной стадии получения частиц производного билирубина, содержащих билирубин и металл, с использованием комплексообразующего эффекта билирубина.

Сначала билирубин растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), а затем, чтобы активировать карбоксильную группу, присутствующую в билирубине, чтобы вызвать желаемое взаимодействие, добавляли соответствующее количество 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) с последующим взаимодействием при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли полиэтиленгликоль, содержащий на конце аминогруппу, с последующим взаимодействием в течение заданного периода времени, с получением производного билирубина, в котором карбоксильная группа билирубина конъюгирована с аминогруппой полиэтиленгликоля через амидную связь. Наконец, выделяли окончательно полученное производное билирубина и извлекали из побочных продуктов при помощи колонки с диоксидом кремния.

1-2. Получение частиц производного билирубина (PEG-BR)

Конъюгированное с полиэтиленгликолем амфифильное производное билирубина, которое было получено в примере 1-1 выше, растворяли в органическом растворителе, таком как хлороформ или диметилсульфоксид, с последующей сушкой в условиях газообразного азота с получением слоя липидной пленки. Полученный слой липидной пленки производного билирубина гидратировали водным раствором с получением самособирающихся частиц билирубина, растворенных в водном растворе.

Пример 2: Получение частиц производного билирубина, содержащих металл (ион металла) по настоящему изобретению -1

2-1. Получение частиц производного билирубина, содержащих ион ⁶⁴Cu в качестве радиоактивного изотопа, и их ПЭТ-визуализация in vivo

Чтобы исследовать эффект инкапсуляции ионов металлов частицами производного билирубина по настоящему изобретению, был проведен следующий эксперимент. Водный раствор небольшого количества соединения с радиоактивным изотопом ⁶⁴CuCl₂, применяемым при диагностике при помощи ПЭТ-изображения, смешивали с водным раствором частиц производного билирубина, приготовленного в примере 1, без отдельных добавок. Затем очень интенсивно и быстро происходило взаимодействие с загрузкой ионов ⁶⁴Сu, время взаимодействия составляло всего примерно 30 минут (фиг. 2).

Кроме того, чтобы исследовать, насколько активными являются частицы производного билирубина по настоящему изобретению, свободные ионы ⁶⁴Cu, не содержащиеся в билирубине, удаляли при помощи эксклюзионной колонки, а затем количественно определяли при помощи радиационного дозиметра. Кроме того, методы взаимодействия в других условиях по рН и температуре в хелатировании ⁶⁴Cu были оптимизированы так, чтобы они были почти идентичны физиологической среде (37°С, рН 7,4) (фиг.3).

Координационная связь между ионом ⁶⁴Cu и производным билирубина по настоящему изобретению может быть образована ионом ⁶⁴Cu и пиррольной группой, лактамной группой или карбоксильной группой билирубина, и их примерное выражение показано в химической формуле 2.

[Химическая формула 2]

Кроме того, частицы производного билирубина, в которых ион ⁶⁴Cu координирован частицами производного билирубина (PEG-BR), полученными в примере 1 выше, были инъецированы крысам с опухолью, и их эффективность in vivo предварительно исследовали при помощи ПЭТ-изображения. В качестве подтверждения результатов, частицы ⁶⁴Cu-билирубина четко визуализировали опухоль зависимым от времени образом, и самое высокое поглощение в опухоли через 1 час, 3 часа и 6 часов после инъекции составляло примерно 2,15, 2,81 и 3,75% инъецированной дозы (ID)/г, соответственно (фиг. 4).

2-2. Получение частиц производного билирубина, содержащих ионы различных металлов (Ni, Mn, Gd, Mg, Ca, Fe)

Чтобы исследовать эффект инкапсуляции (хелатирующий эффект) частиц производного билирубина по настоящему изобретению в отношении различных ионов металлов, исследовали возможность образования координационного комплекса для шести металлов (Ni, Mn, Gd, Mg, Ca и Fe). Для эксперимента применяли следующий метод: водный раствор, содержащий каждый из ионов металлов, добавляли к водному раствору частиц билирубина, приготовленных в примере 1, с последующим перемешиванием, как в примере 2-1 выше. После определенного времени реакции все металлы, особенно переходные металлы, проявляли изменения цвета (Ni = Fe> Gd = Mn), которые очень отличались от изменений цвета для Mg и Ca (фиг. 5a). Кроме того, соответствующие металлы, даже группы магния и кальция, демонстрировали различные изменения в спектре поглощения по сравнению с растворами обычных частиц (фиг.5b).

Вышеуказанные результаты, которые показывают, что после координационного связывания с конкретными ионами металлов раствор частиц билирубина демонстрирует изменение цвета от своего первоначального желтого цвета или показывает смещение или изменение в определенных спектрах поглощения, могут обеспечить применимость нового PEG-илированного билирубина за пределами области предыдущего биомедицинского применения. Следовательно, можно подтвердить, что способность частиц производных билирубина по настоящему изобретению образовывать металлоорганический координационный комплекс для различных металлов может иметь различные применения, включая систему обнаружения ионов металлов.

Пример 3: Получение частиц производного билирубина, содержащих металл (наночастицы металла) по настоящему изобретению -2

3-1. Получение частиц производного билирубина, содержащих единичную суперпарамагнитную наночастицу оксида железа (SPION)

Чтобы на суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPION) нанести покрытие из производного билирубина по настоящему изобретению, раствор гексана, содержащий растворенные в нем суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPION), добавляли к водному раствору наночастиц билирубина, полученных в примере 1 выше, с образованием поверхности раздела между водным слоем и слоем гексана. Поверхность раздела подвергали воздействию искусственного давления, используя ультразвуковой аппарат для смешивания двух слоев в течение определенного заранее периода времени с получением частицы в форме, в которой производное билирубина (PEG-BR) покрывает поверхность наночастиц железа (фиг. 6а). Вышеуказанная реакция основана на принципе обмена лигандов, при котором слой олеиновой кислоты, который первоначально нанесен на наночастицы железа (SPION), отделяется, и вместо этого на наночастицы наносится покрытие посредством реакции хелатирования карбоксильной группы производного билирубина (PEG-BR) и центральной части наночастиц железа (SPION) (фиг. 6b).

3-2. Получение частиц производных билирубина, содержащих кластерную форму суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (SPION)

Чтобы получить частицы в форме, в которой кластеры металлических частиц покрыты производным билирубина, частицы SPION, растворенные в метаноле, смешивали с производным билирубина (PEG-RB), растворенным в органическом растворителе (например, хлороформе), вместо добавления частиц металла, растворенных в органическом растворителе, к водному раствору, содержащему растворенное в нем производное билирубина (PEG-RB), как в примере 3-1. После этого органический растворитель сушили в газообразном азоте с образованием слоя липидной пленки. Затем полученный слой липидной пленки гидратировался с образованием кластерной формы SPION. После проведения вышеуказанных процедур выделяли чистые SPION при помощи магнита, и полученную таким образом кластерную форму SPION выделяли в качестве конечного продукта реакции.

Авторы настоящего изобретения подтвердили с помощью изображений ПЭМ, что в примерах 3-1 и 3-2 были успешно получены два типа частиц с использованием оболочек из PEG-билирубина (фиг.6с).

3-3. Получение частиц производных билирубина, содержащих наночастицы золота

Чтобы покрыть наночастицы золота производным билирубина, указанное производное билирубина (PEG-BR), полученное в примере 1-1 выше, растворяли в воде, а не в органическом растворителе, с последующим немедленным взаимодействием с водным раствором, содержащим растворенные в нем наночастицы золота, в течение заданного периода времени. Принцип взаимодействия аналогичен принципу нанесения покрытия на SPION в примере 3-1. Производное билирубина (PEG-BR), заменяющее цитратный слой, нанесенный на наночастицы золота, наносили в виде покрытия, окружающего ядро наночастицы.

Пример 4: АФК-чувствительность частиц производного билирубина, содержащих металл (наночастицы металла) по настоящему изобретению

4-1. МРТ фантомное исследование частиц производных билирубина, содержащих SPION

Авторы настоящего изобретения провели МРТ фантомное исследование с целью изучения характеристик SPION, покрытых PEG-билирубином, в форме частиц с монораспределением.

Во-первых, проведено сравнение фантомных изображений SPION, покрытых производным билирубина (PEG-BR) по настоящему изобретению, и Feridex, клинически одобренного T2-взвешенного агента для МР, в ходе которого SPION, покрытые производным билирубина (PEG-BR) по настоящему изобретению, показали лучшее значение релаксивности, чем Feridex (фиг. 7).

Кроме того, когда SPION, покрытые производным билирубина (PEG-билирубин), обрабатывали гипохлоритом в качестве генератора АФК, на ПЭМ-изображении наблюдалась агрегация SPION, покрытых PEG-билирубином, из-за чувствительности к АФК, присущей билирубину (фиг. 8). Кроме того, как и предсказывалось, в фантомных исследованиях Т2 МРТ также была косвенно подтверждена чувствительность к АФК за счет постепенного снижения сигнала Т2 пропорционально концентрации АФК, вследствие потери гидрофильности, поддерживаемой ПЭГ-билирубином (фиг.9а и 9b). Такой ответ в виде агрегации SPION может постепенно увеличивать размер SPION и, таким образом, может являться мощной мишенью для терапевтического эффекта магнитной гипертермии.

4-2. Исследования in vitro и in vivo АФК-чувствительность частиц производного билирубина, содержащих SPION

Чтобы исследовать действие и агрегацию наночастиц железа, покрытых PEG-билирубином под воздействием АФК in vitro и in vivo, был проведен следующий эксперимент с использованием первичных макрофагов и штаммов макрофагов, которые, как известно, фагоцитируют чужеродные патогены при помощи АФК и фагоцитоза в условия воспаления.

Сначала макрофаги или брюшную полость обрабатывали липополисахаридами (LPS) для создания искусственного воспаления, затем одновременно обрабатывали SPION, покрытыми PEG-билирубином, и SPION, покрытыми PEG-дистеароилфосфатидилэтаноламином (PEG-DSPE), в качестве контрольной группы, и наблюдали фагоцитоз при помощи оптического микроскопа и МР фантомных изображений.

Чтобы исследовать, генерировались ли АФК в том же количестве в соответствующих условиях, при помощи RT_qPCR измеряли уровень экспрессии гена Nox2 в макрофагах, известного как фактор генерации АФК в организме. В результате группы SPION PEG-DSPE и PEG-RB показали почти одинаковые уровни экспрессии гена Nox2 и генерировали сходные количества АФК, которые были выше, чем для нормальных условий (фиг. 10).

Кроме того, с помощью оптоэлектронного устройства наблюдали соответствующие степени фагоцитоза в группах обработки SPION с покрытием PEG-DSPE и SPION с покрытием PEG-BR в условиях генерирования эквивалентного количества АФК. В результате наблюдения группа лечения SPION с покрытием PEG-BR показала более высокие уровни фагоцитоза, чем группа лечения SPION с покрытием PEG-DSPE в качестве контрольной группы (фиг. 11a, более темный цвет наблюдается при увеличении степени фагоцитоза). Та же картина была получена при МРТ фантомном исследовании макрофагов, взятых из брюшной полости (фиг. 11b).

Вышеуказанные результаты, как полагают, являются следствием того факта, что покрытие PEG-BR отделилось от SPION с покрытием PEG-BR в ответ на АФК, генерируемые макрофагами из-за стресса, возросшего за счет обработки LPS, так что ядра SPION агрегируют, что приводит к усиленному фагоцитозу, или SPION, покрытые PEG-BR, также агрегируют в клетках в ответ на АФК после фагоцитоза. В то время как SPION с покрытием PEG-DSPE в качестве контрольной группы не имели никакой реакции с АФК, считается, что наблюдается активность относительно полной формы SPION с покрытием PEG-DSPE.

4-3. КТ фантомные исследования и тесты in vitro и in vivo на АФК-чувствительность частиц производных билирубина, содержащих наночастицы золота

Наночастицы золота широко изучались в качестве контрастного агента для КТ в доклинических испытаниях. Поверхность наночастиц золота, покрытых лимонной кислотой, подобно SPION, можно заместить пегилированным билирубином (PEG-BR) за счет координационного связывания. Успешное связывание пегилированного билирубина с наночастицами золота было подтверждено с помощью ПЭМ изображений и фантомных КТ изображений, а изменение длины волны УФ/Vis после хелатирования и АФК-чувствительность наночастиц золота с покрытием билирубина было исследовано путем сравнения и наблюдения наночастиц золота с покрытием пегилированным тиолом в качестве контрольной группы.

Кроме того, когда наночастицы золота с покрытием PEG-BR реагируют с АФК, покрытие PEG-BR отслаивается, что приводит к агрегации наночастиц золота с потерей лигандов, так что наночастицы золота обладают мощным фототермическим эффектом в ближнем ИК-диапазоне, что приводит к изменению поглощения (фиг. 12). Это указывает на возможность того, что контрастный агент на основе наночастиц золота, покрытых PEG-BR, можно применять не только в качестве диагностического инструмента для КТ, но также и в качестве инструмента для стимулирования лечения фототермическими эффектами в ответ на АФК в опухолях.

Кроме того, в результате исследования КТ изображений наночастиц золота, покрытых пегилированным билирубином, у мышей in vivo было подтверждено, что ангиографию можно проводить с длительной циркуляцией в течение длительного периода времени, и отличные результаты были также получены при визуализации основных органов, такие как печень и селезенка (фиг. 13).

Пример 5: Получение частиц производного билирубина, содержащих металл (противораковое лекарственное средство на основе платины) по настоящему изобретению -3

Чтобы подтвердить хелатирующий эффект образования комплекса с металлом и терапевтическую противоопухолевую эффективность частиц производного билирубина по настоящему изобретению, были получены наночастицы, загруженные цисплатином, который является наиболее представительным лекарственным средством из металлов, применяемым для лечения опухолей (фиг. 14). Цисплатин имеет основу из платины и используется вместе с наносистемой для доставки.

В результате взаимодействия частиц пегилированного билирубина (PEG-BR) и продукта гидролиза цисплатина беспрецедентное изменение цвета в растворе подтвердило, что цисплатин был загружен (фиг. 15). На фиг. 16 приведена схематическая диаграмма, показывающая принцип связывания между пегилированным билирубином и цисплатином.

Кроме того, в результате проведения теста на высвобождение цисплатина в нескольких разных условиях (pH и АФК) в зависимости от времени в наночастицах билирубина с инкапсулированным цисплатином, цисплатин показал самую высокую скорость высвобождения в ответ на АФК с самой наибольшей пропорцией высвобождения. Менее скорость высвобождения наблюдалась в кислых условиях (pH 5,5), которые, как известно, аналогичны среде внутриклеточных лизосом, и самое низкое высвобождение наблюдалось при физиологическом pH (фиг. 17a и 17b).

Вышеуказанные результаты косвенно подтверждают, что частица производного билирубина, содержащая металл, по настоящему изобретению может стабильно инкапсулировать цисплатин в качестве лекарственного средства на основе платины и селективно высвобождать инкапсулированное лекарственное средство в окружающую микросреду.

Пример 6: Фотоакустическая и фототермическая активность частиц производного билирубина, содержащих металл (противораковое лекарственное средство на основе платины) по настоящему изобретению

При уменьшении пика полосы Соре увеличение поглощения в ИК-области (красное смещение) вызывает заметную фототермическую активность при свете 808 нм. Поскольку наночастицы билирубина сами по себе обладают заметной чувствительностью к инфракрасному свету, фототермическая активность не может быть получена из исходного общего источника инфракрасного света. Такое изменение и вновь приобретенные фотонные характеристики могут быть объяснены с точки зрения теории платиновых синих. Согласно теории, продукт гидролиза цисплатина может быть получен в результате реакции с амидным лигандом.

Что касается наночастиц по настоящему изобретению, в которых пегилированный билирубин координирован с цисплатином, авторы настоящего изобретения использовали такой металлокоординированный комплекс для фотоакустической визуализации и фототермической терапии (ФТТ) благодаря недавно полученному поглощению в ближней инфракрасной области (регион NIR). Фотоакустическая визуализация и фототермическая терапия используют один и тот же принцип света определенной длины волны.

При применении для фотоакустической визуализации in vivo в модели ксенотрансплантата опухоли у мышей было подтверждено, что фотоакустический сигнал постепенно увеличивался после внутривенной инъекции производного билирубина по настоящему изобретению (фиг. 18). Следовательно, была подтверждена возможность фототермической терапии в тех же условиях, и температура поверхности опухоли быстро увеличивалась до 55-60°С в течение 5 минут после воздействия света 808 нм (фиг. 19). В результате в группе, подвергавшейся фототермической терапии с использованием реального света наблюдался значительный эффект уменьшения объема опухоли с течением времени (фиг. 20 и 21).

Пример 7: АФК-чувствительность содержащих металл частиц производного билирубина по настоящему изобретению

7-1. Подтверждение АФК-чувствительности частиц производного билирубина, содержащих наночастицы железа (видимое изменение цвета)

Чтобы исследовать АФК-чувствительность частиц производного билирубина по настоящему изобретению и ее изменение, исследовали изменение наночастиц железа, покрытых пегилированным билирубином по настоящему изобретению, в зависимости от концентрации АФК.

Сначала суспензию, содержащую наночастицы железа, покрытые пегилированным билирубином, получали тем же способом, что и в описанном выше примере, и добавляли NaOCl (100, 10, 1, 0,1, 0 мМ) и AAPH* (100, 10, 1, 0,1, 0 мМ) и перекись водорода (100 мМ) в соответствии с концентрацией, после чего результаты наблюдали невооруженным глазом и с помощью оптического микроскопа. [*2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид (AAPH)]. Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали наночастицы железа, покрытые пегилированным DSPE**. [**1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE)]

Эти результаты показаны на фиг. 22-25.

Как показано на фиг. 22, при концентрации NaOCl 100 мМ весь пегилированный билирубин, который находился в виде покрытия на наночастицах железа, был сброшен из-за высокой концентрации АФК, и, таким образом, оставшиеся гидрофобные наночастицы железа агрегировали друг друга и оседали. В результате цвет, присущий водному раствору наночастиц железа, видимый в двух правых пробирках, также был потерян, с получением чистого цвета воды. В свою очередь, только очень небольшое количество агрегировало (красная стрелка) в средней пробирке, в группе, обработанной 1 мМ в качестве промежуточной концентрации, и показало более темный кофейный цвет из-за более слабой агрегации наночастиц железа по сравнению с контрольной группой (1 мМ) (справа).

Как показано на фиг. 23-25, было подтверждено, что АФК-чувствительность была разной в следующем порядке: гипохлорит (HOCl) >> AAPH >>>>> вода с перекисью водорода. Было также подтверждено, что наночастицы железа, покрытые пегилированным 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламином (DSPE), используемые в качестве отрицательного контроля, не вступали во взаимодействие ни с одним из трех типов АФК. Таким образом, можно подтвердить, что реакция АФК и наночастиц железа, покрытых пегилированным билирубином, была очень специфической.

7-2. Подтверждение АФК-чувствительности частиц производного билирубина, содержащих наночастицы золота (изменение поглощения)

Чтобы количественно оценить АФК-чувствительность частиц производного билирубина по настоящему изобретению, измеряли поглощение до и после взаимодействия частиц производного билирубина и АФК. В частности, изменение раствора до и после взаимодействия наночастиц золота, покрытых пегилированным билирубином, с каждым типом АФК измеряли при помощи поглощения и наблюдения невооруженным глазом.

Эти результаты показаны на фиг. 26 и 28.

Что касается AAPH, только наночастицы золота, покрытые пегилированным билирубином, специфически реагировали с AAPH, а наночастицы золота, покрытые пегилированным тиолом (PEG-SH), используемые в качестве отрицательного контроля, не реагировали с AAPH. Что касается гипохлорита (HOCl), наблюдали, что наночастицы золота, покрытые пегилированным билирубином, и наночастицы золота, покрытые пегилированным тиолом (PEG-SH), реагировали с гипохлоритом, и, таким образом, было подтверждено, что частицы производного билирубина по настоящему изобретению демонстрировали более высокий отклик именно на АФК (AAPH).

Из приведенных выше результатов можно видеть, что частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно применять при определении типа и концентрации АФК.

Пример 8: АФК-чувствительность частиц производного билирубина, координированного ионом марганца, по настоящему изобретению

8-1. Получение частиц производного билирубина, координированного ионом марганца

Чтобы дополнительно исследовать АФК-чувствительные и изменение частиц производного билирубина, содержащих металл, по настоящему изобретению, получали частицы производного билирубина, координированного ионом марганца (Mn2+). Общая схема и способ получения частиц производного билирубина, координированного ионом марганца, показаны на фиг. 29 и 30. В частности, водный раствор MnCl₂ по каплям добавляли при помощи шприцевого насоса так, что молярное соотношение PEG-BR:MnCl₂ составляло 1:1, при сильном перемешивании водного раствора частиц производного билирубина (PEG-BR), полученных в примере 1 выше (стадия 5)). После этого проводили взаимодействие при температуре 37°С в течение 48 часов. После завершения реакции ионы марганца, не связанные с наночастицами билирубина, удаляли с использованием диализного мешка (поплавок A-Lyzer, отсечка по ММ:20K) (стадия 6)) с последующим концентрированием при помощи Amicon 10K (стадия 7)) с получением наночастиц производного билирубина, координированного ионом марганца. Для измерения количества ионов марганца, связанных с полученными наночастицами производного билирубина, использовали ICP-OES (Agilent ICP-OES 5110) (стадия 8). В результате было подтверждено, что 22,67 ± 2,20 мг/кг (в расчете на PEG-BR 1 мМ) ионов марганца были связаны в наночастицах производного билирубина, координированного ионом марганца, по настоящему изобретению.

8-2. Подтверждение АФК-чувствительности частиц производного билирубина, координированного ионом марганца (концентрация ионов, ПЭМ и МРТ)

Для того, чтобы исследовать взаимодействие частиц производного билирубина, координированного ионом марганца, по настоящему изобретению, полученных в примере 8-1, с АФК, к частицам производного билирубина, координированного ионами марганца, добавляли гипохлорит для получения количества высвобождения ионов марганца и T1-взвешенные МРТ изображения. Фиг. 31 иллюстрирует, что, когда координированное ионом марганца производное билирубина по настоящему изобретению реагировало с АФК, гидрофильный билирубин превращался в гидрофильный биливердин, что приводило к ослаблению связывания и расщеплению наночастиц, и в результате координированные ионы марганца отделялись, и, таким образом, можно получить изображение АФК с помощью МРТ.

В частности, 1 мл наночастиц производного билирубина, координированного ионом марганца добавляли в диализный мешок (Float A-Lyzer, отсечка по ММ: 20K) и 1 мМ NaOCl добавляли к 99 мл дистиллированной воды, а затем при комнатной температуре при встряхивании проводили диализ не координированных ионов марганца. В заранее установленное время (0, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 часов и 72 часа) из диализного мешка отбирали фракции по 50 мкл, и с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (Agilent ICP-MS 7700S) определяли количество марганца, содержащегося в каждой фракции.

Результаты показаны на фиг. 32. Как показано на фиг. 32, частицы производного билирубина, координированного ионами марганца по настоящему изобретению высвобождают ионы марганца при стимулировании АФК.

Авторы настоящего изобретения также при помощи просвечивающего электронного микроскопа наблюдали морфологические изменения наночастиц производного билирубина (PEG-BR), координированного ионами марганца по настоящему изобретению до и после обработки гипохлоритом. Результаты показаны на фиг. 33. Как показано на фиг. 33, можно считать подтвержденным, что частицы производного билирубина, координированного ионами марганца, собрались вместе в одном месте с образованием небольшой сферы до стимуляции АФК (гипохлорит), но после стимуляции частицы не собирались, а диспергировались, поскольку связывание иона марганца и билирубина изменялось.

Авторы настоящего изобретения также наблюдали изменения интенсивности сигнала МРТ наночастиц производного билирубина (PEG-BR), координированного ионами марганца по настоящему изобретению до и после обработки гипохлоритом. В качестве измерительного прибора использовали сканер 3-Tesla MRS 3000 (с катушкой для головы крысы в виде птичьей клетки, MR Solutions, Суррей, Великобритания) с размером отверстия 17 см, и параметры измерения горизонтальных T1-взвешенных изображений были следующее:

Время повторения (TR)/время появления эхо-сигнала (TE); 550 мс/11 мс, угол переворота; 90°, область сканирования (FOV); 45 мм × 45 мм, толщина среза; 1,5 мм, матрица; 256 × 128.

Результаты показаны на фиг. 1 и в таблице 1.

[Таблица 1]

	Отношение сигнал/шум (коэффициент контрастности T/N) = (средняя интенсивность сигнала)/{(стандартное отклонение интенсивности шума) * 100}
До обработки NaOCl	10003/(110*100) = 90,9%
После обработки NaOCl	19024/(110*100) = 172,9%

Как показано в таблице 1 и на фиг. 34, можно подтвердить, что наночастицы производного билирубина (PEG-BR), координированного ионом марганца, по настоящему изобретению демонстрируют повышенную яркость T1-взвешенного МРТ изображения после обработки гипохлоритом.

Следовательно, на основании приведенных выше результатов было подтверждено, что частицы производного билирубина по настоящему изобретению можно применять в качестве композиции для обнаружения АФК или места воспаления, сопровождаемого АФК.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на определенные признаки, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что это описание относится только к предпочтительному варианту реализации и не ограничивает объем настоящего изобретения.

1. Частица для лечения и/или диагностики воспалительного заболевания, содержащая:

билирубин, конъюгированный с гидрофильной молекулой; и

атом металла, соединенный посредством координационных связей с по меньшей мере одной группой, выбранной из карбоксильной группы, лактамной группы и пиррольного кольца указанного билирубина.

2. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что указанный атом металла выбран из группы, состоящей из Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Zn, Gd, Mo, Ni, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra и лантаноида.

3. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что указанный атом металла представляет собой железо (Fe) в суперпарамагнитной наночастице оксида железа (SPION) или золото (Au) в наночастице золота.

4. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что указанный атом металла представляет собой ион платины (Pt) или платину (Pt) в противораковом лекарственном средстве на основе платины, выбранном из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, недаплатина и гептаплатина.

5. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что указанный атом металла представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный из группы, состоящей из ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹mTc, ¹¹¹In и ²⁰¹TI.

6. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что указанная гидрофильная молекула выбрана из группы, состоящей из декстрана, карбодекстрана, полисахарида, циклодекстрана, плюроника, целлюлозы, крахмала, гликогена, углевода, моносахарида, бисахарида и олигосахарида, полифосфагена, полилактида, сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактона, полиангидрида, полималеиновой кислоты и производных полималеиновой кислоты, полиалкилцианоакрилата, полигидроксибутилата, поликарбоната, полиортоэфира, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, полигликолида, полиметакрилата, поливинилпирролидона, поли[акрилата], поли[акриламида], полимера сложного винилового эфира, полимера винилового спирта, полистирола, полиоксида, полиэлектролита, поли[1-нитропропилена], поли[N-винилпирролидона], поли[виниламина], поли[бета-гидроксиэтилметакрилата], полиэтиленоксида, поли[этиленоксид-b-пропиленоксида], полилизина и пептида.

7. Применение частицы, содержащей:

билирубин, конъюгированный с гидрофильной молекулой; и

атом металла, соединенный посредством координационных связей с по меньшей мере одной группой, выбранной из карбоксильной группы, лактамной группы и пиррольного кольца указанного билирубина,

где атом металла выбран из группы, состоящей из Cu, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Ni, железа (Fe) в суперпарамагнитной наночастице оксида железа (SPION), золота (Au) в наночастице золота или иона платины (Pt) или платины (Pt) в противораковом лекарственном средстве на основе платины,

для лечения рака.

8. Применение частицы, содержащей:

билирубин, конъюгированный с гидрофильной молекулой; и

атом металла, соединенный посредством координационных связей с по меньшей мере одной группой, выбранной из карбоксильной группы, лактамной группы и пиррольного кольца указанного билирубина,

в качестве контрастного агента для диагностики при помощи изображения.

9. Применение частицы, содержащей:

билирубин, конъюгированный с гидрофильной молекулой; и

атом металла, соединенный посредством координационных связей с по меньшей мере одной группой, выбранной из карбоксильной группы, лактамной группы и пиррольного кольца указанного билирубина,

для обнаружения активных форм кислорода (АФК).

10. Применение по п. 8 или 9, в котором указанный атом металла выбран из группы, состоящей из Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Zn, Gd, Mo, Ni, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra и лантаноида.

11. Применение по п. 8 или 9, в котором указанный атом металла представляет собой железо (Fe) в суперпарамагнитной наночастице оксида железа (SPION) или золото (Au) в наночастице золота.

12. Применение по п. 8 или 9, в котором указанный металл представляет собой ион платины (Pt) или платину (Pt) в противораковом лекарственном средстве на основе платины, выбранном из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, недаплатина и гептаплатина.

13. Применение по любому из пп. 8-10, в котором указанный атом металла представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный из группы, состоящей из ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹mTc, ¹¹¹In и ²⁰¹TI.

14. Применение по любому из пп. 7-13, в котором указанная гидрофильная молекула выбрана из группы, состоящей из декстрана, карбодекстрана, полисахарида, циклодекстрана, плюроника, целлюлозы, крахмала, гликогена, углевода, моносахарида, бисахарида и олигосахарида, полифосфагена, полилактида, сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактона, полиангидрида, полималеиновой кислоты и производных полималеиновой кислоты, полиалкилцианоакрилата, полигидроксибутилата, поликарбоната, полиортоэфира, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, полигликолида, полиметакрилата, поливинилпирролидона, поли[акрилата], поли[акриламида], полимера сложного винилового эфира, полимера винилового спирта, полистирола, полиоксида, полиэлектролита, поли[1-нитропропилена], поли[N-винилпирролидона], поли[виниламина], поли[бета-гидроксиэтилметакрилата], полиэтиленоксида, поли[этиленоксид-b-пропиленоксида], полилизина и пептида.

15. Частица или применение по любому из пп. 1-14, где частица имеет форму оболочка-ядро, где атом металла находится в ядре; билирубин образует оболочку; гидрофильная молекула примыкает к оболочке.

16. Частица или применение по п. 15, отличающаяся тем, что указанный атом металла в указанной форме оболочка-ядро представляет собой атом металла в кластеризованных металлических частицах.

17. Частица или применение по п. 15, отличающаяся тем, что указанный атом металла в указанной форме оболочка-ядро представляет собой атом металла в одной металлической частице.

18. Частица или применение по любому из пп. 1-17, отличающаяся тем, что указанная гидрофильная молекула представляет собой полиэтиленгликоль.

19. Частица или применение по любому из пп. 1-18, отличающаяся тем, что атом металла представляет собой ион ⁶⁴Cu.

20. Частица или применение по любому из пп. 1-18, отличающаяся тем, что атом металла представляет собой железо (Fe) в суперпарамагнитной наночастице оксида железа (SPION).

21. Частица или применение по любому из пп. 1-2, 5-6, 13-15, 18, 19-20, где частица содержит структуру, представленную химической формулой 2:

[Химическая формула 2]

.