Генная терапия для лечения гемофилии a

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны рекомбинатный аденоассоциированный вирус (rAAV) для доставки гена человеческого фактора VIII пациенту, содержащий капсид AAV и упакованный в него векторный геном, при этом указанный векторный геном содержит: (a) AAV с 5' инвертированным концевым повтором (ITR); (b) специфический для печени промотор; (c) кодирующую последовательность, кодирующую человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции; и (d) 3' ITR AAV, причем указанная кодирующая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 95%. Представлен вирус rAAV для доставки гена человеческого фактора VIII пациенту, содержащий капсид AAVhu37 и упакованный в него векторный геном, при этом указанный векторный геном содержит: (a) последовательность AAV с 5' инвертированным концевым повтором (ITR); (b) промотор транстиретина (TTR); (с) энхансер транстиретина (enTTR); (d) кодирующую последовательность, кодирующую человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции; и (e) последовательность 3' ITR AAV, причем указанная кодирующая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Также описана водная суспензия, пригодная для введения пациенту с гемофилией A, причем указанная суспензия содержит водную суспендирующую жидкость и от около 1 x 10¹² геномных копий (ГК)/мл до около 1 x 10¹⁴ ГК/мл вируса rAAV. Также представлена нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции, причем указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 95%. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения гемофилии A. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 25 ил., 4 табл., 3 пр.

 

ВКЛЮЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ, ПУТЕМ ССЫЛКИ

Заявитель тем самым включает путем ссылки материал с перечнем последовательностей, поданный с данной заявкой в электронной форме. Данный файл назван UPN-16-7798PCT_ST25.txt.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительных заявок на патент США: № 62/323,336, поданной 15 апреля 2016 г., № 62/331,807, поданной 4 мая 2016 г., и № 62/428,866, поданной 1 декабря 2016 г. Эти три заявки на патент включены в данный документ в полном объеме путем ссылки.

1. ВВЕДЕНИЕ

Данная заявка относится к вариантам реализации изобретения, используемым для генной терапии для лечения гемофилии A.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гемофилия A (HA или HemA) представляет собой наиболее распространенное наследственное нарушение свертывания крови. В соответствии с Центрами США контроля и профилактики заболеваний, гемофилия A встречается приблизительно в 1 случае на 5000 новорожденных. В США существует около 20 000 людей с гемофилией A. Гемофилия A встречается в четыре раза чаще, чем гемофилия B, и у более чем половины пациентов с гемофилией A наблюдается тяжелая форма гемофилии. HA вызвана дефицитом фактора VIII (FVIII), а также поддается для лечения подходом с замещением генов в первую очередь благодаря тому, что увеличение уровня FVIII (>1 % от нормального) может облегчать фенотип, для которого характерно возникновение тяжелых кровотечений. В настоящее время аденоассоциированные (AAV) вирусные векторы демонстрируют наибольшую перспективу для применения в генной терапии благодаря их превосходному профилю безопасности и способности к прямой долговременной трансгенной экспрессии из постмитотических тканей, таких как печень. 

Однако применение векторов AAV для генной терапии HA вызывает новые сложности из-за отличающихся молекулярных и биохимических свойств человеческого FVIII (hFVIII).По сравнению с другими белками сходного размера экспрессия hFVIII является в высшей степени неэффективной. Применение методов биоинженерии к молекуле FVIII привело к улучшению экспрессии FVIII.Например, удаление B-домена, который не нужен для проявления кофакторной активности, и замена его коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII SQ) приводила к 17-кратному увеличению уровней мРНК по сравнению с полноразмерным FVIII нормального типа и 30 % увеличению секретированного белка. См., Ward, Natalie J., et al. "Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression." Blood 117.3 (2011): 798–807 и патент США № 9,393,323, также опубликованный как WO 2011/005968.Рекомбинантный FVIII-BDD-SQ обеспечивает клиническое применение в качестве заместительного рекомбинантного продукта FVIII (Refacto, Wyeth Pharma; Xyntha, Pfizer).

Другое препятствие для опосредованного AAV переноса генов для генной терапии HA состоит в размере кодирующей FVIII последовательности, которая составляет 7,0 т. н., что намного превышает нормальную емкость упаковки векторов AAV. Сообщалось об упаковке больших экспрессионных кассет в векторы AAV, но это очень нестабильный процесс, приводящий к низким выходам векторных частиц с пониженной инфицирующей способностью и требующий высокой дозы, что может вызывать повреждение печени. См., например, Sarkar, R., W. Xiao, and H. H. Kazazian. "A single adeno‐associated virus (AAV)‐murine factor VIII vector partially corrects the hemophilia A phenotype." Journal of Thrombosis and Haemostasis 1.2 (2003): 220-226; и McIntosh, Jenny, et al. "Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant." Blood 121.17 (2013): 3335–3344.

Таким образом, для лечения HA требуются более эффективные векторы AAV.FVIII.

3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данные варианты реализации изобретения относятся к вектору AAV для генной терапии для доставки нормального человеческого FVIII нуждающемуся в нем субъекту с последующим внутривенным введением такого вектора, приводящим к долговременной, вероятно на 10 лет или более, клинически значимой коррекции нарушения свертывания крови. Популяция субъектов-пациентов представляет собой пациентов, болеющих от умеренной до тяжелой формами гемофилии A. Предполагаемая доза вектора предназначена для увеличения уровней FVIII в крови приблизительно на 3–10 % или 5 %. Цель лечения вектором AAV заключается в переводе тяжелой гемофилии A у пациентов до умеренной или слабой гемофилии A, таким образом облегчая состояние таких пациентов до необходимости нахождения в режиме профилактики.

Продукт генной терапии, описанный в данном документе, обеспечивает множество важных преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время профилактическими подходами для контроля тяжелой гемофилии A. Во-первых, результаты доклинических исследований исследуемого продукта согласовывались с его потенциалом достижения уровней циркуляции фактора VIII до 10 % или более от нормы, это уровни, которые могли быть революционными для целевой популяции пациентов. Во-вторых, данный продукт должен приводить к эффективному достижению постоянных уровней фактора VIII в крови, избегая падения уровней, наблюдаемых в настоящее время при введении экзогенного фактора. В-третьих, это достигается только одним введением, причем необходимость частых внутривенных введений может снижаться на продолжительный период времени, вероятно на десятилетие или дольше.

Данная заявка обеспечивает применение репликационно дефектного аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки гена человеческого фактора VIII (hFVIII или hF8) в клетки печени пациентов (субъектов-людей) с диагностированной гемофилией A. Рекомбинантный вектор AAV (rAAV), применяемый для доставки гена hFVIII (rAAV.hFVIII), должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии. В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (enTTR); промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA. В другом варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер предшественника укороченного α1-микроглобулина/бикунина (ABPS) и enTTR; промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA. В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (enTTR); промотор антитрипсина альфа-1 (A1AT) и сигнал полиA. В другом варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер ABPS и enTTR; промотор A1AT и сигнал полиA. Такие элементы описаны далее в данном документе.

В одном варианте реализации изобретения ген hFVIII кодирует форму фактора VIII с удаленным B-доменом (BDD), в котором B-домен замещен коротким аминокислотным линкером (FVIII-BDD-SQ, также называемым в данном документе как hFVIII). В одном варианте реализации изобретения белковая последовательность FVIII-BDD-SQ показана в SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность FVIII-BDD-SQ показана в SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность hFVIII является кодон-оптимизированной для экспрессии у людей. Такая последовательность может иметь 80 % идентичности с нативной кодирующей последовательностью hFVIII (SEQ ID NO: 1). В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность hFVIII показана в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте изобретения в данном документе предложена водная суспензия, подходящая для введения пациенту с гемофилией A, которая содержит rAAV, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения данная суспензия содержит водную суспендирующую жидкость и от около 1 x 10¹² до около 1 x 10¹⁴ геномных копий (ГК) rAAV/мл. В одном варианте реализации изобретения суспензия пригодна для внутривеннной инъекции. В другом варианте реализации изобретения суспензия дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, консервант и/или буфер, растворенные в водной суспендирующей жидкости.

В еще одном варианте реализации изобретения в данном документе предложен способ лечения пациента, болеющего гемофилией A, с помощью rAAV, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения в водной суспензии в организм пациента доставляют от около 1 x 10¹¹ до около 3 x 10¹³ геномных копий (ГК) rAAV/кг массы тела пациента.

Цель лечения заключается в функциональном замещении дефектного hFVIII пациента посредством основанной на rAAV направленной на печень генной терапии в качестве целесообразного подхода для лечения данного заболевания и улучшения ответа на существующие виды терапий. Варианты реализации изобретения, описанные в данной заявке, в частности основаны на разработке терапевтических композиций и способов, позволяющих безопасно доставлять эффективные дозы, и усовершенствованных способов промышленного получения для соответствия требованиям по очистке продукции для эффективного введения доз субъектам-людям.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E03.P3.hF8co-SQ.PA75.

На ФИГ. 2 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E12.P3.hF8co-SQ.PA75.

На ФИГ. 3 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E03.P2.hF8co-SQ.PA75.

На ФИГ. 4 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E12.P2.hF8co-SQ.PA75.

На ФИГ. 5 показана вариация активности hFVIII перед образованием антител у мышей FVIII KO. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10¹⁰ ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов. Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта). Анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B). Анализы выполняли на мышиной плазме, выделенной на неделе 2 после введения векторов. Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).

На ФИГ. 6 показана активность hFVIII и титр антител против hFVIII на неделю 8 после в/в введения вектора у мышей FVIII KO. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10¹⁰ ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов. Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта). Анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B). Анализы выполняли на мышиной плазме, выделенной на неделе 8 после введения векторов. Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).

На ФИГ. 7 показана в динамике активность hFVIII у мышей FVIII KO с после в/в введение 42 энхансерных/промоторных комбинаций векторов. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10¹⁰ ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов. Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта). Анализом COATEST определяли активность hFVIII на плазме мышей, выделяемой каждые две недели после введения векторов. Строили график по данным отдельных мышей со средними значениями ± SEM (n = 10/группу).

На ФИГ. 8 показаны в динамике титры антител против hFVIII у мышей FVIII KO с последующим в/в введением 42 энхансерных/промоторных комбинаций векторов. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10¹⁰ ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов. Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта). Титры IgG против hFVIII определяли твердофазным ИФА с IgG против hFVIII на мышиной плазме, выделяемой каждые две недели. Строили график по данным отдельных мышей (n = 10/группу).

На ФИГ. 9 представлено сравнение активности hFVIII и титра антител против hFVIII с последующим в/в введением генома E06.TTR.hFVIIIco-SQ с помощью различных векторных капсид. Мышам FVIII KO в/в вводили 10¹⁰ ГК векторов AAVrh10, AAV8, AAV9, AAVhu37 или AAVrh64R1, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из E06.TTR. Собирали плазму каждые две недели и анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B). Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).

На ФИГ. 10 представлена экспрессия hFVIII в предварительных исследованиях на приматах, не являющихся людьми (NHP). (A) Двум самцам макака-резус в/в вводили 3x10¹² ГК/кг AAVrh10.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ. (B) Двум самцам яванского макака в/в вводили 3x1012 ГК/кг AAVhu37.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ. Для оценки экспрессии hFVIII и наличия антител против трансгена hFVIII у макак еженедельно или раз в две недели отбирали кровь. Твердофазным ИФА измеряли в плазме экспрессию hFVIII (сплошная линия), а значения выражали в виде среднего ± SEM. В плазме твердофазным ИФА также определяли титры IgG против hFVIII (штриховая линия).

На ФИГ. 11 представлена экспрессия hFVIII у яванских макак. Пяти самцам макака-резус в/в вводили 1,2x10¹³ ГК/кг одного из вариантов AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, или AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75. У макак каждые две недели отбирали кровь для оценки экспрессии hFVIII в плазме твердофазным ИФА, а значения выражали в виде среднего ± SEM.

На ФИГ. 12 показано образование антител против hFVIII у яванских макак. Пяти самцам макака-резус в/в вводили 1,2x10¹³ ГК/кг одного из вариантов AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, или AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75. Для оценки наличия антител против трансгена hFVIII у макак каждые две недели отбирали кровь. В плазме твердофазным ИФА оценивали титры IgG против hFVIII. Статистический анализ показан на ФИГ. 14.

На ФИГ. 13 представлена технологическая схема.

На ФИГ. 14 представлен анализ времени до наступления события образования антител против FVIII, показанного на ФИГ. 12. С использованием лог-рангового критерия (Мантела-Кокса) отмечена статистически значимая разница между AAVrh.10 и AAVhu.37.

На ФИГ. 15 показано сравнение уровней экспрессии rhCG векторами AAVrh10, AAV8, AAV3B и AAV5 (первая инъекция вектора).

На ФИГ. 16A–16D показаны ДНК-копии векторов rhCG в печени в различные моменты времени (AAVrh10, ФИГ. 16A; AAV8, ФИГ. 16B; AAV3B, ФИГ. 16C; AAV5, ФИГ. 16D).

На ФИГ. 17A–17B показаны уровни rhAFP после повторного введения (вторая инъекция вектора) векторов AAV3B (ФИГ. 17A) или AAV5 (ФИГ. 17B), экспрессирующих rhAFP.

На ФИГ. 18A–18B показаны геномные копии вектора rhAFP в печени (ФИГ. 18A, AAV3B.TBG.rhAFP; ФИГ. 18B, AAV5.TBG.rhAFP).

На ФИГ. 19 показаны различные Nab-ответы на AAV у макак.

На ФИГ. 20A–20B представлены уровни векторных ГК (Фиг. 20A) или РНК-транскриптов (Фиг. 20B) в печени мышей, которым инъецировали векторы с энхансером/промотором AAVrh10, экспрессирующие hFVIIIco IV, как описано в разделе 6.3.8.

На ФИГ. 21 представлены уровни РНК-транскриптов hFVIII в мышце (правая икроножная), правом яичке, поджелудочной железе, правой почке, селезенке, правом легком и сердце мышей, которым инъецировали векторы с энхансером/промотором AAVrh10, экспрессирующие hFVIIIco IV, как описано в разделе 6.3.8.

На ФИГ. 22 показан график, демонстрирующий долговременную стабильную экспрессию человеческого FVIII у яванского макака (35 месяцев) после однократной внутривенной инъекции AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 с дозой 3x10¹² ГК/кг.

На ФИГ. 23 показан график, демонстрирующий уровни ферментов в печени (АЛТ, Ед/мл, квадраты; АСТ, Ед/мл, круги) у макак из ФИГ. 22.

На ФИГ. 24 показан график, демонстрирующий ответ в виде нейтрализующих антител (Nab) на капсид AAVhu.37.

На ФИГ. 25 представлено выравнивание последовательности hFVIIIco (SEQ ID NO: 2) по сравнению с нативной последовательностью hFVIII (SEQ ID NO: 1).

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Варианты реализации, описанные в данной заявке, относятся к применению репликационно дефектного аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки гена человеческого фактора VIII (hFVIII) в клетки печени пациентов (субъектов-людей) с диагностированной гемофилией A. Рекомбинантный вектор AAV (rAAV), применяемый для доставки гена hFVIII (rAAV.hFVIII), должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии. В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (TTR); промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA. Такие элементы описаны далее в данном документе.

Как используется в данном документе, «капсид AAVhu.37» относится к hu.37, имеющему аминокислотную последовательность из Genbank, номер регистрации: AAS99285, SEQ ID NO: 17, которая включена в данный документ путем ссылки. Допускается некоторая вариация этой кодирующей последовательности, которая может включать последовательности с около 99 % идентичности к эталонной аминокислотной последовательностью в AAS99285 и US 2015/0315612 (которые включены в данный документ путем ссылки) (т. е. менее чем около 1 % вариации от эталонной последовательности). Поэтому были описаны способы получения капсидных кодирующих последовательностей и способы продукции вирусных векторов rAAV. См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. США 100 (10), 6081-6086 (2003) и US 2015/0315612.

Как используется в данном документе, «капсид AAVrh10» относится к rh.10, имеющему аминокислотную последовательность из Genbank, номер регистрации: AAO88201, SEQ ID NO: 18, которая включена в данный документ путем ссылки. Допускается некоторая вариация этой кодирующей последовательности, которая может включать последовательности с около 99 % идентичности к эталонной аминокислотной последовательностью в AAO88201 и US 2013/0045186A1 (т. е. менее чем около 1 % вариации от эталонной последовательности), при условии, что поддерживается целостность лигандсвязывающего сайта для очистки с аффинным захватом, а изменение в последовательностях существенно не изменяет диапазон pH для капсида для обеспечения очистки на ионообменной смоле (как обсуждается далее в данном документе). Поэтому были описаны способы получения капсидных кодирующих последовательностей и способы продукции вирусных векторов rAAV. См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. США 100 (10), 6081–6086 (2003) и US 2013/0045186A1.

Как используется в данном документе, термином «титр NAb» определяется величина продуцирования нейтрализующего антитела (например, Nab против AAV), которое нейтрализует физиологические действие своего целевого эпитопа (например, AAV). Титры NAb против AAV можно измерять, как описано, например, в Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381–390, которая включена в данный документ путем ссылки.

Термины «процент (%) идентичности», «идентичность последовательностей», «процент идентичности последовательностей» или «процентная идентичность», в контексте аминокислотных последовательностей, относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для определения соответствия. Процент идентичности можно легко определять для аминокислотных последовательностей для полной длины белка, полипептида, около 32 аминокислот, около 330 аминокислот или их пептидного фрагмента, или соответствующих кодирующих секвенированных последовательностей нуклеотидных последовательностей. Подходящий аминокислотный фрагмент может в длину содержать по меньшей мере около 8 аминокислот и может содержать до около 700 аминокислот. В целом, при упоминании терминов «идентичность», «гомология» или «сходство» между двумя различными последовательностями, то «идентичность», «гомология» или «сходство» определяют в отношении «выровненных» последовательностей. «Выровненные» последовательности или «выравнивания» относятся к множеству последовательностей нуклеиновых кислот или белков (аминокислот), часто содержащих корректировки по отсутствующим или дополнительным основаниям или аминокислотам, по сравнению с эталонной последовательностью. Выравнивания выполняют с использованием любого из разнообразия общедоступных или коммерчески доступных программ для множественного выравнивания последовательностей. Для аминокислотных последовательностей доступны программы выравнивания последовательностей, например программы Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME и Match-Box. Как правило, любую из этих программ используют с настройками по умолчанию, хотя специалист в данной области может при необходимости изменять эти настройки. В альтернативном варианте специалист в данной области может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, которая обеспечивает по меньшей мере тот же уровень идентичности или выравнивания, которые предоставляются эталонными алгоритмами и программами. См., например, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999).

Как используется в данном документе, термин «функционально связанный» относится как к последовательностям контроля экспрессии, которые примыкают к интересующему гену, так и последовательностям контроля экспрессии, которые действуют в транс-положении или на расстоянии контролируют интересующий ген.

«Дефектный по репликации вирус» или «вирусный вектор» относится к рекомбинантной, синтетической или искусственной вирусной частице, в которой в вирусный капсид или оболочку упакована экспрессионная кассета, содержащая интересующий ген, причем упакованы также в этот вирусный капсид или оболочку любые вирусные геномные последовательности также являются дефектными по репликации, т. е. они не могут создавать вирионы потомства, но сохраняют способность инфицировать клетки-мишени. В одном варианте реализации изобретения геном вирусного вектора не включает гены, кодирующие ферменты, требуемые для репликации (геном может быть сконструирован так, чтобы быть «выпотрошенным» — содержащим только интересующий трансген, фланкированный сигналами, необходимыми для амплификации и упаковки искусственного генома), но эти гены могут предоставляться во время продукции. Поэтому считается, что его безопасно использовать в генной терапии, поскольку не может происходить репликация и инфицирование вирионами потомства, за исключением того случая, когда присутствует требуемый для репликации вирусный фермент.

Следует отметить, что термины в единственном числе относится к одному или более элементам. По существу, термины в единственном числе, термины «один или более» и «по меньшей мере один» применяются в данном документе взаимозаменяемо.

Слова «содержать», «содержит» и «содержащий» должны толковаться как включающие, а не исключающие. Слова «состоит», «состоящий» и их варианты должны толковаться как включающие, а не исключающие. При том что различные варианты реализации изобретения в данном описании представлены с использованием стиля «содержащий», в других обстоятельствах родственный вариант реализации изобретения также подразумевает необходимость интерпретации и описания с использованием стиля «состоящий из» или «состоящий по существу из».

Как используется в настоящем описании термин «около» означает вариабельность на 10 % от данного эталонного значения, если не указано иное.

Если в данном документе не указано иное, технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же самое значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области, и учитывая ссылки на опубликованные тексты, которые предоставляют специалисту в данной области общим руководством для множества терминов, использованных в настоящей заявке.

5.1 Векторы для генной терапии

В одном аспекте для применения в генной терапии предложен рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор, несущий ген фактора 8 сворачивания крови человека (hF8 или hFVIII). Вектор rAAV.hFVIII должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии. Вектор готовится в виде препарата в буфере/носителе, подходящем для инфузии субъектам-людям. Буфер/носитель должен содержать компонент, который предотвращает прилипание rAAV к трубке для инфузии, но не влияет на активность связывания rAAV in vivo.

5.1.1. Вектор rAAV.hFVIII

5.1.1.1. Последовательность hFVIII

Человеческий фактор коагуляции VIII продуцируется в виде большого гликопротеина массой 330 кДа с доменной структурой A1-A2-B-A3-C1-C2, в которой и A и C домены обладают внутренней гомологией последовательностей и приблизительно 40 % идентичностью последовательностей с доменами A и C фактора V (FV), который несет аналогичную доменную структуру. Для прокоагулянтной активности необязателен B-домен, который составляет 38 % от общей последовательности. FVIII, в котором удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII SQ), находится в клиническом применении в качестве заместительного рекомбинантного продукта FVIII, и было показано, что это привело к 17-кратному увеличению уровней мРНК по сравнению с полноразмерным FVIII нормального типа и 30 % увеличению секретированного белка. См., McIntosh et al, Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant, Blood, 121(17):3335-44 (Feb 2013) и Ward et al, Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression, Blood, 117(3):798-807 (Jan 2011), которые включены в данный документ путем ссылки.

В одном варианте реализации изобретения ген hFVIII, кодирующий белок hFVIII, показан в SEQ ID NO: 3, являющейся последовательностью FVIII, у которой удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII-BDD-SQ). Таким образом, в одном варианте реализации изобретения трансген hFVIII может включать, но не ограничиваться, одной или более последовательностей, представленных SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 2, которые представлены в приложенном перечне последовательностей, который включен в данный документ путем ссылки. В SEQ ID NO: 1 предложена кДНК для нативного человеческого FVIII-BDD-SQ. В SEQ ID NO: 2 предложена сконструированная кДНК для человеческого FVIII-BDD-SQ, который прошел кодон-оптимизацию для экспрессии у людей (иногда называемый в данном документе как hFVIIIco-SQ или hFVIIIco-BDD-SQ). Необходимо понимать, что ссылка на hFVIII в данном документе, в некоторых вариантах реализации изобретения, относится к нативной или кодон-оптимизированной последовательности hFVIII-BDD-SQ. Альтернативно или дополнительно, могут использоваться доступные в сети или коммерчески доступные компьютерные программы, а также предоставляющие услуги компании для обратной трансляции аминокислотных последовательностей в нуклеотидные кодирующие последовательности, включая как РНК, так и/или кДНК. См., например, обратно транслированные последовательности от компаний EMBOSS, www.ebi.ac.uk/Tools/st/ ; Gene Infinity (www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy (www.expasy.org/tools/). Предполагается, что охвачены все нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные полипептидные последовательности hFVIII, включая нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии у необходимого целевого субъекта (например, методом оптимизации кодонов). В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 95 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 90, 85, 80, 75, 70 или 65 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет около 77 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII представляет собой SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 99 %, 97 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % или 65 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII представляет собой SEQ ID NO: 19. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 90, 85, 80, 75, 70 или 65 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 19. В еще одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 19. См. Ward et al, Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression, Blood, 117(3):798-807 (Jan 2011), которая включена в данный документ путем ссылки для обсуждения различных вариантов FVIII-SQ, включая кодон-оптимизированные варианты.

Кодон-оптимизированные кодирующие области могут конструироваться различными разнообразными методами. Эту оптимизацию можно выполнять, используя методы, которые доступны онлайн (например, GeneArt), опубликованные методы или компании, которые обеспечивают услуги по оптимизации кодонов, например DNA2.0 (г. Менло-Парк, штат Калифорния, США). Один подход для оптимизации кодонов описан, например, в международной публикации патента № WO 2015/012924, которая включена в данный документ путем ссылки. См. также, например, публикацию патента США № 2014/0032186 и публикацию патента США № 2006/0136184. Соответственно модифицируют всю длину открытой рамки считывания (ORF) для данного продукта. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации изобретения, можно изменять только фрагмент ORF. Путем использования одного из этих методов, специалист может применять значения частоты встречаемости к любой заданной полипептидной последовательности и получать фрагмент нуклеиновой кислоты кодон-оптимизированного кодирующей области, которая кодирует данный полипептид.

Для выполнения фактических изменений в кодоны или для синтеза сконструированных кодон-оптимизированных кодирующих области доступен ряд вариантов, описанных в данном документе. Такие модификации или синтез можно выполнять с использованием стандартных и обычных молекулярных биологических манипуляций, хорошо известных средним специалистам в данной области. В одном подходе стандартными способами синтезируются наборы комплементарных олигонуклеотидных пар из 80–90 нуклеотидов, каждый по длине и протяженности длины соответствующий требуемой последовательности. Эти олигонуклеотидные пары синтезируют таким образом, чтобы при ренатурации они образовывали двухцепочечные фрагменты из 80–90 пар оснований, содержащие липкие концы, например, каждый олигонуклеотид в паре синтезируют до размера 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более оснований больше области, которая является комплементарной к другому олигонуклеотиду в этой паре. Одноцепочечные концы каждой пары олигонуклеотидов разработаны для ренатурации с одноцепочечным концом другой пары олигонуклеотидов. Олигонуклеотидным парам позволяют ренатурировать и затем приблизительно от пяти до шести из этих двухцепочечных фрагментов позволяют ренатурировать вместе посредством липких одноцепочечных концов, а потом их лигируют вместе и клонируют в стандартном бактериальном векторе клонирования, например векторе TOPO®, предлагаемом Thermo Fisher Scientific Inc. Затем полученную конструкцию секвенируют стандартными способами. Получают несколько из этих конструкций, состоящих из от 5 до 6 фрагментов из от 80 до 90 пар лигированных вместе фрагментов, т. е. фрагментов из около 500 пар оснований, таким образом, чтобы в наборе плазмидных конструкций была представлена полная требуемая последовательность. Затем вставки этих плазмид разрезают соответствующими ферментами рестрикции и лигируют вместе с образованием готовой конструкции. Готовую конструкцию потом клонируют в стандартном бактериальном векторе клонирования и секвенируют. Дополнительные способы будут непосредственно очевидны специалисту в данной области. В дополнение к этому, синтез генов легко доступен в коммерческой сфере.

5.1.1.2. Вектор rAAV

Поскольку hFVIII изначально экспрессируется в печени, желательно использовать AAV, который проявляет тропизм к печени. В одном варианте реализации изобретения поставляемый AAV капсид представляет собой AAVrh.37. В другом варианте реализации изобретения поставляемый AAV капсид представляет собой AAVrh.10. Однако можно применять любое количество векторов rAAV с тропизмом к печени.

В конкретном варианте реализации изобретения, описанном в примерах ниже, вектор для генной терапии представляет собой вектор AAVhu.37, экспрессирующий трансген hFVIII под контролем промотора транстиретина, называемый rAAVhu.37.TTR.hFVIII. Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип hu.37, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в соотношении 1:1:10. Капсид содержит одноцепочечную ДНК векторного генома rAAV.

Геном rAAVhu.37.TTR.hFVIII содержит трансген hFVIII, фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Трансген hFVIII содержит энхансер, промотор, кодирующую hFVIII последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA). Эти контрольные последовательности являются «функционально связанными» с генными последовательностями hFVIII. Экспрессионную кассету можно встраивать в плазмиду, которая используется для продукции вирусного вектора.

ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV. Минимальные последовательности, требуемые для упаковки экспрессионной кассеты в вирусную частицу AAV, представляют собой 5’ и 3’ ITR AAV, которые могут быть того же происхождения, что и капсид, или которые имеют другое происхождение AAV (для получения псевдотипа AAV). В одном варианте реализации изобретения применяются последовательности ITR из AAV2 или их версия с делецией (∆ITR). Однако могут выбирать ITR из других источников. Если источник ITR происходит из AAV2, а капсид AAV происходит из другого источника AAV, то получаемый вектор может называться псевдотипным. Как правило, экспрессионная кассета для вектора AAV содержит 5’ ITR AAV, кодирующие hFVIII последовательности, любые регуляторные последовательности и 3’ ITR AAV. Тем не менее могут подходить другие конфигурации этих элементов. Была описана укороченная версия 5’ ITR, называемая ∆ITR, у которой удалены D-последовательность и концевой сайт распознавания (trs). В других вариантах реализации изобретения применяют полноразмерные 5’ и 3’ ITR AAV. В одном варианте реализации изобретения последовательность 5' ITR показана в SEQ ID NO: 11. В одном варианте реализации изобретения последовательность 3' ITR показана в SEQ ID NO: 12.

Экспрессия кодирующей hFVIII последовательности управляется специфическим для печени промотором. Из-за размера трансгена hFVIII желательно применение промотора относительно малого размера. Иллюстративная плазмида и вектор, описанные в данном документе, используют промотор транстиретина (TTR) (также называемый в данном документе P3) или его модифицированную версию. В одном варианте реализации изобретения последовательность промотора TTR показана в SEQ ID NO: 7. В альтернативном варианте можно применять специфические для печени промоторы, такие как промотор тироксин-связывающего глобулина (TBG) (также называемый в данном документе как P1) или его укороченную версию, TBG-S1, последовательность которой показана в SEQ ID NO: 8. Другой подходящий промотор представляет собой промотор антитрипсина альфа 1 (A1AT) или его модифицированную версию (также называемый P2), показанную в SEQ ID NO: 9. Другие подходящие промоторы включают промотор альбумина человека (Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997)), humAlb; и промотор корового белка вируса гепатита B (Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996). См., например, базу данных промоторов специфических промоторов печени, г. Колд Спринг Харбор, rulai.schl.edu/LSPD, которая включена путем ссылки. Хотя и менее желательно, в описанных в данном документе векторах могут использоваться другие промоторы, такие как вирусные промоторы, конститутивные промоторы, регулируемые промоторы [см., например, WO 2011/126808 и WO 2013/04943] или промотор, восприимчивый к физиологическим сигналам.

В одном варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают один или более энхансеров. В одном варианте реализации изобретения включена последовательность энхансера транстиретина (enTTR) (100 п. н. последовательности энхансера транстиретина), данная последовательность показана в SEQ ID NO: 5. См. Wu et al, Molecular Therapy, 16(2):280–289, Feb. 2008, которая включена в данный документ путем ссылки. В другом варианте реализации изобретения включен энхансер En34 (коровый энхансер размером 34 п. н. аполипопротеина человека из контрольной области печени), который показан в SEQ ID NO: 4. В еще одном варианте реализации изобретения включен энхансер ABPS (укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP]). Такая последовательность показана в SEQ ID NO: 6. В другом варианте реализации изобретения представлено более одного энхансера. Такая комбинация может включать более одной копии любого из описанных в данном документе энхансеров и/или более одного типа энхансеров. В различных вариантах реализации изобретения энхансеры представлены в одной из следующих комбинаций.

Таблица 1. Комбинации энхансеров

Название комбинации	En34	ABPS	EnTTR	Чистая длина (п. н.)
E01	1	0	0	34
E02	0	1	0	42
E03	0	0	1	100
E04	1	1	0	76
E05	0	1	1	142
E06	1	0	1	134
E07	2	0	0	68
E08	0	2	0	84
E09	0	0	2	200
E10	1	1	1	176
E11	2	0	1	168
E12	0	2	1	184
E13	1	2	0	118
E14	2	1	0	110

В одном варианте реализации изобретения энхансеры комбинируют в следующей последовательности: 5’-EnTTR-ABPS-En34-промотор-3’. В другом варианте реализации изобретения энхансеры комбинируют в следующей последовательности: 5’-промотор-EnTTR-ABPS-En34-3’. В одном варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают enTTR. В другом варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают две копии ABPS и 1 копию enTTR.

В дополнение к этому промотор, экспрессионная кассета и/или вектор могут содержать соответствующие сигналы инициации транскрипции, терминации, энхансерные последовательности и сигналы эффективного процессинга РНК. Такие последовательности включают сигналы сплайсинга и полиаденилирования (полиA); стабилизирующие цитоплазматическую мРНК последовательности; усиливающие эффективность трансляции последовательности (т. е. консенсусная последовательность Козак); усиливающие белковою стабильность последовательности и, при необходимости, последовательности, которые усиливают секрецию кодированного продукта. В одном варианте реализации изобретения включен сигнал полиаденилирования (полиA) для опосредования терминации мРНК-транскриптов hFVIII. Сигнал полиA, используемый в данном документе, представляет собой искусственную полиA, которая представляет собой по размеру около 75 п. н. (PA75), показанную в SEQ ID NO: 10. Примеры других подходящих последовательностей полиA включают в себя среди прочих, например, полиA бычьего гормона роста, SV40, бета-глобина кролика и TK.

В одном варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру от около 5 до 5,5 тысяч пар нуклеотидов. В другом варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру около 5,1 т. п. н. В другом варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру около 5,2 т. п. н. В другом варианте реализации изобретения полный геном вектора rAAV составляет по размеру менее 5 т. п. н.

В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5110 SEQ ID NO: 13. В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5194 SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5138 SEQ ID NO: 15. В другом варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5222 SEQ ID NO: 16.

5.1.2. Лекарственная форма rAAV.hFVIII

В одном варианте реализации изобретения предложен вектор rAAV.hFVIII в фармацевтической композиции, которая содержит водный носитель, наполнитель, разбавитель или буфер. В одном варианте реализации буфер представляет собой фосфатно-солевой буфер (ФСБ). В конкретном варианте реализации изобретения лекарственная форма rAAV.hFVIII представляет собой суспензию, содержащую эффективное количество вектора rAAV.hFVIII, суспензированного в водном растворе, содержащем 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).Однако известны различные подходящие растворы, включая те, которые содержат один или более из следующих компонентов:забуференный солевой раствор, поверхностно-активное вещество и физиологически совместимую соль или смесь солей, подобранных по ионной силе, эквивалентной раствору от около 100 мМ хлорида натрия (NaCl) до около 250 мМ хлорида натрия, или физиологически совместимую соль, подобранную до эквивалентной ионной концентрации.

Например, предложенная в данном документе суспензия может содержать как NaCl, так и KCl. Значение pH может находиться в диапазоне от 6,5 до 8,5 или от 7 до 8,5, или от 7,5 до 8. Подходящее поверхностно-активное вещество или комбинацию поверхностно-активных веществ можно выбирать из полоксамеров, т. е. неионогенных триблоксополимеров, состоящих из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксид)), фланкированного двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксид)), СОЛЮТОЛА HS 15 (макрогол-15 гидроксистеарат), ЛАБРАСОЛА (глицерид полиоксикаприловой кислоты), полиокси-10-олеилового эфира, ТВИНА (сложные эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана), этанола и полиэтиленгликоля. В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма содержит полоксамер. Эти сополимеры обычно обозначаются буквой «P» (полоксамер) с последующими тремя цифрами: первые две цифры x 100 дают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра x 10 дает процентное содержание полиоксиэтилена. В одном варианте реализации изобретения выбран полоксамер 188. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в количестве от около 0,0005 % до около 0,001 % суспензии. В другом варианте реализации изобретения вектор суспендируется в водном растворе, содержащем 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 0,001 % полоксамер 188, pH 7,3.

В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма пригодна для применения для субъектов-людей и вводится внутривенно. В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством болюсной инъекции. В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 10 минут (±5 минут). В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 90 минут (±10 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 20 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 30 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 40 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 50 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 60 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 70 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 80 минут (±5 минут). Однако данный период времени может, при необходимости или желании, корректироваться. Для введения содержащей AAV композиции, описанной в данном документе, и необязательно для совместного введения других активных лекарственных средств или применения терапий в сочетании с опосредованной AAV доставки hFVIII, описанной в данном документе, может применяться любой подходящий способ или путь. Пути введения включают, например, системный, пероральный, ингаляционный, интраназальный, внутритрахеальный, внутриартериальный, интраокулярный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный и другие парентеральные пути введения.

В одном варианте реализации изобретения состав может содержать, например, от около 1,0 x 10¹¹ геномных копий на килограмм массы тела пациента (ГК/кг) до около 1 x 10¹⁴ ГК/кг, от около 5 x 10¹¹ геномных копий на килограмм массы тела пациента (ГК/кг) до около 3 x 10¹³ ГК/кг или от около 1 x 10¹² до около 1 x 10¹⁴ ГК/кг, при измерении методом окПЦР или цифровой капельной ПЦР (цкПЦР), как описано, например, в M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115–25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14, которая включена в данный документ путем ссылки. В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма rAAV.hFVIII представляет собой суспензию, содержащую по меньшей мере 1x10¹³ геномных копий (ГК)/мл или больше, при измерении окПКЦ или цифровой капельной ПЦР (цкПЦР), как описано в, например, в M. Lock et al, выше.

С целью обеспечения удаления пустых капсидов из дозы AAV.hFVIII, которую вводили пациентам, пустые капсиды отделяют от векторных частиц во время процесса очистки вектора, используя, например, обсуждаемый в данном документе метод. В одном варианте реализации изобретения векторные частицы, содержащие упакованные геномы, очищают от пустых капсидов с использованием процесса, описанного в международной заявке на патент № PCT/US2016/066013, поданной 9 декабря 2016 г. и заявке на патент США № 62/322,055, поданной 13 апреля 2016 г. и озаглавленной «Scalable Purification Method for AAVrh.10 (масштабируемый метод очистки AAVrh.10)», которые включены в данный документ путем ссылки. Вкратце, описана двухстадийная схема очистки, которая избирательно захватывает и выделяет содержащие геном векторные частицы rAAV из осветленного концентрированного супернатанта клеточной культуры, продуцирующей rAAV. В процессе используется метод аффинного захвата, проводимый при высокой концентрации солей, с последующим методом с использованием анионообменной смолы, проводимым при высоком значении pH, что обеспечивает получение векторных частиц rAAV практически не содержащих промежуточных продуктов rAAV. Для векторов на основе AAVhu.37 могут применяться аналогичные методы очистки. Другие методы очистки описаны, например, в заявках на патент США № 62/266,347, 62/266,357, 62/322,071, 62/266,351, 62/322,083, 62/266,341 и 62/322,098, каждая из которых включена в данный документ путем ссылки.

Поскольку может применяться любой традиционный технологический процесс, то описанный в данном документе процесс (и в международной заявке на патент № PCT/US2016/066013) обеспечивает выходы векторных препаратов, в которых от 50 до 70 % частиц содержат векторный геном, т. е. от 50 до 70 % заполненных частиц. Таким образом примерная доза составляет 1,6x10¹² ГК/кг, а общая доза частиц будет составлять от 2,3x10¹² до 3x10¹² частиц. В другом варианте реализации изобретения предложенная доза оказывается на половину логарифма выше или равна 5x10¹² ГК/кг, а общая доза частиц будет составлять от 7,6x10¹² до 1,1x10¹³ частиц. В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма характеризуется содержанием концентрата rAAV, имеющего соотношение «пустых» к «полным» равным 1 или меньше, предпочтительно менее 0,75, предпочтительнее 0,5, предпочтительно менее 0,3.

Вкратце, в одном варианте реализации изобретения предложен способ отделения вирусных частиц AAV от капсидных промежуточных продуктов AAV, который включает: проведение для смеси, содержащей рекомбинантные вирусные частицы AAV и капсидные промежуточные продукты AAV, жидкостной хроматографии быстрого разрешения, в ходе которой вирусные частицы AAV и промежуточные продукты AAV связываются с анионообменной смолой, уравновешенной при pH около 10,0, и проведение солевого градиента при контроле элюата на поглощение в ультрафиолете при длине волны от около 260 до около 280, причем полные капсиды AAV собирают из фракции, которая элюируется, когда соотношение A260/A280 достигает точки перегиба.

В одном варианте реализации изобретения данный метод дополнительно включает (a) смешивание суспензии, содержащей рекомбинантные вирусные частицы AAV и капсидные промежуточные продукты AAV, и буфера A, содержащего от 20 мМ до 50 мМ бис-триспропана (BTP) и pH около 10,0; (b) нанесение суспензии из (a) на колонку с сильной анионообменной смолой; (c) промывку нагруженной анионообменной смолы 1 % буфером B, который содержит соль с ионной силой от 10 мМ до 40 мМ NaCl и BTP с pH около 10,0; (d) приложение градиента с возрастающей концентрацией соли к нагруженной и промытой анионообменной смоле, причем солевой градиент эквивалентен от около 10 мМ до около 40 мМ NaCl, и (e) сбор частиц rAAV из элюата, полученного при концентрации солей, эквивалентной по меньшей мере 70 мМ NaCl, при этом частицы rAAV являются по меньшей мере на около 90 % очищенными от промежуточных продуктов AAV. В одном варианте реализации изобретения это значение определяется по числу геномных копий.

В одном варианте реализации изобретения промежуточные продукты элюируют из анионообменной смолы, когда концентрация солей эквивалентна более чем около 50 мМ NaCl. В еще одном варианте реализации изобретения буфер A дополнительно смешан с NaCl до конечной концентрации 1M с целью образования или получения буфера B. В еще одном варианте реализации изобретения солевой градиент имеет ионную силу эквивалентную от 10 мМ до около 190 мМ NaCl. Градиент элюирования может составлять от 1 % буфера B до около 19 % буфера B. Необязательно емкость, содержащая анионообменную смолу представляет собой монолитную колонку, причем буфер A, буфер B и солевой градиент составляют около 60 объемов колонки.

Концентрат или препарат частиц rAAV (с упакованным геномом) является «практически свободным» от пустых капсидов AAV (и других промежуточных продуктов), когда частицы rAAV в концентрате составляют по меньшей мере от около 75 % до около 100 %, по меньшей мере около 80 %, по меньшей мере около 85 %, по меньшей мере около 90 %, по меньшей мере около 95 % или по меньшей мере 99 % rAAV в концентрате, а «пустые капсиды» составляют в концентрате или препарате менее около 1 %, менее около 5 %, менее около 10 %, менее около 15 % rAAV.

В дополнительном варианте реализации изобретения средний выход частиц rAAV составляет по меньшей мере около 70 %. Это значение можно рассчитывать путем определения титра (геномных копий) в данной смеси, нагруженной на колонку, и количества, присутствующего в конечных элюатах. Дополнительно это можно определять на основе к-ПЦР анализа и/или методик ДСН-ПААГ-электрофореза, таких как описанные в данном документе, или таких, которые описаны в данной области.

Например, для расчёта содержания пустых и полных частиц, объемы в полосе VP3 выбранного образца (например, препарата очищенного на градиенте йодиксанола, в котором число ГК = числу частиц) отмечали на графике по сравнению с внесенным количеством ГК-частиц. Полученное линейное уравнение (y = mx+c) используют для расчета количества частиц в объемах полос пиков исследуемого препарата. Затем количество частиц (част.) во внесенных 20 мкл умножают на 50 для получения количества частиц (част.) /мл. Значение частиц/мл, деленное на ГК/мл, дает соотношение частиц к геномным копиям (част./ГК). Вычисление част./мл–ГК/мл дает величину пустых част./мл. Значение пустых част./мл, деленное на част./мл и x 100, дает процентное содержание пустых частиц.

В целом, методы для оценки количества пустых капсидов и векторных частиц AAV с упакованными геномами, известны в данной области.См., например, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122–128. Для испытания на денатурированные капсиды, методы включают проведение для обработанного концентрата AAV электрофореза на ДСН-полиакриламидном геле, состоящем из любого геля, способного разделять три капсидных белка, например гель с градиентом, содержащим в буфере 3–8 % трис-ацетата, затем обработка геля до разделения исследуемого материала и блоттинг геля на нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, предпочтительно нейлоновые.Затем антитела против капсидов AAV применяют как первичные антитела, которые связываются с денатурированными капсидными белками, предпочтительно моноклональное антитело против капсида AAV, наиболее предпочтительно моноклональное антитело B1 против AAV-2 (Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281–9293). Затем используют вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом и содержит средство для определения связывания с первичным антителом, предпочтительнее антитело против IgG, содержащее ковалентно связанную с ним молекулу детекции, наиболее предпочтительно антитело овцы против мышиного IgG, ковалентно связанное с пероксидазой хрена. Метод для выявления связывания используется для полуколичественного определения связывания между первичными и вторичными антителами, предпочтительно метод выявления способен определять эмиссию радиоактивных изотопов, электромагнитное излучение или колориметрические изменения, наиболее предпочтительно — это набор для выявления хемилюминесценции. Например, можно брать образцы из фракций колонки для ДСН-ПААГ-электрофореза и нагревать в буфере для внесения, содержащем восстанавливающий агент (например, ДТТ) и разделять капсидные белки на готовых градиентных полиакриламидных гелях (например, Novex).Можно выполнять окрашивание серебром с использованием набора SilverXpress (Invitrogen, штат Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. В одном варианте реализации изобретения концентрацию векторных геномов (вг) в фракциях колонки можно измерять количественным ПЦР в реальном времени (К-ПЦР).Образцы разбавляют и обрабатывают ДНКазой I (или другой подходящей нуклеазой) для удаления экзогенной ДНК.После инактивации нуклеазы, образцы дополнительно разбавляют и амплифицируют с использованием праймеров и флуорогенного зонда TaqMan™, специфического к последовательности ДНК между праймерами. Количество циклов, требуемое для достижения определенного уровня флуоресценции (пороговый цикл, Ct), измеряется для каждого образца на системе выявления последовательностей Prism 7700, Applied Biosystems.Для получения стандартной кривой в реакции К-ПЦР применяют плазмидную ДНК, содержащую последовательности, идентичные к последовательностям, содержащимся в векторе AAV.Значения порогового цикла (Ct), полученные из образцов, используют для определения титра векторного генома путем нормализации его со значением Ct стандартной кривой для плазмиды.Можно также использовать анализы по конечной точке, основанные на цифровой ПЦР.

В одном аспекте в данном документе предложен оптимизированный метод к-ПЦР, в котором используется широкий спектр сериновых протеаз, например протеиназа K (такая как коммерчески доступная у Qiagen). Более конкретно, анализ титра генома оптимизированной кПЦР аналогичен стандартному анализу, за исключением того, что после расщепления ДНКазой I образцы разбавляют буфером для протеиназы K и обрабатывают протеиназой K, с последующей ее инактивацией нагреванием. Подходящие образцы разбавляют буфером для протеиназы K в количестве равном объему образца. Буфер для протеиназы K можно концентрировать в 2 раза или выше. Как правило, обработка протеиназой K составляет около 0,2 мг/мл, но может варьировать от 0,1 мг/мл до около 1 мг/мл. Этап обработки обычно проводят при температуре около 55 °C в течение около 15 минут, но могут выполнять при более низкой температуре (например, от около 37 °C до около 50 °C) в течении более длительного периода времени (например, от около 20 минут до около 30 минут) или при более высокой температуре (например, до около 60 °C) в течение более короткого периода времени (например, от около 5 до 10 минут). Аналогичным образом инактивацию нагреванием обычно проводят при температуре около 95 °C в течение около 15 минут, но могут выполнять при более низкой температуре (например, от около 70 до около 90 °C) в течении продолжительного периода времени (например, от около 20 минут до около 30 минут). Затем образцы разбавляют (например, 1000-кратно) и подвергают анализу TaqMan, как описано в стандартном анализе. 

Дополнительно или альтернативно можно использовать капельный цифровой ПЦР (кцПЦР). Например, были описаны методы для определения титров одноцепочечного и самокомплементарного генома вектора AAV с помощью кцПЦР. См., например, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115–25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14.

5.1.3 Промышленное получение

Вектор rAAV.hFVIII можно промышленно получать как показано на технологической схеме, показанной на ФИГ. 13. Вкратце, клетки (например, клетки HEK 293) размножают в подходящей системе для культивирования и трансфицируют для получения векторов. Затем собирают вектор rAAV.hFVIII, концентрируют и очищают для получения субстанции вектора, которую потом разливают и готовят готовый препарат в финишном технологическом процессе.

Способы промышленного получения векторов для генной терапии, описанные в данном документе, включают способы, хорошо известные в данной области, такие как получение плазмидной ДНК, используемой для продукции векторов для генной терапии, получения и очистки этих векторов. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор для генной терапии представляет собой вектор AAV, а полученные плазмиды представляют собой цис-плазмиду AAV, кодирующую геном AAV и интересующий ген, транс-плазмиду AAV, содержащую гены rep и cap AAV, и аденовирусную хелперную плазмиду. Процесс получения вектора может включать такие стадии способа, как размножение клеточной культуры, пересев клеток, высевание клеток, трансфекция клеток плазмидной ДНК, замена среды после трансфекции на бессывороточную среду и сбор содержащих вектор клеток и культуральной среды. Собранные содержащие вектор клетки и культуральную среду называют в данном документе неочищенным урожаем клеток.

После этого неочищенный урожай клеток подвергают таким стадиям способа, как концентрирование урожая векторов, диафильтрация урожая векторов, микрофлюидизация урожая векторов, расщепление нуклеазами урожая векторов, фильтрация микрофлюидизированного промежуточного продукта, очистка хроматографией, очистка ультрацентрифугированием, замена буфера фильтрацией с тангенциальным потоком и приготовление лекарственной формы и фильтрация для получения субстанции вектора.

В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 13. В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 15. В другом варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида является такой, как показана в SEQ ID NO: 16.

В конкретном варианте реализации изобретения способы, используемые для промышленного получения векторов для генной терапии описаны в разделе 8, ниже.

5.2 Популяция пациентов

По нескольким причинам выбранной исследуемой популяцией являются пациенты с тяжелой или умеренной гемофилией A (HemA). Пациенты с тяжелой гемофилией A определены как имеющие менее 1 % от нормальной активности фактора VIII (FVIII), таким образом, требующие частых инфузий FVIII для контроля их предрасположенности к кровотечениям. Это представляет значительное затруднение в отношении ведения нормального образа жизни и, в дополнение к этому, уровни FVIII в крови проходят через хорошо известные пики и имеют снижающийся профиль, что неоптимально. Тот факт, что уровни FVIII в крови у тяжелых пациентов оказываются меньше 1 %, дает возможность легко измерять даже от низкого до умеренного увеличения уровней FVIII в крови после введения rAAV.hVIII. Недавние клинические исследования подтвердили действенность этого подхода. Пациенты с умеренной HemA определены, как имеющие уровни от 1 % вплоть до 5 % FVIII в крови.

Пациенты, которые являются кандидатами для проведения лечения предпочтительно представляют собой взрослых мужчин возрастом ≥18 с диагностированной умеренной/тяжелой или тяжелой гемофилией A. В одном варианте реализации изобретения пациент имеет базовую активность FVIII ≤2 % от нормальной или задокументированной истории активности FVIII ≤2 %. В некоторых вариантах реализации изобретения можно лечить пациента возрастом <18 лет. Кандидаты для лечения включают субъектов, у которых было по меньшей мере 3 эпизода с кровотечением за год, которые требуют лечения FVIII по необходимости. Другие кандидаты для лечения, включают субъектов, которых лечат FVIII в профилактическом режиме. Другие критерии демонстрируют, что для субъекта подходит лечение, включающее по меньшей мере 100 дней истории лечения FVIII; в истории болезни отсутствует образование ингибиторов (нейтрализирующих антител) к экзогенному FVIII; отсутствуют известные аллергические реакции к экзогенному FVIII или любому компоненту векторной композиции rAAV.FVIII.

Перед лечением пациента с гемофилией A необходимо оценивать на наличие NAb к серотипу AAV, используемому для доставки гена hFVIII, (например, AAVhu.37 или AAVrh.10). Такие NAb могут влиять на эффективность трансдукции и снижать терапевтическую эффективность. Пациенты с гемофилией A, которые имеют базовый титр NAb ≤ 1:5 являются хорошими кандидатами для лечения с помощью протокола генной терапии rAAV.hFVIII.

Субъектам могут позволять продолжать их стандартные виды лечения (-ий) (например, терапия рекомбинантным FVIII) перед и во время лечения генной терапией по усмотрению лечащего врача. В альтернативном варианте врач может предпочесть прекратить стандартные виды лечения перед проведением лечения генной терапией и, необязательно, возобновить стандартные виды лечения в качестве котерапии после проведения генной терапии.

Желательные конечные критерии оценки схемы генной терапии определяются по увеличению активности FVIII до 3 % от нормы от базового уровня в течение до 52 недель после проведения лечения генной терапией. В одном варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII (например, 5 % или выше) после лечения с помощью rAAV.hFVIII, самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения. В другом варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII 10 %, 15 %, 20 % или выше после лечения с помощью rAAV.hFVIII самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения. В другом варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 95 % или выше после лечения с помощью rAAV.hFVIII самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения.

Несмотря на это, пациенты имеющие одну или более из следующих особенностей могут исключаться из лечения по усмотрению их лечащего врача:

1. В истории болезни серьезное заболевание печени (т. е. портальная гипертензия).

2. Серьезное воспаление или цирроз печени.

3. Подтверждение инфекции с активным вирусом гепатита B (ВГB) или вирусом гепатита C (ВГC).

4. В истории болезни инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) И любой анализ из следующего: число клеток CD4+ <350 клеток/мм³, изменение режима антиретровирусной терапии в пределах 6 месяцев до дня 0 или вирусная нагрузка в плазме >200 копий/мл в 2 отдельных случаях при измерении ПЦР.

5. Титр нейтрализирующих антител против AAVhu.37 (или против AAVrh10, соответственно) >1:5 или ≥1:10.

6. Участие (текущее или предыдущее) в другом исследовании генной терапии.

7. Участие в исследовании другого исследуемого лекарственного средства в течение 3 месяцев до скрининга.

В других вариантах реализации изобретения лечащий врач может определить, что наличие одной или более из этих физических особенностей (история болезни), не должно исключать лечение, предложенное в данном документе.

5.3. Дозирование и путь введения

В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде однократной дозы для одного пациента. В другом варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде множества доз для одного пациента. В дополнительном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде двух доз для одного пациента. В одном варианте реализации изобретения субъекту доставляется минимальная эффективная доза (МЭД) (определяемая доклиническим исследованием, описанным в данном документе в примерах). Как используется в данном документе, МЭД относится к дозе rAAV.hFVIII, требуемой для достижения 5 % от нормальной активности фактора VIII.

Как принято, титр векторов определяют на основе содержания ДНК векторного препарата. В одном варианте реализации изобретения для определения содержания ДНК препаратов векторов rAAV.hFVIII используют количественную ПЦР или оптимизированную ПЦР, как описано в примерах. В одном варианте реализации изобретения для определения содержания ДНК препаратов векторов rAAV.hFVIII используют цифровую капельную ПЦР, как описано в примерах. В одном варианте реализации изобретения дозировка составляет от около 1x10¹¹ геномных копий (ГК)/кг массы тела до около 1x10¹³ ГК/кг, включая конечные критерии оценки. В одном варианте реализации изобретения дозировка составляет 5x10¹¹ ГК/кг. В другом варианте реализации изобретения дозировка составляет 5x10¹² ГК/кг. В конкретных вариантах реализации изобретения дозировка rAAV.hFVIII, введенного пациенту составляет по меньшей мере 5 x 10¹¹ ГК/кг, 1 x 10¹² ГК/кг, 1,5 x 10¹² ГК/кг, 2,0 x 10¹² ГК/кг, 2,5 x 10¹² ГК/кг, 3,0 x 10¹² ГК/кг, 3,5 x 10¹² ГК/кг, 4,0 x 10¹² ГК/кг, 4,5 x 10¹² ГК/кг, 5,0 x 10¹² ГК/кг, 5,5 x 10¹² ГК/кг, 6,0 x 10¹² ГК/кг, 6,5 x 10¹² ГК/кг, 7,0 x 10¹² ГК/кг или 7,5 x 10¹² ГК/кг. Композиции с дефектными по репликации вирусами также можно готовить в виде дозированных единиц, содержащих количество дефектного по репликации вируса, которое находится в диапазоне от около 1,0 x 10⁹ ГК до около 1,0 x 10¹⁵ ГК. Как используется в данном документе, термин «дозировка» может относится к общей дозировке, доставляемой субъекту в ходе лечения, или количеству, доставляемому в ходе однократного (или многократных) введения (-ий).

В другом варианте реализации изобретения композицию повторно вводят в более поздний срок. Необязательно допускается более одного повторного введения. Такое повторное введение может происходить с тем же типом вектора или с другим вирусным вектором, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 6 месяцев после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 1 год после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 2 года после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 3 года после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 4 года после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 5 лет после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 6 лет после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 7 лет после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 8 лет после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 9 лет после первого введения. В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 10 лет после первого введения.

В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 1 % от нормального. В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 2% от нормального. В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 3% от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 4 % от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 5% от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % или больше от нормального.

В некоторых вариантах реализации изобретения rAAV.hFVIII вводят в комбинации с одним или более видами терапии для лечения гемофилии A, например с введением рекомбинантного FVIII.

5.4. Измерение клинических критериев

Определение эффективности лечения можно измерять экспрессией и активностью трансгена, что определяется по уровням фактора VIII в плазме и активности фактора VIII. Дополнительную оценку эффективности можно определять клинической оценкой потребности в заместительной терапии фактора VIII и частотой эпизодов спонтанных кровотечений. Такие оценивания можно проводить дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося периода времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет.

Безопасность вектора для генной терапии можно оценивать по количеству нежелательных явлений, отмеченных при медицинском осмотре изменений и/или параметров, определяемых в клинической лаборатории, оцениваемых в множество моментов времени вплоть до около 52 недели после введения вектора. Хотя физиологическое действие можно наблюдать раньше, например, через около одну неделю, в одном варианте реализации изобретения постоянные устоявшиеся уровни экспрессии достигаются до около 12 недель. Последующие оценивания можно проводить дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося периода времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет. Такие оценивания включают:

a. Медицинский осмотр

b. Электрокардиограмму (ЭКГ)

c. Биохимические анализы: Уровни электролитов в сыворотке, АМК, креатинина, кальция, фосфата, общего белка, альбумина, ЛДГ, КФК, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, билирубина

d. Гематологический анализ: ОАК и лейкограмма, профиль коагуляции

e. Общий анализ мочи

f. Иммунологическую оценку:

g. Серологическая реакция на капсид hu.37 (или капсид rh.10, соответственно) и на фактор VIII

h. Реакция T-клеток на капсид hu.37 (или капсид rh.10, соответственно) и антигены фактора VIII

i. Оценка векторной ДНК; измерения кПЦР в плазме, моче и слюне.

Увеличение hFVIII, достигаемое вместе с введением rAAV.hFVIII, можно оценивать в виде определенного процентного изменения уровня hFVIII в течение около 12 недель или в другие требуемые моменты времени, по сравнению с уровнями hFVIII у пациента, не болеющего гемофилией A, т. е. так называемыми нормальными уровнями hFVIII равными около 100 %. В другом варианте реализации изобретения изменение сравнивают с базовыми уровнями hFVIII у пациента. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 3 % от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 4% от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 5% от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 6% от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 7% от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 8% от нормального. В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 9% от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 10% от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 15% от нормального. В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 20 % или больше от нормального. В одном варианте реализации изобретения проводили исследования на панелях коагуляции как часть стандартного испытания по установлению активности FVIII.

Как используется в данном документе, вектор rAAV.hFVIII «функционально замещает» или «функционально дополняет» организм пациентов с недостаточностью по FVIII активным FVIII, когда в организме пациентов экспрессируется достаточный уровень FVIII для достижения по меньшей мере одного из этих клинических конечных критериев. Функциональное замещение могут обеспечивать уровни экспрессии hFVIII, которые достигаются всего лишь от около 1 % до менее 100 % от нормальных уровней клинических конечных критериев нормального типа у пациента без гемофилии.

В одном варианте реализации изобретения экспрессию можно наблюдать как ранний ответ через от около 8 часов до около 24 часов после введения дозы. Один или более из желаемых клинических эффектов, описанных выше, могут наблюдаться в течение от нескольких дней до нескольких недель после введения дозы.

Долговременную (до 260 недель) безопасность и эффективность можно оценивать после введения rAAV.hFVIII.

В одном аспекте предложена схема доставки генного продукта hFVIII в организм пациента-человека. Данная схема включает (a) доставку вектора rAAV.hFVIII, содержащего экспрессионную кассету, как описано в данном документе, и (b) доставку второго вектора rAAV.hFVIII, содержащего экспрессионную кассету, как описано в данном документе, причем первый рекомбинантный вектор AAV или второй рекомбинантный вектор AAV содержит капсид AAV3B. Последовательность AAV3B показана в SEQ ID NO: 20, имеющая № регистрации AAB95452.1. В одном варианте реализации изобретения один из первого или второго вектора AAV содержит капсид rh.10. В одном варианте реализации изобретения один из первого или второго вектора AAV содержит капсид AAVhu.37. Такие схемы описаны в международной заявке на патент № PCT/US16/42472, которая включена в данный документ путем ссылки.

Вирусные векторы, описанные в данном документе, можно использовать для получения лекарственного средства для доставки hFVIII нуждающемуся в этом субъекту (например, пациенту-человеку), как поставляющие функциональный hFVIII субъекту и/или для лечения заболевания гемофилией A.

В другом аспекте для лечения гемофилии A предложен вектор rAAV.hFIII, описанный в данном документе. В одном варианте реализации изобретения для лечения гемофилии A предложено введение множества доз. В другом аспекте предложен вектор rAAV.hFIII, описанный в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения гемофилии A.

В одном варианте реализации изобретения обеспечивается второе введение вектора rAAV.hFVIII. В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет тот же капсид AAV, который дается с первой дозировкой. В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет капсид AAVrh.10. В другом варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет отличающийся от вектора первой дозы капсид AAV. В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения обладает тропизмом в отношении печени. В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет капсид AAV3B.

В дополнительном аспекте в изобретении обеспечивается нацеливание на гепатоциты пациента.

В одном аспекте доставка первого rAAV и второго rAAV временно разделяется периодом в по меньшей мере один месяц, по меньшей мере около трех месяцев или от около 1 года до около 10 лет.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

6. Пример 1. Доклиническое исследование

6.1 Вектор hFVIII

В отличие от человеческого фактора FIX (hFIX) кДНК hFVIII намного больше и необходимо вносить изменения для подгонки этого трансгена к стандартному геному AAV. Так как трансген hFVIII с удаленным B-доменом (BDD) и с исключением других необходимых элементов транскрипции содержит 1457 аминокислот, то вектор AAV все еще имеет ограниченную емкость упаковки. Следовательно, были предприняты шаги для снижения размера других элементов, включая элементы контроля экспрессии трансгена.

Для ограничения экспрессии hFVIII в печени при сохранении размера элементов насколько возможно меньшими с целью получения 42 комбинаций энхансеров/промоторов было укорочено и скомбинировано несколько сильных специфических для печени промоторов с сочетаниями до трех специфических для печени энхансерных последовательностей. После введения векторов AAV на мышах FVIII KO оценивали активность и иммуногенность hFVIII данного трансгена.

6.1.1 Продукция векторов AAV для доклинического исследования

Получали 42 плазмиды, содержащие одну из комбинаций энхансера/промотора. Получали 14 энхансерных комбинаций, используя три энхансерные последовательности; En34 (коровый энхансер размером 34 п. н. аполипопротеина человека из контрольной области печени), ABPS (укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP]) и EnTTR (энхансерная последовательность размером 100 п. н. из транстиретина). Ряд энхансерных комбинаций ограничен из-за общего размера ITR-ITR и комбинации энхансеров в следующей последовательности: 5’-EnTTR-ABPS-En34-промотор-3’. Таблица 1. Каждую из 14 энхансерных комбинаций вставляли выше по ходу транскрипции от одного из трех промоторов: TBG-S1 (P1, укороченная версия специфического для печени промотора тироксин-связывающего глобулина или TBG), A1AT (P2, модифицированный промотор SERINA1 [α1-антитрипсин]) и TTR (P3, промотор транстиретина). Полученные конструкции были сконструированы для экспрессии кодон-оптимизированной версии человеческого белка-фактора FVIII, у которой удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот hFVIIIco-SQ (SEQ ID NO: 2).

Все векторы AAV получали, как описано в Gao G, Lu Y, Calcedo R, et al. Biology of AAV serotype vectors in liver-directed gene transfer to nonhuman primates. Mol Ther. 2006;13(1):77-87, которая включена в данный документ путем ссылки. Вкратце, экспрессирующие hFVIII плазмиды из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов упаковывали с вирусным капсидом AAVrh10. Экспрессирующие hFVIII плазмиды из E06.TTR также упаковывали в вирусные капсиды AAV8, AAV9, AAVhu37 и AAVrh64R1.

6.1.2 Анализ векторов методом ДСН-ПААГ-электрофореза

Серии векторов AAVrh10 с комбинациями энхансеров/промоторов, использованные в исследовании, подвергали оценке на чистоту методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), как описано в Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther. 2010;21(10):1259–1271, которая включена в данный документ путем ссылки. Вкратце, на ДСН-ПААГ наносили денатурированные и восстановленные векторные образцы, содержащие 5x10⁹ ГК. Белки окрашивали красным красителем SYPRO (Invitrogen, г. Карслбад, штат Калифорния, США) с последующей фиксацией, визуализацией, а затем количественным определением с использованием системы для анализа изображений Syngene и программного обеспечения GeneTool (Syngene, г. Фредерик, штат Мэриленд, США). Рассчитывали процент чистоты капсида (белки (VP1, VP2 и VP3, определяемые к общему белку). Процентное значение чистоты 42 векторов находилось в диапазоне от 29 % (AAVrh10.E12.P3) до 100 %, со средним значением чистоты равным 90 % (данные не показаны).

6.1.3 Мыши

Размножающиеся пары мышей FVIII KO получали у The Jackson Laboratory (г. Бар Харбор, штат Мэн, США) и колонию поддерживали в Лабораториях исследования трансляции университета штата Пенсильвания, размещая в специальных условиях без проникновения патогенов). Все процедуры и протоколы обхождения с животными утверждены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) университета штата Пенсильвания. Самцам FVIII KO в возрасте 6–12 недель в/в в хвостовую вену инъецировали 10¹⁰ ГК вектора на мышь. Разбавляли вектор в фосфатно-солевом растворе (ФСБ) и инъецировали 100 мкл этого разведения вектора. Каждые две недели собирали плазму в пробирки для сбора с цитратом натрия путем отборов крови из ретроорбитального синуса.

6.1.4 Определение активности hFVIII

В плазме измеряли активность hFVIII с помощью набора COATEST SP4 в соответствии с протоколом производителя (DiaPharma, штат Огайо, США). На неделю 2 после инъекции у мышей обнаруживали широкий диапазон активности hFVIII 0,12–2,12 ИЕ/мл (ФИГ. 5).

Среди прочих пять конструкций демонстрировали значительное увеличение уровней активности: E03.TTR, E05.A1AT, E05.TTR, E06.TTR и E12.A1AT (ФИГ. 5A). Вариация уровней активности hFVIII, отмеченная на неделе 2, возникла перед образованием антител к трансгену (ФИГ. 5B). Следовательно существовали зависимые от конструкции значительные отличия в уровнях активности.

6.1.5 Выявление IgG против hFVIII в плазме мышей

Антитела-IgG против hFVIII в плазме мышей измеряли методом твердофазного ИФА, причем все реактивы были получены, если не указано иное, у Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури, США). Планшеты для твердофазного ИФА покрывали 1 мкг/мл BDD-hFVIII-SQ (Xyntha, Wyeth Pharmaceuticals Inc., г. Даллас, штат Техас, США) в 0,1 M карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Промывали лунки пять раз с помощью 0,05 % Твина 20 в ФСБ и блокировали их с помощью 5 % обезжиренного молока (Bio Rad, г. Геркулес, штат Калифорния, США) в ФСБ в течение одного часа при комнатной температуре. После удаления блокирующего буфера образцы плазмы, разбавленные в 5 % обезжиренном молоке, добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. В качестве контроля использовали образцы плазмы, полученные от наивных мышей. Затем планшеты промывали пять раз и добавляли конъюгированный с HRP IgG против антител мыши при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке. После инкубации при комнатной температуре в течение 90 минут планшеты промывали восемь раз и для выявления добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ). После выдержки в течение 5 минут при комнатной температуре останавливали реакцию с использованием 2N серной кислоты, и планшеты считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов BioTek µQuant (г. Уинуски, штат Вермонт, США).

У мышей FVIII KO отмечено образование антител к hFVIII на неделю 4 после введения вектора, а на неделю 8 у мышей в большинстве из 42 групп векторов обнаружили выявляемые уровни IgG против hFVIII с соответствующим снижением уровней активности hFVIII (ФИГ. 6). Временная динамика активности hFVIII и образования антител, количественно определенная по титру, представлена на ФИГ. 7 и 8, соответственно. Более 50 % мышей, которым инъецировали конструкции E05.A1AT, E10.A1AT и все промоторы с комбинацией энхансеров E06, синтезировали антитела к трансгену на неделю 8. Однако антитела к трансгену были обнаружены не во всех группах. Для 6 из 42 векторных групп (E11.TTR, E13.TBG-S1, E13.A1AT и все конструкции с использованием E01) на неделе 8 не было выявлено антител к hFVIII (ФИГ. 6), а у двух групп не было обнаружено выявляемых антител на протяжении 12 недель исследования (E01.A1AT и E11.TTR). Выполняли также анализ времени до наступления события для образования антител к hFVIII. У мышей, которым инъецировали вектор с использованием для экспрессии E01.A1AT, E11.TTR, E01.TBG-S1, E11.A1AT и E13.TBG-S1, оказалось самое длительное время до экспрессии антител, тогда как конструкции, содержащие E06.TTR, E06.A1AT, E05.A1AT, E09.TBG-S1 и E14.TTR показали самое короткое время до экспрессии антител.

6.1.6 Статистический анализ

Для выявления сходных групп лечения, в соответствии с активностью hFVIII в плазме на неделю 2, анализировали данные с использованием модели дисперсионного анализа (ANOVA) с одним фиксированным критерием с ретроспективными анализами с критерием Тьюки для идентификации средних уровней активности, которые отличаются друг от друга. Выполняли анализ времени до наступления события — образования антител против hFVIII.

6.1.9 Сравнение активности и иммуногенности для различных капсидов AAV

Далее определяли разницу в уровнях активности и устанавливали потенциальное распределение по иммуногенности использованных капсидов AAV. Для этого исследования был отобран наиболее иммуногенный геном из предыдущих исследований — E06.TTR. Интересно, что эта конструкция продуцировала значительно более высокую экспрессию, чем большинство других конструкций на неделю 2, но в последующие недели образовывались антитела против трансгена hFVIII у 80 % мышей с инъекциями конструкций.

Тот же самый векторный геном с использованием энхансерной комбинации E06 со специфическим для печени промотором TTR упаковали с одним из пяти капсидов AAV; AAVrh10, AAV8, AAV9, AAVhu37 и AAVrh64R1. Снова мышам FVIII KO в/в инъецировали дозу 10¹⁰ ГК на мышь и в течение всего 12-недельного исследования отслеживали уровни активности hFVIII в плазме и титры IgG против hFVIII. Четкие различия в экспрессии и иммуногенности трансгена видны на основе вектора AAV, используемого для переноса гена (ФИГ. 9). На неделю 2 после введения вектора активность hFVIII в плазме варьировала от 0,51 ИЕ/мл после введения AAVrh64R1 до 1,26 ИЕ/мл после AAVrh10 (ФИГ. 9A). В течение проведения исследования у нескольких мышей синтезировались антитела против hFVIII в диапазоне от 20 % мышей, которым ввели векторы AAV8 или AAV9, до 63 % мышей, которые получили AAVrh10 (ФИГ. 9B). Следовательно даже с высокоиммуногенной комбинацией энхансера и промотора иммунный ответ к трансгену может варьировать в зависимости от капсида AAV, использованного для переноса гена.

6.1.10 Обсуждение

Предыдущие исследования мышей FVIII KO, у которых для экспрессии использовался промотор HLP, не выявили антитела к трансгену на протяжении всего исследования. Данная промоторная последовательность HLP сходна с такой у комбинации энхансера/промотора E01.A1AT, причем у мышей, которым вводили этот вектор AAVrh10 не обнаружили выявляемых антител на протяжении 12 недель исследования. К сожалению, активность этого вектора у мышей FVIII KO была относительно низкой только с выявляемыми 0,189 ИЕ/мл в плазме на неделе 2 после введения вектора и пиковым уровнем 0,303 ИЕ/мл на неделе 6.

Интересно, что капсид AAV, используемый для переноса гена из той же трансгенной кассеты значимо влиял как на иммуногенность к hFVIIII, так и на пиковую активность hFVIII. Для того чтобы исследовать влияние капсида на образование антител против hFVIII была использована наиболее иммуногенная трансгенная кассета (E06.TTR). Пять исследованных векторных капсидов можно разделить на две группы: в одной у ≤ 20 % мышей синтезировались антитела против hFVIII (AAV8 и AAV9), а в другой у > 20 % мышей вырабатывалась гуморальная иммунная реакция (AAVrh10, AAVhu37 и AAVrh64R1). Переносимость по отношению к трансгену hFVIII, связанная с капсидом AAV8, вероятно оказывается ожидаемой благодаря предыдущим исследованиям, которые демонстрируют, что в/в доставка этого капсида может активировать специфические к трансгену регуляторные T-клетки в контексте толерогенной природы печени. В дополнение к этому авторы раннее показали, что не существует выявляемых ингибиторов FIX после в/м инъекции AAV8 у мышей с гемофилией B. Следовательно даже с высокоиммуногенной комбинацией энхансера и промотора иммунный ответ к трансгену может варьировать в зависимости от капсида AAV, использованного для переноса гена.

Уровни активности hFVIII в плазме после введения пяти различных капсидов AAV также значительно варьировали от 0,51 ИЕ/мл с AAVrh64R1 до 1,26 ИЕ/мл с AAVrh10 на неделю 2 после введения векторов. Экспрессия вектора AAVrh10 была значительно увеличенной по сравнению с AAV8 и совпадала с образованием антител против hFVIII у 63 % мышей. Эта сравнительное исследование капсидов выполняли с использованием высокоиммуногенной трансгенной кассеты, и вероятно оно не моделирует то, что наблюдается у людей, для которых у ~30 % пациентов образуются антитела к рекомбинантному белку. Следовательно высокие уровни экспрессии, продуцируемые после введения вектора AAVrh10, могут быть более выгодными для клинической ситуации, при которой может требоваться низкая доза вектора для значимых улучшений в отношении возникновения событий кровотечения и дополнительного введения рекомбинантного белка hFVIII.

По результатам этого исследования для дополнительного изучения были выбраны конструкции E03.TTR (ФИГ. 1; SEQ ID NO: 13), E03.A1AT (ФИГ. 3; SEQ ID NO: 15), E12.TTR (ФИГ. 2; SEQ ID NO: 14) и E12.A1AT (ФИГ. 4; SEQ ID NO: 16).

6.2 Исследования по определению дозировок

6.2.1 Исследования на мышах FVIII KO для определения приблизительной МЭД

Мыши FVIII KO линий C57BL/6 и 129 исходно получают в хвостовую вену инъекцию одной из четырех доз AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75. Дозы таких векторов составляют 5x10¹⁰ ГК/кг, 5x10¹¹ ГК/кг, 5x10¹² ГК/кг и 5x10¹³ ГК/кг. В качестве контроля носителя включена когорта животных, получающая только контрольный препарат (буфер-носитель). После введения вектора ежедневно исследуют животных путем общего осмотра. У животных в соответствующие моменты времени отбирают кровь для определения уровней активности hFVIII. Животных из подгруппы A умерщвляют на день 60 после введения доз, животных из подгруппы B умерщвляют на день 28 после введения доз, а животных из подгруппы C умерщвляют на день 3 после введения доз. Кровь также собирают при аутопсии для химического анализа сыворотки с помощью панелей и гематологического анализа. Умерщвленных животных вскрывают и отбирают органы для изучения биораспределения и гистопатологии, такие как правый паховый лимфоидный узел, правое яичко, поджелудочная железа, двенадцатиперстная кишка, толстая кишка, головной мозг, правая икроножная мышца, желудок, правая почка, правое легкое, селезенка, сердце, печень и обширные поражения, если они есть. Из органов мышей, которые получали самую высокую дозу вектора и которые получали контрольный препарат, экстрагируют общую клеточную ДНК и РНК. Выполняют анализы кПЦР и ОТ-кПЦР на экстрагированной ДНК/РНК для измерения количества копий векторного генома и уровни транскриптов в этих органах, соответственно. Эффективность исследуемого препарата определяют по уровням активности в плазме белка hFVIII анализом COATEST. Антитела против hFVIII также повторно определяют анализом твердофазного ИФА с IgG против hFVIII, а внешний путь коагуляции оценивают в анализе определения протромбинового времени (PT).

6.3 Исследования на нечеловеческих приматах (NHP)

6.3.1 Исследования экспрессии на NHP

Первичной целью этого не предусматривающего требований GLP исследования является оценивание потенциального вектора относительно токсичности и биораспределения у NHP.

Для этого исследования использовали самцов макака-резус и яванского макака. В этом исследовании использовали только животных самцов поскольку гемофилия A является сцепленным с X-хромосомой генетическим нарушением. В начале исследования у всех макак наблюдали титры NAb <1:5, определенные как описано раннее(CALCEDO et al. (2009) Worldwide epidemiology of neutralizing antibodies to adeno-associated viruses. J Infect Dis, 199, 381-90).Перед введением вектора макаки получали анестезию смесью кетамина (10–15 мг/кг) и дексмедетомидина (0,05–0,10 мг/кг), инъецируемую в/м. Макакам в/в вводили векторы через подкожную вену бедра.Перед началом исследования и дважды в неделю в течение исследования путем пункции бедренной вены отбирали образцы крови. Все клинические анализы по определению патологии в образцах крови проводили в Antech Diagnostics (г. Ирвайн, штат Калифорния, США), включая полный анализ крови и лейкограмму, полные клинические химические показатели и панели коагуляции.

На NHP выполняли пилотные исследования экспрессии hFVIII. Двум макакам-резус и двум яванским макакам в/в вводили 3x10¹² ГК/кг AAVrh10 (ФИГ. 10A) и AAVhu37 (ФИГ. 10B) векторы, экспрессирующие hFVIII из комбинации энхансера/промотора ABP2.TGB-S1, соответственно. У всех животных отмечена высокая пиковая экспрессия, но до недель 6–8. У макак, которым инъецировали AAVrh10, наблюдали гуморальный иммунный ответ к hFVIII. У одного животного, которое получило AAVhu37, была задержка в образовании антител против hFVIII, которая происходила на 12 неделю после введения вектора, и они не образовывались у других животных в течение всего хода исследования. За макаком, который получал AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA7, наблюдали в течение 35 месяцев после введения (ФИГ. 22–24).

На основании исследований на мышах FVIII KO и этого пилотного исследования на макаках-резус, отобрали две из исходных 42 комбинаций энхансеров/промоторов для дополнительной оценки на яванский макаках, используя для экспрессии разные капсиды клада E.

6.3.2 Дополнительные исследования на NHP

Далее 20 самцам яванского макака вводили дозы одного из четырех векторов: AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75 и AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75 (n = 5 макак на вектор). Вектор в/в вводили в дозе 1,2x10¹³ ГК/кг (на основе среднего титра по окПЦР). На неделю 2 после введения векторов наблюдали пиковую экспрессию равную 37 % от нормальных уровней FVIII для одного капсида плюс комбинации энхансера/промотора, которая потом выходила на плато 20 % от нормы (ФИГ. 11). В то время когда антитела к hFVIII выявляли у большинства макак на неделю 8, антитела не выявлялись у двух животных на неделю 30 после введения вектора (ФИГ. 12). Эти методы обсуждаются ниже.Применяя анализ времени до наступления события для образования антител, определили, что существует значимая разница между AAVrh10 и AAVhu37 (ФИГ.14).

6.3.3 Определение экспрессии hFVIII в плазме NHP

Экспрессию hFVIII измеряли методом твердофазного ИФА, причем все реактивы были получены, если не указано иное, у Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури, США). Планшеты для твердофазного ИФА покрывали IgG против hFVIII (Green Mountain Antibodies, штат Вермонт, США) при разведении 1:500 в 0,1 M карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Промывали лунки четыре раза с помощью 0,1 % твина 20 в ФСБ и блокировали их с помощью 5 % обезжиренного молока (Bio Rad, г. Геркулес, штат Калифорния, США) в ФСБ в течение одного часа при комнатной температуре. После удаления блокирующего буфера образцы плазмы, разбавленные в 5 % обезжиренном молоке, добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали четыре раза и добавляли IgG против hFVIII (ThermoFisher Scientific, штат Массачусетс, США) при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре планшеты промывали четыре раза и добавляли конъюгированный с HRP IgG против антител овцы при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке. После инкубации при комнатной температуре в течение 90 минут планшеты промывали пять раз и для выявления добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ). После выдержки в течение 5 минут при комнатной температуре останавливали реакцию с использованием 2N серной кислоты, и планшеты считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов BioTek µQuant (г. Уинуски, штат Вермонт, США). На ФИГ. 11.

Результаты долговременной стабильной экспрессии человеческого FVIII у яванского макака (35 месяцев) после однократной внутривенной инъекции AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 показаны на ФИГ. 22. Результаты показывают стабильную экспрессию до аутопсии через 35 месяцев. Результаты исследования активности ферментов печени показаны на ФИГ. 23. Данные результаты показывают, что уровни активности ферментов печени находятся в пределах диапазона нормы, за исключением временного повышения после биопсии печени. Реакция образования нейтрализующих антител (Nab) на капсид AAVhu.37 показана на ФИГ. 24.

Применяли технологию с использованием одиночных клеток для выявления ДНК и РНК вектора AAV в гепатоцитах NHP M11269, упомянутого выше, который получил внутривенное введение AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 в дозе 3E12 ГК/кг. Для оценки наличия геномов и экспрессии AAV выделяли одиночные клетки гепатоцитов. Через 150 недель после введения вектора выделяли гепатоциты из клиновидного фрагмента печени путем перфузии со смесью коллагеназы/протеазы. Одиночные клетки распределяли в отдельные лунки 96-луночного планшета. Для клеток из одного 96-луночного планшета провели амплификацию целого генома (WGA), а геномы AAV в клетках количественно определяли методом цифровой ПЦР, используя зонд к FVIII человека. Второй 96-луночный планшет был использован для целых амплифицированных транскриптом (WTA) для оценки экспрессии FVIII.

Результаты показаны в таблице 3. Геномы AAV можно было выявить у ~25 % выделенных одиночных клеток. Экспрессию РНК обнаружили только у ~4 % или 20 % клеток, которые приняли ДНК. Экспрессирующие РНК клетки можно разделить на два типа с низкой и высокой экспрессией. Остается неясно, почему значительное количество клеток приняло вектор, но не способно экспрессировать трансген. Эти результаты были подтверждены исследованиями с гибридизацией in situ, выполненными на подложке CMC (данные не показаны).

Таблица 3. Процент ДНК и РНК у одиночных позитивных клеток
Одиночная клетка (w152)	Образец	Позитивных/общее кол-во	Процент позитивных
	ДНК	23/96	24 %
	РНК	4/96	4%
РНК/ДНК-позитивные клетки	4/23	17%
гомогенат печени	Образец	биоптат w42	аутоптат w152
	ДНК (ГК/клетку)	10	7.6 +/-1.1
РНК hFVIII (копий в мкг РНК)	4.4 +/- 1.1 E4	6.4 +/- 0.7E4

6.3.4 Выявление IgG против hFVIII в плазме NHP

Антитела-IgG против hFVIII в плазме NHP измеряли методом твердофазного ИФА, как описано раннее, за исключением добавления для выявления конъюгированного с HRP IgG против антител NHP в разведении 1:2000 в обезжиренном молоке (ФИГ. 12).

6.3.5 Выявление титров анализом Бетезда в плазме NHP

Ингибирующее антитело против FVIII человека измеряли модифицированным Ниджмегеном (Nijmegen) анализом Бетезда (Giles et al., 1998). Одна единица Бетезда представляет ингибирование коагуляционной активности нормальной человеческой плазмы на 50 %.

6.3.6 Проведение биопсии печени

Двум NHP из каждой группы проводили биопсию печени, выполняемую минилапаротомией на неделю 5 после введения вектора. Выбор животных основывался на экспрессии hFVIII в плазме на неделю 4. Первое отобранное животное представляло собой животное с медианным уровнем hFVIII, второе отобранное животное представляло собой животное с ближайшим уровнем hFVIII или вторым ближайшим (если ближайший был медианным) к среднему значению. Отбирали образцы ткани печени для гистопатологического исследования, биораспределения вектора и анализа трансгенной мРНК. На день 3 после биопсии печени отбирали кровь для общего анализа крови и лейкограммы, полного анализа клинических химических показателей и панелей коагуляции.

6.3.7 Протокол иммуносупрессии

Начинали схему иммуносупрессии, в объеме необходимом животным, когда после введения вектора возможность выявлять экспрессию hFVIII была утрачена в присутствии выявляемых антител к hFVIII (единица Бетезда >1). Схему иммуносупрессии выполняли с ритуксимабом (250 мг/м², в/в с интервалами в 4 недели, всего 4 инфузии) и циклофосфамидом (300 мг/м², медленная внутривенная инфузия каждые 15 дней, всего 8 доз в течение 4 месяцев), как описано раннее(Mcintosh et al. (2013) Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant. Blood, 121, 3335-44.).

6.3.8 Биораспределение вектора

Во время проведения аутопсии быстро замораживали образцы тканей (паховые лимфоузлы, поясничные лимфоузлы, мышца [правая икроножная], правое яичко, поджелудочная железа, правая почка, селезенка, правое легкое, сердце и печень) мышей C57BL/6J и экстрагировали ДНК с использованием мининабора для выделения ДНК QIAamp (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния, США). Выполняли выявление и количественное определение геномных копий (ГК) векторов в экстрагированной ДНК и относительную экспрессию транскриптов hFVIII в экстрагированной РНК методом ПЦР в реальном времени, как описано раннее. Вкратце, векторные ГК и РНК количественно определяли с использованием праймеров/зонда, предназначенных для трансгенной последовательности hFVIII вектора. Количественное определение ГК из печени выполняли на одном образце печени из каждой мыши (n = 3/группу). Относительную экспрессию транскриптов РНК определяли с использованием ΔΔCT каждого образца, нормализованного по экспрессии 18S.

Биораспределение векторов оценивали для субпопуляции из 18 векторов AAVrh10 с вариантами энхансеров/промоторов. Векторы AAVrh10, экспрессировавшие hFVIIIco IV, вводили в дозе 10¹¹ ГК на мышь в организм от 6 до 8 недельных мышей C57BL/6J дикого типа. Мышам проводили аутопсию на день 14 после введения векторов и отбирали мышцу (правую икроножную), правое яичко, поджелудочную железу, правую почку, селезенку, правое легкое, сердце и печень. Экстрагировали ДНК и РНК и количественно определяли уровни векторных ГК и транскриптов РНК, соответственно, с использованием праймеров/зонда, предназначенных для трансгенной последовательности hFVIII вектора. Не обнаружено значимых отличий в печени для уровней векторных ГК (Фиг. 20A) или РНК-транскриптов (ФИГ. 20B) среди получавших векторы групп, и отсутствовали выявляемые количества ГК и РНК в получавших контрольный препарат (ФСБ) групп. Однако отмечена тенденция к повышенным уровням транскриптов РНК в печени для векторов, в которых для экспрессии использован промотор A1AT, независимо от энхансерных последовательностей (ФИГ. 20B). Для других отобранных тканей уровни РНК-транскриптов hFVIII были в среднем в 1000 раз ниже, чем в печени, но высокая экстрагепатическая экспрессия отмечалась в мышцах и сердцах мышей C57BL/6J после введения E01.TBG-S1, E02.A1AT, E09.A1AT и E09.TTR (ФИГ. 21).

6.4. Исследование вектора

Выполняли анализы по определению характеристик, включающие идентификацию серотипа, содержание пустых частиц и идентификацию продукта трансгена. Описания всех этих анализов приведены ниже.

6.4.1 Титр геномных копий (ГК)

Для определения титра геномных копий использовали оптимизированную количественную ПЦР (окПЦР) путем сравнения распознаваемого плазмидного стандарта. В анализе окПЦР применяли последовательное расщепление с помощью ДНКазы I и протеиназы K с последующим проведением анализа кПЦР для измерения инкапсидированных векторных геномных копий. Выявления ДНК выполняли с использованием специфических к последовательности праймеров, таргетирующих полиA-область PA75, в комбинации с флуоресцентно меченным зондом, гибридизирующимся с той же областью. Сравнение стандартной кривой плазмидной ДНК позволяет проводить определение титров без необходимости какой-либо манипуляции с образцом после ПЦР. В данном анализе были применены ряд стандартов, образцов для валидации и контролей (для фонового уровня и загрязнения ДНК). Для этого анализа провели квалификацию путем принятия и определения аналитических характеристик, включающих чувствительность, предел обнаружения, диапазон количественного определения и межлабораторную и внутрилабораторную прецизионность анализа. Была квалифицирована внутренняя эталонная серия AAVrh.10 и использована для выполнения количественных исследований.

6.4.2 Идентификация векторных капсидов Масс-спектрометрия капсида AAV из VP3

Подтверждение серотипа AAV2/hu.37 или AAV2/rh.10 вектора достигали исследованием на основе анализа пептидов белка капсида VP3 методом масс-спектрометрии (МС). В данном методе использовали мультиферментное расщепление (трипсин, химотрипсин и эндопротеаза Glu-C) полосы белка VP3, вырезанной из гелей ДСН-ПААГ с последующим определением характеристик СВЭЖХ-МС/МС на масс-спектрометре Q-Exactive Orbitrap для секвенирования капсидного белка. Разработали метод тандемной масс-спектрометрии (МС), позволяющий проводить идентификацию определенных загрязняющих белков и выводить пептидную последовательность из масс-спектров.

6.4.3 Соотношение пустых-полных частиц

Профили векторных частиц получали с использованием скорости седиментации при аналитическом ультрацентрифугировании (AUC), измеренной на аналитической центрифуге, что является превосходным методом для получения информации о гетерогенности макромолекулярной структуры, отличия при подтверждении и состояния ассоциации или агрегации. Образец вносили в ячейки и проводили седиментацию при 12 000 об/мин на аналитической центрифуге Beckman Coulter Proteomelab XL-I. Каждые две минуты в течение 3,3 часов записывали сканы показателей преломления. Анализировали данные с помощью модели c(s) (программа Sedfit) и рассчитывали коэффициенты седиментации, построенные по отношению к нормализованным значениям c(s). Должен наблюдаться основной пик, представляющий мономерный вектор. Появление пиков, мигрирующих медленнее основного мономерного пика, показывает пустые/неправильно собранные частицы. Коэффициент седиментации пика пустых частиц определяют с использованием препаратов с пустыми частицами AAV8. Прямое количественное определение основного мономерного пика и предшествующих пиков обеспечивает определение соотношения пустых-полных частиц.

6.4.4 Инфекционный титр

Для определения продуктивного поглощения и репликации вектора в клетках RC32 (клетки HeLa, экспрессирующие rep2) использовали анализ инфекционных единиц (ИЕ). Вкратце, клетки RC32 в 96-луночных планшетах совместно инфицировали серийными разведениями вектора и одинаковым разведением Ad5 с 12 репликатами для каждого разведения rAAV. Через 72 часа после инфицирования клетки лизировали и выполняли кПЦР для выявления амплификации векторов rAAV превышающей исходное введение. Для определения репликативного титра, выраженного в ИЕ/мл, выполняли расчет конечного разведения TCID50 (Спирмена-Кербера). Поскольку значения «инфекционности» зависят от вида частиц, входящих в контакт с клетками, связывания рецепторов, интернализации, транспорта в ядро и репликации генома, они находятся под влиянием конфигурации анализа и наличия соответствующих рецепторов и механизмов ответа после связывания в используемой линии клеток. Рецепторы и механизмы ответа после связывания, критически важные для импорта векторов AAV, обычно поддерживаются в иммортализированных линиях клеток, и поэтому анализы титров инфекционности не являются абсолютным показателем количества присутствующих «инфекционных» частиц. Однако соотношение инкапсидированных ГК к «инфекционным единицам» (описанным как соотношение ГК/ИЕ) можно применять как показатель однородности продукта от серии к серии.

7. Пример 2. Протокол лечения людей

Этот пример относится к лечению генной терапией пациентов с генетически подтвержденной сцепленной с Х-хромосомой гемофилией A из-за мутаций в гене фактора свертывания 8 (FVIII). В этом примере вектор для генной терапии, AAVhu.37.hFVIII, дефектный по репликации аденоассоциированный вирусный вектор hu.37 (AAVhu.37), экспрессирующий hFVIII, вводили пациентам с гемофилией A. Эффективность лечения можно оценивать с использованием уровней FVIII, как заменителе показателя трансгенной экспрессии. Первичные оценки эффективности включают уровни FVIII через около 12 недель после лечения с сохранением эффекта после этого в течение по меньшей мере 1 года. Долгосрочную безопасность и сохранение трансгенной экспрессии можно определять в образцах биопсии печени после лечения.

7.1. Вектор для генной терапии AAV.hFVIII

7.1.1. AAVhu.37.hFVIII

Вектор AAVhu.37.hFVIII состоит из активного ингредиента вектора AAV и буфера лекарственной формы. Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип hu.37, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в ожидаемом соотношении 1:1:10. Капсид содержит рекомбинантный геном вектора AAV (rAAV) из одноцепочечной ДНК (ФИГ.1–ФИГ.4).

Геном содержит трансген человеческого фактора VIII (FVIII), фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Кодон-оптимизированный трансген FVIII человека с удаленным B-доменом содержит энхансер, промотор, кодирующая человеческий фактор VIII (hFVIII) последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA). ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV. В одном варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется промотором транстиретина (SEQ ID NO: 7). В другом варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется модифицированным промотором A1AT (SEQ ID NO: 9). Данная конструкции включает по меньшей мере один энхансерный элемент для стимуляции промоторной активности. В одном варианте реализации изобретения включен энхансер EnTTR (SEQ ID NO: 5). В другом варианте реализации изобретения две копии энхансера ABP-S (SEQ ID NO: 6) идут за одной копией энхансера EnTTR (SEQ ID NO: 5). Включен синтетический сигнал полиA из около 75 нуклеотидов (SEQ ID NO:10) для опосредования терминации транскриптов мРНК человеческого FVIII.

Вектор представлен в виде суспензии вектора AAVhu.37.hFVIII в буфере лекарственной формы. В одном варианте реализации изобретения буфер лекарственной формы представляет собой 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).

Подробная информация о промышленном получении и определении характеристик векторов описана ниже в разделах.

7.1.2. AAVrh.10.hFVIII

Вектор AAVrh.10.hFVIII состоит из активного ингредиента вектора AAV и буфера лекарственной формы. Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип rh.10, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в ожидаемом соотношении 1:1:10. Капсид содержит рекомбинантный геном вектора AAV (rAAV) из одноцепочечной ДНК (ФИГ.1–ФИГ.4).

Геном содержит трансген человеческого фактора VIII (FVIII), фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Кодон-оптимизированный трансген FVIII человека с удаленным B-доменом содержит энхансер, промотор, кодирующая человеческий фактор VIII (hFVIII) последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA). ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV. В одном варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется промотором транстиретина (SEQ ID NO: 7). В другом варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется модифицированным промотором A1AT (SEQ ID NO: 9). Данная конструкции включает по меньшей мере один энхансерный элемент для стимуляции промоторной активности. В одном варианте реализации изобретения включен энхансер EnTTR (SEQ ID NO: 5). В другом варианте реализации изобретения две копии энхансера ABP-S (SEQ ID NO: 6) идут за одной копией энхансера EnTTR (SEQ ID NO: 5). Включен синтетический сигнал полиA из около 75 нуклеотидов (SEQ ID NO:10) для опосредования терминации транскриптов мРНК человеческого FVIII.

Вектор представлен в виде суспензии вектора AAVrh.10.hFVIII в буфере лекарственной формы. В одном варианте реализации изобретения буфер лекарственной формы представляет собой 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).

7.2. Популяция пациентов

По нескольким причинам выбранной исследуемой популяцией являются пациенты с тяжелой гемофилией A. Пациенты с тяжелой гемофилией A определены как имеющие менее 1 % от нормальной активности фактора VIII (FVIII), таким образом, требующие частых инфузий FVIII для контроля их предрасположенности к кровотечениям. Это представляет значительное затруднение в отношении ведения нормального образа жизни и, в дополнение к этому, уровни FVIII в крови проходят через хорошо известные пики и имеют снижающийся профиль, что неоптимально. Тот факт, что уровни FVIII в крови у тяжелых пациентов оказываются меньше 1 %, дает возможность легко измерять даже от низкого до умеренного увеличения уровней FVIII в крови после введения AAV.hFVIII. Недавние клинические исследования подтвердили действенность этого подхода.

Пациенты, которые являются кандидатами для проведения лечения предпочтительно представляют собой взрослых мужчин возрастом ≥18 с диагностированной умеренной/тяжелой или тяжелой гемофилией A. В одном варианте реализации изобретения пациент имеет базовую активность FVIII ≤2 % от нормальной или задокументированной истории активности FVIII ≤2 %. В некоторых вариантах реализации изобретения можно лечить пациента возрастом <18 лет. Кандидаты для лечения включают субъектов, у которых было по меньшей мере 3 эпизода с кровотечением за год, которые требуют лечения FVIII по необходимости. Другие кандидаты для лечения, включают субъектов, которых лечат FVIII в профилактическом режиме. Другие критерии демонстрируют, что для субъекта подходит лечение, включающее по меньшей мере 100 дней истории воздействия к FVIII; в истории болезни отсутствует образование ингибиторов (нейтрализирующих антител) к экзогенному FVIII; отсутствуют известные аллергические реакции к экзогенному FIX или любому компоненту AAV.hFVIII.

Получающие лечение пациенты могут иметь в сыворотке базовый уровень нейтрализующего антитела к AAVhu.37 или AAVrh.10 (соответствуют выбранному вектору) ≤ 1:5.

Субъектам могут позволять продолжать их стандартные виды лечения (-ий) (например, введение заместительного FVIII) перед и во время лечения генной терапией по усмотрению лечащего врача. В альтернативном варианте врач может предпочесть прекратить стандартные виды лечения перед проведением лечения генной терапией и, необязательно, возобновить стандартные виды лечения в качестве котерапии после проведения генной терапии.

7.3. Дозирование и путь введения

Пациенты получают однократную дозу AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII, вводимые посредством инфузии через периферическую вену. Вводимая пациенту доза AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII составляет около 5x10¹¹ ГК/кг или 1,6x10¹² ГК/кг, или 5x10¹² ГК/кг, или 1x10¹³ ГК/кг. С целью обеспечения удаления пустых капсидов из дозы AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII, которую вводили пациентам, пустые капсиды отделяют от векторных частиц путем ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия или ионообменной хроматографии во время процесса очистки вектора, как обсуждается выше.

7.4. Измерение клинических критериев

Первичное оценивание безопасности вводимого продукта. Последующие оценивания проводят дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет.

a. Медицинский осмотр

b. Электрокардиограмма (ЭКГ)

c. Биохимические анализы: Уровни электролитов в сыворотке, АМК, креатинина, кальция, фосфата, общего белка, альбумина, ЛДГ, КФК, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, билирубина

d. Гематологический анализ: ОАК и лейкограмма, профиль коагуляции

e. Общий анализ мочи

f. Иммунологическая оценка:

g. Серологическая реакция на капсид hu.37 или rh.10 и на фактор VIII

h. Реакция T-клеток на капсид hu.37 или rh.10 и антигены фактора VIII

i. Оценка векторной ДНК; измерения кПЦР в плазме, моче и слюне.

Вторичное оценивание основано на измерениях экспрессии и активности трансгена, определяемых по

a. Уровням фактора VIII в плазме и активности фактора VIII;

b. Клинической оценке потребности в заместительной терапии фактора VIII и частотой эпизодов спонтанных кровотечений.

8. Пример 3. Промышленное получение AAV.hFVIII

8.1. Используемые для продукции AAV.hFVIII плазмиды

AAVrh.10.hFVIII продуцируют трансфекцией 3 плазмидных ДНК в человеческие клетки HEK 293 MCB с помощью:

(i) векторной плазмиды, описанной в разделах 8.2.1.1–8.2.1.4

(ii) хелперной плазмиды AAV, называемой pAAV2.rh10.KanR и содержащей гены rep2 и cap rh10 AAV дикого типа, описанной в разделе 8.2.2.1, и

(iii) хелперной аденовирусной плазмиды, называемой pAdDeltaF6(Kan), описанной в разделе 8.2.3.

AAVhu.37.hFVIII продуцируют трансфекцией 3 плазмидных ДНК в человеческие клетки HEK 293 MCB с помощью:

(i) векторной плазмиды, описанной в разделах 8.2.1.1–8.2.1.4

(ii) хелперной плазмиды AAV, называемой pAAV2.hu.37.KanR и содержащей гены rep2 и cap hu.37 AAV дикого типа, описанной в разделе 8.2.2.2, и

(iii) хелперной аденовирусной плазмиды, называемой pAdDeltaF6(Kan), описанной в разделе 8.2.3.

8.2.1 Цис-плазмиды (экспрессионная конструкция векторного генома)

8.2.1.1 pAAV.E03.p3.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 1). Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV. Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.

Описание элементов последовательностей

1. Инвертированные концевые повторы (ITR): ITR AAV представляют собой последовательности, идентичные на обоих концах, но расположенные в противоположной ориентации. Функции последовательностей ITR (GenBank № NC001401) AAV2 как во отношении точки репликации векторной ДНК, так и сигнала упаковки для векторного генома, при которой функционируют AAV и аденовирусный (ad) хелпер, представлены в положении транс. По сути последовательности ITR представляют только цис-действующие последовательности, требуемые для репликации и упаковки векторного генома. Последовательность 5' ITR используется в примере вектора, показанном в SEQ ID NO: 11. Последовательность 3' ITR используется в примере вектора, показанном в SEQ ID NO: 12.

2. Промотор TTR: Транстиретиновый промотор (SEQ ID NO:7) используется для управления высокоэффективной специфической для печени экспрессии гена hFVIII.

3. Энхансер TTR (enTTR): Энхансерная последовательность размером 100 п. н. (SEQ ID NO:5) из транстиретина присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.

4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII) (SEQ ID NO: 1 демонстрирует нативную последовательность; SEQ ID NO: 2 демонстрирует кодон-оптимизированную последовательность). кДНК человеческого фактора коагуляции 8 (FVIII) кодирует фактор коагуляции, необходимый для образования сгустков крови. hFVIII представляет собой последовательность с удаленным B-доменом, в которой домен B был замещен короткой последовательностью SQ, как описано в данном документе. кДНК hFVIII является кодон-оптимизированной для экспрессии у людей.

5. Искусственный сигнал полиаденилирования: (SEQ ID NO: 10) В искусственном сигнале полиаденилирования размером 75 п. н. представлены цис-последовательности для эффективного полиаденилирования мРНК hFVIII. Этот элемент функционирует как сигнал для транскрипционной терминации, специфического события отщепления на 3’-конце образующегося транскрипта после добавления полиаденильного хвоста.

8.2.1.2 pAAV.E12.p3.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 2). Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV. Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером ABPS и enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.

Описание элементов последовательностей

1. Инвертированные концевые повторы (ITR): Такие как у 8.2.1.1

2. Промотор TTR:Такой как у 8.2.1.1

3. Энхансер: Укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP] (SEQ ID NO: 6) с двумя копиями энхансерной последовательности размером 100 п. н. из энхансера транстиретина (enTTR) (SEQ ID NO:5) присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.

4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII): Такая как у 8.2.1.1

5. Искусственный сигнал полиаденилирования: Такой как у 8.2.1.1

8.2.1.3 pAAV.E03.p2.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 3). Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV. Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется модифицированным промотором A1AT с энхансером enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.

Описание элементов последовательностей

1. Инвертированные концевые повторы (ITR): Такие как у 8.2.1.1

2. Промотор A1AT: Модифицированный промотор SERINA1 [α1-антитрипсин] (SEQ ID NO:9) используется для управления высокоэффективной специфической для печени экспрессии гена hFVIII.

3. Энхансер TTR (enTTR): Энхансерная последовательность размером 100 п. н. из транстиретина присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.

4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII): Такая как у 8.2.1.1

5. Искусственный сигнал полиаденилирования: Такой как у 8.2.1.1

8.2.1.4 pAAV.E12.p2.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 4). Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV. Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером ABPS и enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.

Описание элементов последовательностей

1. Инвертированные концевые повторы (ITR): Такие как у 8.2.1.1

2. Промотор A1AT: Такой же как у 8.2.1.3

3. Энхансер: Такой как у 8.2.1.1

4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII): Такая как у 8.2.1.1

5. Искусственный сигнал полиаденилирования: Такой как у 8.2.1.1

8.2.2 Хелперная плазмида

8.2.2.1 AAVrh10-хелперная плазмида pAAV2.rh10.KanR

Эта хелперная плазмида AAVrh10 (8036 п. н.) кодирует 4 белка rep AAV2 дикого типа и 3 капсидных белка VP AAV дикого типа серотипа rh10. Новую последовательность AAV получали из ДНК ткани печени макака-резус и установили AAV-серотип rh10. Для образования химерной упаковывающей конструкции ген cap AAV2 удаляли из плазмиды p5E18 и замещали ПЦР-фрагментом гена cap AAVrh10, амплифицированного из ДНК печени примата для получения плазмиды p5E18VD2/rh10. Следует отметить, что промотор p5 AAV, который в норме управляет экспрессией rep, перемещен в этой конструкции из 5’-конца rep к 3’-концу гена cap rh10. Это расположение служит для введения спейсера между промотором и геном rep (т. е. в остов плазмиды) для снижения регуляции экспрессии rep и увеличения способности поддерживать продукцию вектора с высокими титрами. Остов плазмиды в p5E18 взят у pBluescript KS. Все части компонентов плазмиды были проверены прямым секвенированием. Наконец, для получения pAAV2/rh10 (Kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину.

8.2.2.2 AAVhu.37-хелперная плазмида pAAV2.hu.37.KanR

Эта хелперная плазмида AAVhu.37 (8036 п. н.) кодирует 4 белка rep AAV2 дикого типа и 3 капсидных белка VP AAV дикого типа серотипа hu.37. Схематический вид плазмиды pAAV2.rh10.KanR показан ниже. Для образования химерной упаковывающей конструкции ген cap AAV2 удаляли из плазмиды p5E18 и замещали ПЦР-фрагментом гена cap AAVhu.37, амплифицированного из ДНК печени примата для получения плазмиды p5E18VD2/hu.37. Остов плазмиды в p5E18 взят у pBluescript KS. Все части компонентов плазмиды были проверены прямым секвенированием. Наконец, для получения pAAV2/hu.37 (Kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину.

8.2.3 Аденовирусная хелперная плазмида pAdDeltaF6(Kan)

Плазмида pAdDeltaF6(Kan) имеет размер 15 774 п. н. Данная плазмида содержит участки аденовирусного генома, который является важным для репликации AAV, а именно РНК E2A, E4 и VA (функции аденовируса E1 обеспечиваются клетками 293), но не содержит другие гены для репликации или структурные гены аденовируса. Плазмида не содержит цис-элементы, критически важные для репликации, такие как аденовирусные инвертированные концевые повторы и, поэтому, не предполагается возможный синтез инфекционного аденовируса. Она получена из молекулярного клона Ad5 с удаленными E1, E3 (pBHG10, на основе плазмиды pBR322). В ДНК Ad5 проводили делеции для удаления экспрессии ненужных аденовирусных генов и снижения количества аденовирусной ДНК от 32 т. н. до ~12 т. н. Наконец, для получения pAdΔF6(kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину. Идентичность этих 3 аденовирусных генов подтверждали секвенированием плазмидной ДНК, выполненным Qiagen Genomic Services на исходном плазмидном материале, который отправили в Aldevron Inc. для промышленной наработки плазмидной ДНК. Анализ ДНК выявил 100 % гомологию с 3 генными областями аденовируса типа 5 (GenBank, номер регистрации AF369965).

8.2.4 Главный банк клеток (ГБК) бактерий

ГБК бактерии для продукции этих трех продуцирующих ДНК плазмид, которые используются для поддержания производства DTX101, получали с помощью Aldevron Inc. Банки клеток получали в результате размножения выбранных культур и проводили дорогостоящие исследования для квалификации каждого ГБК бактерий, следуя СОП Aldevron в соответствии с рекомендациями CBER. Выполняли тестирования для каждой из трех плазмид и фиксировали информацию, касающуюся особенностей получения ГБК бактерий.

8.2.5 Промышленное получение плазмидной ДНК

Все плазмиды, используемые в технологическом процессе, получали с помощью Aldevron Inc. под контролем системы контроля качества GMP-S™ и инфраструктуры, использующей актуальные особенности производства cGMP; прослеживаемость, контроль за документацией и разделение материалов. Выполняли тестирования для каждой плазмиды и фиксировали информацию, касающуюся особенностей получения плазмидной ДНК.

8.2.6 Главный банк клеток (ГБК) почки эмбриона человека (HEK) 293

Клетки HEK 293 исходно созданы путем трансформации клеток HEK расщепленной ДНК аденовируса типа 5 Фрэнком Грэхемом (Frank Graham) с коллегами. Для продуцирования rAAV с высокими титрами требуются клетки, экспрессирующие генные продукты E1a и E1b. Клетки HEK293 являются адгезивными и в высшей степени трансфицируемыми с образованием высоких титров rAAV при трансфекции плазмидной ДНК.

8.3 Промышленное получение вектора AAV

8.3.1 Описание производственного процесса

1. Высаживание клеток. Для технологического процесса используют квалифицированную линию клеток 293 почки эмбриона человека. Клетки культивируют в среде, состоящей из среды Игла в модификации Дюльбекко (DMEM) с добавкой 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), облученной гамма-радиацией. Клетки являются субстратзависимыми и диссоциацию клеток выполняют с использованием TrypLE Select, реактива для диссоциации неживотных клеток. Клетки поддерживают при 37 °C (+/- 1 °C) в атмосфере 5 % (+/- 0,5 %) CO₂.

2. Временная трансфекция. Через 3 дня выращивания (среда DMEM + 10 % FBS), клеточную культуральную среду в камере Hyperstack замещают свежей бессывороточной средой DMEM и трансфецируют 3 продуцирующими плазмидами с использованием оптимизированного метода преципитации с PEI.

Полный комплекс для трансфекции ДНК-плазмид готовят в BSC для трансфекции двадцати 36-слойных камер HyperStack Corning (на серию BDS). Вначале готовят смесь ДНК/PEI, содержащую 3,0 мг векторной плазмиды pDTX.hFIX.101, 60 мг pAdDeltaF6(Kan), 30 мг хелперной плазмиды pAAV2.rh10.KanR AAV и PEI, уровня качества для GMP (PEIPro, PolyPlus Transfection SA). После интенсивного перемешивания раствору дают отстояться при комнатной температуре в течение 25 мин, а затем добавляют к бессывороточной среде для гашения реакции и потом добавляют его в 36-слойные камеры Hyperstack Corning. Среду для трансфекции распределяют между всеми 36 слоями камеры Hyperstack и клетки поддерживают при 37 °C (+/- 2 °C) в атмосфере 5 % (+/- 0,5 %) CO₂ 5 дней.

3. Сбор среды с клетками. Трансфицированные клетки и среду собирают из каждой камеры Hypertack, используя одноразовые пакеты для биопроцессов путем асептического слива среды из модулей. После сбора среды в объем ~ 80 литров добавляют MgCl₂ до конечной концентрации 2 мМ (кофактор бензоназы) и добавляют нуклеазу бензоназу (№ 1.016797.0001 по кат. Merck Group) до конечной концентрации 25 единиц/мл. Продукт (в одноразовом пакете для биопроцессов) инкубируют при 37 °C в течение 2–3 ч в инкубаторе для предоставления достаточного времени для ферментативного расщепления остаточной клеточной и плазмидной ДНК в урожае, полученном в результате процедуры трансфекции.Эту стадию выполняют для минимизации количества остаточной ДНК в готовом векторе DP.После инкубационного периода добавляют NaCl до конечной концентрации 500 мМ, чтобы способствовать выделению продукта во время фильтрации и последующей фильтрации в тангенциальном потоке.

4. Осветление. Удаляют клетки и клеточный дебрис из продукта с использованием погружной фильтровальной капсулы (1,2 мкм/0,22 мкм), присоединенной последовательно в виде набора из стерильной закрытой трубки и пакета, используемого с перистальтическим насосом. Среда проходит через капсульный фильтр Sartorius Sartoguard из PES (1,2 мкм/0,22 мкм) (Sartorius Stedim Biotech Inc.).

5. Крупномасштабная фильтрация в тангенциальном потоке. Снижение объема (в 10–20 раз) осветленного продукта достигают с использованием фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), используя специальную набор из стерильной закрытой трубки для биопроцессов, пакет и мембрану, изготовленный Spectrum Labs.

8.4 Повторное введение второго вектора

8.4.1 Повторное введение AAV3B или AAV5

Оценивали эффективность повторного введения вектора с использованием AAV3B или AAV5 у макак-резус, которых ранее лечили векторами AAVrh10 или AAV8. Векторы, показанные в таблице 4, получали, как описано ранее, когда вектор выделяли из супернатанта после тройной трансфекции в клетках HEK293 и очищали на градиенте йодиксанола. Определяли титр векторов методом цифровой ПЦР.

В исследовании на 8 группах (n=3/группу; таблица 1) было задействовано 24 макака-резус (возрастом 3–5 лет) на основании их статуса по предварительно имеющимся NAb. На день 0 макакам инъецировали 1,0x1013 ГК/кг AAV.TBG.hCG.WPRE с вектором AAV, как показано в таблице 4. На неделю 12 макаки получали вторую инъекцию 1,0x10¹³ ГК/кг AAV.TBG.hCG.WPRE с вектором AAV, как показано в таблице 4. Выполняли биопсию печени на неделю 2 и неделю 14, а аутопсию выполняли на неделю 26.

Таблица 4. Краткое описание когорт и векторов

Уровни экспрессии трансгенов (rhCG — хорионический гонадотропин макака-резус, b-субъединица; rhAFP — альфа-фетопротеин макака-резус) в сыворотке измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (твердофазный ИФА). Для измерения ДНК-копий векторов в печени выполняли анализы кПЦР на общей клеточной ДНК, экстрагированной из образцов печени, собранных во время биопсии и аутопсии печени. Выполняли анализ на NAb к AAV как описано раннее. Для визуализации окрашивали срезы печени антителом против CG.

На ФИГ. 15 показано сравнение уровней экспрессии rhCG векторами AAVrh10, AAV8, AAV3B и AAV5 (первая инъекция вектора). На ФИГ. 16A–16D показаны ДНК-копии векторов rhCG в печени в различные моменты времени. На ФИГ. 17A–17B показаны уровни rhAFP после повторного введения (вторая инъекция вектора) векторов AAV3B (ФИГ. 17A) или AAV5 (ФИГ. 17B), экспрессирующих rhAFP. На ФИГ. 18A и ФИГ. 18B показаны геномные копии вектора rhAFP в печени. На ФИГ. 19 показаны различные Nab-ответы на AAV у макак.

У наивных животных векторы клада E (AAVrh10 и AAV8) продемонстрировали наибольшие уровни перипортального переноса генов по сравнению с векторами AAV5 с наименьшими уровнями; перипортальная зона располагается ближе всего к входу кровотока, получает наиболее оксигенированную кровь и является самой важной областью печени для обеспечения метаболических процессов. Векторы AAVrh10 и AAV5 проявили более высокие уровни нейтрализирующих антител (NAb), чем AAV8 и AAV3B. У серонегативных животных отмечена значимая вариация экспрессии трансгенов, включая AAV3B, среди разных животных. В течение исследованного короткого временного промежутка оказывается, что образующееся к AAVrh10 NAb, впоследствии ингибировало трансдукцию in vivo серологически отличающегося серотипа AAV3B; а предыдущее воздействие AAV8 не влияло на трансдукцию AAV3B.

Все публикации, цитируемые в этом описании, а также предварительных заявках на патенты США с номерами 62/323,336, 62/331,807 и 62/428,866, включены в данный документ путем ссылки. Аналогичным образом, номера SEQ ID NO, которые упомянутые в данном документе и оказываются в прилагаемом перечне последовательностей и самом перечне последовательностей, включены путем ссылки. Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты реализации изобретения, следует понимать, что можно выполнять различные модификации, не отступая от сущности данного изобретения. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

(Перечень последовательностей в произвольном формате)

Следующая информация представлена для последовательностей в произвольном формате под числовым идентификатором <223>.

SEQ ID NO: (содержит произвольный формат)	Произвольный формат под <223>
4	<223> сконструированная последовательность
5	<223> сконструированная последовательность
6	<223> сконструированная последовательность
7	<223> сконструированная последовательность
8	<223> сконструированная последовательность
9	<223> сконструированная последовательность
10	<223> сконструированная последовательность
11	<223> сконструированная последовательность
12	<223> сконструированная последовательность
13	<223> сконструированная последовательность
14	<223> сконструированная последовательность
15	<223> сконструированная последовательность
16	<223> сконструированная последовательность
17	<223> Капсид AAVhu.37
18	<223> Капсид AAVrh.10
19	<223> сконструированная последовательность
20	<223> Капсид AAV3B

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>ЗЕ ТРАСТИС ОФ ЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ

<120> ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОФИЛИИ A

<130> UPN-16-7798PCT

<150> US 62/323,336

<151> 2016-04-15

<150> US 62/331,807

<151> 2016-05-04

<150> US 62/428,866

<151> 2016-12-01

<160> 20

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 4371

<212>ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctcccaga atccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371

<210> 2

<211> 4374

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 2

atgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgcc 60

acccggcggtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctg 120

ggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaac 180

accagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatc 240

gccaagccacggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtac 300

gataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtg 360

ggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgg 420

gagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctg 480

aaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccac 540

gtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggag 600

ggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg 660

ttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggat 720

gccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagc 780

ctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatggga 840

accaccccagaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccac 900

cggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatg 960

gatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggag 1020

gcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgag 1080

gaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgat 1140

gatgataacagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacc 1200

tgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcc 1260

cctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacgg 1320

aagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggcc 1380

atccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctg 1440

ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcacc 1500

gatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttc 1560

ccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggacca 1620

accaagtctgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagaga 1680

gacctggcctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag 1740

agaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag 1800

aacagaagctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtg 1860

cagctggaggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtg 1920

ttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagc 1980

atcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaag 2040

atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagc 2100

atggagaacccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagagga 2160

atgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggat 2220

agctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagc 2280

ttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctg 2340

cagtctgatcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggag 2400

gattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagacc 2460

agacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagccca 2520

cacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttc 2580

caggagttcaccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcac 2640

ctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttc 2700

cggaaccaggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggat 2760

cagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctac 2820

ttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgg 2880

gcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactg 2940

ctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggag 3000

ttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatg 3060

gagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaac 3120

taccggttccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcc 3180

caggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagc 3240

atccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctg 3300

tacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatc 3360

tggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctg 3420

gtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttc 3480

cagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactac 3540

agcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctg 3600

ctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagc 3660

ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctac 3720

cggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatc 3780

aagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccac 3840

tacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctcc 3900

atgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctac 3960

ttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacgg 4020

agcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccag 4080

aagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatg 4140

tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttc 4200

cagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaac 4260

agcctggatccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcac 4320

cagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactga 4374

<210> 3

<211> 1457

<212>ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

1025 1030 1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr

1040 1045 1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe

1070 1075 1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

1085 1090 1095

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met

1100 1105 1110

Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly

1115 1120 1125

Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

1130 1135 1140

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg

1145 1150 1155

Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

1160 1165 1170

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser

1175 1180 1185

Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1190 1195 1200

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

1205 1210 1215

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

1220 1225 1230

Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

1250 1255 1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1265 1270 1275

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly

1280 1285 1290

Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

1295 1300 1305

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn

1310 1315 1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln

1325 1330 1335

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu

1340 1345 1350

Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val

1355 1360 1365

Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

1370 1375 1380

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu

1385 1390 1395

Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

1400 1405 1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr

1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1430 1435 1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1445 1450 1455

<210> 4

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 4

tgtttgctgcttgcaatgtttgcccattttaggg 34

<210> 5

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 5

ctacctcgtgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaaggg 60

tcatcagtagttttccatcttactcaacatcctcccagtg 100

<210> 6

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 6

aggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagg 42

<210> 7

<211> 190

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 7

atttcatagaacgaatgttccgatgctctaatctctctagacaaggttcatatttgtatg 60

ggttacttattctctctttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagtca 120

gattggcagggataagcagcctagctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctggga 180

gcagccatca 190

<210> 8

<211> 176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 8

actcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacat 60

cagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctc 120

tagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagaga 176

<210> 9

<211> 218

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 9

tggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggact 60

tagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcct 120

cccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcct 180

cagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaata 218

<210> 10

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 10

aataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaatgtg 60

caaacaatggaggtg 75

<210> 11

<211> 168

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 11

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt 60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact 120

aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctact 168

<210> 12

<211> 164

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 12

gataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggcc 60

actccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgc 120

ccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag 164

<210> 13

<211> 7920

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 13

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt 60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact 120

aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg 180

tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt 240

agttttccatcttactcaacatcctcccagtggaattcatttcatagaacgaatgttccg 300

atgctctaatctctctagacaaggttcatatttgtatgggttacttattctctctttgtt 360

gactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagtcagattggcagggataagcagcct 420

agctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctgggagcagccatcagcggccgccacc 480

atgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgcc 540

acccggcggtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctg 600

ggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaac 660

accagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatc 720

gccaagccacggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtac 780

gataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtg 840

ggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgg 900

gagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctg 960

aaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccac 1020

gtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggag 1080

ggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg 1140

ttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggat 1200

gccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagc 1260

ctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatggga 1320

accaccccagaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccac 1380

cggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatg 1440

gatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggag 1500

gcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgag 1560

gaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgat 1620

gatgataacagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacc 1680

tgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcc 1740

cctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacgg 1800

aagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggcc 1860

atccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctg 1920

ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcacc 1980

gatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttc 2040

ccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggacca 2100

accaagtctgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagaga 2160

gacctggcctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag 2220

agaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag 2280

aacagaagctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtg 2340

cagctggaggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtg 2400

ttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagc 2460

atcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaag 2520

atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagc 2580

atggagaacccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagagga 2640

atgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggat 2700

agctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagc 2760

ttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctg 2820

cagtctgatcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggag 2880

gattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagacc 2940

agacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagccca 3000

cacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttc 3060

caggagttcaccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcac 3120

ctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttc 3180

cggaaccaggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggat 3240

cagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctac 3300

ttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgg 3360

gcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactg 3420

ctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggag 3480

ttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatg 3540

gagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaac 3600

taccggttccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcc 3660

caggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagc 3720

atccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctg 3780

tacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatc 3840

tggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctg 3900

gtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttc 3960

cagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactac 4020

agcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctg 4080

ctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagc 4140

ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctac 4200

cggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatc 4260

aagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccac 4320

tacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctcc 4380

atgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctac 4440

ttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacgg 4500

agcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccag 4560

aagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatg 4620

tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttc 4680

cagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaac 4740

agcctggatccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcac 4800

cagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactgatgagca 4860

tgcaataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaat 4920

gtgcaaacaatggaggtgctcgagtagataagtagcatggcgggttaatcattaactaca 4980

aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgagg 5040

ccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagc 5100

gagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggg 5160

aaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc 5220

gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcg 5280

aatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcg 5340

tgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttc 5400

tcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttcc 5460

gatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta 5520

gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttcttta 5580

atagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttg 5640

atttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaa 5700

aatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcgggg 5760

aaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgct 5820

catgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtat 5880

tcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgc 5940

tcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtggg 6000

ttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacg 6060

ttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattga 6120

cgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagta 6180

ctcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgc 6240

tgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggacc 6300

gaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttg 6360

ggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagc 6420

aatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggca 6480

acaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggccct 6540

tccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtat 6600

cattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggg 6660

gagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgat 6720

taagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaact 6780

tcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaat 6840

cccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatc 6900

ttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgct 6960

accagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactgg 7020

cttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccacca 7080

cttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggc 7140

tgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgga 7200

taaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaac 7260

gacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccga 7320

agggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgag 7380

ggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg 7440

acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccag 7500

caacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcc 7560

tgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgc 7620

tcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgccc 7680

aatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacag 7740

gtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactca 7800

ttaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgag 7860

cggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaagg 7920

<210> 14

<211> 8004

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 14

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt 60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact 120

aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg 180

tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt 240

agttttccatcttactcaacatcctcccagtgaggttaatttttaaactgtttgctctgg 300

ttaataatctcaggaggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagggaat 360

tcatttcatagaacgaatgttccgatgctctaatctctctagacaaggttcatatttgta 420

tgggttacttattctctctttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagt 480

cagattggcagggataagcagcctagctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctgg 540

gagcagccatcagcggccgccaccatgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgc 600

ctgctgcggttctgcttctccgccacccggcggtactacctgggagccgtggagctgagc 660

tgggattacatgcagagcgatctgggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgg 720

gtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggag 780

ttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagccacggccaccctggatgggactgctggga 840

ccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctct 900

catcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgag 960

tacgatgatcagaccagccagcgggagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagc 1020

cacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgc 1080

ctgacctacagctacctgagccacgtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatc 1140

ggagccctgctggtgtgccgggagggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcac 1200

aagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaag 1260

aacagcctgatgcaggatcgggatgccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacacc 1320

gtgaacggatacgtgaaccggagcctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtg 1380

tactggcacgtgatcggaatgggaaccaccccagaggtgcactctatcttcctggaggga 1440

cacacctttctggtgcggaaccaccggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttc 1500

ctgaccgcccagaccctgctgatggatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagc 1560

agccaccagcacgatggaatggaggcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagcca 1620

cagctgcggatgaagaacaacgaggaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagc 1680

gagatggatgtggtgcggttcgatgatgataacagcccaagcttcatccagatccggagc 1740

gtggccaagaagcacccaaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgg 1800

gattacgccccactggtgctggcccctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaac 1860

aacggaccacagcggatcggacggaagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgat 1920

gagaccttcaagacccgggaggccatccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctg 1980

tacggagaggtgggagataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatac 2040

aacatctacccacacggaatcaccgatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaag 2100

ggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtgg 2160

acagtgacagtggaggatggaccaaccaagtctgatccaagatgcctgaccagatactac 2220

agcagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggactgattggaccactgctgatc 2280

tgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtg 2340

atcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgacagagaacatccagaga 2400

ttcctgccaaacccagccggagtgcagctggaggatccagagttccaggccagcaacatc 2460

atgcacagcatcaacggatacgtgttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgag 2520

gtggcctattggtatatcctgagcatcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttc 2580

agcggatacaccttcaagcacaagatggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattc 2640

tccggagagaccgtgttcatgagcatggagaacccaggactgtggatcctgggatgccac 2700

aactctgatttcagaaacagaggaatgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataag 2760

aacactggagattactatgaggatagctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaag 2820

aacaatgccattgagccaagaagcttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccag 2880

agagagatcaccagaaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgattatgatgatacc 2940

atctctgtggagatgaagaaggaggattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagc 3000

ccaagaagcttccagaagaagaccagacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgg 3060

gattatggaatgagcagcagcccacacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtg 3120

ccacagttcaagaaggtggtgttccaggagttcaccgatggaagcttcacccagccactg 3180

taccggggagagctgaacgagcacctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtg 3240

gaggataacatcatggtgaccttccggaaccaggccagccggccatacagcttctacagc 3300

agcctgatcagctacgaggaggatcagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtg 3360

aagccaaacgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaag 3420

gatgagttcgattgcaaggcctgggcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtg 3480

cacagcggactgatcggaccactgctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccac 3540

ggacggcaggtgaccgtgcaggagttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaag 3600

agctggtacttcaccgagaacatggagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatg 3660

gaggatccaaccttcaaggagaactaccggttccacgccatcaacggatacatcatggat 3720

accctgccaggactggtgatggcccaggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatg 3780

ggaagcaacgagaacatccacagcatccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaag 3840

aaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggag 3900

atgctgccaagcaaggccggaatctggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcac 3960

gccggaatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatg 4020

gccagcggacacatccgggatttccagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggcc 4080

ccaaagctggcccggctgcactacagcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagcca 4140

ttcagctggatcaaagtggatctgctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccag 4200

ggagcccggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctg 4260

gatggaaagaagtggcagacctaccggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttc 4320

ggaaacgtggatagcagcggaatcaagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccga 4380

tacatccggctgcacccaacccactacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatg 4440

ggatgtgatctgaacagctgctccatgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgat 4500

gcccagatcaccgccagcagctacttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaag 4560

gcccggctgcacctgcagggacggagcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaag 4620

gagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccaggga 4680

gtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggat 4740

ggacaccagtggaccctgttcttccagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccag 4800

gatagcttcaccccagtggtgaacagcctggatccaccactgctgacccgatacctgcgg 4860

atccacccacagagctgggtgcaccagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgag 4920

gcccaggatctgtactgatgagcatgcaataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtg 4980

cctgggttctctctgtcccggaatgtgcaaacaatggaggtgctcgagtagataagtagc 5040

atggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctc 5100

tgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttg 5160

cccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccg 5220

tcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcag 5280

cacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttccc 5340

aacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcgg 5400

cgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctc 5460

ctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaa 5520

atcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaac 5580

ttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctt 5640

tgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactca 5700

accctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggt 5760

taaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctta 5820

caatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta 5880

aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataata 5940

ttgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgc 6000

ggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctga 6060

agatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatcct 6120

tgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatg 6180

tggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacacta 6240

ttctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat 6300

gacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaactt 6360

acttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggggga 6420

tcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacga 6480

gcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcga 6540

actacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgc 6600

aggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagc 6660

cggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccg 6720

tatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagat 6780

cgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcata 6840

tatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcct 6900

ttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga 6960

ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg 7020

cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc 7080

aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttct 7140

agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc 7200

tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggtt 7260

ggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg 7320

cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct 7380

atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag 7440

ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag 7500

tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg 7560

gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg 7620

gccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattac 7680

cgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt 7740

gagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgat 7800

tcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgc 7860

aattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggc 7920

tcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacca 7980

tgattacgccagatttaattaagg 8004

<210> 15

<211> 7948

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 15

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt 60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact 120

aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg 180

tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt 240

agttttccatcttactcaacatcctcccagtggaattctggacacaggacgctgtggttt 300

ctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccga 360

taactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatcc 420

actgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactga 480

cctgggacagtgaatagcggccgccaccatgcagatcgagctgagcacctgcttcttcct 540

gtgcctgctgcggttctgcttctccgccacccggcggtactacctgggagccgtggagct 600

gagctgggattacatgcagagcgatctgggagagctgccagtggatgcccggttcccacc 660

acgggtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgt 720

ggagttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagccacggccaccctggatgggactgct 780

gggaccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgtggtgatcaccctgaagaacatggc 840

ctctcatcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgagctactggaaggccagcgagggagc 900

cgagtacgatgatcagaccagccagcgggagaaggaggatgataaggtgttcccaggagg 960

aagccacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaacggaccaatggccagcgatccact 1020

gtgcctgacctacagctacctgagccacgtggatctggtgaaggatctgaacagcggact 1080

gatcggagccctgctggtgtgccgggagggaagcctggccaaggagaagacccagaccct 1140

gcacaagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatgagggaaagagctggcacagcgagac 1200

caagaacagcctgatgcaggatcgggatgccgccagcgcccgggcctggccaaagatgca 1260

caccgtgaacggatacgtgaaccggagcctgccaggactgatcggatgccaccggaagag 1320

cgtgtactggcacgtgatcggaatgggaaccaccccagaggtgcactctatcttcctgga 1380

gggacacacctttctggtgcggaaccaccggcaggccagcctggagatcagcccaatcac 1440

cttcctgaccgcccagaccctgctgatggatctgggacagttcctgctgttctgccatat 1500

cagcagccaccagcacgatggaatggaggcctacgtgaaggtggatagctgcccagagga 1560

gccacagctgcggatgaagaacaacgaggaggccgaggattacgatgatgatctgaccga 1620

tagcgagatggatgtggtgcggttcgatgatgataacagcccaagcttcatccagatccg 1680

gagcgtggccaagaagcacccaaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaggagga 1740

ttgggattacgccccactggtgctggcccctgatgatcggagctacaagagccagtacct 1800

gaacaacggaccacagcggatcggacggaagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacac 1860

cgatgagaccttcaagacccgggaggccatccagcacgagagcggaatcctgggaccact 1920

gctgtacggagaggtgggagataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggcc 1980

atacaacatctacccacacggaatcaccgatgtgcggccactgtacagccggcggctgcc 2040

aaagggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaa 2100

gtggacagtgacagtggaggatggaccaaccaagtctgatccaagatgcctgaccagata 2160

ctacagcagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggactgattggaccactgct 2220

gatctgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaaccagatcatgtctgataagagaaa 2280

tgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgacagagaacatcca 2340

gagattcctgccaaacccagccggagtgcagctggaggatccagagttccaggccagcaa 2400

catcatgcacagcatcaacggatacgtgttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgca 2460

cgaggtggcctattggtatatcctgagcatcggagcccagaccgatttcctgagcgtgtt 2520

cttcagcggatacaccttcaagcacaagatggtgtacgaggataccctgaccctgttccc 2580

attctccggagagaccgtgttcatgagcatggagaacccaggactgtggatcctgggatg 2640

ccacaactctgatttcagaaacagaggaatgactgccctgctgaaagtgtccagctgtga 2700

taagaacact ggagattact atgaggatag ctatgaggat atctctgcct acctgctgag 2760

caagaacaat gccattgagc caagaagctt cagccagaac ccaccagtgc tgaagagaca 2820

ccagagagag atcaccagaa ccaccctgca gtctgatcag gaggagattg attatgatga 2880

taccatctct gtggagatga agaaggagga ttttgatatc tatgatgagg atgagaacca 2940

gagcccaaga agcttccaga agaagaccag acactacttc atcgctgcag tggagagact 3000

gtgggattat ggaatgagca gcagcccaca cgtgctgaga aacagagccc agagcggatc 3060

tgtgccacag ttcaagaagg tggtgttcca ggagttcacc gatggaagct tcacccagcc 3120

actgtaccgg ggagagctga acgagcacct gggactgctg ggaccataca tccgggccga 3180

ggtggaggat aacatcatgg tgaccttccg gaaccaggcc agccggccat acagcttcta 3240

cagcagcctg atcagctacg aggaggatca gcggcaggga gccgagccac ggaagaactt 3300

cgtgaagcca aacgagacca agacctactt ctggaaggtg cagcaccaca tggccccaac 3360

caaggatgag ttcgattgca aggcctgggc ctacttcagc gatgtggatc tggagaagga 3420

tgtgcacagc ggactgatcg gaccactgct ggtgtgccac accaacaccc tgaacccagc 3480

ccacggacgg caggtgaccg tgcaggagtt cgccctgttc ttcaccatct tcgatgagac 3540

caagagctgg tacttcaccg agaacatgga gcggaactgc cgggcccctt gcaacatcca 3600

gatggaggat ccaaccttca aggagaacta ccggttccac gccatcaacg gatacatcat 3660

ggataccctg ccaggactgg tgatggccca ggatcagcgg atccggtggt acctgctgag 3720

catgggaagc aacgagaaca tccacagcat ccacttcagc ggacacgtgt tcaccgtgcg 3780

gaagaaggag gagtacaaga tggccctgta caacctgtac ccaggagtgt tcgagaccgt 3840

ggagatgctg ccaagcaagg ccggaatctg gcgggtggag tgcctgatcg gagagcacct 3900

gcacgccgga atgagcaccc tgttcctggt gtacagcaac aagtgccaga ccccactggg 3960

aatggccagc ggacacatcc gggatttcca gatcaccgcc agcggacagt acggacagtg 4020

ggccccaaag ctggcccggc tgcactacag cggaagcatc aacgcctgga gcaccaagga 4080

gccattcagc tggatcaaag tggatctgct ggccccaatg atcatccacg gaatcaagac 4140

ccagggagcc cggcagaagt tcagcagcct gtacatcagc cagttcatca tcatgtacag 4200

cctggatgga aagaagtggc agacctaccg gggaaacagc accggaaccc tgatggtgtt 4260

cttcggaaac gtggatagca gcggaatcaa gcacaacatc ttcaacccac caatcatcgc 4320

ccgatacatc cggctgcacc caacccacta cagcatcaga agcaccctgc ggatggagct 4380

gatgggatgt gatctgaaca gctgctccat gccactggga atggagagca aggccatcag 4440

cgatgcccag atcaccgcca gcagctactt caccaacatg ttcgccacct ggagcccaag 4500

caaggcccgg ctgcacctgc agggacggag caacgcctgg cggccacagg tgaataaccc 4560

aaaggagtgg ctgcaggtgg atttccagaa gaccatgaag gtgaccggag tgaccaccca 4620

gggagtgaag agcctgctga ctagcatgta tgtgaaggag ttcctgatca gcagcagcca 4680

ggatggacac cagtggaccc tgttcttcca gaacggaaag gtgaaggtgt tccagggaaa 4740

ccaggatagc ttcaccccag tggtgaacag cctggatcca ccactgctga cccgatacct 4800

gcggatccac ccacagagct gggtgcacca gatcgccctg agaatggagg tgctgggatg 4860

cgaggcccag gatctgtact gatgagcatg caataaagtc tgagtgggcg gcagcctgtg 4920

tgtgcctggg ttctctctgt cccggaatgt gcaaacaatg gaggtgctcg agtagataag 4980

tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 5040

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 5100

tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagcc ttaattaacc taattcactg 5160

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 5220

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 5280

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 5340

gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 5400

gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 5460

ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 5520

aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 5580

cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 5640

ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat 5700

tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg 5760

cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 5820

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5880

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5940

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 6000

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 6060

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 6120

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 6180

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 6240

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 6300

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 6360

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 6420

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 6480

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 6540

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 6600

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 6660

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 6720

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 6780

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6840

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6900

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6960

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 7020

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 7080

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 7140

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 7200

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 7260

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 7320

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 7380

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 7440

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 7500

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 7560

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 7620

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 7680

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 7740

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 7800

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 7860

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 7920

accatgattacgccagatttaattaagg 7948

<210> 16

<211> 8032

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 16

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt 60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact 120

aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg 180

tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt 240

agttttccatcttactcaacatcctcccagtgaggttaatttttaaactgtttgctctgg 300

ttaataatctcaggaggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagggaat 360

tctggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtgga 420

cttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagc 480

ctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctc 540

ctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatagcggccgccaccatgcagat 600

cgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgccacccggcg 660

gtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctgggagagct 720

gccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgt 780

ggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagcc 840

acggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgt 900

ggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgag 960

ctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgggagaagga 1020

ggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaa 1080

cggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccacgtggatct 1140

ggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggagggaagcct 1200

ggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatga 1260

gggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggatgccgccag 1320

cgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagcctgccagg 1380

actgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatgggaaccacccc 1440

agaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccaccggcaggc 1500

cagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatggatctggg 1560

acagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggaggcctacgt 1620

gaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgaggaggccga 1680

ggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgatgatgataa 1740

cagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacctgggtgca 1800

ctacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcccctgatga 1860

tcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacggaagtacaa 1920

aaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggccatccagca 1980

cgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctgctgatcat 2040

cttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcaccgatgtgcg 2100

gccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcct 2160

gccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggaccaaccaagtc 2220

tgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagagagacctggc 2280

ctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaa 2340

ccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaag 2400

ctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtgcagctgga 2460

ggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtgttcgatag 2520

cctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagcatcggagc 2580

ccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaagatggtgta 2640

cgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagcatggagaa 2700

cccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagaggaatgactgc 2760

cctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggatagctatga 2820

ggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagcttcagcca 2880

gaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctgcagtctga 2940

tcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggaggattttga 3000

tatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagaccagacacta 3060

cttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagcccacacgtgct 3120

gagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttccaggagtt 3180

caccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcacctgggact 3240

gctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttccggaacca 3300

ggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggatcagcggca 3360

gggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctacttctggaa 3420

ggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgggcctactt 3480

cagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactgctggtgtg 3540

ccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggagttcgccct 3600

gttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatggagcggaa 3660

ctgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaactaccggtt 3720

ccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcccaggatca 3780

gcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagcatccactt 3840

cagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacct 3900

gtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatctggcgggt 3960

ggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctggtgtacag 4020

caacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttccagatcac 4080

cgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactacagcggaag 4140

catcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctgctggcccc 4200

aatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagcctgtacat 4260

cagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctaccggggaaa 4320

cagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatcaagcacaa 4380

catcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccactacagcat 4440

cagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctccatgccact 4500

gggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctacttcaccaa 4560

catgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacggagcaacgc 4620

ctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccat 4680

gaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaa 4740

ggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttccagaacgg 4800

aaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaacagcctgga 4860

tccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcaccagatcgc 4920

cctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactgatgagcatgcaataa 4980

agtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaatgtgcaaac 5040

aatggaggtgctcgagtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaaccc 5100

ctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcga 5160

ccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc 5220

agccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccct 5280

ggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagc 5340

gaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggac 5400

gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgct 5460

acacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacg 5520

ttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagt 5580

gctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggcca 5640

tcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtgga 5700

ctcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataa 5760

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaac 5820

gcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgc 5880

gcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagac 5940

aataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatt 6000

tccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccag 6060

aaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcg 6120

aactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaa 6180

tgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggc 6240

aagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccag 6300

tcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataa 6360

ccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagc 6420

taaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccgg 6480

agctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaa 6540

caacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaa 6600

tagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctg 6660

gctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcag 6720

cactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcagg 6780

caactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcatt 6840

ggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcattttt 6900

aatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaac 6960

gtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgag 7020

atcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcgg 7080

tggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagca 7140

gagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaaga 7200

actctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcca 7260

gtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc 7320

agcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctaca 7380

ccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa 7440

aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttc 7500

cagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagc 7560

gtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgg 7620

cctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttat 7680

cccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgca 7740

gccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgca 7800

aaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccg 7860

actggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcac 7920

cccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataac 7980

aatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaagg 8032

<210> 17

<211> 738

<212> ПРТ

<213> Неизвестный

<220>

<223> Капсид AAVhu.37

<400> 17

MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Thr Asn Thr Gly

580 585 590

Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

AsnLeu

<210> 18

<211> 738

<212> ПРТ

<213> Неизвестный

<220>

<223> Капсид AAVrh.10

<400> 18

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Asp

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

AsnLeu

<210> 19

<211> 4371

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сконструированная последовательность

<400> 19

atgcagatcgagctgtctacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttcagcgcc 60

accagacggtactatctgggcgccgtggaactgagctgggactacatgcagagcgacctg 120

ggcgagctgcccgtggacgccagattccctccaagagtgcccaagagcttccccttcaac 180

acctccgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggaattcaccgaccacctgttcaatatc 240

gccaagcccagacccccctggatgggcctgctgggacctacaattcaggccgaggtgtac 300

gacaccgtcgtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgtctctgcacgccgtg 360

ggagtgtcctactggaaggcctctgagggcgccgagtacgacgatcagaccagccagcgc 420

gagaaagaggacgacaaggtgttccctggcggcagccacacctacgtgtggcaggtgctg 480

aaagaaaacggccccatggcctccgaccctctgtgcctgacatacagctacctgagccac 540

gtggacctcgtgaaggacctgaacagcggcctgatcggagccctgctcgtgtgtagagag 600

ggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg 660

ttcgacgagggcaagagctggcacagcgagacaaagaacagcctgatgcaggaccgggac 720

gccgcctctgctagagcctggcccaaaatgcacaccgtgaacggctacgtgaacagaagc 780

ctgcccggactgatcggctgccaccggaagtctgtgtactggcacgtgatcggcatgggc 840

accacccctgaggtgcacagcatctttctggaaggacacacctttctcgtgcggaaccac 900

cggcaggccagcctggaaatcagccctatcaccttcctgaccgcccagacactgctgatg 960

gacctgggccagtttctgctgttctgccacatcagctcccaccagcacgacggcatggaa 1020

gcctacgtgaaggtggacagctgccccgaggaaccccagctgcggatgaagaacaacgag 1080

gaagccgaggactacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtggtgcgcttcgac 1140

gacgataacagccccagcttcatccagatcagaagcgtggccaagaagcaccccaagacc 1200

tgggtgcactatatcgccgccgaggaagaggactgggattacgcccctctggtgctggcc 1260

cccgacgacagaagctacaagagccagtacctgaacaacggcccccagcggatcggccgg 1320

aagtataagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagacattcaagaccagagaggcc 1380

atccagcacgagagcggcatcctgggccctctgctgtatggcgaagtgggcgacaccctg 1440

ctgatcatcttcaagaaccaggccagcagaccctacaacatctaccctcacggcatcacc 1500

gacgtgcggcccctgtactctagaaggctgcccaagggcgtgaaacacctgaaggacttc 1560

cccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtggaagatggcccc 1620

accaagagcgaccccagatgcctgacacggtactatagcagcttcgtgaacatggaacgg 1680

gacctggcctccggcctgattggcccactgctgatctgctacaaagaaagcgtggaccag 1740

cggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgtttagcgtgttcgatgag 1800

aaccggtcctggtatctgaccgagaatatccagcggttcctgcccaaccctgccggcgtg 1860

cagctggaagatcctgagttccaggcctccaacatcatgcactccatcaatggctatgtg 1920

ttcgacagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctactggtacatcctgagc 1980

atcggggcccagaccgacttcctgtccgtgttcttctccggctacaccttcaagcacaag 2040

atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccctttagcggcgaaaccgtgttcatgagc 2100

atggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttccggaacagaggc 2160

atgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgactactacgaggac 2220

agctatgaggacatcagcgcctacctgctgagcaagaacaacgccatcgagcccagaagc 2280

ttcagccagaacccccccgtgctgaagcggcaccagagagagatcacccggaccaccctg 2340

cagtccgaccaggaagagatcgattacgacgacaccatcagcgtggaaatgaagaaagaa 2400

gatttcgacatctacgacgaggacgagaaccagagcccccggtcctttcagaaaaagacc 2460

cggcactacttcattgccgctgtggaacggctgtgggactacggcatgagcagcagccct 2520

cacgtgctgagaaacagggcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttc 2580

caggaattcacagacggcagcttcacccagcctctgtaccgcggcgagctgaacgagcac 2640

ctgggactgctgggcccctatatcagagccgaagtggaagataacatcatggtcaccttc 2700

cggaatcaggcctcccggccctacagcttctacagctccctgatcagctacgaagaggac 2760

cagagacagggcgctgagccccggaagaacttcgtgaagcccaacgagactaagacctac 2820

ttttggaaggtgcagcaccacatggcccctacaaaggacgagttcgactgcaaggcctgg 2880

gcctacttctccgacgtggacctggaaaaggacgtgcactctgggctgatcggccccctg 2940

ctcgtgtgccacaccaacaccctgaatcccgcccacggcagacaggtgacagtgcaggaa 3000

ttcgccctgttcttcaccatcttcgacgaaacaaagagctggtacttcaccgaaaacatg 3060

gaaagaaactgccgggctccctgcaacatccagatggaagatcccaccttcaaagagaac 3120

taccggttccacgccatcaacggctacatcatggacacactgcccggcctcgtgatggct 3180

caggatcagcggatccggtggtatctgctgtccatgggctccaacgagaacatccacagc 3240

atccacttcagcggccacgtgttcaccgtgcggaaaaaagaagagtacaaaatggccctg 3300

tacaacctgtaccctggggtgttcgagacagtggaaatgctgcccagcaaggccggcatc 3360

tggcgggtggagtgtctgatcggcgagcacctgcacgctgggatgagcacactgtttctg 3420

gtgtacagcaacaagtgccagacacctctgggcatggcctctggccacatccgggacttt 3480

cagatcacagccagcggccagtacggccagtgggccccaaaactggccagactgcactac 3540

agcggcagcatcaacgcctggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctg 3600

ctggctcccatgatcatccacggaatcaagacccagggcgccagacagaagttcagcagc 3660

ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctac 3720

cggggcaatagcaccggcaccctgatggtgttcttcggcaacgtggactccagcggcatt 3780

aagcacaacatcttcaacccccccatcattgcccggtacatccggctgcaccccacccac 3840

tacagcatccggtccaccctgagaatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgctcc 3900

atgcccctggggatggaaagcaaggccatctccgacgcccagatcaccgcctccagctac 3960

ttcaccaacatgttcgccacctggtccccatccaaggcccggctgcacctgcagggcaga 4020

agcaatgcttggaggcctcaggtgaacaaccccaaagagtggctgcaggtggacttccag 4080

aaaaccatgaaagtgaccggcgtgaccacccagggcgtgaagtctctgctgacctctatg 4140

tacgtgaaagagttcctgatctccagcagccaggacggccaccagtggaccctgtttttc 4200

cagaacggcaaagtgaaagtgtttcaggggaaccaggactccttcacccccgtcgtgaat 4260

agcctggaccctccactgctgaccagatacctgcggatccaccctcagagttgggtgcac 4320

cagattgctctgcggatggaagtgctgggatgcgaggcccaggacctgtac 4371

<210> 20

<211> 736

<212> ПРТ

<213> Неизвестный

<220>

<223> Капсид AAV3B

<400> 20

MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<---

1. Рекомбинатный аденоассоциированный вирус (rAAV) для доставки гена человеческого фактора VIII пациенту, содержащий капсид AAV и упакованный в него векторный геном, при этом указанный векторный геном содержит:

(a) AAV с 5' инвертированным концевым повтором (ITR);

(b) специфический для печени промотор;

(c) кодирующую последовательность, кодирующую человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции; и

(d) 3' ITR AAV,

причем указанная кодирующая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 95%.

2. Вирус rAAV по п. 1, отличающийся тем, что человеческий фактор VIII представляет собой фактор VIII SQ с удаленным B-доменом, содержащий в длину около 1457 аминокислот.

3. Вирус rAAV по п. 1 или 2, отличающийся тем, что кодирующая последовательность из (с) представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

4. Вирус rAAV по любому из пп. 1–3, отличающийся тем, что капсид AAV представляет собой капсид hu37.

5. Вирус rAAV по любому из пп. 1–4, отличающийся тем, что 5' ITR AAV и/или 3' ITR AAV взяты из AAV2.

6. Вирус rAAV по п. 5, отличающийся тем, что 5' ITR AAV содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и 3' ITR AAV содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

7. Вирус rAAV по любому из пп. 1–6, отличающийся тем, что специфический для печени промотор представляет собой промотор транстиретина (TTR).

8. Вирус rAAV по п. 7, отличающийся тем, что промотор TTR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

9. Вирус rAAV по любому из пп. 1–8, отличающийся тем, что векторный геном дополнительно содержит энхансер.

10. Вирус rAAV по п. 9, отличающийся тем, что энхансер представляет собой специфический для печени энхансер.

11. Вирус rAAV по п. 10, отличающийся тем, что специфический для печени энхансер представляет собой энхансер транстиретина (enTTR).

12. Вирус rAAV по п. 11, отличающийся тем, что энхансер enTTR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

13. Вирус rAAV по любому из пп. 1–12, отличающийся тем, что векторный геном дополнительно содержит последовательность полиA.

14. Вирус rAAV по п. 13, отличающийся тем, что последовательность полиA содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.

15. Вирус rAAV по любому из пп. 1–14, отличающийся тем, что векторный геном имеет размер от около 5 т. п. н. до около 5,5 т. п. н.

16. Вирус rAAV для доставки гена человеческого фактора VIII пациенту, содержащий капсид AAVhu37 и упакованный в него векторный геном, при этом указанный векторный геном содержит:

(a) последовательность AAV с 5' инвертированным концевым повтором (ITR);

(b) промотор транстиретина (TTR);

(с) энхансер транстиретина (enTTR);

(d) кодирующую последовательность, кодирующую человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции; и

(e) последовательность 3' ITR AAV, причем указанная кодирующая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

17. Вирус rAAV по п. 16, отличающийся тем, что векторный геном содержит нуклеотиды 1-5110 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.

18. Водная суспензия, пригодная для введения пациенту с гемофилией A, причем указанная суспензия содержит водную суспендирующую жидкость и от около 1 x 10¹² геномных копий (ГК)/мл до около 1 x 10¹⁴ ГК/мл вируса rAAV по любому из пп. 1–17.

19. Водная суспензия по п. 18, отличающаяся тем, что суспензия дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, консервант и/или буфер, в водной суспендирующей жидкости.

20. Применение rAAV по любому из пп. 1-17 в лечении пациента с гемофилией A, в котором пациенту доставляют водную суспензию от около 1 x 10¹² до около 1 x 10¹⁴ геномных копий (ГК)/кг указанного rAAV.

21. Применение по п. 20, отличающийся тем, что rAAV вводят повторно в более поздний момент времени.

22. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий фактор VIII, обеспечивающий функцию обеспечения коагуляции, причем указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 95%.