Биостимулирующая композиция для роста растений, содержашая липопептиды

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой применение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного липопептида, продуцируемого по меньшей мере одним штаммом Bacillus sp, в качестве биостимулятора для роста растений, где липопептид выбран из итурина, сурфактина и фенгицина или их смеси. В частности, настоящее изобретение относится к применению липопептидов в качестве биостимулирующего агента для роста растений, а также к биостимулирующей композиции, содержащей липопептиды, к способу для получения такой композиции и к способу для способствования роста растительного материала путем применения данной композиции. Изобретение также относится к семенам, покрытым биостимулирующей композицией. Изобретение позволяет усилить рост растений. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области биостимуляторов, применяемых в сельском хозяйстве для способствования росту растений. В частности, настоящее изобретение относится к применению липопептидов в качестве биостимулирующего агента для роста растений, а также к композиции-биостимулятору, содержащей липопептиды, способу получения такой композиции и способу способствования приросту растительного материала путем применения данной композиции. Семена, покрытые биостимулирующей композицией, также являются частью изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Повышение потребности в пище, обусловленное непрерывным повышением населения мира, является серьезной проблемой для будущего времени. Биостимуляторы могут эффективно способствовать решению данной проблемы и они все больше используются в глобальном сельскохозяйственном производстве.

Скорость, с которой корни растения достигают питательных веществ, является ключевым показателем в первоначальном развитии растения и успешном росте, как правило, в течение первых нескольких недель. Биостимуляторы обеспечивают возможность улучшения роста растений за счет обеспечения питательных веществ на основе натуральных продуктов или за счет помощи растениям в получении доступа к их питательным веществам.

Биостимуляторы способствуют росту и развитию растений в течение всего жизненного цикла культуры, от прорастания семян до зрелости растения, они улучшают эффективность обмена веществ в растениях, приводя к повышенному урожаю и улучшенному качеству. Они повышают устойчивость растений к абиотическим стрессам и их способность к восстановлению от них. Они упрощают ассимиляцию, прохождение и использование питательных веществ. Они улучшают качество сельскохозяйственной продукции, в том числе содержание сахара, цвет и размер фрукта. В дополнение, они регулируют и улучшают содержание воды в растениях. Наконец, они повышают некоторые физико-химические свойства почвы и способствуют развитию микроорганизмов на участке земли.

Использование микроорганизмов или коктейлей микроорганизмов для биостимуляции растений широко известно. Эти способы основаны на применении композиций, содержащих очищенный микроорганизм или смесь микроорганизмов, при этом такие композиции содержат, в частности, штаммы Bacillus.

Биостимулирующие композиции для роста растений, описанные в литературе, содержат очищенные штаммы Bacillus отдельно или в комбинации с другими компонентами. Например, в заявке WO 2016/109332 описаны композиции, содержащие биологически чистую культуру штамма D747 Bacillus sp. (подан как FERM ВР-8234). В заявке WO 2016/108976 описаны композиции, содержащие биологически чистую культуру штамма rti279 Bacillus pumilus (подан в АТСС под номером РТА-121164), которые могут быть применены отдельно или в комбинации с химическими веществами или другими микробными агентами, или и с теми и с другими, для способствования росту растений и обеспечения защиты и/или контроля заболеваний растений.

Однако такие композиции обладают недостатками. Для того чтобы композиция была активна, желательно, чтобы микроорганизм был живым и способным размножаться на растении; однако эти условия сложно контролировать. В дополнение, в контексте сельского хозяйства, в котором продвигаются экологические решения, использование генетически модифицированных штаммов микроорганизмов является проблематичным.

Настоящее изобретение предусматривает решение данной проблемы.

Действительно, авторами настоящего изобретения неожиданно было показано, что композиция, содержащая липопептиды, может быть применена для стимуляции роста растений. Препарат, основанный на липопептидах или на супернатанте культуры Bacillus, содержащем липопептид и не содержащем штамм(ы) Bacillus, продуцирующий этот супернатант, обладает двойным преимуществом, заключающемся в том, что он активен сам по себе без необходимости продуцирования биостимулирующих молекул in situ, а также является свободным от ГМО. Ни в одном из документов уровня техники не описано применение такого препарата, содержащего липопептиды, для стимулирования роста растений.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен инновационный подход к биостимуляции роста растений.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый объект изобретения относится к применению по меньшей мере одного липопептида в качестве биостимулятора для роста растений.

Действительно, авторами изобретения впервые было продемонстрировано биостимулирующее действие липопептидов на рост растений путем демонстрации стимулирующего действия препарата очищенных липопептидов. Таким образом, ими предлагается применение липопептидов в качестве биостимулирующего агента. Биостимулирующий агент может представлять собой композицию, полученную из супернатанта по меньшей мере одного штамма Bacillus sp, композицию, концентрированную липопептидами, или композицию, содержащую очищенные липопептиды.

Таким образом, второй объект изобретения относится к композиции, которая оказывает биостимулирует рост растений, отличающейся тем, что данная композиция содержит по меньшей мере один липопептид. Липопептиды могут быть очищены, концентрированы или содержаться в супернатанте культуры Bacillus sp., исключая продукцию клеток. В предпочтительном варианте реализации биостимулирующая композиция соответствует композиции, концентрированной липопептидами, или композиции, содержащей очищенные липопептиды.

Используемый в настоящем документе термин «супернатант» относится к супернатанту или экстракту супернатанта по меньшей мере одного штамма Bacillus sp.

Используемый в настоящем документе термин «концентрированная липопептидная композиция» относится к раствору или композиции, полученной путем концентрации супернатанта культуры по меньшей мере одного штамма Bacillus sp.

Используемый в настоящем документе термин «композиция, содержащая очищенные липопептиды» относится к раствору или композиции, полученной путем очистки липопептидов из раствора, содержащего липопептиды, такого как супернатант культуры по меньшей мере одного штамма Bacillus sp. или концентрированная липопептидная композиция.

Природа, а также количество и чистота липопептидов, могут варьироваться в этих различных композициях.

Как определено в настоящем документе, «биостимулирующая композиция» представляет собой композицию (или раствор, или препарат), которая может улучшать рост растений. Существует множество применимых критериев оценки роста; некоторые критерии описаны в экспериментальной части. Они включают, например, оценку прироста касательно времени прорастания, размера корней, биомассы или высоты растения, связанных с применением биостимулирующей композиции. Для проверки имеет ли препарат биостимулирующие свойства, указанный супернатант может быть нанесен на верхние части растения путем орошения и/или на уровне корней путем орошения и/или смачивания, или путем покрытия/погружения семян.

Штаммы Bacillus sp. известны своей способностью продуцировать липопептиды. Штаммы Bacillus, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются природными или генетически модифицированными штаммами.

В конкретном варианте реализации штаммы Bacillus sp. выбраны из Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus velenzensis и Bacillus firmus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus megaterium, Bacillus vallismortis.

Преимущественно, штаммы Bacillus выбраны из Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens (недавно выявлены как Bacillus velenzensis). В предпочтительном варианте реализации, штаммы В. Subtilis выбраны из АТСС 6633, АТСС 21332, 168, АТСС 9943 и NCIB 3610, а также их производных; штаммы В. amyloliquefaciens выбраны из FZB42 и LMG S-29032 (также известен как GA1), а также их производных.

В другом конкретном варианте реализации биостимулирующую композицию получают путем концентрации супернатанта. Таким образом, концентрированная композиция может соответствовать концентрации по меньшей мере с коэффициентом 2, или даже коэффициентом 5 или 10 относительно собранного супернатанта, предпочтительно, по меньшей мере с коэффициентом 20, и еще более предпочтительно, по меньшей мере с коэффициентом 50. Биостимулирующая композиция также может быть получена путем очистки липопептидов, содержащихся в супернатанте. Таким образом, возможно предложить биостимулирующие растворы, содержащие определенную композицию, как с точки зрения качества (природы присутствующих липопептидов), так и с точки зрения количества.

Биостимулирующая композиция в соответствии с изобретением также может быть определена содержанием липопептида в ней. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации липопептидный препарат в соответствии с изобретением может содержать липопептиды в концентрации по меньшей мере 10 мг/л (0,001%), 20 мг/л, 50 мг/л, 100 мг/л (0,01%), 200 мг/л, 500 мг/л, 1 г/л (0,1%), 2 г/л, 5 г/л (0,5%), 10 г/л (1%), 20 г/л, 50 г/л, предпочтительно, между 1% и 7%, в частности, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% или 7%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере 10% или по меньшей мере 20%, зная, что 1% раствора соответствует концентрации 10 г/л.

Концентрированная липопептидная композиция, или композиция, содержащая очищенные липопептиды, может содержать между 0,002% и 15% липопептидов, чистота которых может варьироваться. В частности, такие композиции могут иметь чистоту липопептидов больше или равную 10%, предпочтительно, больше или равную 15%, 20%, 30%, 40% или 50%. В особенно предпочтительном варианте реализации эти композиции имеют чистоту липопептидов больше или равную 60%, предпочтительно, больше или равную 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или даже 100%.

В контексте настоящего изобретения среди липопептидов с биостимулирующими свойствами для роста растений особенный интерес представляют липопептиды семейств итурина, сурфактинов, фенгицинов, курстакинов и лоцилломицинов.

В предпочтительном варианте реализации биостимулирующая композиция определена содержанием в ней молекул, принадлежащих семейству итурина, и/или молекул, принадлежащих семейству сурфактина, и/или молекул, принадлежащих семейству фенгицина, и/или молекул, принадлежащих семейству курстакина, и/или молекул, принадлежащих семейству лоцилломицина (см. таблицу на фигуре 1).

«Молекулы семейства итурина» означают итурин А, можавенсин, микосубтилин и бацилломицины А, В, С, D, F и L.

«Молекулы семейства сурфактина» означают сурфактины А, В, С, лихенизин и пумилацидин.

«Молекулы семейства фенгицина» означают фенгицины А и В, плипастатины А и В, и аграстатин.

Таким образом, например, биостимулирующая композиция в соответствии с изобретением может содержать между 0,002 и 25% липопептидов, в частности, между 1 и 15% липопептидов.

В первом варианте реализации данная композиция включает между 0,002 и 25% липопептидов в следующих пропорциях: молекулы, на 10-90% принадлежащие семейству итурина, молекулы, на 10-90% принадлежащие семейству сурфактина, молекулы, на 0-50% принадлежащие семейству фенгицина.

Во втором варианте реализации данная композиция содержит между 0,002 и 25% липопептидов в следующих пропорциях: молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству итурина, молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству сурфактина, молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству фенгицина.

Другая биостимулирующая композиция в соответствии с изобретением может содержать между 0,002 и 25% липопептидов, предпочтительно, между 1 и 15% липопептидов, в следующих пропорциях:

- 100% сурфактина

- 100% фенгицина

- 100% итурина, в частности, микосубтилина

- смесь итурина и сурфактина

- смесь микосубтилина и сурфактина

- смесь итурина и фенгицина

- смесь микосубтилина и фенгицина

- смесь сурфактина и фенгицина

- смесь итурина, в том числе микосубтилина, сурфактина и фенгицина.

Композиция в соответствии с изобретением также может содержать первичные метаболиты, продуцированные указанным штаммом, такие как ацетоин, 2-3 бутандиол, прекурсоры ауксина и/или фосфат-растворимые ферменты.

Примеры композиций, в соответствии с изобретением, описаны в экспериментальной части.

Концентрированные липопептидные композиции описаны в примере 2. Композиции, полученные путем концентрации супернатанта культуры и содержащие 175 мг/л итурина, в частности, итурина, в частности, микосубтилина, и 75 мг/л сурфактина А, или 700 мг/л итурина, в частности, микосубтилина, и 300 мг/л сурфактина А, существенным образом увеличивают размер растений томатов и количество свежей биомассы в надземных частях таких растений. Эти две композиции также существенно увеличивают количество свежей биомассы в надземных и корневых частях растений пшеницы. Другая композиция, содержащая 350 мг/л итурина, в частности, микосубтилина, и 150 мг/л сурфактина А существенно увеличивает количество свежей биомассы надземных и корневых частей растений пшеницы, а также содержание хлорофиллов в надземных частях этих растений.

Композиции очищенных липопептидов в соответствии с изобретением описаны в примерах 3 и 4. Композиции, содержащие очищенный итурин, в том числе очищенный микосубтилин (99%), или очищенный фенгицин (99%) или смесь итурина, в том числе микосубтилина, и сурфактина (79%), обладают сильным действием на рост корней, в частности, после обработки семян томатов (см. Пример 3).

Композиции, содержащие между 30% и 99% очищенных липопептидов в относительных пропорциях 80% итурина, в частности, микосубтилина, и 20% сурфактина, улучшают устойчивость к водному стрессу, в частности, у растения томата. Эти биостимулирующие действия у композиций приводят к повышению высоты растений томата между началом и концом водного стресса, улучшенной эффективности фотосинтеза и улучшенной устьичной проводимости (см. пример 4).

Для способствования проникновению препарата в растение композиция в соответствии с изобретением также может содержать адъюванты. Преимущественно, адъювант способствует проникновению биостимулирующей композиции в растение. Выбор адъюванта делается исходя из желаемого действия. Например, смачивающие агенты увеличивают поверхность контакта между листом и каплей путем распространения биостимулирующего материала и обеспечивают удержание продукта на кутикуле. Масла способствуют проникновению биостимулирующих материалов путем «разрушения» барьера слоев эпикутикулярного воска растения; это становится недостатком, когда известно, что масло будет действовать таким же образом на кутикулы культивируемых растений до точки ослабления их природной защиты от патогенных грибков. Другие адъюванты, такие как пенетранты, представляют собой смачивающие агенты, которые пропитывают восковые кутикулы, при этом сохраняя их целостность. В качестве адъювантов также могут быть использованы соли, в частности, для поглощения влаги из воздуха и, таким образом, борьбы с потерей влаги. Наконец, адгезивы фиксируют биостимулирующий материал на листьях и ограничивают выщелачивание и выпаривание. Таким образом, адъюванты должны быть адаптированы к режимам действия биостимулирующих материалов (корень, контакт, системное или проникающее), к типам составов продукта и к типам целевых растений (безволосым или волосатым листьям, толщине кутикулы, стадиям растения, положениям устьица и т.д.).

Преимущественно, адъюванты выбраны из наполненных или ненаполненных полимерных поверхностно-активных веществ, алкилполиглюкозидов и сложных эфиров алкилполиглюкозидов, производных нафтален сульфоната, производных целлюлозы, природных полисахаридов, эмульсий на основе кремния.

Биостимулирующая композиция в соответствии с изобретением в другом варианте реализации также может содержать клетки, при условии, что эти клетки не соответствуют конкретному штамму или штаммам, которые продуцируют супернатант. Клетки, добавленные в препарат, могут обладать конкретными свойствами для усиления биостимулирующего действия препарата супернатанта или дополнительными свойствами, в том числе противогрибковыми свойствами. Таким образом, такие клетки могут быть выбраны из штамма Bacillus sp., отличного от используемого для получения супернатанта, в частности, из штаммов Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus firmus, Bacillus velenzensis, Bacillus methylotrophicus, Bacillus megaterium, Bacillus vallismortis. Такие клетки могут также быть не штаммами типа Bacillus, a Paenibacillus sp., Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chioraphis, Pseudomonas syringae), Streptomyces sp. (Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lydicus). Такие клетки также могут быть дрожжами, микоризными грибами или Trichoderma sp., или Pythium sp.

Третий объект изобретения относится к способу получения биостимулирующего препарата для роста растений, включающему этапы (i) культивирования по меньшей мере одного штамма Bacillus sp., (ii) инкубации в культуральной среде, пригодной для секреции молекул в супернатант, и (iii) сбора супернатанта. В данном способе супернатант или экстракт супернатанта может быть использован непосредственно в качестве биостимулятора.

Время инкубации и культуральная среда выбираются в соответствии со штаммами, подлежащими культивированию; специалист в данной области техники сможет адаптировать эти параметры.

В конкретном варианте реализации, штамм(ы) Bacillus, используемый(е) в данном способе, предпочтительно, выбран(ы) из Bacillus sp. Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus, Bacillus velenzensis, Bacillus firmus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus megaterium, Bacillus vallismortis. Преимущественно, штаммы Bacillus выбраны из штаммов Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens. В предпочтительном варианте реализации штаммы В. subtilis выбраны из АТСС 6633, АТСС 21332, 168, АТСС 9943 и NCIB 3610 и их производных; штаммы В. amyloliquefaciens выбраны из FZB42 и LMG S-29032 и их производных.

В дополнение, данный способ может включать этап концентрации супернатанта. Концентрация препарата может быть получена путем использования одной из технологий, которые хорошо известны специалисту в данной области. Например, препарат может быть концентрирован путем мембранной ультрафильтрации, выпаривания, физико-химического осаждения или экстракции.

В качестве альтернативы, данный способ может включать этап очистки липопептидов. На этапе очистки получают очищенные липопептиды для получения раствора, содержащего не более чем один тип липопептида, или для получения раствора, содержащего комбинацию разных липопептидов. Очистка липопептидов может быть достигнута путем использования технологий, которые хорошо известны специалисту в данной области. Например, можно упомянуть непрерывную последовательность этапов ультрафильтрации, диафильтрации и окончательной очистки с использованием органических растворителей, таких как метанол, этанол, бутанол, этилацетат и хлороформ, взятых отдельно или в комбинации. В качестве альтернативы, очистка липопептидов может быть осуществлена путем кислотного осаждения или путем использования солей одно- или двухвалентных катионов (таких как соли аммония, магния, кальция, натрия и т.д.).

Полученная таким образом биостимулирующая композиция может быть дегидратирована в форму порошка для упрощения ее консервации, хранения и транспортировки. Таким образом, биостимулирующая композиция, определенная выше, может быть получена путем растворения порошка супернатанта для получения желаемой концентрации интересующих молекул, в частности, липопептидов.

Четвертый объект изобретения относится к способу биостимуляции для способствования росту растений, заключающемуся в применении определенной выше биостимулирующей композиции к одной или всем частям растения. В предпочтительном варианте реализации биостимулирующая композиция представляет собой композицию, содержащую очищенные липопептиды.

В конкретном варианте реализации биостимулирующий препарат может быть применен путем фолиарной обработки для получения существенного прироста лиственного и/или корневого, и/или фруктового, и/или овощного, и/или зернового материала. Данная обработка может быть применена, например, путем распыления биостимулирующей композиции.

В другом конкретном варианте реализации биостимулирующая композиция может быть применена путем корневой обработки для получения существенного прироста лиственного и/или корневого, и/или фруктового, и/или овощного, и/или хлебного зернового материала. Данная обработка может быть применена, например, путем орошения биостимулирующим препаратом.

В другом варианте реализации биостимулирующая композиция может быть применена путем обработки семян для получения существенного прироста лиственного и/или корневого, и/или фруктового, и/или овощного, и/или хлебного зернового материала. Данная обработка может быть применена, например, путем покрытия биостимулирующим препаратом.

Другой объект изобретения относится к луковицам декоративных растений, обработанным биостимулирующей композицией, определенной в настоящем изобретении, для получения существенного прироста лиственного материала.

Другой объект изобретения относится к семени, покрытому биостимулирующей композицией, определенной в настоящем изобретении.

Покрытие семени овощной культуры предназначено, в частности, для улучшения исходного роста растения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Описательная таблица молекулярных весов основных липопептидов, продуцированных Bacillus sp.

Фигура 2: Измерение высоты растений томата после применения концентрированных композиций, полученных из Bacillus sp. Высоты растения были измерены после применения композиций, содержащих: (условия 1) композицию, полученную из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащую окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А; (условия 2) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А; (условия 3) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 700 мг/л микосубтилина и 300 мг/л сурфактина А. Анализ показал значительный эффект обработки на высоту растения (Р=0,0029). Статистические группы обозначены на графике буквами а и b.

Фигура 3: Измерение веса свежей биомассы надземных частей растений томата после применения концентрированных композиций, полученных из супернатанта культуры Bacillus sp.Веса свежей биомассы надземных частей растений томата были измерены после применения композиций, содержащих: (условия 1) композицию, полученную из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащую окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А; (условия 2) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А; (условия 3) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 700 мг/л микосубтилина и 300 мг/л сурфактина А. Анализ показал значительный эффект обработки на высоту растения (Р=0,0029). Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Фигура 4: Измерение увеличения влаги и корней растений пшеницы после применения концентрированных композиций, полученных из супернатанта культуры Bacillus sp.

Веса свежей биомассы надземных и корневых частей растений пшеницы были измерены после применения только корневой (К) или корневой и фолиарной (К+Ф) обработки композициями, содержащими: (условия 1) композицию, полученную из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащую окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А; (условия 2) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А; (условия 4) композицию супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 350 мг/л микосубтилина и 150 мг/л сурфактина А. Статистические группы обозначены на графике буквами А и В для биостимулирующего действия на надземные части растений пшеницы и буквами а и b для биостимулирующего действия на корневые части растений пшеницы.

Фигура 5: Измерение увеличения содержания хлорофилла у растений пшеницы после применения концентрированных композиций, полученных из Bacillus sp. Содержание хлорофилла в надземных частях растений пшеницы было измерено после применения только корневой (К) или корневой и фолиарной (К+Ф) обработки композициями, содержащими: (условия 1) композицию из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащую окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А; (условия 4) композицию из супернатанта Bacillus subtilis, содержащую окончательные концентрации для обработки 350 мг/л микосубтилина и 150 мг/л сурфактина А. Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Фигура 6: Измерение длины корней семян томата после обработки смачиванием/покрытием с помощью композиций, содержащих очищенные липопептиды.

Длина корней семян растений была измерена после применения композиций, содержащих: (условия 1) концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% микосубтилина; (условия 2) концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% сурфактина; (условия 3) концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% фенгицина; (условия 4) концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 79% смеси микосубтилина и сурфактина; каждое условие сравнивали с контрольным состоянием, которое соответствует контролю, обработанному таким же объемом 0,1% раствора ДМСО. Статистические группы обозначены на графике буквами а, b.

Фигура 7: Измерение прироста роста растений томата, обработанных композициями, содержащими очищенные липопептиды, между началом и концом периода водного стресса.

Размер растений томата был измерен в конце периода водного стресса и сравнен с размером в начале периода для того, чтобы оценить прирост после применения композиций, содержащих: (условия 1) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептида/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяли при дозе 75 г/га липопептидов; (условия 2) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептида/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; (условия 3) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 99% (масса липопептида/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; каждые условия сравнивают с контрольным состоянием, которое соответствует контролю, обработанному таким же объемом раствора дистиллированной воды. Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Фигура 8: Измерение эффективности фотосинтеза у растений томата, обработанных композициями, содержащими очищенные липопептиды, между началом и концом периода водного стресса.

Эффективность фотосинтеза была измерена ПАМ-флуориметрией в начале и в конце водного стресса и после применения композиций, содержащих: (условия 1) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 75 г/га липопептидов; (условия 2) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; (условия 3) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 99% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; каждые условия сравнивают с контрольным состоянием, которое соответствует контролю, обработанному таким же объемом раствора дистиллированной воды. График А соответствует измерению в начале водного стресса, а график В соответствует измерению в конце водного стресса. Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Фигура 9: Измерение устьичной проводимости у растений томата, обработанных композициями, содержащими очищенные липопептиды, между началом и концом периода водного стресса.

Устьичная проводимость была проанализирована с помощью порометра для измерения скорости потока углекислого газа (СО) или водяного пара через устьица листа в начале и в конце водного стресса и после применения композиций, содержащих: (условия 1) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 75 г/га липопептидов; (условия 2) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; (условия 3) супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 99% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяют при дозе 150 г/га липопептидов; каждые условия сравнивают с контрольным состоянием, которое соответствует контролю, обработанному таким же объемом раствора дистиллированной воды. График А соответствует измерению в начале водного стресса, а график В соответствует измерению в конце водного стресса. Статистические группы обозначены на графике буквами а и b.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Приготовление биостимулирующей композиции

1.а Приготовление супернатанта культуры

Супернатант культуры получают из процесса аэробной ферментации штамма Bacillus, полученного из штамма Bacillus subtilis АТСС 6633 или штамма Bacillus amyloliquefaciens LMG S-29032. Культуру удерживают в перемешанной среде, содержащей источник углерода (глюкозу, сахарозу, …), источник азота (сульфат аммония, пептон…) и микроэлементы при 30°C. рН поддерживается на значении 7. Культуру собирают по прошествии 48-72 часов. Затем ее центрифугируют или фильтруют для удаления клеток. Супернатант культуры готов к концентрации. Процентное содержание липопептидов на данной стадии находится в диапазоне от 0,05 до 0,5% (вес/объем).

1.b Приготовление концентрированного препарата-биостимулятора

- Путем тангенциальной фильтрации

Супернатант культуры, полученный с помощью, например, приготовления, представленного в 1.а, концентрируют посредством тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембраны, порог отсечения которой может составлять от 1 кДа до 100 кДа. Например, 1000 л супернатанта культуры, полученного так, как описано выше, концентрируют путем пропускания через мембрану для получения ретентата в объеме от 10 до 100 л.

- Путем осаждения в кислой среде рН

Вторым примером приготовления концентрированного биостимулирующего препарата является понижение рН для осаждения липопептидов. Концентрированную серную кислоту добавляют в супернатант, полученный, например, посредством приготовления, представленного в 1.а. После получения конечного рН около 1 раствор оставляют перемешиваться в течение от 2 до 12 часов. Центрифугирование позволяет рекуперировать отходы материала, содержащего липопептиды. Эти отходы затем растворяют путем добавления воды и соды для получения рН от 7 до 8,5. Например, когда отходы получены из 1000 л супернатанта культуры, эти отходы могут быть использованы в общем объеме от 10 до 100 л.

Процентное содержание липопептидов в конце одного из этих двух примеров приготовления составляет между 1 и 15% (вес/объем).

Пример 2: Биостимулирующее действие композиции, полученной из супернатанта культуры Bacillus, на рост растений

2.а Анализ соединений, присутствующих в супернатанте

Пригодность композиции для использования в качестве биостимулирующей композиции может быть проверена с помощью аналитических способов. Присутствие липопептидов, первичных метаболитов или ферментов из культуры Bacillus в композиции действительно может быть измерено различными способами, известными специалисту в данной области техники, в частности, посредством жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (или ЖХ-МС), высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или колориметрическими способами.

2.b Способ оценки биостимулирующего действия на растения

Биостимулирующее действие композиции может быть оценен непосредственно на растении путем анализа параметров роста. С этой целью супернатант культуры или композиция, полученная из него, может быть применена к верхним частям растения, на уровне корней путем полива или путем смачивания семян. Эти режимы применения также могут быть скомбинированы. Биостимулирующее действие оценивают после фазы роста.

Биостимулирующее действие получено, если удовлетворен по меньшей мере один из следующих критериев:

- Увеличение размера растения (в высоту или толщину)

- Увеличение свежей и/или сухой биомассы фруктов растения

- Увеличение свежей и/или сухой биомассы надземных частей растения

- Увеличение свежей и/или сухой биомассы корней растения

- Увеличение количества узлов, количества колосьев для хлебных зерновых культур

- Увеличение длины корневой системы растения

- Увеличение урожая хлебных зерновых культур, овощей и/или фруктов

- Увеличение содержания хлорофилла

- Повышенная устойчивость к абиотическому стрессу: например, во время водного стресса: повышенная эффективность фотосинтеза, устьичная проводимость и т.д.

2.с Действие композиций, содержащих липопептиды, на увеличение высоты растений томата.

Оборудование и способы

Испытание проводят в культивационной теплице для обеспечения полуконтролируемых условий температуры и солнечного света:

- температура: 25°C днем/20°C ночью

- Световой период: 14 часов дневного света/10 часов ночи

Теплице отрегулирована на минимальную яркость 175 Вт/м². Ниже этой яркости включается освещение и уравновешивает значение яркости. Тень выходит за пределы яркости 500 Вт/м² и уменьшается до 450 Вт/м².

Каждые условия оценивали на 5 растениях томата, которые предварительно пересадили на стадии 2-го листа в песчаную сельскохозяйственную почву. Первичное удобрение проводят за два дня перед пересадкой с помощью раствора красного Хакафоса 8-12-24 в пропорции 0,2 г на растение томата.

Режим использования, испытанный в данном испытании эффективности биостимулятора, соответствует внесению продукта у подножиях растений при пересадке томата и после 3 недель фолиарного культивирования с учетом объема опрыскивания 200 л/га.

Испытанными композициями являются следующие:

- Супернатант культуры Bacillus amyloliquefaciens, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 40 для получения концентрации 50 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 36% для семейства итуринов (здесь - итурин А) и 24% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А), и 40% для семейства фенгицинов (здесь - фенгицин А и В) (условия 1),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 40 для получения концентрации 50 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 70% для семейства итуринов (здесь - микосубтилин) и 30% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А) (условия 2),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 10 для получения концентрации 200 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 70% для семейства итуринов (здесь - микосубтилин) и 30% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А) (условия 3),

- Контроль, обработанный таким же объемом дистиллированной воды (Контрольные условия)

Высоту растений и свежую биомассу надземных частей затем измеряли по прошествии 6 недель культивирования. Данные обрабатывали посредством вариационного анализа (ANOVA, метод LSD при уровне доверия 95%, т.е. с пороговым значением риска 5%), чтобы отметить значимые эффекты. Испытание проводили с использованием программного обеспечения STATGRAPHICS Centurion XV версии 15.2.06.

Результаты

Экспериментальный протокол обеспечивает возможность сравнения биостимулирующего действия различных композиций, полученных из супернатанта культуры штамма Bacillus, на высоту, которой достигают растения томата. Результаты показаны на фигуре 1. Статистический анализ демонстрирует существенный эффект обработки на этот параметр (Р=0,0029). Статистические группы обозначены на графике буквами а и b, все условия обладают значимым биостимулирующим действием по сравнению с контролем.

Результаты, представленные на фигуре 2, демонстрируют, что композиции из супернатанта Bacillus subtilis, содержащие окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А (условия 2) и окончательные концентрации для обработки 700 мг/л микосубтилина и 300 мг/л сурфактина

А (условия 3) существенно увеличивают размер растений томата в течение периода 6 недель по сравнению с режимом без обработки (Контрольные условия). Биостимулирующее действие условий 1 от супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащего окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А, является значительно более сильным, чем контроль без обработки, но принадлежит к 2 статистическим группам, в том числе таковой контроля.

2.d Действие композиций липопептидов на увеличение свежей биомассы надземных частей растений томата.

Оборудование и способы

Экспериментальный протокол идентичен описанному в параграфе 2.с выше.

Результаты

Экспериментальный протокол обеспечивает возможность сравнения биостимулирующего действия различных композиций, полученных из супернатанта культуры штамма Bacillus, на вес свежей биомассы надземных частей растений томата. Результаты показаны на фигуре 3. Статистический анализ демонстрирует существенный эффект обработки на этот параметр (Р=0,0029).

Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Результаты, представленные на фигуре 2, демонстрируют, что композиции из супернатанта Bacillus subtilis, содержащие окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А (условия 2) и окончательные концентрации для обработки 700 мг/л микосубтилина и 300 мг/л сурфактина А (условия 3), обеспечивают существенное увеличение свежей биомассы надземных частей по сравнению с условиями без обработки (контрольныйе условия). Биостимулирующее действие условий 1 из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащего окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А, является значительно более сильным, чем контроль без обработки, но принадлежит к 2 статистическим группам, включая контроль.

2.е Действие композиций липопептидов на увеличение выработки влажного материала из растений пшеницы и влажного материала из корней растения пшеницы.

Оборудование и способы

Семена пшеницы сорта Тибальт были засеяны на инертный субстрат. Корни росли в жидкой среде. Когда растения пшеницы находились на стадии 1-2 листа, растения были высажены в горшки с песчаной глинистой почвой. Горшки удерживали в культивационной камере при 16 часах света и температуре 19°C.

Для каждой культуры и обработки взращивали 20 растений. Десять растений были обработаны корневой обработкой (обозначены как R на фигурах 4 и 5); 10 растений не были обработаны. Затем в группе из 10 растений, обработанных корневой обработкой, 5 растений были впоследствии обработаны фолиарной обработкой (обозначены R+F на фигурах 4 и 5); 5 растений не были обработаны (обозначены R на фигурах 4 и 5).

Корни растений пшеницы были обработаны путем погружения в различные растворы продуктов и высажены в горшки с песчаной почвой для фруктов непосредственно после обработки. Фолиарные обработки были проведены через 4 недели после высаживания при объеме опрыскивания 200 л/га. Окончательное измерение выполняли по прошествии 9 недель роста.

Полученные данные были статистически проанализированы с помощью SAS 7. Нормальность была проверена критерием Колмогорова-Смирнова, а равенство дисперсий было проверено критерием Левена. Нормально распределенные гомоскедастичные переменные были подвергнуты двунаправленному однофакторному Anova с Тьюки в качестве post-hoc анализа.

Испытанными композициями являются следующие:

- Супернатант культуры Bacillus amyloliquefaciens, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 40 для получения концентрации 50 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 36% для семейства итуринов (здесь - итурин А) и 24% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А), и 40% для семейства фенгицинов (здесь - фенгицин А и В) (условия 1),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 40 для получения концентрации 50 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 70% для семейства итуринов (здесь - микосубтилин) и 30% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А) (условия 2),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный с коэффициентом 20 и разбавленный с коэффициентом 20 для получения концентрации 100 г/га в липопептидах, относительные пропорции которых составляют 70% для семейства итуринов (здесь - микосубтилин) и 30% для семейства сурфактинов (здесь - сурфактин А) (условия 4),

- Контроль обрабатывали таким же объемом дистиллированной воды (Контрольные условия).

Результаты

Экспериментальный протокол обеспечивает возможность сравнения биостимулирующего действия различных композиций, полученных из супернатанта культуры штамма Bacillus, на вес свежей биомассы надземных частей (MF-растение) и свежей биомассы корней (MF-корень) растений пшеницы. Результаты показаны на фигуре 4. Статистические группы обозначены на графике буквами А и В для надземных частей и а и b для корней.

- Действие на свежую биомассы надземных частей растений пшеницы

Результаты, представленные на фигуре 4, демонстрируют, что композиции из супернатанта Bacillus subtilis, содержащие окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А (условия 2), примененные корневой и фолиарной обработками (К+Ф), и окончательные концентрации для обработки 350 мг/л микосубтилина и 150 мг/л сурфактина А (условия 4), примененные корневой обработкой (К), обеспечивают существенное увеличение свежей биомассы надземных частей по сравнению с таковыми в условиях без обработки (Контрольные условия).

Результаты, представленные на фигуре 4, демонстрируют, что композиция из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащего окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В и 60 мг/л сурфактина А (условия 1), примененные только корневой (К) или корневой и фолиарной (К+Ф) обработкой, является значительно более сильной, чем контроль без обработки, но принадлежит к 2 статистическим группам, в том числе таковой контроля. Подобный результат наблюдается для условий 4, примененных корневой и фолиарной (К+Ф) обработкой.

- Действие на свежую биомассу корневых частей растений пшеницы

Результаты, представленные на фигуре 4, демонстрируют, что композиции из супернатанта Bacillus subtilis, содержащие окончательные концентрации для обработки 175 мг/л микосубтилина и 75 мг/л сурфактина А (условия 2), примененные корневой и фолиарной (К+Ф) обработками, и окончательные концентрации для обработки 350 мг/л микосубтилина и 150 мг/л сурфактина А (условия 4), примененные корневой (К) обработкой, обеспечивают существенное увеличение свежей биомассы корневых частей по сравнению с таковыми в условиях без обработки (Контрольные условия).

Результаты, представленные на фигуре 4, демонстрируют, что композиция из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащего окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В, и 60 мг/л сурфактина А (условия 1), примененные на корневом и фолиарном уровне (К+Ф), является значительно более сильной, чем контроль без обработки, но принадлежит к 2 статистическим группам, в том числе таковой контроля. Подобный результат наблюдается для условий 2, примененных корневой (К) обработкой, и условий 4, примененных корневой и фолиарной (К+Ф) обработкой.

2.f Действие композиций липопептидов на увеличение содержания хлорофилла в растениях пшеницы

Оборудование и способы

Экспериментальный протокол идентичен описанному в параграфе 2.е выше.

Результаты

Экспериментальный протокол обеспечивает возможность сравнения биостимулирующего действия различных композиций липопептидов, полученных из супернатанта культуры штамма Bacillus, на содержание хлорофилла в надземных частях растений пшеницы. Результаты показаны на фигуре 5. Статистические группы обозначены на графике буквами a, b и с.

Результаты, представленные на фигуре 5, демонстрируют, что композиция из супернатанта Bacillus subtilis, содержащая окончательные концентрации для обработки 350 мг/л микосубтилина и 150 мг/л сурфактина А (условия 4), примененная корневой и фолиарной (К+Ф) обработкой, обеспечивает существенное увеличение содержания хлорофилла в надземных частях по сравнению с условиями без обработки (Контрольные условия).

Эти результаты также демонстрируют, что композиция из супернатанта Bacillus amyloliquefaciens, содержащая окончательные концентрации для обработки 90 мг/л итурина А, 100 мг/л фенгицина А и В и 60 мг/л сурфактина А (условия 1), примененная корневой (К) или корневой и фолиарной (К+Ф) обработкой, обеспечивает существенное увеличение содержания хлорофилла в надземных частях по сравнению с условиями без обработки (Контрольные условия).

Пример 3: Действие различных композиций липопептидов на размер корня семян томата после орошения/покрытия семян

Оборудование и способы

Испытание было проведено на семенах томата марки MONEYMAKER. Семена томата были предварительно продезинфицированы путем погружения в раствор этанола/воды 75/25 об./об. на 2 мин, затем на 30 мин в 5% отбеливателя (натрий гипохлорит) плюс твин (0,1%) и в конце ополоснуты водой до полного исчезновения пены.

Затем семена были замочены на один час в растворах липопептидов различной чистоты и концентрации.

Растворы липопептидов были концентрированы (см. способы в 1.b) и затем очищены путем тангенциальной фильтрации.

Затем растворы были разбавлены в 0,1% ДМСО для получения концентраций липопептидов для условий 1, составляющих 50 и 100 мкмоль, для условий 2 - 5, 20 и 100 мкмоль, для условий 3 - 5, 20 и 100 мкмоль, для условий 4 - 5, 20 и 100 мкмоль.

Семена были помещены вертикально в чашки Петри и заморожены на одну ночь для нормализации прорастания. Затем боксы были помещены в сушильную камеру при 22°C с 16-часовым световым периодом.

0,1% раствор ДМСО в дистиллированной воде использовался в качестве контроля для эксперимента.

Эксперимент с каждыми условиями повторяли 5 раз в чашке Петри.

Испытанными композициями являются следующие:

- Концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% микосубтилина (условия 1),

- Концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% сурфактина (условия 2),

- Концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 99% фенгицина (условия 3),

- Концентрированный и очищенный супернатант культуры Bacillus subtilis, содержащий 79% смеси, содержащей относительные пропорции 40% микосубтилина и 60% сурфактина (условия 4),

- Контроль, обработанный таким же объемом 0,1% раствора ДМСО (Контроль)

Длина корней была измерена по прошествии 7 суток инкубации в боксах. Нормальность была проверена критерием Колмогорова-Смирнова, а равенство дисперсий проверяли критерием Брауна-Форсайта или критерием Краскела-Уоллиса. Переменные затем были подвержены Anova с post-hoc анализом Стьюдента-Ньюмена-Кейлса с Р=0,05 (уровень доверия 95% или пороговое значение риска 5%), чтобы отметить значительные эффекты. Испытание было проведено с использованием программного обеспечения SigmaPlot 14.0. Статистические группы обозначены буквами а и b.

Результаты

Экспериментальный протокол обеспечивает возможность сравнения биостимулирующего действия различных очищенных композиций липопептидов на длину корней семян томата. В результатах, представленных на фигуре 6, показано, что композиции супернатанта Bacillus subtilis обладают значительным эффектом на рост корней семян томата, за исключением условий 2. Статистические группы обозначены на графике буквами а и b. Исходя из этих результатов, значительный эффект обработки в условиях 1 (микосубтилин) на длину корней может наблюдаться, начиная с концентрации 50 мкмоль (Р=0.028). Несмотря на то, что при концентрациях 20 мкмоль и 100 мкмоль наблюдается действие в условиях 2 (сурфактин), оно не отличается статистически от Контрольных условий. Биостимулирующее действие на длину корней наблюдается при условиях 3 (фенгицин) (Р=0.05) и 4 (смесь микосубтилина и сурфактина), начиная с 5 мкмоль (Р=0,009).

Пример 4: Действие различных очищенных композиций липопептидов на рост растений томата, эффективность фотосинтеза и устьичную проводимость в условиях водного стресса

Цель данного испытания заключается в изучении действия композиций липопептидов, полученных из различных концентрированных и очищенных супернатантов Bacillus subtilis, на рост, эффективность фотосинтеза и устьичную проводимость томатов в условиях водного стресса. Изученные композиции имеют различную чистоту и различные концентрации липопептидов.

Оборудование и способы

Растительный материал

Испытание проводили на семенах томата марки FANDANGO Fi.

Семена были засеяны в грядки для рассады (торф Klasmann). Влагу поддерживали близкой к насыщению во время прорастания (воду подавали путем подпочвенного орошения и опрыскивания). На стадии прорастания 2 листа (после 3 недель) саженцы пересаживали в горшки с почвой для испытания. Во время пересаживания торф, который прилип к корням, удаляли путем погружения в воду перед пересаживанием.

Приготовление почвы и культивационных горшков

Почва для испытания представляет собой песчаную сельскохозяйственную почку с известным составом. Перед испытанием ее просеивали до 10 мм, затем измеряли содержание сухого вещества и водоудерживающую способность. В начале испытания каждый горшок содержит 3,5 кг необработанной почвы, увлажненной на 70% от максимальной водоудерживающей способности (CRmax) почвы.

Вычисляли средний вес 5 горшков для обеспечения целевого веса, соответствующего 70% от CRmax.

Горшки увлажняли при установленном весе, соответствующем 70% CRmax воды почвы для пересаживания, во время периода без водного стресса. В дополнение, обеспечивали исходное удобрение в количестве 100 мл 2 г/л раствора Hakaphos roude 8-12-24. 50 мл данного раствора также обеспечивали перед водным стрессом. Во время водного стресса добавляли раствор KNO₃ и MgSO₄.

Водный стресс

Во время 3-недельного периода недостатка воды горшки не увлажняли в течение недели, затем в течение недели CRmax в них поддерживали на значении 30%, затем - 50% CRmax в течение недели.

Длительность испытания

Испытание проводят в культивационной теплице для обеспечения полуконтролируемых условий температуры и солнечного света:

- температура: 25°C днем/20°C ночью

- Световой период: 14 часов дневного света/10 часов ночи

Теплица отрегулирована на минимальную яркость 175 Вт/м². Ниже этой яркости включается освещение и компенсирует значение яркости. Тень выходит за пределы яркости 500 Вт/м² и уменьшается ниже 450 Вт/м².

Испытанные условия

Различными композициями обрабатывали три раза. Для каждой обработки на один горшок обеспечивали 10 мл композиции. Первую обработку проводили после пересаживания, данная обработка являлась обработкой почвы. Другие обработки проводили путем фолиарного опрыскивания. Вторую обработку проводили после 3 недель культивирования и за два дня перед началом водного стресса, третью проводили после 10 суток водного стресса. Контрольные условия обрабатывали таким же объемом дистиллированной воды.

Испытанными условиями являются следующие, при этом каждые условия содержат 6 повторяющихся горшков.

Испытанными композициями являются следующие:

- Контроль, обработанный таким же объемом дистиллированной воды (Контроль),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяли при дозе 75 г/га липопептидов (условия 1),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 30% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяли при дозе 150 г/га липопептидов (условия 2),

- Супернатант культуры Bacillus subtilis, концентрированный и очищенный до чистоты 99% (масса липопептидов/общая сухая масса) и относительные пропорции которого составляют 80% микосубтилина и 20% сурфактина. Данную композицию применяли при дозе 150 г/га липопептидов (условия 3).

Прирост высоты растений между началом и концом водного стресса, эффективности фотосинтеза в начале и в конце водного стресса и устьичная проводимость в начале и в конце водного стресса измеряли и сравнивали с Контрольными условиями. Переменные затем подвергали Anova и критерию Краскела-Уоллиса с Р=0,05 (уровень доверия 95% или пороговое значение риска 5%), чтобы отметить значительные эффекты. Испытание проводили с использованием программного обеспечения Statgraphics Centurion XV - версия 15.2.06. Статистические группы обозначены буквами a, b и с.

Результаты

Прирост высоты растений томата между началом и концом водного стресса

В конце периода водного стресса высоту растений томата сравнивали с начальной высотой перед периодом водного стресса, прирост роста показан на фигуре 7. Условия 1 статистически не отличаются от контрольных условий (значение Р = 0,432). Улучшенный рост наблюдается в условиях 2, однако она статистически не отличается от контрольных условий (значение Р = 0,124). Значительно отличающийся прирост наблюдается в условиях 3 по сравнению с контрольными условиями (значение Р = 0,008).

Эффективность фотосинтеза путем ПАМ-флуориметрии

Эффективность фотосинтеза была измерена ПАМ-флуориметрией в начале и в конце водного стресса. При стрессе значение Ф (ФСИ) снижается, а нефотохимические процессы усиливаются (рассеивание тепла и флуоресценция хлорофилла) в ущерб фотосинтезу. На фигуре 8А наблюдается небольшое повышение Ф (ФСИ) в условиях 3, однако эффект не является статистически значимым (значение Р=0,4932). На фигуре 8 В наблюдается повышение Ф (ФСИ) в условиях 2 (статистически незначимый эффект) и условиях 3 (статистически значимый эффект) (значение Р=0,0070), так что эти условия меньше подвержены стрессу, чем контрольные условия. Условия 1 имеют более низкое значение Ф (ФСИ) чем контрольные условия (статистически незначимый эффект).

Устьичная проводимость

Измерение устьичной проводимости было проведено с помощью порометра. Это устройство используется для измерения устьичной проводимости листьев. Устьичная проводимость представляет собой меру скорости потока углекислого газа (СО₂) или водяного пара через устьица листа. Устьица представляют собой небольшие поры в верху и и низу листа и отвечают за впуск и выпуск СО и влаги из окружающего воздуха и в него. Единицей измерения являются миллимоли на квадратный метр в секунду (ммоль/м²с).

На фигуре 9А в начале водного стресса условия 1 и 3 имеют наивысшие значения устьичной проводимости, что говорит об улучшенном открытии устьиц и, следовательно, меньшем водном стрессе в этих условиях, однако этот эффект не является статистически значимым (значение Р = 0,0544). На фигуре 9В в конце водного стресса условия 2 и 3 имеют более низкие значения чем контрольные условия и условия 1 (статистически значимый эффект, значение Р = 0,000). Для этих условий 2 и 3 устьица были закрыты, растения лучше удерживают воду и являются более устойчивыми к засухе.

Эти испытания обеспечивают возможность выявления одного из механизмов действия липопептидов, содержащихся в концентрированных супернатантах Bacillus subtilis в качестве биостимулирующего агента, а именно для улучшения устойчивости к водному стрессу. Эффект дозы также наблюдается при значимых эффектах, полученных начиная с 150 г/га и выше, вне зависимости от чистоты липопептидов указанного супернатанта.

1. Применение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного липопептида, продуцируемого по меньшей мере одним штаммом Bacillus sp., в качестве биостимулятора для роста растений, где липопептид выбран из итурина, сурфактина и фенгицина или их смеси.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанная композиция представляет собой композицию, полученную из супернатанта по меньшей мере одного штамма Bacillus sp., концентрированную липопептидную композицию или композицию, содержащую очищенные липопептиды.

3. Биостимулирующая композиция для роста растений, отличающаяся тем, что данная композиция содержит эффективное количество по меньшей мере одного липопептида, продуцируемого по меньшей мере одним штаммом Bacillus sp., где липопептид выбран из итурина, сурфактина и фенгицина или их смеси.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой композицию, полученную из супернатанта по меньшей мере одного штамма Bacillus sp., концентрированную липопептидную композицию или композицию, содержащую очищенные липопептиды.

5. Применение по п. 1 или композиция по п. 4, отличающее(ая)ся тем, что указанный или по меньшей мере один из указанных штаммов Bacillus sp. выбран(ы) из штаммов Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus, Bacillus velenzensis, Bacillus firmus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus megaterium, Bacillus vallismortis.

6. Применение или композиция по п. 5, отличающее(ая)ся тем, что указанный или по меньшей мере один из указанных штаммов Bacillus sp. представляет собой штамм Bacillus subtilis, предпочтительно, выбранный из штаммов АТСС 6633, АТСС 21332, 168, АТСС 9943 и NCIB 3610 и их производных, или штамм Bacillus amyloliquefaciens, предпочтительно, выбранный из штаммов FZB42 и LMG S-29032 и их производных.

7. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что концентрация липопептидов составляет по меньшей мере 20 мг/л (0,002%).

8. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что она содержит между 0,002 и 25% липопептидов в следующих пропорциях: молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству итурина, и/или молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству сурфактина, и/или молекулы, на 0-100% принадлежащие семейству фенгицина.

9. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит адъюванты.

10. Композиция по одному из пп. 3-9, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит клетки, отличающиеся от продуцирующих супернатант клеток.

11. Способ получения биостимулирующей композиции по одному из пп. 3-10 для роста растений, включающий этапы:

- культивирования штамма Bacillus sp., и

- сбора супернатанта, содержащего липопептиды,

- и, необязательно, концентрирования и/или очистки,

- и, необязательно, сушки липопептидов.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный или по меньшей мере один из указанных штаммов Bacillus sp. выбран из штаммов Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus, Bacillus velenzensis и Bacillus firmus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus megaterium, Bacillus vallismortis, предпочтительно, из штаммов Bacillus subtilis или Bacillus amyloliquefaciens.

13. Способ биостимуляции для способствования росту растений, заключающийся в применении композиции по одному из пп. 3-10 путем фолиарной обработки, и/или корневой обработки, и/или обработки семян, и/или обработки луковиц декоративного растения.

14. Семя, покрытое биостимулирующей композицией по одному из пп. 3-10.