Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце человека, специфичных к коронавирусу человека sars-cov2, тест-система

Группа изобретений относится к диагностике иммунитета против COVID-19. Раскрыт способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, с применением тест-системы, предусматривающий проведение реакции на антитела IgM и IgG отдельно в разных лунках в присутствии рекомбинантного антигена, содержащего рецептор-связывающий домен Spike белка коронавируса человека SARS-COV2 (S-RBD), связанный с природным аминоконцевым сигнальным пептидом и с С-концевой гексагистидиновой меткой Spike белка, при этом в каждую лунку 96-луночной планшеты добавляют препарат антигена, инкубируют, удаляют с плашки раствор с антигеном, промывают ячейки ФСБ-T, добавляют в ячейки ФСБ-T с 4% БСА и инкубируют 90 минут, промывают ФСБ-Т, наносят в каждую лунку планшета раствора антигена с ФСБ-Т с 1% БСА, далее наносят по 8 мкл сыворотки крови тестируемого пациента, разведенной в ФСБ-Т с 1% БСА, инкубируют 1 час, промывают ячейки 4 раза ФСБ-Т, добавляют конъюгат антител и фермента, инкубируют 40 минут, промывают ФСБ-Т 6 раз, окрашивают с помощью ТМБ, разведенного в ДМСО, натрий-цитратном буфере с добавлением 30% перекиси водорода, останавливают реакцию окраски добавлением 0,25 М серной кислоты и измеряют оптическую плотность при длине волны 450-620 нм. Также раскрыта тест-система для проведения указанного способа. Группа изобретений пригодна для высокоточного определения антител IgM и IgG в биологическом образце. 2 н.п. ф-лы, 6 табл.

 

В настоящее время в России и в мире происходит массовое заражение коронавирусом SARS-COV2. Эта инфекция может протекать бессимптомно в большинстве случаев, однако у части людей вызывает заболевание - вирусную пневмонию COVID19. Заболевание может протекать тяжело и приводит к летальному исходу у значительной части заболевших. Пандемия COVID19 привела к необходимости карантина и жестких мер изоляции в ряде стран, включая Россию. Однако ряд профессий, включая медиков, подразумевает продолжение работы и в период карантина. Среди них необходимо выявлять группы высокого и низкого риска заражения. Одним из способов уточнения индивидуального риска является проверка присутствия в крови антител, свидетельствующих о сформировавшемся иммунитете к вирусу.

Задачи, которые позволяет решить массовый скрининг на антитела к вирусу SARS-COV2

1. Выявление людей, имеющих иммунитет к вирусу SARS-COV2, для уточнения индивидуального риска.

2. Оценка динамики группового иммунитета к вирусу SARS-COV2 для прогноза срока окончания карантина и установления риска повторного распространения инфекции («вторая волна»)

3. После того как будет разработана вакцина к вирусу SARS-COV2 - оценка ее способности формировать иммунитет, оценка устойчивости поствакцинального иммунитета.

4. Выявление людей, недавно инфицированных вирусом SARS-COV2, в дополнение к тестированию при помощи ПЦР.

5. Тестирование домашних животных (кошки, хорьки) на наличие контакта с патогеном для выявления возможного резервуара инфекции.

Для осуществления вышеперечисленных задач был разработан способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце, а также тест-система для осуществления способа. В качестве биологического образца берется сыворотка или плазма крови человека или кошки, хорька.

В качестве способа, позволяющего обеспечить точное и низкозатратное массовое тестирование, выбран иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). ИФА - это лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.

Выбранный вариант твердофазного ИФА в микропланшетном варианте получил наибольшее распространение в тест-системах для клинических лабораторных исследований, поэтому тест на его основе является доступным и не требует ни специфического оборудования, ни обучения сотрудников существующих лабораторий. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистирольного микропланшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы высокоспецифичные рекомбинантные антигены вируса SARS-COV2. Высокоспецифичный антиген в виде RBD (Receptor Binding Domain - рецептор-связывающего домена) домена белка Spike коронавируса был предоставлен американскими специалистами под руководством профессора Флориана Крамера из госпиталя Маунт Синай в рамках лицензионного соглашения. Подробное описание антигена представлено в публикации Fatima Amanat, Daniel Stadlbauer, […]Florian Krammer. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine (2020). doi: https://d0i.0rg/l0.1101/2020.03.17.20037713. В ходе специфической реакции антигена, сорбированного на микропланшете, с определяемыми в исследуемом образце антителами, образуются иммунные комплексы. Субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Методика проведения анализа

Образцы:

Положительные образцы:

В качестве образцов, в которых предполагается наличие антител к короновирусу COVID-19, использовали образцы сыворотки крови, собранные в период в апреле 2020 года в клиниках г. Москвы и отобранные по следующему принципу:

- известен положительный результат ПЦР-теста на COVID-19

- забор крови произведен не раньше забора биоматериала (мазок/отделяемое из носоглотки и ротоглотки) для постановки ПЦР-теста на COVID-19, давшего положительный результат. Образцы сыворотки хранились при температуре -20°С и размораживались перед постановкой анализа при +4°С (количество циклов разморозки: 1).

Отрицательные образцы:

В качестве образцов, в которых гарантированно отсутствуют антитела к короновирусу COVID-19, использовали образцы плазмы крови, собранные до начала появления COVID-19 (до сентября 2019 года).

Для проведения способа используют следующие реагенты тест-системы:

В качестве антигена используется рекомбинантный антиген, содержащий рецептор-связывающий домен Spike белка коронавируса человека SARS-COV2 (S-RBD), связанный с природным аминоконцевым сигнальным пептидом и с С-концевой гексагистидиновой меткой Spike белка, описанный в публикации Fatima Amanat et al., 2020 и предоставленный в рамках лицензионного соглашения.

Фосфатно-солевой буфер

Фосфатно-солевой буфер с 0,1%

Твин-20 (ФСБ-Т) ФСБ-Т с 4%

БСА (бычьего сывороточного альбумина)

ФСБ-Т с 1%БСА

рабочий раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидин ТМБ, разведенный в ДМСО, натрий-цитратном буфере с добавлением 30% перекиси водорода Рабочий раствор конъюгата IgG (разведение стокового раствора 1:30000) Рабочий раствор конъюгата IgM (разведение стокового раствора 1:50000) 0,25М серная кислота

Используемые приборы:

Центрифуга Liston С 2203 с ротором CRS 4180 на 48 пробирок PST-60HL-4 Термошейкер для планшетов

Вошер, 8-канальная головка, 2 бутыли, остаточный объем до 1,5 мкл, Wellwash, Thermo FS ИФА-фотометр, 405, 450, 620 нм, планшеты, шейкер, Multiskan FC, Thermo FS 2 дозатора на 20-200 мкл, 1 дозатор на 100-1000 мкл, многоканальная пипетка на 50-300 мкл, наконечники без фильтра под них.

Приготовление необходимых реагентов тест-системы:

1000 мл Фосфатно-солевой буфер с 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т): в 1000 мл дистиллированной воды растворяем 10 таблеток PBS (Р071-1/В-60201, ПанЭко), добавляем 1 мл Твин-20, тщательно перемешиваем

50 мл ФСБ-Т с 4% БСА: в 50 мл раствора ФСБ-Т растворить 2 г БСА

70 мл ФСБ-Т с 1% БСА: в 70 мл раствора ФСБ-Т растворить 0,7 г БСА

Развести стоковый раствор конъюгата IgG 1:30000 в растворе ФСБ-Т с 1% БСА

Развести стоковый раствор конъюгата IgM 1:50000 в растворе ФСБ-Т с 1% БСА

Подробное описание способа проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце:

Реакция на антитела IgM и IgG проводится отдельно в разных лунках для каждого биологического образца. Способ проведения ИФА для IgM и IgG совпадает за исключение пункта с добавлением соответствующего конъюгата антител (п. 5), в котором добавляются соответствующие конъюгаты в каждую лунку образца.

1. Приготовить раствор антигена - рецептор-связывающий домен (RBD) белка Spike (S) вируса SARS-COV-2 с концентрацией 0,8 мкг/мл в ФСБ

2. Разаликвотить полученный раствор антигена белка S-RBD по 50 мкл в каждую лунку ИФА планшета

3. Заклеить планшет пленкой, инкубировать 48 часов при температуре +4°С

4. Удалить с плашки раствор с антигеном

5. 3 раза промыть ячейки буфером ФСБ-Т 300 мкл/лунка

6. Добавить в ячейки буфер ФСБ-Т с 4% БСА по 300 мкл на ячейку

7. Инкубировать планшет 90 минут при комнатной температуре от 18 до 25°С

8. Удалить раствор

9. 1 раз промыть ячейки буфером ФСБ-Т 300 мкл/лунка

10. Подготовить биообразцы: центрифугировать пробирку с кровью при 3000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре

И. Произвести предварительное разведение биообразца (сыворотка или плазма крови): 190 мкл раствора ФСБ-Т с 1% БСА и 10 мкл сыворотки

12. Плашку с разведенной сывороткой крови инкубировать на термошейкере 5 мин при скорости 600 оборотов/мин

13. Нанести в каждую лунку планшета по 72 мкл раствора антигена с ФСБ-Т с 1% БСА

14. Нанести по 8 мкл разведенной сывортки крови, перемешать

15. Инкубировать 1 час при температуре +37°С (без перемешивания)

16. Промыть ячейки буфером ФСБ-Т 4 раза (300 мкл/лунка), каждый раз раствор должен находиться в лунке не менее 1 минуты

17. Добавить по 80 мкл рабочего раствора соответствующего конъюгата антител к иммуноглобулинам М или G человека (отдельно) в каждую лунку планшета

18. Инкубировать 40 мин при температуре +37°С

19. Промыть ячейки буфером ФСБ-Т 6 раза (300 мкл/лунка), каждый раз раствор должен находиться в лунке не менее 1 минуты

20. Подготовить раствор ТМБ разведенный в ДМСО, натрий-цитратном буфере с добавлением 30% перекиси водорода (далее - раствор ТМБ) в соответствии с инструкцией производителя

21. Внести быстро в каждую лунку по 100 мкл подготовленного раствора ТМБ

22. Выдержать планшет 10 мин при комнатной температуре (до развития окраски)

23. Добавить в каждую ячейку по 50 мкл 0,25М раствора серной кислоты

24. Измерить оптическую плотность при длине волны 450 и 620 нм

25. Для получения результата необходимо рассчитать коэффициент позитивности (КП): ОП (оптическая плотность) образца = ОП при 450 нм - ОП при 620 нм (для всех образцов) ОП критическое = Среднее значение ОП для всех отрицательных образцов + стандартное отклонение, рассчитанное по ОП для всех отрицательных образцов * 4

КП = ОП образца/ ОП критическое

Оценку результата проводят сравнивая КП образца для каждого иммуноглобулина с референсными значениями, указанными в Таблице 1.

Тест система для проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце содержит рекомбинантный антиген, содержащий рецептор-связывающий домен Spike белка коронавируса человека SARS-COV2 (S-RBD), связанный с природным аминоконцевым сигнальным пептидом и с С-концевой гексагистидиновой меткой Spike белка, раствор ФСБ, раствор ФСБ-Т, раствор ФСБ -Т с 4% БСА, раствор ФСБ -Т с 1% БСА, раствор конъюгатов антител IgM и IgG, стоковый раствор ТМБ, 0,25М раствор серной кислоты.

1. Валидация способа.

Для оценки характеристик способа проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце и тест-системы, используемого в способе, была проведена валидация на выборке 455 отрицательных и 154 положительных образцов. Подробное описание образцов, в том числе клиническая информация, а также результаты проведенного анализа с помощью разработанной тест-системы по каждому образцу представлены в таблице 2. ОП 455 отрицательных образцов послужила основой для расчета ОП критической и для последующего расчета КП для всех образцов валидационной выборки (таблица 3).

2. Расчет характеристик тест-системы

Так как при интерпретации КП есть значения КП, для которых результат остается сомнительным, одной из важных характеристик тест-системы является вероятность получения однозначного (не сомнительного) результата - Call Rate (Таблица 4).

По данным образцов валидационной выборки, для которых был получен однозначный результат хотя бы по одному классу антител, был проведен расчет чувствительности и специфичности.

Специфичность была рассчитана при анализе количества отрицательных образцов, для которых по данным анализа с помощью разработанной тест-системы был получен положительный результат по соответствующему классу антител. Полученные результаты представлены в Таблице 5.

Для оценки чувствительности тест-системы оказалось невозможным использовать все полученные положительные образцы, так как сероконверсия у разных пациентов происходит с разной скоростью, а образцы были забраны в разные дни с момента начала заболевания. Поэтому в качестве образцов для оценки чувствительности для каждого класса антител использовали образцы, для которых наличие соответствующих антител было показано другим серологическим методом (ИФА в другой лаборатории или экспресс-тест Innovita на основе метода ИХ А). Полученные результаты представлены в Таблице 6.

1. Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, с применением тест-системы, предусматривающий проведение реакции на антитела IgM и IgG отдельно в разных лунках в присутствии рекомбинантного антигена, содержащего рецептор-связывающий домен Spike белка коронавируса человека SARS-COV2 (S-RBD), связанный с природным аминоконцевым сигнальным пептидом и с С-концевой гексагистидиновой меткой Spike белка, при этом в каждую лунку 96-луночной планшеты добавляют 50 мкл раствора препарата антигена с концентрацией 0,8 мкг/мл в ФСБ, инкубируют 48 ч при t +4°С, удаляют с плашки раствор с антигеном, промывают ячейки ФСБ-T, добавляют в ячейки по 300 мкл на ячейку ФСБ-T с 4% БСА и инкубируют 90 минут при комнатной температуре, промывают ФСБ-Т, наносят в каждую лунку планшета по 72 мкл раствора антигена с ФСБ-Т с 1% БСА, далее наносят по 8 мкл сыворотки крови тестируемого пациента, разведенной в ФСБ-Т с 1% БСА, инкубируют 1 час при температуре +37°С без перемешивания, промывают ячейки 4 раза ФСБ-Т, добавляют конъюгат антител и фермента, отдельно к иммуноглобулинам М и G человека, инкубируют 40 минут при температуре +37°С, промывают ФСБ-Т 6 раз, окрашивают с помощью добавления по 100 мкл ТМБ, разведенного в ДМСО, натрий-цитратном буфере с добавлением 30% перекиси водорода, останавливают реакцию окраски добавлением 50 мкл 0,25 М серной кислоты и измеряют оптическую плотность при длине волны 450-620 нм.

2. Тест-система для проведения способа по п. 1, включающая рекомбинантный антиген, содержащий рецептор-связывающий домен Spike белка коронавируса человека SARS-COV2 (S-RBD), связанный с природным аминоконцевым сигнальным пептидом и с С-концевой гексагистидиновой меткой Spike белка, раствор ФСБ, раствор ФСБ-Т, раствор ФСБ-Т с 4% БСА, раствор ФСБ-Тс 1% БСА, растворы конъюгатов антител и фермента к IgM и IgG, раствор ТМБ, разведенный в ДМСО, натрий-цитратном буфере с добавлением 30% перекиси водорода, 0,25М раствор серной кислоты.