Способ фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота. Способ фракционирования комплекса биофлавоноидов обезжиренного облепихового шрота заключается в выделении фракции флавонолов методом адсорбционной колоночной хроматографии раствора биофлавоноидов, полученного растворением сухого экстракта комплекса биофлавоноидов обезжиренного облепихового шрота в этиловом спирте 96% об. в соотношении 1:10 при нагревании до полного растворения, при элюировании на силикагеле в течение 4 часов, при этом в качестве элюента используется этиловый спирт с понижающейся концентрацией: 96%, 75%, 50%, 25%. Вышеописанное изобретение позволяет устранить недостатки предшествующего уровня техники и упростить технологию. 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способам фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ на примере выделения фракции флавонолов, и может быть применено на предприятиях отрасли.

Импортозамещение лекарственных средств, наметившееся в последнее время, является благоприятной основой для разработки отечественных оригинальных фармацевтических субстанций и создания лекарственных препаратов на их основе. Изыскание и исследование новых веществ природного происхождения, обладающих фармакологической активностью, является одной из актуальных задач фармакогнозии и фармацевтической отрасли в целом. В приоритете при этом не только местное растительное сырье, но и крупнотоннажные отходы его переработки.

Плоды облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides) довольно широко используются в народной и официнальной медицине, благодаря содержанию значительного количества витаминов А, С, Е, каротиноидов, органических кислот, Сахаров, а также фитостеринов, микроэлементов, фосфолипидов и др. [1]. Особое место занимают Р-витаминные вещества плодов облепихи. Согласно литературным данным полифенольный комплекс плодов облепихи представлен флавонолами, лейкоантоцианами, катехинами и дубильными веществами - производными галловой кислоты. Из суммарного количества флавоноидов на долю катехинов приходится в среднем 42-45%, лейкоантоцианов - 38-40%, флавонолов и их гликозидов - 16-20%, из них рутин (гликозид кверцетина) - 1,55-3,65%, кверцетин - 2,90%, изорманетин - 0,37-14,70%, кемпферол - 0,43-5,46%, мирицетин - 2,71-16,20% [2]. В результате традиционного использования - извлечения из плодов масла и сока, - остается крупнотоннажный отход производства - обезжиренный шрот, который обладает высокой биологической ценностью, благодаря содержанию ряда физиологически активных веществ, наиболее ценными из которых являются биофлавоноиды [3-5].

Биофлавоноиды плодового сырья, в том числе облепихового шрота, являются потенциальными источниками фармацевтических субстанций, так как обладают широким спектром доказанной in silico, in vitro и in vivo фармакологической активностью: антиоксидантная, противовирусная, антибактериальная, адаптогенная, иммуномоделирующая, противоопухолевая, гипогликемическая (антидиабетическая), гепатопротекторная, противовоспалительная, нейропротекторная, кардиопротекторная и антиканцерогенная активность при отсутствии токсичности. Известно, что фармакологическая активность комплекса биофлавоноидов ниже, чем у индивидуальных соединений, так как каждое из них способно воздействовать на множество структурных и функциональных систем клетки и организма в целом [6-10]. Поэтому очевидна необходимость в научно-обоснованном высокоэффективном и надежном способе фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ, в частности флавонолы, для реализации в промышленных масштабах. На решение этой задачи направлено данное техническое решение.

Фракционирование комплекса биофлавоноидов растительного материала является довольно сложной задачей, обусловленной рядом факторов: во-первых, многообразием биофлавоноидов (флавоны, флавонолы, изофлавоны, катехины и т.д.); во-вторых, данные соединения могут находиться в образцах в различных концентрациях в смеси, представленной относящимися к разным группам соединениями; в-третьих, их разнообразными физическими свойствами, в частности, - растворимость, которая является одной из основных биофармацевтических характеристик и определяет как биоэквивавлентность препарата, так и возможность создания лекарственной формы с эффективной дозой лекарственного средства, скоростью и полнотой всасывания. При этом известно, что многие биофлавоноиды обладают довольно низкой растворимостью в водных средах и биологических жидкостях организма [11].

С учетом вышеизложенного фракционирование комплекса биофлавоноидов с выделением фракции флавонолов, как наиболее активной группы природных фенольных соединений, разрешит проблему их рационального использования в качестве сырья для фармацевтических субстанций.

Известен «Способ концентрирования и разделения флавоноидов» (Патент РФ 2646805 С1) [12], включающий сорбционно-хроматографическое фракционирование ацетонитрильных растворов флавоноидов: кверцетин с концентрацией 1×10^-4 моль/дм³, нарингин - 1×10^-4 моль/дм³, (+)-катехин - 1×10^-4 моль/дм³ на предварительно модифицированном триметилхлорсиланом наностркуктурированном мезопористом сорбенте МСМ-41. Недостатком данного способа является использование сорбента, характеризующегося сложностью получения, а также использование в процессе подготовки сорбента высокой температуры и дополнительного модификатора триметилхлорсилана. Кроме того, подготовка сорбента сопряжена с длительными временными затратами и высокой стоимостью его импортных аналогов - 44-55 дол. США/1 шт. (по данным официального сайта веб-портала Alibaba.com: - URL: https://Russian.alibaba.com/product-detail/new-mcm-41-molecular-seive-mesoporous-structere-mcm-41-full-silicon-type-demoulding-60801723730.html?spm=a2700.galleryofferist.0.0.71d61f00DFmlZF найден единственный поставщик сорбента типа МСМ-41 - «Beijing Ding ShengXiong Di Technology Co., Ltd.», Китай), а способ регенерации сорбента в изобретении не раскрыт.

Известен «Method for extracting, fractionating and purifying polyphenolic compounds originating from fresh plant sorting deviations using a high adsorption and elution performance resin» (Patent US 2002187207 Al) [13], в котором фракционирование и очистку полифенольных соединений из растительного пищевого сырья, в частности: листовых растений семейства Compositae или луковичных растений семейства Liliaceae, осуществляют адсорбцией на стирольных дивинилбензольных смолах ТМ Resindion SP70 и SP700 (Mtsubishi Chemical Corporation, Япония), являющихся селективными по отношению к полифенольным соединениям, с последующим элюированием, удерживаемых на смоле соединений, низшими спиртами (метанол или этанол). Недостатком данного способа является использование в качестве адсорбента смол импортного производства, что повышает себестоимость метода и его зависимость от поставок. Кроме того, в патенте не указаны параметры фракционирования и очистки полифенольных соединений, что не дает возможности определить продолжительность процесса элюации и скорость элюации.

В патенте США «Liquid Chromatographic Fraction of Enzymatically Polymerized Flavonoid as an Antioxidant)) (Patent US 20110218252 Al) [14] раскрыт способ фракционирования водного раствора ферментативно полимеризованных флавоноидов, таких как катехины или эпикатехины, на две и более фракции. Разделение фракций осуществлялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе серии Agilent 1200 на колонке быстрого разрешения Zorbax Eclipse XDB-phenyl, 4,6×150 мм, 3,5 мкм, заполненной диметилфенэтилсиланом, связанным со сверхвысокочистым носителем кремнеземом SiO₂ (размер пор 80 ). Температура колонки поддерживалась 35-60°С, растворитель - водный раствор ацетонитрила при нейтральном рН. Объем вводимой пробы полифлавоноида - 40 мкл. Недостатком данного способа является увеличение массы полифенола посредством ферментативного синтеза с получением полимерных флавоноидов; использование в качестве элюента токсичного ацетонитрила, являющегося прекурсором; необходимость подогрева смеси и колонки (температурный диапазон 35-60°С); возможность разделения только микроколичеств водорастворимых флавоноидов, что существенно ограничивает использование метода в промышленных условиях.

Известен метод получения изофлавона дайдзеина (Daidzein), источником которого являются соевые продукты, фасоль, горох, орехи, зерновые продукты, кофе, чай, красный клевер и др. «Daidzein separation and purification method» (Patent CN 105367615 A) [15], в котором выделение и очистка дайдзеина осуществляется фракционированием экстракта на высокоскоростном центробежном противоточном хроматографе. Метод, по описанию авторов, непродолжительный, с хорошей разделительной способностью и низким расходом растворителя, выделенный дайдзеин отличается высокой чистотой. Недостатками предлагаемого способа являются: во-первых, выделение лишь одного специфического флавоноида, при этом его степень чистоты не указана, во-вторых, элюентом является труднорегенерируемая четырехкомпонентная смесь этилацетата, н-бутанола, этанола и воды, и, в-третьих, высокоскоростная центробежная хроматография достаточно дорогой метод, не приемлемый в промышленных условиях.

Метод фракционирования экстракта флавоноидов надземной части кустарника сабии (Sabia parviflora), предлагаемый в патенте «Separation and extraction method of seven flavonoid chemical components in Sabia parviflora» (Patent CN 109879844 A) [16], основан на хроматографическом разделении экстракта цветков сабии (Sabia parviflora) на 7 фракций флавоноидов, окрашенных в желтый цвет.При разделении применялись такие хроматографические методы, как разделение на хроматографических колонках с макропористой синтетической смолой D-101 и силикагелем, обращенно-фазовая хроматографическая колонка ODS-A-HG и полупрепаративная высокоэффективная жидкостная хроматография. Полученные флавоноиды идентифицированы как: кверцетин-3-О-гликозид горечавки, камеллианозид, рутин, цубакиозид А, кемпферол-3-О-рутинозид, изорамнетин-3-О-рутинозид и кемпферол. Смесь флавоноидов элюировали градиентом дихлорметан-метанол и метанол-вода последовательно на различных хроматографических колонках. Недостатками данного изобретения являются: сложность технологического решения, которая заключается в последовательном использовании для разделения смеси флавоноидов нескольких хроматографических колонок; применение в качестве элюентов токсичных растворителей; все полученные соединения, за исключением кемпферола, являются гликозидами.

В изобретении «Separation and purification method of hawthorn leafflavone» (Patent CN 105853534 A) [17] рассмотрен способ выделения и очистки флавоновой фракции листьев боярышника. В процессе очистки экстракт измельченных листьев боярышника растворяют в этиловом спирте и подвергают реэкстракции этилацетатом для удаления примесей. Этиловый спирт упаривают досуха, остаток растворяют в воде, отфильтровывают, а затем очищенный промежуточный продукт подвергают адсорбционному разделению через макропористую смолу АВ-8 или NKA-9: промежуточный продукт смешивают с обработанной водно-этанольным раствором смолой в соотношении 1:4, взбалтывают в течение 2 ч, затем настаивают в течение 24 часов для достижения насыщенной адсорбции, по окончании этого времени растворитель декантируют, а макропористую смолу элюируют 20%-ым этанолом 3-4 раза, отфильтровывают, фильтрат высушивают. Степень чистоты флавоноидов составила 65,40-67,23%. Данное изобретение имеет такие недостатки как необходимость дополнительной стадии реэкстракции этилацетатом и подготовки сорбентов; продолжительность адсорбции флавоноидов на ионообменных смолах (более суток); низкая степень чистоты флавоноидов.

Вышеизложенные способы предусматривают использование в качестве сорбента смол, имеющих либо высокую адсорбционную эффективность, либо высокую элюционную способность, не обладая ими одновременно. Силикагель, в отличие от ионообменных смол, обладает и высокой адсорбционной способностью и избирательностью адсорбционного действия, а также относительно большой прочностью зерен и термостойкостью, что позволяет многократно регенерировать его без потери адсорбционной активности. Стоимость силикагеля для хроматографических колонок составляет от 3000 руб./кг (по данным официального сайта ООО «ДВ-ЭКСПЕРТ» - URL: https://dv-expert.ru/proizvoditeli/macherev-nagel/815330-25-Macherey-Nagel-Silica-gel-60-0-063-0-2-mm-25-kg).

В изобретении «Separation method of flavone compounds in Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze, and flavone composition» (Patent CN 106279318 A) [18] предложен способ разделения флавоновой композиции из растений рода губоцветных (Rotundula). Фракционирование проводится в несколько этапов различными способами. На подготовительном этапе водное извлечение из Clinopodium chinense (Benth.) О. Kuntze концентрировали, остаток хроматографировали на макропористой смоле D101 водно-спиртовым раствором, элюат осаждали кислотой для обогащения извлечения флавоноидами. Затем суммарное извлечение флавоноидов разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле, отбирая 320 фракций элюата. Для получения фракций 1-90; 91-190; 191-260; 261-310 и 311-320 проводили градиентное элюирование растворами 100:5, 100:10, 100:15, 100:20 и 100:25 по объему хлороформа и метанола, соответственно. Дальнейшее разделение объединенных фракций проводили методом гель-фильтрации на колонках, заполненных Sephadex LH-20, элюируя смесью хлороформ-метанол в соотношении 4:6 (фракции 12-48; фракции 49-55, фракции 79-86); на силикагеле, элюируя хлороформом и ацетоном (фракции 133-176); на колонке с полимерным сорбентом MCI, элюируя системой метанол-вода 60:40 (фракции 231-260, фракции 295-310). Идентификацию полученных фракций проводили методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на колонке С-18 (Agilent, геометрия колонки 9,4×250 мм; размер частиц наполнителя 5 мкм; элюент метанол-вода 40:60; УФ-детектирование при длине волны 210 нм; скорость потока 2 мл/мин). Существенными недостатками способа являются: необходимость предварительной очистки растительного экстракта на макропористой смоле D101; сложность процесса разделения флавоноидов, которая заключается в отборе большого количества фракций (320) при различных условиях элюирования; необходимость дополнительного разделения объединенных фракций методом гель-фильтрации; использование смесей токсичных, требующих регенерации, растворителей. Несмотря на получение индивидуальных флавоноидов, перечисленные недостатки ограничивают применение предлагаемого способа в промышленном масштабе.

Вместе с тем комплексных теоретических и экспериментальных исследований по фракционированию комплекса биофлавоноидов с получением флавонолов, необходимых в качестве сырья для фармацевтических субстанций, в том числе при масштабировании, в настоящий момент не проводилось. Техническая сложность известных методик хроматографического разделения полифенольного комплекса растительных экстрактов заключается в продолжительности и многоэтапности процедур (необходимо собрать до 320 фракций), что является серьезным препятствием использования метода в промышленном масштабе.

Наиболее близким к заявленному решению является способ, представленный в [19], согласно которому полученный сухой экстракт биофлаваноидов «подвергли хроматографическому разделению. Хроматографическую колонку (силикагель L 40/100), элюировали для удаления простых фенольных соединений водой и затем 40% этиловым спиртом с повышением концентрации. В работе не представлено сведений по продолжительности фракционирования, количеству и составу полученных в результате хроматографического разделения фракций, за исключением того, что на первом этапе элюирования водой удаляются гидрофильные простые фенольные соединения. Однако, известно, что вязкость воды выше вязкости водно-этанольных растворов, что снижает скорость элюирования из-за заполнения пор сорбента и при понижении полярности элюента необходимо время для достижения динамического равновесия сорбента и растворителя [20]. Что касается экстракции неполярным растворителем (хлороформом), то выход флавонолов на 28% ниже, чем в заявленном способе.

Технический результат - разработка насколько возможно простого и непродолжительного способа фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ, в частности флавонолы.

Для решения этой задачи предлагается способ адсорбционной колоночной хроматографии. В качестве неподвижной фазы использован силикагель с диаметром матричных пор 0,063-0,2 мм. Подвижная фаза - этиловый спирт с понижающейся концентрацией: 96%, 75%, 50%, 25%. Геометрия хроматографической колонки: диаметр d=32 мм, длина l=500 мм. Скорость элюирования - 1 мл/мин. Общая продолжительность элюирования составила 240 мин.

Пример 1. Навеску 1,0 г сухого экстракта комплекса биофлавоноидов облепихового шрота растворяют в этиловом спирте 96% (об.) в соотношении 1:10 при нагревании до полного растворения. Полученный раствор биофлавоноидов наносят на хроматографическую колонку, заполненную силикагелем. В качестве элюента используют этиловый спирт 96% (об.). Контроль за процессом фракционирования осуществляют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). После отбора каждой фракции полярность элюента повышают разбавлением дистиллированной водой. В результате хроматографического разделения получено 5 фракций. По данным ТСХ анализа и УФ-спетроскопии 2 и 3 фракция элюата идентичны, в 1, 4 и 5 фракциях элюата флавонолы не обнаружены. Качественная реакция на содержание флавонолов - цианидиновая проба (проба Шинода) - подтверждает подлинность 2 и 3 фракции. Фракции элюата, содержащие флавонолы, объединяют и отгоняют растворитель «досуха». Выход флавонолов составил 51,25% от суммарного количества полифенольных соединений.

Анализ качественного и количественного состава фракции флавонолов, полученной по предлагаемому способу, проводят методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием на приборе Shimadzu «LC-20 Prominence)), с последующей компьютерной обработкой полученных результатов. Условия хроматографического анализа: колонка: октадецилсиликагель, Symmetry С 18, размер колонки 4,6×250 мм, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил - раствор трифторуксусной кислоты рН=2,6 (40:60), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин. Детектирование: УФ, λ=365 нм; объем вводимой пробы: 10 мм³ (фиг. 1).

Расчет содержания индикаторных компонентов проведен по градуировочному графику, построенному в координатах S (площадь пика) - С (концентрация), г/100 г. Методом ОФ ВЭЖХ в составе фракций флавонолов обнаружены изорамнетин - 67,97%, кверцетин - 29,56% и небольшое количество кемпферола - 2,47%.

Пример 2. Регенерацию силикагеля проводят кипячением в 50%-ом растворе азотной кислоты при гидромодуле 1:2, в течение 30 мин. Затем силикагель отфильтровывают и промывают на фильтре горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата, осадок высушивают при температуре 105°С до постоянной массы. Степень чистоты регенерированного сорбента контролируют методом Фолина-Чокальтеу и по оптической плотности раствора ДМФА, после обработки им силикагеля, на спектрофотометре Simadzu UV1800 при длине волны 520 нм.

Таким образом, заявляемый способ фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота позволяет отказаться от использования токсичных элюентов - метанол, ацетонитрил, хлорорганические растворители - и их труднорегенирируемых смесей. Упрощение технологии заключается в сокращении количества вспомогательных операций (исключение операций пробоподготовки и дополнительной очистки фракции флавонолов) и количества отбираемых фракций элюата с 320 до 5. За счет упрощения технологии продолжительность фракционирования составляет 4 часа.

В настоящее время в лаборатории синтеза и выделения природных и биологически активных веществ Бийского технологического института (филиал) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» успешно прошли испытания по реализации предложенного способа фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота, а также подписано соглашение по апробации предлагаемого технического решения в условиях действующего производства АО «Алтайвитамины» (г. Бийск), профилем которого является производство лекарственных препаратов, в том числе из плодов облепихи крушиновидной.

Источники информации, используемые при составлении заявки

1. Koshelev, Yu.A. Sea Bukthorn: monograph / Yu.A. Koshelev, L.D. Ageeva, E.S. Batashov, V.P. Sevodin, E.D. Rozhnov, N.I. Kuleshova. - Biysk: Publishing house of Polzunov Altai State Technical (Printedby С JSC «Altayvitaminy»), 2015. - 401 p.

2. Аверьянова, E.B. Биологическая ценность облепихи как основа ее комплексной безотходной переработки/Е.В. Аверьянова//Современная наука и инновации. - 2018-№3 (23). - С. 129-139.

3. Дугарова, И.К. Комплексное использование плодов облепихи в производстве пищевых продуктов/И.К. Дугарова, Г.Ц. Цыбикова, И.Т. Александрова//Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2016. - Т. 6, №3. - С. 128-134.

4. Аверьянова, Е.В. Перспективы и направления использования ягодных шротов/Е.В. Аверьянова, М.Н. Школьникова, Е.Д. Рожнов//Индустрия питания. - 2019. - Т. 4 (№2). - С. 20-27. DOI 10.29141/2500-1922-2019-4-2-3.

5. Никулина, Е.О. Облепиховый шрот как функциональный ингредиент для создания продуктов функционального назначения/Е.О. Никулина, Г.В. Иванова, О.Я. Кольман//Вестник КрасГАУ. - 2015. - №10. - С. 98-105.

6. Kim, Ju-Sung Phamalogical effect and component of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)/Ju-Sung Kim, Chang-Yeon Yu, Myong-Jo Kim//J Plant Biotechnol. - 2010. - V. 37. - P. 47-56. DOI:10.5010/JPB.2010.37.1.047.

7. Теплова, B.B. Природные полифенолы: биологическая активность, фармакологический потенциал, пути метаболической инженерии/В.В. Теплова, Е.П. Исакова, О.И. Кляйн, Д.И. Дергачева и др.//Прикладная биохимия и микробиология. - 2018. - Т. 54. - №3. - С. 215-235.

8. Slobodnikova, L. Antibiofilm Activity of Plant Polyphenols/L. Slobodnikova, S. Fialova, K. Rendekova//Molecules. - 2016. - №12. - P. 753-766.

9. Teleszko, M. Analysis of Lipophilic and Hydrophilic Bioactive Compounds Contentin Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Berries/M. Teleszko, A.Wojdylo, M. Rudzifiska, J. Oszmianski, T. Golis // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2015. - №63. - pp. 4120-4129. DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00564.

10. Куркин, B.A. Флавоноиды лекарственных растений: прогноз антиоксидантной активности/В.А. Куркин, В.В. Поройков, А.В. Куркина, Е.В. Авдеева, О.Е. Правдивцева//Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №2-2; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=23252 (дата обращения: 10.06.2020).

11. Липковская Н.А. Зависимость растворимости природных флавоноидов в воде от концентрации мирамистина, поливинилпирролидона и сывороточного альбумина человека/Н.А. Липковская, В.Н. Барвинченко, Т.В. Федянина//Журнал физической химии. Биофизическая химия. - 2014. - Т. 88, №5. - С. 882-886.

12. Патент 2646805 РФ Способ концентрирования и разделения флавоноидов/Л.А. Беланова, СИ. Карпов, В.Ф. Селеменев [и др.] (Россия); заявл. 15.12.2016 №2016149469; опубл. 07.03.2018, бюл. №7.

13. Patent 2002187207 A1 US A23L 33/105; C07C 37/00; (IPC 1-7): A61K 35/78; A23L 33/105 (ЕР); C07H 17/07 (EP); A23V 2002/00 (EP) Method for extracting, fractionating and purifying polyphenolic compounds originating from fresh plant sorting deviations using a high adsorption and elution performance resin / Amiot-Carlin Marie-Josephe, Escudier Jean-Louis, Goupy Pascale, Martin Michel, Mikolajczak Michel (FR); priority date 15.02.2001 №US7722502 A; publication info 12.12.2002.

14. Patent 20110218252 A1 US AA61K4734FI Liquid Chromatographic Fraction of Enzymatically Polymerized Flavonoid as an Antioxidant / Favreau N., Bruno F. F. (US); priority date 08.03.2010 №12/641368; publication info 08.09.2011.

15. Patent 105367615A CN C07H 1/08,C07H 17/07 Daidzein separation and purification method / Hu Xiao, Huang Chunyue, Sun Bailing, Xie Xinxin, Yang Vifang (CN); priority date 29.08.2014 № CN 201410438060 A; publication info 02.03.2016.

16. Patent 109879844 A CN C07D 311/30, C07D 311/40, C07H 1/08, C07H 17/07 Separation and extraction method of seven flavonoid chemical components in Sabia parviflora / Pan Quoji, Sun Qingwen, Xu Wenfen (CN); priority date 17.01.2019 № CN 201910044061 A; publication info 14.06.2019.

17. Patent 105853534 A CN A61K 36/734, A61P 3/10, A61P 39/06 Separation and purification method of hawthorn leaf flavone / Dong Huaqiang, Hou Yi (CN); priority date 26.05.2016 № CN 201610356829 A; publication info 17.08.2016.

18. Patent 106279318 A CN A61K 31/352, A61K 31/7048; A61P 9/00, A61P 9/14, C07D 311/30, C07D 311/32, C07D 311/40, C07H 1/08, C07H 17/07Separation method of flavone compounds in Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze, and flavone composition/Ma Guoxu, Wu Haifeng, Xu Xudong, Yu Shichun, Zhang Xiaopo, Zhong Mingliang, Zhu Vindi (CN); priority date 29.05.2015 № CN 201510291110 A; publication info 04.01.2017.

19. Averyanova E.V., Danilchenko Y.V., Fedorova N.V. Chromatographic study of the component composition and antioxidant activity of polyphenol complex in biological raw materials//Journal of Physics: Cjnference Series. – IOP Publishing, 2019. – T. 1353. – N. 1. – C. 012094.

20. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюент в жидкостной хроматографии// Воронеж: ВГУю – 2003. – 240 с.

Способ фракционирования комплекса биофлавоноидов обезжиренного облепихового шрота, заключающийся в выделении фракции флавонолов методом адсорбционной колоночной хроматографии раствора биофлавоноидов, полученного растворением сухого экстракта комплекса биофлавоноидов обезжиренного облепихового шрота в этиловом спирте 96% об. в соотношении 1:10 при нагревании до полного растворения, при элюировании на силикагеле в течение 4 часов, при этом в качестве элюента используется этиловый спирт с понижающейся концентрацией: 96%, 75%, 50%, 25%.