Антитело против lag-3, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу против LAG-3 или его антигенсвязывающему фрагменту. Также раскрыты молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело; экспрессирующий вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты; клетка-хозяин, содержащая указанный вектор; фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Раскрыты способы лечения с помощью указанного антитела и ингибирования роста опухолевых клеток, ассоциированных с LAG-3; применение указанного антитела для изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного со сверхэкспрессией LAG-3. Изобретение обладает способностью эффективно лечить заболевания, ассоциированные с LAG-3. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 5 пр., 15 табл., 2 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителу против LAG-3, его антигенсвязывающему фрагменту, химерному антителу или гуманизированному антителу, содержащему области CDR (от англ. complementary determining region - область, определяющая комплементарность) антитела против LAG-3, а также фармацевтическим композициям, содержащим антитело против LAG-3, и его антигенсвязывающему фрагменту, а также его применению в качестве противоракового лекарственного средства.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген активации лимфоцитов-3, также известный как LAG-3 или CD223, представляет собой член суперсемейства иммуноглобулинов, который может негативно регулировать разные функции и циклы выживания иммунных клеток. Исследования показали, что LAG-3 играет важную роль в вирусном инфицировании, аутоиммунных заболеваниях и дисфункции иммунной системы, вызываемой опухолью. Влияние на функцию LAG-3 может улучшать статус иммунной дисфункции во время развития данных заболеваний с возможностью улучшения прогноза заболеваний.

В составе суперсемейства иммуноглобулинов LAG-3 состоит из трех областей: внеклеточный домен, трансмембранная область и цитоплазматический домен. Зрелая молекула LAG-3, которая впервые была открыта Triebel et al. в 1990 году (J Exp Med, 1990, 171 (5): 1393-405), состоит из 470 аминокислот с относительной молекулярной массой 70 кДа. Обнаружили, что LAG-3, подобно CTLA-4 и PD-1, представляет собой негативную костимулирующую молекулу, активация которой может негативно регулировать функцию лимфоцита. Структурно, LAG-3 тесно связан с CD4, но он имеет обратную функцию, чем у CD4. Например, молекула LAG-3 имеет высокое сходство с молекулой CD4, и обе могут связываться с молекулами МНС класса II (от англ. Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Однако, авидность связывания LAG-3 с молекулами МНС-II выше, чем авидность связывания CD4. Таким образом, он нарушает активацию TCR (от англ. T-cell receptor - Т-клеточный рецептор), индуцируемую клетками Т-лимфоцитами CD4⁺, и ингибирует активацию Т-лимфоцита (Curr Opin Immunol, 2009, 21(2):179-86; Eur J Immunol, 2003, 33 (4): 970-9). В исследованиях in vitro, показано, что LAG-3 может ингибировать пролиферацию Т-лимфоцита, вызываемую антигеном. Блокирование LAG-3 будет улучшать активацию и пролиферацию Т-лимфоцита и улучшать цитокины, секретируемые клетками - Т-хэлперами типа 1 (Th1). Huang et al. показали, что уровень LAG-3 на активированных регуляторных Т-клетках CD4⁺был значительно повышен, и LAG-3 являлся необходимым условием для того, чтобы регуляторные Т-клетки CD4⁺оказывали самый большой иммуносупрессивный эффект (Immunity, 2004, 21 (4): 503-13). Кроме того, антитело против LAG-3 также поддерживает гомеостаз Т-лимфоцита CD4⁺ и CD8⁺, блокирование LAG-3 будет значительно повышать способность Т-лимфоцитов CD8⁺убивать опухолевые клетки (J Clin Invest, 2007, 117 (11): 3383-92). Некоторые исследования заболеваний также указали на то, что LAG-3 играет важную роль в регуляции развития и прогрессирования заболевания. Gandhi et al. подтвердили, что уровень экспрессии LAG-3 в Т-лимфоцитах ткани лимфомы человека ассоциирован с дисфункцией Т-лимфоцитов, и клиренс Т-лимфоцитов LAG-3⁺может значительно усиливать способность к ликвидации опухолевой клетки с помощью Т-лимфоцитов (Blood, 2006, 108 (7): 2280-9). Результаты показывают, что LAG-3 представляет собой важную ингибирующую молекулу на поверхности иммунных клеток и оказывает значительное негативное регуляторное действие на Т-лимфоциты.

LAG-3 главным образом экспрессируется на Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, NK-клетках (от англ. Natural killer cell - естественный киллер), регуляторных Т-клетках и дендритных клетках (Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35 (7): 2081-8; J Immunol, 2009, 182 (4): 1885-91). LAG-3 представляет собой класс молекул иммунодепрессантов, и является одним из компонентов, составляющих корецептор TCR. Он нарушает активацию TCR, вызываемую Т-лимфоцитом, и играет негативную регуляторную роль в активации Т-лимфоцитов. При некоторых заболеваниях экспрессия LAG-3 повышалась, наблюдалась соответствующая иммуносупрессия. Gandhi et al. обнаружили, что лимфоциты в крови и опухолевых тканях от пациентов с лимфомой Ходжкина на высоком уровне экспрессировали LAG-3; и функция специфичных Т-клеток CD8⁺ была очевидна нарушена в опухолевых тканях, если LAG-3-позитивную Т-клетку удаляли, противоопухолевая функция восстанавливалась и увеличивалась секреция цитокинов. Сделали предположение, что экспрессия LAG-3 ассоциирована с негативной регуляцией иммунной функции специфичных Т-клеток, ингибирование функции молекулы LAG-3 может усиливать противоопухолевое действие Т-клетки, таким образом, что молекула LAG-3 может представлять собой потенциальную мишень для иммунотерапии опухолей (Blood, 2006, 108 (7): 2280-9).

В настоящее время существует несколько транснациональных фармацевтических компаний, таких как BMS и Novartis, занимающихся исследованием моноклональных антител против LAG-3, которые усиливают противоопухолевый эффект Т-клеток и максимально увеличивают собственный иммунный ответ пациента на опухоль посредством стимуляции антиген-специфичных Т-клеточных ответов и впоследствии достигают цели, заключающейся в уничтожении опухолевых клеток. В настоящее время родственными патентами являются патенты, как например, WO 2010019570, Согласно настоящему изобретению предложено антитело против LAG-3 с высокой аффинностью, высокой селективностью и высокой биологической активностью.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий любую одну или более областей CDR (от англ. "complementarity determining region" - "область, определяющая комплементарность"), выбранные из следующих (i) или (ii) или последовательностей с по меньшей мере 85%-ной идентичностью (предпочтительно 95%) со следующими последовательностями:

(i) области HCDR, как показано в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11; и области LCDR, как показано в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17; или

(ii) области HCDR, как показано в: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14; и области LCDR, как показано в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%) идентичностью с данными последовательностями;

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное антитело или его фрагмент.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит каркасную область (FR - от англ. framework) легкой цепи, происходящую из мышиной цепи к, или ее вариант, или область FR легкой цепи, происходящую из мышиной цепи κ, или ее вариант; где вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG1, или ее вариант, или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG2, или ее вариант, или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG3, или ее вариант.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено мышиное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где мышиное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено мышиное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором мышиное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где легкая цепь антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из мышиной цепи κ, или ее вариант, или константную область легкой цепи, происходящую из мышиной цепи λ, или ее вариант; где вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG1, или ее вариант; или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG2, или ее вариант, или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG3, или ее вариант.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой химерное антитело или его фрагмент.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность FR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV7-4-1*02 и hjh6.1, или происходит из ее мутантной последовательности; она содержит FR1, FR2, FR3 из тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV7-4-1*02 и FR4 из hjh6.1 или их мутантную последовательность; предпочтительно последовательность FR тяжелой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций, более предпочтительно имеет одну или более чем одну обратную мутацию, выбранную из группы, состоящей из E46K, R38K, V93T и Y95F.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 21, или последовательность с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%-ной) идентичностью с данной последовательностью; предпочтительно, имеет место 1-10 аминокислотных замен в вариабельной области тяжелой цепи. Данные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе технологии созревания аффинности в данной области.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела содержит последовательность SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, или последовательность с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность FR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-3*01 и hjh6.1 или ее мутантной последовательности; предпочтительно она содержит FR1, FR2, FR3 из тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-3*01 и FR4 из hjh.6.1 или их мутантную последовательность; где последовательность FR тяжелой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций, более предпочтительно одну или более чем одну обратную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F29L, А97Т, M48I, V68A, I70L, R72V и Т74К.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 29, или последовательность с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%-ной) идентичностью с указанной выше последовательностью; предпочтительно имеет место 1-10 аминокислотных замен в вариабельной области тяжелой цепи; Данные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе технологии созревания аффинности в данной области.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%-ной) идентичностью сданными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность FR легкой цепи вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и hjk4.1 и ее мутантной последовательности, она содержит FR1, FR2, FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и FR4 из hjk4.1 или их мутантную последовательность.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 22, или последовательность с по меньшей мере 85%-ной идентичностью с данной последовательностью; предпочтительно, имеет место 1-10 аминокислотных замен в вариабельной области легкой цепи. Данные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе технологии созревания аффинности в данной области.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность FR легкой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций, предпочтительно имеет одну или более чем одну обратную мутацию, выбранную из группы, состоящей из D70Q, F71Y, I48V и A43S.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела выбрана из последовательности SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%-ной) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела показана в SEQ ID NO: 30 или последовательности с по меньшей мере 85%-ной идентичностью с данной последовательностью; предпочтительно имеет место 0-10 аминокислотных замен в вариабельной области легкой цепи; Данные аминокислотные замены могут быть основаны на технологии созревания аффинности в данной области.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность FR легкой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций, предпочтительно имеет одну или более чем одну обратную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L46R, G66R, S60K, P44F, Y36L, K42G, I21L и T85D.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела выбрана из последовательности SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 37, или последовательности с по меньшей мере 85%-ной (предпочтительно 95%-ной) идентичностью с данными последовательностями.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где гуманизированное антитело содержит:

(а) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере 85%-ную (предпочтительно 95%-ную) идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25; и

(б) последовательность вариабельной области легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где гуманизированное антитело содержит:

(а) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере 85%-ную (предпочтительно 95%-ную) идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, и

(б) последовательность вариабельной области легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи имеет по меньшей мере 85%-ную (предпочтительно 95%-ную) идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где антитело содержит комбинацию вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих комбинаций вариабельных областей:

1) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22;

2) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26;

3) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27;

4) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28;

5) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22;

6) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26;

7) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27;

8) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28;

9) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22;

10) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26;

11) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27;

12) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28;

13) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22;

14) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26;

15) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27; и

16) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где антитело содержит комбинацию вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих комбинаций вариабельных областей:

1) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30;

2) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34;

3) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35;

4) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36;

5) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37;

6) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30;

7) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34;

8) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35;

9) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36;

10) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37;

11) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30;

12) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34;

13) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35;

14) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36;

15) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37;

16) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30;

17) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34;

18) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35;

19) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36; и

20) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено химерное или гуманизированное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, в котором тяжелая цепь химерного или гуманизированного антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее вариант, предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого lgG4, или ее вариант, наиболее предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 38.

Легкая цепь указанного химерного антитела или указанного гуманизированного антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из человеческой цепи к, человеческой цепи λ или ее варианта, наиболее предпочтительно содержит константную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 39.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена фармацевтическая композиция, которая содержит терапевтически эффективное количество антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данной области, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

Согласно изобретению дополнительно предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует за связывание с LAG-3 с моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано выше.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано выше.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором, как описано выше, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотических клеток и эукариотических клеток, предпочтительно эукариотических клеток, более предпочтительно клеток млекопитающих.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ получения антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий экспрессирование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине, как описано выше, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению или содержащей их фармацевтической композиции, ингибируя тем самым рост опухоли у субъекта.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение указанного выше антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента или содержащей их фармацевтической композиции в ингибировании роста опухолевых клеток у субъекта.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение указанного антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента или содержащей их фармацевтической композиции в получении лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению или содержащей их фармацевтической композиции или нуклеиновой кислоты, описанной выше, в получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с поражением иммунных клеток, где заболевание или состояние предпочтительно представляет собой рак. Рак, описанный в данном документе, включает рак яичников, меланому (например, метастатическая злокачественная меланома), рак предстательной железы, рак кишечника (например, рак толстой кишки и тонкого кишечника), рак желудка, рак пищевода, рак молочной железы, рак легкого, рак почки (например, светлоклеточный рак почки), рак поджелудочной железы, рак матки, рак печени, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак ротовой полости, рак мозга, рак яичка, рак кожи, рак щитовидной железы и гематологические злокачественные опухоли, включая миелому, и хронический/острый лейкоз, но не ограничивается ими.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1: Гуманизированное антитело против LAG-3 усиливает секрецию цитокина IL-2 (от англ. interleukin-2 - интерлейкин-2) из Т-лимфоцитов, активируемую SEB (от англ. staphylococcal enterotoxin В - стафилококковый энтеротоксин В). Результаты показывают, что гуманизированные антитела против LAG-3 - кандидаты, Hu229-013 и Hu303-005, могут усиливать секрецию IL-2 из активированных Т-лимфоцитов и с зависимым от дозы эффектом концентрации лекарственного средства.

Фиг. 2: Эффект гуманизированного антитела против LAG-3, оказываемый на объем опухоли мышей, несущих опухоль U-87MG. Результаты показывают, что как антитело против LAG-3 Hu229-013 6mpk, так и антитело против LAG-3 Hu303-005 6mpk имеют определенные противоопухолевые эффекты, и степени ингибирования опухолей составляли 27,25% (р меньше 0,05) и 34,94% (р меньше 0,01), соответственно, и имели место значимые различия по сравнению с контрольной группой (р меньше 0,001 по сравнению с hIGg).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины

Для более легкого понимания изобретения определенные технические и научные термины конкретно определены ниже. Если в данном документе конкретно не определено иное, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное обычному специалисту в данной области, к которой принадлежит данное изобретение.

В том виде, в котором он используется в данном документе, однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот представляет собой такой, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) р3558.

Термин «LAG-3» относится к гену активации лимфоцитов-3. Термин «LAG-3» включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Термин «человеческий LAG-3» относится к последовательности человеческого LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность человеческого LAG-3 с Uniprot №Р18627. Также в данной области LAG-3 хорошо известен, как, например, CD223. Последовательность человеческого LAG-3 может отличаться от человеческого LAG-3 Uniprot №Р18627 в том, что, например, человеческий LAG-3 имеет консервативные мутации или мутации в неконсервативных областях, и он имеет по существу такую же биологическую функцию, как и человеческий LAG-3 Uniprot № Р 18627. Например, биологическая функция человеческого LAG-3 представляет собой эпитоп во внеклеточном домене LAG-3, с которым специфично связывается антитело, описанное в данном документе, или биологическая функция человеческого LAG-3 заключается в связывании с молекулами МНС класса II.

Конкретная последовательность человеческого LAG-3 будет, как правило, иметь по меньшей мере 90%-ную идентичность в аминокислотной последовательности с человеческим LAG-3 Uniprot №Р18627 и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицированы как являющиеся аминокислотными последовательностями человека, при сравнении с аминокислотными последовательностями LAG-3 от других видов (например, мышиные). В ряде случаев, человеческий LAG-3 обладает по меньшей мере 85%-ной или даже по меньшей мере 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью в аминокислотной последовательности с LAG-3 Uniprot № Р18627. В конкретных воплощениях последовательность LAG-3 человека будет демонстрировать не больше чем 10 аминокислотных отличий от последовательности LAG-3 Uniprot № Р18627. В конкретных воплощениях человеческий LAG-3 может демонстрировать не больше чем 5 или даже не больше чем 4, 3, 2 или 1 аминокислотное отличие от последовательности LAG-3 Uniprot № Р18627. Процент идентичности может быть определен, как описано в данном документе.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «идентичность последовательностей» указывает на степень идентичности между двумя нуклеиновыми кислотами или двумя аминокислотными последовательностями, при оптимальном выравнивании и сравнении в отношении наличия мутаций, таких как соответствующие замены, вставки или делеции. Идентичность последовательностей между последовательностью, описанной в настоящем изобретении, и соответствующей последовательностью, составляет по меньшей мере 85%, 90% или 95%, предпочтительно по меньшей мере 95%. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%.

Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений, деленного на данные последовательности (то есть идентичность, %, равна числу идентичных положений, деленному на общее число положений с умножением на 100), принимая во внимание число пропусков и длину каждого пропуска, которые должны быть введены для оптимального выравнивания данных двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно выполнять, используя установки по умолчанию алгоритма BLASTN/BLASTP, доступного на веб-сайте национального центра биотехнологического института.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «антитело» относится к относится к иммуноглобулину, структуре четырех пептидных цепей, соединенных вместе дисульфидными связями между двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями. Разные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина демонстрируют разные аминокислотные составы и порядки ранжирования, следовательно, представляют разные виды антигенности. Соответственно, иммуноглобулины могут быть подразделены на пять категорий или так называемых изотипов иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, их тяжелые цепи представляют особой цепь μ, цепь δ, цепь γ, цепь α и цепь ε, соответственно. В соответствии со своим аминокислотным составом шарнирной области и числом и локализацией дисульфидных связей тяжелой цепи, один и тот же тип Ig может быть подразделен на разные подкатегории, например, IgG может быть подразделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкую цепь можно подразделить на цепь κ или λ, с учетом разных константных областей. Каждый из данных пяти типов Ig может иметь цепь κ или λ.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела, упомянутая в данном документе, дополнительно содержит константную область легкой цепи, которая содержит цепь κ, λ человека или мыши, или ее вариант.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела, упомянутая в данном документе, дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, которая содержит IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши, или ее вариант.

Рядом с N-концевой последовательностью тяжелой и легкой цепей антитела, примерно 110 аминокислот сильно меняются, известные как вариабельная область (область F_v); остальная часть аминокислотной последовательности рядом с С-концом относительно стабильна, известная как константная область. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR - от англ. hypervariable region) и четыре относительно консервативные каркасные области последовательности (FR - от англ. framework region). Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела, также известные как область, определяющая комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR - от англ. light chain variable region) и каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR - от англ. heavy chain variable region) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, причем последовательный порядок от N-конца до С-конца является следующим: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и положение аминокислотных остатков области CDR в областях LCVR и HCVR антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствует известным критериям нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) или соответствует критериям нумерации Kabat и Chothia (HCDR1).

Антитело по настоящему изобретению включает мышиное антитело, химерное антитело и гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.

Термин «мышиное антитело» в настоящем изобретении относится к моноклональному антителу против человеческого LAG-3, полученному в соответствии со знанием и с умениями данной области. Во время получения тестируемому субъекту инъецировали антиген LAG-3, и затем отделяли гибридому, экспрессирующую антитело, которое имеет желаемую последовательность или функциональные характеристики. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения мышиное антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно сдержит константную область легкой цепи мышиной цепи κ, λ или ее вариант или дополнительно содержит константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или ее вариант.

Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, которое образовано слиянием вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, химерное антитело может облегчать иммунный ответ, вызываемый мышиным антителом. Для создания химерного антитела сначала создают гибридому, секретирующую специфичное мышиное моноклональное антитело, затем ген вариабельной области клонируют из клеток гибридомы мыши, затем по желанию клонируют ген константной области человеческого антитела, ген вариабельной области мыши лигируют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который может быть вставлен в человеческий вектор, и, наконец, молекула химерного антитела экспрессируется в эукариотической или прокариотической системе. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела против LAG-3 дополнительно содержит константные области легкой цепи κ, А, человека или их вариант. Тяжелая цепь химерного антитела против LAG-3 дополнительно содержит константные области тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или их вариант, предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2 или IgG4 или ее вариант с аминокислотными мутациями (например, мутации YTE).

Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитыми CDR, относится к антителу, созданному посредством прививания мышиных последовательностей CDR в каркас вариабельной области человеческого антитела, а именно, антитело, образованное из разных типов последовательностей каркаса антитела зародышевой линии человека. Гуманизированное антитело преодолевает гетерогенный ответ, вызываемый химерным антителом, которое несет большое количество мышиных белковых компонентов. Такие последовательности каркаса могут быть получены из общедоступной базы данных ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии или из опубликованных референсных последовательностей. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступна на веб-сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также могут быть найдены в Kabat, ЕА, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Для того, чтобы избежать снижения активности во время уменьшения иммуногенности последовательность каркаса вариабельной области человеческого антитела подвергают минимальной обратной мутации для поддержания активности. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению также включает гуманизированное антитело, которое дополнительно подвергают созреванию аффинности CDR посредством фагового дисплея. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения мышиные последовательности CDR гуманизированного антитела против LAG-3 выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-20; конструируют для отбора каркас вариабельной области человеческого антитела, где последовательность FR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелых цепей зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и hjk4.1; где последовательность FR легкой цепи вариабельной области легкой цепи антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелых цепей зародышевой линии человека IGHV3-23*04 и hjh6.1. Для того, чтобы избежать снижения активности, вызываемого уменьшением иммуногенности, вариабельную область человеческого антитела, описанную в данном документе, можно подвергать минимальным обратным мутациям для поддержания активности антитела.

Прививание CDR может приводить к снижению аффинности антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента к антигену вследствие изменения остатков каркаса, находящихся в контакте с антигеном. Такие взаимодействия могут быть результатом высоко соматических мутаций. Таким образом, все еще может быть необходимым вставлять такие донорные аминокислоты каркаса в каркас гуманизированных антител. Аминокислотные остатки, вовлеченные в связывание антигена антителом против LAG-3, не являющимся человеческим, или его антигенсвязывающим фрагментом, можно идентифицировать посредством исследования последовательности вариабельной области и структуры мышиного моноклонального антитела. Каждый из остатков в донорном каркасе CDR, который отличается от зародышевой линии, можно считать имеющим значимость. Если определение наиболее тесно связанных видов является невозможным, последовательность можно сравнивать с консенсусной последовательностью консенсусной последовательности подтипа или мышиной последовательностью с высоким процентом сходства. Полагают, что редкие остатки каркаса являются результатом высоко соматической клеточной мутации, которая играет важную роль в связывании.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или для краткости «фрагмент антитела») относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, белком LAG-3). Показали, что функция антитела, заключающаяся в связывании антигена, может осуществляться фрагментом полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антиген-связывающий фрагмент» антитела, включают (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) F(ab')₂ фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком на шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) один домен или dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 10 341:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) отдельную область, определяющую комплементарность (CDR), или (vii) возможно комбинацию двух или более отдельных CDR, связанных синтетическим линкером. Кроме того, несмотря на то, что данные два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием методов генной инженерии, посредством синтетического линкера, который позволяет их создавать в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH располагаются парой с образованием одновалентных молекул (известны как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Данные фрагменты антитела получают, используя традиционные методики, известные специалистам в данной области, и данные фрагменты подвергаются скринингу в отношении полезности таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающую группировку можно получать посредством методик генной инженерии или посредством ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут представлять собой антитела разных изоформ, например, антитела IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Подразумевается, что термин «одноцепочечное антитело», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общие структуры: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящий линкер в предшествующем уровне техники состоит из повторяющейся GGGGS аминокислотной последовательности или ее варианта, например, варианта с 1-4 повторами (Holligeret al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны Alfthan et al., Protein Eng.8:725-731, Choi et al (2001), Eur.J.lmmuno 1.31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061, Kipriyanovet al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Rooverset al (2001), Cancer Immunol.

Термин «CDR» относится к одной из шести гипервариабельных областей в пределах вариабельных доменов антитела, которые главным образом содействуют связыванию антигена. Одно из наиболее широко используемых определений для шести CDR было предложено Kabat Е.А. et al, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). В том виде, в котором оно используется в данном документе, определение CDR по Kabat относится только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (L CDR 1, L CDR 2, L CDR 3 или L1, L2, L3), а также к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (HCDR2, HCDR3 или Н2, Н3).

Термин «каркас антитела», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к части вариабельного домена, или VL или VH, которая служит скелетом для антигенсвязывающих петель (CDR) данного вариабельного домена. По существу он является вариабельным доменом без CDR.

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на антигене (например, определенные сайты на молекуле LAG-3), с которым специфично связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных или непоследовательных аминокислот в единственной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфичное связывание», «селективное связывание», «селективно связывает» и «специфично связывает» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (KD) приблизительно меньше чем 10^-7 М, как например, 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже.

Термин «конкурентное связывание» относится к антителу, которое распознает один и тот же эпитоп (также называемый антигенной детерминантой) или частью одного и того же эпитопа на внеклеточной области человеческого LAG-3 и связывается с антигеном как и моноклональное антитело по настоящему изобретению. Антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом, как и моноклональное антитело по настоящему изобретению, относится к антителу, которое распознает и связывается с аминокислотной последовательностью человеческого LAG-3, распознаваемой моноклональным антителом по настоящему изобретению.

Термин «KD» или «Kd» относится к константе равновесия диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Обычно антитела по изобретению связываются с LAG-3 с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем приблизительно 10^-7 М, такой как меньше чем приблизительно 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже, например, как определено с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance) на приборе BIACORE.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «эффективно связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер эффективно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном воплощении вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть дополнительно лигированы дополнительные сегменты ДНК. В другом воплощении вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В настоящем изобретении векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный репликатор, и эписомальные векторы млекопитающих), или могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина (например, векторы млекопитающих, не являющиеся эписомальными).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в руководстве по экспериментальным технологиям с антителами Колд-Спринг-Харбор, глава 5-8 и 15. Например, мыши могут быть иммунизированы человеческим LAG-3 или его фрагментами, и полученные антитела затем могут быть ренатурированы, очищены и секвенированы посредством использования традиционных способов, хорошо известных в данной области. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены традиционными способами. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению генетически модифицированы для введения одной или более чем одной каркасной области человека (FR) в CDR нечеловеческого происхождения. Последовательности FR зародышевой линии человека могут быть получены от ImMunoGeneTics (IMGT) через их веб-сайт https://imgt.cines.fr или от The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен экспрессионный вектор. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, которые чувствительны к трансформации, включают члены энтеробактерий, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, как например Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии животных клеток-хозяев включают СНО (от англ. - Chinese Hamster Ovary lines - линии клеток яичника китайского хомяка) и клетки NSO.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть получены и очищены с использованием традиционных способов. Например, последовательности кДНК (комплементарная ДНК), кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, можно клонировать и подвергать рекомбинации в экспрессионный вектор GS. Рекомбинантный экспрессионный вектор иммуноглобулина может затем стабильно трансфицировать клетки СНО. В качестве более рекомендованного способа, хорошо известного в данной области, система экспрессии млекопитающих приведет к гликозилированию, типично на высоко консервативном N-конце в области Fc. В результате экспрессии антитела, специфично связывающегося с человеческим LAG-3, получают стабильные клоны. Позитивные клоны могут быть размножены в культуральной среде, не содержащей сыворотку, для получения антител в биореакторах. Культуральную среду, в которую секретировалось антитело, можно очищать традиционными методиками. Например, среду можно с удобством наносить на колонку на основе сефарозы FF с белком А или G, которую уравновешивали совместимым буфером. Колонку промывают для удаления неспецифичных связывающих компонентов. Связанное антитело элюируют посредством градиента рН и фрагменты антитела выявляют SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и затем объединяют. Антитело можно фильтровать и концентрировать с использованием обычных методик. Растворимую смесь и агрегат можно эффективно удалять обычными методиками, включая гель-фильтрацию или ионный обмен. Полученный продукт может быть сразу же заморожен, например, при -70°С или может быть лиофилизирован.

Термин «введение» и «обработка», в том виде, в котором он применяется к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к приведению экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термин «введение» и «обработка» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где данная жидкость находится в контакте с клеткой. Термин «введение» и «обработка» также означает обработки in vitro или ex vivo, например, клетки реагентом, диагностическим, связывающим соединением или другой клеткой. Термин «лечение», в том виде, в котором он применяется к субъекту-человеку, субъекту ветеринарии или исследования, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям.

Термин «лечить» означает вводить терапевтическое средство, такое как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутрь или наружно пациенту, имеющему один или более чем один симптом заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Типично средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более чем одного симптома заболевания у пациента или популяции, подлежащих лечению, или вызывая регрессию или ингибируя развитие такого(их) симптома(ов) до какой-либо клинически измеряемой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения какого-либо определенного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьировать в соответствии с факторами, такими как течение заболевания, возраст и масса пациента, и способностью лекарственного средства вызывать желаемый ответ у пациента. Был ли облегчен симптом заболевания можно оценить посредством клинического измерения, обычно используемого лечащими врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками, для оценки тяжести или статуса прогрессирования того симптома. В то время как воплощение настоящего изобретения (например, способ лечения или продукт производства) может не быть эффективным в облегчении исследуемого(ых) симптома(ов) заболевания у каждого пациента, оно должно облегчать исследуемый(е) целевой(ые) симптом(ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов, как определено любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна - Уитни, критерий Краскела - Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.

«Консервативные модификации» или «консервативное замещение или замена» относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими похожие характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация главной цепи и жесткость и т.п.), таким образом, что замены часто могут быть сделаны без изменения биологической активности данного белка. Специалисты в данной области признают, что, в общем, единичные аминокислотные замены в заменимых областях полипептида существенно не меняют биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4.sup.th Ed.)) Кроме того, замены структурно или функционально похожих аминокислот с меньшей вероятностью нарушат биологическую активность.

Термин «эффективное количество» охватывает количество, достаточное для смягчения или предупреждения симптома или признака медицинского состояния. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностирования. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее здоровье пациента, путь и доза введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол дозирования, который позволяет избежать значительных побочных эффектов или токсичных действий.

Термин «экзогенный» относится к веществам, которые образуются вне организма, клетки или организма человека, в зависимости от контекста. Термин «эндогенный» относится к веществам, которые образуются в пределах клетки, организма или организма человека, в зависимости от контекста.

Термин «гомология» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или двумя полипептидами. Когда положение в обеих из двух последовательностей, подлежащих сравнению, занято одной и той же мономерной субъединицей - основанием или аминокислотой - например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, тогда данные молекулы являются гомологичными в данном положении. Процент гомологии двух последовательностей является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, являющихся общими у данных двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений с умножением на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, когда последовательности оптимально выровнены, тогда данные две последовательности являются гомологичными на 60%. Если 95 из 100 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, при оптимальном выравнивании последовательностей, тогда данные две последовательности являются гомологичными на 95%. В общем, сравнение осуществляют при выравнивании двух последовательностей с получением максимального процента гомологии.

В том виде, в котором они используются в данном документе, выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную клетку субъекта или полученные из нее культуры без учета числа переносов. Также понятно, что все потомство не может быть с точностью идентичным по содержанию ДНК вследствие целенаправленных или случайных мутаций. Включено потомство с мутациями, которое обладает такой же функциональной или биологической активностью, на что проведена проверка в исходно трансформированной клетке. В том случае, когда подразумеваются отличные обозначения, это будет ясно из контекста.

В том виде, в которой она используется в данном документе, фраза «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к способу или методике, в которой малые количества конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, амплифицируют, как описано, например, в патенте США №4683195. Обычно существует необходимость в доступности информации о последовательности с концов или за пределами исследуемой области, таким образом, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры; данные праймеры будут идентичными или сходными по последовательности с соответствующими нитями матрицы, подлежащей амплификации. 5'-концевые нуклеотиды данных двух праймеров могут быть идентичны концам материала, подлежащего амплификации. ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей РНК, конкретных последовательностей ДНК из тотальной геномной ДНК и кДНК, транскрибируемой с тотальной РНК клетки, последовательностей бактериофагов или плазмид и т.д. Обычно см. Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). В том виде, в котором она используется в данном документе, ПЦР считается одним, но не единственным примером способа амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты на основе полимеразной реакции с нуклеиновой кислотой, включающего применение известной нуклеиновой кислоты в качестве праймера и полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или генерации конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Термин «возможный» или «возможно» означает, что событие или ситуация, которая следует, может происходить, но не обязательно происходит, и описание включает примеры, в которых событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, фраза «возможно содержит 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела с конкретной последовательностью может присутствовать, но не обязательно присутствует.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более чем одно соединение согласно настоящему изобретению или его физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и другие химические компоненты, такие как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция нацелена на содействие введению в организм, облегчение поглощения активного ингредиента и оказание, таким образом, биологического действия.

Пример и тест

Далее в данном документе настоящее изобретение дополнительно описано со ссылкой на примеры. Однако, объем настоящего изобретения не ограничивается ими. В примерах настоящего изобретения, где не описаны конкретные условия, эксперименты обычно проводят в общепринятых условиях, как описано в руководстве по лабораторным технологиям с антителами и руководстве по молекулярному клонированию Колд-Спринг-Харбор, или в условиях, предложенных производителями материалов или продуктов. Когда источник реагентов конкретно не приведен, реагенты представляют собой имеющиеся в продаже общепринятые реагенты.

Пример 1. Получение антигена LAG-3 и антитела

1. Конструирование и экспрессия белка

Белок гена активации лимфоцитов 3 UniProt (человеческий LAG-3, Uniprot: Р18627) использовали в качестве матрицы LAG-3, и аминокислотные последовательности антигена и белка, используемого для выявления, конструировали, возможно разные метки сливали с белком LAG-3 и затем клонировали в вектор pHr (полученный самостоятельно) или вектор рТТ5 (Biovector, Кат №:102762) или вектор pTargeT (Promega, А1410). Белок антиген и белок для выявления по настоящему изобретению временно экспрессировали в клетках 293 или стабильно экспрессировали в CHO-S, очищали и получали.

Следующие антигены LAG-3 относятся к человеческому LAG-3, если конкретно не описано иное.

Внеклеточный домен LAG-3 с Flag-меткой: LAG-3-Flag, для иммунизации мышей.

Примечание: Подчеркнутая последовательность представляет сигнальный пептид, и фрагмент, выделенный курсивом, относится к последовательности Flag-метки.

Полноразмерная последовательность LAG-3: Используемая для конструирования LAG-3-сверхэкспрессирующей клеточной линии, для иммунизации мышей и выявления.

Примечание: Сигнальный пептид плюс внеклеточный домен плюс трансмембранная область плюс внутриклеточный домен

Слитый белок внеклеточного домена LAG-3 и Fc hIgG1: LAG-3-Fc, для выявления

Примечание: Подчеркнутая последовательность представляет сигнальный пептид, дважды подчеркнутая последовательность представляет линкер и фрагмент, выделенный курсивом, представляет Fc.

Слитый белок внеклеточного домена LAG-3 и Fc mIgG2a: LAG-3-mFc, для выявления

Примечание: Подчеркнутая последовательность представляет сигнальный пептид, дважды подчеркнутая последовательность представляет линкер и фрагмент, выделенный курсивом, представляет Fc.

2. Очистка LAG-3-связанного рекомбинантного белка, а также антитела гибридомы и рекомбинантного антитела

1. Стадии очистки рекомбинантного белка LAG-3-Flag с Flag-меткой

Образец центрифугировали при высокой скорости с удалением примесей и концентрировали до соответствующего объема. Затем, колонку со сродством к flag уравновешивали 0,5 × PBS (от англ. phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор) и промывали 2-5 объемами колонки. Образцы супернатанта загружали на колонку после удаления примеси. Промывание колонки 0,5 × PBS до тех пор, пока считывание при А280 не уменьшалось до исходного уровня. Затем, колонку промывали PBS, и нечистый белок смывали и затем собирали. Целевой белок элюировали 100 мМ глицином, рН 3,0, и собирали для дальнейшей активации и очистки in vitro.

2. Стадии очистки антитела гибридомы, рекомбинантного антитела и слитого белка Fc

Супернатант экспрессирующих клеток центрифугировали при высокой скорости с удалением примесей, супернатант экспрессирующей гибридомы очищали посредством колонки с белком G, рекомбинантное антитело и слитый белок Fc очищали посредством колонки с белком А. Промывание колонки 0,5 × PBS до тех пор, пока считывание при А280 не уменьшалось до исходного уровня. Затем целевой белок элюировали 100 мМ уксусной кислотой (рН 3,0) и нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН 8,0. Элюированный образец, как следует, концентрировали и дополнительно очищали с использованием колонки Superdex200 (GE) для гель-хроматографии, которую уравновешивали PBS, пик несоответствий исключали, и правильный образец аликвотировали для использования.

Пример 2. Получение моноклонального антитела против человеческого LAG-3

1. Иммунизация

Моноклональное антитело против человеческого LAG-3 получали посредством иммунизации мышей. Экспериментальные белые мыши SJL, самки, 6-недельного возраста (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на производство животных: SCXK (Пекин) 2012-0001). Среда кормления: уровень SPF (от англ. specific pathogen free - свободный от специфической патогенной микрофлоры). После приобретения мышей, животных держали в лаборатории в течение 1 недели, с 12/12-часовым циклом свет/темнота, при температуре 20-25°С и с влажностью 40-60%. Мышей, которые были адаптированы к данной окружающей среде, иммунизировали в соответствии со следующими схемами. Иммунный антиген представлял собой внеклеточный домен LAG-3 с Flag-меткой (SEQ ID NO: 1).

Схема А: осуществляли перекрестную иммунизацию мышей адъювантом TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma, номер партии: Т2684) и Thermo Imject® Alum (Thremo, номер партии: 77161). Отношение антигена к адъюванту (TiterMax® Gold Adjuvant) составляло 1:1, и отношение антигена к адъюванту (Thermo Imject® Alum) составляло 3:1, с дозой 50 мкг/мышь (первая иммунизация) и 25 мкг/мышь (повторная иммунизация). После эмульгирования антигена осуществляли инокуляцию мышам в сутки 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. В сутки 0 мышам, в несколько мест, подкожно (п.к.) инъецировали эмульгированный антиген, 50 мкг/мышь. В сутки 7 мышам внутрибрюшинно (в.б.) инъецировали 25 мкг/мышь. В сутки 14, 28, 35 и 42 либо инъекцию в спину, либо внутрибрюшинную инъекцию антигена выбирали в соответствии с шишечками на спине и отечными состояниями в области живота. Образцы крови собирали в сутки 21, 35, 49, и титры антител в мышиной сыворотке определяли посредством ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ). После 7 иммунизаций мышей с более высоким титром антител и титром, тяготеющим к поверхности в их сыворотке, отбирали для слияния спленоцитов, повторную иммунизацию осуществляли посредством в.б. инъекции раствора антигена, приготовленного с помощью физиологического раствора, 50 мкг/мышь, за 3 суток до слияния спленоцитов.

Схема В: Осуществляли иммунизацию мышей QuickAntibody-Mouse5W (KX0210041). Отношение антигена к адъюванту составляло 1:1, 25 мкг/мышь (первая иммунизация/повторная иммунизация). Антиген и адъювант быстро смешивали и использовали для инокуляции. Осуществляли инокуляцию мышам в сутки 0, 21 и 35. В сутки 0 мыши инъецировали антигены через икроножные мышцы задней лапы (в.м.), 25 мкг/мышь. В сутки 21 и 35 повторяли тот же путь инъекции, 25 мкг/мышь, (то, проводить ли третью иммунизацию или нет, зависело от титра антитела). Образцы крови собирали в сутки 28 и 42. Титр антитела в мышиной сыворотке определяли посредством ELISA. Мышей с более высоким титром антител и титром, тяготеющим к поверхности в их сыворотке, отбирали для слияния спленоцитов, повторную иммунизацию проводили посредством в.б. инъекции раствора антигена, приготовленного с помощью физиологического раствора, 50 мкг/мышь, за 3 суток до слияния спленоцитов.

2. Слияние спленоцитов

Клетки гибридомы получали посредством слияния лимфоцитов селезенки с клетками миеломы Sp2/0 (ATCC®CRL-8287™) посредством использования оптимизированного способа слияния, опосредованного ПЭГ (полиэтиленгликоль). Полученные клетки гибридомы ресуспендировали в полной среде (среда DMEM (от англ. Dulbecco modified Eagle’s medium - среда Иглу, модифицированная по Дульбекко), содержащая 20% FBS (от англ. Fetal Bovine Serum - фетальная телячья сыворотка), 1×НАТ (от англ. hypoxanthine-aminopterinethymidine - гипоксантин аминоптеринтимидин), 1×OPI) при плотности 0,5-1×10⁶/мл и инкубировали в 96-луночном планшете для клеточных культур, 100 мкл/лунка. После инкубации при 37°С, 5% CO₂ в течение 3-4 суток добавляли 100 мкл/лунка полной среды HAT, и культивирование продолжали в течение 3-4 суток до образования иглоподобного клона. Супернатант удаляли и добавляли 200 мкл/лунка полной среды НТ (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×НАТ, 1×OPI), культивировали при 5% CO₂, 37°С в течение трех суток и затем выявляли посредством анализа ELISA.

3. Скрининг клеток гибридомы

Супернатант культуры гибридомы выявляли посредством ELISA связывания (см. Пример тестирования 1) в соответствии с плотностью роста клеток гибридомы. Эксперименты по блокированию связывания антигена с клетками проводили с позитивными лунками ELISA (см. Пример тестирования 3). Клетки, которые являлись позитивными как в отношении экспериментов по связыванию, так и в отношении экспериментов по блокированию, размножали и хранили в замороженном виде точно по времени, и клетки субклонировали от двух до трех раз до тех пор, пока не был получен клон из одной клетки.

После каждой процедуры субклонирования клетки подвергали ELISA связывания LAG-3 и анализу блокирования связывания антигена с клетками (см. Пример тестирования 1 и Пример тестирования 3). Клоны гибридомы получали посредством вышеуказанных экспериментов по скринингу, и антитело в дальнейшем получали способом на основе клеточной культуры, не содержащей сыворотку, и затем антитело очищали в соответствии с примером очистки для использования в примерах тестирования.

4. Секвенирование позитивного клона гибридомы Способ клонирования последовательности из позитивной гибридомы выглядел следующим образом: сбор клеток гибридомы в логарифмическую фазу роста и выделение РНК Тризолом (Invitrogen, кат. №15596-018) в соответствии с инструкциями к набору, и затем проведение обратной транскрипции с набором обратной транскриптазы PrimeScript™ (Takara, кат. №2680А). кДНК, полученную в результате обратной транскрипции, амплифицировали посредством ПЦР с использованием набора праймеров к мышиному Ig (Novagen, ТВ326 Rev.В 0503), и секвенирование проводили в компании по секвенированию. Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей, соответствующие ДНК-последовательностям клона гибридомы mAb229 и mAb303, показаны в SEQ ID NO: 5, 6 и SEQ ID NO: 7, 8, соответственно.

Полученные позитивные клоны подвергали анализу ELISA связывания с человеческим LAG-3 (Пример тестирования 1, результаты значения ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) для активности связывания с белком показаны в Таблице 2), анализу ELISA связывания с клетками CHO-s, сверхэкспрессирующими человеческий LAG-3 (Пример тестирования 2, результаты значений ЕС50 для активности связывания с клетками показаны в Таблице 2) и анализу блокирования связывания антигена LAG-3 с клетками Дауди (Пример тестирования 3, результаты значения ЕС50 для блокирующей активности показаны в Таблице 2), и анализу их аффинности к человеческому белку LAG-3 (см. Пример тестирования 4, результаты показаны в Таблице 3).

Результаты, показанные в таблице 2, показывают, что оба антитела против LAG-3 mAb229 и mAb303 демонстрировали прекрасную активность связывания с человеческим белком LAG-3, и данные два антитела также демонстрировали превосходную активность связывания с клетками CHO-S, сверхэкспрессирующими полноразмерный человеческий белок LAG-3. Оба антитела против LAG-3 mAb229 и mAb303 значимо блокировали связывание человеческого антигена LAG-3 с клетками Дауди.

Результаты, показанные в таблице 3, показывают, что антитела против LAG-3 mAb229 и mAb303 по настоящему изобретению демонстрировали более сильную активность связывания и аффинность к человеческому белку LAG-3.

Пример 3. Гуманизация мышиного моноклонального антитела гибридомы против человеческого LAG-3 mAb229

Посредством сравнения в базе данных с генами вариабельных областей тяжелых и легких цепей человеческих антител IMGT и программе МОЕ гены вариабельных областей тяжелых и легких цепей зародышевой линии с высокой гомологией с mAb229 отбирали в качестве матриц, CDR, происходящие из мышиных антител, прививали в соответствующую матрицу человеческого происхождения с образованием последовательности вариабельной области с порядком FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Где аминокислотные остатки идентифицировали и аннотировали в соответствии с системой нумерации Kabat.

1. Отбор каркаса для гуманизации клона гибридомы mAb229

Матрица легкой цепи для гуманизации мышиного антитела mAb229 представляет собой IGKV1-39*01 и hjk4.1, матрица тяжелой цепи для гуманизации представляет собой IGHV7-4-1*01 и hjh6.1, последовательности гуманизированной вариабельной области выглядят следующим образом:

Hu229VH-CDR прививка

Hu229VL-CDR прививка

Примечание: Порядок выглядит следующим образом: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, последовательность, выделенная курсивом, представляет последовательность FR, а подчеркнутая последовательность представляет последовательность CDR.

2. Выбор матрицы и схема обратных мутаций для клона гибридомы mAb229, см. приведенную ниже Таблицу 4:

Примечание: Например, I48V обозначает обратную мутацию I на V в положении 48 в соответствии с системой нумерации Kabat. «С прививкой» указывает на то, что CDR мышиного антитела внедряли в последовательности FR зародышевой линии человека.

Примечание: в данной таблице показаны разные комбинации последовательностей разных мутаций. Например, Hu229-005 указывает на то, что в гуманизированном мышином антителе Hu229-005 присутствуют две мутации (HumAb229_VL.1A легкой цепи и HumAb229_VH.1 тяжелой цепи), и т.д.

Последовательности гуманизированного антитела mAb229 выглядят следующим образом:

Hu229VH.1 (идентична Hu229VH-CDR прививка)

Hu229VH.1A

Hu229VH.1B

Hu229VH.1C

Hu229VL.1 (идентична Hu229VL-CDR прививка)

Hu229VL.1A

Hu229VL.1B

Hu229VL.1C

Пример 4. Гуманизация мышиного моноклонального антитела гибридомы против человеческого LAG-3 mAb303

Посредством сравнения в базе данных с генами вариабельных областей тяжелых и легких цепей человеческих антител IMGT и программе МОЕ гены вариабельных областей тяжелых и легких цепей зародышевой линии с высокой гомологией с mAb303 отбирали в качестве матриц, CDR, происходящие из мышиных антител, прививали в соответствующую матрицу человеческого происхождения с образованием последовательности вариабельной области с порядком FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Где аминокислотные остатки идентифицировали и аннотировали в соответствии с системой нумерации Kabat.

1. Отбор каркаса для гуманизации клона гибридомы mAb303

Матрица в виде легкой цепи для гуманизации мышиного антитела mAb303 представляет собой IGKV1-39*01 и hjk4.1, матрица в виде тяжелой цепи для гуманизации представляет собой IGHV1-3*01 и hjh6.1, последовательности гуманизированной вариабельной области выглядят следующим образом:

Hu303VH-CDR прививка

Hu303VL-CDR прививка

Примечание: Порядок выглядит следующим образом FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, последовательность, выделенная курсивом, представляет последовательность FR, а подчеркнутая последовательность представляет последовательность CDR.

2. Выбор матрицы и схема обратных мутаций клона гибридомы mAb303, см. приведенную ниже Таблицу 6:

Примечание: Например, L46R обозначает обратную мутацию L на R в положении 46 в соответствии с системой нумерации Kabat. «С прививкой» указывает на то, что CDR мышиного антитела внедряли в последовательности FR зародышевой линии человека.

Комбинации последовательностей разных мутаций выглядят следующим образом:

Примечание: В данной таблице показаны разные комбинации последовательностей разных мутаций. Например, Hu303-005 указывает на то, что две мутации (HumAb303_VL.1A легкой цепи и HumAb303_VH.1 тяжелой цепи) присутствуют на гуманизированном мышином антителе Hu303-005, и т.д.

Последовательности гуманизированного антитела mAb303 выглядят следующим образом:

Hu303_VH.1 (идентична Hu303VH-CDR прививка)

Hu303_VH.1A

Hu303_VH.1B

Hu303_VH.1C

Hu303_VL.1 (идентична Hu303VL-CDR прививка)

Hu303_VL.1A

Hu303_VL.1B

Hu303_VL.1C

Hu303_VL.1D

Пример 5. Получение рекомбинантного и гуманизированного антитела Антитело конструировали с константной областью, происходящей из человеческой тяжелой цепи IgG4/легкой цепи каппа, в комбинации с каждой вариабельной областью, и в Fc делали мутацию S228P с увеличением стабильности антитела IgG4. Другие мутации, известные в данной области, также можно использовать для повышения его эффективности.

Константная область тяжелой цепи:

Константная область легкой цепи:

1. Молекулярное клонирование рекомбинантного антитела

Последовательности, кодирующие вариабельные области, получали посредством секвенирования позитивных молекул антитела, полученных в результате скрининга гибридомы. Праймеры конструировали в соответствии с полученной последовательностью, секвенируемый ген использовали в качестве матрицы, и разные фрагменты гена антитела VH/VK конструировали посредством ПЦР и затем воссоздавали с использованием экспрессионного вектора pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом константной области hIgG4/hкаппа (CH1-FC/CL)) с конструированием экспрессионной плазмиды VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr для полноразмерного рекомбинантного антитела.

2. Молекулярное клонирование гуманизированного антитела Сконструированную последовательность гуманизированного антитела подвергали оптимизации кодонов и генерировали кодирующую последовательность с предпочтительными для человека кодонами. Конструировали праймеры и посредством ПЦР конструировали разные фрагменты гена VH/VK антител и затем воссоздавали с помощью экспрессионного вектора pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом константной области hIgG4/hкаппа (CH1-FC/CL)) с конструированием экспрессионной плазмиды VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr для полноразмерного гуманизированного антитела.

3. Экспрессия и очистка рекомбинантного и гуманизированного антитела

Клетку HEK293E совместно трансфицировали плазмидами для раздельной экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи антитела в соотношении 1:1,2. Экспрессионный супернатант собирали после 6 суток и примеси удаляли посредством высокоскоростного центрифугирования и затем очищали колонкой с белком А. Колонку промывали PBS до тех пор, пока считывание при А280 не уменьшалось до исходного уровня. Целевой белок элюировали кислотным элюирующим буфером, рН 3,0-рН 3,5, и нейтрализовали 1М Tris-HCl, рН 8,0-9,0. Элюент, как следует, концентрировали и дополнительно очищали посредством колонки для гель-хроматографии Superdex200 (GE), которую уравновешивали PBS. Пик несоответствий исключали, а пик элюирования собирали. Затем правильный образец аликвотировали для использования.

Эффективность и полезные свойства антитела по изобретению проверены биохимическими способами тестирования, как описано ниже.

Пример тестирования 1. ELISA анализ связывания антитела против LAG-3 с человеческим белком LAG-3

Способность к связыванию антитела против LAG-3 с человеческим белком LAG-3 выявляли посредством анализа ELISA. Слитый белок LAG-3 с Fc или mFc-меткой иммобилизировали в 96-луночный планшет для микротитрования посредством связывания с антителом против Fc или mFc, которым покрыт планшет для микротитрования, интенсивность сигнала после добавления антитела использовали для определения активности связывания антитела с LAG-3, конкретный экспериментальный способ состоит в следующем:

Антитело козы против человеческого Fc (Jackson Immuno Research, кат №109-005-008) или антитело козы против мышиного Fc (Sigma, кат № M3534-1ML) разводили до концентрации 2 мкг/мл буфером PBS при рН 7,4 и добавляли в 96-луночный планшет в объеме 50 мкл/лунка, и затем планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2 часов. После отбрасывания жидкости планшеты блокировали 200 мкл/лунка блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренное молоко (обезжиренное молоко Guangming) в PBS, и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2,5 часов или в течение ночи при 4°С (16-18 часов). После блокирования блокирующий раствор отбрасывали, и планшет 5 раз промывали буфером PBST (PBS, содержащий 0,05% твин-20, рН 7,4). Слитый белок LAG-3-Fc (SEQ ID NO:3, полученный самостоятельно) или слитый белок LAG-3-mFc (SEQ ID NO: 4, полученный самостоятельно) разводили буфером для разведения образца (PBS, содержащий 1% BSA (от англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин, РН7,4) до 1 мкг/мл и добавляли в каждую лунку, 50 мкл/лунка. Затем планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 1 ч или в течение ночи при 4°С. После инкубации реакционный раствор в планшете отбрасывали, и планшет 6 раз промывали PBST и затем в него добавляли 50 мкл/лунка разных концентраций тестируемого антитела (очищенное антитело гибридомы или гуманизированное антитело), разведенного буфером для разведения образца, и планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшет 5 раз промывали PBST после инкубации и в него добавляли 100 мкл/лунка вторичного антитела козы против мышиного антитела (Jackson Immuno Research, кат.№115-035-003) или вторичного антитела козы против человеческого антитела (Jackson Immuno Research, кат №109-035-003), меченного HRP (от англ. horseradish peroxidase - пероксидаза хрена), разводили в буфере для разведения образца, и планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После промывания планшетов PBST 6 раз в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунка хромогенного субстрата ТМВ (от англ. tetramethylbenzidine - тетраметилбензидин) (KPL, кат. №52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл/лунка 1М H₂SO₄. Значение OD (от англ. optical density - оптическая плотность) при длине волны 450 нм считывали на микропланшете-ридере NOVOStar, и затем рассчитывали значения ЕС50 связывания антитела против LAG-3 с человеческим LAG-3. Результаты показаны в Таблице 8. Данные показали, что все гуманизированные антитела, полученные способом скрининга в настоящем изобретении, демонстрировали превосходные активности связывания с человеческим белком LAG-3.

Пример тестирования 2. Анализ связывания антитела против LAG-3 с клетками CHO-s, сверхэкспрессирующими человеческий LAG-3 Способность к связыванию антитела против LAG-3 с клетками CHO-S, сверхэкспрессирующими белок LAG-3, выявляли посредством анализа связывания.

Клетки CHO-S трансфицировали плазмидой с полноразмерным LAG-3 (полученной самостоятельно, SEQ ID NO: 2) посредством электропорации, и уровень экспрессии LAG-3 выявляли, после двух недель скрининга, проводимого после приложения давления. Клетки, сверхэкспрессирующие LAG-3, фиксировали на дне 96-луночного планшета, и интенсивность сигнала после добавления антитела использовали для определения активности связывания антитела с клетками CHO-S, сверхэкспрессирующими человеческий LAG-3, конкретный экспериментальный способ состоит в следующем.

100 мкл/лунка клеток засевали в 96-луночный планшет с плотностью 4×10⁵/мл и инкубировали в течение ночи. Супернатант отбрасывали, и планшет три раза промывали PBS, добавляли 4% PFA (от англ. paraformaldehyde - параформальдегид), 100 мкл/лунка, с фиксацией в течение получаса при комнатной температуре, и затем планшет три раза промывали PBS. После отбрасывания жидкости планшет блокировали 200 мкл/лунка блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренное молоко (обезжиренное молоко Guangming), разведенное в PBS, и инкубировали при 37°С в течение 2,5 часов. После блокирования блокирующий раствор отбрасывали, и планшет 5 раз промывали буфером PBST (PBS, содержащий 0,05% твин-20, рН 7,4), затем в него добавляли 50 мкл/лунка тестируемого антитела (очищенное антитело гибридомы или гуманизированное антитело) с разными концентрациями, разведенного буфером для разведения образца, и затем инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 1 ч. Планшет 5 раз промывали PBST после инкубации, в них добавляли 100 мкл/лунка вторичного антитела козы против мышиного антитела (Jackson ImmunoResearch, кат.№115-035-003) или вторичного антитела козы против человеческого антитела (Jackson Immuno Research, кат. №109-035-003), меченного HRP, разбавленного буфером для разведения образца, и планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После промывания планшетов PBST 6 раз в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунка хромогенного субстрата ТМВ (KPL, кат.No. 52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-15 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл/лунка 1М H₂SO₄. Значение OD при длине волны 450 нм считывали на микропланшете-ридере NOVOStar, и затем рассчитывали значения ЕС50 связывания антитела против LAG-3 с клеткой CHOs, сверхэкспрессирующей LAG-3.

Пример тестирования 3. Анализ антитела против LAG-3 в отношении блокирования связывания антигена LAG-3 с клетками Дауди

Клетки Дауди (клетки лейкоза человека, приобретенные у банка клеток китайской академии наук) засевали в 96-луночный планшет с плотностью 3×10⁵/лунка. После центрифугирования при 1000 об/мин супернатант отбрасывали, и затем в планшет добавляли 4% PFA для фиксации в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшет 4 раза промывали PBS после отбрасывания фиксированного раствора, планшет блокировали 200 мкл/лунка блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренное молоко (обезжиренное молоко Guangming), разведенное в PBS, и инкубировали при 37°С в течение 2,5 часов. После блокирования блокирующий раствор отбрасывали, и планшет 5 раз промывали буфером PBST (PBS, содержащий 0,05% твин-20, рН 7,4), в него добавляли 50 мкл/лунка смеси меченного биотином слитого белка LAG-3-Fc (полученного самостоятельно, SEQ ID NO: 3), разведенного буфером для разведения образца (PBS, содержащий 1% BSA, РН 7,4) до конечной концентрации 0,4 мкг/мл, где биотин (набор для мечения биотином, Dojindo Chemical, кат.№LK03) предварительно перемешивали в течение 1 часа, и градиента концентраций антитела, подлежащего тестированию, затем планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Реакционный раствор отбрасывали, и планшет 5 раз промывали PBST после инкубации, в него добавляли 50 мкг/лунка HRP-меченного стрептавидина (Sigma, кат. №S2438), который разводили буфером для разведения образца, и планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После промывания планшета PBST в количестве 5 раз в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунка хромогенного субстрата ТМВ (KPL, кат. №52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-15 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 1М H₂SO₄. Значение OD при длине волны 450 нм считывали на микропланшете-ридере NOVOStar, и затем рассчитывали активность антитела против LAG-3 в блокировании связывания антигена с клетками Дауди. Результаты показаны в Таблице 9. Данные показывают, что все из гуманизированных антител, полученных способом скрининга в настоящем изобретении, значимо блокировали связывание антигена-человеческого LAG-3 с клетками Дауди.

Пример тестирования 4. BIAcore анализ аффинности антитела против LAG-3 1. Захватывающее антитело против мышиного антитела ковалентно связывали с биочипом СМ5 (Кат. №BR-1000-12, GE) в соответствии со способом, описанным в наборе для захвата мышиного антитела (кат.№BR-1008-38, GE), таким образом, что тестируемое антитело захватывалось благодаря аффинности. Затем, антиген LAG-3-Flag (самостоятельно полученный, SEQ ID NO:1) пропускали через поверхность биочипа, и сигнал от взаимодействия выявляли в реальном времени с использованием прибора Biacore с получением кривых связывания и диссоциации, значение аффинности получали в результате аппроксимации, см. приведенную выше таблицу 2. После окончания каждого цикла диссоциации в эксперименте биочип промывали и регенерировали регенерирующим раствором, предоставленным в наборе для захвата мышиных антител. Результаты демонстрируют, что антитела против LAG-3 mAb229 и mAn303 демонстрировали превосходную активность связывания и аффинность к человеческому белку LAG-3.

2. Захватывающее антитело против человеческого антитела ковалентно связывали с биочипом СМ5 (Кат.№BR-1000-12, GE) в соответствии со способом, описанным в наборе для захвата человеческого антитела (кат. №BR-1008-39, GE), таким образом, что тестируемое антитело захватывалось благодаря аффинности. Затем, антиген LAG-3-Flag (самостоятельно полученный, SEQ ID NO:1) пропускали через поверхность биочипа, и сигнал от взаимодействия выявляли в реальном времени с использованием прибора Biacore с получением кривых связывания и диссоциации, значение аффинности получали в результате аппроксимации, см. приведенную ниже таблицу 10. После окончания каждого цикла диссоциации в эксперименте биочип промывали и регенерировали регенерирующим раствором, предоставленным в наборе для захвата человеческих антител. Результаты демонстрируют, что антитела, полученные способом скрининга в настоящем изобретении, демонстрировали превосходную активность связывания и аффинность к человеческому белку LAG-3.

Пример тестирования 5. Активация РВМС-Т-лимфоцитов

Для исследования эффекта антитела против LAG-3, оказываемого на активацию Т-лимфоцитов, мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС - от англ. human peripheral blood mononuclear cell) собирали и очищали. Уровень секреции цитокинов IL-2 измеряли после стимуляции супер-антигеном энтеротоксина В Staphylococcus aureus (SEB) in vitro в течение 72 ч. Экспериментальный процесс кратко описан ниже:

свежевыделенные и очищенные РВМС засевали в 96-луночный планшет для клеточной культуры с плотностью клеток примерно 1×10⁵/лунка и добавляли 100 нг/мл стимула-супер-антигена SEB, и одновременно добавляли градиентно разведенные образцы антител (разведенные средой) или среду в качестве холостого контроля. Затем, планшет инкубировали при 37°С, 5% CO₂ в течение 72 ч, собирали супернатант клеточной культуры. Уровень секретируемого IL-2 в супернатанте культуры измеряли посредством ELISA (BD, кат. №550611). Подробно описанные способы указаны в руководстве от производителей. Результат показан на фиг.1. Оба гуманизированных антитела против LAG-3 Hu229-013 и Hu303-005 могут увеличивать уровни цитокина IL-2, секретируемого активированными Т-лимфоцитами, в разной степени и имеют дозозависимый эффект от концентрации лекарственного средства.

Пример тестирования 6. Ингибирование подкожно инокулированной опухоли U-87MG антителом против LAG-3

В данном исследовании измеряли эффект от гуманизированного антитела против LAG-3 на объем опухоли мышей, несущих опухоль U-87 MG.

100 мкл клеток глиомы человека U87 MG (3,5×10⁶ клеток) инокулировали подкожно в правые ребра мышей NOD-SCID (приобретенных у Changzhou Cavion Experimental Animal Co., Ltd.). Когда опухоль вырастала до 40 мм³ после 10-14 суток, мышей, за исключением мышей со слишком большой или слишком маленькой массой тела или объемом опухоли, случайным образом делили на три группы: контрольная группа с изотипом, соответствующим hIgG, группа с антителами-кандидатами против LAG-3 Hu229-013 и группа с антителами-кандидатами против LAG-3 Hu303-005, в соответствии с объемом опухоли (распределение по группам и дозировку см. в Таблице 1), каждая группа из 8 мышей (D0). РВМС, стимулированные антителом против CD3, инъецировали в опухолевые ткани в количестве 5×10⁵ клеток/60 мкл, и инъецирование тестируемого антитела начинали посредством в.б. инъекции, три раза в неделю всего 6 раз. Мышей измеряли в отношении объема опухоли дважды в неделю, данные записывали. Объем опухоли (V) рассчитывали как:

Объем опухоли (TV)=1/2×a×b², где а и b представляют длину и ширину, соответственно.

Объем опухоли каждой группы выражали как среднее плюс/минус стандартная ошибка (среднее плюс/минус SEM) и откладывали на графике с помощью программы Graphpad Prism 5, анализировали посредством двухфакторного дисперсионного статистического анализа ANOVA, и степень ингибирования опухоли рассчитывали согласно следующей формуле:

Степень пролиферации опухоли (Т/С%)=(Т-Т₀/С-С₀)×100%

Степень ингибирования опухоли % TGI=1-Т/С %

Результат показан в таблице 11 и на фиг. 2, указывая на то, что спустя 14 суток после введения, оба антитела против LAG-3 Hu229-013 6mpk и Hu303-005 6mpk оказывали определенный противоопухолевый эффект, и степени ингибирования опухоли составляли 27,25% (р меньше 0,05) и 34,94% (р меньше 0,01), соответственно. Имело место значимое различие по сравнению с контрольной группой (р меньше 0,001 по сравнению с hIGg).

DO: Первый момент введения; * р<0,05, ** р<0,01, ***р<0,001 по сравнению с hIGg посредством двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA.

Пример тестирования 7. Анализ фармакокинетики (PK) гуманизированных антител против LAG-3 Hu229-013 и Hu303-005 у мыши

Восемнадцать мышей ICR, самцов массой от 18 до 22 г, приобретали у West Poole-Bikai Experimental Animal Co., Ltd. Во время периода кормления мышам давали неограниченный доступ к воде и рациону, продолжительность адаптации в лабораторной среде составляет не меньше чем 3 суток, с 12/12-часовой регуляцией цикла свет/темнота, при температуре 16-26°С и относительной влажности 40-70%. Мышей ICR нумеровали и случайным образом подразделяли на разные группы за одни сутки до начала эксперимента, каждая группа состояла из 3 мышей. В день эксперимента двум группам мышей внутривенно инъецировали гуманизированное антитело-кандидат (Hu229-013) в дозе 3 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно; Другим двум группам мышей внутривенно инъецировали гуманизированное антитело-кандидат (Hu303-005) в дозе 3 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно. Объем внутривенной инъекции составляет 20 мл/кг.

Образцы крови собирали в момент времени 15 мин, 8 ч, 1 сутки, 2 суток, 7 суток, 10 суток, 14 суток, 21 сутки, 28 суток и 35 суток после введения. Каждый раз примерно 0,1 мл цельной крови отбирали в центрифужную пробирку без антикоагулянта, помещали при 4°С на 30 мин и затем центрифугировали при 1000g в течение 15 мин. Затем супернатант отбирали с помощью пипетки в пробирку ЕР и хранили при -80°С.

Концентрацию лекарственного средства в сыворотке измеряли посредством ELISA и рассчитывали Т1/2 и другие основные параметры посредством программы Winnolin. Основные фармакокинетические параметры показаны в Таблице 12:

Площади под кривой (AUC - от англ. Area Under the Curve) гуманизированных антител против LAG-3 Hu229-013 и Hu303-005 у мышей были похожи, и AUC и пиковые концентрации данных двух антител в дозе 3 и 10 мг/кг линейно коррелировали с возрастающей дозой и демонстрировали линейные фармакокинетические характеристики.

Пример тестирования 8. Физическая стабильность антитела Данный пример тестирования использовали для выявления физической стабильности гуманизированных антител против LAG-3 Hu229-013 и Hu303-005.

Термостабильность разных антител выявляли посредством ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия), и сравнивали стабильность антитела в разных буферных системах и разных условиях рН. Буферные системы, соответствующие разным значениям рН, представляют собой, например, PBS (рН 7,4), 10 мМ His/135 мМ NaCl (рН 6,0), 10 мМ ацетат/135 мМ NaCl (рН 5,2).

Образец растворяли в соответствующем буфере и концентрацию образца поддерживали на уровне примерно 1 мг/мл и выявляли с использованием капиллярного дифференциального сканирующего калориметра (ДСК) MicroCal* VP (Malvern). Перед тестированием каждый образец и холостой буфер дегазировали с помощью вакуумного дегазирующего устройства в течение 1-2 мин. В каждую лунку добавляли 400 мкл образца или холостого буфера (количество загрузки составляло 300 мкл). Наконец, в две пары лунок добавляли 14% Decon 90 и ddH₂O, соответственно, для промывки. После загрузки планшета образцом, планшет герметично закрывали пластиковой крышкой. Сканирование начинали с температуры 25°С до 100°С, и скорость сканирования составляет 60°С/ч. Результаты показаны в таблице 13, показывая, что оба антитела Hu229-013 и Hu303-005 демонстрировали прекрасную термостабильность в нескольких тест-системах.

Контроль чистоты образцов проводили посредством эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC - от англ. Size-Exclusion Chromatography-High performance liquid chromatography), и исследовали периодическую стабильность в определенных условиях. Типичные условия заключаются, например, в контроле концентрации образца на уровне примерно 50 мг/мл и сравнении стабильности разных антител, которых неоднократно подвергали замораживанию и оттаиванию при -80°С в количестве 5 раз в системе PBS (рН 7,4) и хранили при 4°С и 40°С в течение одного месяца. Для выявления использовали колонку для HPLC Xbridge protein ВЕН SEC 200А (Waters). Результаты показаны в Таблице 14, указывая на то, что оба антитела демонстрировали лучшую стабильность.

Примечание: Δ% указывает на степень уменьшенной HPLC чистоты

Пример тестирования 9. Химическая стабильность антитела

Деамидирование представляет собой обычную химическую модификацию антител, которая может влиять на стабильность на более поздней стадии, особенно, обычно желательно избегать высокой степени модификации на основе деамидирования в аминокислотных остатках в области CDR или пытаться уменьшить мутации. 500 мкг тестируемого антитела растворяли в 500 мкл PBS при рН 7,4, и затем помещали на водяную баню при 40°С.Для ферментного анализа образцы отбирали в сутки 0, 3, 7. 100 мкг каждого образца, который отбирали в разные моменты времени, растворяли в 100 мкл 0,2 М His-HCl, 8 М раствора Gua-HCl, рН 6,0, и добавляли 3 мкл 0,1 г/мл дитиотреитола (ДТТ), и затем образец помещали на водяную баню при 50°С на 1 ч. После двукратной ультрафильтрации 0,02 М His-HCl, рН 6,0, добавляли 3 мкл 0,25 мг/мл трипсина для ферментативного расщепления на водяной бане при 37°С в течение ночи. Модификацию-деамидирование исследовали с использованием жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХ-МС) (Agilent 6530 Q-TOF), и результаты показаны в Таблице 15.

Примечание: N представляет модифицированный аспарагин, который выявляли, число показывает положение, отсчитываемое от N-конца легкой цепи или тяжелой цепи.

Процент представляет отношение модификации-деамидирования к суммарному сигналу пептида в данном сайте, выявляемому посредством ЖХ-МС.

Результаты масс-спектрометрии показывают, что в выявляемых антителах отсутствовало очевидно высокое относительное содержание сайтов модификации-деамидирования, что дает основания полагать, что химическая стабильность антитела является хорошей на более поздней стадии.

1. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи: (i) где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит: HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14, и где вариабельная область легкой цепи антитела содержит: LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 18, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 19, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 20; или (ii) где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит: HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11, и где вариабельная область легкой цепи антитела содержит: LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 15, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 16, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 17.

2. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело представляет собой мышиное антитело.

3. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в котором вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит каркасную область (FR) легкой цепи, происходящую из мышиной цепи κ, или ее вариант или область FR легкой цепи, происходящую из мышиной цепи λ, или ее вариант, где вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG1, или ее вариант, или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG2, или ее вариант, или область FR тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG3, или ее вариант.

4. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где мышиное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6, или содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 8.

5. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в котором легкая цепь антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из мышиной цепи κ, или ее вариант или константную область легкой цепи, происходящую из мышиной цепи λ, или ее вариант, где тяжелая цепь антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG1, или ее вариант, или константную область тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG2, или ее вариант, или константную область тяжелой цепи, происходящую из мышиного IgG3, или ее вариант.

6. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой химерное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

7. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

8. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, в котором последовательность FR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелых цепей зародышевой линии человека IGHV7-4-1*02 и hjh6.1 или ее мутантной последовательности; предпочтительно содержит FR1, FR2, FR3 из IGHV7-4-1*02 и FR4 из hjh6.1 или их мутантную последовательность; в качестве альтернативы последовательность FR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-3*01 и hjh6.1 или ее мутантной последовательности, предпочтительно содержит FR1, FR2, FR3 из IGHV1-3*01 и FR4 из hjh6.1 или их мутантную последовательность.

9. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, в котором последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 29, или имеет 1-10 аминокислотных замен в последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 29.

10. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где последовательность FR тяжелой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций; предпочтительно обратная мутация находится в области FR тяжелой цепи комбинированной последовательности тяжелых цепей зародышевой линии человека IGHV7-4-1*02 и hjh6.1 и представляет собой одну или несколько аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из E46K, R38K, V93T и Y95F; или предпочтительно обратная мутация находится в области FR тяжелой цепи комбинированной последовательности тяжелых цепей зародышевой линии человека IGHV1-3*01 и hjh6.1, и представляет собой одну или несколько аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из F29L, A97T, M48I, V68A, I70L, R72V и T74K.

11. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, в котором последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, или выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.

12. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, в котором последовательность FR легкой цепи вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела происходит из комбинированной последовательности легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и hjk4.1 или ее мутантной последовательности и содержит FR1, FR2, FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и FR4 из hjk4.1 или их мутантную последовательность.

13. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 14, в котором последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 30, или имеет 1-10 аминокислотных замен в последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 30.

14. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, в котором последовательность FR легкой цепи гуманизированного антитела имеет 0-10 аминокислотных обратных мутаций, предпочтительно одну или несколько обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из D70Q, F71Y, I48V и A43S, или предпочтительно одну или несколько обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из L46R, G66R, S60K, P44F, Y36L, K42G, I21L и T85D.

15. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, где последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, или выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37.

16. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где гуманизированное антитело содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25; в качестве альтернативы последовательность вариабельной области тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28; в качестве альтернативы последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37.

17. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где антитело содержит комбинацию вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующего: 1) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22; 2) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26; 3) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27; 4) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28; 5) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22; 6) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26; 7) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27; 8) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28; 9) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22; 10) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26; 11) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27; 12) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28; 13) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 22; 14) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 26; 15) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 27; 16) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 28; 17) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30; 18) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34; 19) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35; 20) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36; 21) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37; 22) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30; 23) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34; 24) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35; 25) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36; 26) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37; 27) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30; 28) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34; 29) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35; 30) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36; 31) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37; 32) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 30; 33) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 34; 34) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 35; 35) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 36; и 36) вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 37.

18. Антитело против LAG-3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 6-17, где тяжелая цепь химерного антитела или гуманизированного антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариант, предпочтительно константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG4, или ее вариант, наиболее предпочтительно константную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 38, где легкая цепь химерного антитела или гуманизированного антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из человеческой цепи κ, человеческой цепи λ, или ее вариант, более предпочтительно константную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 39.

19. Фармацевтическая композиция для лечения состояний, связанных со сверхэкспрессией LAG-3, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-18 и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

20. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-18.

21. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 20.

22. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-18, где клетка-хозяин трансформирована экспрессионным вектором по п. 21, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотических клеток и эукариотических клеток, предпочтительно эукариотических клеток, более предпочтительно клеток млекопитающих.

23. Способ получения антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-18, где способ включает экспрессирование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине по п. 22 и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

24. Способ ингибирования роста опухолевых клеток, связанных со сверхэкспрессией LAG-3, у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-18 или введение субъекту фармацевтической композиции по п. 19 или нуклеиновой кислоты по п. 20, ингибируя тем самым рост опухоли у субъекта.

25. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-18, или фармацевтической композиции по п. 19, или нуклеиновой кислоты по п. 20 в получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного со сверхэкспрессией LAG-3 и поражением патогенных Т-клеток, где заболевание или состояние предпочтительно представляет собой рак; рак включает рак яичников, меланому, рак предстательной железы, рак кишечника, рак желудка, рак пищевода, рак молочной железы, рак легкого, рак почки, рак поджелудочной железы, рак матки, рак печени, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак ротовой полости, рак мозга, рак яичка, рак кожи, рак щитовидной железы и гематологические злокачественные опухоли, включая миелому и хронический и острый лейкоз, но не ограничивается ими.