Штамм mycobacterium tuberculosis bn для моделирования латентной туберкулезной инфекции
Владельцы патента RU 2760751:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к аттенуированным микобактериям туберкулеза. Штамм Mycobacterium tuberculosis BN депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» с присвоенным номером B-9359 и может быть использован для моделирования латентной туберкулезной инфекции и разработки противотуберкулезной вакцины. Изобретение позволяет повысить эффективность защиты от туберкулеза. 5 ил., 1 табл.
Область техники
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к новому аттенуированному штамму Mycobacterium tuberculosis BN микобактерий туберкулеза, полученному в результате многократного пассирования штамма M. tuberculosis H37Rv на жидких средах. Штамм может быть использован для моделирования латентной туберкулезной инфекции и разработки противотуберкулезной вакцины.
Уровень техники
Создание штаммов Mycobacterium tuberculosis с новыми генетическими свойствами является актуальной задачей для исследования механизмов взаимодействия в системе «патоген - макроорганизм», факторов вирулентности микобактерии; развития лекарственной резистентности, выявления структур M. tuberculosis, обладающих вакцинными свойствами.
Измененные микобактерии (ослабленные, мутантные, с вставками или делециями тех или иных генов и т.д.) являются инструментом с широкими возможностями. С их помощью возможно исследовать взаимодействие между патогеном и макроорганизмом, механизмы формирования дормантных форм микобактерий при латентном туберкулезе и его реактивации (Sambandamurthy V. K., Wang X., Chen B. et al., Nature Medicine, 2002, vol. 8, p. 1171-1174; Shleeva M.O., Kudyakina Yu. K., Vostroknutova G.M., et al. Tuberculosis, 2011, vol. 91, №2, p. 146-154), формирование лекарственной устойчивости V. L., Rifat D., Chuang Yu-M, Thomas R. Ioerger T.R., Karakousis P.C. Front. Microbiol., 2018, vol. 9, Article 494 https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00494; Karakousis Р.С., Williams E.P., Bishai W.R. J. Antimicrob. Chemother., 2008, vol. 61 (2): 323-331. Doi: org./10.1093/ jac/dkm485).
В настоящее время вакцина Кальметта - Герена (БЦЖ), приготовленная из Mycobacterium bovis, остается единственной официально одобренной вакциной для вакцинации людей от туберкулеза (ТБ). Первая попытка вакцинации человека от туберкулеза вакциной БЦЖ была предпринята в 1921 г. БЦЖ была получена в результате пассирования вирулентных M. bovis in vitro на картофельной среде (с добавлением бычьей желчи и глицерина для предотвращения скопления бактерий) в течение 13 лет (1908-1921). Тестирование на животных выявило существенное ослабление штамма [Calmette A. L'infection bacillaire et la tuberculose chez l'homme et chez les animaux. Paris, 1920, Masson et Cie Editeurs; Calmette A, Guerin C, Weill-Halle B. Bull Acad Med. Vol. 91. Essai d'immunisation contre l'infection tuberculeuse. Paris, 1924, pp. 787-96], обзор [Luka S, Mihaescu T. Vaccine. Maedica (Bucur). 2013; 8(1): 53-58]). БЦЖ - одна из самых известных вакцин, когда-либо использовавшихся; несмотря на то, что ее эффективность варьирует в зависимости от популяции, в которой она используется. БЦЖ обеспечивает защиту от развития тяжелых форм детского туберкулеза [Trunz BB, Fine P, Dye C. Lancet. 2006; 367: 1173-1180], но в разной степени эффективна против легочного туберкулеза у взрослых и совершенно неэффективна в некоторых популяциях [Samreen F, Kumari A, Das G, Dwivedi VP. Life Sci. 2020; 252:117594. doi: 10.1016/j.lfs.2020.1175945]. Стоит упомянуть исследования генетических вариаций штаммов БЦЖ, потенциально влияющих на эффективность вакцинации [Ritz N, Hanekom WA, Robins-Browne R, et al. FEMS Microbiol Rev. 2008; 32:821-841; Behr M.A. Lancet Infect Dis. 2002; 2:86-92]. Ранее предпринимались неоднократные попытки улучшить существующие субштаммы БЦЖ с помощью генетических манипуляций, которые включают в себя как вставку генов из M. tuberculosis, так и нарушение работы генов БЦЖ, потенциально мешающих эффективности вакцинации [Andersen P, Kaufmann SH. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 4: a018523; Ahn S, Tran V, Leung A, et al. Mol. Ther. 2018; 26(12): 2863-2874. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.08.023; Hoft DF, Blazevic A, Abate Get al. J Infect Dis. 2008; 198:1491-1501] и несколькими стратегиями первичной иммунизации, которые сочетают БЦЖ с субъединичными вакцинами-кандидатами [Gupta N, Garg S, Vedi S, et al. Front Immunol. 2018; 9:2371. doi: 10.3389/fimmu.2018.02371]. Важно отметить, что генетическое ослабление Mycobacterium tuberculosis до приемлемых стандартов безопасности также привлекало внимание различных исследователей [Arbues A, Aguilo JI, Gonzalo-Asensio J. et al. Vaccine. 2013; 31:4867-4873; Spertini F, Audran R, Chakour R, et al. Lancet Respir. Med. 2015; 3:953-962].
Исторически так сложилось, что десятки штаммов БЦЖ, которые производились и использовались в то или иное время [Corbel M.J., Fruth U., Griffiths F., Knezevic I. Vaccine. 2004; 22:2675-2680], являются потомками предкового штамма, используемого Кальметтом и Гереном в Лилле с 1908 г. Поскольку лиофилизация БЦЖ была введена только в 1961 г. [Gheorgiu M., Augier J., Lagrange P.H. Bull Ist Pasteur. 1983, 281-288], существующие штаммы БЦЖ представляют собой множество генетически различных бацилл, которые со временем приобрели различное количество генетических изменений в течение длительного периода прохождения через разные культуральные среды. Более того, исторический прототип штамма исчез и недоступен для анализа. Поразительная вариабельность эффективности БЦЖ в разных популяциях, выявленная несколько десятилетий назад (обзор в [Colditz G.A., Brewer T.F., Berkey C.S., et al. JAMA. 1994; 2 71:698-702; Davenne T., McShane H. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(8): 1009-1013]), сразу поставила вопрос о том, были ли эти вариации результатом антигенного разнообразия между вакцинными штаммами, особенно после описания достаточных вариаций в последовательностях генома различных субштаммов БЦЖ (см. обзор [Abdallah AM, Hill-Cawthorne GA, Otto TD, Sci Rep. Scientific Reports, 2015, v. 5, Article number: 15443]. Еще более очевидным всегда был вопрос об антигенных различиях между аттенуированной вакциной BCG, M. bovis и вирулентными штаммами M. tuberculosis, на долю которых приходится более 90 процентов всех случаев туберкулеза у людей.
Различными исследователями было ясно продемонстрировано, что M. bovis BCG не имеет множества генов, присутствующих в M. tuberculosis. Многие из них не только играют важную роль в вирулентности, но и кодируют иммунодоминантные белки, такие как члены системы секреции ESX-1, отсутствующие во всех штаммах БЦЖ за счет делеции области RD1 [Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., et al. Science. 1999; 284(5419):1520-1523. doi: 10.1126/science.284.5419.1520; Behr MA, Small PM. A historical and molecular phylogeny of BCG strains. Vaccine. 1999; 17(7-8):915-22. doi: 10.1016/s0264-410x(98)00277-1; Brosch R., Gordon S.V., Garnier T., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(13):5596-601. doi: 10.1073/pnas.0700869104.015; 5:15443. doi: 10.1038/srep15443].
Также было показано, что повторное введение ESX-1 в субштаммы BCG Pasteur и Russia не восстановило полностью вирулентность [Pym A.S., Brodin P., Brosch R., et al. Mol Microbiol. 2002; 46:709-717], что указывает на наличие других важных детерминант вирулентности и, предположительно, иммуногенности. С тех пор было предпринято множество попыток генетически нацелить M. tuberculosis, чтобы снизить вирулентность, но сохранить иммуногенные характеристики, максимально близкие к исходным. Среди частично успешных попыток следует отметить делецию области RD1 [Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., et al. J. Infect. Dis. 2003; 187(1):117-23. doi: 10.1086/345862], развитие мутантов ауксотрофных M. tuberculosis [Sampson S.L., Dascher C.C., Sambandamurthy V.K. Infect. Immun. 2004; 72:3031-3037. doi:10.1128/iai.72.5.3031-3037.2004; Jain P., Hsu T., Arai M., et al. mBio. 2014, 5:e01245-14. doi:10.1128/mBio.01245-14] и штаммов M. tuberculosis, несущих множественные делеции генов семейства Rpf [Yeremeev V.V., Kondratieva T.K., Rubakova E.I., et al. Infect Immun. 2003; 71(8):4789-94. doi: 10.1128/iai.71.8.4789-4794.2003; Kondratieva T, Rubakova E, Kana B.D. et al. Tuberculosis (Edinb). 2011; 91(3):219-23. doi: 10.1016/j.tube.2011.01.005]. Эти целенаправленные подходы казались вполне логичными с точки зрения современной молекулярной генетики и обеспечивали вакцины, эффективность которых на экспериментальных животных моделях была сопоставима с таковой у БЦЖ. Тем не менее, ни один из новых штаммов не продемонстрировал существенно более высокой эффективности по сравнению в экспериментальных моделях. Все подходы к созданию этих штаммов были очень далеки от исходной стратегии - создания противотуберкулезной вакцины путем множественных пассажей in vitro. Этот подход привел к значительному ослаблению исходного вирулентного штамма, как было доказано Кальметтом и Гереном [Calmette A, Guerin C, Weill-Halle B. Bull Acad Med. Vol. 91. Essai d'immunisation contre l'infection tuberculeuse. Paris, 1924, pp. 787-96].
Наиболее близким к заявляемому является штамм M. tuberculosis Mc26030. В этом штамме произошла делеция генетической областей RD1 и panCD, определяющих вирулентность микобактерии (Hinchey J. At al. et al. J Clin Invest, 2007, 117(8):2279-88. doi: 10.1172/JCI31947; Scriba T. J. et al., J Inf Dis, 2016, 214 (1): 659-664, https://doi.org/10.1093/infdis/jiw228 ). Данный штамм потерял генетическую область RD-1, что привело его к утрате вирулентности, в то же время у заявленного штамма область RD-1 сохранена, а утрата вирулентности имеет иную генетическую природу. В отличие от M. tuberculosis Mc26030 заявленный штамм взаимодействует с макроорганизмом путем отличных механизмов, что, в частности, подтверждается его способностью защищать мышей CBA/N.
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является создание нового штамма для изучения взаимодействия микобактерия - макроорганизм, с целью проведения экспериментальных исследований в области латентного туберкулеза. В перспективе - разработать противотуберкулезную вакцину.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом изобретения является создание нового аттенуированного штамма Mycobacterium tuberculosis, с генетическими свойствами, отличными от исходного вирулентного штамма. M. tuberculosis BN проявляет вакцинные свойства равные/превосходящие БЦЖ в мышиной модели туберкулеза. При подкожном введении с последующим заражением вирулентным штаммом M. tuberculosis обеспечивает пролонгирование выживаемости мышей и снижение микобактериальной нагрузки в легких на уровне БЦЖ. При ингаляционном и внутривенном вакцинировании обеспечивает более эффективную защиту, чем БЦЖ.
Технический результат достигается штаммом Mycobacterium tuberculosis BN, задепонированным в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ)) с присвоенным идентификатором B-9359.
Описание штамма:
Mycobacterium, Mycobacterium tuberculosis
Штамм выведен из вирулентного M. tuberculosis H37Rv (CIP 64.31T в коллекции из Пастеровского института, Париж) путем 70-ти последовательных пересевов в жидкой среде 7Н9 (Nikonenko B. et al. Antimicob. Agents Chemother., 2004; 48(12): 4550-5). M. tuberculosis H37Rv Pasteur хранится в коллекции микроорганизмов Центрального НИИ туберкулеза (г. Москва, Россия), в коллекции компании Sequella, inc. (США) и в Институте Пастера в Париже.
Первоначально в среду 7H9 вносили порядка 106 клеток M. tuberculosis H37Rv, в дальнейшем из культуры с появившейся мутностью небольшую часть переносили в свежую среду 7Н9 и т.д.
Генетика штамма: Восемь однонуклеотидных вставок и делеций (in/del), дифференцирующих штаммы BN и H37Rv в генах Rv0092, Rv0997, Rv1046c, Rv1575, Rv2690c, Rv2933, Rv3655c и Rv3911, привели к сдвигу рамки считывания в соответствующих белках. Делеция нуклеотида C в положении 1894 в гене Rv2933, кодирующем PpsC, phenolpthiocerol I типа синтеза фенолптиоцерина. Делеция нуклеотида C в положении 119 в гене Rv0092, кодирующем белок CtpA, медь-транспортную АТФазу P-типа. Транспорт ионов тяжелых металлов через плазматическую мембрану необходим для внутриклеточного выживания различных бактерий (Rowland and Niederweis, 2012). Вставка нуклеотида Т в положение 1763 в гене Rv2690c, кодирующем предполагаемый консервативный интегральный мембранный белок, богатый аланином / валином / лейцином, принадлежащий суперсемейству acid-polyamine-organocation (APC). Делеция нуклеотида C в положении 478 в гене sigM. Белок SigM относится к альтернативным сигма-факторам микобактерий. Делеция нуклеотида G в положении 299 в гене Rv3655c. Соответствующий белок препятствует активации caspase-8 и связывается с E3 ubiquitin-protein ligase RNF213 хозяина RNF213. Кроме того, мы идентифицировали 5 синонимичных SNP и 4 несинонимичных (миссенс) SNP, расположенных в генах Rv0950c и Rv2627c (гипотетические консервативные белки), Rv2380c (mbtE), кодирующем пептид-синтазу, и Rv3229c (desA3), кодирующем предполагаемый linoleoyl-CoA desaturase. Следует подчеркнуть, что не было обнаружено мутаций в генах области EXS-1 / RD-1 и других систем секреции, что указывает на то, что сильное ослабление M. tuberculosis BN не было связано с нарушением секреции факторов вирулентности.
На плотных средах (Dubos agar или Middelbrook 7H10) формируют морщинистые, сухие колонии с неровными краями; вырастают в хорошо различимые визуально макроколонии в течение около 3 недель. Микобактерии окрашиваются по Циль-Нильснену.
Для выращивания культуры использовали жидкие среды Difco Dubos Broth или Difco Middelbrook 7H9 Broth (Bacton, Dikinson and Company, Sparks, USA). Культура вырастала до формирования мутности за 2 недели при температуре 37°С в шейкере при перемешивании. Условия хранения: в фосфатном солевом буфере с 0.05% Tween80 и 0.01% БСА при -80оС, или в лиофилизированном виде.
Как M. tuberculosis по патогенности штамм должен быть отнесен к группе III, однако штамм аттенуирован и совершенно не патогенен для лабораторных мышей.
Мыши, получившие внутривенно по 106 КОЕ, прожили более полутора лет и были выведены из эксперимента.
Вирулентность отсутствует, штамм стимулирует клеточный и гуморальный ответ при введении мышам.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлены фотографии легких: а) мыши C57BL/6 через 300 дней после введения БЦЖ (106); б) мыши C57BL/6 через 300 дней после введения штамма M. tuberculosis BN (106); в) мыши I/S через 300 дней после введения БЦЖ (106); г) мыши I/S через 300 дней после введения штамма M. tuberculosis BN (106).
На фиг. 2 показаны диаграммы, демонстрирующие: А - бактериальную нагрузку через 300 дней после введения БЦЖ, в органах мышей I/St и C57BL/6. L - легкие, S - селезенки; Б - бактериальную нагрузку через 300 дней после введения аттенуированного штамма M. tuberculosis BN, в органах мышей I/St и C57BL/6. L - легкие, S - селезенки.
На фиг. 3 представлен график выживаемости мышей BALB/c, зараженных M. tuberculosis H37Rv после предварительной подкожной вакцинации BCG и аттенуированным штаммом M. tuberculosis BN.
На фиг. 4 представлен график выживаемости мышей BALB/c после ингаляционного введения БЦЖ и аттенуированного штамма M. tuberculosis BN (по 100 КОЕ/легкое) с последующим внутривенным зараженных через 5 недель в/в M. tuberculosis H37Rv.
На фиг. 5 представлен показатель выживаемости мышей CBA/N после вакцинации подкожным введением BCG и штамма M. tuberculosis BN и последующего заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv.
Осуществление изобретения
Выполнение настоящего изобретения, применившего подход, разработанный Кальметом-Гереном, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует достижение высокого результата - получен новый уникальный штамм, являющийся инструментом для исследования механизмов взаимодействия макроорганизм - микобактерия, а также в перспективе для создания новой противотуберкулезной вакцины.
Для выращивания культуры использовали жидкие среду Difco Middelbrook 7H9 Broth (Bacton, Dikinson and Company, Sparks, USA). В 25 мл среды вносили 0.5 мл культуры исходного штамма. Культура вырастала до формирования мутности за 2 недели при температуре 37°С в полулитровых колбах в шейкере. Через 2 недели повторяли процедуру пересева культуры. И так 70 пассажей.
Генетическое описание нового штамма
Проведено полногеномное секвенирование штамма M. tuberculosis NB на платформе NextSeq 6000 Illumina. Библиотека для секвенирования была получена с использованием набора Hyper library construction kit, Kapa Biosystems (Roche) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали на последовательность генома M.tuberculosis H37Rv AL123456.3 с помощью пакета программ Snippy (v.4.3) для выявления мутаций.
Выявлено 5 синонимичных SNP; 5 несинонимичных SNP, расположенных в генах Rv0532 (кодирующем белок PE_PGRS6), Rv0950c и Rv2627c (гипотетические консервативные белки), Rv2380c (mbtE, кодирующем peptide synthetase), Rv3229c (desA3, кодирующем linoleoyl-CoA desaturase (delta(6)-desaturase).
Также выявлены мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания в кодируемом белке:
- Делеция нуклеотида С в позиции 119 гена Rv0092. Ген кодирует белок CtpA, АТФазу, осуществляющую транспорт катионов меди. Показано, что мутации в гене сtpA в бактерии Listeria monocytogenes существенно снижает бактериальную нагрузку в инфицированных мышах (Francis, M.S. and Thomas, C.J., 1997. Mutants in the CtpA copper transporting P-type ATPase reduce virulence ofListeria monocytogenes. Microbial pathogenesis, 22(2), pp.67-78). В S. typhimurium потеря экспрессии гомолога CtpA вызывает повышенную чувствительность бактерий к ионам меди и снижает бактериальную выживаемость в макрофагах (Ladomersky, E. and Petris, M.J., 2015. Copper tolerance and virulence in bacteria. Metallomics, 7(6), pp.957-964)
- Делеция нуклеотида C в позиции 1894 гена Rv2933, кодирующего белок PpsC, рhenolpthiocerol synthesis type-I polyketide synthase. PpsC является одним из ключевых белков синтеза компонента клеточной стенки фтиоцерол димикоцерозата. Показано, что мутации в генах семейства pps накапливаются при длительном культивировании M.tuberculosis in vitro (Domenech, P. and Reed, M.B., 2009. Rapid and spontaneous loss of phthiocerol dimycocerosate (PDIM) from Mycobacterium tuberculosis grown in vitro: implications for virulence studies. Microbiology (Reading, England), 155 (Pt 11), p.3532)
- Инсерция нуклеотида Т в позиции 1763 гена Rv2690c. Ген кодирует предположительный консервативный белок (probable conserved integral membrane alanine and valine and leucine rich protein). Функции белка неизвестны, но аланин-богатые мембранные белки микобактерий часто обладают иммуногенными свойствами.
Для изучения механизмов взаимодействия макроорганизм-микобактерия с использованием заявленного штамма были использованы мыши инбредных линий с различной генетически детерминированной восприимчивостью к туберкулезной инфекции.
Свойства штамма
Штамм M. tuberculosis проявил отсутствие вирулентности у мышей инбредных линий (n=8 в каждой группе). Для этого были отобраны мыши трех разных линий:
1. высоко восприимчивые к туберкулезной инфекции I/St
2. имеющие промежуточную восприимчивость к туберкулезной инфекции BALB/c
3. устойчивые к туберкулезной инфекции C57BL/6
Отобранным инбредным линиям мышей вводили внутривенно - 106 КОЕ БЦЖ или M. tuberculosis BN и проводили динамическое наблюдение в последующие 18 месяцев. Среди мышей I/St и BALB/c наблюдали 100% выживаемость, у мышей C57BL/6 регистрировали 1 из 8 (1,3%) летальный исход через 8 месяцев после получения БЦЖ. При морфологическом исследовании патологии выявлено не было (фиг. 1, 2, 3, 4).
Изучена микобактериальная нагрузка в легких и селезенке мышей различных линий. Через 300 дней после внутривенного введения штамма BN или БЦЖ у мышей I/St и C57BL/6 выявлен умеренный уровень микобактериальной нагрузки (103 - 104 КОЕ). При этом минимальную бактериальную нагрузку отмечали в легких мышей C57BL/6, максимальную - в органах мышей I/St, без превышения значений 103 - 104 (фиг. 2А, 2Б).
Подкожное введение штамма M. tuberculosis BN в дозе 106 КОЕ при последующем внутривенном заражении мышей вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv, показало уровень протекции, равный БЦЖ (фиг. 3, таблица 1).
Таблица 1. Среднее время выживаемости среди мышей линии BALB/c при введении БЦЖ и аттенуированного штамма M. tuberculosis BN
| Исследуемая группа | День гибели мышей | Среднее время выживаемости (дни) | ||||||
| Контрольная | 109 | 117 | 120 | 135 | 147 | 151 | 153 | 133±18 |
| БЦЖ | 193 | 214 | 227 | 243 | 283 | 304 | 236±38 | |
| BN | 201 | 210 | 215 | 244 | 292 | 300 | 244±43 |
Ингаляционное введение штамма M. tuberculosis BN в дозе 100 КОЕ/легкое при последующем заражении мышей вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv, показало уровень протекции, превышающий BCG (фиг. 4).
Ранее было показано, что вакцинация БЦЖ не защищает мышей CBA/N от заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. (Nikonenko et al. Clin Exp Immunol, 1996, 104:37-43; Kondratieva et al. J Immunol, 2010, 184: 1227-34). Однако подкожная вакцинация таких мышей аттенуированным штаммом M. tuberculosis BN демонстрирует его высокие защитные свойства (фиг. 5).
Длительность выживаемости мышей, вакцинированных БЦЖ, составила 112±21 дней. Наблюдение за мышами через 217 дней после вакцинирования аттенуированным штаммом M. tuberculosis BN показало отсутствие летальности в 100% случаев. При этом средний вес тела мышей составил 26,9±4 г. Ранее показано, что к моменту гибели мышей от туберкулезной инфекции вес мышей составляет 16-17 г (Nikonenko et al. 2004). Вот если бы не публикация, тогда я должен приводить динамику.
На основании полученных результатов был сделан вывод о то, что микобактерии штамма M. tuberculosis BN, отличаясь генетически от БЦЖ и H37Rv, способны оказывать протективный противотуберкулезный эффект. Этот эффект сравним с таковым при использовании БЦЖ, но осуществляется посредством других механизмов иммунитета, что обеспечивает протективную противотуберкулезную защиту, в некоторых генетических экспериментальных системах, где БЦЖ не работает.
Штамм Mycobacterium tuberculosis BN, депонированный в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» с присвоенным идентификатором B-9359, для моделирования латентной туберкулезной инфекции.
