Оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот. Система состоит из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа и узла приёма сигнала флуоресценции. Место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, а светодиоды выполнены узкополосными и установлены вдоль боковых торцов чипа-картриджа. Узел приёма сигнала флуоресценции расположен над реакционными лунками чипа-картриджа, снабжён мультиспектральными сенсорами или отдельными фотодиодами. Изобретение обеспечивает повышение компактности, универсальности и быстродействия оптической системы с увеличением ее надежности при проведении различных исследований не только в лаборатории, но и в полевых условиях в режиме реального времени. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для использования оптической системы в компактном переносном приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени.

Из области техники известен прибор - «лаборатория на чипе», включающий лазерный источник с фильтром, первое и второе зеркала, управляющие направлением света, проходящего через первый фильтр, поляризатор, поляризующий свет, отраженный вторым зеркалом, светоделитель, разделяющий поляризованный свет, проходящий через поляризатор, линзу, которая коллимирует поляризованный свет на образец в микроканале, линзу, которая собирает флуоресценцию, излучаемую флуоресцентно меченными биоматериалами, третье зеркало, контролирующее направление флуоресценции, проходящей через линзу, второй фильтр, фильтрующий флуоресценцию, отраженную третьим зеркалом, поляризованный светоделитель, разделяющий флуоресценцию, проходящую через второй фильтр, третий фильтр, который фильтрует флуоресценцию, проходящую через поляризованный светоделитель, вертикальные и горизонтальные фотоэлектронные умножители, которые измеряют сигналы флуоресценции излучаемого света, проходящего через третий фильтр, в вертикальной и горизонтальной плоскостях, поляризатор, установленный перед горизонтальным ФЭУ, осциллограф, который измеряет поляризацию флуоресценции, проходящую через фотоэлектронные умножители (ФЭУ), между первым фильтром и первым зеркалом помещается оптический прерыватель, состоящий из вращающегося диска с прорезями, для периодического включения / выключения источника света (см. опубликованную заявку US2007117220, МПК C12M3/00, оп. в 2007 г.). Данное техническое решение представляет собой достаточно сложное и громоздкое устройство, которое количественно измеряет взаимодействие между биомолекулами и флуоресцентно мечеными биоматериалами, а также активность ферментов с использованием измерения поляризация флуоресценции FP.

Известен прибор для детектирования капельной ПЦР-амплификации на основе микрофлюидного чипа, включающий светодиодный источник возбуждения света, асферическую линзу, причем светодиод в качестве точечного источника света помещен в фокус линзы так, что свет, излучаемый светодиодом, коллимируется через линзу для формирования параллельного пучка света, отображаемого в области чип (см. патент CN109652298, Кл. C12M 1/00, оп. в 2019 г.). В этом устройстве капля, содержащая молекулы ДНК, вводится в капельный микрофлюидный чип с помощью пипетки, затем чип помещают в блок амплификации капельной ПЦР для проведения реакции ПЦР-амплификации, а флуорохром в капле возуждается с помощью светодиода и светофильтра. Изображение флуоресцентной капли фокусируют с помощью алгоритма автофокусировки. Затем получают ряд изображений различных частей чипа с помощью сканирования. Сделанные изображения объединяют для получения полной информации об исследуемой области капли чипа. С помощью этой автоматизированной конструкции получают конечный результат очень медленно. В ней не предусмотрено ускорение работы и увеличение количества исследуемых образцов.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является прибор для проведения ПЦР-анализа с помощью одноразового чипа, включающая оптическую головку, состоящую из 6 идентичных по устройству каналов, каждый из которых включает оптическую систему возбуждения и считывания флуоресценции, при этом система возбуждения состоит из излучающего светодиода, коллиматора, узкополосного светофильтра и объектива, с помощью которого освещается реакционная камера чипа, а для считывания флуоресцентного сигнала используют аналогичную оптическую схему с использованием регистрирующего фотодиода. Вся оптическая головка находится на каретке линейного привода и способна совершать движения вдоль камер чипа, последовательно считывая флуоресценцию из каждой реакционной камеры каждым из спектральных каналов (см. патент RU №2703776, МПК С12Q 1/6806, опубл. В 2019 году). Специфика медленной работы оптической системы и ее использования обоснованы ограничивающими конструктивными признаками прибора.

Техническая проблема заключается в том, что описанные устройства работают медленно и не обеспечивают достижения высокой точности исследований при проведении анализа прибором ПЦР в «полевых» (не лабораторных) условиях в режиме реального времени, например, при выезде на дом к больному, в автомобиле, на улице. В них остается нерешенной задача упрощения средств исследования при высокой результативности. Решение данной задачи не должно ограничиваться только возможностью проведения амплификации нуклеиновых кислот в лабораторных условиях. Найденное решение должно давать возможность проводить различные исследования не только в лабораторных условиях, но и в местах, не предназначенных для медицинских целей.

Настоящее изобретение направлено на решение технической задачи повышения компактности, универсальности и быстродействия оптической системы для проведения амплификации нуклеиновых кислот с увеличением ее надежности при проведении различных исследований.

Решение поставленной технической задачи достигается за счет того, что в оптической системе для проведения амплификации нуклеиновых кислот, состоящей из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа, включающего светодиоды и светофильтры, и узла приема сигнала флуоресценции (фотоприемного устройства), место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, а светодиоды выполнены узкополосными и установлены вдоль боковых торцов чипа-картриджа, при этом узел приема сигнала флуоресценции (фотоприемное устройство) расположен непосредственно над реакционными лунками чипа-картриджа, причем узел приема сигнала флуоресценции (фотоприемное устройство) либо снабжен мульти-спектральными сенсорами, каждый из которых расположен над отдельной лункой, либо снабжен отдельными фотодиодами, каждый из которых расположен над отдельной лункой, выполненными с однополосными и/или многополосными интерференционными светофильтрами. Узел приема сигнала флуоресценции (фотоприемное устройство) снабжен одной или несколькими линзами.

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 изображена оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот, вид спереди. На фиг. 2 - то же, в изометрии. На фиг. 3 изображен одноразовый чип-картридж.

Оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот предназначена для использования в компактном портативном приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени и представляет собой конструкцию, состоящую из двух основных узлов: узла возбуждения флуоресценции (флуорофоров и флуоресцентных красителей) и узла приема сигнала флуоресценции. Узел возбуждения флуоресценции (флуорофоров и флуоресцентных красителей) включает расположенные на плате 1 по боковым сторонам корпуса узкополосные светодиоды 2 с минимальным углом расходимости излучения, расположенные непосредственно напротив соответствующих реакционных лунок 3 одноразового чипа-картриджа 4 по его боковым торцам. Вариант исполнения одноразового чипа-картриджа 4 показан на фиг. 3. На плате 1 могут располагать как один, так и несколько светодиодов 2 в зависимости от того, какие флуоресцентные красители предполагается использовать. А также в зависимости от количества лунок 3 и длины чипа-картриджа 4. При этом каждый светодиод 2 может возбуждать сразу несколько флуорофоров в нескольких лунках 3. Для спектрального разделения возбуждающего излучения и излучения флуорофоров (например, FAM, HEX, ROX и Cy5) между каждым светодиодом 2 и торцом чипа-картриджа 4 установлен соответствующий интерференционный светофильтр 5 с максимумами пропускания в диапазоне например 470, 520, 580, 635 нм. Для увеличения количества полезного излучения, проникающего внутрь чипа-картриджа 4, обеспечивают минимальное расстояние между возбуждающими светодиодами 2 и торцом чипа-картриджа 4.

Чип-картридж 4 (см. фиг. 3) представляет собой плоскую прозрачную пластину, изготовленную из полимерного материала с высокой биоинертностью, низкой автофлуоресценцией и высоким уровнем прохождения света. С нижней стороны в пластине выполнены реакционные лунки 3 (реакционные ячейки) для заправки исследуемыми образцами и реагентами. Каждая реакционная лунка 3 имеет заправочное отверстие 6 и отверстие 7 для выхода воздуха, расположенные сверху чипа-картриджа 4. Чип-картридж 4 имеет герметизирующую пленку с обеих сторон (на рисунке не показано), плотно прилегающую к поверхности и обеспечивающую полную герметизацию лунок 3 и отверстий 6 и 7. Одноразовый чип-картридж 4 может быть снабжен направляющими пазами 8, предназначенными для фиксации в нижней зоне оптической системы прибора для амплификации нуклеиновых кислот. Чип-картридж расположен на нагревательной пластине 9 термоциклера (на рисунке не показано). Прибор с оптической системой может быть снабжен устройством автоматической загрузки чипа-картриджа 4 (на рисунке не показано) в рабочее положение.

Узел приема сигнала флуоресценции представляет собой оптическую фокусирующую систему (фотоприемное устройство), расположенную непосредственно над реакционными лунками 3 чипа-картриджа 4. Фокусирующая система состоит из одной или нескольких линз 10. Их количество зависит от типа фотоприемного устройства 11. При использовании в качестве фотоприемного устройства 11 отдельных фотодиодов, каждый из которых расположен над отдельной лункой 3, в систему устанавливают интерференционный светофильтр 12 со спектрами пропускания, соответствующими спектрам излучения флуоресцентных красителей. Например, такие сфетофильтры 12 могут иметь максимум пропускания в диапазонах 520, 560 и 680 нм и блокировку паразитного излучения возбуждающих светодиодов 2 в диапазонах 470 и 635 нм. При этом при использовании в схеме отдельного фотодиода в качестве фотоприемного устройства 11 допускается использование на выбор двух и более комбинаций флуоресцентных красителей, имеющих подходящие диапазоны излучения.

Также в оптическую систему в качестве фотоприемного устройства 11 допускается установка оптических мульти-спектральных сенсоров, представляющих собой сборку единичных фотодиодов, расположенных в общем корпусе, каждый из которых расположен над отдельной лункой 3 (на рисунке не показано). На каждый фотодиод устанавливают собственный интерференционный светофильтр (на рисунке не показано) с полосами пропускания, соответствующими спектрам излучения применяемых флуорофоров. При этом для увеличения площади фоточувствительного элемента и равномерного распределения излучения в плоскости фокусировки, фотодиоды с фильтрами каждого спектрального диапазона могут быть объединены в пары. В случае установки мульти-спектральных сенсорв не требуется установка дополнительных многополосных светофильтров, при этом появляется возможность проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию с возможностью одновременного определения большого числа мишеней в одной пробе - во всех реакционных лунках 3 чипа-картриджа 4 (до 24 мишеней).

Оптическую систему для проведения амплификации нуклеиновых кислот в компактном портативном приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени используют следующим образом. Чип-картридж 4 с лунками 3, заправленными реагентами, вставляют в прибор через специальное отверстие, находящееся на передней панели амплификатора для проведения амплификации нуклеиновых кислот в зону действия оптической системы. Чип-картридж 4 фиксируют в нижней зоне оптической системы таким образом, чтобы он нижней стороной плотно прилегал к нагревательной пластине 9 термоциклера. Если чип-картридж оснащен пазами 8, то они должны совпасть с аналогичными пазами, расположенными в корпусе оптической системы. Чип-картридж 4 может фиксироваться внутри прибора специальным прижимным механизмом (на рисунке не показано).

В процессе работы прибора после каждого цикла термоциклирования производят измерение уровня флуоресценции специальных флуоресцентных красителей в исследуемом образце, при этом интенсивность излучения говорит о первоначальном количестве интересующих молекул в исследуемом образце. Измерение уровня флуоресценции осуществляют оптической системой с помощью узла возбуждения флуорофоров и флуоресцентных красителей и узла приема сигнала флуоресценции (узел возбуждения оптического сигнала и узел детекции). Во время амплификации происходит торцевое возбуждение флуорофоров и флуоресцентных красителей. Для спектрального разделения возбуждающего излучения и излучения флуорофоров между светодиодами 2 и торцом чипа-картриджа 4 установлены интерференционные светофильтры 5 с максимумами пропускания в диапазонах длин волн, соответствующих длинам волн поглощения флуоресцентных красителей. В оптической системе обеспечено минимальное расстояние между возбуждающими светодиодами 2 и торцами чипа-картриджа 4 для увеличения количества полезного излучения, проникающего внутрь чипа-картриджа 4.

На фиг. 2 изображено условное движение светового сигнала от светодиодов 2 через боковые торцы светопрозрачного одноразового чипа-картриджа 4 в сторону реакционных лунок 3. Излучение флуоресцентного красителя исследуемого образца улавливает система линз 10 с интерференционным светофильтром 12 со спектрами пропускания, соответствующими спектрам излучения флуоресцентных красителей. Такие светофильтры имеют максимум пропускания в диапазонах, например 520, 560 и 680 нм и блокировку паразитного излучения возбуждающих светодиодов 2 в диапазонах 470 и 635 нм. Сигнал, зарегистрированный фотоприемным устройством 11 оптической системы, поступает в плату обработки сигнала, а встроенный компьютер обрабатывает данные и выводит их на дисплей в виде графика ПЦР-кривой (на рисунке не показано). На лицевой панели прибора может быть предусмотрена световая индикация различных режимов работы прибора (термоциклирования, наличия чипа, обнаружения патогена, сигнализированные о появлении различных неисправностей в работе и т.д).

Оптическая система с одноразовым чипом-картриджем 4 для проведения амплификации нуклеиновых кислот может быть использована в молекулярной диагностике. Повышению эффективности исследования с помощью вышеописанной оптической системы способствует материал чипа-картриджа с высокой биоинертностью, низкой автофлуоресценцией и высоким уровнем светопропускания, обеспечивающий возможность использования узкополосных светодиодов 12 с боковых торцов чипа-картриджа 4. Что, в свою очередь, дает возможность значительно уменьшить габариты оптической системы и прибора в целом. Горизонтальное расположение чипа-картриджа в процессе проведения исследований способствует повышению равномерности прогревания и охлаждения образцов, исключает стекание жидкости в реакционных лунках 2 в одну сторону. Торцевое возбуждение флуорофоров дает возможность при уменьшении габаритов оптической системы повысить отношение сигнал/шум (ОСШ) фотоприемного устройства оптической системы.

Таким образом, технический результат, достигаемый с использованием заявленного изобретения, заключается в повышении компактности, универсальности и быстродействия оптической системы для проведения амплификации нуклеиновых кислот с увеличением ее надежности при проведении различных исследований не только в лаборатории, но и в полевых условиях, например, у постели больного в режиме реального времени.

1. Оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот, состоящая из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа, включающего светодиоды и светофильтры, и узла приёма сигнала флуоресценции, отличающаяся тем, что место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, а светодиоды выполнены узкополосными и установлены вдоль боковых торцов чипа-картриджа, при этом узел приёма сигнала флуоресценции расположен непосредственно над реакционными лунками чипа-картриджа, причём узел приёма сигнала флуоресценции либо снабжён мультиспектральными сенсорами, каждый из которых расположен над отдельной реакционной лункой, либо снабжён отдельными фотодиодами, каждый из которых расположен над отдельной реакционной лункой, выполненными с однополосными и /или многополосными интерференционными светофильтрами.

2. Оптическая система по п. 1, отличающаяся тем, что узел приёма сигнала флуоресценции снабжён одной или несколькими линзами.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено устройство для анализа нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается устройства для обнаружения биопатогенов в воздухе. Устройство содержит узел для подготовки воздуха, концентратор, оптическую камеру и источник излучения, направленный на воздушный поток внутри оптической камеры для возбуждения частиц в воздушном потоке для создания излучения флуоресценции и рассеянного частицами излучения.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается устройства для обнаружения биопатогенов в воздухе. Устройство содержит узел для подготовки воздуха, концентратор, оптическую камеру и источник излучения, направленный на воздушный поток внутри оптической камеры для возбуждения частиц в воздушном потоке для создания излучения флуоресценции и рассеянного частицами излучения.

Изобретение может быть использовано в аналитической химии при оптическом детектировании веществ в газовых и жидких средах. Чувствительный элемент люминесцентного сенсора состоит из неорганической пористой матрицы, представляющей собой модифицированный аэросил марки А-175.

Изобретение может быть использовано в аналитической химии при оптическом детектировании веществ в газовых и жидких средах. Чувствительный элемент люминесцентного сенсора состоит из неорганической пористой матрицы, представляющей собой модифицированный аэросил марки А-175.

Изобретение может быть использовано для оценки функционального состояния растений, в том числе при оптимизации агротехнических условий выращивания, а также для выявления устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам среды.

Изобретение относится к биологическому или химическому анализу, а именно к системам и способам, использующим устройства детектирования для биологического или химического анализа.

Изобретение относится к биологическому или химическому анализу, а именно к системам и способам, использующим устройства детектирования для биологического или химического анализа.

Изобретение относится к аналитической химии элементов, а именно к методам определения железа(III), и может быть использовано для его определения в технологических растворах, природных и техногенных водах.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот. Система состоит из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа и узла приёма сигнала флуоресценции. Место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, а светодиоды выполнены узкополосными и установлены вдоль боковых торцов чипа-картриджа. Узел приёма сигнала флуоресценции расположен над реакционными лунками чипа-картриджа, снабжён мультиспектральными сенсорами или отдельными фотодиодами. Изобретение обеспечивает повышение компактности, универсальности и быстродействия оптической системы с увеличением ее надежности при проведении различных исследований не только в лаборатории, но и в полевых условиях в режиме реального времени. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

Наверх