Церебропротектор метаболического действия и способ его получения
Владельцы патента RU 2761549:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к соединению формулы I. Технический результат: получено новое соединение, обладающее церебропротекторной активностью в условиях фокальной ишемии головного мозга, которое может найти применение в медицине для коррекции метаболических нарушений в мозговой ткани при ее ишемическом поражении. 6 ил., 1 табл., 3 пр.
Церебропротекция представляет собой стратегию комплексной терапии заболеваний головного мозга, характеризующихся потерей структурно-функциональной целостности нейронов. Применительно к ишемическому инсульту церебропротекторное воздействие направлено на предотвращение роста зоны некроза головного мозга и сохранение активности клеток в области «ишемической полутени» или «пенумбры». [Savitz SI, Baron JC, Yenari MA, Sanossian N, Fisher M. Reconsidering Neuroprotection in the Reperfusion Era. Stroke. 2017; 48(12):3413-3419. doi:10.1161/STROKEAHA.117.017283]. В большинстве случаев действие лекарственных препаратов, обладающих церебропротекторной активностью, основано на подавлении отдельных звеньев патогенетического повреждения головного мозга в результате прекращения тока крови, т.е. элиминацию «ишемического каскада». [Neuhaus АА, Couch Y, Hadley G, Buchan AM. Neuroprotection in stroke: the importance of collaboration and reproducibility. Brain. 2017; 140(8):2079-2092. doi:10.1093/brain/awx126]. Несмотря на то, что было проведено более 200 клинических испытаний потенциально эффективных церебропротекторов, убедительные данные о клинической эффективности церебропротекторных средств на сегодняшний день отсутствуют. Однако научный и практический интерес к фармакологически активным веществам, восстанавливающим структурно-функциональные свойства мозговой ткани, не уменьшается.
Несмотря на многочисленные недостатки, церебропротекторной терапии существует огромная потребность в данных препаратах. Как известно, главная цель терапия инсульта заключается в восстановлении кровотока в головном мозге в течение определенного времени («терапевтическое окно»). Вторичная цель состоит в том, чтобы модулировать любые факторы, которые могут усугубить повреждение, на что и направлено действие церебропротекторов. К основным направлениям церебропротекторного воздействия относятся: подавление эксайтотоксичностиглутамата, окислительного стресса, процессов нейровоспаления, апоптоза нейронов зоны «пенумбры». [Schain М, Kreisl WC. Neuroinflammation in Neurodegenerative Disorders-a Review. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(3):25. doi: 10.1007/s11910-017-0733-2]. Одним из перспективных векторов развития церебропротекторов как фармакотерапевтической группы является разработка средств метаболического действия, применение которых позволит существенно улучшить метаболические процессы в ишемизированной мозговой ткани, устраняя негативное влияние нескольких взаимосвязанных патогенетических механизмов повреждения головного мозга.
Целью данного изобретения является разработка способа получения и применение производного хромон-3-альдегида в качестве церебропротекторного средства метаболического действия. Ближайшими структурными аналогами производного 3-формилхромона являются соединения, представленные в RU 2052459 С1 и US4008252A, а также соединение ATACL, оказывающее церебропротекторное действие [Воронков А.В., Абаев В.Т., Оганесян Э.Т., Поздняков Д.И. Некотбрые аспекты церебропротекторной активности 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты при ишемическом повреждении головного мозга в эксперименте Медицинский вестник Северного Кавказа. 2018. Т. 13. №1-1, С. 90-93].
К раствору 16,6 г. 2-гидрокси-5-метоксиацетофенона в 50 мл. безводного диметилформамида охлаждаемого в бане льда с солью, прибавляет по каплям за 40 мин. 19 мл (31 г., 203 ммоль) хлорокиси фосфора таким образом, чтобы температура реакционной смеси не превышала 0 Со. Перемешивают при этой температуре 1 час, затем реакционную смесь убирали из охлаждающей бани и оставляли перемешиваться в течение 12 часов. Затем реакционную смесь выливали на 300 граммов мелкого льда и после таяния льда смесь перемешивали 5 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали небольшим количеством воды и сушили на воздухе. Выход хроматографически чистого вещества, которое использовали на следующей стадии как есть 15.5 г. (75%).
К раствору 2.69 г. (13.17 ммоль) 6-метокси-3-формилхромона и 3.72 г. (13.2 ммоль) 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксиацетофенона в 15 мл ледяной уксусной кислоты прибавляли одну каплю (0.03 мл) 72% хлорной кислоты и смеь перемешивали при нагревании до 100 градусов два часа. Затем реакционную смесь выливали в 100 мл. воды, выпавший осадок отфильтровывали и переносили в стакан. Добавляли 20 мл спирта, перемешивали 10 мин. И отфильтровывали осадок. Эту операцию повторяли дважды и светло-желтый остаток перекристаллизовывали из большого количества этилацетата. Выход 1.25 г. (21.8%). Т.пл. 236-238 Со (возг.). Идентификацию полученного соединения проводили с помощью ЯМР-спектроскопии. Спектр 1Н ЯМР (400 МГц), δ, м.д. в DMSO-d6: 1,53 (с, 18Н, 6СН3); 3,95-(с, 3Н, ОСН3); 5,79 (с, 1Н, СН=); 7,28-7,32 (д, J=15,3, 1Н, СН=); 7,46-7,48 (д, J=3,1, 2Н, ArH); 7,68-7,69 (д, J=3,0, 1Н, хромона); 8,02 (с, 2Н, хромона); 8,21 (с, 1Н, хромона); 8,64 (д, 1Н, ОН). В спектре 1Н ЯМР сигналы протонов виниленовой группы в 3 положении хромонового ядра проявляются в виде дублетов с константами спин-спинового взаимодействия более 14 Гц (J=15,3). Эти спектральные характеристики свидетельствуют о том, что двойная связь виниленового фрагмента имеет трансоидную конфигурацию, и подтверждают структуру полученного соединения: 3-[(е)-3-(3,5-дитрет-бутил-4-гидроксифенил)-3-оксопроп-1-енил]-6-метокси-хромен-4-она (рис. 6).
Пример 2.
Оценку «острой токсичности» производного хромон-3-альдегида под шифром 3FС проводили на мышах-самцах линии Balb/c, применением протокола «UpandDown», основные положения которого представлены в OECD №425. Соединение вводили ре ros дробно с 2-х часовым временным интервалом, учитывая величину максимально допустимого объема перорального введения для данного вида животных в следующем интервале доз: 175; 550; 1750; 5000 мг/кг (основное тестирование) и 5000 мг/кг (лимит-тест) Группа контроля (n=10) получала дистиллированную воду в эквиобъемном количестве. Наблюдение за животными осуществляли на протяжении 14-дней, при этом в первые сутки мониторинг производился непрерывно. Регистрировали гибель животных, на основании чего рассчитывали показатель LD50 методом максимального правдоподобия. [Dixon W.J. Staircase Bioassay: The Up-and-Down Method. Neurosci. Biobehav. Rev. 1991; 15; 47-50].
В ходе оценки «острой токсичности» соединения 3FC было установлено, что в условиях лимит-теста при введении изучаемого соединения в дозе 5000 мг/кг (per os) гибели четырех последовательных животных отмечено не было (табл. 1). В связи с этим руководствуясь положениями OECD №425 к проведению основного тестирования; не приступали, а за показатель LD50соединения 3FC принималось максимально введенная доза, т.е. 5000 мг/кг (per os). Таким образом, исследуемое соединение 3FC можно отнести к 5 классу токсичности согласно GHS - классификации [Globally Harmonized System of Classification andi Labelling of Chemicals (GHS) Part 3 Health Hazards, United Nations, 2017)].
Пример 3.
Влияние производного хромон-3-альдегида в дозе 1/100 от LD50 (50 мг/кг) при пероральном введении на изменение зоны некроза головного мозга, |онцентрации лактата, содержания АТФ, уровень мозгового кровотока и изменение когнитивных реакций у животных оценивали на модели необратимой окклюзии средней мозговой артерии. Эксперимент выполнен на 40 крысах-самцах Wistar массой 220±10% грамм, которым моделировали фокальную ишемию головного мозга по методу Tamura (1981). Ход операции: под хлоралгидратным наркозом (350 мг/кг) область ниже и правее глаза депилировали, делали надрез и раздвигали мягкие ткани, обнажая отросток скуловой кости, который удаляли. Далее буром проделывали трепанационное отверстие и термокоагулятором пережигали среднюю мозговую артерию под местом ее пересечения с обонятельным трактом. В дальнейшем, по возможности, восстанавливали топографию мягких тканей. Шов обрабатывали 5% раствором йода [Tamura A, Graham DI, McCulloch J, Teasdale GM. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1981; 1(1):53-60].
В качестве препарата сравнения использовали этилметилгидроксипиридина сукцинат (Мексидол, Фармасофт) в дозе 100 мг/кг. Группа негативного контроля (НК) - терапию не получала. К группе ложнооперированных животных (ЛО) применялись все последовательные процедуры за исключением пережигания средней мозговой артерии. Количество животных в каждой экспериментальной группе равнялось 10. Соединение 3FCu препарат сравнения вводили через 30 минут после моделирования ишемии и далее однократно в сутки на протяжении 3-х дней. На 4-й день у крыс осуществляли регистрацию исследуемых показателей.
Изменение когнитивных реакций у животных оценивали в тесте «Водный лабиринт Морриса».
Установка «Водный лабиринт Морриса», представляет собой арену диаметром 150 см с высотой стенок 60 см с подвижной площадкой диаметром 10 см, заполненной подкрашенной водой [Установка НПК «Открытая наука», Россия]. При проведении исследования установка заполнялась до уровня 50 см. До моделирования ишемии головного мозга крыс обучали процедуре тестирования: в течении 120 сек. животными предоставлялась возможность самостоятельно найти площадку, при условии не выполнения задачи крыс перемещали на площадку на 10 сек. после чего тестирование повторяли. Животные, повторно не выполнившие задачу исключались из эксперимента. После воспроизведения ишемии головного мозга в аналогичных условиях тест повторяли, при этом оцениваемым параметром служил латентный период достижения площадки в сек. [Vorhees CV, Williams МТ. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 2006; 1(2):848-858.doi:10.1038/nprot.2006.116].
Изменение уровня мозгового кровотока у животных определяли методом ультразвуковой допплерографии в бассейне средней мозговой артерии. В работе использовали систему допплерографа УЗОП-010-01 с рабочей частотой 25 МГц и программного обеспечения «ММ-Д-К-Minimax Doppler» v.2.0. (Санкт-Петербург, Россия). Оцениваемым параметром служило изменение средней систолической линейной скорости мозгового кровотока [Воронков А.В., Поздняков Д.И., Хури Е.И., Воронкова М.П. Влияние производного пиримидин-4-1(н)-она на вазодилятирующую функцию эндотелия сосудов у крыс в условиях экспериментальной черепно-мозговой травмы. Дневник казанской медицинской школы. 2018. №3 (21). С. 23-27].
Зону некроза головного мозга у животных оценивали трифенилтетразолиевым методом, основанном на разности экстинкций хлороформных экстрактов формазана между интактным и ишемизированным полушариями мозга [Pozdnyakov DI, Nygaryan SA, Voronkov AV, et.al. Ethylmethylhydroxypyridine succinate, acetylcysteine and choline alphoscerate improve mitochondrial function under condition of cerebral ischemia in rat. Bangladesh J Pharmacol. 2019; 14: 152-58]. Концентрацию молочной кислоты оценивали в сыворотке крови, которую получали центрифугированием свежей цитратной крови в режиме 3500 RPM, 10 Мин. Содержание лактата определяли в ферментативной реакции с образованием квинонимина, концентрация которого пропорциональна содержанию молочной кислоты в образце. Концентрацию АТФ оценивали в супернатанте мозговой ткани, получаемого центрифугированием PBS-гомогената головного мозга (рН 7,2) в режиме 5 мин. 10000g. Содержание АТФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием видоспецифичных наборов реактивов производства CloudClone.
Обработку полученных результатов производили с применением пакета статистического анализа «STATISTICA 6.0». Данные представляли в виде M±SEM. Сравнение групп средних производили методом «ANOVA» с пост-тестом Ньюмена-Кейсла при р<0,05.
В результате было установлено, что в тесте «Водный лабиринт Морриса» (рис. 1) у НК группы животных отмечено увеличение латентного времени достижения площадки по сравнению с аналогичным показателем ЛО крыс в 7,6 раза (р<0,05). При этом, введение животным Мексидола и соединения 3FC способствовало уменьшению времени, затрачиваемого животными на поиск площадки на 22,3% (р<0,05) и 40,7% (р<0,05) соответственно. В тоже время на фоне применения исследуемого объекта ЗРСлатентное время нахождения площадки у крыс было меньше такового у животных, получавших Мексидол на 23,7% (р<0,05).
Оценивая изменение скорости мозгового кровотока (рис. 2) у крыс в условия перманентной фокальной ишемии было установлено, что у НК группы животных данный показатель уменьшился в 2,2 раза (р<0,05) по сравнению с крысами ЛО группы. На фоне введения животным Мексидола и соединения 3FС уровень церебрального кровотока увеличился относительно крыс НК группы на 36,8% (р<0,05) и 92% (р<0,05) соответственно. При этом, у животных, получавших 3FC отмечено увеличение скорости мозгового кровотока по отношению к крысам, которым вводили Мексидол на 40,4% (р<0,05).
В тоже время применение Мексидола и исследуемого соединения 3FC способствовало снижению зоны некроза головного мозга (рис. 3) в сравнении с НК животными на 18% (р<0,05) и 33,2% (р<0,05) соответственно. Стоит отметить, что на фоне введения соединения 3FC зона церебрального некроза была ниже аналогичной у крыс, получавших Мексидол на 18,6% (р<0,05).
В ходе оценки изменения концентрации АТФ (рис. 4) в супернатанте головного мозга животных было установлено, что у крыс НК группы содержание АТФ было меньше такового у ЛО животных на 90,4% (р<0,05). Необходимо отметить, что при введении Мексидола и соединения 3FC концентрация АТФ в супернатанте головного мозга увеличилось (относительно НК группы животных) на 35,4% (р<0,05) и 56,2% (р<0,05) соответственно. В тоже время у крыс, которым вводили 3FC, содержание АТФ было выше аналогичного у животных, которым вводили Мексидол на 15,1%(р<0,05).
Анализируя изменение концентрации молочной кислоты (рис. 5) в сыворотке крови животных было установлено, что у НК группы крыс данный показатель увеличился в 5,3 раза (р<0,05) по отношению к ЛО группе животных. Стоит отметить, что на фоне введения крысам Мексидола содержание лактата уменьшилось на 26,4% (р<0,05) в сравнении с НК группой животных. При этом, у крыс, которым вводили соединение 3FС концентрация молочной кислоты в сыворотке крови была ниже таковой у НК группы животных на 55% (р<0,05) и крыс, получавших Мексидол на 40% (р<0,05).
Таким образом, предлагаемое изобретение, представляющее собой производное 3-формилхромона, вводимое перорально, способствует снижению степени повреждения головного мозга в условиях экспериментальной ишемии посредством восстановления метаболических реакций, направленных на нормализацию аэробно-анаэробного обмена макроэргических соединений.
Соединение структурной формулы I
оказывающее церебропротекторное действие, восстанавливающее метаболические процессы в мозговой ткани, обладающее низкой токсичностью.
