Вектор на основе аденоассоциированного вируса (aav), имеющий гибридный ген hgf, введенный в него

Изобретение относится к биотехнологии. Описан экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из а) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или б) кодон-модифицированной нуклеотидной последовательности, обладающей гомологией последовательностей по меньшей мере 80% с SEQ ID NO: 5, где указанная кодон-модифицированная нуклеотидная последовательность кодирует ту же самую аминокислотную последовательность как кодирующая область SEQ ID NO: 5. Также описана клетка-хозяин, содержащая AAV вектор по п. 1 и продуцирующая белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5. Представлена композиция, содержащая AAV вектор по п. 1, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) или диабетической периферической нейропатии (DPN). Применение AAV вектора по настоящему изобретению делает возможной доставку гибридного гена HGF субъекту с высоким выходом доставки. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Область изобретения

Данная заявка заявляет приоритет и преимущество по корейской патентной заявке №10-2017-0184738, поданной в Ведомство интеллектуальной собственности Республики Корея 29 декабря 2017 года, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к AAV (от англ. adeno-associated virus -аденоассоциированный вирус) вектору, содержащему предварительно заданную последовательность гибридного гена HGF.

Предшествующий уровень техники

Генная терапия представляет собой способ, в котором терапевтические гены доставляют в клетки пациентов с использованием технологии рекомбинантных ДНК с индукцией генетических мутаций клеток-мишеней или экспрессией конкретных белков, осуществляя, таким образом, лечение генетических заболеваний, неизлечимых заболеваний и т.п.Вещества, которые переносят гены в живые организмы, называют носителями или векторами. Векторы главным образом подразделяют на вирусные векторы и невирусные векторы. Ретровирусы и аденовирусы представляют собой типичные типы вирусных векторов, и невирусные векторы включают «голую» ДНК, липосомы и т.п.

Фактор роста гепатоцитов (HGF - от англ. Hepatocyte growth factor) является одним из факторов роста, и исследование разных функций HGF продолжается. Их примеры выглядят следующим образом: (1) лечение заболевания сердца посредством HGF с использованием липосомы в качестве носителя (Aoki et al., Angiogenesis induced by hepatocyte growth factor in non-infarcted myocardium and infracted myocardium: up-regulation of essential transcription factor for angiogenesis, etc. Gene Therapy 7:417-427, 2000); (2) лечение заболевания печени посредством HGF с использованием AAV в качестве носителя (Suzumura et al., Adeno-associated virus vector-mediated production of hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis in mice. Hepatol. Int. 2:80-88, 2008); (3) лечение диабетической периферической нейропатии посредством HGF с использованием «голой» ДНК в качестве носителя (Kessler et al., Double-blind, placebo-controlled study of HGF gene therapy in diabetic neuropathy. Annals of Clinical and Translational Neurology 2:465-478, 2015); и (4) лечение бокового амиотрофического склероза посредством HGF с использованием «голой» ДНК в качестве носителя (Sufit et al., Open label study to assess the safety of VM202 in subjects with amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 18:269-278, 2017).

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения проводили исследования и старались разработать систему доставки генов с повышенной эффективностью доставки гибридного гена HGF, который одновременно экспрессирует изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF), включая fIHGF и dHGF. В результате, авторы настоящего изобретения установили, что эффективность доставки гена может быть значимо улучшена при использовании усеченного мутанта ранее известного гибридного гена HGF и аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве системы доставки гена, и, таким образом, завершили настоящее изобретение.

Таким образом, одним аспектом настоящего изобретения является предложение вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из заданной нуклеотидной последовательности.

Другим аспектом настоящего изобретения является предложение трансформанта, трансформированного описанным выше AAV вектором.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является предложение композиции, содержащей описанный выше AAV вектор, для предупреждения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN - от англ. diabetic peripheral neuropathy) или бокового амиотрофического склероза (ALS - от англ. amyotrophic lateral sclerosis).

Другие цели и преимущества настоящего раскрытия станут более очевидными в сочетании со следующим подробным описанием изобретения, формулы изобретения и графических материалов.

Техническое решение

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предложен вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.

Авторы настоящего изобретения проводили исследование и пытались разработать систему доставки гена с повышенной эффективностью доставки гибридного гена HGF, который одновременно экспрессирует изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF), включая fIHGF и dHGF. В результате, авторы настоящего изобретения установили, что эффективность доставки гена можно значимо улучшить при использовании усеченного мутанта ранее известного гибридного гена HGF и аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве системы доставки гена.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «гибридный ген HGF» относится к последовательности гена, которая одновременно экспрессирует две или более изоформ HGF посредством селективного сплайсинга. Более конкретно, описанные выше две или более изоформ HGF включают по меньшей мере полноразмерную изоформу HGF (fIHGF) и вариант изоформы HGF с делецией (dHGF).

За счет вырожденности кодонов или рассмотрения предпочтительных кодонов в организме, где должны экспрессироваться гены HGF и dHGF, гибридный ген HGF по настоящему изобретению может иметь разные перестройки в кодирующей области в интервале, который не меняет аминокислотную последовательность белка, экспрессируемого с кодирующей области, или может также иметь разные перестройки или модификации в области, отличной от кодирующей области в пределах интервала, который не влияет на экспрессию гена, и такие измененные или модифицированные гены также включены в объем настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение также включает полинуклеотид, имеющий по существу такую же нуклеотидную последовательность, как и гибридный ген HGF SEQ ID NO: 5, и фрагменты данного гена. По существу такой же полинуклеотид означает полинуклеотид, обладающий гомологией последовательностей, составляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%.

Описанный выше гибридный ген HGF может включать кДНК, соответствующую экзонам 1-18 человеческого гена HGF и интрону 4 человеческого гена HGF, вставленному между экзонами 4 и 5 данной кДНК, или ее фрагменты. Известно, что данная последовательность представляет собой HGF-X7, состоящую из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 (см. KR 2017-0024614 (опубликовано 7 марта 2017 года)). Однако, при вставке в AAV вектор описанная выше нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 6 имеет ограничения, связанные с размером. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 по настоящему изобретению соответствует последовательности, демонстрирующей значимо повышенную эффективность доставки гена среди последовательностей, которые усечены в результате удаления части последовательности, соответствующей фрагменту интрона 4 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6. Конкретно, доставка нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 субъекту через введение в AAV вектор демонстрирует значимо повышенную эффективность доставки гена и эффективность экспрессии, по сравнению с применением ранее известного HGF-X8 SEQ ID NO: 7 через введение в AAV вектор.

Полинуклеотид может быть доставлен субъекту в состоянии «голой» ДНК или состоянии, при котором он содержится в системе доставки гена. Показано, что плазмида, вирусный вектор или т.п. могут быть использованы в качестве системы доставки гена, но, как описано выше, в настоящем изобретении в качестве системы доставки гена используют вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

Векторы AAA могут инфицировать неделящиеся клетки и могут инфицировать разные виды клеток. Подробные описания конструкции и применения AAA векторов раскрыты в патенте США №5139941 и №4797368. Результаты исследований по AAV в качестве системы доставки гена раскрыты в LaFace et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp.Hematol. (NY), 21:928-933 (1993); Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994); и Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995). Типично, вирусы AAV получают посредством совместной трансфекции плазмидой, содержащей последовательность целевого гена, фланкированную двумя концевыми повторами AAV (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); и Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)), экспрессионной плазмидой, содержащей кодирующую последовательность AAV дикого типа без концевых повторов и плазмидой, содержащей ген хэлперного аденовируса (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991)).

AAV вектор по настоящему изобретению можно использовать для доставки последовательности чужеродного гена в клетки посредством разных способов вирусного инфицирования, известных в данной области, и данные способы особым образом не ограничены.

AAV вектор по настоящему изобретению имеет серотип AAV, выбранный из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 и AAV16.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный описанным выше AAV вектором.

AAV вектор по настоящему изобретению можно вводить в соответствующие клетки-хозяева, например, клетки млекопитающего, такие как клетки 293Т, или клетки насекомого или т.п., и трансформированные клетки-хозяева можно использовать для получения массовой репликации ДНК гена по настоящему изобретению или массовой продукции его белка.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая описанный выше AAV вектор, для предупреждения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN) или бокового амиотрофического склероза (ALS).

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «предупреждение» относится ко всем действиям подавления диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза посредством введения композиции по настоящему изобретению.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «лечение» относится к (а) задержке или подавлению прогрессирования/развития диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза; (б) облегчению диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза; и (в) устранению диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза.

Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, который обычно используется для препарата, и его примеры могут включать лактозу, дектсрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метил целлюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла, но не ограничиваются ими. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать, помимо приведенных выше ингредиентов, смазывающее вещество, увлажнитель, подсластитель, корригент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и т.п. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и препараты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению предпочтительно можно вводить парентерально, и, например, можно использовать внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечную инъекцию, подкожное введение, интратекальное введение, интрацеребровентрикулярную инъекцию, внутримозговую инъекцию или местное введение.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и введена в виде инъекции. Соответствующая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от факторов, таких как способ приготовления, способ введения, возраст пациента, масса тела и пол, тяжесть симптомов заболевания, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа. Обычный квалифицированный практик может легко определять и прописывать дозу, эффективную для желательного лечения. Согласно воплощению настоящего изобретения AAV вектор по настоящему изобретению вводят в количестве 1×10⁸ - 1×10¹² GC/сайт.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества согласно способу, который может легко реализовать обычный специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, и фармацевтическая композиция может быть получена в единичной лекарственной форме или может быть вставлена в многодозный контейнер. Препарат может находиться в виде раствора, суспензии или эмульсии в масляной или водной среде, или экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы, и препарат может дополнительно содержать диспергирующее средство или стабилизатор.

В одном воплощении настоящего изобретения описанная выше диабетическая периферическая нейропатия представляет собой полинейропатию или очаговую нейропатию.

В одном воплощении настоящего изобретения упомянутая выше полинейропатия представляет собой по меньшей мере одну диабетическую периферическую нейропатию, выбранную из группы, состоящей из гипергликемической нейропатии, дистальной симметричной полинейропатии, автономной нейропатии, острой сенсорной нейропатии, острой болезненной сенсорной нейропатии и хронической сенсомоторной нейропатии. Более конкретно, упомянутая очаговая нейропатия представляет собой по меньшей мере одну диабетическую периферическую нейропатию, выбранную из группы, состоящей из краниальной нейропатии, туловищной нейропатии, нейропатии конечностей, грудопоясничной радикулоневропатии и нейропатии пояснично-крестцового сплетения.

Эффекты, обеспечивающие преимущество

Признаки и преимущества настоящего изобретения кратко обобщены следующим образом.

(а) Согласно настоящему изобретению предложен вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из заранее установленной нуклеотидной последовательности.

(б) Согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный описанным выше AAV вектором.

(в) Согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая описанный выше вектор AAV, для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN) или бокового амиотрофического склероза (ALS).

(г) При применении AAV вектора по настоящему изобретению можно доставлять субъекту гибридный ген HGF с высокой эффективностью доставки.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой блок-схему, показывающую способ получения усеченных мутантов HGF-X7 из pCK-HGF-X7.

Фиг. 2 представляет собой блок-схему, показывающую способ клонирования усеченных мутантов HGF-X7 в векторы рСА.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии белка HGF в клетках С2С12, инфицированных AAV-pCA-HGF-X7-d3 и AAV-pCA-HGF-X7-d4, соответственно.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии белка HGF в клетках С2С12, инфицированных AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий замедление прогрессирования заболевания после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий степень улучшения коэффициента выживаемости после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий степень замедления потери массы после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.

На Фиг. 8 изображены графики, показывающие результаты исследования коэффициента выживаемости и анализа поведенческого теста после интратекального введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.

Способ осуществления изобретения

Далее в данном документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Данные примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен данными примерами в соответствии с сущностью настоящего изобретения.

Примеры

Пример анализа 1: Получение производных HGF-X7

Для конструирования AAV вектора, экспрессирующего две изоформы HGF четыре производных получали из SEQ ID NO: 1 (pCK-HGF-X7) посредством сайт-направленного мутагенеза. Подробное описание данного способа выглядит следующим образом. Сначала, проводили ПЦР (полимеразная цепная реакция) (набор для сайт-направленного мутагенеза, Stratagene, США), используя ДНК SEQ ID NO: 1 в качестве матрицы. Последовательности праймеров, которые были использованы, выглядят следующим образом.

Из колоний, полученных посредством доставки ПЦР-продуктов в С-клетки, отбирали колонии, содержащие pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 и pCK-HGF-X7-d4, и из них выделяли плазмидную ДНК (см. Фиг. 1).

Пример анализа 2: Конструирование производных pCA-HGF-X7

Для получения AAV, содержащих четыре производных, полученных в Примере анализа 1, данные производные клонировали в соответствующие векторы рСА (система, не содержащая хэлперного AAV, Agilent, США). Сначала, pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 и pCK-HGF-X7-d4 в Примере анализа 1 расщепляли эндонуклеазами рестрикции Clal и Sall с получением четырех типов фрагментов HGF-X7-d1, HGF-X7-d2, HGF-X7-d3 и HGF-X7-d4. Векторы рСА также расщепляли посредством эндонуклеаз рестрикции Clal и Sail и затем подвергали лигированию с четырьмя типами фрагментов HGF-X7-d1, HGF-X7-d2, HGF-X7-d3 и HGF-X7-d4, конструируя, таким образом, pCA-HGF-X7-d1, pCA-HGF-X7-d2, рСА-HGF-X7-d3 и pCA-HGF-X7-d4, соответственно (см. Фиг. 2).

Пример анализа 3: Получение производных AAV-pCA-HGF-X7

Соответствующие пладмидные ДНК, сконструированные в Примере анализа 2, использовали для получения AAV. Для получения AAV клетки 239Т (АТСС) получали днем ранее и стабилизировали в течение 24 часов. Клетки 293Т трансфицировали плазмидными ДНК, сконструированными в Примере анализа 2, pHelper в качестве ДНК, необходимой для получения AAV, и pAAV-RC (система, не содержащая хэлперного AAV, Agilent, США), и, спустя трое суток, собирали AAV. Титры собранных AAV измеряли, используя набор для титрования (набор для титрования AAVpro, Takara, JP). AAV получали, используя в общей сложности четыре серотипа (AAV1, AAV2, AAV5 и AAV6).

Пример анализа 4: Проверка экспрессии hHGF или ее отсутствия производных AAV-pCA-HGF-X7

4-1. Способы

Из AAV, полученных в Примере анализа 3, AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4 анализировали для исследования экспрессии hHGF. Сначала, клетки С2С12 (АТСС) высевали в количестве 8x104 клеток/лунка в 12-луночный планшет, и клетки стабилизировали в течение 24 часов. Клетки С2С12 соответственно инфицировали эквивалетными титрами AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4. Супернатант собирали через двое суток после инфицирования, и количество белка HGF анализировали посредством проведения ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ) HGF (системы R&D, США).

4-2. Результаты

В результате анализа, подтвердили, что оба AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4 экспрессировали белок HGF. Главным образом, подтвердили, что уровень экспрессии HGF AAV2-pCA-HGF-X7-d4 был выше, чем уровень экспрессии HGF AAV2-pCA-HGF-X7-d3 (см. Фиг. 3).

Пример анализа 5: Сравнение экспрессии hHGF у AAV-pCA-HGF-X7-d4 и AAV-pCA-HGF-X8

5-1. Способы

AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8 тестировали для сравнения уровня экспрессии hHGF следующим образом. Сначала, клетки С2С12 (АТСС) высевали в количестве 8x104 клеток/лунка в 12-луночный планшет, и клетки стабилизировали в течение 24 часов. Клетки С2С12 соответственно инфицировали эквивалентными титрами AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8. Супернатант собирали через двое суток после инфицирования, и количество белка HGF анализировали посредством проведения ELISA HGF (системы R&D, США).

5-2. Результаты

В результате анализа подтвердили, что как AAV2-pCA-HGF-X7-d4, так и AAV2-pCA-HGF-X8 экспрессировали белок HGF, но AAV2-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировал значимо более высокий уровень экспрессии HGF в примерно 9-10 раз, по сравнению с AAV2-pCA-HGF-X8 (см. Фиг. 4).

Пример анализа 6: Эффект внутримышечной инъекции AAV-pCA-HGF-X7-d4 в мышиных моделях ALS

6-1. Способы

6-1-1. Изготовление мышиных моделей ALS и доставка гена

Широко используемые модели hSOD1-G93A использовали в качестве моделей ALS. Модели получали посредством скрещивания мышей с ALS (Jackson Laboratory, США), подвергали генотипированию и затем исследовали на наличие или отсутствие Tg. Спустя десять недель после рождения, мышей распределяли по двум группам (Tg-AAV6-MCS: 8 животных, Tg-AAV6-pCA-HGF-X7-d4: 7 животных). Отбирали индивиды без Tg и использовали в качестве отрицательного контроля (без Tg: 5 животных). Мышам в возрасте 90 дней вводили AAV в количестве 1×10⁸ GC/сайт через мышцу бедра, переднюю большеберцовую мышцу и икроножную мышцу. В общей сложности вводили 3×10⁸ GC/голова.

6-1-2. Измерение скорости прогрессирования заболевания, коэффициента выживаемости и массы

Для оценки эффективности определяли скорость прогрессирования заболевания и массу, и наблюдали за тем, выживали индивиды или нет.Заболевание ALS в конечном итоге вызывает смерть по мере прогрессирования заболевания, и, таким образом, три индикатора, приведенных выше, являются репрезентативными критериями анализа, которые широко используются в анализах животных с ALS. Скорость прогрессирования заболевания измеряли в соответствии со следующими стандартами и выражали численно.

Оценка симптомов в баллах

5 баллов: нормально

4 балла: поддерживалось равновесие нижней части тела на протяжении 1-2 секунд при хватании за мышиный хвост.

3 балла: поддерживалось равновесие нижней части тела на протяжении меньше чем 1 секунда при хватании за мышиный хвост, но ходьба была в норме

2 балла: равновесие нижней части тела не поддерживалось, волочение ног

1 балл: равновесие нижней части тела не поддерживалось, ходьба на кончиках лап.

0 баллов: смерть

6-2. Результаты

Подтверждали, что заболевание ухудшалось со временем у мышей с ALS (группа введения AAV6-MCS). Однако, подтвердили, что прогрессирование заболевания замедлялось в результате введения AAV6-pCA-HGF-X7-d4. Когда прогрессирование заболевания выражали численно, мыши с ALS имели средний балл по шкале оценки симптомов 2,36 на всем протяжении периода анализа, тогда как группа, которой вводили AAV6-pCA-HGF-X7-d4, демонстрировала средний балл по шкале оценки симптомов 2,88, показывая более высокое значение, чем значение в случае мышей с ALS (группа введения AAV6-MCS) (см. Фиг. 5).

Также подтверждали, что введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 приводило к значительному эффекту улучшения в коэффициенте выживаемости. В этом отношении, группа, которой вводили AAV6-MCS, жили в среднем 139 дней с момента рождения, тогда как группа, которой вводили AAV6-pCA-HGF-X7-d4, жила в среднем 147 дней, указывая на увеличение примерно на 8 дней (см. Фиг. 6).

Наконец подтвердили, что мыши с ALS (AAV6-MCS) имели заметное увеличение в потере массы вследствие потери мышечной массы, но введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 замедляло потерю массы. А именно, посредством относительного сравнения массы подтвердили, что мыши с ALS имели среднее изменение массы, составляющее примерно 34% с момента введения до конца анализа, но введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировало среднее изменение массы, составляющее 22%, указывая на более медленную потерю массы (см. Фиг. 7).

Пример анализа 7: Эффект интратекального введения AAV-pCA-HGF-X7-d4 мышиным моделям ALS

7-1. Способы

7-1-1. Изготовление мышиных моделей ALS и доставка гена

Широко используемые модели hSOD1-G93A использовали в качестве моделей ALS. Модели получали посредством скрещивания мышей с ALS (Jackson Laboratory, США), подвергали генотипированию и затем исследовали на наличие или отсутствие Tg. Индивидов, сохраняющих предварительно установленный уровень мутантного гена, отбирали и использовали в анализе. Индивидов без Tg использовали в качестве отрицательного контроля (13 животных). Индивидов с Tg распределяли по группам Tg-AAV1-MCS и Tg-AAV1-pCA-HGF-X7-d4, содержащим 14 и 16 животных, соответственно. В возрасте 60 дней мышам один раз интратекально вводили AAV в количестве 5×10⁹ GC/сайт.

7-1-2. Исследование коэффициента выживаемости и анализ поведенческого теста

Для подробного исследования эффективности, коэффициента выживаемости, исследовали один из наиболее важных показателей при ALS, и для исследования индивидуальной двигательной способности у индивидов, страдающих от заболевания ALS, проводили тесты «вращающийся стержень» и «висящая проволока». Кроме того, для исследования силы мышечной функции измеряли силу захвата.

Коэффициент выживаемости исследовали посредством проверки выживания или гибели индивидов каждый день. В отношении теста «вращающийся стержень», использовали способ ускорения, при котором мышь помещали на вращающийся стержень, и затем измеряли то, как долго мышь проведет на вращающемся стержне, и, в частности, скорость вращающегося стержня усиливали с течением времени.

В отношении теста «висящая проволока», мышь помещали на структуру с решетчатой структурой, и затем данную структуру переворачивали и измеряли время, которое индивид проводил, вися на данной структуре вниз головой.

В отношении теста силы захвата, передние и задние лапы мыши помещали на устройство измерения силы и затем измеряли силу мышц.

Данные выражены в виде среднее плюс/минус SEM (от англ. Standard error of the mean - стандартная ошибка среднего), и статистический анализ для каждого набора данных проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ в каждом случае с последующим ретроспективным анализом с критерием Тьюки (*: р меньше 0,05, **: р меньше 0,01, ***: р меньше 0,001, ****: р меньше 0,0001).

7-2. Результаты

Подтвердили, что эффект лечения наблюдался при интратекальном введении AAV1-pCA-HGF-X7-d4. Сначала, в результате исследования выживаемости группа введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировала значимое увеличение выживаемости, по сравнению с группой введения AAV1-MCS. Подтвердили, что мыши имели среднюю продолжительность жизни 144 дня при введении AAV1-MCS, тогда как индивиды, которым вводили AAV1-pCA-HGF-X7-d4, демонстрировали среднюю продолжительность жизни 160 дней, указывая на увеличение, составляющее примерно 16 дней.

Наблюдалось, что двигательная активность действительно повышалась. В тесте «вращающийся стержень» отрицательный контроль оставался на вращающемся стержне на протяжении в среднем 226 секунд, тогда как данный период времени значимо уменьшался до 112 секунд в группе Tg-AAV1-MCS. Однако, данный период времени улучшался в среднем до 151 секунды в случае тестируемой группы, которой вводили AAV1-pCA-HGF-X7-d4. Похожие эффекты лечения также наблюдали в тестах «висящая проволока» и силы захвата. В частности, на последней стадии прогресирования заболевания (на сутки 137 с рождения), время, проведенное в подвешенном состоянии на проволоке, составляло примерно 31 секунду в группе введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4, что указывало на большое увеличение, по сравнению с примерно 7 секундами в группе введения AAV1-MCS. Также в результатах измерения силы захвата, группа введения AAV1-MCS демонстрировала силу приблизительно 28 г, но сила значимо увеличивалась до 66 г в группе введения pCA-HGF-X7-d4 (см. Фиг. 8).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> HELIXMITH CO., LTD

<120> ВЕКТОР НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА (AAV), ИМЕЮЩИЙ ГИБРИДНЫЙ ГЕН HGF, ВВЕДЕННЫЙ В НЕГО

<130> PP180055

<150> KR 10-2017-0184738

<151> 2017-12-29

<160> 15

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 7377

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pCK-HGF-X7

<400> 1

cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600

accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660

accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720

gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780

tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840

gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900

ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960

caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020

ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080

aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140

cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200

gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260

caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320

agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380

aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440

aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500

taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560

ttgacacgaa gcttgctagc accatgtggg tgaccaaact cctgccagcc ctgctgctgc 1620

agcatgtcct cctgcatctc ctcctgctcc ccatcgccat cccctatgca gagggacaaa 1680

ggaaaagaag aaatacaatt catgaattca aaaaatcagc aaagactacc ctaatcaaaa 1740

tagatccagc actgaagata aaaaccaaaa aagtgaatac tgcagaccaa tgtgctaata 1800

gatgtactag gaataaagga cttccattca cttgcaaggc ttttgttttt gataaagcaa 1860

gaaaacaatg cctctggttc cccttcaata gcatgtcaag tggagtgaaa aaagaatttg 1920

gccatgaatt tgacctctat gaaaacaaag actacattag aaactgcatc attggtaaag 1980

gacgcagcta caagggaaca gtatctatca ctaagagtgg catcaaatgt cagccctgga 2040

gttccatgat accacacgaa cacaggtaag aacagtatga agaaaagaga tgaagcctct 2100

gtctttttta catgttaaca gtctcatatt agtccttcag aataattcta caatcctaaa 2160

ataacttagc caacttgctg aattgtatta cggcaaggtt tatatgaatt catgactgat 2220

atttagcaaa tgattaatta atatgttaat aaaatgtagc caaaacaata tcttacctta 2280

atgcctcaat ttgtagatct cggtatttgt ggatcctggg taggaaacac atttgaatgg 2340

tatttactaa gatactaaaa tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc 2400

aaggtctcag taaaagtaga aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa 2460

tgtaactgga ttttcaaaga aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt 2520

atgatctttt gtgtaaagtc tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc 2580

acaagcagta caaaagtata aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat 2640

gctggtaata acactaagag tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag 2700

ttactgcact caatggctta ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag 2760

tcaaaatgat caaaattatt gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta 2820

gatacagact acaaagtgga gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta 2880

ctctattatc ccttggagct tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta 2940

tggttacact cagtgcacag gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg 3000

gtctcacagt aagaaagtga gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct 3060

ttattcatgt tacttcatga atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat 3120

aagaaaagca ataaacaaac aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga 3180

tttcaaaatc agtggcagcg atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct 3240

gctatctttt agtggagctt tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat 3300

gtttgactca gcaaattcac aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca 3360

gctaaatgga tgttaataaa attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt 3420

aaggtaaaat atatgaagga atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata 3480

cccactaatt agtaaaatta ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat 3540

tatcatttta aaactagctt tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac 3600

tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag 3660

gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat 3720

ggggagagtt atcgaggtct catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg 3780

gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt 3840

gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac 3900

cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac 3960

actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc 4020

actgtcaata ccatttggaa tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac 4080

gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga 4140

aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc 4200

tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat 4260

ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg 4320

gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg 4380

aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga 4440

aatccactca ttccttggga ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct 4500

acaatagtca atttagacca tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt 4560

gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat 4620

aaacatatct gcggaggatc attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt 4680

ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga 4740

agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa 4800

ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt 4860

acgattgatt tacctaatta tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat 4920

ggctggggct acactggatt gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat 4980

ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct 5040

gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc 5100

ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt 5160

ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg 5220

atacacaaaa ttattttaac atataaggta ccacagtcat agcggccgct ctagagggcc 5280

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 5340

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 5400

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 5460

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagtcgaa 5520

attcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 5580

ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 5640

cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 5700

aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 5760

acgacgagat cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 5820

gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 5880

gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 5940

agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 6000

tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 6060

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 6120

cgcgctgcct cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 6180

accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 6240

tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 6300

ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc 6360

ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca 6420

accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc 6480

cagtctagct atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg 6540

ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc 6600

ggactggctt tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 6660

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 6720

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 6780

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 6840

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 6900

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 6960

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7020

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 7080

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 7140

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 7200

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7260

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7320

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatg 7377

<210> 2

<211> 3479

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X7-d1

<400> 2

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tcctattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa 780

ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat 840

gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg 900

aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat 960

cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc 1020

tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat 1080

ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg 1140

taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag 1200

ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta 1260

actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa 1320

aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 1380

tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 1440

gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 1500

cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 1560

gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1620

ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1680

ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1740

tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1800

aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1860

tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1920

aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1980

agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 2040

atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 2100

ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 2160

acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 2220

gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 2280

attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 2340

gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 2400

caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 2460

attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 2520

taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 2580

cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2640

cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2700

aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2760

cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2820

gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2880

ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2940

ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 3000

tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 3060

tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 3120

ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 3180

gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 3240

tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 3300

agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 3360

tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 3420

catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3479

<210> 3

<211> 3279

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X7-d2

<400> 3

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tcctttacta ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca 780

aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat 840

acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc 900

tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg 960

ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc 1020

tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta 1080

ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag 1140

aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt 1200

caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct 1260

atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt 1320

tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct 1380

aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag 1440

gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc 1500

actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat 1560

cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac 1620

tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta 1680

cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg 1740

gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat 1800

catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat 1860

gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct 1920

cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact 1980

gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact 2040

gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag 2100

catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat 2160

ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac 2220

tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc 2280

aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac 2340

aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat 2400

gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat 2460

ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca 2520

atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta 2580

aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa 2640

catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc 2700

ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga 2760

ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga 2820

tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg 2880

attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc 2940

tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata 3000

atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa 3060

atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca 3120

cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga 3180

tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata 3240

cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3279

<210> 4

<211> 3079

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X7-d3

<400> 4

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tcctaaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 780

agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 840

gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 900

tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 960

taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1020

tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1080

aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1140

ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1200

caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1260

taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1320

ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1380

gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 1440

agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 1500

tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 1560

ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 1620

caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 1680

cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 1740

tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 1800

tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 1860

aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 1920

tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 1980

ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2040

tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2100

atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2160

tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2220

agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2280

ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2340

cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 2400

aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 2460

gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 2520

ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 2580

ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 2640

gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 2700

atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 2760

caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 2820

ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 2880

gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 2940

aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3000

tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3060

taaggtacca cagtcatag 3079

<210> 5

<211> 2879

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X7-d4

<400> 5

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tccttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 780

tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 840

gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 900

cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 960

gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1020

ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1080

ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1140

tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1200

aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1260

tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1320

aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1380

agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 1440

atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 1500

ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 1560

acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 1620

gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 1680

attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 1740

gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 1800

caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 1860

attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 1920

taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 1980

cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2040

cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2100

aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2160

cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2220

gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2280

ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2340

ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 2400

tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 2460

tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 2520

ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 2580

gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 2640

tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 2700

agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 2760

tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 2820

catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 2879

<210> 6

<211> 3679

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X7

<400> 6

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780

ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840

aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900

gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960

cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020

aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080

ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140

ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200

gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260

tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320

caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380

agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440

gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500

tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560

taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620

tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680

aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740

ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800

caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860

taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920

ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980

gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040

agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100

tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160

ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220

caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280

cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340

tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400

tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460

aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520

tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580

ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640

tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700

atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760

tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820

agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880

ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940

cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000

aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060

gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120

ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180

ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240

gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300

atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360

caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420

ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480

gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540

aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600

tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660

taaggtacca cagtcatag 3679

<210> 7

<211> 2730

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HGF-X8

<400> 7

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780

aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840

ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900

atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960

taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020

actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080

cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140

gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200

cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260

ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320

tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380

tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440

ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500

atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560

actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620

tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680

attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740

atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800

gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860

tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920

ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980

ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040

ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100

ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160

gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220

aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280

gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340

cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400

actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460

gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520

ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580

gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640

ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700

attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730

<210> 8

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер d1

<400> 8

tctcggtatt tgtggatcct attatgatct tttgtgtaaa 40

<210> 9

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер d1

<400> 9

tttacacaaa agatcataat aggatccaca aataccgaga 40

<210> 10

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер d2

<400> 10

tctcggtatt tgtggatcct ttactattat aaaccaaaac 40

<210> 11

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер d2

<400> 11

gttttggttt ataatagtaa aggatccaca aataccgaga 40

<210> 12

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер d3

<400> 12

tctcggtatt tgtggatcct aaggtgtaag atgttaaagg 40

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер d3

<400> 13

cctttaacat cttacacctt aggatccaca aataccgaga 40

<210> 14

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер d4

<400> 14

tctcggtatt tgtggatcct tataagaaaa gcaataaaca 40

<210> 15

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер d4

<400> 15

tgtttattgc ttttcttata aggatccaca aataccgaga 40

1

<---

1. Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из а) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или б) кодон-модифицированной нуклеотидной последовательности, обладающей гомологией последовательностей по меньшей мере 80% с SEQ ID NO: 5, где указанная кодон-модифицированная нуклеотидная последовательность кодирует ту же самую аминокислотную последовательность как кодирующая область SEQ ID NO: 5.

2. Клетка-хозяин, содержащая AAV вектор по п. 1 и продуцирующая белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

3. Композиция, содержащая AAV вектор по п. 1, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) или диабетической периферической нейропатии (DPN).

4. Композиция по п. 3, где диабетическая периферическая нейропатия представляет собой полинейропатию или очаговую нейропатию.