Производные хинолина для лечения воспалительных заболеваний

Изобретение относится к применению соединения формулы (I), где Z и V представляют собой C или N, означает ароматическое кольцо, где V представляет собой C или N и, когда V представляет собой N, V находится в мета- или пара- положении относительно Z, т. е. образует соответственно пиридиновую или пиразиновую группу; R независимо представляет собой атом водорода, метильную группу, группу метокси, трифторметильную группу, группу трифторметокси, аминогруппу, атом галогена и группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) и, в частности, атом фтора или хлора, группу трифторметокси и аминогруппу; Q представляет собой N или O, при условии что R'' отсутствует, когда Q представляет собой O; R₃ и R₄ независимо представляют собой атом водорода; n и n' равны 1 или 2; R' независимо представляет собой атом галогена и, в частности, атома фтора или хлора, аминогруппу, метильную группу, группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, при условии что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2 и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы, или альтернативно R' независимо представляет собой атом галогена и, в частности, атом фтора или хлора, метильную группу или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, при условии что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2 и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы; R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания, выбранного из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, остеоартрита, псориаза, астмы и воспаления, обусловленного карциномой толстой кишки. Также изобретение относится к соединению формулы (Id), значения радикалов указаны в формуле изобретения, к конкретным производным хинолина и их применению для лечения указанных выше заболеваний, а также к фармацевтической композиции на основе конкретных соединений. Технический результат: получены соединения, повышающие регуляцию уровня экспрессии miR-124 и полезные для лечения и/или профилактики таких воспалительных заболеваний, как воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, рассеянный склероз, остеоартрит, псориаз, астма и воспаление, обусловленное карциномой толстой кишки. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 9 пр.

, (Id)

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к идентификации новых производных хинолина, эффективных для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний, а также к новым видам терапевтического применения производного хинолина против воспалительных заболеваний.

Изобретение также относится к области биомаркеров в сочетании с такими воспалительными заболеваниями.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Воспаление представляет собой защитную реакцию иммунной системы на повреждение ткани и инфекцию. Однако в некоторых обстоятельствах воспалительная реакция может повреждать организм. В острой фазе воспаление характеризуется болью, повышением температуры, покраснением, припухлостью и утратой функции. Существует широкий ряд воспалительных состояний, которыми поражены миллионы людей во всем мире.

Действительно, воспалительные заболевания включают широкий ряд состояний, включающих воспалительное заболевание, обусловленное аутоиммунным заболеванием, воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), воспалительное заболевание суставов, воспалительное заболевание пищеварительного тракта и воспалительное заболевание кожи. Среди них особый интерес представляют воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит и рассеянный склероз.

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) представляет собой комплексное многофакторное заболевание (Perše и Cerar, 2012). В целом оно относится к двум хроническим состояниям, представляющим собой язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), в которые вовлечено воспаление кишечника. ВЗК распространено в развитых странах, где этим заболеванием поражены вплоть до 1 на 200 индивидов региона Северной Европы. У пациентов с ВЗК присутствует несколько клинически значимых проблем для врачей. Колит, индуцированный декстрансульфатом натрия (DSS-индуцированный колит), обусловлен повышающей регуляцией различных провоспалительных цитокинов, включая фактор некроза опухоли (ФНО) альфа и интерферон (ИФН) гамма. Недавно показано, что регуляция гена микроРНК-124 нарушена, в особенности у пациентов детского возраста с активным ЯК, что приводит к повышенным уровням экспрессии передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3) и транскрипционной активации нижележащих мишеней, среди прочего провоспалительных цитокинов (Koukos и др.; Gastroenterology; 145(4):842-52: 2013). Однако, несмотря на недавние достижения, остается необходимость в безопасной, хорошо переносимой терапии с быстрым началом действия и повышенной способностью к поддержанию долгосрочной ремиссии.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой наиболее часто встречающееся аутоиммунное заболевание с распространенностью приблизительно от 0,3 до 1% населения во всем мире, и оно часто связано с ограниченной подвижностью, повышенной социальной зависимостью и нетрудоспособностью. РА представляет собой системное воспалительное заболевание, поражающее ткань выстилки сустава, называемую синовием. Ревматоидная синовиальная ткань характеризуется гиперпролиферацией фибробластоподобных синовиоцитов (ФПС) в интимальном слое выстилки и инфильтрацией субсиновиального слоя макрофагами, T и B клетками и другими воспалительными клетками, которые способствуют воспалению и деструкции кости и хряща. Внутрисуставная и системная экспрессия провоспалительных цитокинов, в частности, фактора некроза опухоли альфа (ФНОα), интерлейкина-1 (ИЛ-1) и -6 (ИЛ-6), продуцируемых, в основном, синовиальными макрофагами, играет критическую роль в патогенезе РА, например, посредством участия в гиперпролиферации РА ФПС. Пациентов с РА, как правило, лечат группой низкомолекулярных лекарственных средств, называемых базисными препаратами для лечения ревматоидного артрита (БПЛРА). БПЛРА некоторыми путями подавляют гиперактивные иммунные и/или воспалительные системы организма, замедляя посредством этого прогрессирование заболевания. Пациентов с РА, на которых БПЛРА не оказывают эффекта, лечат биологическими средствами, такими как антагонисты фактора некроза опухолей (ФНО). Однако, даже несмотря на то, что антагонисты ФНО эффективны примерно у двух третей пациентов, они из эффективных часто становятся неэффективными в пределах 5 лет. Следовательно, требуются альтернативные виды лечения. Следует отметить, что особый интерес представляют новые терапевтические подходы, разработанные для пациентов с РА на ранних стадиях, до того, как заболевание становится хроническим.

Рассеянный склероз (РС) представляет собой аутоиммунное воспалительное заболевание, демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, приводящее к разрушению миелина, олигодендроцитов и аксонов. РС характеризуется множественными очагами поражения воспалением и инфильтрацией макрофагов и энцефалитогенных Т клеток в центральной нервной системе. Микроглия находится во всей центральной нервной системе и задействована в начале и прогрессировании воспалительных заболеваний ЦНС. Микроглия при ее активации в высокой степени повреждает функцию ЦНС посредством продуцирования ею нейротоксинов, воспалительных клеток (белка воспаления-10, макрофагального белка воспаления-1, макрофагального белка воспаления-2, C-C лиганда хемокинов 19, моноцитарного хемоаттрактантного белка-1, моноцитарного хемоаттрактантного белка-2 и иммунных клеток, продуцирующих антитела. Микроглия направляет воспалительные реакции, которые могут приводить в результате к инфильтрации головного и спинного мозга иммунными клетками, направленными против чужеродных организмов, а также Т-клеток, разрушающих миелиновые белки. Периферические макрофаги появляются в ЦНС в процессе воспаления, и эти клетки имеют в высокой степени активированный фенотип, эффективно стимулируют распространение энцефалитогенных Т клеток, и считают, что они участвуют в деструкции нервной ткани.

МикроРНК (миРНК), которые составляют самую обширную группу некодирующих РНК, представляют собой класс некодирующих РНК длиной около 22 нуклеотидов (нт), которые ингибируют экспрессию генов посредством связывания с нетранслируемой областью (UTR) мРНК транскриптов-мишеней (Lai и др., Nature Genetics, т. 30, № 4, стр. 363–364, 2002; Bartel и др., Cell, т. 136, № 2, стр. 215–233, 2009). Гены миРНК составляют приблизительно 1-2 % известных эукариотических геномов. По прогнозам предполагается, что каждая миРНК может быть нацелена более чем на 200 транскриптов, и что отдельная миРНК может регулироваться множественными миРНК (LINDOW, DNA Cell Biol., т. 26(5), стp. 339-351, 2007). миРНК образуются из эндогенных транскриптов, имеющих шпилечную форму, и действуют посредством спаривания оснований с мРНК-мишенями, что приводит к расщеплению мРНК или к подавлению трансляции в зависимости от степени спаривания оснований. К образованию миРНК приводят два события процессинга: сначала формирующиеся транскрипты миРНК (при-миРНК) претерпевают процессинг до 70-нуклеотидных предшественников (пре-миРНК), которые экспортируются из ядра и расщепляются в цитоплазме с образованием коротких (длиной около 22 нуклеотидов) зрелых миРНК (LEE, EMBO J., т. 21, стp; 4663-4670, 2002). миРНК могут иметь межгенную или внутригенную локализацию. При межгенной локализации их экспрессия координирована с другими миРНК в виде кластера (Altuvia и др., Nucleic Acids Research, т. 33, № 8, стp. 2697–2706, 2005, Ozsolak и др., Genes and Development, т. 22, № 22, стp. 3172–3183, 2008). При внутригенной локализации, т.е. при расположении внутри гена, кодирующего белок (почти исключительно в интронах), они часто экспрессируются с одной и той же нити, что и их ген-хозяин (Liu и др., Cell Research, т. 18, № 10, стp. 985–996, 2008, Kim и др., EMBO Journal, т. 26, № 3, стp. 775–783, 2007), и на коррелирующих с ним уровнях (Baskerville и др., RNA, т. 11, № 3, стp. 241–247, 2005).

В настоящее время показано, что гиперэкспрессия миРНК, в частности, миРНК-124, инактивирует воспалительные макрофаги и преобразует их в клетки, подобные клетками микроглии. Считают, что миРНК-124 ингибируют активацию макрофагов путем направления на CEBPα, фактор транскрипции, ответственный за дифференцировку клеток миелоидной линии. Внутривенная инъекция липосом, содержащих миРНК-124, приводит к значительному подавлению клинических симптомов экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) и ингибированию инфильтрации энцефалитогенных Т клеток и воспалительных макрофагов в ЦНС.

Действительно, Ponomarev и др. («microRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-α-PU.1 pathway»; Nature Medicine (2011); 17:1: 64-71) предполагают, что миРНК-124 может играть роль в качестве ключевого регулятора состояния покоя микроглии и в качестве модулятора активации моноцитов и макрофагов. На основании модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) данное исследование позволяет предположить, что паттерн экспрессии миРНК-124 претерпевает модулирование (либо повышающую регуляцию, либо понижающую регуляцию в зависимости от типа клеток) у мышей с ЭАЭ.

Из WO2010/151755 также следует введение миРНК-124 для лечения воспалительного заболевания центральной нервной системы (ЦНС).

Из статьи Sun и др. («microRNA-124 mediates the cholinergic anti-inflammatory action through inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines»; Cell Research (2013); 23:1270-1283) также следует, что миРНК-124 может опосредовать холинергическое противовоспалительное действие посредством направления на STAT3 и TNF (ФНО)-альфа-превращающий фермент (TACE).

С другой стороны, идентифицированы новые соединения, на которые также ссылаются в настоящем документе как на «производные хинолина», но для отдельных показаний.

В качестве ссылки, хинолин представляет собой гетероциклическое ароматическое органическое соединение формулы:

Таким образом, «производные хинолина» включают замещенные хинолины, такие как моно- или полизамещенные хинолины.

Из WO2010/143170 следует применение соединений для лечения состояний, связанных с преждевременным старением.

Из WO2010/143169 и WO2012/080953 следует применение соединений для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Из WO2010/143168 следует применение соединений для лечения отдельных видов рака. Показано, что эти соединения способны к коррекции нарушений альтернативного сплайсинга.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время обнаружено, что соединения, как далее в настоящем документе определено в формуле (I), пригодны при лечении и/или профилактике воспалительных заболеваний.

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), как определено ниже, для применения при лечении и/или профилактике воспалительных заболеваний.

В частности, изобретение относится к соединениям формулы (I), как определено ниже, для применения при лечении и/или профилактике воспаления и/или воспаления, которое может встречаться совместно с такими воспалительными заболеваниями.

Изобретение также относится к применению по меньшей мере одной миРНК in vitro или ex vivo, где по меньшей мере одна миРНК представляет собой миРНК-124, в качестве биомаркера для скрининга производного хинолина и в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Изобретение дополнительно относится к соединению формулы (Id) или (Ie), как определено в данном документе ниже, как таковому.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (Id) или (Ie).

Оно также относится к соединению как таковому, выбранному из перечня, состоящего из:

- (8) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (9) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (10) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (11) 8-хлор-N⁴-(2-морфолиноэтил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (13) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (14) 8-хлор-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (15) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (16) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (17) 8-хлор-6-(2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (18) 8-хлор-6-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (19) 8-хлор-6-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (20) 8-хлор-N-(3-фтор-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (21) N-(5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)-8-хлорхинолин-2-амина;

- (22) N²-(8-хлорхинолин-2-ил)-N⁵-(3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил)-4-(трифторметил)пиридин-2,5-диамина;

- (28) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (29) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (30) 8-хлор-N-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (31) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (32) 8-хлор-N-(2-(пирролидин-1-ил)этил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (33) 8-хлор-N-(4-морфолинобутил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (34) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (35) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (36) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (37) N¹-(4,8-дихлорхинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (38) 4,8-дихлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (39) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (40) 8-хлор-N²-(2-морфолиноэтил)-N⁴-(3-морфолинопропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (41) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(2-нитро-4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (42) N¹-(8-хлорхинолин-2-ил)-N¹-(2-морфолиноэтил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (43) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (44) N¹-(8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)хинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (46) 8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин;

- (47) 4-(2-((8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолин;

- (48) 8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин;

- (49) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолина;

- (50) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-5-ил)окси)этил)морфолина;

- (51) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметил-пиридин-2-иламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (52) моно-[2-(8-хлор-хинолин-2-иламино)-5-трифторметокси-фенил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (53) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметокси-фениламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты

- и их фармацевтически приемлемых солей, и более конкретно выбранное из соединений (8), (9), (10), (11), (30), (46), (47), (48), (49) и (50), как определено выше, или одной из их фармацевтически приемлемых солей.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (Id) или (Ie) или одно из соединений (8), (9), (10), (11), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52) и (53), и более конкретно одного из соединений (8), (9), (10), (11), (30), (46), (47), (48), (49) и (50), как определено выше.

Изобретение дополнительно относится к способу повышения экспрессии миРНК-124 in vitro или ex vivo в эукариотической клетке, включающему по меньшей мере стадию, на которой:

a) обеспечивают эукариотическую клетку,

b) приводят эту клетку в контакт с производным хинолина и, в частности, с соединением формулы (I).

Изобретение дополнительно относится к способу скрининга in vitro или ex vivo соединения-производного и, в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, где способ включает по меньшей мере стадию, на которой:

a) обеспечивают эукариотическую клетку,

b) приводят эту клетку в контакт с соединением формулы (I),

c) определяют экспрессию миРНК-124 в клетке, и

d) выбирают соединение-кандидат, предположительно эффективное при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, когда уровень экспрессии миРНК-124, определенный на стадии c), повышен относительно эталонного значения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: модель 1 индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита – изменение потери массы в процентах по времени (дни) в модели DSS на мыши в присутствии соединения производного хинолина (24), как определено в настоящем документе ниже. Потеря массы в процентах (%) указана на оси y. Лечение DSS применяют в дни 3–10 (ось x). Производное хинолина в метилцеллюлозе (MC) или только MC вводят через зонд с 3 по 29 день.

Фиг. 2: модель 2 индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита – изменение потери массы в процентах по времени (дни) в модели DSS на мыши после второго цикла DSS в присутствии соединения производного хинолина (24), как определено в настоящем документе ниже. Потеря массы в процентах (%) указана на оси y. Лечение DSS начинали на день 12 и продолжали в течение периода 5 дней (ось x). Производное хинолина в метилцеллюлозе (MC) или только MC вводят через зонд с 3 по 29 день.

Фиг. 3: модель индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита — толстые кишки извлекали через 2–3 дня после второго введения DSS (в течение 5 дней) и измеряли изменение размеров толстой кишки (см). Статистически незначимое различие обозначено как «нз». Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни, звездочкой указано статистически значимое различие (p<0,5), двумя звездочками указано высоко статистически значимое различие (p<0,05).

Фиг. 4: модель индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита — толстые кишки извлекали через 3 дня после второго введения DSS и анализировали в них число очагов поражения. Очаги поражения наблюдали под микроскопом и измеряли.

Фиг. 5: модель индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита — толстые кишки извлекали через 3 дня после второго введения DSS и определяли площадь очага поражения (мм²).

Фиг. 6: модель коллаген-индуцированного артрита — изменение припухлости суставов (мм) по времени (недели) на средней арифметической когорте из 10 животных. Припухлость суставов (мм) указана на оси y. Изменение между группами, подвергнутыми по сравнению с неподвергнутыми воздействию, оценивали в течение 12 недель.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность в идентификации новых соединений для применения при лечении и/или профилактике воспалительных заболеваний.

Также существует потребность в новом биомаркере для оценки активности лекарственных препаратов-кандидатов, таких как производные хинолина, направленных на воспалительные заболевания.

Цель настоящего изобретения состоит в удовлетворении этих потребностей.

Производные хинолина

Согласно первому аспекту объект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I):

(I)

где:

Z представляет собой C или N,

V представляет собой C или N,

означает ароматическое кольцо, где V представляет собой C или N, и, когда V представляет собой N, V находится в орто-, мета- или пара- положении относительно Z, т.е. образует соответственно пиридиновую, пиридазиновую, пиримидиновую или пиразиновую группу,

R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из группы –CN, гидроксильной группы, группы –COOR₁, (C₁-C₃)фторалкильной группы, группы (C₁-C₃)фторалкокси, (C₃-C₆)циклоалкильной группы, группы –NO₂, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси, группы фенокси, группы -NR₁-SO₂-NR₁R₂, группы –NR₁-SO₂-R₁, группы -NR₁-C(=O)-R₁, группы -NR₁-C(=O)-NR₁R₂, группы -SO₂-NR₁R₂, группы -SO₃H, группы -O-SO₂-OR₃, группы -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), группы -O-CH₂-COOR₃ и (C₁-C₃)алкильной группы, где алкил необязательно монозамещен гидроксильной группой,

Q представляет собой N или O при условии, что R'' отсутствует, когда Q представляет собой O,

R₁ и R₂ независимо представляют собой атом водорода или (C₁-C₃)алкильную группу,

R₃ и R₄ независимо представляют собой атом водорода, Li⁺, Na⁺, K⁺, N⁺(Ra)₄ или бензильную группу,

n равно 1, 2 или 3,

n' равно 1, 2 или 3,

R' независимо представляет собой атом водорода или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, атома галогена, гидроксильной группы, группы -COOR₁, группы -NO₂, группы -NR₁R₂, группы морфолинил или морфолино, N-метилпиперазинильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, группы (C₁-C₄)алкокси, группы -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) и группы –CN, и может дополнительно представлять собой группу, выбранную из:

A представляет собой ковалентную связь, атом кислорода или NH,

B представляет собой ковалентную связь или NH,

m равно 1, 2, 3, 4 или 5,

p равно 1, 2 или 3,

Ra и Rb независимо представляют собой атом водорода, (C₁-C₅)алкильную группу или (C₃-C₆)циклоалкильную группу,

Ra и Rb дополнительно могут образовать вместе с атомом азота, к которому они присоединены, насыщенный 5- или 6-членный гетероцикл, необязательно содержащий дополнительный гетероатом, выбранный из N, O и S, где гетероцикл необязательно замещен одним или более Ra при условии, что, когда R' представляет собой группу (IIa) или (IIIa), n' может быть равно 2 или 3 только в том случае, если другие группы R' отличаются от группы (IIa) или (IIIa),

R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу (IIa), как определено выше,

или любая из его фармацевтически приемлемых солей,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения Q представляет собой N.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения n равно 1 или 2.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения n' равно 1 или 2.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения R независимо представляет собой атом водорода, метильную группу, группу метокси, трифторметильную группу, группу трифторметокси, аминогруппу, атом галогена и группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), и более конкретно атом фтора или хлора, группу трифторметокси и аминогруппу.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена, и более конкретно атом фтора или хлора, аминогруппу, метильную группу, группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' альтернативно независимо представляет собой атом водорода, атом галогена, и более конкретно атом фтора или хлора, метильную группу или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Все предшествующие и последующие конкретные воплощения изобретения можно, конечно, объединять вместе и образовать часть изобретения.

Соединения формулы (I) включают соединения формулы (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie), как определено в настоящем документе ниже.

Согласно конкретному воплощению изобретения другой объект настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (Ia):

(Ia)

где R, R', R'', n и n' являются такими, как определено выше,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n равно 1 или 2.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n' равно 1 или 2.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из гидроксильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, (C₁-C₃) фторалкокси группы, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси и (C₁-C₃)алкильной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы, группы -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), группы -NR₁R₂ или группы , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно другому аспекту предпочтительного воплощения изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, и предпочтительно R'' представляет собой атом водорода или метильную группу.

Согласно конкретному воплощению изобретения другой объект настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (Ib):

(Ib)

где R, R', R'', n и n' являются такими, как определено выше,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n равно 1 или 2.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n' равно 1, 2 или 3.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из гидроксильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, (C₁-C₃)фторалкокси группы, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси, группы -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) и (C₁-C₃)алкильной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы, группы -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), группы -NR₁R₂ или группы , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' альтернативно независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы или группы -NR₁R₂.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, и предпочтительно R'' представляет собой атом водорода или метильную группу.

Согласно конкретному воплощению изобретения другой объект настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (Ic):

(Ic)

где R, R', R'', n и n' являются такими, как определено выше,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n' равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из гидроксильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, (C₁-C₃) фторалкокси группы, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси и (C₁-C₃)алкильной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R альтернативно независимо представляет собой атом водорода или атом галогена.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы, группы -NR₁R₂ или группы , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R' альтернативно независимо представляет собой атом водорода или атом галогена.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, и предпочтительно R'' представляет собой атом водорода или метильную группу.

Согласно конкретному воплощению изобретения другой объект настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (Id):

(Id)

где R, R', n и n' являются такими, как определено выше,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n' равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из гидроксильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, (C₁-C₃) фторалкокси группы, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси и (C₁-C₃)алкильной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R альтернативно независимо представляет собой атом водорода, (C₁-C₃)фторалкильную группу, (C₁-C₃)фторалкокси группу или атом галогена.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы, группы -NR₁R₂ или группы , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R' альтернативно независимо представляет собой атом водорода или атом галогена.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, и предпочтительно R'' представляет собой атом водорода или метильную группу.

Согласно конкретному воплощению изобретения другой объект настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (Ie):

(Ie)

где R, R', n и n' являются такими, как определено выше,

при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения n' равно 1.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из гидроксильной группы, (C₁-C₃)фторалкильной группы, (C₁-C₃)фторалкокси группы, группы –NR₁R₂, группы (C₁-C₄)алкокси и (C₁-C₃)алкильной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R альтернативно независимо представляет собой атом водорода, (C₁-C₃)фторалкильную группу, (C₁-C₃)фторалкокси группу или атом галогена.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R' независимо представляет собой атом водорода, атом галогена или группу, выбранную из (C₁-C₃)алкильной группы, гидроксильной группы, группы -NR₁R₂ или группы , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃ при условии, что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2, и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы.

Согласно одному аспекту данного предпочтительного воплощения R' альтернативно независимо представляет собой атом водорода или атом галогена.

Согласно другому аспекту данного предпочтительного воплощения изобретения R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3, и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, и предпочтительно R'' представляет собой атом водорода или метильную группу.

Согласно другому конкретному воплощению изобретения соединения (Id) и (Ie), как определено выше, как таковые также образуют часть настоящего изобретения.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения некоторые соединения формулы (I) являются новыми, образуют часть настоящего изобретения и выбраны из (номер указан в таблице 1 ниже):

- (8) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (9) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (10) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (11) 8-хлор-N⁴-(2-морфолиноэтил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (13) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (14) 8-хлор-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (15) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (16) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (17) 8-хлор-6-(2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (18) 8-хлор-6-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (19) 8-хлор-6-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (20) 8-хлор-N-(3-фтор-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (21) N-(5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)-8-хлорхинолин-2-амина;

- (22) N²-(8-хлорхинолин-2-ил)-N⁵-(3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил)-4-(трифторметил)пиридин-2,5-диамина;

- (28) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (29) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (30) 8-хлор-N-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (31) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (32) 8-хлор-N-(2-(пирролидин-1-ил)этил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (33) 8-хлор-N-(4-морфолинобутил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (34) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (35) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (36) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (37) N¹-(4,8-дихлорхинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (38) 4,8-дихлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (39) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (40) 8-хлор-N²-(2-морфолиноэтил)-N⁴-(3-морфолинопропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (41) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(2-нитро-4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (42) N¹-(8-хлорхинолин-2-ил)-N¹-(2-морфолиноэтил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (43) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (44) N¹-(8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)хинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (46) 8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин;

- (47) 4-(2-((8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолин;

- (48) 8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин;

- (49) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолина;

- (50) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-5-ил)окси)этил)морфолина;

- (51) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметил-пиридин-2-иламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (52) моно-[2-(8-хлор-хинолин-2-иламино)-5-трифторметокси-фенил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (53) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметокси-фениламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты

- и их фармацевтически приемлемых солей.

Для цели настоящего изобретения соединение формулы (I) включает любое из соединений формулы (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie), а также их комбинаций. Соединения формулы (I) включают соединения (1) – (53), как определено в таблице I, и их комбинации.

Соединения по изобретению могут существовать в форме свободных оснований или солей присоединения с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Подходящие физиологически приемлемые соли присоединения кислоты соединений формулы (I) включают гидробромид, тартрат, цитрат, трифторацетат, аскорбат, гидрохлорид, тартрат, трифлат, малеат, мезилат, формиат, ацетат и фумарат.

Соединения формулы (I) и/или их соли могут образовать сольваты или гидраты, и изобретение включает все такие сольваты и гидраты.

Термины «гидраты» и «сольваты» просто означают, что соединения (I) согласно изобретению могут иметь форму гидрата или сольвата, т.е. объединяться или ассоциироваться с одной или более молекул воды или растворителя. Это является лишь химической характеристикой таких соединений, которая может быть применена ко всем органическим соединениям данного типа.

Соединения формулы (I) могут содержать один или более асимметрических атомов углерода. Они могут, таким образом, существовать в форме энантиомеров или диастереоизомеров. Эти энантиомеры, диастереоизомеры и их смеси, включая рацемические смеси, входят в объем настоящего изобретения.

В контексте настоящего изобретения термин:

- «атом галогена» понимают как означающий атом хлора, фтора, брома или йода и, в частности, обозначает атом хлора, фтора или брома,

- «(C₁-C₅)алкил» при использовании в настоящем документе соответственно относится к C₁-C₅ нормальному, вторичному или третичному насыщенному углеводороду. Примерами являются, но не ограничиваясь указанными, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, бутил, пентил,

- «(C₃-C₆)циклоалкил» при использовании в настоящем документе соответственно относится к циклическому насыщенному углеводороду. Примерами являются, но не ограничиваясь указанными, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил,

- «(C₁-C₄)алкокси» при использовании в настоящем документе соответственно относится к O-(C₁-C₄)алкильной группировке, где алкил является таким, как определено выше. Примерами являются, но не ограничиваясь указанными, метокси, этокси, 1-пропокси, 2-пропокси, бутокси,

- «фторалкильная группа» и «фторалкоксигруппа» относятся соответственно к алкильной группе и алкоксигруппе, как определено выше, где указанные группы замещены по меньшей мере одним атомом фтора. Примерами являются перфторалкильные группы, такие как трифторметил или перфторпропил,

- «насыщенный 5- или 6-членный гетероцикл» при использовании в настоящем документе соответственно относится к насыщенному циклу, содержащему по меньшей мере один гетероатом. Примерами являются но не ограничиваясь указанными, морфолин, пиперазин, тиоморфолин, пиперидин, пирролидин,

- «пациент» может распространяться на людей или млекопитающих, таких как кошки или собаки.

Соединения формулы (I), подходящие для изобретения, могут быть получены, как описано в документах WO2010/143170, WO2010/143169, WO2012/080953 и WO2010/143168, и/или как описано в настоящем документе ниже.

Более конкретно соединения формулы (I), где R' представляет собой группу, выбранную из:

как определено выше, могут быть получены в соответствии с путями синтеза, как описано в WO2012/080953, более конкретно, когда A представляет собой O.

Когда A представляет собой N, можно применять следующий путь синтеза. Производное хинолина формулы (VII) можно синтезировать в виде строительного блока, перед дополнительными реакциями перекрестного сочетания.

С целью получения соединения формулы (VII) можно проводить следующую последовательность реакций, как показано ниже на схеме 1.

Схема 1

Соединение формулы (II), где R' отличается от H и является таким, как определено выше, и может, в частности, представлять собой атом хлора, можно помещать в пиридин, затем можно добавлять соединение формулы (III) в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например, 1,5, по отношению к соединению формулы (II). Реакционную смесь можно перемешивать при температуре в диапазоне от 110 до 150°C, например, при 130°C, в течение времени в диапазоне от 8 часов до 18 часов, например, 14 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь можно концентрировать при пониженном давлении, и полученный в результате остаток можно разбавлять органическим растворителем, таким как дихлорметан. Затем органическую фазу можно промывать насыщенным водным раствором неорганического основания, такого как Na₂CO₃, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (IV).

Соединение формулы (IV) можно помещать в смесь ТГФ/вода, затем можно добавлять гидроксид натрия в молярном отношении в диапазоне от 1 до 1,5, например, 1,2, по отношению к соединению формулы (IV), и реакционную смесь можно перемешивать при комнатной температуре в течение времени в диапазоне от 8 часов до 18 часов, например, 14 часов. Затем можно добавлять концентрированную соляную кислоту до достижения pH 2, и полученный в результате раствор можно экстрагировать органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органическую фазу можно высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (V).

Соединение формулы (V) можно помещать в полифосфорную кислоту, добавленную в молярном отношении в диапазоне от 5 до 15, например, 10, по отношению к соединению формулы (V), и реакционную смесь можно перемешивать при температуре в диапазоне от 110 до 150°C, например, при 130°C, в течение времени в диапазоне от 8 часов до 18 часов, например, 14 часов. После охлаждения до комнатной температуры можно медленно добавлять водный раствор гидроксида натрия, имеющий диапазон молярности от 1 до 5 М, например, 2 М. Полученный в результате осадок можно фильтровать, промывать водой и высушивать при пониженном давлении в эксикаторе с получением соединения формулы (VI).

Соединение формулы (VI) можно помещать в POCl₃, добавлять в молярном отношении в диапазоне от 5 до 15, например 10, по отношению к соединению формулы (VI), и реакционную смесь можно перемешивать при температуре в диапазоне от 80 до 120°C, например, при 100°C, в течение времени в диапазоне от 1 часа до 5 часов, например 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры можно медленно добавлять воду. Полученный в результате осадок можно фильтровать, промывать водой и высушивать при пониженном давлении в эксикаторе с получением соединения формулы (VII).

Указанное промежуточное соединение формулы (VII) можно использовать для образования соединения формулы (I) путем его сочетания с производным анилина, производным аминопиридина, производным пиримидина, производным гидроксипиридина, производным фенола или производным гидроксипиримидина, как описано в WO2010/143170, WO2010/143169, WO2012/080953 и WO2010/143168, и/или как дополнительно описано в настоящем документе ниже.

Атом хлора в положении 4 промежуточного соединения формулы (VII) может быть впоследствии замещен амином с образованием производного хинолина, несущего группу формулы (IIa), где A = NH.

Когда Q = N, и R'' отличается от H, можно применять следующие пути, проиллюстрированные на схемах 2 и 3.

С целью получения соединения формулы (IX) можно проводить следующую реакцию, как показано ниже на схеме 2.

Схема 2

Соединение формулы (VIII), где Z, V, n, n', R и R' являются такими, как определено выше, можно помещать в безводный полярный растворитель, такой как безводный N,N-диметилформамид, в присутствии AklHal, где Alk представляет собой (C₁-C₄)алкильную группу, а Hal представляет собой атом галогена, в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1,1, и в присутствии неорганического основания, такого как трет-бутоксид калия, в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1,1, по отношению к соединению формулы (VIII). Реакционную смесь можно перемешивать при комнатной температуре в течение времени в диапазоне от 7 часов до 24 часов, например 16 часов. Реакционную смесь можно распределять между водой и органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органические фазы можно собирать, промывать насыщенным водным соляным раствором, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (IX).

С целью получения соединений формулы (XII) можно проводить следующую реакцию, как показано ниже на схеме 3.

Схема 3

Соединение формулы (X), где Z, V, n, n', R и R' являются такими, как определено выше, можно помещать в безводный полярный растворитель, такой как безводный N,N-диметилформамид, в присутствии NaH в молярном отношении в диапазоне от 2 до 5, например 3, и реакционную смесь можно перемешивать при комнатной температуре в течение времени в диапазоне от 10 минут до 50 минут, например 30 минут. Затем соединение формулы (XI), где m, B, Ra и Rb являются такими, как определено выше, можно помещать в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1, в безводный полярный растворитель, такой как безводный N,N-диметилформамид, в присутствии KI в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1, и в присутствии органического основания, такого как Et₃N, в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1, по отношению к соединению формулы (X), и реакционную смесь можно перемешивать при комнатной температуре в течение времени в диапазоне от 10 минут до 50 минут, например 30 минут, в инертной атмосфере газа, например аргона. Затем активированное соединение (X) можно добавлять к соединению (XI), и полученную в результате реакционную смесь можно перемешивать при температуре в диапазоне от 70 до 110°C, например, при 90°C, в течение времени в диапазоне от 2 часов до 10 часов, например 4 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь можно концентрировать при пониженном давлении, и полученный в результате остаток можно разбавлять органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органическую фазу можно промывать насыщенным водным соляным раствором, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (XII).

Когда группа несет замещение, представляющее собой аминогруппу формулы (IIa), где A представляет собой NH, можно применять следующий путь, как на схеме 4.

Схема 4

Соединение формулы (XIII), где Z, V, n', R и R' являются такими, как определено выше, и X представляет собой атом галогена, такой как Br, можно помещать в смесь полярных растворителей, такую как смесь диоксан/N,N-диметилформамид. Затем соединение формулы (XIV), где B, R_a, и R_b являются такими, как определено выше, добавляют в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1,5, по отношению к соединению формулы (XIII) в присутствии ненуклеофильного органического основания, такого как трет-бутоксид натрия или трет-бутоксид калия, в молярном отношении в диапазоне от 2 до 5, например 3, в присутствии дифосфина, такого как Ксантфос (4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантин) или X-Phos (2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилдифенил) в количестве в диапазоне от 5 моль% до 40 моль% относительно общего количества соединения формулы (XIII), и в присутствии катализатора, такого как Pd(OAc)₂ или Pd₂(dba)₃, в количестве в диапазоне от 2 моль% до 15 моль% относительно общего количества соединения формулы (XIII). Реакционную смесь можно нагревать в микроволновом реакторе при температуре в диапазоне от 90 до 150°C, например при 120°C, в течение времени в диапазоне от 30 минут до 100 минут, например 70 минут. Реакционную смесь можно концентрировать при пониженном давлении, и полученный в результате остаток можно разбавлять органическим растворителем, таким как этилацетат. Органическую фазу можно промывать водой, декантировать, высушивать над сульфатом магния, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (XV).

Соединения общей формулы (Id), как определено выше, могут быть получены в соответствии со схемой 5 ниже.

Схема 5

Соединение формулы (XVI), где n' и R' являются такими, как определено выше, и X представляет собой атом галогена, такой как Cl, можно помещать в полярный растворитель, такой как N,N-диметилформамид, в присутствии неорганического основания, такого как Cs₂CO₃, в молярном отношении в диапазоне от 2 до 5, например 3, и в присутствии CuI в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1. Затем соединение формулы (XVII), где R, V и n являются такими, как определено выше, можно добавлять в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1, по отношению к соединению формулы (XVI). Реакционную смесь можно нагревать в микроволновом реакторе при температуре в диапазоне от 130 до 170°C, например при 150°C, в течение времени в диапазоне от 30 минут до 100 минут, например 50 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси можно добавлять воду, нерастворенные твердые вещества можно фильтровать через целит, и полученный в результате фильтрат можно экстрагировать органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органическую фазу можно промывать насыщенным водным соляным раствором, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (Id).

Соединения общей формулы (Ie), как определено выше, могут быть получены в соответствии со схемой 6 ниже.

Схема 6

Соединение формулы (XVI), где n' и R' являются такими, как определено выше, и X представляет собой атом галогена, такой как Cl, можно помещать в полярный растворитель, такой как N,N-диметилформамид, в присутствии неорганического основания, такого как Cs₂CO₃, в молярном отношении в диапазоне от 2 до 5, например 3, и в присутствии CuI в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1. Затем соединение формулы (XIX), где R, V и n являются такими, как определено выше, можно добавлять в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1, по отношению к соединению формулы (XVI). Реакционную смесь можно нагревать в микроволновом реакторе при температуре в диапазоне от 130 до 170°C, например при 150°C, в течение времени в диапазоне от 30 минут до 100 минут, например 50 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси можно добавлять воду, нерастворенные твердые вещества можно фильтровать через целит, и полученный в результате фильтрат можно экстрагировать органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органическую фазу можно промывать водой и насыщенным водным соляным раствором, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (Ie).

Более конкретно соединения формулы (I), где R' представляет собой группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), может быть получено, начиная с соединения формулы (XX), в котором группа R' представляет собой группу OH, посредством следующего пути:

Схема 7

Соединение формулы (XX), где Z, V, n, n', R и R' являются такими, как определено выше, можно помещать в безводный хлоралкановый растворитель, такой как безводный дихлорметан, при 0°C в инертной атмосфере газа, например аргона, в присутствии диэтилхлорфосфата в молярном отношении 1 и в присутствии органического основания, такого как триэтиламин, в молярном отношении в диапазоне от 1 до 2, например 1,2, по отношению к соединению формулы (XX). Реакционную смесь можно перемешивать при комнатной температуре в течение времени в диапазоне от 7 часов до 24 часов, например 14 часов. Затем реакционную смесь можно концентрировать при пониженном давлении, и полученный в результате остаток можно распределять между водным раствором соляной кислоты молярности в диапазоне от 1 до 2 М, например 1 М, и органическим растворителем, таким как этилацетат. Затем органические фазы можно собирать, промывать насыщенным водным раствором неорганического основания, такого как Na₂CO₃, высушивать над MgSO₄, фильтровать и концентрировать при пониженном давлении с получением соединения формулы (XXI).

Затем соединение формулы (XXI) можно помещать в полярный апротонный растворитель, такой как ацетонитрил, в присутствии триметилсилилбромида в молярном отношении в диапазоне от 1 до 5, например 4, по отношению к соединению формулы (XXI). Реакционную смесь можно перемешивать при микроволновом облучении при температуре в диапазоне от 50 до 70°C, например при 60°C, в течение времени в диапазоне от 15 часов до 60 минут, например 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры можно медленно добавлять смесь MeOH/вода (95/5). Полученный в результате осадок можно фильтровать, промывать водой и высушивать при пониженном давлении в эксикаторе с получением соединения формулы (XXII).

Такую же методику можно применять для получения соединений формулы (I), где R представляет собой группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄), начиная с соединения формулы (I), в котором группа R представляет собой группу OH.

Воспалительные заболевания

Таким образом, изобретение также относится к соединению формулы (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie) для применения при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Авторам изобретения неожиданно удалось показать, что соединения формулы (I) приводили к резкому улучшению признаков, обусловленных воспалительными заболеваниями, такими как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и ревматоидный артрит (РА), на основании двух моделей in vivo на мышах.

Способность соединений формулы (I) к модулированию воспаления оценивали в двух установленных моделях на мышах двух воспалительных заболеваний: воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и ревматоидный артрит (РА). Модель колита, индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-), на мышах использовали для исследования воспалительного заболевания кишечника (см. Perše и Cerar; «Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks»; Journal of Biomedicine and Biotechnology (2012); 718617). Модель коллаген-индуцированного артрита использовали для исследования ревматоидного артрита, как показано в статье Brand и др. («Collagen-induced arthritis»; Nature Protocols; (2007); 2(5):1269-75).

Действительно, авторы изобретения показали, что введение соединения, имеющего формулу (I), привело in vivo к улучшению в отношении длины толстой кишки и уменьшения изменений в лимфоидных органах, таких как пейеровы бляшки, в моделях индуцированного (DSS-) колита у мышей. Авторы изобретения дополнительно показали, что введение соединения формулы (I), привело к значимому уменьшению припухлости и уменьшению признаков воспаления на основании модели коллаген-индуцированного артрита у мышей.

В соответствии c изобретением «воспаление» характеризуется болью, повышением температуры, покраснением и припухлостью, и может быть результатом инфекции, раздражения или повреждения.

Таким образом, «воспалительное заболевание» относится к группе заболеваний и/или расстройств, вызванных избыточным воспалением или нарушенной регуляцией воспаления.

Согласно изобретению «лечение и/или профилактика воспалительного заболевания» может относиться к лечению и/или профилактике воспалительного заболевания, или воспаления как такового, которое может встречаться у индивида совместно с воспалительным заболеванием.

Таким образом, лечение и/или профилактика воспалительного заболевания также включает лечение и/или профилактику воспаления как такового.

Согласно изобретению «лечение и/или профилактика» воспалительного заболевания включает лечение, уменьшение вероятности развития или отсрочку возникновения указанного воспалительного заболевания.

Согласно изобретению «индивид» может относиться к человеку или млекопитающему, отличающемуся от человека, и предпочтительно к человеку.

Неограничивающим образом воспалительные заболевания включают: воспалительное заболевание, обусловленное аутоиммунным заболеванием, воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), воспалительное заболевание суставов, воспалительное заболевание пищеварительного тракта, воспалительное заболевание кожи и другие воспалительные заболевания, связанные с эпителиальными клетками, такие как бронхит, воспаление, обусловленное раком, таким как карцинома толстой кишки, воспаление, обусловленное раздражением, и воспаление, обусловленное повреждением.

Таким образом, воспалительное заболевание может быть выбрано из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания, обусловленного аутоиммунным заболеванием, воспалительного заболевания центральной нервной системы (ЦНС), воспалительного заболевания суставов, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, воспалительного заболевания кожи и других воспалительных заболеваний, связанных с эпителиальными клетками, воспаления, обусловленного раком, воспаления, обусловленного раздражением, и воспаления, обусловленного повреждением.

В частности, воспалительное заболевание выбрано из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, остеоартрита, атеросклероза, анкилозирующего спондилита, псориаза, дерматита, синдрома Шегрена, бронхита, бронхиальной астмы и воспаления, обусловленного карциномой толстой кишки.

Более конкретно воспалительное заболевание выбрано из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, остеоартрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, синдрома Шегрена, бронхита и воспаления, обусловленного карциномой толстой кишки.

Более конкретно воспалительное заболевание выбрано из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, остеоартрита, анкилозирующего спондилита и псориаза.

Предпочтительно воспалительное заболевание согласно изобретению включает: воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, ревматоидный артрит и рассеянный склероз.

Еще более предпочтительно воспалительное заболевание согласно изобретению включает: воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит и рассеянный склероз.

Воспалительное заболевание может также включать болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, бронхиальную астму, атеросклероз и дерматит.

В качестве дерматита можно указать экзему.

В свете описанного выше изобретение относится к соединению формулы (I) для применения при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, включающего воспаление как таковое и воспаление, обусловленное воспалительным заболеванием.

Таким образом, изобретение также относится к применению соединения формулы (I) для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания, включающего воспаление как таковое и воспаление, обусловленное воспалительным заболеванием.

Согласно другому аспекту объект настоящего изобретения относится к соединению (Ie), (Id), (8), (9), (10), (11), (44), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53) или его фармацевтически приемлемым солям, отдельно или в комбинации, для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно другой из его целей изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение (Ie), (Id), (8), (9), (10), (11), (44), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53) или его фармацевтически приемлемые соли, отдельно или в комбинации.

Изобретение также относится к применению соединения формулы (I) для получения композиции, такой как лекарственное средство, для лечения и/или профилактики воспаления, включающего воспаление как таковое и воспаление, обусловленное воспалительным заболеванием.

Изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики воспалительного заболевания, включающего воспаление как таковое и воспаление, обусловленное воспалительным заболеванием, и который включает стадию введения соединения формулы (I) пациенту, нуждающемуся в этом.

миРНК-124

МикроРНК (миРНК) представляют собой малые однонитевые некодирующие РНК, который могут действовать в цитоплазме клетки, вызывая снижение экспрессии их когнатных информационных РНК-мишеней или трансляции белкового продукта мРНК. Зрелые миРНК в характерном случае имеют около 19-23 нуклеотидов в длину. Эта способность миРНК к ингибированию продуцирования их белков-мишеней приводит в результате к регуляции многих типов клеточной активности, таких как определение судьбы клетки, апоптоз, дифференцировка и онкогенез.

miR-124 впервые клонирована в мыши. Предшественник miR-124 человека (или miRN-124 или миРНК-124 или микроРНК 124) был клонирован из эмбриональных стволовых клеток. К настоящему времени идентифицировано 9 гаплотипов предшественников miR-124 (Guo и др., PLoS ONE, 2009, 4(11):e7944), из которых 3 присуцтствуют у человека, hsa-miR-124-1, hsa-miR-124-2 и hsa-miR-124-3. (Соответственно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3).

Предшественник микроРНК miR-124 представляет собой малую некодирующую молекулу РНК. Зрелые приблизительно 21-нуклеотидные микроРНК претерпевают процессинг из шпилечных последовательностей предшественника под действием дайсер фермента. Зрелые последовательности представляют собой SEQ ID NO: 4 для miR-124-3p и SEQ ID NO: 5 для miR-124-5p.

Согласно изобретению определение уровня экспрессии miR-124 включает как определение уровня экспрессии предшественника, так и зрелой miR-124.

Изобретение также относится к соединению формулы (I) для повышения экспрессии miR-124 в биологическом образце.

Таким образом, в соответствии с другой из его задач изобретение относится к способу повышения экспрессии miR-124 in vitro или ex vivo в эукариотической клетке, включающему по меньшей мере стадию, на которой:

a) обеспечивают эукариотическую клетку,

b) приводят указанную клетку в контакт с соединением-производным и, в частности, с соединением формулы (I).

Способы скрининга соединений-кандидатов

Одним из ключевых факторов успеха разработки определенного лекарственного препарата или вакцины является возможность эффективно и быстро оценивать их эффективность. Поэтому особенно важно иметь соответствующие инструменты, такие как специфичные биомаркеры, на которых может быть основана оценка эффективности лекарственного препарата или вакцины.

Неожиданно обнаружено, что в процессе воспаления miR-124 играет важную роль. Действительно, авторы изобретения показали, что соединения формулы (I) способны модулировать экспрессию miR-124. В частности, авторы изобретения показали, что соединения по изобретению могут осуществлять повышающую регуляцию (вплоть до 100-кратного повышения) экспрессии miR-124 на мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) от доноров, выделенных центрифугированием в градиенте Фиколла™.

Поскольку теперь авторы изобретения установили, что соединения формулы (I) способны модулировать экспрессию miR-124, изобретение также относится к способу скрининга in vitro или ex vivo производного хинолина и, в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Таким образом, в соответствии с его другой задачей изобретение относится к применению in vitro или ex vivo по меньшей мере одной миРНК, где по меньшей мере одна миРНК представляет собой миРНК-124 в качестве биомаркера для скрининга производного хинолина и в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Таким образом, изобретение также относится к способу скрининга in vitro или ex vivo производного хинолина и, в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, включающему по меньшей мере стадию, на которой:

a) обеспечивают эукариотическую клетку,

b) приводят указанную клетку в контакт с соединением формулы (I),

c) определяют экспрессию миРНК-124 в клетке, и

d) выбирают соединение-кандидат, предположительно эффективное при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, когда уровень экспрессии миРНК-124, определенный на стадии c), модулирован относительно эталонного значения.

Согласно изобретению «модулирование» уровня экспрессии включает как повышающую, так и понижающую регуляцию уровня экспрессии. В смысле изобретения «модулирование» уровня экспрессии miR-124 предпочтительно относится к повышающей регуляции.

В частности, изобретение относится к способу скрининга in vitro или ex vivo производного хинолина и, в частности, соединения формулы (I), предположительно эффективного при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, включающему по меньшей мере стадию, на которой:

a) обеспечивают эукариотическую клетку,

b) приводят указанную клетку в контакт с соединением формулы (I),

c) определяют экспрессию миРНК-124 в клетке, и

d) выбирают соединение-кандидат, предположительно эффективное при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания, когда уровень экспрессии миРНК-124, определенный на стадии c), повышен относительно эталонного значения.

Согласно одному воплощению изобретения присутствие или уровень экспрессии miR-124 определяют в эукариотической клетке из биологического образца и сравнивают с контрольным эталонным значением.

В частности, «биологический образец», подходящий для изобретения, может представлять собой образец биологической жидкости, такой как кровь, плазма или сыворотка крови, слюна, интерстициальная жидкость или моча; образец клеток, такой как культура клеток, линия клеток, линия стволовых клеток или образец, содержащий мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), образец биопсии ткани, такой как ткань полости рта, ткань желудочно-кишечного тракта, кожа, слизистая оболочка полости рта, либо множество образцов из клинических исследований. Образец может представлять собой неочищенный образец, либо он может быть очищен до различных степеней перед хранением, обработкой или определением.

В частности, биологический образец, подходящий для изобретения, представляет собой образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или образец, содержащий МКПК. Таким образом, биологический образец по изобретению может быть получен путем обработки из периферической цельной крови, используя общепринятые методики в данной области техники, такие как центрифугирование в градиенте плотности, и более конкретно в градиенте Фиколла™.

Образцы МКПК, в частности, обработанные в градиенте Фиколла™, склонны включать в себя лимфоциты (Т клетки, B клетки и естественные киллерные клетки (NK)), моноциты и дендритные клетки. У людей частоты этих популяций клеток варьируют между индивидами.

Таким образом, и не ограничиваясь указанными, эукариотическая клетка включает любой из типов клеток, как определено выше, такие как лимфоциты (Т клетки, B клетки и NK клетки), моноциты и дендритные клетки.

Стадию сбора биологических образцов для применений и способов по изобретению выполняют перед осуществлением изобретения и указанная стадия не представляет собой стадию применения или способа в соответствии с изобретением.

Образцы для оценки мРНК можно брать через любые желаемые интервалы. Например, образцы можно брать каждый час, два раза в день, один раз в день, один раз в неделю, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в год или тому подобное. Образец можно подвергать тестированию сразу или хранить для последующего тестирования.

Образцы можно очищать перед тестированием. В некоторых воплощениях изобретения miR-124 можно выделить из оставшегося содержимого клетки перед тестированием. Кроме того, при желании молекулы miR-124 можно отделить от остальных мРНК в образце. Например, miR-124 можно отделить от мРНК на основе различия размеров перед тестированием.

Контрольное эталонное значение, которое используют для сравнения определенного уровня экспрессии miR-124 в исследуемом биологическом образце, получают из контрольного образца.

Контрольные образцы могут быть взяты из различных источников. В некоторых воплощениях изобретения контрольные образцы берут у пациента до лечения или до присутствия заболевания (например, архивный образец крови). В других воплощениях изобретения контрольные образцы берут у группы нормальных, не страдающих заболеванием членов популяции. В другом воплощении изобретения клеточный анализ можно проводить на контрольной культуре клеток, например, не подвергнутых воздействию тестируемого соединения или подвергнутых воздействию контрольного соединения, такого как ДМСО, метилцеллюлоза (МЦ) или вода.

Согласно одному воплощению изобретения для определения или мониторинга воспалительного заболевания у пациента контрольное эталонное значение может быть получено из изолированного биологического образца, полученного от индивида или группы индивидов, для которых известно, что они не страдают таким состоянием.

Согласно другому воплощению изобретения для определения или мониторинга эффективности лечения воспалительного заболевания у пациента контрольное эталонное значение может быть получено из изолированного биологического образца, полученного от индивида или группы индивидов, для которых известно, что они не страдают таким(-и) состоянием(-ями), и/или не получающих лечение, эффективность которого необходимо определять или подвергать мониторингу. Альтернативно контрольное эталонное значение может быть получено из изолированного биологического образца, полученного у пациента, страдающего воспалительным заболеванием и получающего лечение, эффективность которого необходимо определять или подвергать мониторингу, где изолированный биологический образец берут у пациента перед проведением лечения.

Специалисту в данной области техники доступны многочисленные способы определения присутствия или уровня экспрессии биомаркера miR-124.

Например, для оценки присутствия и/или уровня экспрессии miR-124 в образце можно использовать методы анализа или матричные тест-системы нуклеиновых кислот.

Последовательность miR-124 можно использовать для получения соответствующего нуклеотида, действующего в качестве комплементарного зонда или праймера для использования в различных анализах нуклеиновых кислот для обнаружения экспрессии или присутствия биомаркера miR-124 в образце, таких как, но не ограничиваясь указанными, Нозерн-блоттинг и методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (например, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени или количественная ОТ-ПЦР). Методы, такие как кОТ-ПЦР, можно использовать для правильного количественного определения миРНК в образце.

Смысловые и антисмысловые зонды или праймеры согласно изобретению могут быть получены с использованием любого способа, известного специалистам в данной области техники, в частности, способов, описанных в Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ED., 2001, Cold Spring Harbour, N. Y.).

Способы, относящиеся к обнаружению и количественному определению РНК или ДНК, хорошо известны в данной области техники. Специалист в данной области техники может обратиться, например, к статьям Wang и др. (1989, Proc Natl Acad Sci USA, т. 86: 917-921), de Wong и др. (2005, Bio Techniques, т. 39 (1): 75-85), de Nolan и др. (2006, Nat Protoc, т. 1(3): 1559-1582) et de Klinck и др. (2008, Cancer Research, т. 68: 657-663), или также к общему обзору, опубликованному Bustin (2000, Journal of Molecular Endocrinology, т. 25: 169-193).

Изолированный нуклеиново-кислотный зонд, подходящий для определения присутствия или уровня экспрессии miR-124 представляет собой нуклеиново-кислотный зонд, способный к специфичной гибридизации с miR-124, такой как предшественник или зрелая miR-124.

Такой нуклеиново-кислотный зонд может содержать от 18 до 30 нуклеотидов, в частности, от 20 до 27, предпочтительно от 20 до 25, предпочтительно 20, 22 или 25, и более предпочтительно около 25 нуклеотидов. Как указано выше, такие нуклеиново-кислотные зонды могут быть получены в соответствии с любыми известными способами в данной области техники.

В данной области техники известны способы и формулы прогнозирования оптимальной температуры гибридизации для данного зонда и данной мишени.

Таким образом, специалист в данной области техники может легко рассчитать оптимальную температуру гибридизации на основании серии зондов на данной последовательности-мишени и конкретных условий гибридизации.

Преимущественно оптимальная температура гибридизации указанных зондов составляет от 40°C до 60°C, и более конкретно от 45°C до 55°C и предпочтительно составляет около 48°C.

Примеры буферов, подходящих для гибридизации нуклеиново-кислотного зонда по изобретению с биомаркером по изобретению, в качестве буфера гибридизации можно упомянуть буфер, содержащий 100 мМ морфолиноэтансульфоновой кислоты (МЭС), 1 M [Na+], 20 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,01% Твин-20, в качестве буфера отмывки при нежестких условиях буфер, содержащий 6X SSPE, 0,01% Твин-20, и в качестве буфера отмывки при жестких условиях — буфер, содержащий 100 мМ МЭС, 0,1 M [Na+], 0,01% Твин-20.

В одном воплощении изобретения способ обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот может представлять собой способ, основанный на флуоресцентном красителе, где концентрацию нуклеиновой кислоты оценивают путем определения интенсивности флуоресценции лигандов, таких как красители, которые связываются с указанными нуклеиновыми кислотами. Флуоресцентные красители хорошо известны в данной области техники.

Альтернативно нуклеиновую кислоту можно определять с использованием спектрофотометрии.

В другом воплощении изобретения способ обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот может представлять собой способ, основанный на гибридизации. Указанные способы, основанные на гибридизации, могут включать методы ПЦР и количественной ПЦР (кОТ-ПЦР или к-ПЦР) или методы с использованием обратной транскриптазы/полимеразы. Преимущественно стадия секвенирования может быть включена в указанный способ или объединена с ним.

Эти способы могут включать (i) стадию экстракции клеточных мРНК, (ii) стадию обратной транскрипции мРНК в ДНК с помощью обратной транскриптазы и (iii) стадию амплификации ДНК с ДНК, полученной на предшествующей стадии. Обычно с одного и того же исходного образца амплифицируют следующие нуклеиновые кислоты: (a) ДНК, полученную после стадии обратной транскрипции мРНК-мишени, и (b) ДНК или множество ДНК, полученные после обратной транскрипции мРНК, конститутивно и постоянно экспрессируемой клетками («генов домашнего хозяйства»), таких как РНК, кодируемые генами MRPL19, PUM1 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GADPH).

Амплифицированную ДНК можно определять количественно после разделения с помощью электрофореза и измерения полос ДНК. Результаты, относящиеся к мРНК-мишени(-ям), выражают в относительных единицах по сравнению с мРНК, кодируемыми генами «домашнего хозяйства». В некоторых воплощениях изобретения стадию разделения амплифицированных ДНК осуществляют после электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием полос ДНК бромистым этидием, а затем количество ДНК, содержащееся в этих полосах миграции, определяют с помощью денситометрии. В других воплощениях изобретения можно использовать микроканальное устройство, в котором амплифицированную ДНК разделяют с помощью капиллярного электрофореза, после чего количественно определяют испускаемый сигнал с помощью лазерного луча. Такое устройство может представлять собой устройство LabChip®, например, серии «GX», имеющееся в продаже от компании Caliper LifeSciences (г. Хопкинтон, штат Массачусетс, США).

Количественные результаты, полученные с помощью кОТ-ПЦР, иногда могут быть более информативными, чем качественные данные, и могут упростить стандартизацию методов анализа и контроль качества. Так, в некоторых воплощениях изобретения методы анализа, основанные на кОТ-ПЦР, могут быть пригодны для определения уровней миРНК в клеточных анализах. Способ кОТ-ПЦР может быть также пригоден при мониторинге лечения пациента. Коммерчески доступные способы на основе кОТ-ПЦР (например, матричная тест-система TaqmanR™)

Для определения экспрессии или присутствия миРНК в исследуемом образце можно использовать любую подходящую платформу метода анализа. Например, метод анализа может иметь форму экспресс-пробы с импрегнированным субстратом, мембраны, чипа, диска, тест-полоски, фильтра, микросферы, предметного стекла, многолуночного планшета или оптического волокна. Система анализа может иметь твердый носитель, к которому прикрепляют олигонуклеотид, соответствующий миРНК. Твердый носитель может включать, например, пластик, силикон, металл, смолу, стекло, мембрану, частицы, осадок, гель, полимер, лист, сферу, полисахарид, капилляр, пленку, планшет или предметное стекло. Компоненты системы анализа могут быть приготовлены и упакованы совместно в виде набора для обнаружения миРНК.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотидная матричная тест-система для тестирования активности производного хинолина или лекарственного препарата-кандидата в биологическом образце может быть приготовлена или приобретена. Матричная тест-система в характерном случае содержит твердый носитель и по меньшей мере один олигонуклеотид, приведенный в контакт с носителем, где олигонуклеотид соответствует по меньшей мере участку биомаркера miR-124. В некоторых воплощениях изобретения участок биомаркера miR-124 содержит по меньшей мере 5, 10, 15, 20 или более оснований.

Согласно одному воплощению изобретения присутствие или экспрессию miR-124 можно анализировать в комбинации с другими миРНК, также используемыми в качестве биомаркеров. В таком воплощении изобретения матричную тест-систему можно использовать для оценки экспрессии или присутствия множественных миРНК в исследуемом образце, включая миРНК-124. Как правило, способ включает следующие стадии: a) приведение исследуемого образца в контакт с матричной тест-системой, содержащей серию зондов, в условиях, достаточных для того, чтобы произошло специфичное связывание; и b) исследование матричной тест-системы для обнаружения присутствия любого обнаружимого уровня, в результате чего оценивают количество соответствующих миРНК-мишеней в исследуемом образце. Использование экспрессионной матричной тест-системы дает возможность получения профиля экспрессии миРНК для данного исследуемого образца.

Способы приготовления методов анализа или матричных тест-систем для анализа миРНК хорошо известны в данной области техники, и нет необходимости в их более подробном описании в настоящем документе.

Нуклеиново-кислотные матричные тест-системы можно использовать для обнаружения присутствия или дифференциальной экспрессии миРНК в биологических образцах. Полинуклеотидные матричные тест-системы (такие как матричные тест-системы ДНК или РНК) в характерном случае включают области полинуклеотидов обычно с различающейся последовательностью («агенты захвата»), расположенные на носителе в заданной конфигурации. Матричные тест-системы являются «адресуемыми», поскольку эти области (иногда называемые «признаками матричных тест-систем») имеют различные заданные положения («адреса») на носителе матричной тест-системы. Область (т.е. «признак» или «зона» матричной тест-системы) в конкретном заданном положении (т.е. «адресе») на матричной тест-системе определяет конкретную миРНК-мишень. Полинуклеотидные матричные тест-системы в характерном случае создают на плоских носителях либо путем нанесения заранее полученных полинуклеотидов на носитель сайт-специфическим способом, либо путем сайт-специфического синтеза полинуклеотидов in situ на носителе. Матричные тест-системы для обнаружения экспрессии миРНК могут быть созданы путем нанесения (например, контактным или струйным способом, либо фотолитографией) либо звеньев-предшественников (таких как нуклеотидные или аминокислотные мономеры), либо заранее синтезированного агента захвата. После нанесения полинуклеотидных агентов захвата на носитель в характерном случае носитель обрабатывают (например, промывают или блокируют) и хранят до использования.

Матричная тест-система для обнаружения экспрессии миРНК имеет по меньшей мере два, три, четыре или пять различных субъектных зондов. Тем не менее, в некоторых воплощениях изобретения субъектная матричная тест-система может включать серию зондов, имеющих по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 500, или по меньшей мере 1000 или более зондов, которые могут определять соответствующее число миРНК. В некоторых воплощениях изобретения субъектные матричные тест-системы могут включать зонды для определения по меньшей мере участка или всей идентифицируемой миРНК организма или могут включать ортологические зонды от множественных организмов.

Нуклеиново-кислотную матричную тест-систему можно приводить в контакт с исследуемым образцом или меченым образцом, содержащим анализируемые вещества-миРНК, в условиях, способствующих специфичному связыванию миРНК в исследуемом образце с одним или более из агентов захвата, присутствующим на матричной тест-системе, для выявления наблюдаемого паттерна связывания. Указанный паттерн связывания можно определить при детальном исследовании матричной тест-системы. Например, миРНК-мишени в исследуемом образце могут быть меченными подходящей меткой (такой как флуоресцентное соединение), а затем эту метку можно соответствующим образом наблюдать (например, путем наблюдения паттерна флуоресценции) на матричной тест-системе после экспозиции матричной тест-системы с образцом. Наблюдаемый паттерн связывания может быть показателем присутствия и/или концентрации одного или более миРНК-компонентов исследуемого образца.

Мечение миРНК можно осуществлять, используя способы, хорошо известные в данной области техники, такие как использованием ДНК лигазы, концевой трансферазы или путем мечения каркаса РНК и т.д. В некоторых воплощениях изобретения миРНК можно метить флуоресцентной меткой. Иллюстративные флуоресцентные красители включают, не ограничиваясь указанными, ксантиновые красители, флуоресцеиновые красители, родаминовые красители, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбокси-2',4,7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE или J), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA или T), 6-карбокси-X-родамин (ROX или R), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5 или G5), 6-карбоксиродамин-6G (R6G6 или G6) и родамин 110; цианиновые красители, например, красители Cy3, Cy5 и Cy7; красители Alexa, например Alexa-fluor-555; кумарин, диэтиламинокумарин, умбеллиферон; бензимидные красители, например, Hoechst 33258; фенантридиновые красители, например, техасский красный; этидиевые красители; акридиновые красители; карбазольные красители; феноксазиновые красители; порфириновые красители; полиметиновые красители, красители Бодипай, хинолиновые красители, пирен, флуоресцеинхлортриазинил, R1 10, эозин, JOE, R6G, тетраметилродамин, лиссамин, ROX, нафтофлуоресцеин и тому подобное.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотидная матричная тест-система для оценки иммуномодулирующей активности может быть приготовлена или приобретена, например, у компании Affymetrix. Матричная тест-система может содержать твердый носитель и множество олигонуклеотидов, приведенных в контакт с носителем. Олигонуклеотиды могут присутствовать в определенных, адресуемых положениях на твердом носителе, каждое из которых соответствует по меньшей мере участку последовательностей миРНК, которые могут дифференциально экспрессироваться при воздействии производного хинолина или лекарственного препарата-кандидата на клетку или пациента. Последовательности миРНК содержат по меньшей мере одну последовательность miR-124.

При использовании матричной тест-системы для оценки миРНК в характерном случае способ может включать стадии 1) получения матричной тест-системы, содержащей поверхностно-связанные субъектные зонды; 2) гибридизации популяции миРНК с поверхностно-связанными зондами в условиях, достаточных для обеспечения специфичного связывания; (3) отмывок после гибридизации для удаления нуклеиновых кислот, не связавшихся при гибридизации; и (4) обнаружения гибридизованных миРНК. Реагенты, используемые на каждой из этих стадий, и условия их использования могут изменяться в зависимости от конкретного применения.

Гибридизацию можно осуществлять в подходящих условиях гибридизации, жесткость которых можно по желанию изменять. Характерные условия достаточны для образования комплексов зонд/мишень на поверхности матричной тест-системы между комплементарными членами связывания, т.е. между поверхностно-связанными субъектными зондами и комплементарными миРНК в исследуемом образце. В некоторых воплощениях изобретения можно применять жесткие условия гибридизации. Гибридизацию в характерном случае проводят в жестких условиях гибридизации. Для гибридизации исследуемого образца с нуклеиново-кислотной матричной тест-системой используют стандартные методы гибридизации, которые хорошо известны в данной области техники (например, в условиях, достаточных для обеспечения специфичного связывания миРНК-мишеней в исследуемом образце с зондами на матричной тест-системе). Выбор подходящих условий, включая температуру, концентрацию солей, концентрацию полинуклеотида, время гибридизации, жесткость условий отмывки и тому подобное зависят от схемы эксперимента, включая источник образца, идентичность агентов захвата, ожидаемую степень комплементарности и т.д., и могут быть определены в порядке рутинного экспериментирования обычными специалистами в данной области техники. Как правило, «жесткие условия гибридизации» и «жесткие условия отмывки после гибридизации» в контексте гибридизации нуклеиновых кислот в характерном случае зависят от последовательности и различаются в различных условиях эксперимента. Гибридизацию можно проводить в течение периода от приблизительно 12 до приблизительно 24 часов. Жесткость условий отмывки может влиять на степень, с которой последовательности миРНК специфично гибридизуются с комплементарными агентами захвата. Обычным специалистам в данной области техники легко понять, что для обеспечения условий аналогичной жесткости можно использовать альтернативные, но сравнимые условия гибридизации.

В качестве иллюстрации в одном воплощении изобретения эксперименты по определению профиля экспрессии миРНК можно проводить с использованием матричной тест-системы миРНК Affymetrix Genechip 2.0, следуя протоколам, описанным в руководстве пользователя.

В одном конкретном воплощении изобретения гибридизацию можно проводить, используя набор для гибридизации, отмывки и окрашивания GeneChip® (Affymetrix, № 900720). Преимущественно указанную гибридизацию проводят, следуя протоколам изготовителя.

После процедуры гибридизации миРНК поверхностно-связанные полинуклеотиды матричной тест-системы в характерном случае отмывают, чтобы удалить несвязанные нуклеиновые кислоты. Отмывку можно проводить с использованием любого традиционного протокола отмывки, где условия отмывки в характерном случае являются жесткими, как описано выше. Например, стадию отмывки можно проводить с использованием буферов для отмывки, имеющихся в продаже от компании Affymetrix (№№ 900721 и 900722). Затем гибридизацию миРНК-мишеней с зондами обнаруживают с использованием стандартных методов считывания матричной тест-системы. Считывание полученной в результате гибридизованной матричной тест-системы можно выполнять, например, путем освещения матричной тест-системы и считывания локализации и интенсивности полученной в результате флуоресценции для каждого признака матричной тест-системы для обнаружения комплексов связывания миРНК/зонда.

Модулирование присутствия или уровня экспрессии miR-124 относительно контрольного образца, такого как контрольное эталонное значение, полученное у здорового донора, может быть показателем воспалительного заболевания. В частности, уменьшение или подавление присутствия или сниженный уровень экспрессии указанной миРНК относительно значения контрольного образца (т.е. контрольного эталонного значения, полученного у здорового донора) может быть показателем воспалительного заболевания.

Таким образом, в одном воплощении применение изобретения может включать получение или определение уровня экспрессии miR-124 в изолированном биологическом образце и сравнение указанного определенного уровня экспрессии с контрольным эталонным значением. Наблюдение модулирования указанного определенного уровня относительно контрольного эталонного значения может быть показателем воспалительного заболевания или лечения данного воспалительного заболевания.

Повышенный или претерпевающий повышающую регуляцию уровень экспрессии miR-124 в присутствии лекарственного препарата-кандидата относительно контрольного эталонного значения (т.е. без лечения лекарственным препаратом-кандидатом, таким как производное хинолина) является показателем предполагаемой эффективности лекарственного препарата-кандидата при лечении и/или профилактике воспалительного заболевания.

Соответственно, при «увеличении количества» или «повышающей регуляции» miR-124 из исследуемого образца в биологическом образце по сравнению с контрольным эталонным значением указанное увеличение может представлять собой увеличение приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000% или более по сравнению с контрольным эталонным значением (т.е. без лечения производным хинолина).

В частности, топределенный уровень экспрессии miR-124 может быть увеличен по меньшей мере в два раза, предпочтительно по меньшей мере в четыре раза, предпочтительно по меньшей мере в шесть раз, предпочтительно по меньшей мере в восемь раз, предпочтительно по меньшей мере в десять раз относительно указанного контрольного эталонного значения.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения определенный уровень экспрессии miR-124 может быть увеличен по меньшей мере в 100 раз относительно указанного контрольного эталонного значения.

Согласно одному воплощению изобретения применение способа согласно изобретению можно осуществлять на практике для оптимизации схемы дозирования пациента. Пациенты могут иметь различную реакцию на данное производное хинолина, в частности, соединение формулы (I), в зависимости от таких факторов, как возраст, состояние здоровья, генетический фон, наличие других осложнений, прогрессирование заболевания и совместное введение других лекарственных препаратов. Применение биомаркера miR-124 может быть пригодно для оценки и оптимизации схемы дозирования, такой как количество дозы и/или режим дозирования, производного хинолина у пациента. В этом отношении биомаркер на основе miR-124 можно также использовать для прослеживания и регулирования эффективности лечения индивидуального пациента со временем. Биомаркер можно использовать для сбора информации, необходимой для выполнения регулирования лечения пациента, по необходимости увеличивая или уменьшая дозу агента. Например, пациента, получающего производное хинолина, можно подвергать тестированию с помощью биомаркера на основе miR-124, чтобы наблюдать, становится ли дозировка эффективной, или необходимо вводить более интенсивный план лечения. Таким образом, количество вводимого лекарственного препарата, периодизацию введения, частоту введения, продолжительность введения можно регулировать в зависимости от определения биомаркера miR-124.

Биомаркер miR-124 можно также использовать для прослеживания соблюдения пациентом режима и схемы лечения в процессе индивидуальных схем лечения или во время клинических исследований. За этим можно следить через установленные промежутки времени, чтобы гарантировать, что пациенты, включенные в исследование, принимают препараты согласно инструкции. Кроме того, пациента, получающего производное хинолина, можно подвергать тестированию с помощью биомаркера miR-124, чтобы определить, соблюдает ли пациент режим дозирования согласно плану лечения. Повышенный уровень экспрессии биомаркера по сравнению с неподвергавшимся воздействию контрольным образцом является показателем соблюдения протокола.

Таким образом, без отклонения от объема изобретения контрольное эталонное значение может быть получено из эукариотической клетки, выделенной из: биологического образца от здорового донора и/или донора, ранее неподвергавшегося лечению данным лекарственным препаратом-кандидатом, таким как данное производное хинолина.

Биомаркер по изобретению можно применять на практике для оценки и наблюдения эффективности производных хинолина, в частности, соединений формулы (I). Соответственно, присутствие или уровень экспрессии miR-124 можно определять в изолированном биологическом образце, полученном от пациента, ранее подвергавшегося лечению производным хинолина, таким как соединение формулы (I).

Затем определенное присутствие или уровень экспрессии miR-124 в изолированном биологическом образце можно сравнивать с контрольным эталонным значением.

В случае наблюдения повышения определенного уровня экспрессии miR-124 относительно контрольного эталонного значения данное определение является показателем активности производных хинолина и, в частности, соединений формулы (I).

В другом воплощении изобретения в случае наблюдения повышения определенного уровня экспрессии miR-124 относительно контрольного эталонного значения данное определение может быть показателем наличия у пациента эффекта от лечения данными производными хинолина и, в частности, указанными соединениями формулы (I).

В другом воплощении изобретения в случае наблюдения повышения определенного уровня относительно контрольного эталонного значения данное определение может быть показателем эффективности лечения данными производными хинолина и, в частности, указанными соединениями формулы (I).

В другом воплощении изобретения в случае наблюдения повышения определенного уровня экспрессии miR-124 относительно контрольного эталонного значения данное определение является показателем терапевтической эффективности данных производных хинолина и, в частности, данных соединений формулы (I), в качестве терапевтического средства для профилактики и/или лечения воспалительного заболевания.

В другом воплощении изобретения в случае наблюдения повышения определенного уровня экспрессии miR-124 относительно контрольного эталонного значения данное определение является показателем терапевтической эффективности конкретного режима дозирования данных производных хинолина и, в частности, данных соединений формулы (I), в качестве терапевтического средства для профилактики и/или лечения воспалительного заболевания в случае определения контрольного эталонного значения из биологического образца, полученного от пациента, получающего лечение в соответствии с другим режимом дозирования.

Химические структуры и спектроскопические данные некоторых соединений формулы (I) по изобретению проиллюстрированы соответственно в приведенной ниже табл. 1 и в табл. 2 (см. примеры).

Таблица 1

Формула (Ia)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
51
Формула (Ib)
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
52
53
Формула (Ic)
45
Формула (Id)
46
47
Формула (Ie)
48
49
50

Примеры, приведенные в настоящем документе, подразумевают исключительно как иллюстративные, и специалисты в данной области техники распознают или смогут определить с использованием не более чем рутинных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретных соединений, материалов и методик. Все такие эквиваленты рассматривают как находящиеся в пределах объема изобретения, и они охвачены прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамин; соединение (9)

орто-Хлоранилин (5,3 мл, 50 ммоль, 1 экв.) помещали в пиридин (8 мл). Затем добавляли диэтилмалонат (11,4 мл, 75 ммоль, 1,5 экв.), и реакционную смесь перемешивали при 130°C в течение 14 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученный в результате остаток разбавляли дихлорметаном. Затем органическую фазу промывали насыщенным водным раствором Na₂CO₃, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением этил-2-[(2-хлорфенил)карбамоил]ацетата (2,7 г, 22%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,74 (br s, 1H), 8,38 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,40 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,28 (td, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,07 (td, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 4,30 (q, J = 7,1 Гц, 2H), 3,54 (s, 2H), 1,34 (t, J = 7,1 Гц, 3H).

Этил-2-[(2-хлорфенил)карбамоил]ацетат (2,4 г, 9,93 ммоль, 1 экв.) помещали в смесь ТГФ (9,9 мл)/вода (3,8 мл). Затем добавляли гидроксид натрия (477 мг, 11,92 ммоль, 1,2 экв.), и реакционную смесь перемешивали в течение 14 часов при комнатной температуре. Затем добавляли концентрированную соляную кислоту до достижения pH 2, и полученный в результате раствор экстрагировали этилацетатом. Затем органическую фазу высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 2-[(2-хлорфенил)карбамоил]уксусной кислоты (2 г, 94%).

¹H ЯМР (300 МГц, MeOD) δ 7,98 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,45 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,30 (td, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,16 (td, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 3,54 (s, 2H).

Реакционную смесь 2-[(2-хлорфенил)карбамоил]уксусной кислоты (3,7 г, 17,32 ммоль, 1 экв.) в полифосфорной кислоте (17 г, 173,2 ммоль, 10 экв.) перемешивали при 130°C в течение 14 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем медленно добавляли 2М водный раствор гидроксида натрия. Полученный в результате осадок фильтровали, промывали водой и высушивали при пониженном давлении в эксикаторе с получением 8-хлорхинолин-2,4-диола (3 г, 89%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 11,66 (br s, 1H), 10,40 (br s, 1H), 7,78 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,66 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,17 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 5,81 (s, 1H).

Масс-спектр (МС) (ионизация электрораспылением (ИЭР)) [M-H]^- = 194,1

Реакционную смесь 8-хлорхинолин-2,4-диола (1,5 г, 7,67 ммоль, 1 экв.) в POCl₃ (7,1 мл, 76,7 ммоль, 10 экв.) перемешивали при 100°C в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем медленно добавляли воду. Полученный в результате осадок фильтровали, промывали водой и высушивали при пониженном давлении в эксикаторе с получением 2,4,8-трихлорхлорхинолина (1,6 г, 90%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8,21 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 8,14 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,78 (t, J = 8,4 Гц, 1H).

Реакционную смесь 2,4,8-трихлорхинолина (1 г, 4,30 ммоль, 1 экв.), 2-амино-4-трифторметилпиридина (768 мг, 4,73 ммоль, 1,1 экв.), Pd(OAc)₂ (19 мг, 0,09 ммоль, 2 моль%), КсантФос (50 мг, 0,09 ммоль, 2 моль%) и Cs₂CO₃ (3,9 г, 12,04 ммоль, 2,8 экв.) в t-BuOH (17,2 мл) нагревали при 90°C в течение 2 дней. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученный в результате остаток разбавляли этилацетатом. Затем органическую фазу промывали водой, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением (4,8-дихлорхинолин-2-ил)-(4-трифторметилпиридин-2-ил)-амина (13) (588 мг, 38%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,40 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,4 Гц, 1H), 8,06 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,86 (dd, J = 8,1, 1,5 Гц, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,40 (t, J = 8,1 Гц, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,22 (d, J = 5,4 Гц, 1H).

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 358,1

Реакционную смесь (4,8-дихлорхинолин-2-ил)-(4-трифторметилпиридин-2-ил)-амина (200 мг, 0,54 ммоль, 1 экв.), 3-(пиперидин-1-ил)пропан-1-амина (94 мкл, 0,59 ммоль, 1,1 экв.), CuI (10 мг, 0,05 ммоль, 0,1 экв.), L-пролин (9 мг, 0,11 ммоль, 0,2 экв.), карбоната калия (148 мг, 1,01 ммоль, 2 экв.) в ДМСО (1,4 мл) перемешивали при 90°C в течение 24 часов в инертной атмосфере аргона. Затем реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. После декантации водную фазу дополнительно экстрагировали дихлорметаном. Органические фазы собирали, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 8-хлор-N⁴-(3-пиперидин-1-ил-пропил)-N²-(4-трифторметилпиридин-2-ил)-хинолин-2,4-диамина (9) (48 мг, 7%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,55 (s, 1H), 8,40 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,77 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,72 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,18 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,10 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 5,88 (s, 1H), 3,41 – 3,31 (m, 2H), 2,59 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,57 – 2,43 (m, 4H), 2,01 – 1,92 (m, 2H), 1,79 – 1,70 (m, 4H), 1,65 – 1,54 (m, 2H).

¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 154,9, 154,0, 152,3, 148,5, 144,2, 132,2, 129,7, 121,7, 119,7, 118,4, 112,4, 109,8, 88,0, 59,6, 55,1, 44,9, 26,1, 24,4, 23,4.

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 464,2

Пример 2: 2-N-(8-хлорхинолин-2-ил)-5-N-(3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил)-4-(трифторметил)пиридин-2,5-диамин; соединение (22)

Реакционную смесь 2,8-дихлорхинолина (198 мг, 1,0 ммоль, 1 экв.), 5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-амина (241 мг, 1,0 ммоль, 1 экв.), Pd(OAc)₂ (4,5 мг, 0,02 ммоль, 2 моль%), КсантФос (11,6 мг, 0,02 ммоль, 2 моль%) и Cs₂CO₃ (782 мг, 2,4 ммоль, 2,4 экв.) в t-BuOH (4 мл) нагревали в микроволновом реакторе при 120°C в течение 70 минут. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученный в результате остаток разбавляли этилацетатом. Затем органическую фазу промывали водой, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением N-[5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-ил]-8-хлорхинолин-2-амина (21) (300 мг, 75%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,71 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,81 (m, 2H), 7,65 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,33 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,00 (d, J = 9,0 Гц, 1H).

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 403,7

Реакционную смесь N-[5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-ил]-8-хлорхинолин-2-амина (101 мг, 0,250 ммоль, 1 экв.), 3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропан-1-амина (64 мкл, 0,375 ммоль, 1,5 экв.), Pd₂(dba)₃ (28 мг, 0,030 ммоль, 12 моль%), КсантФос (43,4 мг, 0,075 ммоль, 30 моль%) и трет-бутоксида натрия (72 мг, 0,75 ммоль, 3 экв.) в смеси диоксан (1 мл)/ДМФА (0,1 мл) нагревали в микроволновом реакторе при 120°C в течение 70 минут. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученный в результате остаток разбавляли этилацетатом. Затем органическую фазу промывали водой, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 2-N-(8-хлорхинолин-2-ил)-5-N-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил]-4-(трифторметил)пиридин-2,5-диамина (22) (52 мг, 43%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,39 (s, 1H), 7,97 – 7,86 (m, 2H), 7,82 (br s, 1H), 7,73 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,56 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,23 (t, J = 7,5 Гц, 1H), 6,94 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 3,34 – 3,22 (m, 2H), 2,80 – 2,44 (m, 10H), 2,37 (s, 3H), 1,87 (t, J = 6,0 Гц, 2H).

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 479,0

Пример 3: 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амин; соединение (28)

8-хлор-N-[4-(трифторметокси)фенил]хинолин-2-амин, т.е. соединение (24), синтезировали, как описано в WO2010/143169, в примере 5.

Реакционную смесь 8-хлор-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина (24) (340 мг, 1,0 ммоль, 1 экв.), трет-бутоксида калия (124 мг, 1,1 ммоль, 1,1 экв.) и йодметана (69 мкл, 1,1 ммоль, 1,1 экв.) в ДМФА (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. Органические фазы собирали, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина (28) (247 мг, 70%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 7,69 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,49 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,36 – 7,25 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,75 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 3,69 (s, 3H).

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 353,1

Пример 4: 8-хлор-N-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амин; соединение (30)

8-хлор-N-[4-(трифторметокси)фенил]хинолин-2-амин, т.е. соединение (24), синтезировали, как описано в WO2010/143169, в примере 5.

Реакционную смесь 8-хлор-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина (24) (500 мг, 1,47 ммоль, 1 экв.) и NaH (177 мг, 4,43 ммоль, 3 экв.) в безводном ДМФА (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь 1-(3-хлорпропил)пиперидина гидрохлорида (292 мг, 1,47 ммоль, 1 экв.), KI (245 мг, 1,47 ммоль, 1 экв.) и Et₃N (205 мкл, 1,47 ммоль, 1 экв.) в безводном ДМФА (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут в инертной атмосфере аргона. Затем к пиперидиновой цепи добавляли активный хинолин, и полученную в результате реакционную смесь перемешивали при 90°C в течение 4 часов. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученный в результате остаток разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным водным соляным раствором, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 8-хлор-N-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амин (30) (472 мг, 69%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 7,73 – 7,63 (m, 2H), 7,48 (d, J = 7,9 Гц, 1H), 7,39 – 7,26 (m, 4H), 7,13 (t, J = 7,9 Гц, 1H), 6,67 (d, J = 9,1 Гц, 1H), 4,26 – 4,14 (m, 2H), 2,52 – 2,33 (m, 6H), 2,11 – 1,97 (m, 2H), 1,64 – 1,52 (m, 4H), 1,45 (s, 2H).

¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 156,5, 147,3, 144,1, 143,5, 137,1, 130,8, 129,7, 129,1, 126,4, 124,7, 122,7, 122,4, 118,9 (t, J = 222 Гц), 112,5, 56,9, 54,5, 49,6, 25,6, 24,6, 24,3.

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 464,4

Пример 5: 8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин; соединение (46)

Реакционную смесь 2,8-дихлорхинолина (79 мг, 0,4 ммоль, 1 экв.), 2-гидрокси-4-(трифторметил)пиридина (65 мг, 0,4 ммоль, 1 экв.), CuI (76 мг, 0,4 ммоль, 1 экв.) и Cs₂CO₃ (391 мг, 1,2 ммоль, 3 экв.) в ДМФА (6 мл) нагревали в микроволновом реакторе при 150°C в течение 50 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли воду. Нерастворенные твердые вещества отфильтровывали через целит, и полученный в результате фильтрат дважды экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали водой и насыщенным водным соляным раствором, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 8-хлор-2-{[4-(трифторметил)пиридин-2-ил]окси}хинолина (46) (68 мг, 52%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 8,40 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 8,34 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 8,18 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,90 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 7,85 (d, J = 7,9 Гц, 1H), 7,56 (t, J = 7,9 Гц, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Гц, 1H).

¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 161,6, 151,2, 143,4, 142,3, 138,7, 138,2, 137,4, 133,4, 130,6, 129,1, 127,6, 126,7, 120,2, 119,7, 102,3.

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 325,1

Пример 6: 8-хлор-2-((4-(трифторметокси)фенокси)хинолин; соединение (48)

Реакционную смесь 2,8-дихлорхинолина (2х79 мг, 2х0,4 ммоль, 1 экв.), 4-(трифторметокси)фенола (2х52 мкл, 2х0,4 ммоль, 1 экв.), CuI (2х76 мг, 2х0,4 ммоль, 1 экв.) и Cs₂CO₃ (2х391 мг, 2х1,2 ммоль, 3 экв.) в ДМФА (2х6 мл) нагревали в микроволновом реакторе при 150°C в течение 50 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли воду. Нерастворенные твердые вещества отфильтровывали через целит, и полученный в результате фильтрат дважды экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали водой и насыщенным водным соляным раствором, высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 8-хлор-2-[4-(трифторметокси)фенокси]хинолина 48 (212 мг, 78%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 8,12 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,73 (d, J = 8,1 Гц, 1H), 7,66 (d, J = 8,1 Гц, 1H), 7,46 (d, J = 9,1 Гц, 2H), 7,38 – 7,22 (m, 3H), 7,12 (d, J = 8,8 Гц, 1H).

¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 161,5, 151,9, 145,9, 142,7, 140,5, 132,0, 130,3, 127,0, 126,4, 125,1, 122,8, 122,2, 119,0 (t, J = 255 Гц), 113,6.

МС (ИЭР) [M+H]⁺ = 340,1

Структуры других соединений по изобретению подтверждены спектром ЯМР.

Таблица 2

Пр.	Характеристики
8	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,57 (s, 1H), 8,45 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 8,43 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 7,90 (br s, 1H), 7,66 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,18 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 6,99 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 6,68 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,17 (t, J = 6,3 Гц, 2H), 2,56 (t, J = 7,8 Гц, 2H), 2,50 – 2,39 (m, 4H), 2,17 – 2,04 (m, 2H), 1,66 – 1,59 (m, 4H), 1,51 – 1,43 (m, 2H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 154,1, 153,8, 152,5, 148,7, 143,8, 133,5, 129,8, 122,9, 117,5, 113,2, 112,5, 109,9, 103,9, 67,2, 56,2, 54,8, 26,9, 26,1, 24,5. МС (ИЭР) [M+H]+ = 465,4
9	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,55 (s, 1H), 8,40 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,77 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,72 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,18 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,10 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 5,88 (s, 1H), 3,41 – 3,31 (m, 2H), 2,59 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,57 – 2,43 (m, 4H), 2,01 – 1,92 (m, 2H), 1,79 – 1,70 (m, 4H), 1,65 – 1,54 (m, 2H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 154,9, 154,0, 152,3, 148,5, 144,2, 132,2, 129,7, 121,7, 119,7, 118,4, 112,4, 109,8, 88,0, 59,6, 55,1, 44,9, 26,1, 24,4, 23,4. МС (ИЭР) [M+H]+ = 464,2
10	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,53 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,04 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,76 (dd, J = 7,5, 1,2 Гц, 1H), 7,64 (dd, J = 7,5, 1,2 Гц, 1H), 7,43 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,30 (t, J = 7,5 Гц, 1H), 7,15 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 3,87 (s, 3H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 157,6, 155,8, 149,0, 143,4, 138,0, 131,9, 130,0, 126,3, 126,1, 124,4, 115,0, 113,1, 113,0, 111,6, 111,5, 36,3. МС (ИЭР) [M+H]+ = 338,1
11	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,50 (s, 1H), 8,41 (br s, 1H), 8,14 (br s, 1H), 7,72 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,53 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,21 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,11 (s, 1H), 5,96 (s, 1H), 5,88 (s, 1H), 3,77 (s, 4H), 3,25 (s, 2H), 2,77 (s, 2H), 2,54 (s, 4H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 154,8, 153,7, 151,1, 148,5, 144,2, 132,4, 129,9, 122,4, 118,2, 118,0, 112,5, 109,9, 89,2, 67,2, 56,0, 53,2, 38,9. МС (ИЭР) [M+H]+ = 452,1
13	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,40 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,4 Гц, 1H), 8,06 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,86 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,40 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,22 (d, J = 5,4 Гц, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 358,1
14	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,51 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,99 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,75 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,63 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,39 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,29 (t, J = 7,5 Гц, 1H), 7,14 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 4,48 (t, J = 7,2 Гц, 2H), 3,77 – 3,59 (m, 4H), 2,57 – 2,33 (m, 6H), 2,13 – 1,97 (m, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 451,2
15	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,47 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,89 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,49 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 7,38 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,08 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 6,99 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 4,45 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 4,21 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 3,83 – 3,64 (m, 8H), 2,87 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,70 – 2,56 (m, 4H), 2,56 – 2,36 (m, 6H), 2,12 – 1,96 (t, J = 6,9 Гц, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 580,4
16	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,50 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 8,37 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,61 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,34 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,13 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 6,65 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,47 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 4,26 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 3,78 – 3,64 (m, 8H), 2,92 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,69 – 2,56 (m, 4H), 2,55 – 2,38 (m, 6H), 2,05 (t, J = 6,9 Гц, 2H), МС (ИЭР) [M+H]+ = 580,2
17	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,47 (s, 1H), 8,41 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 8,24 (br s, 1H), 7,88 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,49 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 7,14 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 6,99 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,94 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 4,17 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 2,87 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 2,75 – 2,61 (m, 4H), 2,57 – 2,45 (m, 4H), 2,31 (s, 3H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 233,6
18	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,48 (s, 1H), 8,42 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,94 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,78 (br s, 1H), 7,53 (d, J = 2,4 Гц, 1H), 7,16 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 7,06 – 6,98 (m, 2H), 4,20 (t, J = 6,0 Гц, 2H), 2,84 (t, J = 6,0 Гц, 2H), 2,61 – 2,50 (m, 4H), 1,69 – 1,59 (m, 4H), 1,52 – 1,42 (m, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 450,9
19	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,48 (s, 1H), 8,41 (d, J = 4,5 Гц, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,87 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,14 (d, J = 4,5 Гц, 1H), 7,01 – 6,89 (m, 2H), 4,08 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 2,66 – 2,41 (m, 6H), 2,13 – 1,99 (m, 2H), 1,72 – 1,59 (m, 4H), 1,55 – 1,41 (m, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 465,0
20	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 8,24 (d, J = 4,8 Гц, 1H), 8,19 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,79 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,71 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,34 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,08 (t, J = 4,8 Гц, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 341,9
21	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,71 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,81 (m, 2H), 7,65 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,33 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,00 (d, J = 9,0 Гц, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 403,7
22	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 9,39 (s, 1H), 7,97 – 7,86 (m, 2H), 7,82 (br s, 1H), 7,73 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,56 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 7,23 (t, J = 7,5 Гц, 1H), 6,94 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 3,34 – 3,22 (m, 2H), 2,80 – 2,44 (m, 10H), 2,37 (s, 3H), 1,87 (t, J = 6,0 Гц, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 479,0
28	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,69 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,49 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,36 – 7,25 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,75 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 3,69 (s, 3H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 353,1
29	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,26 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,93 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,54 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,21 (d, J = 9,0 Гц, 3H), 6,83 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 6,53 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,06 (t, J = 6,0 Гц, 2H), 2,56 (t, J = 7,5 Гц, 2H), 2,52 – 2,40 (m, 4H), 2,14 – 2,01 (m, 2H), 1,69 – 1,58 (m, 4H), 1,50 – 1,41 (m, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 480,3
30	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,73 – 7,63 (m, 2H), 7,48 (d, J = 7,9 Гц, 1H), 7,39 – 7,26 (m, 4H), 7,13 (t, J = 7,9 Гц, 1H), 6,67 (d, J = 9,1 Гц, 1H), 4,26 – 4,14 (m, 2H), 2,52 – 2,33 (m, 6H), 2,11 – 1,97 (m, 2H), 1,64 – 1,52 (m, 4H), 1,45 (s, 2H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 156,5, 147,3, 144,1, 143,5, 137,1, 130,8, 129,7, 129,1, 126,4, 124,7, 122,7, 122,4, 121,8, 118,9, 112,5, 56,9, 54,5, 49,6, 25,6, 24,6, 24,3. МС (ИЭР) [M+H]+ = 464,4
31	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,74 – 7,65 (m, 2H), 7,50 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,42 – 7,28 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,63 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 4,34 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 3,66 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,78 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,59 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 452,3
32	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,70 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,69 (dd, J = 7,8, 1,2 Гц, 1H), 7,50 (dd, J = 7,8, 1,2 Гц, 1H), 7,38 – 7,26 (m, 4H), 7,15 (t, J = 7,8 Гц,1H), 6,66 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 4,35 (t, J = 7,5 Гц, 2H), 2,91 (t, J = 7,5 Гц, 2H), 2,70 – 2,60 (m, 4H), 1,83 – 1,74 (m, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 436,1
33	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,66 (d, J = 9,3 Гц, 1H), 7,64 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,46 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,29 – 7,22 (m, 4H), 7,10 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,59 (d, J = 9,3 Гц, 1H), 4,16 (t, J = 7,5 Гц, 2H), 3,66 (t, J = 4,8 Гц, 4H), 2,46 – 2,36 (m, 6H), 1,78 (dt, J = 15,0, 7,2 Гц, 2H), 1,59 (dt, J = 15,0, 7,2 Гц, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 480,1
34	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,80 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,75 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,66 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,58 (br s, 1H), 7,19 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,11 (t, J = 8,4 Гц, 1H), 5,83 (s, 1H), 3,24 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,61 – 2,46 (m, 6H), 1,91 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 1,78 – 1,68 (m, 4H), 1,62 – 1,52 (m, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 479,3
35	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,00 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,87 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,80 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,32 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,27 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,05 (s, 1H), 6,84 (br s, 1H).
36	1H ЯМР (300 МГц, MeOD) δ 8,37 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 8,26 (d, J = 9,3 Гц, 2H), 7,60 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,22 (d, J = 9,3 Гц, 2H), 7,00 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 6,75 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,29 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 3,73 (t, J = 4,8 Гц, 4H), 2,94 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,66 (t, J = 4,8 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 468,1
37	1H ЯМР (300 МГц, MeOD) δ 7,92 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,71 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,63 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,24 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,05 (s, 1H), 6,83 – 6,79 (m, 1H), 6,64 – 6,58 (m, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 388,0
38	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,87 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,70 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,37 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,32 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,17 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,69 (s, 1H), 4,29 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 3,63 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,73 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 2,55 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 486,1
39	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,87 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,78 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,44 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 7,21 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 6,95 (br s, 1H), 6,91 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 6,84 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 4,16 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 3,76 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,84 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,61 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 468,1
40	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,67 – 7,59 (m, 2H), 7,39 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,26 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,07 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,79 (s, 1H), 4,34 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 3,82 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 3,69 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 3,05 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,78 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 2,66 – 2,60 (m, 4H), 2,57 – 2,48 (m, 6H), 1,82 (t, J = 5,4 Гц, 2H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 594,4
41	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,95 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 7,81 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,70 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,66 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,61 – 7,56 (m, 1H), 7,54 (dd, J = 7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,19 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 6,49 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 4,32 – 4,21 (m, 2H), 3,60 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,81 (t, J = 6,3 Гц, 2H), 2,49 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 497,1
42	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,91 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,73 (dd, J = 7,8, 1,2 Гц, 1H), 7,58 (dd, J = 7,8, 1,2 Гц, 1H), 7,52 (br s, 1H), 7,22 (t, J = 7,8 Гц, 1H), 7,05 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,82 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,73 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 3,54 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 3,21 (t, J = 6,0 Гц, 2H), 2,60 (t, J = 6,0 Гц, 2H), 2,40 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 467,2
43	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,11 (d, J = 9,3 Гц, 1H), 7,56 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,36 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,30 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 6,59 (d, J = 9,3 Гц, 1H), 6,53 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,34 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 4,22 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 3,72 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 3,65 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,88 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 2,76 (t, J = 6,9 Гц, 2H), 2,63 – 2,55 (m, 8H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 581,2
44	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,25 (d, J = 9,3 Гц, 1H), 7,53 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,24 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,64 (d, J = 9,3 Гц, 2H), 6,59 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,52 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,21 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 3,72 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,88 (t, J = 5,4 Гц, 2H), 2,61 (t, J = 4,5 Гц, 4H).
46	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,40 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 8,34 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 8,18 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,90 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 7,85 (d, J = 7,9 Гц, 1H), 7,56 (t, J = 7,9 Гц, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Гц, 1H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 161,6, 151,2, 143,4, 142,3, 138,7, 138,2, 137,4, 133,4, 130,6, 129,1, 127,6, 126,7, 120,2, 119,7, 102,3. МС (ИЭР) [M+H]+ = 325,1
47	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,33 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 8,18 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 8,08 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,60 (d, J = 2,4 Гц, 1H), 7,10 (d, J = 2,4 Гц, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,50 (dd, J = 7,5, 1,8 Гц, 1H), 4,25 (t, J = 5,5 Гц, 2H), 3,86 – 3,69 (m, 4H), 2,89 (t, J = 5,5 Гц, 2H), 2,73 – 2,54 (m, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 454,2
48	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,12 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,73 (d, J = 8,1 Гц, 1H), 7,66 (d, J = 8,1 Гц, 1H), 7,46 (d, J = 9,1 Гц, 2H), 7,38 – 7,22 (m, 3H), 7,12 (d, J = 8,8 Гц, 1H). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 161,5, 151,9, 145,9, 142,7, 140,5, 132,0, 130,3, 127,0, 126,4, 125,1, 122,8, 122,2, 119,0 (t, J = 255 Гц), 113,6. МС (ИЭР) [M+H]+ = 340,1
49	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,03 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,48 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 7,44 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,27 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,10 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,02 (d, J = 2,7 Гц, 1H), 4,19 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 3,75 (t, J = 4,5 Гц, 4H), 2,85 (t, J = 5,7 Гц, 2H), 2,61 (t, J = 4,5 Гц, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 469,1
50	1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,52 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 7,59 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 7,45 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,27 (d, J = 9,0 Гц, 2H), 7,07 (d, J = 8,7 Гц, 1H), 6,67 (d, J = 8,4 Гц, 1H), 4,29 – 4,20 (m, 2H), 3,79 – 3,70 (m, 4H), 2,98 – 2,88 (m, 2H), 2,71 – 2,56 (m, 4H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 469,1
51	1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 10,84 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 8,58 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 8,31 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,49 (d, J = 8,8 Гц, 1H), 7,36 (d, J = 5,1 Гц, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 420,1
52	1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 9,23 (d, J = 9,1 Гц, 1H), 8,21 (d, J = 9,1 Гц, 1H), 7,79 (t, J = 7,5 Гц, 2H), 7,46 – 7,18 (m, 5H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 435,0
53	1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 9,92 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,7 Гц, 2H), 8,15 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,7 Гц, 2H), 7,17 (d, J = 9,0 Гц, 1H). МС (ИЭР) [M+H]+ = 435,0

Фармакологические данные

Соединения по изобретению подвергали фармакологическим тестам, которые показали их релевантность в качестве активных веществ при лечении и, в частности, для профилактики воспалительного заболевания.

Пример 7: Модулирование экспрессии miR-124 производными хинолина в модели воспалительного заболевания кишечника in vivo

A. Материал и способы

Исследования ex vivo

Экстракция мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) с использованием градиента Фиколла™

Для указанной цели МКПК здоровых доноров выделили центрифугированием в градиенте Фиколла™ в соответствии со стандартными протоколами.

Кратко, 60-70 мл лейкоцитарной пленки наливают в колбу емкостью 175 см², и объем доводят до 300 мл, используя фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), для получения разбавления лейкоцитарной пленки приблизительно в 5 раз. Затем 38 мл разбавленной лейкоцитарной пленки добавляют в пробирки Falcon™ емкостью 50 мл, содержащие 12 мл Фиколла™ (Histopack-1077), при температуре окружающей среды. Препарат центрифугируют в течение 30 минут при факторе разделения 515 при температуре окружающей среды. Лимфоцитарное кольцо выделяют из пробирки Falcon™ с помощью пипетки для переноса (Pastette^®), а затем промывают ФСБ с помощью центрифугирования в течение 10 минут при факторе разделения 290 и при температуре окружающей среды до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.

Затем клетки ресуспендируют при 37°C до плотности 1,5x10⁶ клеток/мл в питательной среде RPMI Glutamax (Life Technologies, № 61870-010) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) (Thermo Fischer, № SV30160.03) и без активации. Клетки инкубируют в течение 48 часов при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Обработка клеток молекулами, подвергнутыми скринингу

Для скрининга используют шестилуночные планшеты. Молекулы, подвергнутые скринингу, добавляют внутрь каждой лунки, содержащей 3,10⁶ клеток/4 мл RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 40 ед/мл интерлейкина-2 (ИЛ-2) (Peprotech, № 200-02). В одну лунку добавляют 100% ДМСО (4 мкл) и тестируют в качестве отрицательного контроля.

Каждое тестируемое условие ставят, как описано в данном документе ниже, и конечный соответствующий объем доводят в соответствии с лункой:

1) производные хинолина в 100% ДМСО – (5 мкМ и конечный объем 4 мкл), 

2) антиретровирусные лекарственные препараты: Маравирок, Эфавиренз, Дарунавир, AZT (10 мкм для всех - конечный объем 4 мкл).

Лунки инкубируют в течение трех дней при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Среду заменяют (день 3) в соответствии со стандартными протоколами. Кратко, планшеты центрифугируют при факторе разделения 290 в течение 5 минут и отбирают 3 мл супернатанта. Затем добавляют 3 мл среды RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 40 ед/мл ИЛ-2 с 3 мкл исходного раствора молекулы, подвергаемой скринингу, в концентрации 5 мМ в 100% ДМСО или 3 мкл 100% ДМСО в качестве отрицательного контроля.

Экстракция миРНК (день 6)

Клетки получают в пробирках Falcon™ емкостью 15 мл, центрифугируют при факторе разделения 290 в течение 5 минут, а затем промывают в 10 мл ФСБ и дополнительно центрифугируют при факторе разделения 290 в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендируют в 1 мл ФСБ и считают.

Получают 6x10⁶ клеток и центрифугируют при факторе разделения 290 в течение 5 минут. Осадок клеток подвергают лизису в 300 мкл буфера для лизиса ML из набора для экстракции миРНК Macherey Nagel Nucleospin® (Macherey Nagel № 740971), а затем хранят при -20°C.

Для каждого исследуемого образца добавляют 5 мкл 2x10⁸ копий/мкл контрольного РНК-транскрипта для калибровки (Ce_miR-39 от компании QIAGEN^© – № 219610 SEQ ID N°6). Экстракцию миРНК осуществляют с использованием протокола к набору для экстракции миРНК Macherey Nagel Nucleospin^®, используя объем элюирования для РНК 50 мкл и миРНК 30 мкл, а затем хранят при -20°C.

Обратная транскрипция миРНК (день 6)

Стадию обратной транскрипции выполняют для 12 мкл миРНК с помощью набора для обратной транскрипции miScript RT II (ОТ) от компании QIAGEN^©, используя буфер miScript HiSpec, а затем хранят при -20°C.

Количественная ПЦР миРНК (день 6)

Стадию количественной ПЦР осуществляют с помощью набора для ПЦР QIAGEN^© miScript SYBR^® Green и метода анализа праймеров miScript в соответствии с протоколом производителя.

Состав реакционной смеси miScript для 384-луночных планшетов:

Смесь	мкл/реакция
2X смесь SYBR® Green	5
10X универсальный праймер	1
10X метод анализа праймеров	1
H2O	2
Суммарный объем смеси:	9
Матричная кДНК в H2O (*)	1
Конечный объем:	10

(*) кДНК, полученная с помощью набора miScript II RT

Реакцию повторяют в трех повторностях в 384-луночном планшете в соответствии с протоколом производителя на системе ПЦР в реальном времени LightCycler^® 380 Roche. Циклические условия также устанавливают в соответствии с протоколом производителя:

Стадия	Время	Температура
Стадия начальной активации	15 мин
3-стадийные циклы:
Денатурация	15 с
Отжиг	30 с
Элонгация	30 с
Число циклов	40 циклов

Относительное количественное определение кПЦР известно в данной области техники и более подробно описано ниже.

Относительное количественное определение

Из разбавленного до 1/10 в H₂O для miR-124 кПЦР (Hs_miR-124a) или до 1/100 для гена сравнения/«гена домашнего хозяйства» кПЦР (Hs_miR-26a и Hs_miR-191, используя методы анализа праймеров miScript Primer Assays (Hs_miR-124a, Hs_miR-26a и Hs_miR-191 или QIAGEN^© – сравнения ms00006622, ms00029239 и ms00003682).

Анализ осуществляют, используя модели относительного количественного определения без корректировки на эффективность (2^-ΔΔCp), используя среднее значение точек пересечения (Cp) из трех повторностей miR-124 и среднее средних значений из трех повторностей miR-26a и miR-191.

B. Результаты

Одну группу доноров (для каждого соединения тестировали от 1 до 7 доноров) оценили в присутствии различных соединений формулы (I).

Используя описанный выше протокол, оценили среднюю кратность изменения (по сравнению с ДМСО) экспрессии miR-124 с различными донорами (любыми от 1 до 7) путем относительного количественного определения, и данные представлены ниже в табл.3:

Таблица 3

Молекула	Кратность изменения по сравнению с клетками, обработанными ДМСО (Относительное количественное определение)	Число тестируемых доноров
Среднее арифметическое	Стандартное отклонение
1	31,96	7,25	3
23	45,09	7,44	3
45	34,21	6,22	3
2	66,68	13,86	2
3	48,52	12,71	3
24	32,48	21,76	7
12	16,33	15,12	4
4	24,37	-	1
25	14,28	6,50	2
5	26,76	8,45	3
6	30,94	12,28	3
26	6,13	1,18	2
27	1,42	0,19	3
7	7,54	-	1
28	22,20	8,25	3
8	7,97	2,66	3
30	9,88	8,75	4
9	111,77	75,69	2
10	21,08	13,46	3
48	23,98	11,01	4
46	6,23	4,38	6
11	17,42	-	1
Маравирок	0,73	0,56	4
Эфавиренз	0,46	0,27	4
Дарунавир	1,08	0,89	4
AZT	0,90	0,55	4

Таким образом, экспериментальные данные показывают, что упомянутые выше производные хинолина формулы (I) осуществляют повышающую регуляцию уровней экспрессии miR-124 в МКПК по сравнению с эталонным значением, установленным на МКПК, не подвергнутых воздействию.

Напротив, ни один из известных антиретровирусных препаратов (Маравирок, Эфавиренз, Дарунавир или AZT) не оказывал значимого влияния на гиперэкспрессию miR-124 в МКПК от четырех доноров.

Пример 8: Действие производных хинолина в модели (DSS-) индуцированного колита

A. Материал и способы

Модели на мышах

Модель DSS

Часто используемой моделью воспалительного заболевания кишечника на мышах является модель колита, индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-). Характерными гистологическими изменениями острого DSS-колита являются истощение муцина, дегенерация эпителия и возможная деструкция слизистого барьера, приводящая к воспалению и колиту.

Трем группам мышей C57BL/6 6-недельного возраста (8 мышей в каждой группе) вводили DSS в питьевой воде (2,5%) в течение 9 дней (Фиг. 1-2). Потерю массы и потребление воды определяли каждый день. Последнее определяли путем измерения потери объема питьевой воды в соответствующих устройствах. Мышам вводили через зонд 200 мкл только 0,5 МЦ (группа DSS + МЦ) или совместно с 40 мг/кг соединения 24 (группа DSS + МЦ + 24). В момент, когда контрольные мыши потеряли вплоть до 20% их массы тела (DSS), введение DSS прекращали и заменяли питьевой водой. Остальные введения продолжали в течение 21 дня.

Трем группам мышей C57BL/6 16-недельного возраста (7 мышей в каждой группе) вводили 2,5% DSS в питьевой воде (Фиг. 3). Мышам вводили через зонд 200 мкл только 0,5 МЦ (группа DSS + МЦ) или совместно с 40 мг/кг соединения 24 (группа DSS + МЦ + 24). Мышам вводили DSS в течение 6 дней, и в момент, когда контрольные мыши потеряли вплоть до 15% массы тела (DSS), всех мышей подвергали эвтаназии и извлекали толстую кишку для дальнейших анализов.

Толстые кишки определяли с помощью линейки, и для гистологического анализа получали препараты целой кишки в соответствии с методикой «рулета» (Whittem и др.; «Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)», J Vis Exp 2010 (35) 1652), фиксированные в формалине и заключенные в парафин. Срезы 4 мкм депарафинизировали и окрашивали гематоксилином и эозином и анализировали размер очагов поражения и другие изменения (Фиг. 4-6). Авторы изобретения сравнивали мышей, неподвергнутых и подвергнутых воздействию, в течение цикла введения DSS с производными хинолина, суспендированными в метилцеллюлозе, или только метилцеллюлозой (МЦ). Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни, звездочкой указано значимое различие (p<0,5), двумя звездочками указано высокое значимое различие (p<0,05).

B. Результаты

Представленные результаты получены с использованием соединения-производного хинолина (24), структура которого представлена ниже для справки.

(24)

После 5 дней введения DSS у мышей, которым вводили производное хинолина, проявлялась потеря массы тела, составляющая менее 1% в среднем, в отличие от группы МЦ или мышей, не подвергнутых воздействию, у которых проявлялась потеря массы от 10% до 20% (Фиг. 1 и 2).

В частности, авторы изобретения отметили более высокое потребление воды у мышей, которым вводили препарат, отражающее гасящее действие производных хинолина на заболевание. Введение производного хинолина также приводило к значимому контролю потери массы тела у мышей во время второго введения DSS, что указывает на то, что эффект от лечения у мышей не прекратился, и производное хинолина подходит для многократного введения. После одного цикла DSS длина толстой кишки у мышей, которым вводили производные хинолина (6,4 см +/- 0,6 см), была значимо больше по сравнению с мышами, которым вводили только МЦ (5,9 см +/- 0,8 см), и мышами, не подвергнутыми воздействию (5,8 см +/- 0,8 см) (Фиг. 3). Указанное различие было еще более выраженным у мышей, которые получали два цикла DSS — длина толстой кишки у мышей, которым вводили производные хинолина (5,7 см +/- 0,9 см), была значимо больше по сравнению с мышами, которым вводили только МЦ (4,3 см +/- 0,5 см), и мышами, не подвергнутыми воздействию (4,4 см +/- 0,4 см) (Фиг. 3). У мышей различных когорт развивалось сравнимое число очагов поражения (Фиг. 4), но средний размер площади поражения резко уменьшался у мышей, которым вводили производное хинолина, т.е. 2,1 мм² по сравнению с 8,4 мм² у мышей, которым вводили только МЦ (Фиг. 5). Указанное различие сохранялось у мышей, подвергнутых воздействию двух циклов DSS (3,8 мм² по сравнению с 12,2 мм²).

Наконец, авторы изобретения наблюдали уменьшение изменений в лимфоидных органах, таких как пейеровы бляшки, после двух циклов DSS, что позволяет предположить, что введение производных хинолина модулирует иммунные ответы.

Пример 9: Действие производных хинолина в модели коллаген-индуцированного артрита

A. Материал и методы

Модели на мышах

Модель коллаген-индуцированного артрита

Группам мышей DBA/1 9-10-недельного возраста проводили внутрикожно иммунизацию бычьим коллагеном типа II, эмульгированным в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Мышам проводили пробу через 21 день после первой иммунизации и оценивали фенотипическое проявление артрита путем мониторинга один раз в два дня голеностопного сустава каждой задней лапы толщину определяли с помощью контрольного прибора, представляющего собой циферблатный штангенциркуль (от 0 до 10 мм), используя калибр для контроля толщины. Мышам вводили производные-кандидаты хинолина один раз в день в течение двух недель, суспендированные в метилцеллюлозе, или только метилцеллюлозу (МЦ), а затем проводили мониторинг развития заболевания. Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни, звездочкой указано значимое различие (p<0,5).

B. Результаты

Только у одной из десяти мышей, которым вводили тестируемое соединение-производное хинолина (24), проявлялись признаки воспаления (для сравнения у 8 из 10 мышей, которым вводили МЦ, развивалось заболевание). У мышей, которым вводили производные хинолина, проявлялась значимо уменьшенная припухлость по сравнению с мышами, которым вводили только МЦ (1,9 мм по сравнению с приблизительно 2,2 мм) (Фиг. 6).

Таким образом, результаты тестов, проведенных на соединениях, раскрытых в настоящем изобретении, показали, что данные соединения могут быть пригодны для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний, как дополнительно описано выше.

С указанной целью можно вводить эффективное количество данного соединения индивиду, страдающему воспалительными заболеваниями.

Так, соединение в соответствии с настоящим изобретением можно применять на практике в фармацевтической композиции, которая может содержать эффективное количество данного соединения и один или более фармацевтических эксципиентов.

Упомянутые выше эксципиенты выбирают в соответствии с дозированной формой и желаемым способом введения.

В данном контексте они могут быть представлены в любой фармацевтической форме, подходящей для энтерального или парентерального введения в ассоциации с соответствующими эксципиентами, например, в форме плоских таблеток или таблеток, покрытых оболочкой, твердых желатиновых капсул, капсул с мягкой оболочкой и других капсул, суппозиториев или в питьевой форме, такой как суспензии, сиропы, или в форме инъекционных растворов или суспензий, в дозах, обеспечивающих введение от 0,1 до 1000 мг активного вещества в сутки.

Можно использовать любой путь введения. Например, соединение формулы (I) можно вводить пероральным, парентеральным, внутривенным, трансдермальным, внутримышечным, ректальным, подъязычным, в слизистую оболочку, назальным или другими способами. Кроме того, соединение формулы (I) можно вводить в форме фармацевтической композиции и/или в единичной дозированной форме.

В частности, фармацевтические композиции по изобретению можно вводить перорально и/или парентерально.

Подходящие дозированные формы включают, но не ограничиваются указанными, капсулы, таблетки (включая быстрорастворимые таблетки и таблетки с отсроченным высвобождением), порошок, сиропы, пероральные суспензии и растворы для парентерального введения.

Фармацевтическая композиция может также содержать другое противовоспалительное средство, хорошо известное специалистам в данной области техники, в комбинации с соединением в соответствии с настоящим изобретением.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> ABIVAX

UNIVERSITE DE MONTPELLIER

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)

INSTITUT CURIE

<120> QUINOLINE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES

<130> PR72917

<150> EP14306164.6

<151> 2014-07-17

<160> 6

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 85

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aggccucucu cuccguguuc acagcggacc uugauuuaaa uguccauaca auuaaggcac 60

gcggugaaug ccaagaaugg ggcug 85

<210> 2

<211> 109

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

aucaagauua gaggcucugc ucuccguguu cacagcggac cuugauuuaa ugucauacaa 60

uuaaggcacg cggugaaugc caagagcgga gccuacggcu gcacuugaa 109

<210> 3

<211> 87

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ugagggcccc ucugcguguu cacagcggac cuugauuuaa ugucuauaca auuaaggcac 60

gcggugaaug ccaagagagg cgccucc 87

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

uaaggcacgc ggugaaugcc 20

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cguguucaca gcggaccuug au 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 6

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

<---

1. Применение соединения формулы (I)

(I),

где

Z представляет собой C или N,

V представляет собой C или N,

означает ароматическое кольцо, где V представляет собой C или N и, когда V представляет собой N, V находится в мета- или пара- положении относительно Z, т. е. образует соответственно пиридиновую или пиразиновую группу,

R независимо представляет собой атом водорода, метильную группу, группу метокси, трифторметильную группу, группу трифторметокси, аминогруппу, атом галогена и группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) и, в частности, атом фтора или хлора, группу трифторметокси и аминогруппу,

Q представляет собой N или O, при условии что R'' отсутствует, когда Q представляет собой O,

R₃ и R₄ независимо представляют собой атом водорода,

n равно 1 или 2,

n' равно 1 или 2,

R' независимо представляет собой атом галогена и, в частности, атом фтора или хлора, аминогруппу, метильную группу, группу -O-P(=O)-(OR₃)(OR₄) или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2 или 3 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, при условии что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2 и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы, или альтернативно R' независимо представляет собой атом галогена и, в частности, атом фтора или хлора, метильную группу или группу , где A представляет собой O или NH, m равно 2 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃, при условии что, когда R' представляет собой такую группу, n' равно 1 или 2 и, когда n' равно 2, другая группа R' отличается от указанной группы,

R'' представляет собой атом водорода, (C₁-C₄)алкильную группу или группу , где m равно 2 или 3 и X₁ представляет собой O, CH₂ или N-CH₃,

для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания, выбранного из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, остеоартрита, псориаза, астмы и воспаления, обусловленного карциномой толстой кишки.

2. Применение по п. 1, где Q представляет собой N.

3. Применение по п. 1 или 2, где соединение выбрано из

(Ia),

(Ib) и

(Ic),

где R, R', R'', n и n' являются такими, как определено в п. 1.

4. Применение соединения по любому из пп. 1-3, где соединение представляет собой

(Ib),

где R, R', R'', n и n' являются такими, как определено в п. 1.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (24)

.

6. Применение по п. 5, где указанное воспалительное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника.

7. Применение по п. 5, где указанное воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона или язвенный колит.

8. Применение по п. 5, где указанное воспалительное заболевание представляет собой ревматоидный артрит (РА) или остеоартрит.

9. Соединение формулы (Id):

(Id),

где R представляет собой трифторметильную группу,

n равно 1,

n' равно 1 или 2,

R' независимо представляет собой атом галогена и может дополнительно представлять собой группу, выбранную из -O(CH₂)₂NRaRb, где Ra и Rb образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, насыщенный 6-членный гетероцикл, содержащий дополнительный гетероатом, представляющий собой O, при условии что, когда R' представляет собой группу -O(CH₂)₂NRaRb, n' может быть равно 2 только в том случае, если другая группа R' отличается от указанной группы -O(CH₂)₂NRaRb.

10. Соединение, выбранное из перечня, состоящего из:

- (8) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (9) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (10) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (11) 8-хлор-N⁴-(2-морфолиноэтил)-N²-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2,4-диамина;

- (13) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (14) 8-хлор-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (15) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (16) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(3-морфолинопропил)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (17) 8-хлор-6-(2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (18) 8-хлор-6-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (19) 8-хлор-6-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (20) 8-хлор-N-(3-фтор-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)хинолин-2-амина;

- (21) N-(5-бром-4-(трифторметил)пиридин-2-ил)-8-хлорхинолин-2-амина;

- (22) N²-(8-хлорхинолин-2-ил)-N⁵-(3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил)-4-(трифторметил)пиридин-2,5-диамина;

- (28) 8-хлор-N-метил-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (29) 8-хлор-5-(3-(пиперидин-1-ил)пропокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (30) 8-хлор-N-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (31) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (32) 8-хлор-N-(2-(пирролидин-1-ил)этил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (33) 8-хлор-N-(4-морфолинобутил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (34) 8-хлор-N⁴-(3-(пиперидин-1-ил)пропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (35) 4,8-дихлор-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (36) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (37) N¹-(4,8-дихлорхинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (38) 4,8-дихлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (39) 8-хлор-6-(2-морфолиноэтокси)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (40) 8-хлор-N²-(2-морфолиноэтил)-N⁴-(3-морфолинопропил)-N²-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2,4-диамина;

- (41) 8-хлор-N-(2-морфолиноэтил)-N-(2-нитро-4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (42) N¹-(8-хлорхинолин-2-ил)-N¹-(2-морфолиноэтил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (43) 8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)-N-(2-морфолиноэтил)-N-(4-(трифторметокси)фенил)хинолин-2-амина;

- (44) N¹-(8-хлор-5-(2-морфолиноэтокси)хинолин-2-ил)-4-(трифторметокси)бензол-1,2-диамина;

- (46) 8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолина;

- (47) 4-(2-((8-хлор-2-((4-(трифторметил)пиридин-2-ил)окси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолина;

- (48) 8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолина;

- (49) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-6-ил)окси)этил)морфолина;

- (50) 4-(2-((8-хлор-2-(4-(трифторметокси)фенокси)хинолин-5-ил)окси)этил)морфолина;

- (51) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметил-пиридин-2-иламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (52) моно-[2-(8-хлор-хинолин-2-иламино)-5-трифторметокси-фенил]ового эфира фосфорной кислоты;

- (53) моно-[8-хлор-2-(4-трифторметокси-фениламино)-хинолин-6-ил]ового эфира фосфорной кислоты;

и более конкретно выбранное из соединений (8), (9), (10), (11), (30), (46), (47), (48), (49) и (50), как определено выше.

11. Применение соединения, как определено в п. 9, для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания, где указанное воспалительное заболевание выбрано из перечня, состоящего из: воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, остеоартрита, псориаза, астмы и воспаления, обусловленного карциномой толстой кишки.

12. Фармацевтическая композиция для повышающей регуляции уровня экспрессии miR-124, содержащая соединение, как определено в п. 9 или выбранное из соединений (8), (9), (10), (11), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52) и (53), в эффективном количестве, и более конкретно одно из соединений (8), (9), (10), (11), (30), (46), (47), (48), (49) и (50), как определено в п. 10, и один или более фармацевтический эксципиент.