Агент, индуцирующий клеточную гибель, для клеток, имеющих мутации гена braf, агент, подавляющий рост таких клеток, и фармацевтическая композиция для терапии заболеваний, вызванных дефектом роста таких клеток

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, способ подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, и ингибитора BRAF для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Предложены способ скрининга лекарственного средства для индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, и способ скрининга лекарственного средства для подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Предложенная группа изобретений обеспечивает индуцирование гибели клеток и подавление клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к агенту, индуцирующему клеточную гибель, для клетки, имеющей мутацию гена BRAF (например, тип раковой клетки), агенту, подавляющему рост такой клетки, и фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста такой клетки, и, кроме того, относится к способу скрининга агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост.

Уровень техники

Ген BRAF представляет собой ген, кодирующий тип серин-треонин киназы, составляющей путь RAS-RAF-MAPK. Мутации в гене BRAF были зарегистрированы в различных опухолях. Например, мутация, в которой аминокислота валин замещена глутаминовой кислотой в положении 600 (V600E), обнаружен во многих раковых клетках. Известно, что BRAF, обладающий мутацией V600E, всегда активирует нисходящий сигнальный путь и вызывает рост клеток без внеклеточной стимуляции.

Например, ген BRAF, имеющий мутацию V600E, обнаруживается при многих колоректальных раках (от 5 до 15%) и меланоме (около 60%). Отметим, что при многих раках, таких как рак поджелудочной железы и колоректальный рак, с высокой частотой обнаруживаются мутации в гене KRAS. Белок KRAS представляет собой G-белки, локально присутствующие на внутренней поверхности клеточной мембраны. RAS, такие как KRAS, активируют RAF, такие как CRAF и BRAF, RAF последовательно активирует MEK, и MEK активирует MAPK, тем самым формируя каскад (Непатентная литература 1 и 2). Редкий случай включает мутацию BRAF и мутацию KRAS, поскольку мутация BRAF и мутация KRAS находятся во взаимоисключающей связи (Непатентная литература 3).

В настоящее время при раках с BRAF, имеющих мутацию V600E, считается эффективной терапия ингибитором против BRAF, имеющих мутацию V600E. Вемурафениб (PLX4032) и PLX4720 известны как такие ингибиторы. Однако раковые клетки могут приобретать устойчивость к этим ингибиторам при их непрерывном введении, что делает терапевтические эффекты ограниченными. Таким образом, для раковых клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, востребованы более эффективные агенты, индуцирующие гибель клеток, и агенты, подавляющие рост, замещающие эти ингибиторы.

Глутатион-S-трансфераза (GST), один из ферментов, катализирующих конъюгацию глутатиона, известен как фермент, конъюгирующий вещество, такое как лекарственное средство с глутатионом (GSH), в вещество на водной основе. GST, на основании аминокислотной последовательности, классифицируется на 6 типов изоферментов: α, μ, ω, π, θ и ξ. Из них, экспрессия GST-π (глутатион S-трансферазы пи, также называемая GSTP1), в частности, возрастает в различных раковых клетках и, как указывается, является возможным фактором устойчивости к некоторым противораковым агентам. На самом деле известно, что, когда антисмысловой ДНК или GST-π ингибитору против GST-π разрешено воздействовать на лекарственно-устойчивую систему раковых клеток, сверхэкспрессирующую GST-π, резистентность к лекарственному средству подавляется (Непатентная литература 4-6). Кроме того, в недавнем докладе, когда siРНК против GST-π разрешено воздействовать на GST-сверхэкспрессирующую андроген-независимую линию клеток рака предстательной железы, ее рост подавляется и апоптоз увеличивается (Непатентная литература 7).

Кроме того, известно, что GST-π образует комплекс с c-Jun-N-терминальной киназой (JNK) и ингибирует активность JNK (Непатентная литература 8). Кроме того, известно, что GST-π участвует в S-глутатионилировании белков, связанном с реакциями клеточного стресса (Непатентная литература 9). Кроме того, GST-π, как известно, способствует защитному действию при гибели клеток, вызванной активными формами кислорода (ROS) (Непатентная литература 10). Как описано выше, подразумевается, что GST-π среди GST имеет различные особенности и функции.

Сообщается, что, когда siРНК против GST-π разрешено воздействовать на систему раковых клеток, имеющую мутацию KRAS, активация Akt подавляется и аутофагия увеличивается, но индукция апоптоза примерно умеренная (Непатентная литература 11). В патентной литературе 1 раскрывается, что апоптоз раковых клеток можно индуцировать использованием лекарственного средства, подавляющего GST-π, и ингибитора аутофагии, такого как 3-метиладенин в качестве активных компонентов. Патентная литература 2 дополнительно раскрывает, что, когда одновременно ингибируется экспрессия GST-π и Akt, клеточный рост подавляется и индуцируется гибель клеток, и аутофагия, индуцированная ингибированием экспрессии GST-π, заметно подавляется одновременным ингибированием экспрессии Akt и тому подобное.

Однако в клетке, имеющей мутацию в гене BRAF, описанной выше, не обнаружено взаимосвязи между экспрессией GST-π и клеточным ростом или гибелью клеток, или роли GST-π в сигнальной трансдукции.

Список цитирования

Патентная литература

Патентная литература 1: WO2012/176282

Патентная литература 2: WO2014/098210

Непатентная литература

Непатентная литература 1: Curr Top Microbiol Immunol. 2012; 355: 83-98

Непатентная литература 2: Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug; 8(4): 419-26

Непатентная литература 3: British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764

Непатентная литература 4: Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21(7): 945-51

Непатентная литература 5: Ban et al., Cancer Res. 1996; 56(15): 3577-82

Непатентная литература 6: Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306(3): 861-9

Непатентная литература 7: Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008; 29(6): 1134-8

Непатентная литература 8: Adler et. al, EMBO J. 1999, 18, 1321-1334

Непатентная литература 9: Townsend, et.al, J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445

Непатентная литература 10: Yin et.al, Cancer Res. 2000 60, 4053-4057

Непатентная литература 11: Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No. 1065

Сущность настоящего изобретения

Техническая задача

В сложившейся ситуации, настоящее изобретение имеет целью предоставить агент, обладающий действием, индуцирующим клеточную гибель, и/или действием, подавляющим рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, предоставить фармацевтическую композицию для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, и предоставить способ скрининга агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост.

Решение задачи

Авторы настоящего изобретения провели подробные исследования с учетом вышеуказанной цели и обнаружили, что рост клеток интенсивно подавляется, когда GST-π подавляется в клетке, имеющей мутацию в гене BRAF, и рост клеток также интенсивно подавляется, когда GST-π подавляется даже в клетке, имеющей мутацию гена BRAF и устойчивой к традиционно известным ингибиторам BRAF, в результате чего было выполнено настоящее изобретение. Настоящее изобретение включает следующее.

(1) Агент, индуцирующий клеточную гибель для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента.

(2) Агент, подавляющий клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента.

(3) Агент по (1) или (2), где мутация представляет собой мутацию V600E.

(4) Агент по (1) или (2), где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF.

(5) Агент по (1) или (2), где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

(6) Агент по (1) или (2), где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой раковую клетку, высоко экспрессирующую GST-π.

(7) Фармацевтическая композиция для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, содержащая агент по любому из вышеуказанных (1)-(6).

(8) Фармацевтическая композиция по (7), где заболевание представляет собой рак.

(9) Фармацевтическая композиция по (8), где рак представляет собой рак, высоко экспрессирующий GST-π.

(10) Фармацевтическая композиция по (8), где раком является колоректальный рак или меланома.

(11) Способ скрининга агента, индуцирующего клеточную гибель, и/или агента, подавляющего клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий выбор лекарственного средства, подавляющего GST-π.

(12) Способ для скрининга по (11), включающий этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, этап измерения уровня экспрессии GST-π в клетке и этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества.

Настоящее описание охватывает раскрытое содержание, описанное в патентной заявке JP No. 2015-84286 и в патентной заявке JP No. 2016-78710, которые являются основой приоритета настоящей заявки.

Полезные эффекты настоящего изобретения

В соответствии с агентом, индуцирующим гибель клеток, по настоящему изобретению, гибель клеток может быть индуцирована очень интенсивно для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент, индуцирующий гибель клеток, по настоящему изобретению, может показывать очень высокую эффективность в качестве фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.

Кроме того, в соответствии с агентом, подавляющим клеточный рост, по настоящему изобретению клеточный рост может быть подавлен очень интенсивно для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент подавления роста клеток по настоящему изобретению может показывать очень высокую эффективность в качестве фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.

Кроме того, согласно способу скрининга в соответствии с настоящим изобретением можно выбрать лекарственное средство для индуцирования гибели клеток и/или для очень интенсивного подавления клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.

Краткое описание чертежей

[Фигура 1] Фиг. 1 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления роста клеток, вызванного нокдауном GST-π в клеточной линии колоректального рака, имеющей мутацию в гене BRAF (результаты подсчета числа клеток, результаты вестерн-блоттинга).

[Фигура 2] Фиг. 2 представляет собой характерные диаграммы, показывающие результаты исследования эффекта подавления роста клеток, вызванного нокдауном GST-π в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF (результаты подсчета числа клеток, результаты вестерн-блоттинга).

[Фигура 3] Фиг. 3 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления клеточного роста, когда GST-π siРНК и ингибитор BRAF использовали в комбинации в линии клеток колоректального рака, имеющей мутацию в гене BRAF.

[Фигура 4] Фиг. 4 представляют собой характерные диаграммы, показывающие результаты исследования эффектов подавления клеточного роста, когда GST-π siРНК и ингибитор BRAF использовали в комбинации в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF.

[Фигура 5] Фиг. 5 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления клеточного роста, вызванного нокдауном GST-π в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF и резистентной к ингибитору BRAF.

[Фигура 6] Фиг. 6 представляет собой фотографии электрофореза, показывающие результаты анализа вестерн-блоттинга экспрессии GST-π, когда GST-π был нокаутирован в клеточной линии меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивую к ингибитору BRAF.

Описание вариантов осуществления

Агент, индуцирующий клеточную гибель, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, содержит лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента. Агент, индуцирующий клеточную гибель, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, демонстрируют эффект индуцирования клеточной гибели и эффект подавления клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.

GST-π, при использовании в настоящем описании, относится к ферменту, который кодируется геномом GSTP1, и катализирует конъюгацию глутатиона. GST-π присутствует у различных животных, включая человека, и известна информация о его последовательности (например, человек: NM_000852 (NP_000843), крыса: NM_012577 (NP_036709), мышь: NM_013541 (NP_038569) и т. д. Цифры представляют собой номера базы данных NCBI, цифры вне круглых скобок являются нуклеотидными последовательностями, а числа в круглых скобках являются аминокислотными последовательностями). В качестве примера, нуклеотидная последовательность в кодирующей области гена GST-π человека, зарегистрированная в базе данных, представлена в SEQ ID NO:1 и аминокислотная последовательность в белке GST-π человека, кодируемом геном GST-π человека, представлена в SEQ ID NO:2.

Следует отметить, что GST-π может быть определен специфической нуклеотидной последовательностью и аминокислотной последовательностью, как описано выше, но необходимо учитывать мутацию в нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности (включая полиморфизмы), которые, возможно, должны быть рассмотрены вызванными между биологическими индивидуумами. А именно, GST-π не ограничивается белками, имеющими идентичную последовательность с аминокислотной последовательностью, зарегистрированной в базе данных, но включает в себя те, которые имеют равную функцию с GST-π и имеют последовательность с 1 или 2, или более, обычно 1 или несколько, для, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных аминокислот из вышеуказанной последовательности. Кроме того, GST-π также включает те, которые состоят из нуклеотидной последовательности, имеющую 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, или 97% или более, идентичность с указанной специфической нуклеотидной последовательностью, и кодирующий белок, имеющий равную функцию с GST-π. Следует отметить, что специфическая функция GST-π, как описано выше, относится к активности фермента, катализирующего конъюгацию глутатиона.

Следует отметить, что в настоящем описании фразы, такие как «при использовании в настоящем описании», «используемый в настоящем описании», «в настоящем описании» и «описанный в настоящем описании», означают, что последующие описания этих фраз применяются ко всем изобретениям, описанным в настоящем описании, если не указано иное. Кроме того, если не указано иное, все технические термины и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, что и те, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Все патенты, патентные публикации и другие публикации, цитируемые в настоящем документе, должны быть полностью включены в настоящее описание.

Примеры «лекарственное средство, подавляющее GST-π», используемые в настоящем описании, включают в себя, но не ограничиваются ими, лекарственные средства, подавляющие продуцирование и/или активность GST-π, и лекарственные средства, способствующие распаду и/или инактивации GST-π. Примеры лекарственных средств, подавляющих продуцирование GST-π включают, но не ограничиваются ими, молекулы РНК-интерференции, рибозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, ДНК/РНК-химерные полинуклеотиды к ДНК, кодирующей GST-π, и векторы, экспрессирующие их.

Кроме того, для лекарственного средства, подавляющего GST-π, могут быть использованы любые соединения, которые действуют на GST-π. Примеры таких пригодных для использования соединений включают органические соединения (аминокислоты, полипептиды или их производные, низкомолекулярные соединения, углеводы и высокомолекулярные соединения) и неорганические соединения. Кроме того, эти соединения могут быть природными или неприродными веществами. Примеры производного полипептида включают модифицированные полипептиды, полученные добавлением модифицирующей группы и вариантных полипептидов, полученных путем изменения аминокислотного остатка. Кроме того, эти соединения могут представлять собой одно соединение или химическую библиотеку, продукты экспрессии библиотеки генов, клеточные экстракты, супернатанты клеточной культуры, продукты ферментации микроорганизмов, экстракты морских организмов и растительные экстракты. А именно, «лекарственное средство, подавляющее GST-π» не ограничивается нуклеиновыми кислотами, такими как молекулы РНК-интерференции, но включает любые соединения.

Конкретные примеры лекарственного средства, подавляющего активность GST-π, включают, но не ограничиваются ими, вещества конъюгации GST-π, такие как глутатион, аналоги глутатиона (например, патентные документы WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346 и те, которые описаны в непатентной литературе 4 и т. д.), кетопрофен (непатентная литература 2), индометацин (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49(22):6265-8), этакриновая кислота, пирипрост (Tew et al., Cancer Res. 1988;48 (13):3622-), анти-GST-π-антитела и доминантно-негативные мутанты GST-π. Эти препараты являются коммерчески доступными или могут быть соответствующим образом произведены на основе известных технологий.

Лекарственное средство, подавляющие продуцирование или активность GST-π, предпочтительно представляет собой молекулы РНК-интерференции, рибозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, ДНК/РНК-химерные полинуклеотиды к ДНК, кодирующей GST-π, или векторы, экспрессирующие их из-за высокой специфичности и низкой вероятности побочных эффектов.

Подавление GST-π может быть определено на основании экспрессии GST-π или активности, подавленной в клетке, по сравнению со случаем, когда ингибитору GST-π не разрешалось воздействовать. Экспрессия GST-π может быть оценена с помощью любых известных методов, таких как, без каких-либо ограничений, метод иммунной преципитации с использованием анти-GST-π антител, ИФА, ELISA, IRA, IRMA, метод вестерн-блоттинг, иммуногистохимический метод, иммуноцитохимический метод, метод проточной цитометрии, различные методы гибридизации, метод назерн-блоттинг, метод саузерн-блоттинг и различные методы ПЦР, в которых нуклеиновая кислота способна специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей GST-π, или ее уникальным фрагментом, или транскриптом (например, мРНК), или сплайсированным продуктом нуклеиновой кислоты.

Активность GST-π может быть оценена путем анализа известных активностей GST-π, таких как, без каких-либо ограничений, связывание с белками, такими как Raf-1 (в частности, фосфорилированный Raf-1) и EGFR (в частности, фосфорилированный EGFR) любыми известными способами, такими как метод иммунной преципитации, метод вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия, метод аффинной адсорбции или метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Молекула РНК-интерференции при использовании в настоящем описании относится к любым молекулам, представляющим РНК-интерференцию, и включает в себя, но не ограничиваясь ими, двухцепочечные РНК, такие как siРНК (малая интерферирующая РНК), miРНК (микроРНК), shРНК (малая РНК, образующая шпильки), ddРНК (ДНК-направленная РНК), piРНК (Piwi-взаимодействующая РНК) и rasiРНК (ассоциированная с повторами siРНК), и их варианты. Эти молекулы РНК-интерференции коммерчески доступны или могут быть сконструированы и изготовлены на основе известной информации о последовательности, а именно, нуклеотидной последовательности, как указано в SEQ ID NO:1 и/или аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:2. Кроме того, антисмысловая нуклеиновая кислота при использовании в настоящем описании включает РНК, ДНК, ПНК и их комплексы.

ДНК/РНК-химерный полинуклеотид при использовании в настоящем описании включает в себя, но не ограничивается этим, двухцепочечные полинуклеотиды, состоящие из ДНК и РНК, ингибирующие экспрессию гена-мишени, как описано в патентной публикации JP (Kokai) No. 2003-219893 A.

Количество активного компонента, добавляемого к агенту или композиции по настоящему изобретению, может представлять собой количество, индуцирующее гибель клеток, такую как апоптоз, и/или подавление роста клеток при введении агента или композиции. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которые превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество известно или соответствующим образом определяют с помощью анализа in vitro с использованием культивируемых клеток или анализа на модельном животном, таком как мышь, крыса, собака или свинья, и эти методы испытаний хорошо известны специалистам в данной области техники. Индукцию апоптоза можно оценить с помощью различных известных методов, используя обнаружение признака, характерного для апоптоза, такого как фрагментация ДНК, связывание аннексина V с клеточной мембраной, изменения потенциала на митохондриальной мембране или активация каспазы, или терминальное дезоксиуридиновое мечение концов (TUNEL). Кроме того, подавление роста клеток может быть оценено с помощью различных известных методов, таких как подсчет количества жизнеспособных клеток в течение времени, измерение размера, объема и массы опухоли, измерение количества синтеза ДНК, метод WST-1, BrdU (бромдеоксиуридин) или метод включения 3H-тимидина. Количество добавляемого активного компонента варьируется в зависимости от лекарственной формы агента и композиции. Например, когда несколько единиц композиции используют для однократного введения, количество активного компонента, добавляемого к единичной композиции, может быть одним из нескольких равных единиц количества активного компонента, необходимого для одного введения. Такое количество, которое должно быть добавлено, может быть соответствующим образом отрегулировано специалистами в данной области техники.

Кроме того, добавление лекарственного средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет производить агент, индуцирующий гибель клеток, агент, подавляющий рост клеток, композицию, вызывающую клеточную гибель, или композицию, подавляющую клеточный рост.

Кроме того, лекарственное средство, подавляющее GST-π, используется для индукции гибели клеток или подавления клеточного роста. К тому же, может быть предусмотрен способ индуцирования гибели клеток или способ подавления роста клеток, включающий введение эффективного количества лекарственного средства, подавляющего GST-π.

Следует отметить, что оба вышеуказанных метода индукции гибели клеток, такие как апоптоз или подавление роста клеток, могут быть in vitro или in vivo методами. Кроме того, лекарственное средство для этих методов описано выше, и эффективным количеством лекарственного средства может быть количество, которое индуцирует гибель клеток или подавляет клеточный рост в клетке, в которую вводится лекарственное средство. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которые превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество известно или может быть определено соответствующим образом, например, с помощью анализа in vitro с использованием культивируемых клеток и тому подобного, и метод анализа хорошо известен специалистам в данной области техники. Индукция гибели клеток или подавление роста клеток могут быть оценены различными известными методами, включая описанные выше. Вышеуказанное эффективное количество, когда лекарственное средство вводится в определенную группу раковых клеток, не обязательно должно быть количеством, которое всегда вызывает гибель клеток или подавление роста для всех клеток в клеточной группе. Например, указанное выше эффективное количество может быть количеством, которое вызывает апоптоз или подавление роста до 1% или более, 2% или более, 3% или более, 4% или более, 5% или более, 6% или более, 8% или более, 10% или более, 12% или более, 15% или более, 20% или более, или более 25%, или более клеток в вышеуказанной группе клеток.

Агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, действуют на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF. Клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, демонстрирующую дефект роста из-за мутации в гене BRAF (как правило, раковые клетки).

В частности, агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, предпочтительно, применяют к клетке, высоко экспрессирующей GST-π (как правило, клетке рака, высоко экспрессирующей GST-π) среди клеток, демонстрирующих дефект роста из-за мутации в гене BRAF. Используемая здесь экспрессирующая GST-π раковая клетка означает клетку, имеющую значительно более высокий уровень экспрессии GST-π, по сравнению с нормальной клеткой, среди клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, и демонстрирующая дефект клеточного роста. Следует отметить, что уровень экспрессии GST-π можно измерить в соответствии с обычным методом, таким как ОТ-ПЦР или микрочип.

Мутация в гене BRAF означает мутацию, такую как делеция, замещение, добавление, вставка в аминокислотной последовательности BRAF дикого типа и мутацию в участке контроля экспрессии гена BRAF. Следует отметить, что мутация в гене BRAF здесь является так называемой мутацией с приобретением функции. А именно, ген BRAF, имеющий мутацию (иногда называемый мутантным геном BRAF), включает гены, кодирующие мутантный BRAF с повышенной активностью серин-треонин киназы, вызванной мутацией. Кроме того, мутантный ген BRAF также включает те, которые имеют мутацию в участке контроля экспрессии и увеличенный уровень экспрессии по сравнению с геном BRAF дикого типа. А именно, клетка, экспрессирующая мутантный ген BRAF, имеет свойство постоянно поддерживать нисходящий сигнальный путь (например, сигнальный путь к MEK) от BRAF путем экспрессии мутантного BRAF или увеличения уровня экспрессии BRAF.

Примеры мутантного гена BRAF включают гены, кодирующие мутантный BRAF, где валин, кодируемый кодоном 600 в гене BRAF дикого типа, замещен глутаминовой кислотой (обозначается как V600E. В дальнейшем упоминается так же), в том числе V600D, V600G, V600K, V600M, V600R, V600L, G469A, G469V, D594N и V600insT (вставка T).

Агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, способны эффективно индуцировать гибель клеток или подавлять клеточный рост даже для раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, таким образом, эффективны в качестве компонентов фармацевтической композиции для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Кроме того, лекарственная форма средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет получать фармацевтическую композицию для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. К тому же, болезнь, вызванная дефектом роста клетки, может быть подвергнута лечению и терапии путем введения эффективного количества полученной фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом.

Фармацевтическая композиция является эффективной для лечения причины заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Заболевание, вызванное раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF, не ограничено и включает в себя раки, высоко экспрессирующие GST-π, и во многих случаях, раки, имеющие мутацию в гене BRAF, включены в рак, высоко экспрессирующий GST-π.

Примеры включают, но не ограничиваются ими, саркомы, такие как фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, липосаркома, рабдомиосаркома, лейомиосаркома, ангиосаркома, саркома Капоши, лимфангиосаркома, синовиальная саркома, хондросаркома и остеосаркома, карциномы, такие как рак глаза, рак щитовидной железы (папиллярный рак), рак оболочек головного мозга, опухоль головного мозга, рак гипофиза, рак слюнных желез, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак легких (немелкоклеточный рак), рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак аппендикса, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчного протока, рак анального канала, рак почки, рак мочеточника, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак полового члена, рак яичка, рак матки (рак эндометрия), рак яичников (серозный рак яичников), рак вульвы, рак влагалища и рак кожи (злокачественная меланома), и далее лейкоз и злокачественная лимфома. Следует отметить, что «рак» в настоящем изобретении включает эпителиальную злокачественную опухоль и неэпителиальную злокачественную опухоль. Рак в настоящем изобретении может присутствовать в любой части тела, включая мозг, голову и шею, грудь, конечность, легкие, сердце, вилочковую железу, пищевод, желудок, тонкую кишку (двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку), толстую кишку (ободочную кишку, слепую кишку, аппендикс, прямую кишку), печень, поджелудочную железу, желчный пузырь, анус, почки, мочеточник, мочевой пузырь, предстательную железу, пенис, яичко, матку, яичник, вульву, влагалище, кожу, поперечнополосатую мышцу, гладкую мышцу, синовиальную мембрану, хрящ, кость, щитовидную железу, надпочечную железу, брюшину, брыжейку, костный мозг, кровь, сосудистую систему, лимфатическую систему, такую как лимфатический узел и лимфатическая жидкость.

В частности, агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, может эффективно индуцировать гибель клеток или подавлять клеточный рост даже для клетки, которая приобрела резистентность к ингибитору BRAF, среди клеток, имеющих мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент, индуцирующий гибель клеток, или агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, эффективен в качестве компонента фармацевтической композиции для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, и резистентностью к ингибитору BRAF. Кроме того, лекарственная форма средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет получать фармацевтическую композицию для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, и резистентностью к ингибитору BRAF. Кроме того, заболевание, вызванное дефектом роста клеток, можно лечить и подвергать терапии путем введения эффективного количества полученной фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом, то есть пациенту с уменьшенным терапевтическим эффектом ингибитором BRAF.

Используемый здесь ингибитор BRAF означает вещество, ингибирующее сигнальную трансдукцию от BRAF до нисходящего пути, в частности вещество, специально ингибирующее сигнальную трансдукцию, вызванную мутацией BRAF, имеющую мутацию с приобретением функции, описанную выше. Примеры известного ингибитора BRAF включают вемурафениб ((PLX4032), Cas No.: 918504-65-1, N-[3-[5-(4-хлорфенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил]-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамид) и PLX4720 (Cas No.: 918505-84-7, N-[3-(5-хлоро-1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамид).

Кроме того, примеры ингибитора BRAF включают регорафениб, дазатиниб, PLX-8394, BeiGene-283, PLX-3603, RG-7304 (CAS NO.: 213406-50-9), LY-3009120 (CAS NO.: 1454682-72-4), ребастиниб (Cas. No.: 1020172-07-9), аналоги 1Н-пиразоло[3,4-b]пиридин-5- карбоксамида, ASN-003, пролекарство вемурафениб, N-(тиофен-2-ил) производные бензамида, DCB-R0237, REDX-04988, EBI-907, EBI-945, госсипин, nanolipolee-007, TEW-0201, miРНК-3157 и производное тиазола (NMS-P186, NMS-P285, NMS-P349, NMS-P383, NMS-P396 и NMS-P730).

Кроме того, примеры ингибитора BRAF включают, помимо вышеуказанного, SB590885 (Cas No.: 405554-55-4, N,N-диметил-2-[4 -[(4Z)-4-(1-нитрозo-2,3-дигидроинден-5-илиден)-5-(1Н-пиридин-4-илиден)-1Н-имидазол-2-ил]фенокси]этанамин), ингибитор B-Raf 1 (Cas No.: 1093100-40-3, 1-N-(4-хлорфенил) -6-метил-5-N-[3-(7H-пурин-6-ил)пиридин-2-ил]изохинолин-1,5-диамин), B-Raf ингибитор 1 дигидрохлорид (Cas No.: 1191385-19-9, 1-N-(4-хлорфенил)-6-метил-5-N-[3-(7Н-пурин-6-ил)пиридин-2-ил]изохинолин-1,5-диамин; дигидрохлорид), дабрафениб (Cas No.: 1195765-45-7, N-[3-[5-(2-аминопиримидин-4-ил)-2-трет-бутил-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил]-2,6-дифторбензолсульфонамид), LGX818 (Cas No.: 1269440-17-6, метил N-[(2S)-1-[[4-[3-[5-хлор-2-фтор-3-(метансульфонамидо)фенил]-1-пропан-2-илпиразол-4-ил]пиримидин-2-ил]амино]пропан-2-ил]карбамат), HG6-64-1 (Cas No.: 1315329-43-1, см. патентный документ WO 2011/090738.), PF-04880594 (Cas No.: 1111636-35-1, 3-[[4-[1-(2,2-дифторэтил)-3-(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)пиразол-4-ил]пиримидин-2-ил]амино]пропаннитрил), ингибитор BRAF (Cas No.: 918505-61-0, N-[2,4-дифтор-3-(5-пиридин-3-ил-1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)фенил]пропан-2-сульфонамид), ингибитор B-Raf (Cas No.: 1315330-11-0, N-[4-[(4-этилпиперазин-1-ил)метил]-3-(трифторметил)фенил]-4-метил-3-[(6-метил-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)окси]бензамид), TAK-632 (Cas No.: 1228591-30-7), N-[7-циано-6-[4-фтор-3-[[2-[3-(трифторметил)фенил]ацетил]амино]фенокси]-1,3-бензотиазол-2-ил]циклопропанкарбоксамид, AZ 628 (Cas No.: 878739-06-1, 3-(2-цианопропан-2-ил)-N-[4-метил-3-[(3-метил-4-оксохиназолин-6-ил)амино]фенил]бензамид), RAF265 (Cas No.: 927880-90-8, 1-метил-5-[2-[5-(трифторметил)-1H-имидазол-2-ил]пиридин-4-ил]окси-N-[4-(трифторметил)фенил]бензимидазол-2-амин), CEP-32496 (Cas No.: 1188910-76-0, 1-[3-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)оксифенил]-3-[5-(1,1,1-трифтор-2-метилпропан-2-ил)-1,2-оксазол-3-ил]мочевина), GDC-0879 (Cas No.: 905281-76-7, 2-[4-[(1E)-1-гидроксиимино-2,3-дигидроинден-5-ил]-3-пиридин-4-илпиразол-1-ил]этанол), сорафениба тозилат (Cas No.: 475207-59-1, 4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]карбамоиламино]фенокси]-N-метилпиридин-2-карбоксамид; 4-метилбензолсульфокислота), дабрафениба мезилат (Cas No.: 1195768-06-9, N-[3-[5-(2-аминопиримидин-4-ил)-2-трет-бутил-1,3-тиазол-4-ил]-2 фторофенил]-2,6-дифторобензолсульфонамид; метансульфокислота), CEP-32496 гидрохлорид (Cas No.: 1227678-26-3, 1-[3-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)оксифенил]-3-[5-(1,1,1-трифтор-2-метилпропан-2-ил)-1,2-оксазол-3-ил]мочевина; гидрохлорид) и сорафениб (Cas No.: 284461-73-0, 4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]карбамоиламино]фенокси]-N-метилпиридин-2-карбоксамид).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться в комбинации с другими активными компонентами, отличными от лекарственного средства, подавляющего GST-π. Используемые в комбинации здесь включают, например, введение других активных компонентов в виде отдельных фармацевтических препаратов и введение других активных компонентов в форме комбинированного агента, по меньшей мере, с одним из других лекарственных средств. Когда другие активные компоненты вводят в виде отдельных фармацевтических препаратов, препарат, содержащий другие активные компоненты, может быть введен перед другими препаратами, вместе с другими препаратами или после других препаратов.

Вышеуказанные ингибиторы BRAF могут быть соответствующим образом использованы для таких других активных компонентов. Кроме того, другие активные компоненты также включают эффективные для лечения заданного заболевания. Например, когда заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак, противораковый агент можно использовать в комбинации. Примеры противоракового агента включают алкилирующие агенты, такие как ифосфамид, гидрохлорид нимустина, циклофосфамид, дакарбазин, мелфалан и ранимустин, антиметаболиты, такие как гидрохлорид гемцитабина, эноцитабин, цитарабин-окфосфат, препараты цитарабина, тегафур-урацил, тегафур-гимерацил-отерацил калий комбинированные агенты (например, TS-1), доксифлуридин, гидроксикарбамид, фторурацил, метотрексат и меркаптопурин, противоопухолевые антибиотики, такие как гидрохлорид идарубицина, гидрохлорид эпирубицина, гидрохлорид даунорубицина, гидрохлорид доксорубицина, гидрохлорид пирарубицина, гидрохлорид блеомицина, сульфат пепломицина, гидрохлорид митоксантрона и митомицин С, алкалоиды, такие как этопозид, гидрохлорид иринотекана, динартрат винорелбина, гидрат доцетаксела, паклитаксел, сульфат винкристина, сульфат виндезина и сульфат винбластина, агенты гормональной терапии, такие как анастрозол, цитрат тамоксифена, цитрат торемифена, бикалютамид, флутамид и фосфат эстрамустина, комплексы платины, такие как карбоплатин, цисплатин (CDDP) и недаплатин, ангиогенные ингибиторы, такие как талидомид, неовастат и бевацизумаб и L-аспарагиназа.

Когда активный компонент в каждом из агентов, композиций и способе лечения по настоящему изобретению, описанный в настоящем описании, представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как молекула РНК-интерференции, рибозима, антисмысловая нуклеиновая кислота или ДНК/РНК-химерный полинуклеотид, которые могут быть использованы непосредственно в виде голой нуклеиновой кислоты или могут также поддерживаться различными векторами. Для вектора можно использовать любой из известных векторов, таких как плазмидные векторы, фаговые векторы, фагмидные векторы, космидные векторы, вирусные векторы. Вектор, который будет поддерживаться, предпочтительно, содержит, по меньшей мере, промотор, усиливающий экспрессию нуклеиновой кислоты, и нуклеиновая кислота в этом случае предпочтительно лигируется оперативно с промотором. Нуклеиновая кислота, лигированная оперативно с промотором, означает, что нуклеиновая кислота и промотор расположены так, что белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, может быть соответствующим образом получен под действием промотора. Вектор может быть или не быть реплицируемым в клетке-хозяине, и транскрипция гена может быть проведена вне или внутри ядра в клетке-хозяине. В последнем случае нуклеиновая кислота может быть включена в геном клетки-хозяина.

Кроме того, активный компонент может также поддерживаться различными невирусными липидами или белковыми носителями. Такой носитель не ограничен и примеры включают холестерины, липосомы, промоторы антител, наночастицы циклодекстрина, слитые пептиды, аптамеры, биодеградируемые сополимеры и полимеры полимолочной кислоты, благодаря которым может быть увеличена эффективность внутриклеточного введения (например, см. Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008; 68(5):1247-50 и т.д.). Особенно полезны катионные липосомы и полимеры (например, полиэтиленимин и т. д.). Другие примеры пригодного в качестве такого носителя полимера включают те, которые описаны в патентном документе US 2008/0207553 и US 2008/0312174.

Для каждой фармацевтической композиции по настоящему изобретению, описанной в настоящем описании, активный компонент может быть объединен с другими вспомогательными компонентами при условии, что эффекты активного компонента не будут затронуты. Примеры вспомогательного компонента включают другие химиотерапевтические агенты, фармакологически приемлемые носители, эксципиенты и растворители. Кроме того, в зависимости от пути введения и способа высвобождения лекарственного средства вышеуказанная композиция также может быть покрыта подходящим материалом, например, энтеросолюбильным покрытием или временным распадающимся материалом, или включается в подходящую систему высвобождения лекарственного средства.

Каждый агент и композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут вводиться различными путями, включая как пероральные, так и парентеральные, и примеры пути введения включают, но не ограничиваются ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, локальный, внутриопухолевый, внутриутробный, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, внутрижелудочковый, чрезслизистый, трансдермальный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриутробный, или может быть приготовлен в виде лекарственной формы, подходящей для каждого пути введения. Можно использовать любую известную лекарственную форму и способ приготовления (например, см. «Hyojun Yakuzaigaku» («Standard Pharmaceutics» на английском языке), edited by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, и т. д.).

Лекарственная форма, подходящая для перорального введения, не ограничена, и примеры включают порошки, гранулы, таблетки, капсулы, растворы, суспензии, эмульсии, гели и сиропы, а примеры лекарственной формы, подходящей для парентерального введения, включают инъекции, такие как инъекции раствора, суспензионные инъекции, инъекции эмульсии и приготовленные для немедленного применения инъекции. Препарат для парентерального введения может быть в форме водного или неводного изотонического стерильного раствора или суспензии.

Каждый агент или композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут также быть нацелены на определенную ткань или клетку. Целеуказание может быть достигнуто с помощью любого известного метода. Когда он предназначен для доставки к раку, примеры используемых методов включают в себя, но не ограничиваясь ими, пассивное целеуказание, в котором препарат, предпочтительно, имеет размер от 50 до 200 нм, в частности, от 75 до 150 нм, для получения эффектов EPR (повышенной проницаемости и удерживания) и активного целеуказания, в котором лиганд, такой как CD19, HER2, трансферриновый рецептор, рецептор фолиевой кислоты, рецептор VIP, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9(2): E128-47), RAAG10 (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2005-532050), PIPA (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2006-506071) или KID3 (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2007-529197), пептид, имеющий мотив RGD или мотив NGR, F3 или LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68) используют в качестве таргетирующего агента. Кроме того, известно, что ретиноид и его производное полезны в качестве таргетирующего агента в раковой клетке (патентный документ WO 2008/120815), и, таким образом, можно также использовать носитель, содержащий ретиноид в качестве таргетирующего агента. Носители описаны в патентных документах WO2009/036368, WO 2010/014117 и WO 2012/170952, в дополнение к вышеуказанной литературе.

Каждый агент или композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут поставляться в любой форме и, с точки зрения стабильности при хранении, могут быть предоставлены в форме приготовления для немедленного применения на медицинском участке или рядом с врачом и/или фармацевтом, медсестрой или другому медицинскому персоналу. Такая форма особенно полезна, когда агент или композиция по настоящему изобретению содержат компоненты, которые трудно хранить стабильно, такие как липиды, белки и нуклеиновые кислоты. В этом случае агент или композиция по настоящему изобретению предоставляется в 1 или 2, или более емкостях, содержащих по меньшей мере, один важный элемент, и подготовленный перед использованием, например, в течение 24 ч, предпочтительно до 3 ч, более предпочтительно, непосредственно перед использованием. Для подготовки можно подходящим образом использовать реагент, растворитель и оборудование для подготовки, обычно доступные на подготовительном участке.

Таким образом, настоящее изобретение относится к набору для подготовки композиции, содержащему 1 или 2, или более емкостей, содержащих активные компоненты, которые могут содержаться в каждом агенте или композиции по настоящему изобретению отдельно или в комбинации, а также необходимые элементы каждого агента или композиции для предоставления в виде такого набора. Набор по настоящему изобретению может включать, помимо вышеперечисленного, инструкции, описывающие способ подготовки и способ введения каждого агента или композиции по настоящему изобретению, такие как письменная информация и цифровой носитель данных, такой как CD или DVD. Кроме того, набор по настоящему изобретению может включать в себя все необходимые элементы для завершения каждого агента или композиции по настоящему изобретению, но не обязательно включать все элементы. Таким образом, набор по настоящему изобретению может не включать реагент и растворитель, обычно доступные на медицинском участке и экспериментальные средства, такие как стерилизованная вода, физиологический раствор и раствор глюкозы.

Эффективное количество в каждом способе лечения по настоящему изобретению, описанное в настоящем описании, представляет собой, например, количество, которое облегчает симптом заболевания или задерживает, или останавливает развитие заболевания, предпочтительно, количество, которое подавляет или излечивает заболевание. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которое превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество соответствующим образом определяют с помощью испытания in vitro с использованием культивируемых клеток или испытания на модельном животном, таком как мышь, крыса, собака или свинья, и эти методы испытаний хорошо известны специалистам в данной области техники. Доза лекарственного средства, используемого в способе лечения по настоящему изобретению, известна специалистам в данной области техники или может быть соответствующим образом определена вышеуказанными испытаниями.

Конкретная доза активного компонента, вводимого при способе лечения по настоящему изобретению, описанном в настоящем описании, может быть определена с учетом различных состояний субъекта, нуждающегося в лечении, таких как степень тяжести симптомов, общие состояния здоровья субъекта, возраст, масса тела, пол субъекта, диета, время и частота введения, вводимые совместно лекарственные средства, реактивность на терапии, лекарственная форма и соответствие терапии.

Путь введения включает различные пути, включая пероральный и парентеральный, такие как оральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, локальный, внутриопухолевый, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, внутрижелудочковый, чрезслизистый, трансдермальный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриутробный.

Частота введения варьируется в зависимости от свойства используемого агента или композиции и состояний субъекта, включая вышеуказанное, но может быть, например, несколько раз в день (более конкретно, два раза, 3, 4 или 5 раз, или более в день), раз в день, каждые несколько дней (точнее, каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней), каждую неделю, каждые несколько недель (точнее, каждые 2, 3 или 4 недели).

Термин «субъект», используемый в настоящем описании, означает любого биологического индивидуума, предпочтительно животных, еще более предпочтительно, млекопитающих, а также, более предпочтительно, людей. В настоящем изобретении субъект может быть здоровым или пораженным заболеванием, но, когда предполагается лечение конкретного заболевания, субъект обычно означает субъекта, который поражен или подвержен влиянию заболевания.

Кроме того, термин «лечение», используемый в настоящем описании, включает в себя приемлемые с медицинской точки зрения все виды профилактического и/или терапевтического вмешательства с целью выздоровления, временной ремиссии или профилактики заболевания. Например, термин «лечение» включает в себя приемлемые с медицинской точки зрения вмешательства с различными целями, включая задержку или остановку развития заболевания, регрессирование или исчезновение поражения, предотвращение начала или предотвращение повторения.

Лекарственное средство, подавляющее GST-π, демонстрирует индукцию гибели клеток и/или подавление клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, как описано выше. Таким образом, при использовании подавления GST-π как индикатора, можно скринировать агент, индуцирующий гибель клеток, и/или агент, подавляющий клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. А именно, вещество, способное подавлять GST-π, может быть веществом-кандидатом для агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF (как правило, раковые клетки).

Например, тестируемое вещество контактирует с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF, в качестве примера раковой клетки, для измерения уровня экспрессии GST-π в клетке. Когда уровень экспрессии в случае контакта с тестируемым веществом уменьшается по сравнению с уровнем экспрессии, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, тестируемое вещество может быть выбрано в качестве вещества-кандидата для лекарственного средства, подавляющего GST-π.

Тестируемое вещество здесь не ограничено и может быть любым веществом. Тестируемое вещество может представлять собой односоставное вещество или смесь, состоящую из множества составляющих компонентов. Тестируемое вещество может содержать композицию, содержащую неустановленные вещества, такие как экстракт из микроорганизма или культуральная жидкость, или композицию, содержащую известные композиции в заданном соотношении компонентов. Кроме того, тестируемым веществом может быть любой из белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, органических соединений и неорганических соединений.

Пример

Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, но технический объем настоящего изобретения не ограничивается этим.

[Пример 1]

В настоящем примере изучался эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, было разрешено воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF. Во-первых, в качестве раковой клетки, имеющей мутацию (V600E) в гене BRAF, культивировали 1 тип клеточной линии колоректального рака (CACO-2) и 4 типа клеточных линий меланомы (A375, SK-MEL-28, A2058, Malme-3М) культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Используемой средой были MEM + 20%, FBS + 0,1 мМ и NEAA для CACO-2, DMEM + 15% и FBS для A375, EMEM + 10% и FBS для SK-MEL-28, DMEM + 10% и FBS для A2058, и IMDM + 20% и FBS для Malme-3M, ко всем из которых был добавлен антибиотик.

За день до трансфекции каждые клетки высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя среду, свободную от антибиотиков, так что достигалось 10-20% монослоя. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO: 3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды. Среду промывали PBS 1 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде, содержащей антибиотик. Клетки суспендировали в 5 мл среды и высевали в чашку Петри размером 60 мм (CACO-2: 0,4×10⁵ клеток, A375: 1,0×10⁵ клеток, SK-MEL-28: 0,2×10⁵ клеток, A2058: 0,8×10⁵ клеток, Malme-3M: 0,6×10⁵ клеток).

Такую же операцию проводили в качестве контрольных экспериментов с использованием реактива «Scramble siRNA» (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO:4)) или «AllStars Negative Control siRNA» (siКонтроль) (QIAGEN). После трансфекции с помощью GST-π siРНК число клеток подсчитывалось на День 0 и День 5, соответственно.

Дополнительно, в настоящем примере, экспрессия GST-π была подтверждена вестерн-блоттингом, соответственно, когда GST-π siРНК разрешалось воздействовать на клетки CACO-2, клетки A375, клетки SK-MEL-28, клетки A2058 и клетки Malme-3M. А именно, используя клетки, собранные через 3 д после трансфекции GST-π siРНК, был проведен анализ вестерн-блоттинга на нокдаун GST-π. Собранные клетки сначала промывали холодным PBS, к которому добавляли холодный лизисный буфер (1% NP-40, 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, дополненный реактивом «Mini EDTA-free» (Roche) и «PhosSTOP» (Roche)), охлаждали на льду и инкубировали в течение 30 мин для солюбилизации. Затем проводили центрифугирование при 4°C, 15000 об/мин в течение 15 мин, получая таким образом клеточный экстракт. В полученном клеточном экстракте количественно определяли белки с использованием набора «Micro BCA Protein Assay Kit» (Thermo SCIENTIFIC). Затем 20 мкг экстракта клеток денатурировали в условии восстановления и ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием «MULTIGEL II mini 4/20» (13 Вт) (Cosmo Bio) для разделения белков. После завершения ДСН-ПААГ-электрофореза белки транскрибировали на PVDF-мембрану с использованием устройства для блоттинга. Блоттинг-мембрану инкубировали в PBS с 5% снятого латекса/0,05% Tween 20 (сокращенно PBS-T) при 4°C в течение 16 ч для блокировки. Затем мембрану подвергали взаимодействию с «anti-GST-π» (MBL), разведенным в растворе «Membrane blocking Solution» (Invitrogen), при 4°C в течение 16 ч. Реакцию вторичного антитела проводили при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием кроличьего антитела, помеченного пероксидазой хрена (HRP). Обнаружение полосы сигнала проводили на рентгеновской пленке методом хемилюминесценции с использованием реактивов «ECL Western Blocking Detection Reagents» (GE Healthcare). Промывку между каждой из операций проводили путем встряхивания в течение 5 мин, 4 раза, с использованием PBS-T.

Результаты на линии клеток колоректального рака показаны на Фиг. 1, а результаты на линии клеток меланомы показаны на Фиг. 2. Следует отметить, что на Фиг. 1 и 2 показаны результаты подсчета числа клеток и результаты анализа вестерн-блоттинга. Как показано на Фиг. 1 и 2, как в клеточной линии колоректального рака, так и линии клеток меланомы, способность к росту клеток заметно подавлялась из-за нокдауна GST-π GST-π siРНК, который является лекарственным средством, подавляющим GST-π, в раковых клетках, имеющих мутацию в гене BRAF. Мутация в гене BRAF была обнаружена в высоко злокачественных опухолях и, как известно, в колоректальных раках, как фактор неблагоприятного прогноза при неизменяемых колоректальных раках. У половины пациентов с меланомой имеются мутации в гене BRAF, и когда метастатический потенциал высок, смертность и злокачественность являются самыми высокими. Результаты настоящего примера показывают, что лекарственное средство, подавляющее GST-π, эффективено при подавлении клеточного роста раковых клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, что повышает ожидания для новой терапии этих трудноизлечимых раковых заболеваний.

[Пример 2]

В настоящем примере изучали эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, и ингибитору BRAF, разрешалось воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF.

Во-первых, 1 тип клеточной линии колоректального рака (CACO-2) и 2 типа клеточных линий меланомы (SK-MEL-28 и A2058), соответственно, культивировали таким же образом, как в примере 1, и за день до трансфекции, высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя среду, свободную от антибиотиков, так что достигалось 10-20% монослоя. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO:3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды. Среду промывали PBS 1 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде, содержащей антибиотик. Клетки суспендировали в 5 мл среды и высевали в чашку Петри размером 60 мм (CACO-2: 0,4×10⁵ клеток, SK-MEL-28: 0,2×10⁵ клеток и A2058: 0,8×10⁵ клеток). Такую же операцию проводили как контрольный эксперимент с использованием «AllStars Negative Control siRNA» (siКонтроль) (QIAGEN). На День 1 после трансфекции к среде добавляли PLX4720 (Selleck), ингибитор BRAF, чтобы достичь концентрации 40 мкM для CACO-2, 0,7 мкM для SK-MEL-28 и 10 мкM для A2058, и культивирование продолжали до Дня 5. Контроль, обработанный PLX4720, культивировали путем добавления растворителя DMSO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Анализ роста проводили путем подсчета числа клеток с Дня 0 по День 5 после трансфекции.

На Фиг. 3 показан результат подсчета числа клеток CACO-2, на Фиг. 4 показаны результаты подсчета числа клеток SK-MEL-28 и A2058. Как видно на Фиг. 3, было высказано предположение о том, что по сравнению со случаем, когда GST-π siРНК разрешено воздействовать самостоятельно на клеточную линию колоректального рака (линия CACO-2, имеющая мутацию в гене BRAF), или случаем, когда PLX4720 разрешено воздействовать на клеточную линию колоректального рака вместе с siКонтролем, эффект подавления клеточного роста был значительным в том случае, когда GST-π siРНК и PLX4720 разрешено воздействовать в комбинации на такой клеточной линии. Кроме того, как показано на Фиг. 4, было высказано предположение о том, что по сравнению со случаем, когда GST-π siРНК разрешено воздействовать самостоятельно на клеточных линиях меланомы (SK-MEL-28 и A2058, имеющие мутацию в гене BRAF) или случаем, когда PLX4720 разрешено воздействовать на клеточные линии меланомы вместе с siКонтролем, эффект подавления клеточного роста был значительным в том случае, когда GST-π siРНК и PLX4720 разрешено воздействовать в комбинации на таких линиях клеток меланомы.

[Пример 3]

В настоящем примере изучали эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, было разрешено воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF и устойчивость к ингибитору BRAF (клетка, резистентная к ингибитору BRAF).

<Подсчет числа клеток>

Клетки, резистентные к ингибитору BRAF, используемые в настоящем примере, получали следующим образом. Линию клеток меланомы A375, используемую в примере 1, инкубировали в среде DMEM, содержащей антибиотик, к которой добавляли 1-5 мкМ PLX4720 (Selleck) и 15% FBS при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂ в течение 1 мес. Линия клеток, выжившая после 1-мес инкубации, определялась как устойчивые к PLX4720 клетки A375 и использовалась в настоящем примере.

В настоящем примере за день до трансфекции устойчивые к PLX4720 клетки A375 клетки высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя свободную от антибиотиков среду DMEM, содержащую 15% FBS, так что достигалась концентрация 0,5×10⁶ клеток/10 мл. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO:3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды DMEM, содержащей 15% FBS. Среду промывали PBS 2 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде DMEM, содержащей антибиотик и 15% FBS. Клетки в суспензии высевали в чашку Петри размером 60 мм, так что достигалась концентрация 1,0×10⁵ клеток/5 мл. Такую же операцию проводили в качестве контрольных экспериментов с использованием реактива «Scramble siRNA» (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO:4)) или «AllStars Negative Control siRNA» (QIAGEN). После трансфекции с помощью GST-π siРНК число клеток подсчитывалось на День 0, 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно.

<Подтверждение экспрессии GST-π>

Экспрессия GST-π была подтверждена вестерн-блоттингом, когда GST-π siРНК было разрешено воздействовать на устойчивые к PLX4720 клетки A375, как описано выше. А именно, используя клетки, собранные в каждый из указанных выше периодов после трансфекции GST-π siРНК, проводили анализ вестерн-блоттинга на нокдаун GST-π.

Собранные клетки сначала промывали холодным PBS, к которому добавляли холодный лизисный буфер (1% NP-40, 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, дополненный реактивом «Mini EDTA-free» (Roche) и «PhosSTOP» (Roche)), охлаждали на льду и инкубировали в течение 30 мин для солюбилизации. Проводили центрифугирование при 4°C, 15000 об/мин в течение 15 мин, получая таким образом клеточный экстракт. В полученном клеточном экстракте количественно определяли белки с использованием набора «Micro BCA Protein Assay Kit» (Thermo SCIENTIFIC). Затем 20 мкг экстракта клеток денатурировали в условии восстановления и ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием «MULTIGEL II mini 4/20» (13 Вт) (Cosmo Bio) для разделения белков. После завершения ДСН-ПААГ-электрофореза белки транскрибировали на PVDF-мембрану с использованием устройства для блоттинга. Блоттинг-мембрану инкубировали в PBS с 5% снятого латекса/0,05% Tween 20 (сокращенно PBS-T) при 4°C в течение 16 ч для блокировки. Затем мембрану подвергали взаимодействию с «anti-GST-π» (MBL), разведенным в растворе «Membrane blocking Solution» (Invitrogen), при 4°C в течение 16 ч. Реакцию вторичного антитела проводили при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием кроличьего антитела, помеченного пероксидазой хрена (HRP). Обнаружение полосы сигнала проводили на рентгеновской пленке методом хемилюминесценции с использованием реактивов «ECL Western Blocking Detection Reagents» (GE Healthcare). Промывку между каждой из операций проводили путем встряхивания в течение 5 мин, 4 раза, с использованием PBS-T.

<Результат>

В последние годы клеточная линия меланомы с приобретенной резистентностью к ингибитору BRAF, понимается как связанная с рецидивом меланомы. Соответственно, GST-π был нокаутирован с использованием резистентных к PLX4720 A375 для исследования того, способствует ли GST-π зависимости CRAF в резистентной к ингибитору BRAF меланоме. Измерение клеточного роста клеток выявило заметный эффект подавления роста (Фис. 5). Когда был подтвержден нокдаун GST-π, экспрессия GST-π было подавлена на День 2 и День 3 (Фиг. 6).

Настоящий пример показывает, что рост клеток, имеющих мутацию в гене BRAF и устойчивость к ингибитору BRAF (клетка, резистентная к ингибитору BRAF), был эффективно подавлен. Согласно результатам, можно ожидать эффекта для предотвращения или уменьшения заболеваний, в которых резистентная к BRAF клетка является фактором, например, рецидива меланомы.

Все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные здесь, должны быть включены сами по себе в настоящее описание посредством ссылки.

1. Способ индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий этап введения лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

2. Способ подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий этап введения лекарственного средства, подавляющего GST-π, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

3. Способ по п. 1 или 2, где мутация представляет собой мутацию V600E.

4. Способ по п. 1 или 2, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой раковую клетку, высокоэкспрессирующую GST-π.

5. Применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

6. Применение по п. 5, где рак представляет собой рак, высокоэкспрессирующий GST-π.

7. Применение по п. 5, где раком является колоректальный рак или меланома.

8. Способ скрининга лекарственного средства для индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий

этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивой к ингибитору BRAF,

этап измерения экспрессионного уровня продукции GST-π в клетке и

этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

9. Способ скрининга лекарственного средства для подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий

этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивой к ингибитору BRAF,

этап измерения экспрессионного уровня продукции GST-π в клетке и

этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.

10. Применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, и ингибитора BRAF, где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них, для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.