Нуклеотидная последовательность, экспрессирующая якорный белок экзосом для применения в качестве вакцины

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицине, а именно, для применения в вакцинопрофилактике и вакцинотерапии с помощью индукции иммунного ответа CTL. Заявлен экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий слитый белок. Указанный слитый белок содержит (i) человеческий HIV-1 Nef белок с мутациями 3C, 153L и 177G и слит на своем C-конце с (ii) иммуногенным антигеном. Вакцинная композиция, включающая экспрессионный вектор и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей и/или адьювантов. Способ индукции иммунного ответа CTL у субъекта, где способ включает введение субъекту экспрессионного вектора. Изобретение позволяет создание вакцины на основе образования эндогенных сконструированных экзосом, которая способна индуцировать иммунный ответ CT против инфекционных и опухолевых заболеваний. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 28 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, экспрессирующей якорный белок экзосом для применения в качестве вакцины В частности, настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, экспрессирующей слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит якорный белок экзосом, слитый на своем C-конце с антигеном, или состоит из него, или ДНК-вектору экспрессии, содержащему указанную нуклеотидную последовательность, для применения в качестве вакцины.

Известно, что иммунный ответ оказывает защитное действие как от внешних, так и внутренних угроз для здоровья. Во многих случаях, когда природный иммунитет не может сдерживать развитие патологии, иммунный ответ, вызываемый введением иммуногенов, может блокировать патогенный процесс, как происходит, например, в результате индукции нейтрализующих антител против нескольких инфекционных патогенов.

Иным путем, идентификация, производство и маркетинг CTL-вакцин являются намного более ограниченными, хотя имеет место широкий консенсус о их потенциальной пользе против развития хронических инфекций и опухолевых заболеваний.

Предполагается, что получение сильного и многогранного иммунного ответа CTL, представляет собой терапевтическое значение для лечения нескольких патологий. Например, несколько фактов указывает на то, что клеточно-опосредованные иммунные ответы являются важными в контроле инфекции HPV, и вследствие этого, ассоциированных с вирусом новообразований. Фактически, как общая иммуносупрессия, так и слабый ответ CTL против HPV ассоциированы с вирусной персистенцией и прогрессированием заболеваний.

Наиболее широко используемые экспериментальные методики для индукции антигенспецифического иммунитета CTL основаны на применении вирусных векторов, пептидов и инактивированных патогенов. Однако к настоящему времени никакого иммуногенного препарата CTL не доступно на рынке.

ДНК-вакцинация в целях продуцирования иммуногенных белков признана успешной. Например, ДНК-вакцины против японского энцефалита была выпущена в 2010 году для применения у человека (1). Кроме того, была одобрена ДНК-вакцина для защиты лошадей от вируса лихорадки Западного Нила (2, 3). Кроме того, предварительное исследование ДНК-вакцинации против рассеянного склероза было описано как эффективное (4). В совокупности эти факты подтверждают идею о том, что ДНК-вакцинация может быть перспективной для применения у человека. Среди преимуществ ДНК-вакцинации следует упомянуть легкость разработки и производства, стабильность при хранении, рентабельность и персистенцию иммуногена. Теоретические недостатки были бы представлены возможным продуцированием антител к ДНК и нарушение генетически контролируемых механизмов клеточного роста. Однако основное ограничение представлено недостаточной активностью вызываемого иммунного ответа. По этой причине многие протоколы вакцинации, включающие применение ДНК для примирования иммунного ответа сопровождаются инокуляцией иммуногена в рамках альтернативных составов для бустирования иммунитета.

Экзосомы представляют собой везикулы размером 50-100 нанометров, высвобождаемые непрерывно всеми типами клеток. Они образуются в результате выпячивания вовнутрь эндосомальных мембран. Такие внутрипросветные везикулы образуют мультивезикулярные тельца (MVB), которые могут передвигаться к плазматической мембране, с которой они сливаются, тем самым, высвобождая содержимое своих пузырьков во внеклеточную среду. Нановезикулы, демонстрирующие как физические, так и биохимические свойства, похожие на экзосомы, но образуемые в результате непосредственной экструзии плазматической мембраны, были описаны в мышечных клетках (5, 6). Если ранее считалось, что экзосомы предназначены исключительно для секреции клеточных отходов, в настоящее время принято, что экзосомы представляют собой часть сети межклеточных взаимодействий. Они содержат матричные РНК, микроРНК, ДНК и белки, которые могут быть функциональными в целевых клетках.

Их иммуногенность главным образом является следствием количеств и качества антигенов, которые они содержат. Экзосомы были исследованы с точки зрения противоопухолевых иммуностимулирующих средств, и в некоторых случаях они получают одобрение для клинических испытаний (7-9). Было обнаружено, что экзосомы, спонтанно выгружающие опухолевые антигены, главным образом транс-мембранные белки, такие как gp100, TRP-1, Her2/neu и CEA, индуцируют активацию специфического противоопухолевого T-клеточного ответа (10, 11). Клинические исследования показали пригодность и хорошую переносимость экзосом в качестве бесклеточных вакцин у пациентов с опухолями. Однако их терапевтическая эффективность, по-видимому, является достаточно ограниченной, делая необходимым поиск новых способов повышения их иммуногенности. С данной проблемой столкнулись при разработке чужеродных антигенов для повышения их дисплея на экзосомальной мембране. В этом отношении в данное время были описаны две стратегии. В первой используется связывание доменов C1C2 лактадгерина с липидами экзосом, приводя к ассоциации гетерологичного антигена с наружной стороной экзосомальных мембран. Другая основана на покрытии экзосом энтеротоксином А Staphylococcus aureus, соединенным в хвостовой части с высокогидрофобным транс-мембранным доменом.

Отпочковывание HIV требует взаимодействия с рядом клеточных факторов, также участвующих в биогенезе экзосом, такими как, Alix, Tsg101 и некоторыми другими компонентами комплекса эндомальной сортировки, необходимой для транспорта (ESCRT). Кроме того, мембраны оболочек HIV и экзосомы имеют много общих компонентов, в том числе липидные рафты, т.е., микродомены клеточной мембраны, обогащенные холестерином, фосфолипидами с насыщенными боковыми цепями, и сфинголипиды. Конвергенция биогенеза экзосом и HIV предполагает возможность того, что продукты вирусов содержатся в экзосомах. Это имеет место в случае Nef HIV-1, который ассоциируется посредством заякоривания своего N-концевого остатка миристиновой кислоты с микродоменами липидных рафтов в пограничной мембране MVB. Nef представляет собой белок с молекулярной массой 27 килодальтон (кДа), не обладающий ферментативной активностью, однако, выступающий в роли каркасного/адапторного элемента в инициации активации молекул, передающих сигналы, в большинстве случае при ассоциации с микродоменами липидных рафтов.

Ранее был идентифицирован мутант Nef ^V153 ^{L E}177^G, включенный при довольно высоких уровнях в частицы HIV-1, HIV-1-вирусоподобные частицы (VLP) (12) и экзосомы (13). Эффективность включения в экзосомы по-прежнему повышается, если данный мутант конструировали с N-концевым пальмитоилированием посредством мутации ^G3^C, что предположительно является следствием повышенной ассоциации с липидными рафтами. Этот мутант Nef (также называемый Nef^mut) является дефектным в отношении главным образом всех функций Nef, а эффективность его включения в наночастицы не изменяется значительно при слиянии на его C-конце с чужеродными белками. Манипулирование Nef^mut способствует включению больших количеств предпочтительных антигенов в экзосомы, которые, таким образом, остаются защищенными от внешних факторов нейтрализации/расщепления. Недавно было описано, что экзосомы, сконструированные на основе Nef^mut, образуемые in vitro, индуцируют эффективный антигенспецифический ответ CTL (14). В частности, уже были получены довольно перспективные результаты применения экзосом, образуемых in vitro, несущих белок HPV-E7 в качестве иммуногена (14).

В то же время, с точки зрения потенциального клинического применения этих результатов, данная стратегия сталкивается с возможными техническими трудностями, в том числе стандартизацией промышленного производства, высокой себестоимостью и хранением иммуногена. Помимо этого, предполагается, что образуемые in vitro экзосомы имеют ограниченное время полужизни при инъекции, являясь подверженными выведению из ретикуло-эндотелиальной системы хозяина посредством распознавания «не своих» молекул, ассоциированных с экзосомальной мембраной. В этом отношении было описано, что период полужизни как выделенных ex vivo, так и образуемых in vitro экзосом длится около 2 минут после инъекции, демонстрируя мгновенное накопление в печени и селезенке, и лишь небольшие количества экзосом выявляются через 4 часа.

В свете вышеуказанного, таким образом, очевидна необходимость в обеспечении новых видов иммунотерапии, способных преодолевать недостатки известных видов терапии.

На основании этих технических предпосылок, в настоящем изобретении предусмотрена новая стратегия вакцины на основе образования эндогенных сконструированных экзосом, которая способна преодолевать недостатки известных терапевтических стратегий, индуцирующих иммунный ответ CTL инфекционных и опухолевых заболеваний.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что введение ДНК-векторов, экспрессирующих слитые белки на основе Nef^mut, в организме животного-хозяина в результате внутримышечной (в/м) инокуляции вызывает мощный иммунный ответ CTL, значительно ингибируя рост уже имлантированных опухолевых клеток. Несколько фактов указывают на то, что образование эндогенных сконструированных экзосом происходило на основе наблюдаемого противоопухолевого эффекта.

В частности, результаты в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют : i) способность мышечных клеток образовывать сконструированные экзосомы после трансфекции ДНК; ii) воспроизводимую индукцию антигенспецифического иммунитета CTL после инокуляции вектора, экспрессирующего Nef^mut/E7, демонстрируя выраженный противоопухолевый эффект в терапевтических условиях, и iii) иммуногенность экзосом, выделенных из плазмы крови мышей, инокулированных ДНК, повторно инфузированных в мышей-реципиентов.

Помимо этого, исследовали, приводит ли и насколько эффективно эктопическая экспрессия Nef^mut к высвобождению сконструированных экзосом. Данные, полученные с использованием клеток C₂C₁₂, подтверждали идею о том, что Nef^mut накапливается в экзосомоподобных нановезикулах, высвобождаемых мышечными клетками мыши при уровнях, аналогичных таковым, выявляемым в клетках человека. Данные исследования не включали в себя терминально дифференцированные мышечные клетки, т.е., тип клеток, на которые наиболее вероятно происходит целенаправленное воздействие при в/м инокуляции у мышей. Было выдвинуто предположение, что в этих клетках механизмы, лежащие в основе везикулярного внутриклеточного транспорта, не изменяются, по меньшей мере качественно.

В связи с этим выявление сконструированных экзосом в плазме крови от мышей, инокулированных в/м Nef^mut ДНК-векторами, подтверждало гипотезу о том, что Nef^mut может накапливаться в экзосомах, также высвобождаемых дифференцированными мышечными клетками. Теоретически нельзя исключить, что по меньшей мере часть введенной ДНК могла бы целенаправленно воздействовать на другие типы клеток путем, например, диффузии ДНК в дренирующие лимфатические узлы, где она может быть захвачена и интернализирована дендритными клетками (DC). В то же время, возможно, что захват ДНК DC не являлся соответствующей частью механизмов описываемых в данном документе явлений активации CD8⁺ T-клеток, учитывая, что подострая инокуляция ДНК, экспрессирующей Nef^mut/E7, которая, как предполагается, предпочтительно целенаправленно воздействует на DC, приводила к значимо более слабому E7-специфическому CD8⁺ T-клеточному иммунному ответу (не показано).

Степени CD8⁺ T-клеточной активации, выявляемые у мышей, инокулированных ДНК, были, по-видимому, намного более выраженными, чем таковые, которые наблюдались у мышей, которым вводили образованные in vitro сконструированные экзосомы (14). Даже несмотря на то, что прямые сравнительные эксперименты не могут быть проведены с точки зрения невозможности сравнения количеств этих двух различных иммуногенов, инокуляция ДНК вызывала E7-специфическую CD8⁺ T-клеточную активацию, достаточно сильную для того, чтобы быть четко выявленной без стимуляции/экспансии спленоцитов in vitro, необходимых в случае, когда мышей инокулировали экзосомами, образованными клетками человека in vitro(14). По всей видимости лучшие результаты, полученные в случае введения ДНК, вероятно, были следствием того факта, что клетки, экспрессирующие инокулированную ДНК, могут порождать непрерывный источник иммуногенных экзосом, готовых быть интернализированными как локальными, так и дистальными APC.

В соответствии с настоящим изобретением были получены несколько экспериментальных фактов, касающихся механизма, лежащего в основе иммунного ответа CTL, наблюдаемого после введения ДНК. В частности, выявление флуоресцентных экзосом в плазме крови мышей, инокулированных вектором, экспрессирующим GFP, слитым с Nef^mut, доказывало, что сконструированные экзосомы действительно были образованы при введении ДНК-вектора. Кроме того, активности Nef^mut, отличные от его накопления в экзосомах, по-видимому, не были важными для CD8⁺ T-клеточной активации, поскольку ее выявляли у мышей, которым вводили вектор, экспрессирующий Nef^mut, но не Nef дикого типа. Соответственно, было замечено, что ответ CTL не был основан на высвобождении свободных антигенов из клеток, на которые целенаправленно воздействовала ДНК, о чем свидетельствовало отсутствие E7-специфического CD8⁺ T-клеточного ответа у мышей, которым вводили E7 векторы экспрессии, в которых внеклеточное выделение E7 свидетельствовало об ответе антитела к E7. Помимо этого, было доказано, что экзосомы, выделенные из плазмы мышей, которым вводили вектор, экспрессирующий Nef^mut/E7, но не отдельно E7, были иммуногенными при введении в наивных мышей-реципиентов.

В совокупности эти экспериментальные факты согласовывались с гипотезой о том, что образование иммуногенных эндогенных сконструированных экзосом происходило на основе CD8⁺ T-клеточной активации. Примечательно, что этот иммунный ответ был как быстрым, так и достаточно выраженным для того, чтобы эффективно противодействовать росту сингенных опухолевых клеток, имплантированных перед иммунизациями.

На основании представленных в данном документе экспериментальных фактов, наиболее вероятным механизмом, лежащим в основе CD8⁺ T-клеточной активации, индуцируемой инокуляцией ДНК-векторов, экспрессирующих векторы на основе Nef^mut, могут быть обобщены, как описано на Фиг. 1. Мышечные клетки, экспрессирующие введенный ДНК-вектор, высвобождают сконструированные экзосомы, которые интернализируются APC. Как показано ранее, интернализация экзосом на основе Nef^mut приводит к перекрестной презентации ассоциированных антигенов и, как следствие, примированию антигенспецифических CD8⁺ T-клеток. Бустинг иммунного ответа, обеспечиваемый вторым введением ДНК, был бы усилен в результате непрерывного образования экзосом из клеток, на которые целенаправленно воздействует инокулируемая ДНК. В соответствии с тем, что ранее наблюдали у мышей, инокулируемых образованными in vitro экзосомами (14), ни антитела к E7, ни антитела к Nef не были выявлены в плазме крови, полученной от инокулированных мышей, явно подтверждая то, что загруженные экзосомами антигены главным образом вызывают TH-1 смещенный иммунный ответ.

В конечном итоге, с точки зрения возможного применения этих результатов по отношению к раку молочной железы человека, также были исследованы следующие аспекты: i) может ли иммуногенный раздражитель, индуцируемый сконструированными экзосомами, нарушать иммунную толерантность, и ii) их эффективность при применении к организму человека. В частности, для исследования того, является ли иммунная активация, индуцируемая сконструированными in vivo экзосомами, достаточно выраженной для того, что нарушать толерантность, рассматривали широко исследуемую модель трансгенных мышей HER2/neu (15). В данном документе трансген rHER2/neu экспрессируется в тимусе, приводя к толерантности, значительно нарушающей CD8⁺ T-ветку, что следует из того факта, что CD8⁺ T-лимфоциты, ускользающие от толерантности, являются очень слабо представленными (16). С помощью анализа Elispot с использованием IFN-γ воспроизводимо оценивали, что два введения ДНК-вектора, экспрессирующего Nef^mut, слитого с внеклеточным доменом HER2 (HER2-ECD), были достаточными для нарушения CD8⁺ T-толерантности по отношению к HER2/neu. Эти результаты были релевантными, поскольку значимый HER2/neu-специфический ответ CTL ни в каких случаях не обнаруживался у этих трансгенных мышей при введении HER2/neu ДНК-векторов экспрессии (17-19).

Интересно отметить, что было обнаружено, что эта иммунная активация коррелировала с задержкой опухолевого развития. Это было впервые, когда связанное с CTL, но антитело-независимое ингибирование опухолевого развития наблюдали у трансгенных по HER2/neu мышей. С другой стороны, тот факт, что иммунологическое давление, образуемое HER2-ECD-специфическим иммунным ответом CTL не был достаточным для излечения опухолевого заболевания, не был удивительным по меньшей мере по двум причинам. Во-первых, у трансгенных по HER2/neu мышей все эпителиальные клетки молочных желез одновременно экспрессируют онкоген, приводя к синхронному развитию множественных неопластических поражений. Таким образом, противоопухолевый иммунитет может быть преодолен множеством явлений трансформации. Помимо этого, внутренняя генетическая нестабильность опухолевых клеток может приводить к ускользанию от иммунного давления в результате так называемого механизма иммунного редактирования, а именно, элиминацией, равновесием и ускользанием (20). В этом отношении противоопухолевый ответ отдает предпочтение изменениям в раковых клетках, способных избегать иммунный контроль. Само собой разумеется, что, предполагается, что эффективность такого механизма повышается с числом сопутствующих опухолевых поражений.

Для предоставления возможности использования средства по настоящему изобретению в клинической практике также демонстрировали его эффективность в организме человека. С этой целью проводили эксперименты с использованием условий, воспроизводящих механизм, лежащий в основе индукции антигенспецифического CD8⁺ T-лимфоцитарного иммунного ответа, ранее описанного у мышей (21). Результат, полученный с помощью конфокального микроскопического анализа, находился в соответствии с гипотезой о том, что продукт ДНК-вектора, трансфицированного в первичные мышечные клетки человека, может быть интернализирован DC в результате образования сконструированных экзосом. Помимо этого, данные, полученные в результате анализов перекрестного примирования, указывают на то, что образование трансфицированными мышечными клетками экзосом, сконструированных для включения Nef^mut или его производных, является достаточным для генерирования эффективно выявляемой антигенспецифической активности CTL. Тот факт, что антигенспецифическое перекрестное примирование было значительно нарушено, когда были использованы ингибиторы биосинтеза экзосом, находится в соответствии с гипотезой о том, что доставки сконструированных экзосом к DC была центральным этапом для генерации антигенспецифической активации CTL. В целом, результаты, полученные с использованием клеток ex vivo, указывают на отсутствие очевидных ограничений при использовании платформы CTL-вакцин на основе Nef^mut у человека.

На основе вышеуказанного, платформа CTL-вакцин в соответствии с настоящим изобретением представляет собой новый вид терапии против солидных опухолей. Нарушение толерантности по отношению к опухоль-ассоциированным собственным антигенам, а также повышение ответа против опухоль-ассоциированных антигенов представляет собой следующий барьер с точки зрения противоопухолевой иммунотерапии (22). Платформа CTL-вакцин на основе сконструированных экзогенных экзосом в соответствии с настоящим изобретением способна отвечать обеим конечным точкам, представляя, таким образом, действительно новую концепцию с точки зрения иммунизации CTL.

В предложенной в данном документе стратегии индуцирования иммунитета CTL, основанной на сконструированных эндогенных экзосомах, используется легкость образования, хранения и доставки типичных ДНК-вакцин, комбинируемая со значительной иммуногенностью антигенов в экзосомах при слиянии Nef^mut, а также присущая ей гибкость с точки зрения выбора иммуногена.

В соответствии с настоящим изобретением был предусмотрен ДНК-вектор, называемый «Nef^mut шаттл», разработанный для легкой вставки и экспрессии последовательностей предпочтительного антигена.

Исходя из структурной точки зрения, ДНК-вектор в соответствии с настоящим изобретением может подвергаться улучшениям как с точки зрения эффективности транскрипции, например, в результате замещения промотора CMV-IE другими промоторами, даже более сильными, и/или вставки стабилизирующих последовательностей транскрипта (например, постранскрипционных регуляторных элементов вируса гепатита сурков, WPRE), так и с точки зрения сведения к минимальному размеру «якорного белка экзосом», благоприятствуя, таким образом, включению антигена, слитого с ним.

Поскольку в соответствии с настоящим изобретением экзосомы/нановезикулы могут быть сконструированы «in vivo» для включения больших количеств любого антигена, биотехнологическая платформа настоящего изобретения может представлять терапевтическую эффективность против любого заболевания, восприимчивого к атаке специфических CTL.

Применение в терапевтических целях вакцинации на основе ДНК-векторов, экспрессирующих слитые продукты с «якорным белком экзосом» Nef^mut в соответствии с настоящим изобретением, применимо ко всем патологиям, для которых может быть полезен эффективный иммунный ответ CTL. Несомненно, что число и происхождение антигенов, которые могут быть сконструированы, могут быть расширены в отношении терапевтических стратегий, с которыми необходимо взаимодействовать.

Таким образом, специфической целью настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, экспрессирующая слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит якорный белок экзосом из последовательности SEQ ID NO:1, слитый на своем C-конце с антигеном, или состоит из него, или ДНК-вектор экспрессии, содержащий указанную нуклеотидную последовательность, для применения в вакцинопрофилактике и вакцинотерапии, при этом SEQ ID NO:1 представляет собой следующую последовательность:

MGCKWSKSSV VGWPAVRERM RRAEPAADGV GAASRDLEKH GAITSSNTAA TNADCAWLEA QEEEEVGFPV TPQVPLRPMT YKAAVDLSHF LKEKGGLEGL IHSQRRQDIL DLWIYHTQGY FPDWQNYPTG PGIRYPLTFG WCYKLVPVEP EKLEEANKGE NTSLLHPVSL HGMDDPGREV LEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC.

Нуклеотидная последовательность или ДНК-вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены предпочтительно внутримышечно; другие пути введения могут представлять собой аэрозольное введение (т.е., введение в верхние дыхательные пути), внутридермальное, слизистое подострое введение.

Антиген может быть выбран из группы, состоящей из антигена вируса папилломы человека, такого как E6 и E7, антигена HIV, такого как Gag и Tat, антигена вируса Эбола, такого как VP24, VP40, NP и GP, антигена вируса лихорадки Западного Нила, такого как NS3, антигена HBV, такого как Core, антигена HCV, такого как Core, NS3, E1 и E2, антигена вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым, такого как GP и NP, антигена вируса гриппа A, такого как NP и M1, антигена меланомы человека, такого как MAGE-A3 и MART-1, опухоль-ассоциированных антигенов человека, таких как Her2/Neu, Hox B7.

Как упомянуто выше, нуклеотидная последовательность, экспрессирующая якорный белок экзосом последовательности SEQ ID NO:1 может представлять собой следующую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 (нуклеотидная последовательность Nef^mut):

atg ggt tgc aag tgg tca aaa agt agt gtg gtt gga tgg cct gct gta agg gaa aga atg aga cga gct gag cca gca gca gat ggg gtg gga gca gca tct cga gac cta gaa aaa cat gga gca atc aca agt agc aat aca gca gct acc aat gct gat tgt gcc tgg cta gaa gca caa gag gag gag gag gtg ggt ttt cca gtc aca cct cag gta cct tta aga cca atg act tac aag gca gct gta gat ctt agc cac ttt tta aaa gaa aag ggg gga ctg gaa ggg cta att cac tcc caa cga aga caa gat atc ctt gat ctg tgg atc tac cac aca caa ggc tac ttc cct gat tgg cag aac tac aca cca gga cca ggg gtt aga tat cca ctg acc ttt gga tgg tgc tac aag cta gta cca gtt gag cca gag aag tta gaa gaa gcc aac aaa gga gag aac acc agc ttg tta cac cct gtg agc ctg cat gga atg gat gac ccg gcg aga gaa gtg tta gag tgg agg ttt gac agc cgc cta gca ttt cat cac gtg gcc cga gag ctg cat ccg gag tac ttc aag aac tgc tga

Нуклеотидная последовательность или ДНК-вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для предупреждения и лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из хронических инфекционных заболеваний, таких как инфекции, вызываемые, HBV, HCV и HIV, туберкулез и малярия, острые инфекционные заболевания, такие как грипп, лихорадка Западного Нила, геморрагическая лихорадка Конго-Крым и лихорадка Эбола, опухоли, такие как опухоль молочной железы, легких, предстательной железы или мочевого пузыря.

Настоящее изобретение также рассматривает фармацевтическую композицию, содержащую или состоящую из нуклеотидной последовательности, экспрессирующей слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит якорный белок экзосом из последовательности SEQ ID NO:1, слитый на своем C-конце с антигеном, или ДНК-вектора экспрессии, содержащего указанную нуклеотидную последовательность, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями и/или адъювантами, такими как адъювант CD8⁺ T-клеточного ответа (например, адъювант Iscomatrix™), где SEQ ID NO:1 представляет собой следующую последовательность:

MGCKWSKSSV VGWPAVRERM RRAEPAADGV GAASRDLEKH GAITSSNTAA TNADCAWLEA QEEEEVGFPV TPQVPLRPMT YKAAVDLSHF LKEKGGLEGL IHSQRRQDIL DLWIYHTQGY FPDWQNYPTG PGIRYPLTFG WCYKLVPVEP EKLEEANKGE NTSLLHPVSL HGMDDPGREV LEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC.

Как упомянуто выше, атиген может быть выбран из группы, состоящей из антигена вируса папилломы человека, такого как E6 и E7, антигена HIV, такого как Gag и Tat, антигена вируса Эбола, такого как VP24, VP40, NP и GP, антигена вируса лихорадки Западного Нила, такого как NS3, антигена HBV, такого как Core, антигена HCV, такого как Core, NS3, E1 и E2, антигена вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым, такого как NP и GP, антигена вируса гриппа A, такого как NP и M1, антигена меланомы человека, такого как MAGE-A3 и MART-1, опухоль-ассоциированных антигенов человека, таких как Her2/Neu, HoxB7.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, экспрессирующая якорный белок экзосом SEQ ID NO:1 может представлять собой следующую последовательность SEQ ID NO:2:

atg ggt tgc aag tgg tca aaa agt agt gtg gtt gga tgg cct gct gta agg gaa aga atg aga cga gct gag cca gca gca gat ggg gtg gga gca gca tct cga gac cta gaa aaa cat gga gca atc aca agt agc aat aca gca gct acc aat gct gat tgt gcc tgg cta gaa gca caa gag gag gag gag gtg ggt ttt cca gtc aca cct cag gta cct tta aga cca atg act tac aag gca gct gta gat ctt agc cac ttt tta aaa gaa aag ggg gga ctg gaa ggg cta att cac tcc caa cga aga caa gat atc ctt gat ctg tgg atc tac cac aca caa ggc tac ttc cct gat tgg cag aac tac aca cca gga cca ggg gtt aga tat cca ctg acc ttt gga tgg tgc tac aag cta gta cca gtt gag cca gag aag tta gaa gaa gcc aac aaa gga gag aac acc agc ttg tta cac cct gtg agc ctg cat gga atg gat gac ccg gcg aga gaa gtg tta gag tgg agg ttt gac agc cgc cta gca ttt cat cac gtg gcc cga gag ctg cat ccg gag tac ttc aag aac tgc tga

Фармацевтическая композиция может быть введена предпочтительно путем внутримышечного введения; другие пути введения могут представлять собой аэрозольное введение (т.е., введение в верхние дыхательные пути), внутридермальное, слизистое подострое введение.

Помимо этого, настоящее изобретение рассматривает фармацевтическую композицию, указанную выше, для применения в вакцинопрофилактике и вакцинотерапии, например, в предупреждении и лечении заболеваний, выбранных из группы, состоящей из хронических инфекционных заболеваний, таких как инфекции, вызываемые, HCV и HIV, туберкулез и малярия, острые инфекционные заболевания, такие как грипп, лихорадка Западного Нила, геморрагическая лихорадка Конго-Крым и лихорадка Эбола, опухоли, такие как опухоль молочной железы, легких, предстательной железы или мочевого пузыря.

Нуклеотидная последовательность, ДНК-вектор экспрессии или фармацевтическая композиция, содержащая то же самое, в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в области медицины, а также области ветеринарии.

Настоящее изобретение далее будет описано иллюстративным, но не ограничивающим путем, в соответствии с его предпочтительными вариантами осуществления, с особой отсылкой на включенные в него чертежи.

На Фиг. 1 показана смеха механизма, лежащего в основе активации CTL, индуцируемой инокуляцией Nef^mut ДНК-векторов. После введения ДНК-вектора, экспрессирующего антиген, слитый с Nef^mut, трансфицированные мышечные клетки высвобождают как немодифицированные, так и сконструированные экзосомы. Содержимое последних при интернализации APC и перекрестной презентации индуцирует примирование/активацию CD8⁺ T-лимфоцитов, специфических в отношении антигенов, загруженных в эндогенные сконструированные экзосомы.

На Фиг. 2 показано выявление сконструированных экзосом в супернатантах трансфицированных мышечных клеток мыши. A. Анализ FACS клеток 293T человека и мышечных клеток C₂C₁₂ мыши через два дня после трансфекции Nef^mut/GFP или Nef_G2A/GFP векторами экспрессии. M1 обозначает диапазон положительных значений, установленный в результате анализа клеток, трансфицированных имитационным контролем. Представлены проценты положительных клеток. B. Количественная оценка с точки зрения активности AchE экзосом, восстановленных с помощью дифференциальных центрифугирований на основе супернатантов из одинакового количества (т.е., 5×10⁶) трансфицированных клеток 293T и C₂C₁₂. C. Вестерн-блоттинг экзосом на основе трансфицированных клеток 293T и C₂C₁₂. Продукты на основе Nef выявляли в клеточных лизатах и экзосомах, в том время как β-актин и Alix выступали в качестве маркеров клеточных лизатов и экзосом соответственно. Стрелки обозначают соответствующие белковые продукты. Молекулярные маркеры представлены в кДа. D. FACS экзосом из трансфицированных клеток C₂C₁₂. 10 мЕд экзосом из клеток C₂C₁₂, трансфицированных Nef^mut-GFP или Nef_G2A-GFP векторами экспрессии, анализировали с помощью FACS с точки зрения прямого/бокового светорассеяния (верхние панели) и флуоресценции GFP (нижние панели). Квадранты указывают размер выявляемых твердых частиц (верхние панели) или диапазон положительных значений, рассчитанных с помощью анализа экзосом на основе клеток, трансфицированных имитационным контролем. Результаты отражают два независимых эксперимента.

На Фиг. 3 показано выявление флуоресцентных нановезикул в плазме крови от мышей, инокулированных ДНК-вектором, экспрессирующим Nef^mut-GFP. A. Анализ экспрессии связанных с GFP продуктов в мышечных тканях от мышей, инокулированных указанными ДНК-векторами. Увеличение: 40×. B. Мышей C57 Bl/6 инокулировали в/м ДНК-векторами, экспрессирующими указанные продукты, а через 3 и 9 дней экзосомы выделяли из плазмы крови с помощью дифференциальных центрифугирований. Затем эквивалентные количества (т.е., 1 мЕд) экзосом связывали с не содержащими белых латексных гранул альдегида/сульфата, и в конечном итоге анализировали в отношении их флуоресценции. В качестве контроля использовали 10 мкЕд экзосом, выделенных из супернатантов клеток 293T, транзиентно трансфицированных Nef^mut-GFP вектором (Ctrl+). Квадранты располагали на основании флуоресценции необработанных гранул. Указаны проценты положительных явлений. Результаты отражают два анализа.

На Фиг. 4 показана инокуляция Nef^mut/E7 ДНК-вектора, индуцирующего E7-специфический CD8⁺ T-клеточный ответ в отсутствие продуцирования антител. CD8⁺ T-клеточный ответ у мышей, инокулированных ДНК-векторами, экспрессирующими E7 или Nef^mut/E7, или пустым вектором. Мышей C57 Bl/6 (шесть на группу) инокулировали два раза различными ДНК-векторами. Спленоциты, извлеченные из мышей, инкубировали с 5 мкг/мл неродственных нонамеров (не показано), специфических в отношении E7 или Nef нонамеров. Степени клеточной активации оценивали с помощью анализа Elispot с использованием IFN-γ, проводимого в трех повторах с использованием 10⁵ клеток/лунка. В качестве контроля необработанные клетки также инкубировали с использованием 5 нг/мл PMA и 500 нг/мл иономицина. Показано число IFN-γ пятнообразующих единиц (SFU)/10⁵ клеток на основании трех повторов лунок, засеянных спленоцитами из каждой инокулированной мыши. Также были представлены межгрупповые значение + SD SFU. Результаты отражают три независимых эксперимента. * p<0,05. B. Анализ CTL, проводимый с использованием CD8⁺ T-клеток от мышей, инокулированных указанными векторами. CD8⁺ T-клетки, выделенные из спленоцитов от различных инокулированных мышей, объединяли и культивировали в течение 6 часов при различных соотношениях клеток (таких как от 20:1 до 5:1) с использованием клеток EL-4, предварительно меченых CFSE и предварительно обработанных неродственными пептидами или пептидами E7 в течение 16 часов. Через шесть часов уровни гибели клеток EL-4 оценивали с помощью FACS при мечении 7-AAD. Показаны результаты, представляющие четыре независимые эксперимента. C. Выявление антител к E7 в плазме крови от мышей, инокулированных указанными ДНК-векторами. В качестве внутреннего стандарта положительного контроля (Ctrl+) использовали разведения плазмы крови 1:10000 от мышей, которым вводили 10 мкг рекомбинантных белков E7 или Nef совместно с адъювантом. Показаны средние значения поглощения +SD трех повторов плазмы крови, объединенные от шести мышей на группу.

На Фиг. 5 показано, что введение ДНК-вектора, экспрессирующего wtNef, не вызывает специфический в отношении Nef CD8⁺ T-клеточный иммунный ответ у мышей. Специфический в отношении Nef CD8⁺ T-клеточный иммунный ответ у мышей, инокулированных ДНК-векторами, экспрессирующими wtNef, Nef^mut, или пустым вектором. Мышей С57 Bl/6 (четыре на группу) инокулировали в/м два раза ДНК-векторами, а через десять дней после последней иммунизации мышей умерщвляли и спленоциты культивировали в микролунках Elispot с использованием IFN-γ в течение 16 часов в отсутствии или присутствии неродственных или специфических в отношении Nef нонамеров. В качестве контроля необработанные клетки также инкубировали с использованием 5 нг/мл PMA и 500 нг/мл иономицина. Показано среднее количество + SD SFU/10⁵ клеток. Результаты отражают два независимых эксперимента. * p<0,05.

На Фиг. 6 показан E7-специфический CD8⁺ T-клеточный иммунитет, индуцированный у мышей, которым вводили экзосомы от мышей, инокулированных Nef^mut/E7 ДНК-вектором. CD8⁺ T-клеточный иммунный ответ у мышей, инокулированных экзосомами, выделенными из плазмы крови сингенных мышей, которым ранее вводили векторы, экспрессирующие E7, Nef^mut/E7, или пустой вектор. Мышей С57 Bl/6 (8 на группу, мыши-доноры) инокулировали два раза указанными ДНК-векторами, а через десять дней после последней инокуляции PBMC извлекали в результате забора крови из ретроорбитальных пазух и исследовали в анализе Elispot с использованием IFN-γ на наличие E7-специфического CD8⁺ T-клеточного ответа (верхние панели). Через два дня мышей умерщвляли, а экзосомы выделяли из плазмы крови с помощью дифференциальный центрифугирований. Затем эквивалентные количества этих экзосом три раза использовали для инокуляции сингенных мышей (3 на группу). Через десять дней после последней инокуляции спленоциты извлекали и степени CD8⁺ T-клеточной активации, оцениваемые с помощью анализа Elispot с использованием IFN-γ проводили в трех повторах (нижняя панель).

Во всех анализах Elispot с использованием IFN-γ клетки также инкубировали с 5 нг/мл PMA и 500 нг/мл иономицина. Показано среднее количество + SD SFU/105 клеток. Результаты отражают два независимых эксперимента. * p<0,05.

На Фиг. 7 показан терапевтический противоопухолевый эффект, индуцированный в/м инокуляцией Nef^mut/E7 ДНК-вектора. Мышей С57 Bl/6 подвергали воздействию 2×10⁵ клеток TC-1 и через 4 дня, когда опухолевые массы выявляли путем пальпации, инокулировали ДНК-вектором, экспрессирующим Nef^mut/E7 (семь мышей) или, в качестве контроля, Nef^mut, пустым вектором или носителем (четыре мыши на группу). Инокуляции ДНК повторяли на день 11 после иплантации опухолевых клеток и рост опухолевой массы отслеживали в динамике. A. E7-специфический CD8⁺ T-клеточный ответ, определяемый с помощью анализа Elispot с использованием IFN-γ в PBMC, извлекаемых в результате забора крови из ретроорбитальных пазух через 7 дней после последней иммунизации и культивируемых в течение 16 часов в присутствии неродственных пептидов или пептидов E7. В качестве контроля PBMC также инкубировали с использованием 5 нг/мл PMA и 500 нг/мл иономицина. Показано число SFU/10⁵ клеток на основании трех повторов лунок, засеянных спленоцитами из каждой инокулированной мыши. B. Определение размера опухоли в течение 30-дневного времени наблюдения. C. Измерение веса опухолей от мышей, которым вводили Nef^mut или Nef^mut/E7 ДНК-векторы во время умерщвления.

Показаны значения, выявленные для каждой инокулированной мыши. Результаты отражают два независимых эксперимента.

На Фиг. 8 показано выявление экзосом, сконструированных с использованием HER2/neu ECD, в супернатантах трансфицированных клеток. Вестерн-блоттинг лизатов клеток и экзосом из культур клеток 293T, трансфицированных вектором, экспрессирующим Nef^mut, Nef^mut/HER2 ECD, или пустым вектором. Продукты на основе Nef выявляли в клетках и экзосомах, в том время как β-актин и Alix выступали в качестве маркеров клеточных лизатов и экзосом соответственно. Стрелки обозначают соответствующие белковые продукты. Молекулярные маркеры представлены в кДа. Результаты отражают пять независимых экспериментов.

На Фиг. 9 показано выявление антител к HER2/neu в плазме крови от инокулированных мышей. Плазму крови от мышей, которым вводили векторы, экспрессирующие Nef^mut или Nef^mut/HER2-ECD, инкубировали с клетками 293T, трансфицированными за два дня до этого HER2/neu вектором экспрессии. После инкубации с вторичными антителами клетки фиксировали и проводили анализ FACS. В качестве положительных контролей анализировали плазму крови от мышей, которым вводили лизаты опухолевых клеток 676-1-25, конститутивно сверхэкспрессирующие HER2/neu (клетки HER2/neu) и mAb к HER2/neu (Ctrl+). Результаты представлены в виде средних значений +SD средних флуоресцентных интенсивностей (MFI), выявленных с помощью FACS с использованием плазмы крови от каждой мыши которой осуществляли введение, и отражают два анализа.

На Фиг. 10 показано выявление HER2/neu-специфического CD8⁺ T-клеточного иммунитета, индуцированного у мышей при введении ДНК-вектора, экспрессирующего ^Nefmut/HER2-ECD. CD8⁺ T-клеточный ответ у мышей, инокулированных ДНК-векторами, экспрессирующими Nef^mut или Nef^mut/HER2-ECD, или пустым вектором (пустой). Мышей 129Sv-Neu T (пять на группу) в/м инокулировали два раза различными ДНК-векторами. Во время умерщвления 10⁵ спленоцитов инкубировали в течение ночи с 5 мкг/мл неродственных, Nef- или HER2-ECD-специфических нонамеров или без них, в двух повторах или трех повторах микролунок для Elispot с использованием IFN-γ. В качестве контроля клетки также инкубировали в отсутствие пептидов (Nil). Показано среднее число пятнообразующих единиц IFN-γ (SFU)/10⁵ + SD. Результаты отражают три независимых эксперимента. * p<0,05. Внизу показан проявляемый планшет для Elispot с использованием IFN-γ на основе иллюстративного анализа.

На Фиг. 11 показано выявление HER2/neu-специфического CD8⁺ T-клеточного иммунитета, индуцированного у мышей, которым вводили ДНК, в сочетании с антигенспецифической активностью CTL. Анализ CTL, проводимый с использованием CD8⁺ T-клеток от мышей, инокулированных указанными векторами. CD8⁺ T-клетки выделяли из объединенных спленоцитов, культивируемых в двух повторах в течение 6 часов при соотношении клеток 10:1 с клетками TC-1, ранее мечеными CFSE и обработанными в течение 16 часов неродственными пептидами, специфическими в отношении Nef или HER2-ECD пептидами. Через шесть часов гибель клеток TC-1 оценивали с помощью анализа FACS с мечением 7-AAD. Показаны средние значения + SD, рассчитанные на основании трех независимых экспериментов. * p<0,05. Среднее значение фоновых условий (т.е., кокультуры CD8⁺ T-лимофицитов от наивных мышей с необработанными клетками TC-1): 8,1 ± 3,5. Внизу показаны иллюстративные точечные диаграммы на основании анализа FACS кокультур. Указаны проценты двойных флуоресцентных по отношению ко всем CFSE-положительным клеткам.

На Фиг. 12 показан противоопухоелый эффект, индуцированный в результате инокуляции Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектора. Мышей 129Sv-NeuT (5 на группу) инокулировали два раза указанными ДНК-векторами или носителем (нулевым) в возрасте 15 и 17 недель. A. Частота опухолей, выражаемая в виде числа мышей по меньшей мере с одной опухолью >1 мм в диаметре. B. Многократность опухолей, рассчитанная в виде совокупного количества опухолей/общее количество мышей + SD. Данные отражают три независимых эксперимента.

На Фиг. 13 показана интернализация iDC экзосом, высвобождаемых первичными скелетными мышечными клетками человека. A. Анализ FACS SKMC через 2 дня после трансфекции векторами, экспрессирующими GFP, Nef^mut/GFP, или пустым вектором. Показаны уровни флуоресценции GFP, выявленные в иллюстративном анализе из пяти независимых экспериментов. Указаны проценты GFP-положительных клеток. M1: диапазон положительных значений. B. Конфокальный микроскопический анализ кокультур, содержащих iDC и SKMC, трансфицированные ДНК-векторами, экспрессирующими GFP или Nef^mut/GFP, при этом последнюю осуществляли в присутствии или в отсутствие GW4869 и спироэпоксида. Перед анализом предметные стекла окрашивали DAPI (синяя флуоресценция) и mAb к CD45 (красная флуоресценция). В случае кокультур, содержащих трансфицированные Nef^mut/GFP SKMC, описывали два среза одного и того же поля, при этом в первом подсвечивали CD45-положительные клетки (верхняя панель, черные стрелки), в том время как на изображении внизу указаны Nef^mut/GFP-экспрессирующие SKMC (черно-зеленая стрелка) и области накопления флуоресценции в iDC (белые стрелки).

На Фиг. 14 показана специфическая в отношении Nef активность CTL, вызываемая DC человека, кокультивируемыми с мышечными клетками, экспрессирующими Nef^mut ДНК-векторы. A. Схема анализов перекрестного примирования. SKMC трансфицировали, а через 48 часов помещали в кокультуру с iDC, которую еще через 24 часа выделяли и доводили до созревания. Затем к mDC добавляли аутологичные PBL и кокультивирование проводили в течение 7 дней. После этого стимуляцию PBL повторяли и еще через 7 дней CD8⁺ T-лимфоциты выделяли и исследовали в анализах CTL посредством кокультивирования с сингенными целевыми клетками. B. Вестерн-блоттинг клеточных лизатов на основании родительских или стабильно трансфицированных Nef^mut клеток MCF-7. Фильтры инкубировали антителами к Nef или к β-актину. Стрелки обозначают соответствующий белковый продукт. Молекулярные маркеры представлены в кДа. C. Анализ CTL, проводимый в результате кокультивирования примированных CD8⁺ T-лимфоцитов с клетками MCF-7, экспрессирующими или не экспрессирующими Nef^mut в соотношении клеток 10:1. Результаты представлены в виде средних значений + SD, рассчитанных на основании трех повторов условий из трех независимых экспериментов. * p<0,05. Среднее значение фоновых условий (т.е., кокультуры наивных CD8⁺ T-лимофицитов с MCF-7): 11,9 ± 5.

На Фиг. 15 показано, что обработка ингибиторами синтеза экзосом блокирует перекрестно примирование, индуцированное DC, выделенными из кокультур с трансфицированными SKMC. SKMC трансфицировали ДНК-вектором, экспрессирующим слитый продукт Nef^mut/MART-1, а через 2 дня помещали в кокультуру с iDC в присутствии или в отсутствие GW4869 и спироэпоксида. Через 16 часов iDC выделяли, доводили до созревания и помещали в кокультуру с аутологичными PBL. Через два цикла после стимуляции CD8⁺ T-лимфоциты выделяли и подвергали воздействию в анализе CTL в результате кокультивирований 10:1 с мечеными CFSE сингенными B-LCL, ранее обработанными неродственными или специфическими в отношении MART-1 пептидами. Показаны средние проценты гибели целевых клеток + SD, рассчитанные на основании трех условий из трех независимых экспериментов. Среднее значение фоновых условий (т.е., кокультуры наивных CD8⁺ T-лимофицитов с необработанными сингенными B-LCL): 7,3 ± 2,1.

ПРИМЕР 1 : Противоопухолевая HPV E7-специфическая активность CTL, вызываемая сконструированными in vivo экзосомами путем инокуляции ДНК.

Материалы и способы

Молекулярные конструкции и клеточные культуры

Все молекулярные конструкции основывались на векторах с промотором IE-CMV. Конструкции векторов, экспрессирующих Nef^mut (13), Nef^mut-GFP (13), Nef_G2A-GFP (23), wtNef (24) и HPV-E7 (25), уже были описаны. 293T, мышечные клетки C₂C₁₂ мыши, и экспрессирующие HPV-E7 опухолевые клетки TC-1 выращивали в модифицированной по Иглу среде Дульбекко совместно с 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой (FCS). Анализы трансфекции проводили с помощью способа с использованием липофектамина 2000, который в случае клеток C₂C₁₂ модифицировали добавлением липосом на свежетрипсинизированные клетки. Спленоциты мыши и клетки EL-4, т.е., CD4⁺ T-клетки лимфомы тимуса мышей, изначально полученные от мышей C57 Bl/6 при обработке 9,10-диметил-1,2-бензантраценом, культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FCS.

Выделение, выявление и характеристика экзосом

Экзосомы выделяли из клеточных супернатантов путем дифференциального цетрифугирования. Более подробно, супернатанты центрифугировали при 500×g в течение 10 минут. Затем супернатанты подвергали дифференциальным центрифугированиям, состоящим из первого ультрацентрифугирования при 10000×g в течение 30 минут. Затем супернатанты собирали, фильтровали с использованием 0,22 мкМ размера пор и ультрацентрифугировали при 70000×g в течение 1 часа. Осажденные везикулы ресуспендировали в 1×PBS, и повторно ультрацентрифугировали при 70000×g в течение 1 часа. После этого осадки ресуспендировали в 1:100 исходного объема 1×PBS. Извлечение экзосом из плазмы инокулированных мышей проводили аналогичным образом, за исключением того, что образцы разводили в 5 раз перед исходными центрифугированиями, время выполнения которых удваивали. Количество извлеченных экзосом оценивали в результате измерения активности ацетилхолинэстеразы (AchE), т.е., классического экзосомального маркера, с помощью набора Amplex Red (Molecular Probes) в соответствии с рекомендациями производителя. Активность AchE измеряли в виде мЕд/мл, где 1 мЕд определяли в виде количества фермента, который гидролизует 1 пмоль ацетилхолина в холин и ацетат в минут при pH 8,0 при 37°C.

Флуоресцентные экзосомы из трансфицированных клеточных культур непосредственно выявляли с помощью FACS (Gallios, Beckman Coulter) или в случае экзосом, выделенных из плазмы крови, анализировали при связывании с латексными гранулами альдегида/сульфата (Invitrogen Molecular Probes). С этой целью образцы инкубировали с 5 мкл гранул в течение ночи при комнатной температуре на вращающемся планшете и затем промывали, ресуспендировали в 1×PBS-2% об./об. формальдегида и проводили анализ FACS.

В случае вестерн-блоттинга экзосом эквивалентные количества нановезикул лизировали в PBS, 1% Triton X-100 в присутствии антипротеолитических средств и затем отделяли с помощью 10% SDS-PAGE. Между тем, вестерн-блоттинг также проводили по отношению к лизатам трансфицированных клеток путем промывания клеток дважды 1×PBS (pH 7,4) и лизирования их в течение 20 минут на льду буфером для лизиса (20 мМ HEPES, pH 7,9, 50 мМ NaCl, 10 мМ EDTA, 2 мМ EGTA, 0,5% неионогенныый детергент IGEPAL CA-630, с добавкой антипротеолитических средств. Цельноклеточные лизаты центрифугировали при 6000×g в течение 10 минут при 4°C. Концентрацию белка клеточных экстрактов определяли с помощью количественного анализа белка по Лоури. Аликвоты от 30 до 50 мкг общего белка определяли с помощью 10% SDS-PAGE. Белки переносили путем электроблоттинга на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (Amersham) в течение ночи с помощью Bio-Rad Trans-Blot. Фильтры обнаруживали с использованием 1:1000 разведенной овечьей антисыворотки к Nef ARP 444 (великодушный подарок М. Харриса, Университет Лидса, Лидс, Великобритания), а также разведенного 1:250 mAb к β-актину AC-74 от Sigma и поликлональных антител к Alix H-270 от Santa Cruz.

Иммунизация мышей и выявление продуцирующих IFN-γ CD8⁺ T-лимфоцитов

Все исследования с использованием животных, описанные в данном документе, утверждали этическим комитетом Istituto Superiore di , Рим, Италия (протокол № 555/SA/2012) в соответствии с Законодательным декретом 116/92, который введен в действие в Италии Директивой ЕС 86/609/EEC в отношении защиты лабораторных животных. Животных, используемых в исследовании, содержали и подвергали обработке в соответствии с рекомендациями, включенными в данный документ выше, упомянутыми Законодательным декретом. Мышей С57 Bl/6 приобретали в Charles River Laboratories и инокулировали в/м два раза через десятидневные промежутки 50 мкг в каждую заднюю конечность плазмидной ДНК, очищенной не содержащим эндотоксина набором Qiagen. Мышей также инокулировали подкожно (п/к) 6 мЕд эквивалентов AchE активности экзосом, очищенных от плазмы крови мышей, которым вводили ДНК-векторы три раза через десятидневные промежутки и умерщвляли через десять дней после последней иммунизации. Для выявления специфических в отношении E7 и Nef CD8⁺ T-клеточных иммунных ответов спленоциты помещали в культуру в микролунки для Elispot с использованием IFN-γ (Millipore) в присутствии 5 мкг/мл HPV-E7 или HIV-1 Nef 8- или 9-мерных пептидов, уже идентифицированных в целях эффективного связывания комплекса H-2 K^b мышей C57 Bl/6, т.е., DLYCYEQL (аминокислоты 21-28) (SEQ ID NO: 3) и RAHYNIVTF (аминокислоты 49-57) (SEQ ID NO: 4) в случае E7 (HPV-16, номер доступа в Gene Bank AAD33252.1), и TAATNADCA (аминокислоты 48-56) (SEQ ID NO: 5) в случае Nef (HIV-1, штамм F12, номер доступа EMBL Z11530). Связывающиеся с Н-2 K^b специфические в отношении HPV E6 пептиды KLPQLCTEL (аминокислоты 18-26) (SEQ ID NO: 6) и YDFAFRDL (аминокислоты 50-57) (SEQ ID NO: 7) (HPV-16, номер доступа в Gene Bank AAD33253.1) использовали в качестве неродственных пептидов. После инкубации в течение ночи планшеты для Elispot с использованием IFN-γ проявляли (Mabtech AB) и пятнообразующие клетки анализировали и подсчитывали с помощью ридера Elispot (ридер A.EL.VIS. Elispot и компьютерная программа для анализа, GmbH).

Флуоресцентный микроскопический анализ

В случае анализа с помощью флуоресцентного микроскопа 7 мкМ срезы из четырехглавых мышц инокулированных мышей получали с помощью изготовления срезов с использованием криостата (Leika CM 3050) и помещали на предметные стекла. Затем срезы инкубировали с 4',6'-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Vector Laboratories) совместно со средой, препятствующей выгоранию флуоресценции. В конечном итоге покровные стекла помещали на предметные стекла, которые затем наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 Plus.

Анализ CTL

CD8⁺ T-клетки выделяли из спленоцитов инокулированных мышей с помощью положительного иммуномагнитного отбора (Miltenyi Biotec). Их помещали в кокультуру в течение 6 часов в RPMI 10% FCS с клетками EL-4, ранее мечеными сложным эфиром карбоксифлуоресцеинсукцинимидила (CFSE, Invitrogen), и обрабатывали в течение ночи пептидами E7 или неродственными пептидами. Кокультуры развивали при различных соотношениях клеток (т.е., от 20:1 до 5:1 эффекторых/целевых клеток) в 200 мкл RPMI 20% в 96-луночных планшетах с U-образным дном. После этого гибель клеток EL-4 подсчитывали с помощью анализа FACS вскоре после добавления 7-AAD в конечной концентрации 1 мкг/мл.

Выявление антител к E7 и Nef в плазме крови

Плазму крови от инокулированных мышей объединяли и двукратные последовательные разведения, начиная с 1:10, анализировали на наличие антител к E7. Конечное разведение соответствовало поглощению <0,1 OD при 450 нм. Каждый образец плазмы анализировали в трех повторах и среднее значение поглощения принимали в качестве конечного показателя. Для анализа использовали рекомбинантные E7 и Nef. Белки адсорбировали в течение ночи при 4°C в карбонатном буфере (pH 9,4) в микротитровальных планшетах Maxisorp (NUNC) в концентрациях 0,25 мкг/лунка. После этапа блокирования в течение 2 часов при 37C в PBS, содержащем 3% обезжиренное сухое молоко (NFDM), планшеты инкубировали при 37°C в течение 1 часа с 100 мкл последовательно разведенной плазмы крови в 1% NFDM-PBS. Специфические комплексы антиген-антитело выявляли с помощью конъюгированного с пероксидазой козьего антитела к IgG мыши (GE Healthcare Ltd) с использованием тетраметилбензидина в качестве субстрата. Через 30 минут при комнатной температуре ферментативную реакцию останавливали в результате добавления 50 мкл 1 M серной кислоты/лунка. Этапы промывания осуществляли с использованием 200 мкл/лунка PBS, содержащего 0,05% Tween-20, в автоматической мойке.

Противоопухолевые эффекты Nef^mut/E7 экзосом

Противоопухолевая активность, индуцируемая инокуляцией Nef^mut/E7 вектора экспрессии, оценивали у мышей, которых ранее подвергали атаке 2×10⁵ клеток TC-1. Инокуляции ДНК осуществляли через 4 и 11 дней после атаки опухолевых клеток в соответствии с вышеописанным протоколом, и только у мышей, у которых развивались пальпируемые опухоли. Опухолевый рост отслеживали с помощью визуального контроля, пальпации и измерения диаметра опухолевых узлов, рассчитанного как (длина × ширина²)/2. В конце времени наблюдения опухоли эксплантировали и взвешивали.

Статистический анализ

При необходимости данные представляли в виде средних значений +/- стандартное отклонение (SD). В некоторых случаях использовали парный критерий Стьюдента и подтверждали с помощью непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона. p < 0,05 считали значимым.

Результаты

Выявление сконструированных экзосом, высвобождаемых трансфицированными ДНК мышечными клетками мыши

Мышечные клетки представляют собой идеальную мишень для эффективной и стабильной экспрессии эктопической ДНК при введении in vivo. Целью было экспрессирование Nef^mut ДНК-векторов in vivo с целью конструирования экзосом, конститутивно высвобождаемых клетками, экспрессирующими инокулируемую ДНК. Предполагалось, что эти эндогенные экзосомы демонстрируют характеристики, по меньшей мере аналогичные таковым, получаемым в культурах тканей с точки зрения индукции антигенспецифических иммунных ответов CTL.

Как уже оценивали в типах человеческих клеток различного происхождения, предварительно исследовали и то, была ли интернализация Nef^mut ДНК-вектора экспрессии в мышечных клетках мыши достаточной для образования сконструированных экзосом. Примечательно, что мышечные клетки мыши высвобождают нановезикулы с экзосомоподобными характеристиками, биогенез которых, однако, отличается от такового генерируемых MVB экзосом. С целью внесения ясности, экзосомоподобные нановезикулы, высвобождаемые мышечными клетками мыши, в данном документе обозначаются экзосомами.

Мышечные клетки C₂C₁₂ мыши и в качестве контроля клетки 293T человека трансфицировали вектором, экспрессирующим GFP, слитым на C-конце с изотипом Nef^mut или Nef (т.е., Nef_G2A), уже характеризовали за свою неэффективность ассоциироваться с экзосомами (26). Трансфицированные клеточные культуры отслеживали в отношении соответствующей эффективности трансфекции (Фиг. 2A), которая в мышечных клетках, по-видимому, составляла свыше 50% эффективности, выявляемой в клетках 293T. Супернатанты собирали и экзосомы выделяли с помощью дифференциальных центрифугирований. Затем экзосомальные препараты титровали с точки зрения активности AchE (Фиг. 2B). Эти два типа клеток, по-видимому образовывали аналогичные уровни AchE-положительных нановезикул, вне зависимости от условий трансфекции. Вестерн-блоттинг равных количеств экзосом продемонстрировал наличие происходящих из Nef молекул в экзосомах из клеток 293T и C₂C₁₂, трансфицированных Nef^mut-GFP, но не Nef_G2A-GFP векторами (Фиг. 2C). Анализ FACS экзосомальных препаратов подтвердил ассоциацию флуоресценции с нановезикулами, извлеченными из клеток C₂C₁₂, трансфицированных Nef^mut-GFP, но не Nef_G2A-GFP (Фиг. 2D).

В совокупности было доказано, что экзосомоподобные нановезикулы, высвобождаемые мышечными клетками мыши, могут быть сконструированы с помощью производных Nef^mut, как ранее доказано в эпителиоподобных трансформированных клетках 293T человека.

Продукты производых Nef^mut могут быть выявлены в экзосомах из плазмы крови мышей, инокулированных ДНК

На основании результатов in vitro, которые были получены с использованием мышечных клеток мыши, предпринимали попытку экспрессии Nef^mut вектора in vivo. С этой целью 50 мкг Nef^mut-GFP, Nef_G2A-GFP или пустого вектора инокулировали в каждую четырехглавую мышцу мышей C57 Bl/6. Через три дня несколько инокулированных мышей умерщвляли, а их конечности криоконсерваровали. Затем срезы, полученные из областей инокуляции, анализировали в отношении экспрессии связанных с GFP продуктов. В соответствии с уже описанными свойствами Nef и его мутантов/производных, Nef^mut, по-видимому, накапливался в области плазматической мембраны, при этом располагаясь также в виде внутриклеточных точечных отложений. В отличие от этого, мутант Nef_G2A, вследствие отсутствия N-концевого миристоилирования, располагался более диффузным внутрицитоплазматическим образом (Фиг. 3A). Через три и девять дней после инокуляции плазму крови извлекали из оставшихся инокулированных мышей, а экзосомы выделяли с помощью дифференциальных центрифугирований. Экзосомальные препараты затем титровали с точки зрения активности AchE и одинаковые количества экзосом связывали с белыми латексными гранулами альдегида/сульфата. При применении этого способа предполагалось, что даже редкие флуоресцентные нановезикулы подлежат выявлению с помощью анализа FACS. Положительные сигналы подсчитывали в образцах, содержащих экзосомы, выделенные из мышей через 3 и 9 дней после введения Nefmut-GFP, но не NefG2A-GFP вектора (Фиг. 3B).

Эти результаты указывали на то, что инокуляция в мышей векторов, экспрессирующих производные Nef^mut может приводить к образованию сконструированных экзосом.

Специфический в отношении HPV-E7 ответ CTL при в/м инокуляции Nef^mut/E7 ДНК-вектора экспрессии

После этого оценивали иммуногенность антигенов, загруженных в экзосомы, образующиеся в результате инокуляции ДНК-векторов, экспрессирующих производные Nef^mut. С этой целью мышей C57 Bl/6 (шесть на группу) инокулировали в/м в каждую заднюю конечную 50 мкг векторов, экспрессирующих только Nef^mut/E7 или E7, или пустого вектора. Следует отметить, что анализ иммунного ответа после введения вектора, экспрессирующего только E7, был инструментом для оценки эффекта слияния Nef^mut с точки зрения иммуногенности CD8⁺ T-клеток. Инокуляции повторяли через 10 дней, а еще через 10 дней мышей умерщвляли и спленоциты культивировали в течение ночи в микропланшетах Elispot с использованием IFN-γ в присутствии неродственных, специфических в отношении Nef- или E7 H-2 K^b нонамеров. Уровни CD8⁺ T-клеточной активации, наблюдаемые в культурах с использованием неродственных пептидов, оставались на фоновых уровнях и аналогичными таковым, выявляемым в спленоцитах, культивируемых в отсутствие пептидов (не показано). С другой стороны, активацию клеток отчетливо выявляли в спленоцитах от мышей, инокулированных Nef^mut/E7 вектором экспрессии после инкубации с E7 или Nef нонамерами (Фиг. 4A). И, наоборот, отсутствие CD8⁺ T-клеточного ответа выявляли в культурах спленоцитов от мышей, получавших E7 вектор экспрессии или пустой вектор, вне зависимости от используемого пептида.

Для оценки того, ассоциировался ли CD8⁺ T-клеточный ответ с измеримой активностью CTL, CD8⁺ T-клетки выделяли из пулов спленоцитов и затем помещали в кокультуры в течение 6 часов при различных соотношениях клеток (таких как, от 20:1 до 5:1) с использованием меченых CFSE клеток EL-4, предварительно обработанных в течение ночи неродственными или E7 нонамерами. После этого кокультуры метили 7-AAD и уровни гибели целевых клеток подсчитывали с помощью FACS. Результаты, представленные на Фиг. 4B, показывают отчетливое повышение гибели целевых клеток в кокультурах 20:1 и 10:1, содержащих CD8⁺ T-лимфоциты только от мышей, инокулированных Nef^mut/E7 вектором экспрессии с EL-4, предварительно обработанным специфическими в отношении E7 нонамерами. Этот результат демонстрировал, что активированные CD8⁺ T-лимфоциты, выявляемые у мышей, инокулированных Nef^mut/E7 вектором экспрессии, с помощью анализа Elispot с использованием IFN-γ, обладал специфической в отношении E7 цитотоксической активностью. Примечательно, что антитела к E7, выявляли только в плазме крови от мышей, инокулированных вектором, экспрессирующим только E7 (Фиг. 4C).

В совокупности эти данные указывали на то, что в/м инокуляция вектора, экспрессирующего гетерологичный антиген, слитый с Nef^mut, приводит к индукции выраженного антигенспецифического ответа CTL в отсутствие продуцирования антител.

Инокуляция ДНК-вектора, экспрессирующего изоформу Nef дикого типа, не вызывает специфическую в отношении Nef CD8⁺ T-клеточную активацию

Результаты доказывают, что в/м введение ДНК-векторов, экспрессирующих производные Nef^mut, приводит к образованию экзосом, нагруженных продуктами Nef^mut, коррелирующему с индукцией ответа CTL против чужеродного антигена, включенного в экзосомы. Для подтверждения гипотезы о том, что высокие уровни включения Nef^mut в экзосомы были обязательными для того, чтобы вызывать антигенспецифический CD8⁺ T-клеточный ответ, воспроизводили эксперименты по иммуногенности, однако с помощью инокуляции мышей векторами, экспрессирующими изоформу дикого типа Nef, которая включается в экзосомы при гораздо более низких количествах по сравнению с Nef^mut (13). С этой целью мышам C57 Bl/6 (пять на группу) вводили в/м в каждую заднюю конечную 50 мкг вектора, экспрессирующего только wtNef или Nef^mut, или пустого вектора. Инокуляции повторяли через 10 дней, а еще через 10 дней мышей умерщвляли. После этого сплетоциты выделяли и культивировали в течение ночи в микропланшетах Elispot с использованием IFN-γ в присутствии неродственных или специфических в отношении Nef нонамеров. Как показано на Фиг. 5, мыши, инокулированные вектором, экспрессирующим wtNef, в отличие от мышей, получающих Nef^mut вектор, не демонстрировали специфический в отношении Nef CD8⁺ T-клеточный ответ.

Эти результаты указывают на то, что эффективность антигена, загружаемого в экзосомы, является определяющей для индукции иммунного ответа, также указывая на то, что функции wtNef сами по себе не были включены в наблюдаемую CD8⁺ T-клеточную активацию.

Экзосомы, выделенные из плазмы крови мышей, иммунизированных ДНК-вектором, экспрессирующим Nef^mut/E7, индуцируют специфический в отношении E7 ⁺ T-клеточный ответ у сингенных мышей.

Для подкрепления гипотезы о том, что CD8⁺ T-клеточный иммунный ответ, выявляемый при инокуляции Nef^mut векторов экспрессии, основан на образовании in vivo сконструированных экзосом, оценивали то, были ли экзосомы, очищенные от плазмы крови инокулированных мышей иммуногенными у наивных мышей-реципиентов. С этой целью восемь мышей инокулировали векторами, экспрессирующими E7, Nef^mut/E7, или пустым вектором в соответствии с указанным выше в данном документе графиком. Через восемь дней после последней иммунизации PBMC извлекали в результате забора крови из ретроорбитальных пазух и помещали в микролунки для Elispot с использованием IFN-γ для проверки специфического в отношении E7 CD8⁺ T-клеточного ответа. Как уже было замечено, введение вектора, экспрессирующего Nef^mut/E7, но не вектора, экспрессирующего только E7, приводило к отчетливо выявляемому специфическому в отношении E7 CD8⁺ T-клеточного ответа (Фиг. 6A). Плазму крови из гомогенных групп объединяли и экзосомы выделяли с помощью дифференциальных центрифугирований. После этого экзосомы титровали с точки зрения активности AchE, и эквивалент 6 мЕд активности AchE экзосом вводили п/к в сингенных мышей три раза с интервалами десять дней. В конечном итоге мышей умерщвляли и спленоциты исследовали в отношении специфических в отношении E7 CD8⁺ T-клеточных ответов. Интересно, что в результате культивирования в течение ночи в микропланшетах для Elispot с использованием IFN-γ замечали специфическую в отношении E7 клеточную активацию только в культурах спленоцитов от мышей, инокулированных экзосомами, очищенными от мышей, которым вводили Nef^mut/E7 вектор экспрессии (Фиг. 6B).

Эти результаты указывали на то, что в/м введение ДНК, экспрессирующей Nef^mut/E7, приводила к образованию иммуногенных экзосом, тем самым, дополнительно подтверждая гипотезу о том, что образование с использованием ДНК эндогенных сконструированных экзосом происходило на основе наблюдаемого выраженного специфического в отношении E7 CD8⁺ T-клеточного иммунного ответа.

Терапевтический противоопухолевый эффект специфического в отношении HPV-E7 ответа CTL, индуцированного в/м инокуляцией Nef^mut/E7 ДНК-вектора экспрессии

В конечном итоге оценивали выраженность CD8⁺ T-клеточного иммунного ответа, вызванного введением Nef^mut/E7 вектора экспрессии с точки зрения противоопухолевого эффекта. С этой целью проводили анализы терапевтической иммунизации мышей C57 Bl/6, инокулированных п/к 2×10⁵ клетками TC-1. Мышей, у которых развивалась опухолевая масса, выявляемая с помощью пальпации, т.е., приблизительно 2 мм в диаметре, затем инокулировали 50 мкг/задняя конечность векторов, экспрессирующих пустой вектор, Nef^mut (4 мыши на каждую группу) или Nef^mut/E7 (шесть мышей) на день 4 и день 11 после имплантации клеток. В качестве контроля 4 мышам с ипмлантируемой опухолью вводили только носитель. На день 21 проводили забор крови из ретроорбитальных пазух у мышей, которым вводили Nef^mut или Nef^mut/E7 векторы экспрессии, который способствовал оценке индукции специфического в отношении E7 CD8⁺ T-клеточного иммунного ответа (Фиг. 7A). Рост опухолей отслеживали в течение 30 дней, а после этого мышей умерщвляли, опухоли эксплантировали и взвешивали. На Фиг. 7B отчетливо показано, что в то время как введение контрольных ДНК-векторов не вызывало роста имплантированных опухолевых клеток, их экспансия была значительно нарушена у мышей, инокулированных Nef^mut/E7 вектором, при этом опухолевые клетки, по-видимому, по-прежнему исчезали у 3 мышей, что подтверждали при оценки веса опухоли (Фиг. 7C).

Исходя из этих данных можно сделать вывод о том, что инокуляция Nef^mut/E7 ДНК-вектора экспрессии вызывала CD8⁺ T-клеточный иммунный ответ также в присутствии опухолевых клеток. Наиболее важным являлось то, что иммунный ответ был выраженным и достаточно быстрым для того, чтобы существенно ингибировать рост ранее имплантированных сингенных опухолевых клеток.

В совокупности эти результаты представляли собой значимое достижение в направлении терапевтических применений стратегий иммунизации с использованием эндогенных экзосом на основе Nef^mut.

ПРИМЕР 2: Исследование CD8+ T-клеточного иммунитета, вызванного инокуляцией in vivo векторов, экспрессирующих антигены, слитые с Nef^mut

Стратегию иммунизации на основе инокуляции ДНК-векторов, экспрессирующих антиген, слитый с C-концом Nef^mut, также успешно применяли к ряду дополнительных вирусных антигенов (см. Табл. 1). Более конкретно, векторы, экспрессирующие такие антигены, слитые с Nef^mut, вводили мышам C57 Bl/6 или Balb/c в соответствии с указанным выше в данном документе графиком. Через 10-15 дней после последней инокуляции анализы ELISPOT с использованием IFN-γ проводили с использованием спленоцитов от мышей, которым выполняли введение, с помощью пептидов, описанных в Табл. 1.

Результаты подтверждали гипотезу о том, что введение ДНК, экспрессирующей антигены, слитые с Nef^mut, представляло собой средство индукции иммунитета CTL против широкого диапазона полноразмерных антигенов.

ПРИМЕР 3: Исследование активности CTL, вызываемой сконструированными in vivo экзосомами в соответствии с настоящим изобретением при раке молочной железы

Материалы и способы

Молекулярные конструкции

ДНК, кодирующую внеклеточный домен (ECD) активированного rHER2/neu, извлекали с помощью RT-PCR, проводимого в отношении общей РНК, экстрагируемой из клеток N202.1A, т.е., клеточной линии, происходящей от мышей FVB, трансгенных по rHER-2/neu (27). Использовали следующие праймеры, содержащие сайты рестрикции Nhe I и Eco RI на соответствующем 5' конце: прямой (расположенный непосредственно ниже по отношению к сигнальному пептиду) 5' CTAGCT AGCACCCAAGTGTGTACCGGC 3'(SEQ ID NO:18); обратный: 5'CCGGAATTCTCAGTGGGT CA GTTGATGGG 3'(SEQ ID NO:19). Для получения вектора, экспрессирующего слитый продукт Nef^mut/HER2-ECD, продукт ПЦР разрезали Nhe I/Eco RI, и включали в рамку на 3' конце переваренного Nhe I/Eco RI вектора на основе pcDNA3, экспрессирующего Nef^mut. С помощью этой стратегии предполагалось, что последовательности HER2-ECD крысы и мыши сливаются с Nef^mut в образующихся молекулярных конструкциях. Отбор осуществляли на основе присутствия последовательности rHER2/neu. Уже описывали векторы, экспрессирующие Nef^mut, Nef^mut/GFP и Nef^mut/MART-1 (13). Вектор с промотором IE-CMV, экспрессирующий rHER2/neu, любезно предоставлен A. Amici, Урбинский университет, Италия.

Клеточные культуры и трансфекции

293T, MCF-7, мышечные клетки C₂C₁₂ (все получены из Американской коллекции типовых культур), и клетки TC-1 (28) выращивали в модифицированной по Иглу среде Дульбекко совместно с 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой (FCS). Анализы трансфекции проводили с помощью способа с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), который в случае клеток C₂C₁₂ модифицировали добавлением липосом на свежетрипсинизированные клетки. B-LCL HLA-A.02 (29), спленоциты мышей, и CD8⁺ T-клеточные лимфоциты культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FCS. Первичные скелетные мышечные клетки человека (SKMC) получали от Lonza и культивировали с использованием рекомендуемой среды.

PBMC человека получали от здоровых доноров с помощью градиентов Fycoll-Hypaque. Моноциты выделяли из PBMC с помощью иммуномагнитного набора для отбора моноцитов (Miltenyi). Чистоту извлеченных клеточных популяций анализировали с помощью анализа FACS с использованием конъюгированного с PE mAb к CD14 (Becton Dickinson). Моноциты дифференцировали до iDC при культивировании в течение 4-5 дней в среде RPMI с добавлением 20% FCS, 30 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (Serotec Ltd) и 500 Ед/мл IL-4 (R&D Systems). Созревание DC получали с помощью обработки в течение носи 10 нг/мл липополисахарида (LPS).

Получение и очистка экзосом

Экзосомы выделяли с помощью дифференциальных центрифугирований, как ранее описано (30), начиная с супернатантов клеток 293T через 48-72 часа после трансфекции. Количество извлеченных экзосом оценивали в результате измерения активности ацетилхолинэстеразы (AchE, т.е., классического экзосомального маркера) (31) с помощью набора Amplex Red (Molecular Probes, Thermo Fisher) в соответствии с рекомендациями производителя.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг клеточных лизатов и экзосом проводили, как описано (13). Фильтры обнаруживали с использованием 1:1000 разведенной овечьей антисыворотки к Nef ARP 444 (MRC), а также разведенного 1:250 mAb к β-актину AC-74 от Sigma и разведенных 1:100 поликлональных антител к Alix H-270 от Santa Cruz.

Мышиная модель

Все исследования с использованием животных, описанные в данном документе, утверждали этическим комитетом ISS (протокол № 107/2016-PR) в соответствии с Законодательным декретом 116/92, который введен в действие в Италии Директивой ЕС 86/609/EEC в отношении защиты лабораторных животных. Животных, используемых в исследовании, содержали и подвергали обработке в соответствии с рекомендациями, включенными в данный документ выше, упомянутыми Законодательным декретом. Использовали колонию трансгенных мышей 129Sv-NeuT, полученную и размноженную в виварии ISS (32). У этих мышей активированный ген rHER-2/neu активируется LTR MMLV и виргинные самки спонтанно развивают карциномы молочной железы, которые становятся пальпируемыми в возрасте 15-20 недель. Присутствие трансгена rHER2/neu обычно проверяют с помощью ПЦР, как описано (32). Мышей инокулировали в/м два раза в возрасте 15 и 17 недель 50 мкг в каждую четырехглавую мышцу плазмидной ДНК, очищенной не содержащий эндотоксина набором Qiagen. Молочные железы проверяли один раз в неделю для отслеживания опухолей. Мышей, несущих опухоли, превышающие 30 мм в диаметре, умерщвляли.

Выявление антител

Плазму крови от инокулированных мышей разводили 1:20 и исследовали на наличие антител к HER2/neu на клетках 293T, трансфицированных за два дня HER2/neu вектором экспрессии. Через 2 часа инкубации при 4°C клетки промывали конъюгированными с FITC антителами к IgG мыши, и через 1 час проводили анализ FACS. В качестве положительного контроля использовали клон 7.16.4 разведенного 1:20 mAb к HER2/neu (Sigma).

Анализ ELISPOT

Для выявления специфических в отношении HER2/neu и Nef CD8⁺ T-клеточных иммунных ответов спленоциты помещали в микролунки для Elispot с использованием IFN-γ (Millipore) в присутствии 5 мкг/мл HER2 или HIV-1 Nef 9-мерных пептидов, связывающих комплекс H-2 K^b трансгенных мышей 129Sv, т.е., ILHDGAYSL (аминокислоты 436-444) (33) и TAATNADCA (аминокислоты 48-56) (34) соответственно. В качестве контроля использовали гетерологичные пептиды, связывающие Н-2 K^b (35). После инкубации в течение ночи планшеты для Elispot с использованием IFN-γ проявляли (Mabtech) и подсчитывали пятнообразующие единицы (SFU).

Анализ перекрестного примирования

В общей сложности 10⁶ SKMC трансфицировали 10 мкг Nef^mut векторов или контрольных векторов. Через 48 часов клетки помещали в кокультуру с iDC в соотношении клеток 1:5 и в некоторых случаях в присутствии 2 мкМ ингибиторов биосинтеза экзосом GW4869 и спироэпоксида (36-41). После инкубации в течение ночи iDC выделяли и доводили до созревания в результате обработки LPS в течение 24 часов. После этого iDC промывали и помещали в кокультуру с аутологичными лимфоцитами периферической крови (PBL) в соотношении клеток 1:10. Через неделю процедуру стимуляции повторяли, а еще через неделю CD8⁺ T-клетки извлекали для анализов CTL.

Анализы CTL

Анализы CTL с использованием клеток мыши проводили с помощью выделения CD8⁺ T-клеток из спленоцитов в результате положительного иммуномагнитного отбора (Miltenyi). Их помещали в кокультуру в течение 6 часов в RPMI 10% FCS с клетками TC-1, ранее мечеными сложным эфиром карбоксифлуоресцеинсукцинимидила (CFSE, Invitrogen, Thermo Fisher) в соответствии с рекомендациями производителя, и обрабатывали в течение ночи пептидами HER2/neu, Nef или неродственными пептидами. Кокультуры развивали в соотношении эффекторных/целевых клеток 10:1 в 200 мкл RPMI 20% в 96-луночных планшетах с U-образным дном. После этого гибель клеток TC-1 подсчитывали с помощью анализа FACS вскоре после добавления 7-AAD в конечной концентрации 1 мкг/мл. Анализы CTL в клетках человека проводили аналогичным образом, за исключением того, что в качестве целевых клеток использовали MCF-7 или B-LCL.

Конфокальный микроскопический анализ

Кокультуры, полученные в течение ночи, содержащие iDC и SKMC, трасфицированные за два дня до этого векторами, экспрессирующими GFP или Nef^mut/GFP, содержали при соотношении клеток 1:5 в присутствии или в отсутствие GW4869 и спироэпоксида. После этого культуры окрашивали сначала антителом к CD45 (т.е., маркером iDC) в течение 1 часа при 4°C, и затем конъюгированными с Alexa-Fluor 610 вторичными антителами. В конечном итоге кокультуры метили 4',6'-диамино-2-фенилиндолом (DAPI, Vector Laboratories) и фиксировали в забуференном формальдегиде (2% об./об.). Фазово-контрастные и флуоресцентные изображения записывали с помощью устройства Olympus IX-81.

Статистический анализ

При необходимости данные представляли в виде средних значений +/- стандартное отклонение (SD). В некоторых случаях использовали парный критерий Стьюдента и подтверждали с помощью непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона. p < 0,05 считали значимым.

Результаты

Внеклеточный домен rHER2/neu эффективно загружается в экзосомы при слиянии с Nef^mut.

ECD rHER2/neu, лишенный сигнального пептида, сливали на C-конце Nef^mut в контексте эукариотического вектора с промотором IE-CMV. Для проверки стабильности и экзосомального включения слитого продукта клетки 293T транзиентно трансфицировали векторами, экспрессирующими Nef^mut или Nef^mut/HER2-ECD, или пустым вектором. Через 48 часов клетки лизировали и супернатанты подвергали дифференциальным центрифугированиям с выделением экзосом. Клеточные и экзосомальные лизаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга (Фиг. 8). Слитый продукт, по-видимому, был стабильным и загружался при значимых степенях в экзосомы. Аналогичные результаты получали в результате трансфекции мышечных клеток C₂C₁₂ мыши (не показано).

Введение в трансгенных мышей rHER2/neu ДНК-вектора, экспрессирующего Nef^mut/HER2-ECD, индуцирует специфическую активацию CD8⁺ T-лимфоцитов в отсутствие ответа со стороны антител

Выдвигали предположение, как уже было доказано в случае других слитых продуктов на основе Nef^mut (21), что в/м введение в мышей Nef^mut/HER2-ECD вектора экспрессии приводило к образованию иммуногенных эндогенно сконструированных экзосом, содержащих слитый продукт Nef^mut/HER2-ECD. Вопрос заключался в том, являлась ли предполагаемая CD8⁺ T-лимфоцитарная иммуногенность этих экзосом достаточно сильно для того, чтобы нарушать толерантность в отношении HER2/neu.

Вначале исследовали индукцию антител к HER2/neu, т.е., эффект, уже описанный у мышей, которым вводили rHER2/neu ДНК-векторы (42, 43). С этой целью трансгенным мышам HER2/neu вводили ДНК-векторы, экспрессирующие Nef^mut или Nef^mut/HER2-ECD (3 на группу). Через пятнадцать дней после второго введения плазму крови извлекали и исследовали на наличие антител к HER2/neu с использованием в качестве индикаторных клеток 293T, транзиентно трансфицированных ДНК-вектором, экспрессирующим HER2/neu. Как описано на Фиг. 9, специфических в отношении HER2/neu антител в плазме крови от мышей, которым вводили ДНК-вектор, экспрессирующий Nef^mut/HER2-ECD, не выявляли. В отличие от этого, антитела выявляли в плазме крови от мышей, которым вводили лизаты клеток, экспрессирующих rHER2/neu, как ранее описано (32). Эти результаты, по-видимому, находились в соответствии с ранее описанными касательно отсутствия ответа со стороны антител против продуктов, включенных в сконструированные экзосомы (14, 21).

Затем анализировали антигенспецифический CD8⁺ T-лимфоцитарный ответ, исследуя спленоциты от мышей, которым проводили введение, с помощью анализов Elispot с использованием IFN-γ, проводимых при стимуляции ограниченными в отношении H2^b Nef и HER2-ECD нонамерами. Как показано на Фиг. 10, активацию лимфоцитов выявляли в случае, когда спленоциты от мышей, которым вводили ДНК, экспрессирующую Nef^mut, стимулировали пептидом Nef, но не пептидом HER2-ECD. С другой стороны, пептиды Nef и HER2-ECD индуцировали активацию лимфоцитов в культурах спленоцитов от мышей, которым вводили Nef^mut/HER2-ECD. Аналогичные результаты получали при исследовании PBMC, извлеченных в результате забора крови из ретроорбитальных пазух (не показано).

Эти данные показывали индукцию специфических в отношении Nef и HER/neu CD8⁺ T-лимфоцитарных ответов у мышей, которым вводили Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектор.

Индукция антигенспецифической активности CTL у трансгенных мышей rHER2/neu, которым вводили Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектор экспрессии.

После этого целью исследования была оценка того, могло ли введение Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектора экспрессии индуцировать специфическую в отношении HER2/neu активность CTL. С этой целью CD8⁺ T-лимфоциты выделяли из спленоцитов трансгенных мышей HER2/neu, инокулированных пустым вектором или векторами, экспрессирующими Nef^mut или Nef^mut/HER2-ECD. CD8⁺ T-лимфоциты затем помещали в кокультуру с сингенными мечеными CFSE клетками TC-1, предварительно обработанными соответствующими пептидами. Через 5 часов развитие кокультур останавливали, их метили 7-AAD и анализировали с помощью FACS для оценки процента мертвых целевых клеток TC-1. Как показано на Фиг. 11, повышение гибели целевых клеток выявляли в случае, когда CD8⁺ T-лимфоциты от мышей, которым вводили Nef^mut ДНК-вектор, кокультивировали с TC-1, предварительно обработанными пептидом Nef. Более важным является то, что активность CTL также была очевидной, когда CD8⁺ T-лимфоциты от мышей, которым вводили Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектор, кокультивировали с TC-1, предварительно обработанными специфическими в отношении Nef или HER2, ограниченными в отношении H2^b пептидами.

Эти результаты связывали в/м введение Nef^mut/HER2-ECD ДНК-вектора и индукцию специфической в отношении HER2/neu активности CTL.

Нарушение толерантности HER2/neu связано с противоопухолевой активностью

После этого целью исследования была оценка того, была ли связана специфическая в отношении HER2-ECD активность CTL с выявляемой противоопухолевой активностью. Трансгенным мышам 129Sv-Neu T в возрасте пятнадцати недель, еще не содержащим пальпируемых поражений, вводили носитель или ДНК-векторы, экспрессирующие Nef^mut и Nef^mut/HER2-ECD. Инъекции повторяли через две недели, а появление пальпируемых опухолей отслеживали еженедельно. Как описано на Фиг. 12, введение ДНК, экспрессирующей Nef^mut/HER2-ECD, было ассоциировано со значимой задержкой развития опухолей. Отслеживание останавливали во время первых умерщвлений, необходимых в связи с этическими причинами.

Эти данные подчеркивали непосредственную связь между специфической в отношении HER2-ECD активностью CTL, индуцируемой в результате в/м введения ДНК, и противоопухолевой активностью.

Трансляция платформы CTL-вакцины по отношению к человеку: индукция антигенспецифической активности CTL с помощью сконструированных экзосом

Для предоставления возможности исследования платформы CTL-вакцин в клинической практике, демонстрация ее эффективности в организме человека является обязательной. С этой целью организовывали эксперименты, в которых исследуют условия, по меньшей мере отчасти воспроизводящие механизм, лежащий в основе индукции антигенспецифического CD8⁺ T-лимфоцитарного иммунного ответа, ранее описанного у мышей, которым вводили Nef^mut ДНК-векторы экспрессии (1). Впервые описывали перенос экзосом из трансфицированных мышечных клеток в iDC. SKMC трансфицировали GFP или Nef^mut/GFP ДНК-векторами, а эффективность трансфекции проверяли с помощью анализа FACS (Фиг. 13A). В этом отношении ранее было описано, что экспрессия Nef^mut/GFP приводит к образованию флуоресцентных экзосом (13). После кокультивирования трансфицированных SKMC с iDC присутствие флуоресцентных агрегатов в iDC подтверждали с помощью конфокального микроскопического анализа при мечении реципиентных iDC mAb к CD45 (Фиг. 13B, средние панели). Между тем, флуоресценцию GFP не выявляли в популяции CD45⁺ клеток в случае, когда использовали SKMC, а также в случае, когда кокультуры обрабатывали ингибиторами биосинтеза экзосом GW4869 и спироэпоксидом (Фиг. 13B, левая и правая панели соответственно). Этот результат подтверждал гипотезу о том, что вхождение молекул Nef^mut/GFP в iDC было опосредовано межклеточным переносом экзосом.

Затем выполняли анализы перекрестного примирования, направленные на оценку индукции антигенспецифической активности CTL, как обобщено на Фиг. 14A. Более подробно, SKMC трансфицировали ДНК-векторами, экспрессирующими производные Nef^mut, а затем кокультивировали с iDC HLA-A.02. Через двадцать четыре часа iDC выделяли, доводили до созревания с помощью LPS и затем помещали в кокультуру с аутологичными PBL. Кокультуры со зрелыми (m) DC-PBL поддерживали в течение семи дней, а после этого лимфоциты выделяли и подвергали второму циклу стимуляции в результате добавления свежих mDC, ранее кокультивированных с трансфицированными SKMC. Еще через семь дней лимфоциты извлекали из кокультур, фракцию CD8⁺ T выделяли и помещали в кокультуру в контексте анализа CTL с клетками MCF-7 HLA-A.02, исходными или сконструированными для стабильной экспрессии Nef^mut (Фиг. 14B). Результаты на основании анализов CTL (Фиг. 14C) показали гибель целевых клеток MCF-7/Nef^mut, по-видимому, в большей степени, чем тогда, когда их подвергали воздействию CD8⁺ T-клеток, стимулированных DC, кокультивированными с экспрессирующими Nef^mut SKMC по сравнению с выявляемыми в кокультурах с CD8⁺ T-клетками, стимулированными DC из кокультур с SKMC, трансфицированными контрольным вектором. С другой стороны, никакой антигенспецифической активности CTL не выявляли в процессе использования исходных MCF-7 в качестве целевых клеток.

Затем эти исследования расширяли в направлении антигенов, слитых с Nef^mut. Кроме этого, проверяли происходило ли образование сконструированных экзосом на основании индукции антигенспецифической активности CTL. С этой целью воспроизводили анализы перекрестного примирования с использованием ДНК-вектора, экспрессирующего Nef^mut, слитый с MART-1, т.е., ассоциированным с меланомой антигеном человека (44), и в соответствии с процедурами, представленными на Фиг. 14A, за исключением того, что поддержание кокультур SKMC-iDC проводили в присутствии или в отсутствие ингибиторов биосинтеза экзосом GW4869 и спироэпоксида. В конечном итоге анализы CTL осуществляли в результате кокультивирования CD8⁺ T-лимфоцитов с B-LCL HLA-A.02, ранее обработанными ограниченным в отношении HLA-A.02 MART-1 (т.е., AAGIGILTV (SEQ ID NO: 20), аминокислоты 27-35) (45) или неродственными пептидами. Как описано на Фиг. 15, стимулированные CD8⁺ T-лимфоциты демонстрировали специфическую в отношении MART-1 активность CTL. В то же время, ее больше не выявляли тогда, когда использовали CD8⁺ T-лимфоциты, стимулированные DC из кокультур с SKMC, поддерживаемых в присутствии ингибиторов экзосом.

Эти данные указывали на то, что образование трансфицированными мышечными клетками экзосом сконструированных с целью включения Nef^mut или его производных, представляет собой часть механизма, лежащего в основе антигенспецифической активности CTL, наблюдаемой в случае клеток человека. Таким образом, эти результаты подтверждали гипотезу о том, что платформа CTL-вакцины характеризуется потенциалом к применению против опухолевых антигенов у человека.

Литературные источники

1. Halstead S.B., S.J. Thomas. 2011. New Japanese encephalitis vaccines: alternatives to production in mouse brain. Expert Rev. Vaccines. 10: 355-64. doi:10.1586/erv.11.7.

2. Ng T., D. Hathaway, N. Jennings, D. Champ, Y.W. Chiang, H.J. Chu. 2013. Equine vaccine for West Nile virus. Dev. Biol.; 114: 221-7.

3. El Garch H., J.M. Minke, J. Rehder, S. Richard, C. Edlund Toulemonde, S. Dinic, C. Andreoni, J.C. Audonnet, R. Nordgren, V. Juillard. 2008. A West Nile virus (WNV) recombinant canarypox virus vaccine elicits WNV-specific neutralizing antibodies and cell-mediated immune responses in the horse. Vet. Immunol. Immunopathol. 123: 230-9.

4. O., T.N. Eagar, E.M. Frohman, P.D. Cravens. 2007. DNA plasmid vaccination for multiple sclerosis. Arch. Neurol. 64: 1385-6.

5. Guescini M., D. Guidolin, L. Vallorani, L. Casadei, A.M. Gioacchini, P. Tibollo, M. Battistelli, E. Falcieri, L. Battistin, L.F. Agnati, V. Stocchi. 2010. C₂C₁₂ myoblasts release micro-vesicles containing mtDNA and proteins involved in signal transduction. Exp Cell Res. 16: 1977-84. doi:10.1016/j.yexcr.2010.04.006.

6. Romancino D.P., G. Paterniti, Y. Campos, A. De Luca, V. Di Felice, A. d'Azzo, A. Bongiovanni. 2013. Identification and characterization of the nano-sized vesicles released by muscle cells. FEBS Lett. 587: 1379-84. doi:10.1016/j.febslet.2013.03.012.

7. Morse M.A., J. Garst, T. Osada, S. Khan, A. Hobeika, T.M. Clay, N. Valente, R. Shreeniwas, M.A. Sutton, A. Delcayre, D.H. Hsu, J.B. Le Pecq, H.K. Lyerly. 2005. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J. Transl Med. 3:9.

8. Escudier B., T. Dorval, N. Chaput, T. , M.P. Caby, S. Novault, C. Flament, C. Leboulaire, C. Borg, S. Amigorena, C. Boccaccio, C. Bonnerot, O. Dhellin, M. Movassagh, S. Piperno, C. Robert, V. Serra, N. Valente, J.B. Le Pecq, A. Spatz,C O. Lantz, T. Tursz, E. Angevin, L. Zitvogel. 2005. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J. Transl Med. 3:10.

9. Dai S., D. Wei, Z. Wu, X. Zhou, X. Wei, H. Huang, G. Li. 2008. Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combined with GM-CSF for colorectal cancer. Mol Ther. 16: 782-90. doi: 10.1038/mt.2008.1.

10. Tan A., H. De La , A.M. Seifalian. 2010. The application of exosomes as a nanoscale cancer vaccine. Int J Nanomedicine. 5: 889-900. doi:10.2147/IJN.S13402.

11. Chaput N., C. . 2011 Exosomes: immune properties and potential clinical implementations. Semin Immunopathol. 33:419-40. doi:10.1007/s00281.

12. Peretti S., I. Schiavoni, K. Pugliese, M. Federico. 2005. Cell death induced by the herpes simplex virus-1 thymidine kinase delivered by human immunodeficiency virus-1-based virus-like particles. Mol Ther. 12: 1185-96.

13. Lattanzi L., M. Federico. 2012. A strategy of antigen incorporation into exosomes: comparing cross-presentation levels of antigens delivered by engineered exosomes and by lentiviral virus-like particles. Vaccine. 30: 7229-37. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.10.010.

14. Di Bonito P., B. Ridolfi, S. Columba-Cabezas, A. Giovannelli, C. Chiozzini, F. Manfredi, S. Anticoli, C. Arenaccio, M. Federico. 2015. HPV-E7 delivered by engineered exosomes elicits a protective CD8⁺ T cell-mediated immune response. Viruses. 7: 1079-99. doi: 10.3390/v7031079.

15. Fry EA, Taneja P, Inoue K. 2016. Clinical applications of mouse models for breast cancer engaging HER2/neu. Integr Cancer Sci Ther 3(5):593-603.

16. Rolla S, C, Malinarich S, Orsini M, Forni G, Cavallo F, Ria F. 2006. Distinct and non-overlapping T cell receptor repertoires expanded by DNA vaccination in wild-type and HER-2 transgenic BALB/c mice. J Immunol 177(11):7626-7633.

17. Rovero S, Amici A, Di Carlo E, Bei R, Nanni P, Quaglino E, Porcedda P, Boggio K, Smorlesi A, Lollini PL, Landuzzi L, Colombo MP, Giovarelli M, Musiani P, Forni G. 2000. DNA vaccination against rat her-2/Neu p185 more effectively inhibits carcinogenesis than transplantable carcinomas in transgenic BALB/c mice. J. Immunol 165(9):5133-5142.

18. Quaglino E, Iezzi M, Mastini C, Amici A, Pericle F, Di Carlo E, Pupa SM, De Giovanni C, Spadaro M, Curcio C, Lollini PL, Musiani P, Forni G, Cavallo F.2004. Electroporated DNA vaccine clears away multifocal mammary carcinomas in her-2/neu transgenic mice. Cancer Res 64(8):2858-2864.

19. Quaglino E, Mastini C, Iezzi M, Forni G, Musiani P, Klapper LN, Hardy B, Cavallo F. 2005. The adjuvant activity of BAT antibody enables DNA vaccination to inhibit the progression of established autochthonous Her-2/neu carcinomas in BALB/c mice. Vaccine 23(25):3280-3287.

20. Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. 2011. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science 331(6024):1565-1570.

21. Di Bonito P, Chiozzini C, Arenaccio C, Anticoli S, Manfredi F, Olivetta E, Ferrantelli F, Falcone E, Ruggieri A, Federico M. 2017. Antitumor HPV E7-specific CTL activity elicited by in vivo engineered exosomes produced through DNA inoculation. Int J Nanomedicine 12:4579-4591.

22. van der Burg SH, Arens R, Ossendorp F, van Hall T, Melief CJ. 2016. Vaccines for established cancer: overcoming the challenges posed by immune evasion. Nat Rev Cancer 16(4):219-233.

23. Keppler O.T., I. Allespach, L. , D. Fenard, W.C. Greene, O.T. Fackler. 2005. Rodent cells support key functions of the human immunodeficiency virus type 1 pathogenicity factor Nef. J. Virol. 79: 1655-65.

24. D'Aloja P., E. Olivetta, R. Bona, F. Nappi, D. Pedacchia, K. Pugliese, G. Ferrari, P. Verani, M. Federico. 1998. gag, vif, and nef genes contribute to the homologous viral interference induced by a nonproducer human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) variant: identification of novel HIV 1-inhibiting viral protein mutants. J. Virol. 72: 4308-19.

25. Massa S., P. Simeone, A. Muller, E. Benvenuto, A. Venuti, R. Franconi. 2008. Antitumor activity of DNA vaccines based on the human papillomavirus-16 E7 protein genetically fused to a plant virus coat protein. Hum. Gene Ther. 19: 354-64. doi: 10.1089/hum.2007.122.

26. Arenaccio C., C. Chiozzini, S. Columba-Cabezas, F. Manfredi, M. Federico. 2014. Cell activation and HIV-1 replication in unstimulated CD4⁺ T lymphocytes ingesting exosomes from cells expressing defective HIV-1. Retrovirology. 11: 46. doi: 10.1186/1742-4690-11-46.

27. Nanni P, Nicoletti G, De Giovanni C, Landuzzi L, Di Carlo E, Cavallo F, Pupa SM, Rossi I, Colombo MP, Ricci C, Astolfi A, Musiani P, Forni G, Lollini PL. 2001. Combined allogeneic tumor cell vaccination and systemic interleukin 12 prevents mammary carcinogenesis in HER-2/neu transgenic mice. J Exp Med 194:1195-1205.

28. Halbert CL, Demers GW, Galloway DA. 1991. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol 65: 473-478.

29.Di Bonito P, Grasso F, Mochi S, Petrone L, Fanales-Belasio E, Mei A, Cesolini A, Laconi G, Conrad H, Bernhard H, Dembek CJ, Cosma A, Santini SM, Lapenta C, Donati S, Muratori C, Giorgi C, Federico M. 2009. Anti-tumor CD8⁺ T cell immunity elicited by HIV-1-based virus-like particles incorporating HPV-16 E7 protein. Virology 395:45-55.

30. C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. 2006. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol 3. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

31. Rieu S, C, Rabesandratana H, Sainte-Marie J, Vidal M. 2000. Exosomes released during reticulocyte maturation bind to fibronectin via integrin alpha4beta1. Eur J Biochem; 267: 583-590.

32. E, Sestili P, Carpinelli G, Canese R, Cecchetti S, Schiavoni G, D'Urso MT, Belardelli F, Proietti E. 2016. Chemo-immunotherapy induces tumor regression in a mouse model of spontaneous mammary carcinogenesis. Oncotarget 7(37): 59754-59765.

33. Gritzapis AD, Mahaira LG, Perez SA, Cacoullos NT, Papamichail M, Baxevanis CN. 2006. Vaccination with human HER-2/neu (435-443) CTL peptide induces effective antitumor immunity against HER-2/neu-expressing tumor cells in vivo. Cancer Res 66(10):5452-5460.

34. Liang X, Fu TM, Xie X, Emini EA, Shiver JW. 2002. Development of HIV-1 Nef vaccine components: immunogenicity study of Nef mutants lacking myristoylation and dileucine motif in mice. Vaccine 20:413-421.

35. Bauer S, Heeg K, Wagner H, Lipford GB. 1995. Identification of H-2Kb binding and immunogenic peptides from human papilloma virus tumour antigens E6 and E7. Scand J Immunol 42:317-323.

36. Chairoungdua A, Smith DL, Pochard P, Hull M,Caplan MJ. 2010. Exosome release of beta-catenin: a novel mechanism that antagonizes Wnt signaling. J Cell Biol 190:1079-1091.

37. Kogure T, Lin WL, Yan IK, Braconi C, Patel T. 2011. Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology 54:1237-1248.

38. Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, Takeshita F, Matsuki Y, Ochiya T. 2010. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J Biol Chem 285: 17442-17452.

39. Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, Hagiwara K, Takeshita F, Ochiya T. 2012. Competitive interactions of cancer cells and normal cells via secretory microRNAs. J Biol Chem 287:1397-1405.

40. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, Rajendran L, Wenzel D, Wieland F, Schwille P, B, Simons M. 2008. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 319:1244-1247.

41. Yuyama K, Sun H, Mitsutake S, Igarashi Y. 2012. Sphingolipid-modulated exosome secretion promotes clearance of amyloid-beta by microglia. J Biol Chem 287:10977-10989.

42. Nanni P, Landuzzi L, Nicoletti G, De Giovanni C, Rossi I, Croci S, Astolfi A, Iezzi M, Di Carlo E, Musiani P, Forni G, Lollini PL. 2004. Immunoprevention of mammary carcinoma in HER-2/neu transgenic mice is IFN-gamma and B cell dependent. J Immunol 173(4):2288-2296.

43. Rolla S, Marchini C, Malinarich S, Quaglino E, Lanzardo S, Montani M, Iezzi M, Angeletti M, Ramadori G, Forni G, Cavallo F, Amici A. 2008. Protective immunity against neu-positive carcinomas elicited by electroporation of plasmids encoding decreasing fragments of rat neu extracellular domain. Hum Gene Ther 19(3):229-240.

44. Busam KJ, Jungbluth AA. 1996. Melan-A, a new melanocytic differentiation marker. Adv Anat Pathol 6: 12-18.

45. Rivoltini L, Kawakami Y, Sakaguchi K, Southwood S, Sette A, Robbins PF, Marincola FM, Salgaller ML, Yannelli YR, Appella E, Rosenberg SA. 1995. Induction of tumor-reactive CTL from peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes of melanoma patients by in vitro stimulation with an immunodominant peptide of the human melanoma antigen MART-1. J Immunol 154: 2257-2265.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИСТИТУТО СУПЕРИОРЕ ДИ САНИТА’

<120> НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ЯКОРНЫЙ БЕЛОК

ЭКЗОСОМ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИНЫ

<130> PCT40823

<150> IT 102016000101794

<151> 2016-10-11

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 1

Met Gly Cys Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Ala Val

1 5 10 15

Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala

20 25 30

Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr

35 40 45

Ala Ala Thr Asn Ala Asp Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu

50 55 60

Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly

85 90 95

Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Pro

115 120 125

Thr Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys

130 135 140

Leu Val Pro Val Glu Pro Glu Lys Leu Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu

145 150 155 160

Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro

165 170 175

Gly Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His

180 185 190

His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys

195 200 205

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 2

atgggttgca agtggtcaaa aagtagtgtg gttggatggc ctgctgtaag ggaaagaatg 60

agacgagctg agccagcagc agatggggtg ggagcagcat ctcgagacct agaaaaacat 120

ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca 180

caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 240

tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 300

attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 360

ttccctgatt ggcagaacta cacaccagga ccaggggtta gatatccact gacctttgga 420

tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gagaagttag aagaagccaa caaaggagag 480

aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catggaatgg atgacccggc gagagaagtg 540

ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600

gagtacttca agaactgctg a 621

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Human papillomavirus type 16

<400> 3

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Human papillomavirus type 16

<400> 4

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 5

Thr Ala Ala Thr Asn Ala Asp Cys Ala

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Human papillomavirus type 16

<400> 6

Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Human papillomavirus type 16

<400> 7

Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Ebola virus

<400> 8

Lys Phe Ile Asn Lys Leu Asp Ala Leu His

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Ebola virus

<400> 9

Asp Ala Val Leu Tyr Tyr His Met Met

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> Ebola virus

<400> 10

Leu Arg Ile Gly Asn Gln Ala Phe Leu Gln Glu Phe Val Leu Pro Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Ebola virus

<400> 11

Val Tyr Gln Val Asn Asn Leu Glu Glu Ile Cys

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Ebola virus

<400> 12

Asp Ala Val Leu Tyr Tyr His Met Met

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Hepatitis C virus

<400> 13

Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Hepatitis C virus

<400> 14

Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> West Nile virus

<400> 15

Gly Tyr Ile Ser Thr Lys Val Glu Leu

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> West Nile virus

<400> 16

Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Pro Arg Thr Asn Thr Ile Leu

1 5 10 15

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 17

Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met

1 5

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> forward primer

<400> 18

ctagctagca cccaagtgtg taccggc 27

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> reverse primer

<400> 19

ccggaattct cagtgggtca gttgatggg 29

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLA-A.02-restricted MART-1

<400> 20

Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val

1 5

<---

1. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит (i) человеческий HIV-1 Nef белок с мутациями 3C, 153L и 177G, слитый на своем C-конце с (ii) иммуногенным антигеном, для применения в вакцинопрофилактике и вакцинотерапии с помощью индукции иммунного ответа CTL.

2. Экспрессионный вектор по п.1, где слитый белок состоит из (i) человеческого HIV-1 Nef белка с мутациями 3C, 153L и 177G, слитого на его C-конце с (ii) иммуногенным антигеном.

3. Экспрессионный вектор по п.1, где антиген выбирают из группы, состоящей из антигена вируса папилломы человека, антигена HIV, антигена вируса Эбола, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена HBV, антигена HCV, антигена вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым, антигена вируса гриппа A, антигена меланомы человека и опухоль-ассоциированных антигенов человека.

4. Экспрессионный вектор по п.3, где антиген вируса папилломы человека представляет собой E6 или E7, антиген HIV представляет собой Gag или Tat, антиген вируса Эбола представляет собой VP24, VP40, NP или GP, антиген вируса лихорадки Западного Нила представляет собой NS3, антиген HBV представляет собой Core, антиген HCV представляет собой Core, NS3, E1 или E2, антиген вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым представляет собой GP или NP, антиген вируса гриппа A представляет собой NP или M1, антиген меланомы человека представляет собой MAGE-A3 и MART-1 и опухоль-ассоциированный антиген человека представляет собой Her2/Neu или Hox B7.

5. Вакцинная композиция, включающая:

экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит (i) человеческий HIV-1 Nef белок с мутациями 3C, 153L и 177G, слитый на своем C-конце с (ii) иммуногенным антигеном, и

один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей и/или адьювантов.

6. Вакцинная композиция по п.5, где антиген выбирают из группы, состоящей из антигена вируса папилломы человека, антигена HIV, антигена вируса Эбола, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена HBV, антигена HCV, антигена вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым, антигена вируса гриппа A, антигена меланомы человека и опухоль-ассоциированных антигенов человека.

7. Вакцинная композиция по п.6, где антиген вируса папилломы человека представляет собой E6 или E7, антиген HIV представляет собой Gag или Tat, антиген вируса Эбола представляет собой VP24, VP40, NP или GP, антиген вируса лихорадки Западного Нила представляет собой NS3, антиген HBV представляет собой Core, антиген HCV представляет собой Core, NS3, E1 или E2, антиген вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым представляет собой GP или NP, антиген вируса гриппа A представляет собой NP или M1, антиген меланомы человека представляет собой MAGE-A3 и MART-1 и опухоль-ассоциированный антиген человека представляет собой Her2/Neu или Hox B7.

8. Вакцинная композиция по п.5, где фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для внутримышечного введения.

9. Вакцинная композиция по п.5, где адъваюнт представляет собой адъювант CD8+ T-клеточного ответа.

10. Способ индукции иммунного ответа CTL у субъекта, где способ включает введение субъекту экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий слитый белок, при этом указанный слитый белок содержит (i) человеческий HIV-1 Nef белок с мутациями 3C, 153L и 177G, слитый на своем C-конце с (ii) иммуногенным антигеном.

11. Способ индукции иммунного ответа CTL у субъекта по п.10, где антиген выбирают из группы, состоящей из антигена вируса папилломы человека, антигена HIV, антигена вируса Эбола, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена HBV, антигена HCV, антигена вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым, антигена вируса гриппа A, антигена меланомы человека и опухоль-ассоциированных антигенов человека.

12. Способ индукции иммунного ответа CTL по п.11, где антиген вируса папилломы человека представляет собой E6 или E7, антиген HIV представляет собой Gag или Tat, антиген вируса Эбола представляет собой VP24, VP40, NP или GP, антиген вируса лихорадки Западного Нила представляет собой NS3, антиген HBV представляет собой Core, антиген HCV представляет собой Core, NS3, E1 или E2, антиген вируса геморрагической лихорадки Конго-Крым представляет собой GP или NP, антиген вируса гриппа A представляет собой NP или M1, антиген меланомы человека представляет собой MAGE-A3 и MART-1 и опухоль-ассоциированный антиген человека представляет собой Her2/Neu или Hox B7.