Композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака
Группа изобретений относится к способу лечения рака, способу уменьшения размера опухоли, способу повышения выживаемость субъекта, имеющего рак, способу усиления иммунного ответа против опухоли, способу лечения аутоиммунного заболевания и способу ослабления воспалительного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, где модулятор содержит антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или рекомбинантный слитый белок сиглека-15. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение рака, уменьшение размера опухоли, повышение выживаемости, усиление иммунного ответа против опухоли, аутоиммунного заболевания, ослабление воспалительного ответа. 6 н. и 38 з.п. ф-лы, 27 ил., 18 пр.
Родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/253437, поданной 10 ноября 2015 г., которая включена здесь посредством ссылки в ее полном объеме.
Уровень техники
Известно, что рак является одной из основных причин смерти в промышленно развитых странах. Причиной рака является прогрессирующий рост потомства одной трансформированной клетки. Для лечения рака необходимо, чтобы все злокачественные клетки были элиминированы или разрушены без гибели пациента. Привлекательным способом достижения этого будет индукция иммунного ответа против опухоли, который мог бы различать опухолевые клетки и их нормальные аналоги. Действительно, иммунная система обладает большим потенциалом для специфического разрушения опухолей без проявления токсичности для нормальной ткани. Естественная способность иммунной системы обнаруживать и уничтожать аномальные клетки может предупредить развитие многих видов рака. Кроме того, долгосрочная память иммунной системы может предупредить рецидивирование рака.
Однако опухолевые клетки иногда могут избежать обнаружения и разрушения иммунной системой, за счет снижения экспрессии опухолевых антигенов на их поверхности, что затрудняет их распознавание иммунной системой. Альтернативно, опухолевые клетки могут экспрессировать белки на их поверхности, которые индуцируют инактивацию иммунных клеток, или стимулируют клетки в микроокружении на высвобождение веществ, которые подавляют иммунные реакции и способствуют пролиферации и выживаемости опухолевых клеток. Таким образом, сохраняется постоянная потребность в идентификации новых молекул, которые модулируют иммунные реакции против опухолей, для разработки новых иммунотерапевтических агентов (Sznol M. и Chen L., Clin. Cancer Res., 19 (5): 1021-1034, 2013).
Клеточные мембраны иммунных клеток покрыты плотной оболочкой из различных гликанов, таких как сиаловая кислота, которые распознаются различными гликан-связывающими белками. Связывающие сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобные лектины (сиглеки) представляют собой семейство мембранных белков типа I, которые регулируют функции клеток врожденной и адаптивной иммунной системы посредством распознавания гликанов. (Kameda Y. et al., J. Bone Miner. Res., 2013, 28 (12): 24463-75). Белки сиглеки содержат компонент связывания сиаловой кислоты и Ig-подобную молекулу. Они участвуют в клеточных адгезионных взаимодействиях, функциях нейронов и головного мозга, и развитии нейронов. Имеются два более мелких члена семейства сиглеков: сиглек-14 и cиглек-15. Обе эти молекулы содержат небольшие внутриклеточные домены и внутримембранные домены, которые могут фосфорилироваться. Они достаточно малы, чтобы передавать сигналы через клеточную мембрану за счет их размера. Эти члены семейства сиглеков встречаются как у мыши, так и человека, и являются высоко эволюционно-консервативными между видами.
Предшествующие данные по микрочипам показывают, что сиглек-15 присутствует на миелоидных клетках периферической крови, на макрофагах и моноцитах. Сиглек-15 обычно экспрессируется на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, В-клетках и остеокластах. Экспрессия сиглека-15 в моноцитах, миелоидных клетках и В-клетках может индуцироваться и повышающе регулироваться лигандом RANK и M-CSF (Stuible M. et al., J. Biol. Chem., 2014, 289 (10): 6498-512; Takamiya R. et al., Glycobiology, 2013; 23 (2): 178-87). У сиглек-15-дефицитных мышей отмечен слабый остеопетроз, вызванный нарушением развития остеокластов (Kameda Y. et al., J. Bone Miner. Res., 28 (12): 24463-75, 2013). Несмотря на то, что роль сиглека-15 в дифференцировке остеокластов и ремоделировании костей была хорошо изучена, мало что известно об иммунологической функции сиглека-15 (Stuible M. et al., J. Biol. Chem., 2014, 289 (10): 498-512). Результаты недавних исследований показали наличие экспрессии и совместной локализации сиглека-15 и CD68 в опухолях легкого, аденокарциноме прямой кишки и гепатоцеллюлярной карциноме, экспрессия которых была обнаружена на макрофагах, что также подтверждает экспрессию сиглека-15 на миелоидных клетках (Takamiya R. et al., Glycobiology, 2013; 23 (2): 178-87).
Следовательно, в данной области существует потребность в идентификации дополнительных молекул, которые модулируют иммунные ответы против опухолей, чтобы расширить уровень успеха и в полной мере использовать противоопухолевую и аутоиммунную иммунотерапию.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на обнаружении того, что сиглек-15 играет критическую роль в подавлении иммунных реакций на рак, обеспечивая, таким образом, обоснование для манипулирования с путем сиглека-15 для разработки в будущем терапевтических препаратов против рака. В частности, было обнаружено, что снижение экспрессии сиглека-15 уменьшает размер опухоли и повышает выживаемость мышей с опухолями головного мозга. Кроме того, ингибирование активности сиглека-15 блокированием взаимодействия между сиглеком-15 и его лигандами на мышиной модели воспаления головного мозга, а также отмена экспрессии сиглека-15 у мышей с нокаутом сиглека-15, приводили к обострению воспаления головного мозга.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способам лечения рака или усиления иммунного ответа на рак ингибированием или подавлением экспрессии и/или активности сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В другом аспекте настоящее изобретение включает способы лечения аутоиммунного заболевания или снижения воспалительного ответа у субъекта повышением экспрессии и/или активности сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора cиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым осуществляя лечение рака у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора сиглека-15, антагонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка сиглека-15 или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на сиглек-15. В еще одних вариантах осуществления слитый белок сиглек-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
В некоторых вариантах осуществления модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет молекулу растворимого Sialyl-Tn. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с Sialyl-Tn.
В некоторых вариантах осуществления модулятор снижает уровни экспрессии и/или активности MAG и/или LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления модулятор снижает уровень экспрессии и/или активности белков, содержащих Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора MAG, антагонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка MAG, ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на MAG, низкомолекулярного ингибитора LRRC4C, антагонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка LRRC4C или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, почечноклеточной карциномы, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга. В еще одних вариантах осуществления рак головного мозга представляет глиобластому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет рак ободочной кишки, эндометриоидный рак, рак почки (например, папиллярно-клеточную карциному почки, светлоклеточную карциному почки), рак печени, рак щитовидной железы, рак легкого (например, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого), рак головы и шеи, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, глиобластому, рак прямой кишки или рак желчных протоков. В одном варианте осуществления рак представляет рак головного мозга. В одном варианте осуществления рак представляет глиобластому. В одном варианте осуществления рак не является раком крови. В одном варианте осуществления рак не является лейкозом. В одном варианте осуществления рак не является острым миелоидным лейкозом (AML).
В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
В еще одних вариантах осуществления субъект является человеком.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения размера опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора cиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым уменьшая размер опухоли у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора сиглека-15, антагонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка сиглека-15 или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на сиглек-15. В некоторых вариантах осуществления слитый белок сиглек-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
В некоторых вариантах осуществления модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена.
В некоторых вариантах осуществления модулятор снижает экспрессию и/или активность MAG и LRRC4C. В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора MAG, антагонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка MAG, ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на MAG, низкомолекулярного ингибитора LRRC4C, антагонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка LRRC4C или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления опухоль ассоциирована с раком, выбранным из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, почечноклеточной карциномы, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга. В еще одних вариантах осуществления рак головного мозга представляет глиобластому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет рак ободочной кишки, эндометриоидный рак, рак почки (например, папиллярно-клеточную карциному почки, светлоклеточную карциному почки), рак печени, рак щитовидной железы, рак легкого (например, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого), рак головы и шеи, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, глиобластому, рак прямой кишки или рак желчных протоков. В одном варианте осуществления рак представляет рак головного мозга. В одном варианте осуществления рак представляет глиобластому. В одном варианте осуществления рак не является раком крови. В одном варианте осуществления рак не является лейкозом. В одном варианте осуществления рак не является острым миелоидным лейкозом (AML).
В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
В еще одних вариантах осуществления субъект является человеком.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу повышения выживаемости субъекта, имеющего рак, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым повышая выживаемость субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора сиглека-15, антагонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка сиглека-15 или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на сиглек-15. В некоторых вариантах осуществления слитый белок сиглек-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
В некоторых вариантах осуществления модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена.
В некоторых вариантах осуществления модулятор снижает экспрессию и/или активность MAG и LRRC4C. В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора MAG, антагонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка MAG, ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на MAG, низкомолекулярного ингибитора LRRC4C, антагонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка LRRC4C или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, почечноклеточной карциномы, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга. В еще одних вариантах осуществления рак головного мозга представляет глиобластому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет рак ободочной кишки, эндометриоидный рак, рак почки (например, папиллярно-клеточную карциному почки, светлоклеточную карциному почки), рак печени, рак щитовидной железы, рак легкого (например, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого), рак головы и шеи, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, глиобластому, рак прямой кишки или рак желчных протоков. В одном варианте осуществления рак представляет рак головного мозга. В одном варианте осуществления рак представляет глиобластому. В одном варианте осуществления рак не является раком крови. В одном варианте осуществления рак не является лейкозом. В одном варианте осуществления рак не является острым миелоидным лейкозом (AML).
В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
В еще одних вариантах осуществления субъект является человеком.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым усиливая иммунный ответ против опухоли субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора сиглека-15, антагонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка сиглека-15 или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на сиглек-15. В некоторых вариантах осуществления слитый белок сиглек-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
В некоторых вариантах осуществления модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена.
В некоторых вариантах осуществления модулятор снижает экспрессию и/или активность MAG и LRRC4C. В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора MAG, антагонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка MAG, ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на MAG, низкомолекулярного ингибитора LRRC4C, антагонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка LRRC4C или ингибирующего пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления опухоль ассоциирована с раком, выбранным из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, почечноклеточной карциномы, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга. В еще одних вариантах осуществления рак головного мозга представляет глиобластому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет рак ободочной кишки, эндометриоидный рак, рак почки (например, папиллярно-клеточную карциному почки, светлоклеточную карциному почки), рак печени, рак щитовидной железы, рак легкого (например, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого), рак головы и шеи, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, глиобластому, рак прямой кишки или рак желчных протоков. В одном варианте осуществления рак представляет рак головного мозга. В одном варианте осуществления рак представляет глиобластому. В одном варианте осуществления рак не является раком крови. В одном варианте осуществления рак не является лейкозом. В одном варианте осуществления рак не является острым миелоидным лейкозом (AML).
В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
В еще одних вариантах осуществления субъект является человеком.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор повышает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым осуществляя лечение аутоиммунного заболевания у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного активатора сиглека-15, агонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, или белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления модулятор способствует взаимодействию между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор повышает экспрессию и/или активность MAG и LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного активатора MAG, агонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию MAG, низкомолекулярного активатора LRRC4C, агонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, или белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию LRRC4C.
В еще одних вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из белка MAG, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок MAG, белка LRRC4C или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок LRRC4C. В одном варианте осуществления модулятор представляет синтетический Sialyl-Tn или синтетический пептид, несущий Sialyl-Tn.
В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание является воспалительным заболеванием головного мозга. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет рассеянный склероз. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым осуществляя лечение аутоиммунного заболевания у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления белок сиглек-15 выбран из группы, состоящей из полноразмерного белка сиглека-15, функционального фрагмента сиглека-15 или IgV-домена сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание является воспалительным заболеванием головного мозга. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет рассеянный склероз. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор повышает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым ослабляя воспалительный ответ в головном мозге у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного активатора сиглека-15, агонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, или белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления модулятор способствует взаимодействию между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд представляет Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор повышает экспрессию и/или активность MAG и LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного активатора MAG, агонистического антитела к MAG или его антигенсвязывающего фрагмента, белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию MAG, низкомолекулярного активатора LRRC4C, агонистического антитела к LRRC4C или его антигенсвязывающего фрагмента, или белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию LRRC4C.
В еще одних вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из белка MAG, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок MAG, белка LRRC4C или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления воспалительный ответ в головном мозге ассоциирован с рассеянным склерозом. В некоторых вариантах осуществления воспалительный ответ в головном мозге ассоциирован с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым ослабляя воспалительный ответ в головном мозге у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления белок сиглек-15 выбран из группы, состоящей из полноразмерного белка сиглека-15, функционального фрагмента сиглека-15 или IgV-домена сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления воспалительный ответ в головном мозге ассоциирован с рассеянным склерозом. В некоторых вариантах осуществления воспалительный ответ в головном мозге ассоциирован с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, пригодного для лечения аутоиммунного заболевания или рака у субъекта, включающему обеспечение испытуемого соединения; определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15; и выбор соединения, которое модулирует экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для лечения аутоиммунного заболевания или рака у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления повышение экспрессии и/или активности сиглека-15 указывает, что соединение пригодно для лечения аутоиммунного заболевания. В еще одних вариантах осуществления снижение экспрессии и/или активности сиглека-15 указывает, что соединение пригодно для лечения рака.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, пригодного для усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающему обеспечение испытуемого соединения; определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15; и выбор соединения, которое снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, пригодного для ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом, включающему обеспечение испытуемого соединения; определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15; и выбор соединения, которое повышает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к модулятору сиглека-15, где модулятор модулирует взаимодействие между сиглеком-15 и MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор связывается с IgV-доменом сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления модулятор связывается с эпитопом, содержащим остаток 143 сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления модулятор является ингибитором сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления ингибитор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора сиглека-15, антагонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, рекомбинантного слитого белка сиглека-15, или ингибиторного пептида или нуклеиновой кислоты, нацеленных на сиглек-15.
В некоторых вариантах осуществления модулятор является активатором сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления активатор выбран из группы, состоящей из низкомолекулярного активатора сиглека-15, агонистического антитела к сиглеку-15 или его антигенсвязывающего фрагмента, или белка и нуклеиновой кислоты, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию сиглека-15.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами и подробным описанием, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1А показан паттерн экспрессии РНК сиглека-15 в разных тканях мыши с использованием ОТ-ПЦР. На фиг. 1В показан паттерн экспрессии РНК сиглека-15 в тканях человека с использованием анализа микрочипов. На фиг. 1С графически показан паттерн экспрессии сиглека-15 на основе анализа микрочипов. Сиглек-15 в основном экспрессируется на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, В-клетках и остеокластах.
На фиг. 2 показаны уровни экспрессии сиглека-15 в злокачественной опухоли человека по сравнению с нормальной тканью.
На фиг.3А показана экспрессия человеческого сиглека-15 в опухолевых клеточных линиях человека, как определено с использованием данных микрочипов NCI60 (BioGPS, условные единицы). На фиг. 3В показана экспрессия человеческого сиглека-15 в опухолевых клеточных линиях человека, как определено с использованием FACS.
На фиг. 4А показано взаимодействие между сиглеком-15 и связывающими лигандами, миелин-ассоциированным гликопротеином (MAG) и лейцин-богатым повтором 4C (LRRC4C). Взаимодействие между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C является высоко консервативным между мышью и человеком. На фиг. 4B показано связывание между антигеном Sialyl-Tn и слитым белком сиглек-15-mIg или контрольным mIg, как определено с использованием биосенсоров с иммобилизованным стрептавидином Octet.
На фиг. 5 показана экспрессия мРНК MAG в нормальной ткани и в злокачественной опухоли. Экспрессия MAG имеет место на высоком уровне в головном мозге или опухоли головного мозга.
На фиг. 6 показана экспрессия mRNA LRRC4C в нормальной ткани и в злокачественной опухоли. Экспрессия LRRC4C подвержена повышаюшей регуляции в злокачественных опухолях, таких как опухоль головного мозга, опухоль молочной железы, опухоль яичника, почечноклеточная карцинома и саркома Юинга.
На фиг.7 графически показан связывающий домен для сиглек-15-MAG или LRRC4C. В частности, IgV-домен сиглека-15 необходим для взаимодействия с MAG и LRRC4C. Мутация в R143A в IgV-домене препятствует связыванию с MAG или LRRC4C, на основании чего можно предположить, что оба лиганда связываются с остатком 143 IgV-домена в сиглеке-15.
На фиг. 8А показан уровень включения 3H-тимидина в РВМС, стимулированных анти-CD3-антителом OKT3, и подвергшихся воздействию иммобилизованного человеческого сиглека-15 или контрольного IgG. На фиг.8В показан уровень люциферазной активности, наблюдаемой в клетках Jurkat NF-AT с репортером люциферазой после инкубации с клетками 293T.mT3, сверхэкспрессирующими контрольную плазмиду (контроль), полноразмерный FASLG (FASLG), полноразмерный сиглек-15 (сиглек-15 FL), конструкцию, кодирующую эктодомен сиглек-15, и трансмембранный домен B7-H6 (сиглек-15 АТМ) или LRRC4C.
На фиг. 9А показан уровень включения 3H-тимидина в мышиные спленоциты, стимулированные иммобилизованным анти-CD3, и иммобилизованным мышиным слитым белком сиглек-15-mIgG (S15-mIg) или контрольным IgG (mIg). На фиг. 9В показан уровень включения 3H-тимидина в мышиные спленоциты, стимулированные иммобилизованным анти-CD3, и мышиным растворимым слитым белком сиглек-15-mIgG (S15-mIg) или контрольным IgG (mIg). На фиг. 9C показан уровень включения 3H-тимидина в активированные спленоциты от трансгенных мышей OT-1, совместно культивированных с клетками 293T-KbOVA, сверхэкспрессирующими мышиный полноразмерный сиглек-15 (KbOVA-S15) или ложный контроль (контроль KbOVA). На фиг. 9D показан уровень экспрессии сиглека-15 в трех клеточных линиях 293T-KbOVA, экспрессирующих мышиный сиглек-15. На фиг. 9E показан уровень IFN-γ, присутствующий в супернатанте активированных спленоцитов от трансгенных мышей OT-1, совместно культивированных с 293T-KbOVA, имеющих возрастающие уровни экспрессии сиглека-15 (определенные на фиг.9D). На фиг. 9F показан уровень TNF-α, присутствующего в супернатанте активированных спленоцитов от трансгенных мышей OT-1, совместно культивированных с клетками 293T-KbOVA, имеющих возрастающие уровни экспрессии сиглека-15.
На фиг. 10А показана зависимость доза-эффект гибели клеток-мишеней 293T-KbOVA под действием T-клеток ОT-1, по данным анализа цитотоксичности на основе адгезии (ACEA Biosciences). На фиг. 10B сравнивается сигнал адгезии клеток 293T-KbOVA, сверхэкспрессирующих сиглек-15 (293T-KbOVA-S15), с сигналом адгезии клеток, трансфецированных контрольной плазмидой, 293T-KbOVA (293T-KbOVA-контроль), в присутствии возрастающих количеств Т-клеток OT-1. Соотношения показывают долю Т-клеток OT-1 по отношению к клеткам 293T-KbOVA.
На фиг.11А представлена схематическая диаграмма модели активации OT-1 in vivo, описанной в примере 8. На фиг. 11В показан процент клеток OT-1 в общей популяции CD8 T-клеток в крови (левая панель) и селезенке (правая панель) мышей дикого типа (WT) или мышей с нокаутом во всем теле сиглека-15 (KO) после внутривенного переноса спленоцитов у мышей OT-1/RagKO. Процент клеток OT-1 определяли окрашиванием FACS с использованием тетрамера OT-1. На фиг.11С показана пролиферация клеток OT-1 крови на сутки 5, определенная окрашиванием анти-EdU, и рассчитанная в виде процента EdU-позитивных клеток OT-1/общему количеству OT-1-позитивных клеток. На фиг. 11D показан апоптоз спленоцитов, которые были выделены и культивированы в течение ночи без стимуляции, и окрашены на аннексин V. Апоптоз рассчитывали в виде процента аннексин V-позитивных клеток OT-1/общему количеству OT-1-позитивных клеток.
На фиг. 12А показан процент клеток ОТ-1 в общей популяции CD8 Т-клеток в крови мышей на различные временные точки после внутривенного переноса спленоцитов от мышей OT-1/RagKO в соответствии со схемой, представленной на фиг.11А. WT, мышь дикого типа; KO, мышь с нокаутом во всем теле сиглека-15; LysM-Cre KO, мышь с макрофаг-специфическим нокаутом сиглека-15. На фиг. 12B показан уровень IL-10 в плазме крови мышей с нокаутом во всем теле сиглека-15 KO и LysM-Cre KO, определенных во время реакции Т-клеток OT-1, по сравнению с мышами дикого типа.
На фиг. 13 показан процент миелоидных клеток, CD8+ клеток и CD4+ клеток в крови мышей дикого типа (WT) или мышей с нокаутом сиглека-15 (S15KO) в возрасте 11 месяцев.
На фиг. 14 показаны уровни цитокинов в супернатанте макрофагов, совместно культивированных с клетками 293T, которые сверхэкспрессируют контрольную плазмиду (контроль), полноразмерный LRRC4C или сиглек-15.
На фиг. 15 показано, что антитело к сиглеку-15 S15m02 функционирует как блокирующее антитело, которое нарушает связывание сиглека-15 с MAG или LRRC4C, тогда как антитело к сиглеку-15 S15m03 не влияет на взаимодействие между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C.
На фиг. 16 показано, что введение блокирующего антитела к сиглеку-15 S15m02, приводит к тому, что у мышей с EAE развивались более тяжелые симптомы заболевания, чем у их аналогов, которым вводили контрольное mAb, или которые получали антитело S15m03.
На фиг. 17 показано, что введение слитого белка сиглек-15-Fc мышам с EAE (с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом) вызывало обострение воспаления у этих мышей.
На фиг. 18 показано, что у мышей с нокаутом сиглека-15 (KO) (верхняя линия) имели место более тяжелые симптомы заболевания EAE, чем у мышей дикого типа (WT) (нижняя линия), что указывает на ингибирующую роль сиглека-15 в регуляции воспалительных ответов в головном мозге.
На фиг. 19А показаны баллы клинической оценки EAE у мышей WT, иммунизированных пептидом MOG, и дополнительно иммунизированных коклюшным токсином на сутки 0 и сутки 1 с последующей обработкой 100 мкг слитого белка сиглек-15-mIg (сиглек-15-mIg) или контрольного mIg (левая панель), или слитого белка сиглек-15-hIg (сиглек-15-hIg) или контрольного hIg (правая панель) два раза в неделю, начиная с суток 6, в целом животные получили 4 дозы. На фиг. 19В показано включение 3H-тимидина в спленоциты, полученные от мышей, обработанных контрольным mIg, на сутки 12, которых повторно стимулировали пептидом MOG (60 мкг/мл) в течение 3 суток в присутствии 5 мкг/мл слитого белка сиглек-15-mIg (S15-mIg) или контрольного mIg (mIg).
На фиг. 20 показано, что блокирование сиглека обработкой слитым белком сиглек-15-Fc достоверно уменьшало размер опухоли у мышей с глиобластомой.
На фиг. 21 показано, что блокирование сиглека обработкой слитым белком сиглек-15-Fc достоверно повышало выживаемость мышей с глиобластомой.
На фиг.22 показан синергетический эффект обработки слитым белком сиглек-15-Fc и анти-PDL1 в уменьшении размера опухоли и повышении выживаемости мышей с глиобластомой.
На фигуре 23А показана люциферазная активность в головном мозге мышей дикого типа (WT) или мышей с нокаутом сиглека-15 (сиглек-15 KO), которым инокулировали интракраниально на сутки 0 клетки глиобластомы GL261, содержащими репортер люциферазу. На фиг. 23В представлены изображения люциферазной активности в головном мозге мышей WT и KO на сутки 13 и 18 после инокуляции клеток GL261. На фиг. 23С представлена кривая выживаемости мышей WT и KO, которым инокулировали GL261.
На фиг. 24А показано процентное и общее количество Т-клеток CD8 в головном мозге или селезенке мышей обеих групп (WT и KO) на сутки 14. На фиг. 24B показано процентное и общее количество CD4 T-клеток в головном мозге или селезенке мышей обеих групп (WT и KO) на сутки 14. На фиг. 24C показано процентное и общее количество дендритных клеток (DC), макрофагов и микроглии в головном мозге или селезенке мышей обеих групп (WT и KO) на сутки 14. На фиг. 24D показано процентное и общее количество IFN-γ-позитивных CD8 или CD4 T-клеток в лимфоцитах головного мозга у мышей WT или KO, несущих опухоли, полученных на сутки 14, и повторно стимулированных опухолевыми клетками GL-261 в течение ночи.
На фиг. 25А показана экспрессия сиглека-15 на клетках MC38-S15- и MC38-S15+, определенная окрашиванием моноклональным антителом против сиглека-15 FACS (фиг. 25A). На фиг. 25В показан опухолевый рост клеток MC38-S15- и MC38-S15+ после инокуляции подкожной инъекцией мышам B6 (фиг. 25B).
На фиг.26 показан средний размер опухоли у мышей B6, которым инокулировали стабильную клеточную линию MC38-S15+, и обработанных контрольным антителом, анти-сиглек-15-антителом m01 или слитым белком сиглек-15-mIg. Показан средний размер опухоли в каждой группе.
На фиг. 27А приведен предлагаемый механизм действия сиглека-15, служащего в качестве лиганда. На фиг. 27B представлен предполагаемый механизм действия сиглека-15, служащего в качестве рецептора.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на обнаружении того, что сиглек-15 играет важную роль в подавлении иммунных реакций на рак, обеспечивая, таким образом, обоснование для манипулирования с путем сиглека-15, для разработки в будущем лекарственных препаратов против рака. В частности, было обнаружено, что снижение экспрессии сиглека-15 уменьшает размер опухоли и повышает выживаемость мышей с опухолями головного мозга. Кроме того, ингибирование активности сиглека-15 блокированием взаимодействия между сиглеком-15 и его лигандами на мышиной модели воспаления головного мозга, а также отмена экспрессии сиглека-15 у мышей с нокаутом сиглека-15, обостряли воспаление мозга. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам лечения рака, способам лечения аутоиммунного заболевания, способам регуляции иммунного ответа на рак и способам регуляции воспалительного ответа у субъектов модуляцией экспрессии и/или активности сиглека-15, а также его связывающих партнеров на том же пути.
I. Определения
Для того чтобы настоящее изобретение было более понятным, вначале определяются некоторые термины. Если не указано иное, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Значение и объем терминов должны быть ясными; однако в случае какой-либо возможной неоднозначности определения, представленные в данном контексте, имеют приоритет относительно любого словаря или определения во внешнем источнике. Приведение диапазонов значений здесь предназначено лишь служить кратким способом перечисления индивидуально каждого отдельного значения, находящегося в пределах этого диапазона, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в нем.
В нижеследующем описании для пояснения приведены конкретные числа, материалы и конфигурации, чтобы обеспечить полное понимание изобретения. Однако специалисту должно быть понятно, что настоящее изобретение может быть осуществлено на практике без этих специальных деталей. В некоторых случаях хорошо известные признаки опущены или упрощены, чтобы сделать ясным описание настоящего изобретения. Более того, ссылка в описании на такие выражения, как «один вариант осуществления» или «вариант осуществления», означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены, по меньшей мере, в один вариант осуществления изобретения. Появление фразы «в одном варианте осуществления» в разных местах в описании изобретения не обязательно указывает на тот же вариант осуществления.
Использование артиклей «a» и «an» и «the» и подобных ссылок в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должно толковаться как для единственного, так и для множественного числа (т.е., один или более), если не указано иное или явно противоречит контексту. В качестве примера «элемент» означает один элемент или более элементов. Термин «содержащий», «имеющий», «включающий» и «составляющий» должны толковаться как открытые термины (т. е. означающие «включающий, но не ограниченный этим»), если не указано иное.
Как здесь используется, термин «сиглек-15», также известный как связывающий сиаловую кислоту Ig-подобный лектин 15, антиген-подобный 3 CD33, молекула 3-подобный CD33, CD33L3 и HsT1361, является членом белков семейства лектинов, который содержит связывающий сиаловую кислоту компонент и Ig-подобную молекулу. Последовательность мРНК сиглека-15 человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером GI: 225637536 (NM_213602.2, SEQ ID NO: 1). Последовательность полипептидной последовательности сиглека-15 человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером GI: 4 7106069 (NP_998767.1, SEQ ID NO: 2).
Как здесь используется, термин «MAG», также известный как миелин-ассоциированный гликопротеин, связывающий сиаловую кислоту Ig-подобный лектин 4A, SIGLEC4A или GMA, представляет собой мембранный белок типа I и член надсемейства иммуноглобулинов. MAG является функциональным рецептором NOGO-66 и, как полагают, участвует в миелинизации нейронов. MAG также присутствует в миелоидных клетках и особенно в микроглии. У мышей с нокаутом MAG (KO) возникают проблемы с фагоцитозом. MAG связывается с сиалилированными гликоконъюгатами и опосредует некоторые миелин-нейронные-клеточные взаимодействия. Для этого гена описаны три альтернативно сплайсированных транскрипта, кодирующих различные изоформы. Последовательность мРНК MAG человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером GI: 312836849 (NM_002361.3, SEQ ID NO: 3). Последовательность полипептидной последовательности MAG человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером GI: 11225258 (NP_002352.1, SEQ ID NO: 4).
Как здесь используется, термин «LRRC4C», также известный как лейцин-богатый повтор 4C (LRR4С), лиганд netrin-G1, NGL1 или KIAA1580, LRRC4C представляет собой молекулу семейства LRR, ассоциированную с ростом нейронов, образованием дендрита и удлинением аксонов. LRRC4C в основном локализуется на постсинаптической стороне возбуждающих синапсов и взаимодействует с пресинаптическим лигандом netrin-G1 для регуляции образования возбуждающего синапса. Последовательность мРНК LRRC4C человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером GI: 385724810 (NM_020929.2, SEQ ID NO: 5). Последовательность полипептидной последовательности LRRC4C человека можно найти, например, в GenBank под инвентарным номером No. GI: 51317373 (NP_065980.1, SEQ ID NO: 6).
Как здесь используется, термин «Sialyl-Тn», также известный как «STn», «антиген Sialyl-Tn» и «Neu5Acα2-6GalNAcα-O-Ser/Thr», относится к замещенной сиаловой кислотой форме антигена Tn. Tn-антиген представляет олигосахарид на основе N-ацетилгалактозамина (GalNAc), связанный с серином или треонином гликозидной связью в виде O-гликана. Sialyl-Tn представляет собой усеченный O-гликан, содержащий сиаловую кислоту α-2,6, связанную с GalNAc α-O-Ser/Thr. Экспрессия Sialyl-Tn вызвана активацией пути аберрантного гликозилирования и обычно имеет место в опухолевых клетках. Биосинтез Sialyl-Tn связан с экспрессией сиалилтрансферазы ST6GalNAc1 и мутациями COSMC (β3-Gal-T-специфического молекулярного шаперона ядра 1). Сообщалось об экспрессии Sialyl-Tn в более чем 80% карцином человека, включая злокачественную опухоль желудка, ободочной кишки, молочной железы, легкого, пищевода, предстательной железы и эндометрия, и она связана с неблагоприятным прогнозом (Munkley, Int. J. Mol. Sci. (2016), 17 (3): 275).
Следует отметить, что во всех случаях названия молекул, например сиглека-15, MAG или LLRC4C, включают как ген, так и белок, если не указано иное. Таким образом, термин «сиглек-15» при использовании в отношении молекулы включает как белок сиглек-15, так и ген сиглек-15.
Термин «уровень сиглека-15» включает уровни мРНК или кДНК сиглека-15 и/или концентрацию, экспрессию, активность, функцию или стабильность белка, ДНК, мРНК или кДНК сиглека-15. В одном варианте осуществления, как здесь используется, термин «уровень» относится к измеряемому количеству сиглека-15. Количество может быть либо (a) абсолютным количеством, измеряемым в молекулах, молях или массе на единицу объема или клетках, или (b) относительным количеством, например, измеренным с помощью денситометрического анализа.
Как здесь используется, «модулятор сиглека-15» относится к любому соединению или молекуле, которая модулирует экспрессию мРНК и/или экспрессию белка сиглека-15; и/или стабильность мРНК и/или белка сиглека-15; и/или биологическую активность сиглека-15. Модулятор может модулировать экспрессию и/или активность сиглека-15 прямо или опосредованно. Модулятор сиглека-15 действует непосредственно на сиглек-15, например антитело, которое связывается с сиглеком-15 и ингибирует или активирует его функцию. В еще одном варианте осуществления модулятор сиглека-15 действует опосредованно на сиглек-15 (например, через другую молекулу, например, партнера по связыванию с сиглеком-15), что приводит к повышению или снижению активности сиглека-15. Примерные агенты, подходящие для применения в способах по изобретению, включают молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (например, антисмысловые РНК, sdРНК и siРНК), внутриклеточные антитела, рекомбинантные слитые белки, ингибиторные пептиды или небольшие молекулы. Агенты, подходящие для применения в способах по изобретению, подробно обсуждаются ниже.
Как здесь используется, различные формы термина «модулировать» включают стимуляцию (например, повышение или повышающую регуляцию определенного ответа или активности) и ингибирование (например, снижение или понижающую регуляцию определенного ответа или активности). В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет ингибитор сиглек-15. В некоторых вариантах осуществления модулятором является активатор сиглека-15.
Как здесь используется, термин «ингибировать» относится к снижению экспрессии, стабильности и/или биологической активности сиглека-15. Например, термин «ингибирование» относится к способности снижать или понижающе регулировать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15, как здесь описано.
Как здесь используется, термин «стимулировать» относится к повышению экспрессии, стабильности и/или биологической активности сиглека-15. Например, термин «стимулировать» относится к способности повышать или повышающе регулировать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15, как здесь описано.
Как здесь используется, «ингибитор активности сиглека-15» или «антагонист сиглека-15», включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность, опосредованную сиглеком-15. В некоторых вариантах осуществления антагонист сиглека-15 ингибирует полипептид сиглека-15. В других вариантах осуществления антагонист сиглека-15 ингибирует лиганд сиглека-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
Как здесь используется, «агонист активности сиглека-15» или «агонист сиглека-15», включает любую молекулу, которая частично или полностью стимулирует или усиливает биологическую активность антигена, с которым он связывается. Примерные агонисты сиглека-15 связываются с сиглеком-15 и стимулируют трансдукцию сигнала через сиглек-15 при связывании, имитируя взаимодействие сиглека-15 с природным лигандом, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Другие примерные агонисты активности сиглека-15 связываются и трансдуцируют сигнал через лиганд сиглека-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, имитируя взаимодействие лиганда с сиглеком-15.
Как здесь используется, термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулинов, состоящих из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно называемой здесь HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой здесь LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми находятся более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.
Как здесь используется, термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающий участок» антитела (или просто «фрагмент антитела»), относится к участку полноразмерного антитела, обычно связывающемуся с мишенью или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты. Выражение «функциональный фрагмент» антитела представляет собой производное, обладающее одинаковой качественной биологической активностью с полноразмерным антителом. Например, функциональный фрагмент антагонистического анти-сиглек-15-антитела может связываться с сиглеком-15 таким образом, чтобы блокировать, ингибировать или нейтрализовать биологическую активность, опосредованную сиглеком-15. Как здесь используется, термин «функциональный фрагмент» по отношению к антителам, относится к фрагментам Fv, scFv, диателу, F(ab)и F(ab')2. Фрагмент «Fv» является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания мишени. Эта область состоит из димера вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи в плотной нековалентной связи (димера VH-VL). Именно в такой конфигурации три CDR каждой вариабельной области взаимодействуют с определением сайта связывания мишени на поверхности димера VH-VL. scFv содержит вариабельную область одной тяжелой цепи и вариабельную область одной легкой цепи, соединенные пептидным линкером такого размера, который позволяет областям VH и VL взаимодействовать с образованием сайта связывания мишени. В совокупности шесть CDR придают специфичность связывания мишени антителу или фрагменту антитела. Однако даже одна вариабельная область (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для мишени) может обладать способностью распознавать и связывать мишень, хотя, и с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.
Как здесь используется, термины «антагонистическое антитело» или «блокирующее антитело», относятся к антителу, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Типичные антагонистические антитела по существу или полностью ингибируют биологическую активность антигена.
Как здесь используется, термин «агонистическое антитело» относится к антителу, которое стимулирует или увеличивает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Типичные агонистические антитела стимулируют трансдукцию сигнала через антиген при связывании, имитируя взаимодействие антигена с природным лигандом.
Как здесь используется, термин «субъект» относится к животному, такому как млекопитающее, включая примата (например, человека, примата, отличного от человека, например, обезьяну и шимпанзе), неприматов (таких как корова, свинья, верблюд, лама, лошадь, коза, кролик, овца, хомяк, морская свинка, кошка, собака, крыса, мышь и кит), птицу (например, утку или гуся) и акулу. В одном варианте осуществления субъектом является человек, такой как человек, который лечится или оценивается в отношении наличия заболевания, расстройства или состояния, человек, подверженный риску развития заболевания, расстройства или состояния, человек, имеющий заболевание, расстройство или состояние, и/или человек, который лечится по поводу заболевания, расстройства или состояния, как здесь описано. В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием. В одном варианте осуществления возраст субъекта составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет. В еще одном варианте осуществления возраст субъекта составляет примерно 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100 лет. Значения и диапазоны между вышеуказанными диапазонами также предназначены быть частью настоящего изобретения. Кроме того, предполагаются для включения диапазоны значений с использованием комбинации любого из вышеуказанных значений в качестве верхнего и/или нижнего пределов.
Как здесь используется, термины «лечить» или «лечение» относятся к полезному или желаемому результату, включая, не ограничиваясь этим, облегчение или ослабление одного или более симптомов, снижение тяжести расстройства, стабилизированное (т. е. не ухудшающееся) состояние расстройства, ослабление или смягчение расстройства, независимо от того, является оно детектируемым или недетектируемым. «Лечение» также может означать повышение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствии лечения.
Как здесь используется, термин «эффективное количество» относится к количеству терапевтического агента, которое является достаточным для снижения или ослабления тяжести и/или продолжительности расстройства или одного или более его симптомов, подавления или профилактики развития расстройства, индукции регрессии расстройства, подавления или предупреждения рецидива, развития, начала или прогрессирования одного или более симптомов, ассоциированных с расстройством, выявления расстройства или усиления или повышения профилактического или терапевтического эффекта(ов) другой терапии (например, профилактического или терапевтического агента). Для эффективного количества может потребоваться более чем одна доза.
II. Способы по изобретению
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на обнаружении того, что сиглек-15 играет важную роль в иммунной регуляции. Функция сиглека-15 была хорошо изучена в дифференцировке остеокластов, где он играет неиммуногенную роль. В дополнение к его роли в дифференцировке остеокластов сиглек-15 регулирует иммунный ответ подавлением активности иммунных клеток, включая Т-клетки и макрофаги, как здесь описано. Следовательно, повышающая регуляция сиглека-15 в опухолевых клетках или в микроокружении опухоли может приводить к подавлению иммунного ответа у субъекта против опухоли. Кроме того, дефицит сиглека-15 может способствовать возникновению состояний, связанных с аутоиммунитетом.
Не желая связываться с теорией, предлагается, что сиглек-15 может выполнять иммуномодулирующую функцию, действуя в качестве лиганда и/или рецептора (фиг. 27). Сиглек-15 экспрессируется на миелоидных клетках и сверхэкспрессируется в микроокружении головного мозга, в опухолевых клетках и в микроокружении опухоли. При сверхэкспрессии в головном мозге, опухолевых клетках или в микроокружении опухоли сиглек-15 может функционировать в качестве лиганда, где он может напрямую влиять на Т-клеточные ответы или опосредованно через миелоидные клетки. Как Т-клетки, так и миелоидные клетки могут экспрессировать рецептор(ы), ответственный за иммунную репрессивную функцию сиглека-15 (фиг. 27A). В дополнении или в альтернативном варианте экспрессия лигандов сиглека-15 в микроокружении головного мозга, в опухолевых клетках или в микроокружении опухоли может индуцировать трансдукцию сигнала через сиглек-15, действующего в качестве рецептора (фиг. 27B). Следовательно, сиглек-15 может опосредованно влиять на Т-клеточные ответы через взаимодействия миелоидные клетки:Т-клетки или иммунные супрессорные цитокины, такие как IL-10 и TGF-бета.
В различных аспектах настоящее изобретение относится к способам модуляции иммунной функции путем стимуляции или ингибирования активности сиглека-15.
А. Способы повышение иммунного ответа посредством снижения экспрессии и/или активности сиглека-15
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам усиленич иммунного или воспалительного ответа у субъекта введением субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта. В одном варианте осуществления данный способ может быть использован для увеличения количества Т-клеток, например, CD4 Т-клеток и/или CD8 Т-клеток у субъекта. В еще одном варианте осуществления данный способ можно использовать для повышения активности Т-клеток, например, CD4 T-клеток и/или CD8 T-клеток у субъекта.
Вышеуказанный способ можно использовать для лечения расстройства, при котором повышение или усиление иммунного ответа у субъекта может оказывать положительное действие. Например, модулятор сиглека-15, который снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, может быть использован для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом. Такие способы могут включать введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает уровень экспрессии и/или активности сиглека-15 у субъекта, тем самым осуществляя лечение рака у субъекта.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам уменьшения размера опухоли у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор уменьшает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым уменьшая размер опухоли у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам повышения выживаемости субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор уменьшает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым повышая выживаемость субъекта.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым усиливая иммунный ответ против опухоли у субъекта.
Модулятор сиглека-15, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, включает любое соединение или любую молекулу, которые могут регулировать экспрессию и/или активность сиглека-15, например, экспрессию мРНК и/или экспрессию белка сиглека-15; стабильность мРНК и/или белка сиглека-15; и/или биологическую активность сиглека-15. Модулятор может модулировать экспрессию и/или активность сиглека-15 прямо или опосредованно. В некотором варианте осуществления модуляторы ингибируют экспрессию и/или активность сиглека-15. Ингибиторные модуляторы сиглека-15 могут действовать непосредственно на сиглек-15, например, антагонистическое антитело, которое связывается с сиглеком-15 и ингибирует его функцию. Альтернативно, ингибиторные модуляторы сиглека-15 действуют опосредованно на сиглек-15 (например, через другую молекулу, например, партнера по связыванию с сиглеком-15), что приводит к снижению активности. Примеры модуляторов, подходящих для применения в способах по изобретению, включают низкомолекулярные ингибиторы, антагонистические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, рекомбинантные слитые белки (например, растворимые слитые белки сиглека-15, например, растворимый сиглек-15-Fc), ингибиторные пептиды или молекулы интерферирующих нуклеиновых кислот (например, антисмысловые РНК, sdРНК и siРНК). Модуляторы, подходящие для применения в способах по изобретению, подробно обсуждаются ниже.
Модулятор сиглека-15 по настоящему изобретению также может блокировать взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. Связывающие лиганды сиглека-15 можно идентифицировать любыми способами, известными в данной области техники. Например, белок-белковое взаимодействие между сиглеком-15 и связывающими лигандами может быть идентифицировано путем коиммунопреципитации, в котором связывание пары представляющих интерес белков определяется по образованию копреципитата с антителом in vitro. Альтернативно, можно использовать подход с системой дрожжевых двойных гибридов или фаговым дисплеем для скрининга связывающих лигандов сиглека-15. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы методы химического сшивания, за которым следует масс-спектрометрический анализ, для идентификации взаимодействующих белков.
В некотором варианте осуществления связывающие лиганды для сиглека-15, подходящие для применения в настоящем изобретении, можно идентифицировать с помощью технологии рецепторных чипов. Технология рецепторных чипов представляет хорошо зарекомендовавшую себя технологию скрининга контррецепторов белков-мишеней (Zhu Y. et al., Nat. Commun., 4: 2043, 2013; Yao S. et al., Immunity, 34 (5): 729-740, 2011). Вкратце, рецепторный чип содержит твердую подложку, включающую множество лунок, где каждая из множества лунок содержит клетку, которая трансфицирована геном, кодирующим рецепторный белок. Ген-мишень (кодирующий секретируемый белок) или внеклеточный домен гена-мишени (кодирующий трансмембранный белок, например, иммунный модулятор) генетически слит с меткой гена (мышиным IgG2a Fc, человеческим IgG1 Fc, FLAG или 6xHIS), для получения слитых генов, как описано ранее (Chapoval A.I. et al., Mol. Biotechnol., 21 (3): 259-264, 2002). При трансфекции отдельных слитых генов в клетки 293T очищенный рекомбинантный слитый белок используется для скрининга против рецепторного чипа. Меченое флуоресцентной меткой вторичное антитело против метки используют для детектирования связывания белка-мишени, например, иммунного модулятора, идентифицированного на основе способов по настоящему изобретению, с трансфицированными клетками 293T и скринируют с использованием системы для детектирования клеток Applied Biosystems 8200 и анализируют с помощью программного обеспечения CDS 8200. Полное содержание вышеприведенных ссылок включено здесь посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет MAG. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет Sialyl-Tn.
Сайты связывания на сиглеке-15 для его лигандов, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, можно определить любыми способами, известными в данной области. Например, можно получить мутантные белки сиглека-15 с делецированными доменами и выделить с использованием стандартных методов, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет собой мутантный белок сиглек-15 с пониженной активностью для связывания лиганда. Например, модулятор может представлять мутантный белок сиглек-15 с одной мутацией замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена.
Модуляторы сиглека-15, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, могут усилить иммунный ответ против опухоли посредством ингибирования активности, участвующей в пути сиглека-15, например, снижением экспрессии и/или активности любых связывающих лигандов сиглека-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет собой низкомолекулярный ингибитор MAG или LRRC4C, антагонистическое антитело к MAG или LRRC4C или его антигенсвязывающий фрагмент, рекомбинантный слитый белок MAG, который является ингибиторным по своей природе, рекомбинантный слитый белок LRRC4C, который является ингибиторным по своей природе, или ингибирующий белок или нуклеиновая кислота, нацеленные на MAG или LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают Sialyl-Tn. Такое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связывать Sialyl-Tn и имитировать его связь с сиглеком-15. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет растворимую молекулу Sialyl-Tn, необязательно связанную с каркасом, например, каркасным пептидом. Модуляторы, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, подробно обсуждаются ниже.
Вышеуказанные способы можно использовать для лечения расстройства, при котором повышение или усиление иммунного ответа у субъекта может оказывать положительное действие. Такие расстройства включают, не ограничиваясь этим, рак. Введение модулятора сиглека-15, который снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, можно использовать, например, для стимуляции иммунного ответа против рака (например, стимуляции Т-клеточного ответа против рака), уменьшения размера опухоли и/или повышения выживаемости субъекта, имеющего рак.
Как здесь описано, термин «рак» относится к одной группе заболеваний, вызванных неконтролируемой аномальной пролиферацией клеток, которые могут проникать в соседние ткани или другие части тела. Опухолевые клетки могут образовывать солидную опухоль, в которой опухолевые клетки сосредоточены в одном месте вместе, или могут находиться в виде разбросанных клеток, как это имеет место при лейкозе. Типы рака, которые подходят для лечения посредством снижения экспрессии или активности сиглека-15, включают, не ограничиваясь этим, солидные опухоли и/или гематологические злокачественные заболевания. В одном варианте осуществления рак имеет эпителиальное происхождение. Типичные виды рака, которые можно лечить с помощью вышеуказанных способов, включают, не ограничиваясь этим, рак надпочечников, анальный рак, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, опухоли головного мозга/ЦНС, рак молочной железы, болезнь Кастлемана, рак шейки матки, рак ободочной кишки/прямой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, рак глаза, рак желчного пузыря, рак органов желудочно-кишечного тракта, рак почки, рак гортани и гипофарингеальный рак, лейкоз, рак печени, рак легкого, лимфому, лимфому кожи, злокачественную мезотелиому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, рак носовой полости и рак околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, рак ротовой полости и рак ротоглотки, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак полового члена, опухоли гипофиза, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, рак ободочной кишки, рак желудка, рак яичка, рак тимуса, рак щитовидной железы, саркому матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема и опухоль Вильмса. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, почечноклеточной карциномы, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга.
В некоторых вариантах осуществления рак представляет рак ободочной кишки, эндометриоидный рак, рак почки (например, папиллярно-клеточную карциному почки, светлоклеточную карциному почки), рак печени, рак щитовидной железы, рак легкого (например, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого), рак головы и шеи, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, глиобластому, рак прямой кишки или рак желчных протоков. В одном варианте осуществления рак представляет рак головного мозга. В одном варианте осуществления рак представляет глиобластому. В одном варианте осуществления рак не является раком крови. В одном варианте осуществления рак не является лейкозом. В одном варианте осуществления рак не является острым миелоидным лейкозом (AML).
Использование «эффективного количества» модуляторов по настоящему изобретению (и терапевтических композиций, содержащих такие модуляторы) представляет собой эффективное количество в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Например, эффективное количество модулятора может варьироваться в зависимости от таких факторов, как статус заболевания, возраст, пол, репродуктивный статус и масса тела, а также способность агента вызывать желаемый ответ в организме. Схемы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального ответа. Например, несколько разделенных доз могут быть назначены ежедневно, или доза может быть пропорционально снижена, как указано в зависимости от ситуации.
Как здесь используется, термин «лечить» относится к вмешательству, которое приносит пользу пациенту, например пациенту, страдающему или подверженному риску развития заболевания. Лечение включает действия, предпринятые, и действия, от которых воздерживаются, с целью улучшения состояния пациента, например, облегчения одного или более симптомов, или задержки начала развития или прогрессирования заболевания.
В одном варианте осуществления изобретение относится к комбинированной терапии для лечения рака, где модулятор сиглека-15, который снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, вводится субъекту в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек, например, антагонистом PD-L1 или антагонистом PD-1. PD-1 представляет белок иммунной контрольный точки на Т-клетках, который удерживает Т-клетки от атаки на клетки в организме, которые экспрессируют PD-L1. Некоторые опухолевые клетки сверхэкспрессируют PD-L1, что позволяет им избежать распознавания Т-клетками. Ингибиторы PD-L1 и PD-1 могут усиливать иммунный ответ против опухолевых клеток и могут синергически способствовать гибели опухолевых клеток при использовании в сочетании с антагонистом активности сиглека-15. Типичные ингибиторные анти-PD-L1-антитела, которые можно использовать в сочетании с антагонистом активности сиглека-15, включают, не ограничиваясь этим, атезолизумаб (Genentech), авелумаб (Pfizer) и дурвалумаб (AstraZeneca). Примерные ингибиторные анти-PD-1-антитела, которые можно использовать в сочетании с антагонистом активности сиглека-15, включают, не ограничиваясь этим, пембролизумаб (Merck) и ниволумаб (Bristol-Myers Squibb).
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают стадию скрининга, на которой пациенты, имеющие рак, подвергаются скринингу на повышение активности сиглека-15 в злокачественной опухоли или в микроокружении опухоли. Например, в одном варианте осуществления биологический образец, содержащий опухолевые клетки, получают от субъекта, и определяют экспрессию сиглека-15 и сравнивают с подходящим контролем, например, сравнимым образцом, полученным от здорового субъекта, референсным значением, указывающим уровень экспрессии у здорового субъекта и т. д. Повышающая регуляция сиглека-15 в биологическом образце, содержащем опухолевые клетки, может указывать на то, что субъект будет иметь пользу от агента, который снижает экспрессию или активность сиглека-15.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы могут включать стадию скрининга, на которой пациенты с текущим аутоиммунным заболеванием исключаются из лечения модулятором сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления модулятор сиглека-15, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, не будет вызывать неспецифическое аутоиммунное заболевание у субъекта. Субъекты, получающие лечение, включающее модулятор сиглека-15, могут быть выбраны таким образом, чтобы у них не развилось спонтанно аутоиммунное заболевание.
В. Способы ослабления воспаления повышением экспрессии и/или активности сиглека-15
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способы снижения нежелательного иммунного или воспалительного ответа у субъекта введением субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор повышает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта. В одном варианте осуществления данный способ можно использовать для уменьшения количества Т-клеток, например, CD4 Т-клеток и/или CD8 Т-клеток у субъекта. В еще одном варианте осуществления данный способ можно использовать для снижения активности Т-клеток, например, CD4 Т-клеток и/или CD8 Т-клеток у субъекта.
Вышеуказанный способ можно использовать для лечения расстройства, при котором снижение иммунного ответа или воспалительного ответа будет оказывать положительное действие у субъекта. Например, модулятор сиглека-15, который повышает экспрессию и/или активность сиглека-15, можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор повышает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, тем самым осуществляя лечение аутоиммунного заболевания у субъекта.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способам лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым осуществляя лечение аутоиммунного заболевания у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор повышает уровни экспрессии и/или активности сиглека-15, тем самым ослабляя воспалительный ответ в головном мозге у субъекта.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ослабления воспалительного ответа в головнос мозге у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым ослабляя воспалительный ответ в головном мозге у субъекта.
Модулятор сиглек-15, подходящий для применения в вышеуказанных способах, включает любое соединение или молекулу, которые могут повышающе регулировать экспрессию и/или активность сиглека-15, например, модуляцией экспрессии мРНК и/или экспрессии белка сиглека-15; стабильности мРНК и/или белка сиглека-15; и/или биологической активности сиглека-15. Модулятор может модулировать экспрессию и/или активность сиглека-15 прямо или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления модуляторы повышают экспрессию и/или активность сиглека-15. Стимулирующие модуляторы сиглека-15 могут функционировать непосредственно на сиглеке-15, например, агонистическое антитело, которое связывается с сиглеком-15 и стимулирует его функцию. В еще одних вариантах осуществления стимулирующий модулятор сиглека-15 действует опосредованно на сиглек-15 (например, через другую молекулу, например, партнера по связыванию с сиглеком-15), что приводит к повышенной активности. Примерные модуляторы, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, включают низкомолекулярные активаторы, агонистические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или белок и нуклеиновую кислоту, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию сиглека-15. Альтернативно, модулятор, который повышает экспрессию и/или активность сиглека-15, предназначенный для применения в способах по настоящему изобретению, включает белок сиглек-15 или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок сиглек-15. В некоторых вариантах осуществления белок сиглек-15 выбран из группы, состоящей из полноразмерного белка сиглека-15, функционального фрагмента сиглека-15 или IgV-домена сиглека-15. Модуляторы, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, подробно обсуждаются ниже.
Модулятор сиглека-15 по настоящему изобретению также может способствовать взаимодействию между сиглеком-15 и его связывающим лигандом. Связывающие лиганды сиглека-15 могут быть идентифицированы любыми способами, известными в данной области техники. Например, белок-белковое взаимодействие между сиглеком-15 и связывающими лигандами может быть идентифицировано анализом коиммунопреципитации, в котором связывание пары представляющих интерес белков определяют по образованию копреципитата с антителом in vitro. Альтернативно, можно использовать анализ с системой дрожжевых двойных гибридов или фаговым дисплеем для скрининга связывающих лигандов для сиглека-15. В некоторых вариантах осуществления методы с химической сшиванием с последующей масс-спектрометрией можно использовать для анализа взаимодействующих белков.
В некоторых вариантах осуществления связывающие лиганды для сиглека-15, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы с помощью технологии рецепторных чипов, как здесь описано.
В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет собой MAG. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 представляет Sialyl-Tn.
Примерные модуляторы сиглека-15, подходящие для применения в практике некоторых вариантов осуществления способов, описанных здесь, могут ослаблять воспаление стимуляцией активности, связанной с путем сиглека-15, например, повышением экспрессии и/или активности связывающих лигандов сиглека-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет низкомолекулярный активатор MAG или LRRC4C, агонистическое антитело к MAG или LRRC4C или его антигенсвязывающий фрагмент, белок или нуклеиновую кислоту, которые активируют транскрипцию и/или трансляцию MAG или LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет белок MAG или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок MAG. В еще одном варианте осуществления модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет белок LRRC4C или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок LRRC4C. В одном варианте осуществления модулятор представляет синтетическую молекулу Sialyl-Tn. Например, Sialyl-Tn можно вводить самостоятельно или связать, например, ковалентно или нековалентно конъюгировать с каркасной молекулой. В одном варианте осуществления модулятор представляет синтетический пептид, несущий Sialyl-Tn. Sialyl-Tn может связаться с сиглеком-15 и активировать сиглек-15, функционируя в качестве агониста активности сиглека-15. Модуляторы, которые повышают экспрессию и/или активность сиглека-15, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, подробно обсуждаются ниже.
Заболевания, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь этим, аутоиммунные заболевания или рак. Термин «лечить» относится к любому типу лечения, которое приносит пользу пациенту, например, пациенту, страдающему или подверженному риску развития заболевания. Лечение включает действия, предпринятые, и действия, от которых воздерживаются, с целью улучшения состояния пациента, например, облегчения одного или более симптомов, или задержки начала развития или прогрессирования заболевания.
Как здесь описано, «аутоиммунными заболеваниями» являются болезни, которые возникают в результате аномального иммунного ответа организма против веществ и тканей, присутствующих в организме в норме, и они включают, не ограничиваясь этим, ревматоидный артрит (РА), ювенильный хронический артрит (JCA), тиреоидит, синдром трансплантат против хозяина (GVHD), склеродермию, сахарный диабет, болезнь Грейвса, аллергию, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с аллогенной трансплантацией, такой как, не ограничиваясь этим, трансплантация почки, трансплантация сердца, трансплантация костного мозга, трансплантация печени, трансплантация поджелудочной железы, трансплантация тонкой кишки, трансплантация легкого и трансплантация кожи. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание является воспалительным заболеванием головного мозга. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет собой рассеянный склероз. В еще одних вариантах осуществления воспалительное заболевание головного мозга представляет экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE).
III. Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции, содержащие сиглек-15 или модулятор сиглека-15 по настоящему изобретению, могут быть получены смешиванием белка или нуклеиновой кислоты, имеющие требуемую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol A. (1980)), в виде водных растворов, лиофилизированных или других высушенных композиций. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат, гистидин и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Твин™, плюроники™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Составы по настоящему иобретению также могут содержать более одного активного соединения, если необходимо, для конкретного показания, которое подвергается лечению. Например, если необходимо лечить аутоиммунное заболевание, то композиции по изобретению, содержащие сиглек-15 или модулятор сиглека-15, можно объединить с лекарственными средствами, о которых известно, что они прменяются в лечении аутоиммунных заболеваний, такими как метилпреднизолон, кеналог, медрол, преднизолон, кортеф, гидрокортизон, кортизон, триамцинолона ацетонид, целестон солюспан, метилпреднизолона ацетат, орапред ODT, велипред 20, Солу-Медрол или метилпреднизолона натрий. Если следует лечить рак, то составы по изобретению, содержащие сиглек-15 или модулятор сиглека-15, могут быть объединены с лекарственными средствами, о которых известно, что они применяются в лечении рака, такими как абиратерона ацетат, ABITREXATE (метотрексат), ABRAXANE (стабилизированный альбумином нанодисперсный паклитаксел), ADCETRIS (бретуксимаб ведотин), адо-трастузумаб эмтанзин, ADRIAMYCIN (доксорубицина гидрохлорид), ADRUCIL (фторурацил), афатитиба дималеат, AFINITOR (эверолимус), ALDARA (имиквимод), альдеслейкин, алемтузумаб, ALIMTA (пеметрекседа динатрий), ALOXI (палоносетрона гидрохлорид), AMBOCHLORIN (хлорамбуцил), AMBOCLORIN (хлорамбуцил), аминолевулиновая кислота, анастрозол, апрепитант, AREDIA (памидроната динатрий), ARIMIDEX (анастрозол), AROMASIN (эксеместан), ARRANON (неларабин), триоксид мышьяка, ARZERRA (офатумумаб) аспарагиназа Erwinia chrysanthemi, AVASTIN (бевацизумаб), акситиниб, азацитидин, бендамустина гидрохлорид, бевацизумаб, бексаротен, BEXXAR (тозитумомаб и 131йод тозитумомаб), блеомицин, бортезомиб, BOSULIF (босутиниб), кабазитаксел, кабозантиниб-S-малат, CAMPATH (алемтузумаб), CAMPTOSAR (иринотекана гидрохлорид), капецитабин, карбоплатин, карфилзомиб, CEENU (ломустин), CERUBIDINE (даунорубицина гидрохлорид), цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, CLAFEN (циклофосфамид), клофарабин, COMETRIQ (кабозантиниб-S-малат), COSMEGEN (дактиномицин), кризотиниб, циклофосфамид, CYFOS (ифосфамид), цитарабин, дабрафениб, дакарбазин, DACOGEN (децитабин), дактиномицин, дазатиниб, даунорубицина гидрохлорид, децитабин, дегареликс, денилейкин дифтитокс, деносумаб, декстразоксана гидрохлорид, доцетаксел, доксорубицина гидрохлорид, EFUDEX (фторурацил), ELITEK (расбурибаза), ELLENCE (эпирубицина гидрохлорид), ELOXATIN (оксалиплатин), элтромбопаг оламин, EMEND (апрепитант), энзалутамид, эпирубицина гидрохлорид, ERBITUX (цетуксимаб), эрибулина мезилат, ERIVEDGE (висмодегиб), эрлотиниба гидрохлорид, ERWINAZE (аспарагиназа Erwinia chrysanthemi), этопозид, эверолимус, EVISTA (ралоксифена гидрохлорид), эксеместан, FARESTON (торемифен), FASLODEX (фулвестрант), FEMARA (летрозол), филграстим, FLUDARA (флударабина фосфат), флударабина фосфат, FLUOROPLEX (фтороурацил), фторурацил, фолиновая кислота, FOLOTYN (пралатрексат), фулвестрант, гефитиниб, гемцитабина гидрохлорид, гемтузумаб озогамицин, GEMZARAR (гемцитабина гидрохлорид), GILOTRIF (афатиниба дималеат), GLEEVEC (иматиниба мезилат), HALAVEN (эрибулина мезилат), HERCEPTIN (трастузумаб), HYCAMTIN (топотекана гидрохлорид), ибритумомаб тиуксетан, ICLUSIG (понатиниба гидрохлорид), ифосфамид, имитиниба мезилат, имиквимод, INLYTA (акситиниб), INTRON A (рекомбинантный интерферон альфа-2b), 131йод тозитумомаб и тозитумомаб, ипилимумаб, IRESSA (гефитиниб), иринотекана гидрохлорид, ISTODAX (ромидепсин), иксабепилон, JAKAFI (руксолитиниба фосфат), JEVTANA (кабазитаксел), Kadcyla (адо-трастузумаб эмтанзин), KEOXIFENE (ралоксифена гидрохлорид), KEPIVANCE (палифермин), KYPROLIS (карфилзомиб), лапатиниба дитозилат, леналидомид, летрозол, лейковорина кальций, лейпролида ацетат, ломустин, LUPRON (лейпролида ацетат), MARQIBO (липосома с винкристином сульфатом), MATULANE (прокарбазина гидрохлорид), мехлорэтамина гидрохлорид, MEGACE (мегестрола ацетат), мегестрола ацетат, MEKINIST (траметиниб), меркаптопурин, месна, METHAZOLASTONE (темозоломид), метотрексат, митомицин, MOZOBIL (плериксафор), MUSTARGEN (мехлорэтамина гидрохлорид), MUTAMYCIN (митомицин C), MYLOSAR (азацитидин), MYLOTARG (гемтузумаб озогамицин), наночастицы паклитаксела (стабилизированный альбумином нанодисперсный паклитаксел), NAVELBINE (винорелбина тартрат), неларабин, NEOSAR (циклофосфамид), NEUPOGEN (филграстим), NEXAVAR (сорафениба тозилат), нилотиниб, NOLVADEX (тамоксифена цитрат), NPLATE (ромиплостим), офатумумаб, омецетаксина мепезукцинат, ONCASPAR (пегаспаргаза), ONTAK (денилейкин дифтитокс), оксалиплатин, паклитаксел, стабилизированный альбумином нанодисперсный паклитаксел, палифермин, палоносетрона гидрохлорид, памидронат динатрий, панитумумаб, пазопаниба гидрохлорид, пегаспаргаза, пегинтерферон альфа-2b, PEG-INTRON (пегинтерферон альфа-2b), пеметрексед динатрий, пертузумаб, PLATINOL (цисплатин), PLATINOL-АQ (цисплатин), плериксафор, помалидомид, POMALYST (помалидомид), понатиниба гидрохлорид, пралатрексат, преднизон, прокарбазина гидрохлорид, PROLEUKIN (альдеслейкин), PROLIA (деносумаб), PROMACTA (элтромбопаг оламин), PROVENGE (сипулейцел-T), PURINETHOL (меркаптопурин), радий 223 дихлорид, ралоксифена гидрохлорид, расбурикас, рекомбинантный интерферон альфа-2b, регорафениб, REVLIMID (леналидомид), RHEUMATREX (метотрексат), ритуксимаб, ромидепсин, ромиплостим, RUBIDOMYCIN (даунорубицина гидрохлорид), руксолитиниба фосфат, сипулейцел-T, сорафениба тозилат, SPRYCEL (дазатиниб), STIVARGA (регорафениб), сунитиниба малат, SUTENT (сунитиниба малат), SYLATRON (пегинтерферон альфа-2b), SYNOVIR (талидомид), SYNRIBO (омацетаксина мепесукцинат), TAFINLAR (дабрафниб), тамоксифена цитрат, TARABINE PFS (цитарабин), TARCEVA (эрлотиниба гидрохлорид), TARGRETIN (бексаротен), TASIGNA (нилотиниб), TAXOL (паклитаксел), TAXOTERE (доцетаксел), TEMODAR (темозоломид), темозоломид, темсиролимус, талидомид, TOPOSAR (этопозид), топотекана гидрохлорид, торемифен, TORISEL (темсиролимус), тозитумомаб и 131йод тозитумомаб, TOTECT (дексразоксана гидрохлорид), траметиниб, трастузумаб, TREANDA (бендамустина гидрохлорид), TRISENOX (триоксид мышьяка), TYKERB (лапатиниба дитосилат), ванвутаниб, VECTIBIX (панитумумаб), VelP, VELBAN (винбластина сульфат), VELCADE (бортезомиб), VELSAR (винбластина сульфат), вемурафениб, VEPESID (этопозид), VIADUR (лейпролида ацетат), VIDAZA (азацитидин), винбластина сульфат, винкристина сульфат, винорелбина тартрат, висмодегиб, VORAXAZE (глюкарпидаза), вориностат, VOTRIENT (пазопаниба гидрохлорид), WELLCOVORIN (лейковорин кальций), XALKORI (кризотиниб), XELODA (капецитабин), XGEVA (деносумаб), XOFIGO (радий 223 дихлорид), XTANDI (энзалутамиб), YERVOY (ипилимумаб), ZALTRAP (зив-афлиберцепт), ZELBORAF (вемурафениб), ZEVALIN (ибритумомаб тиуксетан), ZINECARD (дексразоксана гидрохлорид), зив-афлиберцепт, золендроновая кислота, ZOLINZA (вориностат), ZOMETA (золедроновая кислота) и ZYTIGA (абиратерона ацетат). В одном варианте осуществления модулятор сиглека-15 может быть объединен с антагонистом PD-L1, например, антагонистическим анти-PD-L1-антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В еще одном варианте осуществления модулятор сиглека-15 можно объединить с антагонистом PD-1, например, антагонистическим анти-PD-1-антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
Активные ингредиенты также могут быть включены в микрокапсулу, полученную, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, микрокапсулу из гидроксиметилцеллюлозы или желатиновую микрокапсулу, и микрокапсулу из поли(метилметакрилата) соответственно, в виде коллоидных систем доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в виде макроэмульсий. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Составы, предназначенные использоваться для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны.
Как правило, ингредиенты композиций доставляются по отдельности или смешиваются вместе в разовой лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или пакет-саше, с указанием количества активного агента. В тех случаях, когда способ введения представляет собой инфузию, то композицию можно разлить в инфузионныы флаконы, содержащие стерильную воду для фармацевтических целей или физиологический раствор. Если способ введения представляет инъекцию, то обеспечивается ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения. В альтернативном варианте осуществления одна или более фармацевтических композиций по изобретению поставляются в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, с указанием количества и концентрации агента.
Активный агент можно включить в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения, обычно полученную в виде инъекционного раствора. Инъеционный раствор может состоять из жидкой или лиофилизированной лекарственной формы во флинтгласовом флаконе или флаконе из темного стекла, ампуле или предварительно заполненном шприце. Жидкая или лиофилизированная лекарственная форма может дополнительно содержать буфер (например, L-гистидин, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия, хлорид натрия), криопротектор (например, сахароза, трегалоза или лактоза), объемообразующий агент (например, маннит), стабилизатор (например, L-метионин, глицин, аргинин), адъювант (гиалуронидаза).
Композиции по настоящему изобретению, например, сиглек-15 или модулятор сиглека-15, могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), микроэмульсия, дисперсии, липосомы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Фармацевтические композиции, содержащие сиглек-15 или модулятор сиглека-15, описанные здесь, могут быть формулированы для введения в конкретную ткань. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть желательным вводить сиглек-15 или модулятор сиглека-15 в соединительную ткань, ткань головного мозга и/или опухолевые участки в различных органах.
Сиглек-15 и модуляторы сиглека-15, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, можно вводить любыми подходящими путями, включая парентеральное введение (например, инъекция, инфузия) и можно вводить подкожным, внутрибрюшинным, интрапульмональным и интраназальным, и, при желании, использовать для местного применения, введения в очаг поражения, например, интратуморальное введение. Парентеральные инфузии включают внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное или подкожное введение. Кроме того, сиглек-15 и модуляторы сиглека-15 можно соответствующим образом вводить пульсирующей инфузией, особенно со снижающимися дозами. Дозирование можно проводить путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции. Способ введения можно выбрать в соответствии с различными факторами, например, является введение кратковременным или длительным. Предусматриваются другие способы введения, включая местное, в частности, трансдермальное, трансмукозальное, ректальное, пероральное или локальное введение, например, через катетер, расположенный рядом с участком, куда требуется ввести препарат. Инъекция, особенно внутривенная, представляет особый интерес.
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают введение терапевтически эффективного количества сиглека-15, как здесь описано, субъекту. В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают введение субъекту терапевтически эффективного количества модулятора сиглека-15. Терапевтически эффективное количество сиглека-15 или модулятора сиглека-15 представляет количество, достаточное для лечения заболевания, например, аутоиммунного заболевания или рака, у субъекта. Терапевтически эффективная доза сиглека-15 или модулятора сиглека-15, как здесь описано, будет несколько различаться от субъекта к субъекту, и будет зависеть от таких факторов, как возраст, масса и состояние субъекта, и путь доставки. Такие дозировки можно определить в соответствии с процедурами, известными специалистам в данной области. В иллюстративном варианте осуществления терапевтически эффективное количество антагониста сиглека-15 представляет количество, эффективное для снижения уровня или активности сиглека-15 у субъекта. В еще одном иллюстративном варианте осуществления терапевтически эффективное количество агониста сиглека-15 представляет количество, эффективное для повышения уровня или активности сиглека-15 у субъекта.
В одном варианте осуществления терапевтические способы, описанные здесь, осуществляются у человека.
IV. Модуляторы сиглека-15 в способах по изобретению
Как описано выше, снижение экспрессии сиглека-15 приводит к уменьшению размера опухоли и повышает выживаемость мышей с опухолями головного мозга, в то время, как снижение экспрессии и/или активности сиглека-15 обостряет воспаление головного мозга, указывая на то, что сиглек-15 играет важную роль в качестве иммуномодулирующей молекулы в регуляции иммунных ответов на рак и воспаление. Следовательно, молекулы, которые модулируют, например, ингибируют или активируют, экспрессию и/или активность сиглека-15 и/или молекулы, которые модулируют, например, ингибируют или активируют, экспрессию и/или активность партнеров по связыванию сиглека-15, например, MAG или LRRC4C, пригодны для применения в способах по настоящему изобретению. Примерные модуляторы могут модулировать, например, ингибировать или стимулировать, связывание между сиглеком-15 и лигандом сиглека-15 (например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn). Ингибиторный модулятор (т. е. ингибитор) или активирующий модулятор (т. е. активатор) может представлять нуклеиновую кислоту, полипептид, антитело или низкомолекулярное соединение. В некоторых вариантах осуществления ингибитор или активатор функционирует на уровне транскрипции, стабильности мРНК, трансляции, стабильности/деградации белка, модификации белка и связывания белка.
А. Ингибиторные модуляторы
В некоторых вариантах осуществления модулятор для применения в способах по изобретению представляет ингибиторный модулятор. В некоторых вариантах осуществления ингибиторный модулятор представляет собой небольшую молекулу, например, низкомолекулярный ингибитор сиглека-15, низкомолекулярный ингибитор связывания лигандов с сиглеком-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В еще одних вариантах осуществления ингибиторный модулятор для применения в способах по изобретению представляет внутриклеточную связывающую молекулу, которая функционирует таким образом, чтобы специфически ингибировать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В еще одних вариантах осуществления ингибиторный модулятор представляет антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG или LRRC4C, или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления ингибиторный модулятор представляет рекомбинантный слитый белок для сиглека-15 и/или связывающих лигандов, например, MAG или LRRC4C. В еще одних вариантах осуществления слитый белок сиглека-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc. В некоторых вариантах осуществления ингибиторные модуляторы для применения в способах по изобретению представляют молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционирует таким образом, чтобы специфически снизить экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG или LRRC4C.
Как здесь используется, термин «внутриклеточная связывающая молекула» предназначен для включения молекул, которые функционируют внутриклеточно, с ингибированием экспрессии или активности белка путем связывания с белком или с нуклеиновой кислотой (например, молекулой мРНК), которая кодирует белок.
Модулятор сиглека-15 по настоящему изобретению также может модулировать, например, блокировать взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления связывающий лиганд сиглека-15 выбран из группы, состоящей из MAG и LRRC4C. В некоторых вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143. В еще одних вариантах осуществления модулятор представляет мутантный белок сиглек-15, который имеет делецию IgV-домена. В некоторых вариантах осуществления модулятор сиглека-15 связывается с IgV-доменом сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления модулятор сиглека-15 связывается с остатком 143 сиглека-15. В некоторых вариантах осуществления модулятор сиглека-15 связывается с областью в лиганде сиглека-15, например, MAG или LRRC4C, где происходит взаимодействие между сиглеком-15 и его лигандом.
i. Ингибиторные нуклеиновые кислоты
В одном варианте осуществления способы, описанные здесь, включают нацеливание на сиглек-15 и/или связывающие лиганды, например, MAG или LRRC4C, с использованием ингибиторных нуклеиновых кислот. Нуклеиновокислотный ингибитор может кодировать короткую интерферирующую РНК (например, агент РНКi), которая нацелена на сиглек-15 и/или его связывающие лиганды, например, MAG или LRRC4C, и ингибирует его экспрессию или активность. Термин «агент РНКi» относится к РНК или ее аналогу, имеющему достаточную комплементарность последовательности к РНК-мишени для направленной РНК-интерференции. Примеры также включают ДНК, которая может быть использована для получения РНК.
РНК-интерференция: РНК-интерференция (РНКi) относится к последовательность-специфическому или селективному процессу, посредством которого молекула-мишень (например, ген-мишень, белок-мишень или РНК-мишень) подвергается понижающей регуляции. Как правило, РНК-интерференция («РНКi») представляет двухцепочечную короткую интерферирующую РНК (siРНК), короткую шпилечную РНК (shРНК) или одноцепочечную микроРНК (miРНК), которая приводит к каталитической деградации специфических мРНК, и также они могут быть использованы для снижения или ингибирования экспрессии генов. РНК-интерференция (РНКi) представляет процесс, при котором двухцепочечная РНК (дцРНК) индуцирует последовательность-специфическую регуляцию экспрессии генов в клетках животных и растений, и в бактериях (Aravin and Tuschl, FEBS Lett., 26: 5830-5840, 2005; Herbert et al., Curr. Opin. Biotech, 19: 500-505, 2008; Sharp, Genes Dev., 15: 485-490, 2001; Valencia-Sanchez et al., Genes Dev., 20: 515-524, 2006). В клетках млекопитающих РНКi может быть запущена дуплексами из 21 нуклеотида короткой интерферирующей РНК (siРНК) (Chiu et al., Mol. Cell., 10: 549-561, 2002), микроРНК (miРНК), функциональной малой шпилечной РНК (shРНК) или других dsРНК, которые экспрессируются in vivo с использованием ДНК-матриц с промоторами РНК-полимеразы II или III (Zeng et al., Mol. Cell, 9: 1327-1333, 2002; Paddison et al., Genes Dev., 16: 948-958, 2002; Denti et al., Mol. Ther., 10: 191-199, 2004; Lee et al., Nature Biotechnol, 20: 500-505, 2002; Paul et al., Nature Biotechnol., 20: 505-508, 2002; Rossi, Human Gene Ther., 19: 313-317, 2008; Tuschl T., Nature Biotechnol, 20: 440-448, 2002; Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (9): 6047-6052, 2002).
Молекулы siРНК: термин «короткая интерферирующая РНК» или «siРНК» (также известная как «малая интерферирующая РНК») относится к РНК-агенту, предпочтительно к двухцепочечному агенту, длиной примерно 10-50 нуклеотидов, предпочтительно длиной примерно 15-25 нуклеотидов, более предпочтительно длиной примерно 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов, где цепи, необязательно имеющие свисающие концы, содержат, например, 1, 2 или 3 свисающих нуклеотида (или нуклеотидных аналогов), который способен направлять или опосредовать РНК-интерференцию. Встречающиеся в природе siРНК образуются из более длинных молекул dsРНК (например, > 25 нуклеотидов в длину) посредством клеточного механизма РНКi.
В общем, в способах, описанных здесь, можно использовать молекулы dsРНК, содержащие 16-30, например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в каждой цепи, где одна из цепей по существу идентична, например, по меньшей мере, на 80% (или более предпочтительно, например, на 85%, 90%, 95% или 100%) идентична, например, имеет 3, 2, 1 или 0 ошибочно спаренных нуклеотида, области-мишени в мРНК, и другая цепь комплементарна первой нити. Молекулы dsРНК можно синтезировать химически, или они могут быть транскрибированы in vitro или in vivo, например, shРНК, из ДНК-матрицы. Молекулы dsРНК можно сконструировать с использованием любого метода, известного в данной области техники. Отрицательные контрольные siРНК не должны обладать значительной комплементарностью последовательности к соответствующему геному. Такие отрицательные контроли можно сконструировать путем случайного скремблирования нуклеотидной последовательности выбранной siРНК; может быть выполнен поиск гомологии, для гарантии того, что отрицательный контроль не имеет гомологии с любым другим геном в соответствующем геноме. Кроме того, отрицательные контрольные siРНК можно сокнструировать введением в последовательность одного или более ошибочных спариваний нуклеотидов.
В способах, описанных здесь, можно использовать как siРНК, так и модифицированные производные siРНК, например, siРНК, модифицированные в целях изменения свойств, таких как специфичность и/или фармакокинетика композиции, например, для увеличения периода полураспада в организме, например, сшитые siРНК. Таким образом, изобретение включает способы введения производных siРНК, которые включают siРНК, имеющую две комплементарные цепи нуклеиновой кислоты, где две цепи сшиты. Модификации олигонуклеотидов включают, не ограничиваясь этим, 2'-O-метил, 2'-фтор, 2'-O-метилоксиэтил и фосфоротиоат, боранофосфат, 4'-тиорибозу. (Wilson and Keefe, Curr., Chem. Biol., 10: 607-614, 2006; Prakash et al., J. Med. Chem., 48: 4247-4253, 2005; Soutschek et al., Nature, 432: 173-178, 2004).
В некоторых вариантах осуществления производное siРНК содержит на своем 3'-конце молекулу биотина (например, фотоотщепляемый биотин), пептид (например, пептид Tat), наночастицу, пептидомиметик, органические соединения (например, краситель, такой как флуоресцентный краситель) или дендример. Посредством модификации производных siРНК таким образом можно увеличить захват клетками или повысить активность нацеливания на клетки полученного производного siРНК по сравнению с соответствующей siРНК, также такая модификация позволяет проводить мониторинг производного siРНК в клетке или повысить стабильность производного siРНК по сравнению с соответствующей siРНК.
Композиции ингибиторных нуклеиновых кислот могут быть неконъюгированными или могут быть конъюгированы с другой группой, такой как наночастица, для совершенствования свойств композиций, например, фармакокинетических параметров, таких как всасывание, эффективность, биодоступность и/или период полураспада. Конъюгацию можно осуществить способами, известными в данной области, например, с использованием методов Lambert et al., Drug Deliv. Rev., 47 (1): 99-112, 2001; Fattal et al., J. Control Release, 53 (1-3): 137-43, 1998; Schwab et al., Ann. Онкол. 5 Suppl. 4: 55-8, 1994; и Godard et al., Eur. J. Biochem., 232 (2): 404-10, 1995). Ингибиторные молекулы нуклеиновой кислоты также могут быть помечены с использованием любого метода, известного в данной области; например, композиции нуклеиновых кислот можно пометить флуорофором, например, Cy3, флуоресцеином или родамином. Введение метки может быть выполнено с использованием набора, например, набора для мечения siРНК SILENCERTM (Ambion). Кроме того, в siРНК можно ввести радиоактивную метку, например, с использованием 3H, 32P или другого подходящего изотопа.
Доставка siРНК: прямая доставка siРНК в физиологическом растворе или других эксципиентах может вызвать сайленсинг генов-мишеней в тканях, таких как глаз, легкие и центральная нервная система (Bitko et al., Nat. Med., 11: 50-55 (2005); Shen et al., Gene Ther., 13: 225-234 (2006), Thakker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004)). У взрослых мышей эффективная доставка siРНК может быть выполнена методом доставки «высокого давления», быстрой инъекцией (в течение 5 сек) большого объема раствора, содержащего siРНК, животному в хвостовую вену (Lewis, Nature Genetics, 32: 107 -108, 2002).
Липосомы и наночастицы также можно использовать для доставки siРНК в организм животных. Было показано, что способы доставки с использованием липосом, например, стабильных частиц нуклеиновая кислота-липид (SNALP), системы доставки на основе диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), а также, например, липоплексов, например, липофектамина 2000, TransIT-TKO, эффективно подавляют мРНК-мишень (de Fougerolles, Human Gene Ther., 19: 125-132 (2008), Landen et al., Cancer Res., 65: 6910-6918 (2005), Luo et al., Mol. Pain 1:29 (2005), Zimmermann et al., Nature, 441: 111-114 (2006)). Конъюгирование siРНК с пептидами, РНК-аптамерами, антителами или полимерами, например, динамическими поликонъюгатами, наночастицами на основе циклодекстрина, ателоколлагеном и хитозаном, может повысить стабильность и/или поглощение siРНК (Howard et al., Mol. Ther., 14: 476-484 (2006), Hu-Lieskovan et al., Cancer Res., 65: 8984-8992 (2005), Kumar и др., Nature, 448: 39-43; McNamara et al., Nat. Biotechnol, 24: 1005-1015 (2007); Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 12982-12987 (2007); Song et al., Nat. Biotechnol, 23: 709-717 (2005); Wolfrum et al., Nat. Biotechnol, 25: 1149-1157 (2007)).
Вирус-опосредованные механизмы доставки также можно использовать для индуции специфического сайленсинга генов-мишеней посредством экспрессии siРНК, например, получением рекомбинантных аденовирусов, несущих siРНК, под транскрипционным контролем промотора РНК-полимеразы II. Инфицирование клеток HeLa такими рекомбинантными аденовирусами позволяет уменьшить экспрессию эндогенного гена-мишени. Инъекция рекомбинантных аденовирусных векторов трансгенным мышам, экспрессирующим гены-мишени siРНК, приводит к снижению экспрессии гена-мишени in vivo. Там же. На животной модели электропорация эмбрионов целиком может эффективно доставлять синтетическую siРНК в мышиные эмбрионы после имплантации (Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (22): 14236-40 (2002)).
Применение сконструированных предшественников РНК для индуции РНКi: сконструированные предшественники РНК, введенные в клетки или целые организмы, как здесь описано, приведут к продукции желаемой молекулы siРНК. Такая молекула siРНК затем связывается с эндогенными белковыми компонентами пути РНКi, чтобы связаться и нацелиться на специфическую последовательность мРНК для ее расщепления, дестабилизации и/или ингибирования трансляции деструкцией. Таким образом, мРНК, которая должна быть нацелена siРНК, полученной из сконструированного предшественника РНК, будет истощаться из клетки или организма, что приведет к уменьшению концентрации белка, кодированного этой мРНК, в клетке или организме.
Антисмысловая: «антисмысловая» нуклеиновая кислота может включать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например, быть комплементарной кодирующей цепи молекулы двухцепочечной кДНК или комплементарной последовательности мРНК-мишени. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарной целой кодирующей цепи последовательности-мишени или только ее области (например, кодирующей области гена-мишени). В еще одном варианте осуществления молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты является антисмысловой к «некодирующей области» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей выбранный ген-мишень (например, 5' и 3' нетранслируемые области).
Антисмысловую нуклеиновую кислоту можно сконструировать таким образом, чтобы она была комплементарна всей кодирующей области мРНК-мишени, но также может иметь место олигонуклеотид, который является антисмысловым только для фрагмента кодирующей или некодирующей области мРНК-мишени. Например, антисмысловый олигонуклеотид может быть комплементарным области, окружающей старт-сайт трансляции мРНК-мишени, например, между -10 и +10 областями интересующей нуклеотидной последовательности гена-мишени. Длина антисмыслового олигонуклеотида может составлять, например, примерно 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или более нуклеотидов.
Антисмысловую нуклеиновую кислоту по изобретению можно сконструировать с использованием реакций химического синтеза и ферментативного лигирования с применением процедур, известных в данной области. Например, антисмысловую нуклеиновую кислоту (например, антисмысловый олигонуклеотид) можно синтезировать химически с использованием природных нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, сконструированных для повышения биологической стабильности данных молекул или для повышения физической стабильности дуплекса, образованного между антисмысловой и смысловой нуклеиновыми кислотами, например, могут быть использованы производные фосфоротиоата и нуклеотиды, замещенные акридином. Антисмысловую нуклеиновую кислоту также можно получить биологически с использованием экспрессионного вектора, в который была субклонирована нуклеиновая кислота в антисмысловой ориентации (т. е. РНК, транскрибированная из вставленной нуклеиновой кислоты, будет иметь антисмысловую ориентацию по отношению к интересующей нуклеиновой кислоте-мишени, описанной далее в следующем подразделе).
На основе последовательностей, описанных здесь, относящихся к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG и LRRC4C, специалист в данной области может легко выбрать и синтезировать любую из ряда подходящих антисмысловых молекул для применения согласно настоящему изобретению. Например, может быть приготовлена «прогулка генов», включающая серию олигонуклеотидов из 15-30 нуклеотидов, охватывающих длину нуклеиновой кислоты-мишени, с последующим тестированием на ингибирование экспрессии гена-мишени. Необязательно, могут быть оставлены гэпы из 5-10 нуклеотидов между олигонуклеотидами для уменьшения количества синтезированных и тестированных олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые молекулы нацелены на IgV-домен сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления антисмысловые молекулы нацелены на область в MAG или LRRC4C, где происходит взаимодействие с сиглеком-15. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые молекулы нацелены на область, охватывающую остаток 143 сиглека-15.
Молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты по изобретению обычно вводят субъекту (например, прямой инъекцией в участок ткани) или генерируют in situ таким образом, что они гибридизуются с клеточной мРНК и/или геномной ДНК, кодирующей белок-мишень, с ингибированием экспрессии белка, например, посредством ингибирования транскрипции и/или трансляции. Альтернативно, молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы для нацеливания на выбранные клетки и затем вводиться системно. Для системного введения антисмысловые молекулы можно модифицировать таким образом, чтобы они специфически связывались с рецепторами или антигенами, экспрессируемыми на выбранной клеточной поверхности, например, посредством связывания молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты с пептидами или антителами, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности или антигенами. Молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты также могут быть доставлены в клетки с использованием векторов, описанных здесь. Для достижения достаточных внутриклеточных концентраций антисмысловых молекул можно использовать векторные конструкции, в которых молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты находится под контролем сильного промотора pol II или pol III.
Технология CRISPR: экспрессия полинуклеотида-мишени (например, ДНК или РНК сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG и LRRC4C) может быть модифицирована обеспечением связывания комплекса CRISPR с полинуклеотидом, где комплекс CRISPR включает фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью в полинуклеотиде-мишене, где направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизуется с tracr-последовательностью. В некотором варианте осуществления связывание комплекса CRISPR с полинуклеотидом-мишенью приводит к повышению экспрессии полинуклеотида-мишени. В еще одном варианте осуществления связывание комплекса CRISPR с полинуклеотидом-мишенью приводит к снижению экспрессии полинуклеотида-мишени (например, ДНК или РНК сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG и LRRC4C).
Технология регулярно расположенных группами, коротких палиндромных повторов (CRISPR) включена в изобретение в качестве подхода для получения РНК-направляемой нуклеазы с настраиваемыми специфичностями для редактирования генома-мишени. Редактирование генома, опосредуемое этими нуклеазами, использовалось для быстрой, простой и эффективной модификации эндогенных генов в самых разных, важных в биологии и медицине типах клеток и в организмах, с которыми традиционно можно манипулировать генетически.
В общем, термин «система CRISPR» в совокупности относится к транскриптам и другим/элементам, участвующим в экспрессии или направлении активности CRISPR-ассоциированных («Cas») генов, включающая последовательности, кодирующие ген Cas, tracr-последовательность (трансактивирующую CRISPR) (например, tracrРНК или активная частичная tracrРНК), парную tract-последовательность (включающую «прямой повтор» и tracrРНК-процессированный частичный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также относящуюся к «спейсеру» в контексте эндогенной системы CRISPR) или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR. В вариантах осуществления изобретения термины «направляющая последовательность» и «направляющая РНК» используются взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы CRISPR получены из системы CRISPR типа I, типа II или типа III. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы CRISPR получены из конкретного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, такого как Streptococcus pyogenes. В общем, система CRISPR характеризуется элементами, которые способствуют формированию комплекса CRISPR в сайте последовательности-мишени (также относится к «протоспейсеру» в контексте эндогенной системы CRISPR). В контексте формирования комплекса CRISPR «последовательность-мишень» относится к последовательности, к которой сконструирована направляющая последовательность для того, чтобы иметь с ней комплементарность, где гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей последовательностью способствует формированию комплекса CRISPR. Последовательность-мишень может содержать любой полинуклеотид, такой как полинуклеотиды ДНК или РНК (например, ДНК или РНК сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например MAG и LRRC4C). В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень находится в ядре или цитоплазме клетки.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения система CRISPR/Cas представляет систему CRISPR типа II, и фермент Cas представляет Cas9, которая катализирует расщепление ДНК. В результате ферментативного действия Cas9, полученной из Streptococcus pyogenes, или любой близкородственной Cas9, образуются двухцепочечные разрывы в последовательностях сайтов-мишеней, которые гибридизуются с 20 нуклеотидами направляющей последовательности и которые имеют последовательность NGG мотива, смежного с протоспейсером (PAM), после 20 нуклеотидов последовательности-мишени. Активность CRISPR через Cas9 для сайт-специфического распознавания и расщепления ДНК определяется направляющей последовательностью, tracr-последовательностью, которая гибридизуется частично с направляющей последовательностью и последовательностью PAM. Дополнительные аспекты системы CRISPR описаны в публикации Karginov and Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archae, Mol. Cell, 2010, 37(1): 7.
Локус CRISPR типа II из Streptococcus pyogenes SF370, который содержит кластер четырех генов Cas9, Cas1, Cas2 и Csn1, а также два некодирующих РНК-элемента, tracrРНК и специфическую совокупность повторяющихся последовательностей (прямых повторов), разделенных короткими отрезками неповторяющихся последовательностей (спейсеры, примерно 30 п.о. каждый). В этой системе направленный двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) генерируется на четырех последовательных стадиях. Во-первых, две некодирующие РНК, совокупность пре-crРНК и tracrРНК, транскрибируются из локуса CRISPR. Во-вторых, tracrРНК гибридизуется с прямыми повторами pre-crРНК, которые затем процессируются в зрелые crРНК, содержащие отдельные спейсерные последовательности. В-третьих, зрелый комплекс crРНК:tracrРНК направляет Cas9 к ДНК-мишени, состоящую из протоспейсера и соответствующего PAM посредством образования гетеродуплекса между спейсерной областью crРНК и протоспейсером ДНК. Наконец, Cas9 опосредует расщепление ДНК-мишени апстрим PAM с образованием DSB в протоспейсере. Несколько аспектов системы CRISPR могут быть дополнительно улучшены для повышения эффективности и универсальности таргетинга CRISPR. Оптимальная активность Cas9 может зависеть от наличия свободного Mg2+ на уровнях выше, чем в ядре млекопитающих (см., например, Jinek et al., 2012, Science, 337: 816), и предпочтительно мотив NGG сразу после протоспейсера ограничивает способность мишени в среднем на каждые 12 п.о. в геноме человека.
Вышеуказанные стратегии на основе ингибиторной нуклеиновой кислоты также можно использовать для снижения уровней Sialyl-Tn. Например, РНК-интерференция, молекулы siРНК, антисмысловые нуклеиновые кислоты и/или технологию CRISPR можно использовать для модуляции уровня экспрессии ферментов, ответственных за образование Sialyl-Tn. Как здесь отмечалось, Sialyl-Tn представляет собой усеченный O-гликан, содержащий сиаловую кислоту, α-2,6 связанную с GalNAc α-O-Ser/Thr. Примеры ферментов, участвующих в синтезе Sialyl-Tn, включают сиалитрансферазу ST6GalNAc1 и COSMC (β3-Gal-T-специфический молекулярный шаперон ядра 1). Модуляция ферментов, участвующих в продуции Sialyl-Tn, таких как сиалитрансфераза ST6GalNAc1 или COSMC, например, с использованием ингибиторных нуклеиновых кислот, может быть использована для снижения уровней Sialyl-Tn in vivo или in vitro.
ii. Антагонистические антитела
Изобретение также предусматривает способы и композиции, содержащие антагонистическое антитело, которое ингибирует сиглек-15 и/или его связывающие лиганды, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, тем самым снижая экспрессию и/или активность сиглек-15 и усиливая иммунный ответ против рака.
В некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, или его антигенсвязывающий фрагмент, снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn.
В некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или антагонистическое антитело к лигандам сиглека-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, или его антигенсвязывающий фрагмент, блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и его связывающим лигандом, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с IgV-доменом сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с остатком 143 сиглека-15. В некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с областью в лиганде сиглека-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn, где происходит взаимодействие между сиглеком-15 и его лигандами.
В одном варианте осуществления антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с внеклеточным эпитопом сиглека-15. Например, антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с сиглеком-15 во внеклеточном эпитопе, ответственным за взаимодействие между сиглеком-15 и лигандом сиглека-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. Такие антитела могут частично или полностью блокировать взаимодействие между сиглеком-15 и лигандом сиглека-15, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. В иллюстративном варианте осуществления антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с сиглеком-15 в эпитопе, который включает остаток 143. В одном варианте антагонистическое антитело к сиглеку-15 не передает сигнал через сиглек-15. В одном варианте антагонистическое антитело к сиглеку-15 индуцирует эндоцитоз сиглека-15. В еще одном варианте антагонистическое антитело к сиглеку-15 не индуцирует эндоцитоз сиглека-15.
Анти-сиглек-15-антитела можно подвергнуть скринингу в отношении их способности противодействовать функции сиглека-15 с использованием стандартных методов. Примеры антагонистических антител к сиглеку-15 включают S15m03 и S15m02, описанные здесь. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, полученные из S15m03 или S15m02, также могут быть пригодными в качестве антагонистов сиглека-15. Например, производное S15m03 или S15m02 может представлять химерный, гуманизированный или человеческий вариант S15m03 или S15m02. Примерное производное S15m03 или S15m02 содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность участков (CDR) S15m03 или S15m02. Например, производное S15m03 или S15m02 может содержать CDR3 тяжелой цепи и/или легкой цепи S15m03 или S15m02. В еще одном примере производное S15m03 или S15m02 может содержать CDR2 тяжелой цепи и/или легкой цепи S15m03 или S15m02. В еще одном примере производное S15m03 или S15m02 может содержать CDR1 тяжелой цепи и/или легкой цепи S15m03 или S15m02. В еще одном примере производное S15m03 или S15m02 может содержать CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и/или легкой цепи S15m03 или S15m02. В предпочтительных вариантах осуществления производные S15m03 или S15m02 сохраняют антигенсвязывающую специфичность S15m03 или S15m02 для сиглека-15.
В одном варианте осуществления анти-сиглек-15-антитело представляет собой антитело, представленное в предварительной заявке на патент США № 62/397794, поданной 21 сентября 2016 года, полное содержание которой включено здесь посредством ссылки.
Другие примерные анти-сиглек-15-антитела, которые могут быть пригодны в качестве антагонистов сиглека-15, включают, не ограничиваясь этим, mAb A9E8 (описанное в патенте США № 9447192), mAb DS-1501 (Daiichi Sankyo), mAb 32A1 (описанное в патенте США № 8575316) mAb AB-25E9 (Alethia Biotherapeutics), mAb 25B8, mAb 25E6 и mAb 25E9 (описанные в патенте США № 9388242). Полное содержание патентов США № 9447192, № 8557316 и № 9388242 включено здесь посредством ссылки. Другие примерные анти-сиглек-15-антитела включают антитела, которые конкурируют за связывание с вышеуказанными антителами против сиглека-15, и/или которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом в сиглеке-15 в качестве вышеуказанных анти-сиглек-15-антител. В одном варианте антагонист сиглека-15 не является mAb A9E8 или его антигенсвязывающим фрагментом. В еще одном варианте осуществления антагонист сиглека-15 не является mAb DS-1501 или его антигенсвязывающим фрагментом. В еще одном варианте осуществления антагонист сиглека-15 не представляет mAb AB-25E9 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с внеклеточным эпитопом MAG. Например, антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с MAG во внеклеточном эпитопе, ответственным за взаимодействие между MAG и сиглеком-15. Такие антитела могут частично или полностью блокировать взаимодействие между MAG и сиглеком-15. В примерном варианте осуществления антагонистическое анти-MAG-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с MAG в эпитопе, который взаимодействует с остатком 143 сиглека-15. В одном варианте осуществления антагонистическое анти-MAG-антитело не передает сигнал через MAG.
В одном варианте осуществления антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с внеклеточным эпитопом LRRC4C. Например, антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с LRRC4C во внеклеточном эпитопе, ответственным за взаимодействие между LRRC4C и Сиглек-15. Такие антитела могут частично или полностью блокировать взаимодействие между LRRC4C и сиглеком-15. В примерном варианте осуществления антагонистическое анти-LRRC4C-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с LRRC4C в эпитопе, который взаимодействует с остатком 143 сиглека-15. В одном варианте осуществления антагонистическое анти-LRRC4C-антитело не передает сигнал через LRRC4C.
В одном варианте осуществления антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с Sialyl-Tn. Такие антитела могут частично или полностью блокировать взаимодействие между Sialyl-Tn и сиглеком-15. В примерном варианте осуществления антагонистической анти-Sialyl-Tn-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с Sialyl-Tn в эпитопе, который взаимодействует с сиглеком-15. В одном варианте осуществления антагонистическое анти-Sialyl-Tn-антитело не передает сигнал через полипептид, содержащий Sialyl-Tn.
Антагонистические антитела, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, можно идентифицировать, подвергнуть скринингу (например, с использованием фагового дисплея) или охарактеризовать их физико-химические свойства и/или биологическую активность с помощью различных методов, известных в данной области (см. например, Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, Greenfield, ed., 2014). Специфичность связывания антитела для его антигена может быть тестирована с использованием способов, известных в данной области, таких как ELISA, вестерн-блоттинг или поверхностный плазмонный резонанс.
Антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и композиций, известных в данной области, например, как описано в патенте США № 4816567, включенном здесь посредством ссылки. Выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую, например, анти-сиглек-15-антитело используют для трансформации клеток-хозяев для экспрессии. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В дополнительном варианте осуществления обеспечивается один или более векторов (например, экспрессионных векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В дополнительном варианте осуществления обеспечивается клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин включает (например, была трансформирована): вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомячка (CHO) или лимфоидной клеткой (например, Y0, NS0, клеткой Sp20).
Для рекомбинантной продукции анти-сиглек-15-антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, выделяют и вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделить и секвенировать с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные здесь. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и Fc-эффекторная функция. Информацию по экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, в патентах США № 5648237, 5789199 и 5840523. После экспрессии антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.
В дополнение к прокариотам эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования у которых «гуманизированы», что приводит к получению антитела с частично или полностью человеческим паттерном гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech., 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech., 24: 210-215 (2006).
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также могут происходить из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Клетки позвоночных могут также использоваться в качестве хозяев. Например, могут быть пригодными клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами пригодных клеточных линий клеток млекопитающих являются линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия почки человеческого эмбриона (293 или клетки 293, как описано, например, в публикации Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); мышиные клетки Сертоли (клетки ТМ4, как описано, например, в публикации Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Нер G2); опухоль молочной железы мыши (MM I Ub0562); клетки TR1, как описано, например, в публикации Mather et al. Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982); клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), в том числе, клетки DHFR.sup.-CHO (Uriaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); и линии клеток миеломы, такие как YO, NSO и Sp2/0. Обзор по некоторым линиям клеток-хозяев млекопитающих, пригодным для продукции антител, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).
iii. Низкомолекулярные ингибиторы
Другие ингибиторные модуляторы, которые могут быть использованы для специфического ингибирования активности белка сиглека-15, представляют химические соединения, которые непосредственно ингибируют активность сиглека-15 или ингибируют взаимодействие между сиглеком-15 и его связывающими лигандами, например, MAG, LRRC4C и/или Sialyl-Tn. Такие соединения могут представлять природные продукты или члены комбинаторной химической библиотеки, и могут быть идентифицированы с использованием скрининговых анализов, как подробно описано ниже.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярные ингибиторы по настоящему изобретению могут блокировать взаимодействие между сиглеком-15 и его связывающими лигандами. Например, низкомолекулярные ингибиторы связываются с IgV-доменом сиглека-15. В еще одних вариантах осуществления низкомолекулярные ингибиторы по настоящему изобретению могут связываться с областью в MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, которая взаимодействует с IgV-доменом сиглека-15, тем самым блокируя взаимодействие между сиглеком-15 и его лигандом, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярные ингибиторы выбраны для связывания доменов, разделяющих гомологию с доменом сиглека-15. Например, небольшая молекула по настоящему изобретению может быть нацелена на домен, который, по меньшей мере, на 50% идентичен, по меньшей мере, на 60% идентичен, по меньшей мере, на 70% идентичен, по меньшей мере, на 80% идентичен, по меньшей мере, на 90% идентичен или, по меньшей мере, на 95% или 99% идентичен IgV-домену сиглека-15. Такая небольшая молекула будет способна связывать белковые домены, возможно в сиглеке-15, которые в функциональном отношении подобны, например, IgV-домену сиглека-15.
Низкомолекулярные ингибиторы по настоящему изобретению могут также связываться с определенным мотивом или консенсусной последовательностью, полученной из IgV-домена сиглека-15, что позволяет низкомолекулярным ингибиторам специфически связываться с доменами, которые являются одинаковыми между членами семейства сиглеков. В еще одном варианте осуществления небольшие молекулы по настоящему изобретению связываются с белковыми мотивами или консенсусными последовательностями, которые представляют трехмерную структуру белка. Такие мотивы или консенсусные последовательности не должны представлять собой непрерывную цепочку аминокислот, а в большей степени представляют нелинейное расположение аминокислот, которое возникает в результате трехмерного фолдинга сиглека-15 (т. е. структурного мотива). Примером такого мотива может быть мотив, сконструированный на основе IgV-домена сиглека-15. Такие мотивы и консенсусные последовательности могут быть сконструированы в соответствии с любыми способами, известными в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления небольшая молекула связывается с определенными последовательностями белка сиглека-15, например, с остатком 143 сиглека-15.
iv. Слитые белки или мутантные белки
Варианты белка сиглека-15 или варианты связывающих лигандов сиглека-15 (например, MAG и LRRC4C), которые функционируют в качестве антагонистов и ингибируют активность сиглека-15, могут быть использованы в способах по настоящему изобретению. Например, в качестве ингибиторного модулятора в настоящем изобретении можно использовать Fc-слитый белок сиглека-15, который функционирует в качестве блокирующего белка аналогично антагонистическому анти-сиглек-15-антителу. В иллюстративном варианте осуществления антагонист слитый белок сиглек-15-Fc представляет собой растворимый слитый белок сиглек-15-Fc. Альтернативно, мутанты сиглека-15, которые обладают пониженной активностью связывания для своих лигандов, также будут функционировать в качестве ингибиторного модулятора для применения в способах по изобретению. Например, в качестве ингибиторного модулятора в настоящем изобретении может быть использован мутант сиглека-15, который имеет одну мутацию замены в остатке 143 или мутант сиглека-15 без IgV-домена.
В некоторых вариантах осуществления варианты связывающих лигандов сиглека-15 (например, MAG и LRRC4C) блокируют взаимодействие между сиглеком-15 и его связывающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления в качестве ингибиторного модулятора в настоящем изобретении можно использовать Fc-слитый белок MAG или LRRC4C, который функционирует в качестве блокирующего белка аналогично антагонистическому анти-сиглек-15-антителу. В еще одном примере белок, содержащий Sialyl-Tn, может функционировать в качестве блокирующего агента посредством связывания и секвестрации сиглека-15. Альтернативно, мутанты MAG или LRRC4C, которые обладают погниженной активностью связывания для сиглека-15, также будут функционировать в качестве ингибиторного модулятора для применения в способах по изобретению. Например, мутант MAG или LRRC4C, который имеет мутацию, которая отменяет взаимодействие с IgV-доменом сиглека-15, может быть использован в качестве ингибиторного модулятора в настоящем изобретении.
Рекомбинантный слитый белок для сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG или LRRC4C, для применения в способах по настоящему изобретению, можно получить из рекомбинантного вектора в соответствии с методами, известными в данной области. Рекомбинантные векторы могут содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок сиглек-15, в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Fc-участок IgG, может быть операбельно связана в экспрессионном векторе с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок, такой как сиглек-15 и/или его связывающие лиганды, например, MAG и LRRC4C, или его функциональный сегмент. Затем полученный слитый белок можно легко выделить из клеток способами, известными в данной области, такими как с применением анти-Fc-антитела.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные векторы могут включать одну или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, которые предназначены для применения для экспрессии, которые операбельно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована (т. е. рекомбинантным экспрессионным вектором). По отношению к рекомбинантному экспрессионному вектору «операбельно связанный» означает, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, который обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда вектор вводится в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» предназначен для включения промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов экспрессии (например, сигналов полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology, vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что конструирование экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, предназначенной для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и тому подобное. Экспрессионные векторы по изобретению могут вводиться в клетки-хозяева для получения тем самым белков или пептидов, включая слитые белки или пептиды, кодированные нуклеиновыми кислотами, как описано здесь.
Рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению могут быть сконструированы для экспрессии полипептида или его функционального фрагмента в прокариотических (например, E. coli) или эукариотических клетках (например, клетках насекомых с использованием экспрессионных векторов на основе бакуловирусов, дрожжевых клеток или клеток млекопитающих). Подходящие клетки-хозяева могут включать, не ограничиваясь этим, клетки E.coli, клетки Bacillus, клетки Saccharomyces, клетки Pochia, клетки NS0, клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки миеломы или клетки, описанные здесь.
Еще один аспект изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был введен рекомбинантный вектор по изобретению. Термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» используются здесь взаимозаменяемо. Понятно, что такие термины относятся не только к конкретной данной клетке, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут иметь место в последующих поколениях за счет мутации или воздействия окружающей среды, то такое потомство не может, по сути, быть идентичным родительской клетке, но оно включается в объем данного термина, как используется здесь.
Векторную ДНК можно ввести в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычных методов трансформации или трансфекции. Как здесь используется, термины «трансформация» и «трансфекция» предназначены относиться к различным методам, известным в данной области техники, для введения чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, включая копреципитацию фосфатом кальция или хлоридом кальция, DEAE-декстран-опосредованную трансфекцию, липофекцию или электропорацию.
v. Пептиды, полученные из сиглека-15
Ингибиторный модулятор для применения в способах по настоящему изобретению представляет собой пептидное соединение, полученное из аминокислотной последовательности сиглека-15 и/или его связывающих лигандов (например, последовательности, раскрытые здесь в SEQ ID NO: 2, 4 и 6). В частности, ингибиторное соединение включает фрагмент сиглека-15 (или его миметик), который опосредует взаимодействие сиглека-15 со связывающим лигандом, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, так что контактироване сиглека-15 с этим пептидным соединением конкурентно ингибирует взаимодействие сиглека-15 с его связывающим лигандом, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Например, пептид, полученный из сиглека-15, который содержит аминокислотную последовательность в IgV-домене, может служить в качестве ингибиторного модулятором. Альтернативно, пептид, полученный из сиглека-15, который содержит аминокислотную последовательность, окружающую остаток 143 сиглека-15, может служить в качестве ингибиторного модулятора. В еще одних вариантах осуществления пептид, полученный из MAG или LRRC4C, который содержит аминокислотную последовательность в области, где происходит взаимодействие с сиглеком-15, может служить в качестве ингибиторного модулятора.
Пептидные соединения по изобретению могут быть получены внутриклеточно в клетках введением в клетки экспрессионного вектора, кодирующего пептид. Такие экспрессионные векторы можно получить стандартными методами. Пептид можно экспрессировать внутриклеточно в виде слитой конструкции с другим белком или пептидом (например, слиянием GST). Альтернативно рекомбинантному синтезу пептидов в клетках, пептиды получить химическим синтезом с использованием стандартных методов пептидного синтеза. Затем синтезированные пептиды могут быть введены в клетки различными способами, известными в данной области техники, для введения пептидов в клетки (например, липосомы и тому подобное).
В. Стимулирующие модуляторы
В некоторых вариантах осуществления модулятор для применения в способах по изобретению представляет собой стимулирующий модулятор, который повышает экспрессию и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, и тем самым ослабляет воспаление у субъекта, нуждающегося в этом. Примеры таких стимулирующих модуляторов включают белки, молекулы нуклеиновых кислот, например, экспрессионные векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, и небольшие молекулы, которые стимулируют экспрессию и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, в клетке.
Как здесь используется, термин «молекула нуклеиновой кислоты» предназначен для включения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК) и аналогов ДНК или РНК, полученных с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет двухцепочечную ДНК. Молекулу нуклеиновой кислоты, используемую в способах по настоящему изобретению, можно выделить с использованием стандартных методов молекулярной биологии. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет белок сиглек-15. Например, стимулирующий модулятор представляет полноразмерный белок сиглек-15, функциональный фрагмент сиглека-15 или IgV-домен сиглека-15. Стимулирующие модуляторы стимулируют взаимодействие между сиглеком-15 и его связывающими лигандами, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. В еще одних вариантах осуществления стимулирующий модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок сиглек-15. Например, кДНК (полноразмерная или частичная последовательность кДНК) клонируется в рекомбинантный экспрессионный вектор, и вектор трансфицируется в клетки с использованием стандартных методов молекулярной биологии. кДНК может быть получена, например, амплификацией с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скрининга соответствующей библиотеки кДНК.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующий модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет связывающий лиганд белка сиглека-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Стимулирующий модулятор способствует взаимодействию между сиглеком-15 и его связывающими лигандами. В еще одних вариантах осуществления стимулирующий модулятор, подходящий для применения в способах по настоящему изобретению, представляет молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающий лиганд белка сиглека-15, например, MAG и LRRC4C.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующий модулятор для применения в способах по изобретению представляет внутриклеточную связывающую молекулу, которая функционирует, чтобы активировать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Как здесь используется, термин «внутриклеточная связывающая молекула» предназначен для включения молекул, которые функционируют внутриклеточно, с повышением экспрессии или активности белка посредством связывания с белком или с нуклеиновой кислотой (например, молекулой мРНК), которая кодирует белок.
В еще одних вариантах осуществления стимулирующий модулятор представляет агонистическое антитело к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG или LRRC4C, или его антигенсвязывающий фрагмент. Такие агонистические антитела к сиглеку-15 и/или его связывающим лигандам, например, MAG или LRRC4C, могут быть идентифицированы и получены с использованием способов, описанных здесь.
В одном варианте осуществления стимулирующий модулятор представляет слитый белок сиглек-15. В примерных вариантах осуществления стимулирующий слитый белок сиглек-15 иммобилизован, например, на клетке или на твердой подложке, например, на бусине. Например, слитый белок сиглек-15-Fc, связанный с мембраной, может повысить активность связывающих лигандов сиглека-15 или сиглека-15 и может функционировать в качестве агониста сиглека-15. В еще одном варианте осуществления агонист представляет слитый белок сиглек-Fc, содержащий мутации в FcR-связывании.
В некотором варианте осуществления стимулирующая нуклеиновая кислота может быть использована для активации экспрессии и/или активности сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG и LRRC4C, на основе технологии CRISPR, как здесь описано.
Другие стимулирующие модуляторы, которые можно использовать для специфической активации активности белка сиглека-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, представляют химические соединения, которые непосредственно активируют активность сиглека-15 или способствуют взаимодействию между сиглеком-15 и/или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Такие соединения можно идентифицировать с использованием скрининговых тестов, которые выбирают для таких соединений, как подробно описано ниже.
V. Скрининговые тесты
Модуляторы, которые влияют на активность сиглека-15, могут быть известны (например, антитела, которые влияют на активность сиглека-15 или мутантные белки сиглека-15) или могут быть идентифицированы с использованием способов, описанных здесь. Изобретение обеспечивает способы (также называемые здесь «скрининговыми тестами») для идентификации других модуляторов, т. е. кандидатов или испытуемых соединений или модуляторов (например, пептидов, небольших молекул или других лекарственных средств), которые модулируют экспрессию и/или активность сиглека-15, и для тестирования или оптимизации активности других модуляторов.
В некоторых вариантах осуществления молекулы, которые связываются с сиглеком-15 и/или его связывающими лигандами, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, или оказывают стимулирующее или ингибирующее действие на экспрессию и/или активность сиглека-15 или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
В одном варианте осуществления способность соединения непосредственно модулировать экспрессию, посттрансляционную модификацию или активность сиглека-15 или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, измеряется в качестве показателя с использованием скринингового теста по настоящему изобретению.
Модуляторы, способные ингибировать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15 или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, идентифицированные способами по изобретению, пригодны в качестве соединений-кандидатов, подходящих для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, уменьшения размера опухоли или повышения выживаемости у субъекта, нуждающегося в этом, или усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом.
Модуляторы, которые способны повышать экспрессию, стабильность и/или активность сиглека-15 или его связывающих лигандов, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, идентифицированные способами по изобретению, пригодны в качестве соединений-кандидатов, подходящих для лечения аутоиммунного заболевания или ослабления воспалительного ответа у субъекта, нуждающегося в этом.
Например, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам идентификации соединения, пригодного для лечения аутоиммунного заболевания или рака у субъекта. Способы включают обеспечение испытуемого соединения (или множества испытуемых соединений), определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15 и выбор соединения, которое модулирует экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для лечения аутоиммунного заболевания или рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления повышение экспрессии и/или активности сиглека-15 указывает на то, что соединение пригодно для лечения аутоиммунного заболевания. В еще одних вариантах осуществления снижение экспрессии и/или активности сиглека-15 указывает на то, что соединение пригодно для лечения рака.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам идентификации соединения, пригодного для усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают обеспечение испытуемого соединения (или множества испытуемых соединений), определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15 и выбор соединения, которое снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам идентификации соединения, пригодного для ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом. Способы включают обеспечение испытуемого соединения (или множества испытуемых соединений), определение влияния испытуемого соединения на экспрессию и/или активность сиглека-15 и выбор соединения, которое повышает экспрессию и/или активность сиглека-15, тем самым идентифицируя соединение, пригодное для ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта.
Примеры модуляторов, соединений-кандидатов или испытуемых соединений включают, не ограничиваясь этим, нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК), углеводы, липиды, белки, пептиды, пептидомиметики, небольшие молекулы и другие лекарственные средства. Модуляторы могут быть получены с использованием любого из многочисленных подходов к способам комбинаторных библиотек, известных в данной области, включающих: биологические библиотеки; пространственно адресуемые параллельные библиотеки в твердой и жидкой фазах; способы синтетических библиотек, в которых требуется обратное преобразование; способ библиотеки «одна гранула-одно соединение» и способы синтетических библиотек с применением отбора при помощи аффинной хроматографии. Способ биологических библиотек ограничивается белковыми библиотеками, в то время как другие четыре подхода применимы к библиотекам пептидов, непептидных олигомеров или низкомолекулярных соединений (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145, патент США № 5738996 и патент США № 5807683, полное содержание каждой из вышеприведенных ссылок включено здесь посредством ссылки).
Примеры способов синтеза молекулярных библиотек можно найти в данной области, например, в публикациях: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Акад. Sci. USA, 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Акад. Sci. USA, 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem., 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; и Gallop et al. (1994) J. Med. Chem., 37: 1233, содержание каждой из вышеприведенных ссылок включено здесь посредством ссылки. Библиотеки соединений могут быть представлены, например, в растворе (например, Houghten (1992) Bio/Techniques, 13: 412-421) или на бусинах (Lam (1991) Nature, 354: 82- 84), чипах (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), бактериях (патент США № 5223409), спорах (патенты США № 5571698, 5403484 и 5223409), плазмидах (Cull et al., 1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869) или фаге (Scott and Smith (19900 Science 249: 386-390; Devlin, 1990) Science, 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 и Felici (1991) J. Mol. Biol., 222: 301-310). Содержание каждой из вышеприведенных ссылок включено здесь посредством ссылки.
Испытуемое соединение может контактировать с клеткой, которая экспрессирует белок сиглек-15, или молекулой, с которой сиглек-15 непосредственно взаимодействует, например, MAG или LRRC4C. Например, испытуемое соединение может контактировать с клеткой, которая изначально естественным образом экспрессирует или сконструирована для экспрессии белка(ов), введением в клетку экспрессионного вектора, кодирующего белок.
Альтернативно, испытуемые соединения можно подвергнуть воздействию бесклеточной композиции, которая включает белок(и) (например, клеточный экстракт или композицию, которая включает, например, очищенный природный или рекомбинантный белок).
Соединения, которые модулируют экспрессию и/или активность сиглека-15 или связывающего лиганда сиглека-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, могут быть идентифицированы с использованием различных «считываний».
Например, клетку можно трансфицировать экспрессионным вектором, инкубировать в присутствии и в отсутствии испытуемого соединения, и можно определить влияние соединения на экспрессию сиглека-15 или на биологический ответ, регулируемый сиглеком-15. Биологическая активность сиглека-15 включает активности, определенные in vivo или in vitro, в соответствии со стандартными методами. Активность может представлять прямую активность, такую как связывание со связывающим лигандом, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn. Альтернативно, активность является опосредованной активностью, такой как усиление воспалительного ответа в головном мозге.
Для того, чтобы определить, модулирует ли испытуемое соединение экспрессию белка сиглека-15, можно провести транскрипционные анализы in vitro. Для того, чтобы определить, может ли испытуемое соединение модулировать экспрессию мРНК сиглека-15, можно выполнить различные методы, такие как количественная ПЦР или ПЦР в режиме реального времени.
В данной области известны различные репортерные гены, и они пригодны для применения в скрининговых тестах по изобретению. Примеры подходящих репортерных генов включают те, которые кодируют хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, бета-галактозидазу, щелочную фосфатазу, зеленый флуоресцентный белок или люциферазу. Стандартные способы измерения активности этих генных продуктов известны в данной области.
Различные типы клеток подходят для применения в качестве индикаторной клетки в скрининговом тесте. Предпочтительно используют клеточную линию, которая экспрессирует низкие уровни эндогенного сиглека-15 и затем конструируют для экспрессии рекомбинантного белка. Клетки для применения в данных анализах включают эукариотические клетки. Например, в одном варианте осуществления клетка представляет грибковую клетку, такую как дрожжевая клетка. В еще одном варианте осуществления клетка является растительной клеткой. В еще одном варианте осуществления клетка является клеткой позвоночного, например, клеткой птицы или клеткой млекопитающего (например, мышиной клеткой или клеткой человека).
Рекомбинантные экспрессионные векторы, которые можно использовать для экспрессии, например, сиглека-15, известны в данной области. Например, кДНК сначала вводят в рекомбинантный экспрессионный вектор с использованием стандартных методов молекулярной биологии. кДНК может быть получена, например, амплификацией с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скринингом соответствующей библиотеки кДНК. Нуклеотидные последовательности кДНК для молекулы или молекулы на пути сигнальной трансдукции, включающие (например, человеческие, мышиные и дрожжевые), известны в данной области и могут быть использованы для конструирования ПЦР-праймеров, которые позволяют амплифицировать кДНК стандартными методами ПЦР или для конструирования гибридизационного зонда, который может быть использован для скрининга библиотеки кДНК с использованием стандартных методов гибридизации.
В еще одном варианте осуществления испытуемые соединения могут быть подвергнуты воздействию бесклеточной композиции, которая включает белок(и) (например, клеточный экстракт или композицию, которая включает, например, очищенный природный или рекомбинантный белок). Сиглек-15, экспрессированный рекомбинантными методами в клетках-хозяевах или культуральной среде, можно выделить из клеток-хозяев или клеточной культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков. Например, можно использовать ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку антителами для получения очищенного или полуочищенного белка, который может использоваться в бесклеточной композиции. Альтернативно, лизат или экстракт клеток, экспрессирующих представляющий интерес белок, можно приготовить для применения в качестве бесклеточной композиции.
В одном варианте осуществления соединения, которые специфически модулируют активность сиглека-15 или активность связывающего лиганда на пути сигнальной трансдукции с участием сиглека-15, идентифицируются на основании их способности модулировать взаимодействие сиглека-15 с его связывающим лигандом. Связывающим лигандом может быть молекула мРНК или белковая молекула, например, MAG или LRRC4C. В данной области известны подходящие методы, которые позволяют обнаруживать белок-белковые взаимодействия (например, иммунопреципитации, двухгибридные анализы и т.п.) или которые позволяют детектировать взаимодействия между сиглеком-15 и мРНК (например, анализ сдвига электрофоретической подвижности, анализ ДНКазы I и т.п.). Выполняя такие анализы в присутствии и отсутствии испытуемых соединений, результаты анализов можно использовать для идентификации соединений, которые модулируют (например, ингибируют или повышают) активность сиглека-15 со связывающим лигандом.
Соединения, идентифицированные в скрининговых тестах, можно использовать в способах модуляции одного или более биологических ответов, регулируемых сиглеком-15. Следует понимать, что может быть желательно формулировать такое соединение(я) в качестве фармацевтических композиций, как здесь описано, до контактирования с клетками.
После идентификации испытуемого соединения, которое прямо или опосредованно модулирует, например, экспрессию или активность сиглека-15 одним из различных способов, описанных выше, выбранное испытуемое соединение (или «представляющее интерес соединение») затем может быть дополнительно оценено на его влияние на клетки, например, контактированием представляющего интерес соединения с клетками in vivo (например, введением представляющего интерес соединения в организм) или ex vivo (например, выделением клеток из организма и контактированием выделенных клеток с представляющим интерес соединением или, альтернативно, контактированием представляющего интерес соединения с клеточной линией) и определением влияния представляющего интерес соединения на клетки по сравнению с соответствующим контролем (таким как необработанные клетки или клетки, обработанные контрольным соединением или носителем, который не модулирует биологический ответ).
В еще одном аспекте изобретение относится к комбинации двух или более анализов, описанных здесь. Например, модулятор может быть идентифицирован с использованием анализа на основе клеток или без клеток, и способность модуляторов повышать или снижать активность сиглека-15 или белка, с которым взаимодействует сиглек-15, может быть подтверждена in vivo, например, на животном, таком как, например, животная модель, например, опухолевая модель глиобластомы.
Более того, модулятор сиглека-15 или молекула на сигнальном пути, включающем сиглек-15, идентифицированный, как здесь описано (например, молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты или специфическое антитело или небольшая молекула), может быть использован на животной модели для определения эффективности, токсичности или побочных эффектов лечения, с помощью такого модулятора. Альтернативно, модулятор, идентифицированный, как здесь описано, может быть использован на животной модели для определения механизма действия такого модулятора.
В еще одном варианте осуществления, следует понимать, что можно использовать аналогичные скрининговые тесты для идентификации соединений, которые опосредованно модулируют активность и/или экспрессию сиглека-15, например, проведением скрининговых тестов, таких как описанные выше, с использованием молекул, с которыми взаимодействует сиглек-15, например, MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, или любых молекул, которые функционируют апстрим или даунстрим на пути сиглека-15.
Соединения, идентифицированные с помощью скрининговых тестов по настоящему изобретению, рассматриваются в качестве кандидатов терапевтических агентов, пригодных для лечения заболеваний, например, рака или аутоиммунного заболевания, как здесь описано. Таким образом, изобретение также включает соединения, идентифицированные в скрининговых тестах, и способы их введения и применения в лечении, профилактике или замедлении развития или прогрессирования заболеваний, описанных здесь.
Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными методами анализа или испытуемыми агентами, и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и агенты могут варьироваться. Следует также понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не предназначены для ограничения каким-либо образом. Полное содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, приведенных по тексту данной заявки, а также на фигурах, включено здесь посредством ссылки.
Примеры
Пример 1. Идентификация сиглека-15 технологией на основе полногеномных микрочипов активности Т-клеток
Для проведения полногеномного поиска человеческих мишеней для иммунотерапии был разработан полногеномный микрочип активности Т-клеток (GS-TCAA). Были получены 6402 кДНК мембраны человека, покрывающие 90% генома человеческих мембран, с использованием наборов miniprep Qiagen, количественно оцененных и разбавленных для конструирования GS-TCAA.
Ряд рецепторных чипов человека, содержащих четыре 1536-луночных планшета, центрифугировали (600 g, 2 мин) с последующей обратной трансфекцией. Вкратце, в 1536-луночные планшеты с микрочипами разливали по 2 мкл optiMEM, содержащей липофектамин 3000 (7 мкл липо/мл), на лунку с использованием робота-дозатора (Multidrop Combi, Thermo Scientific), и быстро встряхивали в течение 1 мин с помощью ультраскоростного орбитального шейкера. Все планшеты хранили при комнатной температуре в течение 20 мин с последующим добавлением клеток 293T.2A.m.anti-CD3 для стимуляции Т-клеток (2000 клеток в 4 мкл на лунку) с помощью Multidrop. После этого планшеты дополнительно центрифугировали (1000 g, 4 мин) для удаления пузырьков внутри каждой лунки до инкубации при 37°С. Т-клетки с репортером или первичные Т-клетки (4000 клеток), такие как сконструированные клеточные линии Jurkat с различными репортерами GFP, загружали в планшеты с микрочипами через 24 ч после трансфекции. Визуализацию планшетов проводили через 12 ч после совместной культивирования Т-клеток со стимуляторами Т-клеток на основе 293Т с помощью анализатора изображений InCell (GE). После оптимального анализа изображений с использованием программного обеспечения Cellprofiler были определены гены-кандидаты с потенциальными регуляторными функциями. Например, если молекула неэффективна в модуляции активности Т-клеток, то сигнал GFP останется таким же. Если молекула действует в качестве стимулирующего сигнала для активности Т-клеток, тогда будет детектироваться более сильный сигнал GFP. Альтернативно, если молекула является ингибирующей, то будет наблюдаться значительно более слабый сигнал GFP. Основываясь на полногеномных микрочипах активности T-клеток, сиглек-15 был идентифицирован в качестве иммунного модулятора, на основании чего можно предположить, что сиглек-15 может иметь иммунологическую функцию.
Пример 2. Экспрессия сиглека-15 в головном мозге и миелоидных клетках
Экспрессию сиглека-15 оценивали в разных тканях мыши с использованием ОТ-ПЦР с библиотекой мышиных кДНК (Clontech Laboratories). Плазмиду сиглек-15 использовали в качестве положительного контроля (Origene). Результаты приведены на фиг. 1A. Результаты анализа с использованием микрочипов экспрессии РНК сиглека-15 в тканях человека (BioGPS.org) приведены на фиг. 1B. Приведенные данные показывают, что сиглек-15 экспрессируется в клетках головного мозга и миелоидных клетках как у человека, так и у мыши в нормальных условиях. Данные микрочипов из базы BioGPS представлены на фиг. 1C, они демонстрируют, что сиглек-15 экспрессируется на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, В-клетках и остеокластах. Следовательно, сиглек-15 может иметь физиологическую функцию при заболеваниях головного мозга и/или в регуляции иммунного ответа.
Пример 3. Экспрессия сиглека-15 в злокачественных опухолях
Метаанализ экспрессии сиглека-15 в злокачественных опухолях человека проводили с использованием данных микрочипов из базы TCGA. Экспрессию мРНК сиглека-15 во многих злокачественных опухолях человека сравнивали с аналогичной нормальной тканью (фиг. 2). Исходные данные базы нормализовали с использованием программного обеспечения UCSC Cancer Genomics Browser (https://genome-cancer.ucsc.edu) и анализировали с использованием программы R. Эти данные показывают, что сиглек-15 сверэкспрессируется во многих злокачественных опухолях человека и может играть роль в развитии и прогрессировании рака.
Экспрессию сиглека-15 также оценивали в нескольких опухолевых клеточных линиях человека. Экспрессия сиглека-15 в опухолевых клеточных линиях человека определяли с использованием микрочипа NCI60 (BioGPS) (фиг. 3A, значения экспрессии показаны в условных единицах). Несколько опухолевых клеточных линий человека окрашивали анти-сиглек-15-антителом m03. Антитело m03 получали иммунизацией мышей NZB/W F1 с использованием слитого белка мышиного эктодомена сиглека-15, и оно перекрестно реагирует с человеческим сиглеком-15. Окрашенные клетки анализировали на экспрессию сиглека-15 с использованием FACS (фиг. 3B). Эти данные показывают, что сиглек-15 также повышающе регулируется в опухолевых клеточных линиях человека.
Пример 4. Идентификация MAG или LRRC4C в качестве лигандов для сиглека-15 с помощью технологии рецепторных чипов
Для индентификации лиганда для сиглека-15, слитый белок сиглек-15-Fc получали слиянием внеклеточного домена каждой молекулы с мышиной или человеческой Fc-меткой (Dong H. et al., Nat. Med., 1999; 5 (12): 1365-9) и подвергали скринингу во вновь созданном полногеномном рецепторном чипе человека (Yao S. et al., Immunity 2011, 34 (5): 729-40). Вкратце, полную библиотеку генов человеческих мембран, содержащую более 6200 генов, собирали, поддерживали и разбавляли средой OPTI-MEM и помещали по отдельности в четыре 1536-луночных планшета из расчета 40 нг/лунку с использованием роботизированной системы. Липофектамин 2000 добавляли в каждую лунку и смешивали с плазмидами в течение 30 мин. Затем в каждую лунку вносили две тысячи клеток HEK293T для проведения транзиентной трансфекции. Через 8 ч после трансфекции в каждую лунку вносили 10 нг слитой конструкции человеческий сиглек-15-Fc и анти-Fc вторичного антитела в системе FMAT с синим окрашиванием. Планшеты считывали через 24 ч после трансфекции с использованием системы для детектирования клеток Applied Biosystems 8200 и анализировали с использованием программного обеспечения CDS 8200. Гены Fc-рецептора человека служили внутренним положительным контролем для анализа.
Два положительных результата идентифицировали для лигандов сиглека-15: миелин-ассоциированного гликопротеина (MAG) и лейцин-богатого повтора 4C (LRRC4C) (фиг. 4A). MAG, также названный сиглеком-4, в основном обнаруживали в головном мозге, и он участвует в миелинизации нейронов. Он также присутствует в миелоидных клетках и особенно в микроглии. У мышей с нокаутом MAG (KO) имеют место проблемы с фагоцитозом. LRRC4C представляет молекулу семейства LRR, связанную с ростом нейронов, образованием дендритов и удлинением аксонов. LRRC4C в основном локализуется на постсинаптической стороне возбуждающих синапсов и взаимодействует с пресинаптическим лигандом netrin-G1, для регуляции образования возбуждающего синапса. Было показано, что экспрессия MAG имеет место на высоком уровне в головном мозге или опухолевой ткани головного мозга (фиг. 5), и уровни мРНК LRRC4C также повышены в различных видах злокачественных опухолей, таких как злокачественная опухоль головного мозга, злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль яичника, карцинома почек и саркома Юинга (фиг. 6). Ранее сообщалось, что сиглек-15 взаимодействует с Sialyl-Tn. Для подтверждения этого наблюдения определяли связывание Sylyl-Tn-антигена Neu5Ac α2-6GalNAc со слитым белком сиглеком-15 (сиглек-15-mIg) с использованием биосенсоров с иммобилизованным стрептавидином Octet (ForteBio). Биосенсоры с иммобилизованным стрептавидином Octet были предварительно нагружены NeuAa-2-6 GalNac-биотин (Glycotech, 50 мкг/мл) и определяли ответы на сиглек-15-mIg или контрольный mIg (2-кратные серийные разведения, начиная с 100 мкг/мл) (фиг. 4B). Экспрессия Sialyl-Tn была отмечена во многих злокачественных опухолях человека и мыши. Следовательно, Sialyl-Tn может быть дополнительным партнером по связыванию, который служит в качестве лиганда/рецептора для сиглека-15.
Специфичность взаимодействия между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C была дополнительно исследована анализом проточной цитометрией. Все антитела для окрашивания проточной цитометрии были получены от BD Bioscience (San Jose, CA) или eBioscience (San-Diego, CA). Слитый белок сиглек-15 хорошо связывался с клетками HEK293T, трансфицированными MAG или LRRC4C, но не связывался с контрольными клетками, и включение mAb против сиглека-15 полностью блокировало это взаимодействие. Фактически, взаимодействие между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C является высоко консервативным у мыши и человека. Как показано на фиг.4А, человеческий сиглек-15 может связываться с MAG человека и мыши, и мышиный сиглек-15 также может распознавать как LRRC4 мыши, так и человека, на основании чего можно предположить о наличии перекрестного межвидового взаимодействия.
Пример 5. Идентификация домена связывания сиглека-15 с MAG и LRRC4C
Для определения домена связывания сиглека-15 с MAG или LRRC4C, были получены и очищены мутанты сиглека-15 с делеционными доменами. Сиглек-15 содержит внутриклеточный домен, трансмембранный домен, домен IgC и IgV-домен. Человеческий или мышиный сиглек-15 получали методом ПЦР, аналогичным описанному ранее (Sedy J.R. et al., Nat. Immunol., 2005; 6 (1): 90-8). Точечные мутации сиглека-15 выбирали, основываясь на предыдущих публикациях, и получали с использованием ПЦР (Cheung T.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102 (37): 13218-23; Compaan D.M. et al., J. Biol. Chem., 2005, 280 (47): 39553-61). Как показано на фиг. 7, делеция IgV-домена из сиглека-15 полностью отменяла его взаимодействие с MAG и LRRC4C. Кроме того, точечная мутация в остатке 143 IgV-домена (мутация R143A) была способна элимировать взаимодействие между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C, указывая на то, что IgG-домен сиглека-15 необходим для взаимодействия с MAG или LRRC4C, более конкретно, взаимодействие включает остаток R143 в IgV-домене.
Пример 6. Сиглек-15 непосредственно ингибирует активность Т-клеток
Для определения влияния сиглека-15 на активность Т-клеток человека, человеческие РВМС стимулировали иммобилизованным анти-CD3-антителом (в диапазоне концентраций от 0,03 мкг/мл до 1 мкг/мл), и иммобилизованным слитым белком человеческий сиглек-15-mIgG (S15-mIg) или контрольным мышиным IgG (mIg) (5 мкг/мл) в течение 72 ч. Через 16 ч определяли включение 3H-тимидина в пролиферирующие Т-клетки (фиг. 8A). Клетки, подвергнутые воздействию S15-mIg, имели достоверно более низкие уровни включения 3H-тимидина, указывая на то, что контактирование с сиглеком-15 в качестве лиганда снижает пролиферацию Т-клеток.
Мембрана-ассоциированную экспрессионную конструкцию OKT3 получали путем слияния нуклеиновой кислоты, кодирующей scFv-фрагмент антитела к человеческому CD3 OKT3, с нуклеиновой кислотой, кодирующей CD14. Эту конструкцию трансфицировали в клетки 293T для получения клеток 293T.mOKT3, которые экспрессируют scFv OKT3 на клеточной поверхности. Клетки с репортером люциферазой Jurkat NF-AT совместно культивировали в течение 12 ч с клетками 293T.m.OKT3, экспрессирующими контрольную плазмиду, полноразмерный FASLG (Fas-лиганд), LRRC4C, сиглек-15 или ген, кодирующий эктодомен сиглека-15 с трансмембранным доменом B7-H6 (сиглек-15 ATM). Люциферазную активность определяли через 4 ч после совместного культивирования (фиг. 8В). В этой системе сверхэкспрессия FASLG практически элиминировала сигнал NF-AT по сравнению с контрольной плазмидой. Кроме того, было отмечено, что экспрессия полноразмерного сиглека-15 или сиглека-15 ATM также могла достоверно ингибировать сигналы люциферазы NF-AT.
Результаты вышеуказанных экспериментов показывают, что сиглек-15 человека, действуя в качестве лиганда, может ингибировать активность Т-клеток.
Для подтверждения того, что мышиный сиглек-15 аналогичным образом ингибирует активность мышиных Т-клеток, анализировали включение 3H-тимидина в мышиные спленоциты после воздействия мышиного сиглека-15. Мышиные спленоциты стимулировали иммобилизованным анти-CD3 (в диапазоне концентраций от 0 мкг/мл до 2 мкг/мл) и подвергали воздействию иммобилизованного или растворимого слитого белка мышиный сиглек-15-mIgG (S15-mIg) или контрольного мышиного IgG (mIg) (5 мкг/мл) в течение 72 ч. Через 16 ч определяли включение тимидина в пролиферирующие Т-клетки анализировали. Включение 3H-тимидина в клетки, подвергнутые воздействию иммобилизованной слитой конструкции сиглек-15-mIgG, показано на фиг.9А. Включение 3H-тимидина в клетки, подвергнутые воздействию растворимого сиглек-15-mIgG, показано на фиг.9B. Клетки, подвергнутые воздействию мышиный S15-mIg, имели пониженные уровни включения 3H-тимидина, указывая на то, что контактирование с лигандом сиглек-15 снижает пролиферацию мышиных спленоцитов.
Клетки 293T трансфицировали плазмидами, кодирующими H2-Kb, слитыми с пептидом OVA (SIINFEKL), с получением клеток 293T-Kb-OVA. Затем клетки инфицировали лентивирусным вектором, кодирующим полноразмерный сиглек-15, с получением клеток 293T-Kb-OVA-S15. Было выделено несколько клеточных линий с переменной экспрессией сиглека-15 в результате скрининга FACS. Мышей OT-1, трансгенные для OVA-специфического TCR, распознающего пептид OVA SIINFEKL H-2kb, получали из питомника Jackson Laboratory. Спленоциты от трансгенных мышей OT-1 предварительно активировали пептидом SIINFEKL плюс IL-2 в течение 3 суток. Затем активированные клетки совместно культивировали с клетками 293T-KbOVA, экспрессирующими полноразмерный мышиный сиглек-15 (KbOVA-S15), или трансфицированными контрольными клетками (контроль KbOVA) в течение 3 суток. Через 16 ч определяли включение 3H-тимидина в пролиферирующие Т-клетки (фиг. 9C). Спленоциты, подвергнутые воздействию сиглека-15 в контексте клеток 293T-KbOVA, имели пониженные уровни включения 3H-тимидина, указывая на то, что контактирование с сиглеком-15, находящимся в клетках, снижало пролиферацию мышиных спленоцитов.
Различные уровни экспрессии мышиного сиглека-15 были установлены на трех клеточных линиях 293T-KbOVA, экспрессирующих мышиный сиглек-15, как показано анализом FACS после окрашивания анти-сиглек-15-антителом m03 (фиг. 9D). Спленоциты от трансгенных мышей OT-1 предварительно активировали пептидом SIINFEKL и IL-2, как описано выше. Затем активированные спленоциты совместно культивировали с клеточными линиями 293T-KbOVA, имеющими возрастающие уровни экспрессии сиглека-15, как показано на фиг.9D, в течение 3 суток. Уровни IFN-γ (фиг. 9E) и уровни TNF-α (фиг. 9F) в супернатанте измеряли с помощью анализа Cytometric Bead Array (CBA) (BD Pharmingen). Продукция IFN-γ и TNF-α снижалась с увеличением уровней экспрессии сиглека-15, указывая на то, что сиглек-15 ингибирует функцию Т-клеток дозозависимым образом.
Пример 7. Ассоциированный с клетками сиглек-15 снижает цитотоксичность Т-клеток
Анализ цитотоксичности на основе адгезии использовали для исследования влияния сиглека-15 на цитотоксичность Т-клеток и значения для индукции гибели опухолевых клеток.
Клетки-мишени 293T-KbOVA помещали в планшет 384 E-Plate (ACEA Biosciences) с плотностью 104 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Клетки, прикрепившиеся к планшету, генерировали возрастающие электрические сигналы. Если их оставить ненарушенными, то электрический сигнал со временем будет возрастать, и затем снижаться за счет избыточного роста клеток. Для тестирования эффекта антигенспецифичных Т-клеток в этой системе, клетки-мишени 293T-KbOVA совместно культивировали с предварительно активированными Т-клетками OT-1 в различных соотношениях (в диапазоне соотношений от 0:1 до 2:1). Сигнал адгезии клеток-мишеней, возрастающий с течением времени, показан на фиг. 10А. Наблюдали наличие зависимости «доза-эффект» по отношению к уровню гибели клеток-мишеней 293T-KbOVA под действием Т-клеток ОТ-1. Чем выше было соотношение Т-клетки ОТ-1:клетки-мишени 293T-KbOVA, присутствующие в анализе, тем детектировался меньший сигнал, указывая на то, что было обнаружено меньшее количество живых клеток 293T-KbOVA с увеличением количества Т-клеток OT-1.
В данной системе гибель клеток-мишеней под действием Т-клеток со сверхэкспрессией сиглека-15 (293T-KbOVA-S15) сравнивали с гибелью клеток-мишеней под действием Т-клеток, которые являются сиглек-15-негативными (293T-KbOVA-контроль), в присутствии различных соотношений Т-клеток OT-1 к клеткам-мишеням. Сигнал от клеток 293T-KbOVA, сверхэкспрессирующих сиглек-15, был слабее чем от контрольных клеток в отсутствии Т-клеток (соотношение 0:1). Однако клетки, сверхэкспрессирующие сиглек-15, генерировали более высокий сигнал в присутствии Т-клеток (соотношение 1:1 или 2:1), что указывает на устойчивость к гибели под действием Т-клеток (фиг. 10B). Эти данные показывают, что связанный с клетками сиглек-15 (например, находящийся на опухолевых клетках, экспрессирующих сиглек-15,) может сделать клетки устойчивыми к цитотоксическому действию Т-клеток.
Пример 8. Дефицит сиглека-15 индуцирует повышенные Т-клеточные ответы
Мышам дикого типа (WT) или мышам с нокаутом во всем теле сиглека-15 (KO) вводили внутривенно (в/в) спленоциты, полученные от мышей OT-1/RagKO, в соответствии со схемой, приведенной на фиг. 11A. Вкратце, мыши получали 2×106 спленоцитов на сутки -1 и вторично иммунизировали внутрибрюшинно (в/б) 100 мкг пептида OVA плюс 100 мкг поли(i:c) на сутки 0. Процент клеток OT-1 по отношению к общей популяции CD8 T-клеток определяли в крови на сутки 4 и в селезенке на сутки 5 (фиг. 11B). Процент клеток OT-1 определяли окрашиванием FACS с использованием тетрамера OT-1.
Процент антигенспецифичных CD8 T-клеток в крови и селезенке повышался у мышей с нокаутом сиглека-15 KO по сравнению с мышами WT. На основании этого результата можно предположить, что снятие ингибирующего эффекта сиглека-15 позволяет Т-клеткам более эффективно реагировать на праймирование антигеном.
Т-клетки OT-1 вводили мышам WT или S15KO на сутки -1 с последующей стимуляцией пептидом на сутки 0, как показано на фиг.11А. Мышам выпаивали 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) (0,8 мг/мл) с питьевой водой, начиная с суток 0, и меняли каждые два дня. Пролиферацию клеток OT-1 крови анализировали на сутки 5 окрашиванием анти-EdU и рассчитывали как процент EdU-позитивных клеток OT-1/общему количеству OT-1-позитивных (фиг. 11C). Спленоциты также выделяли и культивировали в течение ночи без стимуляции и окрашивали аннексином V. Апоптоз рассчитывали по соотношению аннексин V-позитивных клеток OT-1/общему количеству OT-1-позитивных клеток (фиг. 11D).
Пример 9. Происходящий из миелоидных клеток сиглек-15 в значительной степени ответственен за функцию сиглека-15 in vivo
Для подтверждения клеточной популяции, ответственной за ответ сиглека-15, была получена мышь с макрофаг-специфическим нокаутом сиглека-15 (LysM-Cre KO), что позволило провести анализ того, какие клетки экспрессируют сиглек-15 и ингибируют Т-клетки. Конвенцинальные мыши с нокаутом сиглека-15, полученные от MMRRC (Mutant Mouse Resource & Research Centers) (штамм B6.Cg-Siglec15tm1.1Cfg/Mmucd, ссылочный номер MMRRC:032723-UCD), подвергали обратному скрещиванию с мышами LysM-Cre (Jax Labs) с получением мышей с нокаутом сиглека-15 LysM-Cre. Этих мышей затем обратно скрещивали с мышами C57/BL6 в 6 поколениях до проведения экспериментов.
Систему трансфекции Т-клеток OT-1, описанную в примере 8, использовали для сравнения экспансии Т-клеток OT-1 у мышей с нокаутом во всем теле сиглека-15 (KO) и мышей с макрофаг-специфическим нокаутом сиглека-15 (LysM-Cre KO). Кровь собирали на разные временные точки и определяли процент клеток OT-1 в общей популяции CD8 T-клеток (фиг. 12A). Экспансия Т-клеток OT-1 достигала пика на сутки 3 у мышей WT, и позднее у двух типов мышей KO. Фаза сжатия, фаза, на которой Т-клетки сжимаются после их первоначального расширения, остается выше на обеих моделях КО, указывая на то, что в отсутствии ингибирования сиглеком-15 Т-клетки сохраняются в более высоких количествах. Мыши с нокаутом во всем теле сиглека-15 (KO) и LysM-Cre KO ведут себя одинаково, на основании чего можно предположить, что макрофаги могут в значительной степени быть ответственными за ингибирующее действие молекулы сиглека-15. Уровень IL-10 в плазме крови мышей с нокаутом всего тела KO и мышей LysM-Cre KO также оценивали во время реакции Т-клеток OT-1 и сравнивали с мышами дикого типа (фиг. 12B). Более низкий уровень IL-10 идентифицировали в плазме мышей с нокаутом во всем теле сиглека-15 KO и LysM-Cre KO по сравнению с мышами дикого типа.
Пример 10. Дефицит сиглека-15 оказывает незначительный эффект на эндогенные пулы иммунных клеток
Для определения того, влияет ли дефицит сиглека-15 у нокаутных мышей на состав эндогенных пулов иммунных клеток, определяли процент миелоидных, CD8 или CD4 популяций в крови мышей дикого типа (WT) и мышей с нокаутом сиглека-15 (S15KO) в возрасте 11 месяцев (фиг. 13).
Полученные данные показывают, что, несмотря на то, что антигенспецифичные Т-клеточные ответы достоверно повышались у мышей с нокаутом сиглека-15 KO, у этих мышей в норме отсутствуют явные наследственные иммунные фенотипы (либо миелоидных иммунных клеток, либо Т-клеток). Установление этого факта указывает на то, что сиглек-15 может функционировать в индуцированном паттерне экспрессии и/или функциональности.
Пример 11. Сиглек-15, находящийся в клетках, ингибирует ответы макрофагов
Мышиные перитонеальные макрофаги совместно культивировали с 293T клетками, сверхэкспрессирующими контрольную плазмиду (контроль), полноразмерный LRRC4C или сиглек-15 в присутствии различных концентраций LPS в течение 24 ч. Уровни цитокинов в супернатанте измеряли с помощью анализа Cytometric Bead Array (CBA) (BD Pharmingen). Продукция макрофагами IL-6, TNF-α и TGF-β1 снижалась, когда клетки совместно культивировали с клетками, экспрессирующими сиглек-15 (фиг. 14). Эти данные показывают, что сиглек-15, находящийся в клетках, непосредственно ингибирует ответы миелоидных клеток. Следовательно, в качестве лиганда сиглек-15 может функционировать как через миелоидные клетки, так и Т-клетки, для обеспечения ингибирующих активностей в иммунной системе.
Пример 12. Эффект блокирования взаимодействия сиглека-15 и MAG или LRRC4C у мышей ЕАЕ
Для определения роли взаимодействия сиглека-15 и MAG или LRRC4C в регуляции воспалительных заболеваний головного мозга, использовали мышиную модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). EAE представляет воспалительную модель энцефалита и демиелинизации, которая поражает спинной мозг и головной мозг, вызывая паралич. Модель EAE широко используется в качестве модели рассеянного склероза (MS), воспалительного демиелинизирующего заболевания человека. Степень паралича можно количественно оценить с помощью баллов клинической оценки EAE. Вкратце, самок мышей C57BL/6 (в возрасте 6-10 недель) получали из Национального института рака, NIH (Frederick, MD). Мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель иммунизировали подкожно на сутки 0 введением 100 мкг пептида MOG (35-55), эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (CFA) (Difco), для индукции развития EAE. 400 нг коклюшного токсина (Sigma) в 200 мкл PBS вводили дважды на сутки 0 и 2. Каждой мыши вводили внутрибрюшинно 200 мкг mAb к сиглеку-15 (S15m02, S15m03) или контрольное антитело, или слитый белок, как указано, на сутки 7 и сутки 10. Мышиные mAb к мышиному сиглеку-15 получали иммунизацией мыши NZB/W F1 слитым белком мышиный сиглек-15-Ig. Все слитые белки получали слиянием внеклеточного домена каждой молекулы с мышиной или человеческой Fc-меткой (Dong H. et al., Nat. Med., 1999; 5 (12): 1365-9).
Тяжесть заболевания оценивали в баллах по следующей шкале: 0, отсутствие заболевания; 1, паралич хвоста; 2, парапарез; 3, параплегия; 4, параплегия со слабостью передних конечностей или паралич; 5, наличие павших или мертвых животных, как описано ранее (Stromnes I.M. et al., Nature protocols, 2006; 1 (4): 1810-9). На фиг. 15 показано, что антитело к сиглеку-15 клона S15m02 функционировало в качестве блокирующего антитела, которое предупреждало связывание сиглека-15 с MAG или LRRC4C. В результате у мышей, получавших антитело S15m02, развивались более тяжелые симптомы заболевания, чем у их аналогов, которым вводили контрольное mAb или которые получали антитело S15m03 (фиг. 16), на основании чего можно предположить, что взаимодействие между сиглеком-15 и MAG или LRRC4C имеет решающее значение для регуляции воспалительных ответов в головном мозге. Результаты были дополнительно подтверждены обработкой мышей с EAE слитой конструкцией сиглек-15-Fc и сиглек-15-mIg. Течение EAE обострялось после того, как мыши получали слитый белок сиглек-15-Fc (фиг. 17).
Пример 13. Роль сиглека-15 в подавлении воспалительных ответов в головном мозге
Для подтверждения того, что сиглек-15 играет роль, регулирующую воспаление головного мозга, мышиную модель с нокаутом сиглека-15 (KO) получали из MMRRC (UC Davis) (Tao et al., J. Immunol., 2008; 180 (10): 6649-55). Мышей дикого типа (WT) и мышей с нокаутом сиглека-15 иммунизировали пептидом MOG (33-35) для индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), с последующим определением клинических баллов оценки течения EAE. Как показано на фиг. 18, у мышей с ноакутом сиглека-15 KO имели место более выраженные симптомы течения EAE, чем у мышей WT, что указывает на ингибирующую роль сиглека-15 в регуляции воспалительных ответов в головном мозге.
Пример 14. Дефицит сиглека-15 усиливает аутоиммунитет
Мышей дикого типа (WT) и мышей с ноаутом сиглека-15 (сиглек-15 KO) иммунизировали пептидом MOG для индукции EAE. Всех мышей дополнительно иммунизировали коклюшным токсином на сутки 0 и на сутки 1. Определяли баллы клинической оценки мышей WT и мышей с нокаутом сиглека-15 KO, подтверждающие, что у мышей с нокаутом сиглека-15 KO имели место более тяжелые симптомы EAE, чем у мышей WT.
Отдельную когорту мышей дикого типа (WT) иммунизировали пептидом MOG и дополнительно иммунизировали коклюшным токсином на сутки 0 и сутки 1 с последующей обработкой слитым белком сиглек-15-mIg (сиглек-15-mIg) или контрольным mIg, или слитым белком сиглек-15-hIg (сиглек-15-hIg) или контрольным hIg (100 мкг) два раза в неделю, начиная с суток 6, в общей сложности животные получали 4 дозы. Баллы клинической оценки EAE проводили с течением времени (фиг. 19A). На сутки 12 спленоциты от контрольных мышей, обработанных mIg, повторно стимулировали пептидом MOG (60 мкг/мл) в течение 3 суток в присутствии 5 мкг/мл растворимого белка сиглек-15-mIg (S15-mIg) или контрольного mIg (mIg). Ингибирование включения 3H-тимидина в обеих группах измеряли после дальнейшей инкубации в течение 16 ч (фиг. 19B). Эти данные показывают, что растворимый сиглек-15-mIg может функционировать в качестве антагониста in vivo и стимулировать антигенспецифические Т-клеточные ответы. Это механистическое исследование способствует дальнейшему пониманию функциональной роли слитого белка сиглека-15 на модели воспаления мозга (EAE).
Пример 15. Роль сиглека-15 в подавлении иммунных ответов в злокачественной опухоли головного мозга
Для тестирования влияния сиглека-15 на регуляцию иммунных реакций при раке, была использована модель опухоли головного мозга. Мышам C57BL/6 прививали интракраниально опухолевые клетки GL261, содержащие репортер люциферазу, который использовали для количественного определения размера опухоли. На сутки 4 после прививки опухолевых клеток мыши мышей облучали в низкой дозе и затем обрабатывали слитым белком сиглек-15-Fc или контрольным Ig на сутки 5 и сутки 10. Размер опухоли в обеих группах тщательно контролировали. Как показано на фиг. 20 и 21, блокада сиглека-15 обработкой слитым белком сиглек-15-Fc достоверно уменьшала размер опухоли (фиг. 20) и повышала выживаемость мышей (фиг. 21). У мышей, обработанных слитым белком сиглек-15-Fc, также проявлялся синергический эффект с обработкой анти-PD-L1-антителом, что заметно повышало эффективность анти-PD-L1 в снижении размера опухоли и повышении выживаемости (фиг. 22). Эти результаты показывают, что блокирование или иное ингибирование активности сиглека-15 может усилить иммунные реакции на злокачественную опухоль.
Пример 16. Высокая инфильтрация опухоль-ассоциированных CD8 Т-клеток у мышей, несущих опухоли
Как показано выше, сиглек-15 экспрессируется в головном мозге. Определяли количество и активность Т-клеток на модели опухоли головного мозга, мышах дикого типа (WT) и мышах с нокаутом сиглека-15 (Siglec15 KO). Мышам WT или мышам с нокаутом сиглека-15 KO прививали глиобластому GL261 интракраниально на сутки 0. Опухолевую нагрузку в мозге контролировали на различные временные точки измерением люциферазной активности (фиг. 23А). Люциферазную активность в головном мозге мышей WT и KO визуализировали на сутки 13 и 18 после инокуляции клеток GL261 (фиг. 23B). Кривая выживаемости мышей WT и KO, инокулированных GL261, демонстрирует, что время выживания мышей с нокаутом сиглека-15 KO выше, чем у мышей WT (фиг. 23C). На сутки 14 некоторые мыши из обеих групп были подвергнуты эвтаназии. Определяли количество и процентное содержание популяций CD8 Т-клеток (фиг. 24A), CD4 T-клеток (фиг. 24B) или миелоидных клеток (фиг. 24C) в головном мозге или селезенке. Кроме того, лимфоциты головного мозга у мышей WT или KO, несущих опухоль, повторно стимулировали опухолевыми клетками GL-261 в течение ночи, и определяли процентное и общее количество IFN-γ-позитивных CD8 или CD4 Т-клеток (фиг. 24D).
Определяли высокую инфильтрацию функциональных CD8 Т-клеток в месте опухоли у мышей с нокаутом сиглека-15 KO, но не в месте опухолей у мышей WT. Данный эффект связан с опухолью, поскольку различие в селезенке между мышами отсутствовало. Кроме того, наблюдали достоверную разницу в популяциях дендритных клеток/макрофагов головного мозга. Эти данные показывают, что сиглек-15 может оказывать влияние на ответы иммунных клеток в месте опухоли. В частности, экспрессия сиглека-15 в микроокружении опухоли/головного мозга может ингибировать Т-клетки и/или миелоидные клетки и «отключать» иммунный ответ против опухоли.
Пример 17. Рост опухолевых клеток, экспрессирующих сиглек-15
Клетки аденокарциномы ободочной кишки MC38 инфицировали лентивирусной экспрессионной конструкцией, кодирующей сиглек-15 (S15+) или контрольной конструкцией (S15-). Популяции клеток MC38-S15- и MC38-S15+ подвергали сортингу с использованием FACS после инфицирования лентивирусом. Экспрессия сиглека-15 на клетках MC38-S15- и MC38-S15+ подтверждалась окрашиванием моноклональным антителом FACS (фиг. 25A). Мышам B6 подкожно инокулировали клетки MC38-S15- и MC38-S15+ (0,4 М клеток/мышь) и контролировали рост опухоли (фиг. 25B). Опухоли, полученные из клеток MC38, экспрессирующих сиглек-15, были крупнее, чем опухоли, полученные из клеток MC38, без экспрессии сиглека-15.
Пример 18. Антагонисты сиглека-15 ингибируют рост опухолевых клеток, экспрессирующих сиглек-15
Стабильную клеточную линию MC38-S15+ подкожно инокулировали мышам B6 (0,4 М клеток/мышь). Мышей обрабатывали контрольным антителом, антителом против сиглека-15 m01 или S15-mIg (в/б 200 мкг/мышь) на сутки 6, и затем каждые четыре дня, в общей сложности животные получали четыре дозы. Средний размер опухоли в каждой группе показан на фиг. 26. Размер опухоли был достоверно ниже у мышей, обработанных антагонистами сиглека-15 m01 или S15-mIg.
Эквиваленты
Специалистам в данной области будет понятно, или они смогут установить с использованием не более чем обычного экспериментирования многие эквиваленты специфических вариантов осуществления изобретения, описанного здесь. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> YALE UNIVERSITY
CHEN, Lieping
WANG, Jun
SUN, Jingwei
<120> Композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака
<130> 117886-01120
<150> US 62/253,437
<151> 2015-11-10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1523
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> мРНК сиаловая кислота-связывающего Ig-подобного лектина 15 (сиглека-15), Homo sapiens
<400> 1
tccggctccc gcagagccca cagggacctg cagatctgag tgccctgccc acccccgccc 60
gccttccttc ccccaccacg cctgggaggg ccctcactgg ggaggtggcc gagagcgggt 120
ctggcctggg gtgttcagat gctcacagca tggaaaagtc catctggctg ctggcctgct 180
tggcgtgggt tctcccgaca ggctcatttg tgagaactaa aatagatact acggagaact 240
tgctcaacac agaggtgcac agctcgccag cgcagcgctg gtccatgcag gtgccacccg 300
aggtgagcgc ggaggcaggc gacgcggcag tgctgccctg caccttcacg cacccgcacc 360
gccactacga cgggccgctg acggccatct ggcgcgcggg cgagccctat gcgggcccgc 420
aggtgttccg ctgcgctgcg gcgcggggca gcgagctctg ccagacggcg ctgagcctgc 480
acggccgctt ccggctgctg ggcaacccgc gccgcaacga cctctcgctg cgcgtcgagc 540
gcctcgccct ggctgacgac cgccgctact tctgccgcgt cgagttcgcc ggcgacgtcc 600
atgaccgcta cgagagccgc cacggcgtcc ggctgcacgt gacagccgcg ccgcggatcg 660
tcaacatctc ggtgctgccc agtccggctc acgccttccg cgcgctctgc actgccgaag 720
gggagccgcc gcccgccctc gcctggtccg gcccggccct gggcaacagc ttggcagccg 780
tgcggagccc gcgtgagggt cacggccacc tagtgaccgc cgaactgccc gcactgaccc 840
atgacggccg ctacacgtgt acggccgcca acagcctggg ccgctccgag gccagcgtct 900
acctgttccg cttccatggc gccagcgggg cctcgacggt cgccctcctg ctcggcgctc 960
tcggcttcaa ggcgctgctg ctgctcgggg tcctggccgc ccgcgctgcc cgccgccgcc 1020
cagagcatct ggacaccccg gacaccccac cacggtccca ggcccaggag tccaattatg 1080
aaaatttgag ccagatgaac ccccggagcc caccagccac catgtgctca ccgtgaggag 1140
tccctcagcc accaacatcc atttcagcac tgtaaagaac aaaggccagt gcgaggcttg 1200
gctggcacag ccagtcctgg ttctcgggca ccttggcagc ccccagctgg gtggctcctc 1260
ccctgctcaa ggtcaagacc ctgctcaagg aggctcatct ggcctcctat gtggacaacc 1320
atttcggagc tccctgatat ttttgccagc atttcgtaaa tgtgcatacg tctgtgtgtg 1380
tgtgtgtgtg tgagagagag agagagagag tacacgcatt agcttgagcg tgaaacttcc 1440
agaaatgttc ccttgccctt tcttacctag aacacctgct atagtaaagc agacaggaaa 1500
ctgttaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1523
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Предшественник сиаловая кислота-связывающего Ig-подобного лектина 15
<400> 2
Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro
1 5 10 15
Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu
20 25 30
Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val
35 40 45
Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys
50 55 60
Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile
65 70 75 80
Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly
100 105 110
Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg
115 120 125
Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val
130 135 140
Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val
145 150 155 160
Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu
165 170 175
Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu
180 185 190
Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu
195 200 205
Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala
210 215 220
Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala
225 230 235 240
Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His
245 250 255
Gly Ala Ser Gly Ala Ser Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly
260 265 270
Phe Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg
275 280 285
Arg Arg Pro Glu His Leu Asp Thr Pro Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln
290 295 300
Ala Gln Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Asn Pro Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Thr Met Cys Ser Pro
325
<210> 3
<211> 2458
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> мРНК миелин-ассоциированного гликопротеина (MAG), вариант транскрипта 1, Homo sapiens
<400> 3
aggcggcccc tggcacccag ggggagggga ggggctggca agtgggggcc tagaccctgg 60
aaggcagggg actgcgagct gggctggcgg agcagaggtg cagaagcaac tgagtccaag 120
ttgtctggcg gcttcaggtg gacccagaag acgtccccaa ctcagggaga ttcagcgatc 180
actcactcgc tgtacagaat gatattcctc acggcactgc ctctgttctg gattatgatt 240
tcagcctccc gagggggtca ctggggtgcc tggatgccct cgtccatctc ggccttcgaa 300
ggcacgtgcg tctccatccc ctgccgcttt gacttcccgg atgagctgcg gcccgctgtg 360
gtgcatggtg tctggtactt caatagcccc taccccaaga actacccccc ggtggtcttc 420
aagtcgcgca cccaagtagt ccacgagagc ttccagggcc gcagccgcct cctgggggac 480
ctgggcctgc gaaactgcac cctcctgctc agcaacgtca gccccgagct gggcgggaag 40
tactacttcc gtggggacct gggcggctac aaccagtaca ccttctcaga gcacagcgtc 600
ctggatatcg tcaacacccc caacatcgtg gtgcccccag aggtggtggc aggcacggag 660
gtggaggtca gctgcatggt gccggacaac tgcccagagc tgcgccctga gctgagctgg 720
ctgggccacg aggggctggg ggagcccgct gtgctgggcc ggctgcggga ggacgagggc 780
acctgggtgc aggtgtcact gctgcacttc gtgcccacga gggaggccaa cggccacagg 840
ctgggctgcc aggcctcctt ccccaacacc accctgcagt tcgagggcta cgccagcatg 900
gacgtcaagt accccccggt gattgtggag atgaactcct cggtggaggc catcgagggc 960
tcccacgtga gcctgctctg tggggctgac agcaaccccc cgccgctgct gacctggatg 1020
cgggacggga cagtcctccg ggaggcggtg gccgagagcc tgctcctgga gctggaggag 1080
gtgacccccg ccgaagacgg cgtctatgcc tgcctggccg agaatgccta tggccaggac 1140
aaccgcaccg tggggctcag tgtcatgtat gcaccctgga agccaacagt gaacgggaca 1200
atggtggccg tagaggggga gacggtctct atcttgtgct ccacacagag caacccggac 1260
cctattctca ccatcttcaa ggagaagcag atcctgtcca cggtcatcta cgagagcgag 1320
ctgcagctgg agctgccggc cgtgtcaccc gaggatgatg gagagtactg gtgtgtggct 1380
gagaaccagt atggccagag ggccaccgcc ttcaacctgt ctgtggagtt cgcccctgtg 1440
ctcctcctgg agtcccactg cgcggcagcc cgagacacgg tgcagtgcct gtgcgtggtg 1500
aagtccaacc cggagccgtc cgtggccttt gagctgccat cgcgcaatgt gaccgtgaac 1560
gagagcgagc gggagttcgt gtactcggag cgcagcggcc tcgtgctcac cagcatcctc 1620
acgctgcggg ggcaggccca ggccccgccc cgcgtcatct gcaccgcgag gaacctctat 1680
ggcgccaaga gcctggagct gcccttccag ggagcccatc gactgatgtg ggccaagatc 1740
gggcctgtgg gcgccgtggt cgcctttgcc atcctgattg ccatcgtctg ctacattacc 1800
cagacacgca ggaaaaagaa cgtgacagag agccccagct tctcggcagg ggacaaccct 1860
cccgtcctgt tcagcagcga cttccgcatc tctggggcac cagagaagta cgagagcgag 1920
aggcgcctgg gatctgagag gaggctgctg ggccttcggg gtgagccccc agagctggac 1980
ctgagctatt ctcactcgga cctggggaaa cggcccacca aggacagcta cacgctgacg 2040
gaggagctag ctgagtatgc tgaaatccgg gtcaagtgaa ggagctgggg gcagcctgcg 2100
tggctgaccc ccctcaggac cctcgctggc ccccactggc tgtgggctcc cttcctccca 2160
aaagtatcgg gggctggggc aggaggggag tgaggcaggt gacagtgagg tcctgggggc 2220
ctgacctccc cctccttccc agctgcccct ccctgccagc acccccacgc cctcattacg 2280
gctcctctct aacctccttt accctcatct gtctggaggg gagctctgtc tgtccgtgtt 2340
atttattgct acttcctgcc tggtctcctg cccccacacc tggccctggg gcctgtacaa 2400
aagggacatg aaataaatgc cccaaagcca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2458
<210> 4
<211> 626
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Предшественник изоформы миелин-ассоциированного гликопротеина
<400> 4
Met Ile Phe Leu Thr Ala Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp
35 40 45
Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro
50 55 60
Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val
65 70 75 80
Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly
85 90 95
Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Asn Val Ser Pro Glu Leu Gly
100 105 110
Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr
115 120 125
Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Val Asn Thr Pro Asn Ile Val
130 135 140
Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met
145 150 155 160
Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly
165 170 175
His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Ala Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp
180 185 190
Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg
195 200 205
Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ser Phe Pro Asn Thr
210 215 220
Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Met Asp Val Lys Tyr Pro Pro
225 230 235 240
Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His
245 250 255
Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr
260 265 270
Trp Met Arg Asp Gly Thr Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu
275 280 285
Leu Leu Glu Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Val Tyr Ala
290 295 300
Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Gly Leu
305 310 315 320
Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Met Val
325 330 335
Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn
340 345 350
Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ser Thr
355 360 365
Val Ile Tyr Glu Ser Glu Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Ser Pro
370 375 380
Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln
385 390 395 400
Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Val Leu Leu
405 410 415
Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys
420 425 430
Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser
435 440 445
Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Ser Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu
450 455 460
Arg Ser Gly Leu Val Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala
465 470 475 480
Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ala Arg Asn Leu Tyr Gly Ala
485 490 495
Lys Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg Leu Met Trp Ala
500 505 510
Lys Ile Gly Pro Val Gly Ala Val Val Ala Phe Ala Ile Leu Ile Ala
515 520 525
Ile Val Cys Tyr Ile Thr Gln Thr Arg Arg Lys Lys Asn Val Thr Glu
530 535 540
Ser Pro Ser Phe Ser Ala Gly Asp Asn Pro Pro Val Leu Phe Ser Ser
545 550 555 560
Asp Phe Arg Ile Ser Gly Ala Pro Glu Lys Tyr Glu Ser Glu Arg Arg
565 570 575
Leu Gly Ser Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu Arg Gly Glu Pro Pro Glu
580 585 590
Leu Asp Leu Ser Tyr Ser His Ser Asp Leu Gly Lys Arg Pro Thr Lys
595 600 605
Asp Ser Tyr Thr Leu Thr Glu Glu Leu Ala Glu Tyr Ala Glu Ile Arg
610 615 620
Val Lys
625
<210> 5
<211> 2626
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> мРНК лейцин-богатого повтора 4C (LRRC4C),
вариант транскрипта 1,Homo sapiens
<400> 5
agtttttggc ttactttttg gcggagtctc ttggacacgt ttttgctggt gctggaagat 60
cagatacatg gaacctttga aaactgatta tttttctccg atatgactta aaaaaaaata 120
aaaagaagaa aagaaaatag agtagtgcac ggcaagctag aggattgtaa attttccttg 180
gtgaactttg aggatccata aagaaggagt tactggaaaa gcaagaataa cttatgcgga 240
ttaacaatat ggaaacatcc tgagactact ttggaatcgc cataaattaa gtgggttcca 300
gttttgcaaa cagagaaacg ggtccatgaa caatttgcta caggtataaa gaagtatctg 360
cagaaatcca gagcacttat taaacttctt tgagttttct caggaagatc aatacctgtt 420
ggagaaattt tactaagatt ggcaaacgca ctgcctactt acagcataga gacccccagt 480
ggagagctag actgtttgaa ttccagaagg accaacacca gataaattat gaatgttgaa 540
caagatgacc ttacatccac agcagataat gataggtcct aggtttaaca gggccctatt 600
tgaccccctg cttgtggtgc tgctggctct tcaacttctt gtggtggctg gtctggtgcg 660
ggctcagacc tgcccttctg tgtgctcctg cagcaaccag ttcagcaagg tgatttgtgt 720
tcggaaaaac ctgcgtgagg ttccggatgg catctccacc aacacacggc tgctgaacct 780
ccatgagaac caaatccaga tcatcaaagt gaacagcttc aagcacttga gacacttgga 840
aatcctacag ttgagtagga accatatcag aaccattgaa attggggctt tcaatggtct 900
ggcgaacctc aacactctgg aactctttga caatcgtctt actaccatcc cgaatggagc 960
ttttgtatac ttgtctaaac tgaaggagct ctggttgcga aacaacccca ttgaaagcat 1020
cccttcttat gcttttaaca gaattccttc tttgcgccga ctagacttag gggaattgaa 1080
aagactttca tacatctcag aaggtgcctt tgaaggtctg tccaacttga ggtatttgaa 1140
ccttgccatg tgcaaccttc gggaaatccc taacctcaca ccgctcataa aactagatga 1200
gctggatctt tctgggaatc atttatctgc catcaggcct ggctctttcc agggtttgat 1260
gcaccttcaa aaactgtgga tgatacagtc ccagattcaa gtgattgaac ggaatgcctt 1320
tgacaacctt cagtcactag tggagatcaa cctggcacac aataatctaa cattactgcc 1380
tcatgacctc ttcactccct tgcatcatct agagcggata catttacatc acaacccttg 1440
gaactgtaac tgtgacatac tgtggctcag ctggtggata aaagacatgg ccccctcgaa 1500
cacagcttgt tgtgcccggt gtaacactcc tcccaatcta aaggggaggt acattggaga 1560
gctcgaccag aattacttca catgctatgc tccggtgatt gtggagcccc ctgcagacct 1620
caatgtcact gaaggcatgg cagctgagct gaaatgtcgg gcctccacat ccctgacatc 1680
tgtatcttgg attactccaa atggaacagt catgacacat ggggcgtaca aagtgcggat 1740
agctgtgctc agtgatggta cgttaaattt cacaaatgta actgtgcaag atacaggcat 1800
gtacacatgt atggtgagta attccgttgg gaatactact gcttcagcca ccctgaatgt 1860
tactgcagca accactactc ctttctctta cttttcaacc gtcacagtag agactatgga 1920
accgtctcag gatgaggcac ggaccacaga taacaatgtg ggtcccactc cagtggtcga 1980
ctgggagacc accaatgtga ccacctctct cacaccacag agcacaaggt cgacagagaa 2040
aaccttcacc atcccagtga ctgatataaa cagtgggatc ccaggaattg atgaggtcat 2100
gaagactacc aaaatcatca ttgggtgttt tgtggccatc acactcatgg ctgcagtgat 2160
gctggtcatt ttctacaaga tgaggaagca gcaccatcgg caaaaccatc acgccccaac 2220
aaggactgtt gaaattatta atgtggatga tgagattacg ggagacacac ccatggaaag 2280
ccacctgccc atgcctgcta tcgagcatga gcacctaaat cactataact catacaaatc 2340
tcccttcaac cacacaacaa cagttaacac aataaattca atacacagtt cagtgcatga 2400
accgttattg atccgaatga actctaaaga caatgtacaa gagactcaaa tctaaaacat 2460
ttacagagtt acaaaaaaca aacaatcaaa aaaaaagaca gtttattaaa aatgacacaa 2520
atgactgggc taaatctact gtttcaaaaa agtgtcttta caaaaaaaca aaaaagaaaa 2580
gaaatttatt tattaaaaat tctattgtga tctaaagcag acaaaa 2626
<210> 6
<211> 640
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Предшественник белка лейцин-богатого повтора 4C
<400> 6
Met Leu Asn Lys Met Thr Leu His Pro Gln Gln Ile Met Ile Gly Pro
1 5 10 15
Arg Phe Asn Arg Ala Leu Phe Asp Pro Leu Leu Val Val Leu Leu Ala
20 25 30
Leu Gln Leu Leu Val Val Ala Gly Leu Val Arg Ala Gln Thr Cys Pro
35 40 45
Ser Val Cys Ser Cys Ser Asn Gln Phe Ser Lys Val Ile Cys Val Arg
50 55 60
Lys Asn Leu Arg Glu Val Pro Asp Gly Ile Ser Thr Asn Thr Arg Leu
65 70 75 80
Leu Asn Leu His Glu Asn Gln Ile Gln Ile Ile Lys Val Asn Ser Phe
85 90 95
Lys His Leu Arg His Leu Glu Ile Leu Gln Leu Ser Arg Asn His Ile
100 105 110
Arg Thr Ile Glu Ile Gly Ala Phe Asn Gly Leu Ala Asn Leu Asn Thr
115 120 125
Leu Glu Leu Phe Asp Asn Arg Leu Thr Thr Ile Pro Asn Gly Ala Phe
130 135 140
Val Tyr Leu Ser Lys Leu Lys Glu Leu Trp Leu Arg Asn Asn Pro Ile
145 150 155 160
Glu Ser Ile Pro Ser Tyr Ala Phe Asn Arg Ile Pro Ser Leu Arg Arg
165 170 175
Leu Asp Leu Gly Glu Leu Lys Arg Leu Ser Tyr Ile Ser Glu Gly Ala
180 185 190
Phe Glu Gly Leu Ser Asn Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ala Met Cys Asn
195 200 205
Leu Arg Glu Ile Pro Asn Leu Thr Pro Leu Ile Lys Leu Asp Glu Leu
210 215 220
Asp Leu Ser Gly Asn His Leu Ser Ala Ile Arg Pro Gly Ser Phe Gln
225 230 235 240
Gly Leu Met His Leu Gln Lys Leu Trp Met Ile Gln Ser Gln Ile Gln
245 250 255
Val Ile Glu Arg Asn Ala Phe Asp Asn Leu Gln Ser Leu Val Glu Ile
260 265 270
Asn Leu Ala His Asn Asn Leu Thr Leu Leu Pro His Asp Leu Phe Thr
275 280 285
Pro Leu His His Leu Glu Arg Ile His Leu His His Asn Pro Trp Asn
290 295 300
Cys Asn Cys Asp Ile Leu Trp Leu Ser Trp Trp Ile Lys Asp Met Ala
305 310 315 320
Pro Ser Asn Thr Ala Cys Cys Ala Arg Cys Asn Thr Pro Pro Asn Leu
325 330 335
Lys Gly Arg Tyr Ile Gly Glu Leu Asp Gln Asn Tyr Phe Thr Cys Tyr
340 345 350
Ala Pro Val Ile Val Glu Pro Pro Ala Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly
355 360 365
Met Ala Ala Glu Leu Lys Cys Arg Ala Ser Thr Ser Leu Thr Ser Val
370 375 380
Ser Trp Ile Thr Pro Asn Gly Thr Val Met Thr His Gly Ala Tyr Lys
385 390 395 400
Val Arg Ile Ala Val Leu Ser Asp Gly Thr Leu Asn Phe Thr Asn Val
405 410 415
Thr Val Gln Asp Thr Gly Met Tyr Thr Cys Met Val Ser Asn Ser Val
420 425 430
Gly Asn Thr Thr Ala Ser Ala Thr Leu Asn Val Thr Ala Ala Thr Thr
435 440 445
Thr Pro Phe Ser Tyr Phe Ser Thr Val Thr Val Glu Thr Met Glu Pro
450 455 460
Ser Gln Asp Glu Ala Arg Thr Thr Asp Asn Asn Val Gly Pro Thr Pro
465 470 475 480
Val Val Asp Trp Glu Thr Thr Asn Val Thr Thr Ser Leu Thr Pro Gln
485 490 495
Ser Thr Arg Ser Thr Glu Lys Thr Phe Thr Ile Pro Val Thr Asp Ile
500 505 510
Asn Ser Gly Ile Pro Gly Ile Asp Glu Val Met Lys Thr Thr Lys Ile
515 520 525
Ile Ile Gly Cys Phe Val Ala Ile Thr Leu Met Ala Ala Val Met Leu
530 535 540
Val Ile Phe Tyr Lys Met Arg Lys Gln His His Arg Gln Asn His His
545 550 555 560
Ala Pro Thr Arg Thr Val Glu Ile Ile Asn Val Asp Asp Glu Ile Thr
565 570 575
Gly Asp Thr Pro Met Glu Ser His Leu Pro Met Pro Ala Ile Glu His
580 585 590
Glu His Leu Asn His Tyr Asn Ser Tyr Lys Ser Pro Phe Asn His Thr
595 600 605
Thr Thr Val Asn Thr Ile Asn Ser Ile His Ser Ser Val His Glu Pro
610 615 620
Leu Leu Ile Arg Met Asn Ser Lys Asp Asn Val Gln Glu Thr Gln Ile
625 630 635 640
<---
1. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, где модулятор содержит антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или рекомбинантный слитый белок сиглека-15, где модулятор также снижает уровни экспрессии и/или активности MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn, тем самым осуществляя лечение рака у субъекта.
2. Способ по п.1, где слитый белок сиглека-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
3. Способ по п.1, где модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом.
4. Способ по п.3, где связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG, LRRC4C и Sialyl-Tn.
5. Способ по п.1, где рак выбран из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака почки, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга.
6. Способ по п.5, где рак головного мозга представляет глиобластому.
7. Способ по п.1, где субъект является человеком.
8. Способ уменьшения размера опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, где модулятор содержит антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или рекомбинантный слитый белок сиглека-15, тем самым уменьшая размер опухоли у субъекта.
9. Способ по п.8, где слитый белок сиглека-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
10. Способ по п.8, где модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом.
11. Способ по п.10, где связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG, LRRC4C и Sialyl-Tn.
12. Способ по п.8, где модулятор также снижает экспрессию и/или активность MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
13. Способ по п.8, где опухоль ассоциирована с раком, выбранным из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака почки, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга.
14. Способ по п.13, где рак головного мозга представляет глиобластому.
15. Способ по п.8, где субъект является человеком.
16. Способ повышения выживаемости субъекта, имеющего рак, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15 у субъекта, где модулятор содержит антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или рекомбинантный слитый белок сиглека-15, тем самым повышая выживаемость субъекта.
17. Способ по п.16, где слитый белок сиглека-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
18. Способ по п.16, где модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом.
19. Способ по п.18, где связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG, LRRC4C и Sialyl-Tn.
20. Способ по п.16, где модулятор также снижает экспрессию и/или активность MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
21. Способ по п.16, где рак выбран из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака почки, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга.
22. Способ по п.21, где рак головного мозга представляет глиобластому.
23. Способ по п.16, где субъект является человеком.
24. Способ усиления иммунного ответа против опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора сиглека-15, где модулятор снижает экспрессию и/или активность сиглека-15, где модулятор содержит антагонистическое антитело к сиглеку-15 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или рекомбинантный слитый белок сиглека-15, тем самым усиливая иммунный ответ против опухоли у субъекта.
25. Способ по п.24, где слитый белок сиглека-15 представляет слитый белок сиглек-15-Fc.
26. Способ по п.24, где модулятор блокирует взаимодействие между сиглеком-15 и связывающим лигандом.
27. Способ по п.26, где связывающий лиганд выбран из группы, состоящей из MAG, LRRC4C и Sialyl-Tn.
28. Способ по п.24, где модулятор также снижает экспрессию и/или активность MAG, LRRC4C или Sialyl-Tn.
29. Способ по п.24, опухоль ассоциирована с раком, выбранным из группы, состоящей из рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака почки, аденокарциномы прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы и саркомы Юинга.
30. Способ по п.29, где рак головного мозга представляет глиобластому.
31. Способ по п.24, где субъект является человеком.
32. Способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым осуществляя лечение аутоиммунного заболевания у субъекта.
33. Способ по п.32, где белок сиглек-15 выбран из группы, состоящей из полноразмерного белка сиглека-15, функционального фрагмента сиглека-15 или IgV-домена сиглека-15.
34. Способ по п.32, где аутоиммунное заболевание является воспалительным заболеванием головного мозга.
35. Способ по п.34, где воспалительное заболевание головного мозга является рассеянным склерозом.
36. Способ по п.32, где субъект является человеком.
37. Способ ослабления воспалительного ответа в головном мозге у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества белка сиглека-15 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок сиглек-15, тем самым ослабляя воспалительный ответ в головном мозге у субъекта.
38. Способ по п.37, в котором белок сиглек-15 выбран из группы, состоящей из полноразмерного белка сиглека-15, функционального фрагмента сиглека-15 или IgV-домена сиглека-15.
39. Способ по п.37, где воспалительный ответ в головном мозге ассоциирован с рассеянным склерозом.
40. Способ по п.37, где субъект является человеком.
41. Способ по п.1, где указанный субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
42. Способ по п.8, где указанный субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
43. Способ по п.16, где указанный субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
44. Способ по п.24, где указанный субъект не страдает текущим аутоиммунным заболеванием.
