Конъюгат "цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство" и способ его получения

Авторы патента:

ЛИ, Цзе (CN)

ЧЖУ, И (CN)

ВАН, Иси (CN)

ЧЖО, Ши (CN)

ЧЭНЬ, Лань (CN)

ВАНЬ, Вэйли (CN)

ЮЙ, Юнго (CN)

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K47/68 - Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками

Владельцы патента RU 2762594:

СЫЧУАНЬ БАЙЛИ ФАРМ КО., ЛТД. (CN)

Изобретение относится к конъюгату «цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство» с участками встраивания цистеина в положение 205 и/или положение 206 (система нумерации по Kabat) легкой цепи антитела и/или положение 439 (система нумерации по Kabat) тяжелой цепи. Встраивая цистеин (C) в тяжелую цепь и/или легкую цепь целевого антитела в конкретный участок встраивания и осуществляя сайт-специфическую конъюгацию с помощью свободной тиоловой группы (-SH) сайт-специфически встроенного цистеина и линкера, конъюгированного с высокоактивным низкомолекулярным цитотоксином, получают конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство» с хорошей гомогенностью. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 28 ил., 5 табл., 32 пр.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка представляет собой заявку на национальном этапе по международной заявке № PCT/CN2017/104706, поданной 30 сентября 2017 года, по которой испрашивают приоритетное преимущество по патентной заявке Китая № 201610876568.9, поданной 8 октября 2016 года, полное описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к терапевтическим соединениям и способам их получения, и, в частности, к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» и способам их получения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) представляют большой интерес в области таргетной терапии. Два лекарственных средства, адцетрис и кадсила, одобрены для продажи в США и продемонстрировали хорошую клиническую эффективность. Более 50 лекарственных средств на основе ADC проходят стадию клинических испытаний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» (TDC), способам получения конъюгатов «антитело-цитотоксин» и способам их применения.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин». В одном из вариантов осуществления участок встраивания цистеина включает один или более из следующих трех участков встраивания или положений встраивания в целевых антителах: положение 205 легкой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит GLSSPCVTKSF, при этом C представляет собой встроенный цистеин), положение 206 легкой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит GLSSPVCTKSF, при этом C представляет собой встроенный цистеин) и положение 439 тяжелой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит YTQKSLSCLSPGK, при этом C представляет собой встроенный цистеин).

Антитело, содержащее одну или более из указанных выше мутаций с инсерцией цистеина, сохраняет способность к связыванию с антигеном, присущую родительскому антителу (аффинность). В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к сайт-специфическому соединению конъюгата «антитело-цитотоксин «(TDC) по тиоловой группе цистеина с использованием конъюгата «линкер-лекарственное средство» (т.е. линкер-цитотоксин), где тиоловая группа принадлежит цистеину, встроенному в положение 205 или/и положение 206 легкой цепи или/и положение 439 тяжелой цепи.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин», содержащему антитело, включаеющее сайт-специфически встроенный цистеин, где участок встраивания цистеина содержит один или более участков, выбранных из следующих трех участков встраивания: положение 205 константной области каппа/лямбда-легкой цепи (система нумерации по Kabat), положение 206 константной области каппа/лямбда-легкой цепи (система нумерации по Kabat) или положение 439 константной области тяжелой цепи антитела IgG (система нумерации по Kabat).

Аминокислотная последовательность, окружающая участок встраивания цистеина, включает одну или более из следующих трех последовательностей: LC-205ins: GLSSPCVTKS; LC-206ins: GLSSPVCTKSF или HC-439ins: TQKSLSCLSPGK.

В одном из вариантов осуществления высокоактивный цитотоксин конъюгируют с помощью линкера со свободной тиоловой группой из модифицированного цистеина, встроенного в конкретные участки встраивания цистеина антитела, где легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность GLSSPCVTKSF или GLSSPVCTKSF, и тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность TQKSLSCLSPGK, и где C является цистеином, встроенным в положение 205 легкой цепи, положение 206 легкой цепи или положение 439 тяжелой цепи антитела.

В одном из вариантов осуществления легкая цепь антитела имеет изотип каппа (κ) или лямбда (λ). В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь антитела имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном из вариантов осуществления встроенный цистеин содержит тиоловую группу (-SH). В одном из вариантов осуществления тиоловая группа (-SH) способна к химической конъюгации.

В одном из вариантов осуществления низкомолекулярный, высокоактивный цитотоксин сайт-специфически соединяют со свободной тиоловой группой встроенного цистеина с помощью линкера; низкомолекулярный высокоактивный цитотоксин может включать, в качестве неограничивающих примеров, MMAE, MMAF, PBD, SN-38, Dox и их производные. Формулы примеров цитотоксинов, MMAE, MMAF, PBD, SN-38, Dox, представлены ниже:

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин». В одном из вариантов осуществления способ включает стадии: восстановления антитела с помощью восстановителя (такого как DTT, TCEP и т.п.) для получения восстановленного антитела, удаления защитной группы из встроенного цистеина антитела для получения свободной тиоловой группы; удаления восстановителя и защитной группы посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации; окисления восстановленного антитела с помощью окислителя (такого как DHAA, CuSO₄) для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей антитела; добавления конъюгата «линкер-лекарственное средство» (т.е. линкер-цитотоксин) для конъюгации со свободной тиоловой группой модифицированного цистеина и удаления неконъюгированного конъюгата «линкер-лекарственное средство» посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации.

Список аминокислот:

Название	Символ и аббревиатура
Аланин	A и Ala
Аргинин	R и Arg
Аспарагин	N и Asn
Аспарагиновая кислота	D и Asp
Цистеин	C и Cys
Глутамин	Q и Gln
Глутаминовая кислота	E и Glu
Глицин	G и Gly
Гистидин	H и His
Изолейцин	I и Ile
Лейцин	L и Leu
Лизин	K и Lys
Метионин	M и Met
Фенилаланин	F и Phe
Пролин	P и Pro
Серин	S и Ser
Треонин	T и Thr
Триптофан	W и Trp
Тирозин	Y и Tyr
Валин	V и Val

SEQ ID NO: 6 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа)LC-Cys205insc

>LC-Cys205ins-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCVTKSFNRGEC

где C в GLSSPVCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.

SEQ ID NO: 8 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206insc

>LC-Cys206ins-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVCTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 10 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins

>IgG1-Fc-Cys439ins

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCLSPGK

где C в TQKSLSCLSPGK является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузка.

SEQ ID NO: 12 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C

>LC-V205C-Каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC

где C в GLSSPCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.

В настоящем описании представлен новый конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» (TDC), который обладает значительными преимуществами по сравнению с не-сайт-специфически конъюгированным ADC, включая, в качестве неограничивающих примеров, хорошую гомогенность и низкую частоту побочных эффектов. Доклинические исследования подтверждали, что эти новые конъюгаты антител значительно превосходят не-сайт-специфически конъюгированные ADC.

Цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания предпочтительных вариантов осуществления и сопутствующих чертежей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изложенные выше и другие признаки настоящего изобретения будут более очевидными из следующего описания и формулы изобретения вместе с сопутствующими чертежами. На представленных чертежах изображены лишь некоторые варианты осуществления, приведенные в соответствии с описанием, и, таким образом, не следует истолковывать их как ограничение объема настоящего изобретения, изобретение будет описано более подробно с помощью сопутствующих чертежей, на которых:

Фигура 1 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAEby способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 2 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 3 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 4 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 5 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 6 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 7 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 8 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;

Фигура 9 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению соотношения токсин/антитело для 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом RP-ВЭЖХ, как описано в примере 26.

Фигура 10 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3 способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;

Фигура 11 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-LC-Cys205ins способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;

Фигура 12 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-LC-Cys206ins способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;

Фигура 13 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-HC-Cys439ins способа SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;

Фигура 14 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 28;

Фигура 15 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 29, где показано измерение аффинности антигена c-met и антитела 4E1 и TDC 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM и 4E1-HC-Cys439ins-MVPM;

Фигура 16 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 29, где показано измерение аффинности антигена Trop2 и антитела 4D3 и TDC 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM и 4D3-HC-Cys439ins-MVPM;

На фигуре 17 показана IC₅₀ для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMA, и злокачественные клетки представляют собой EGFRwt-гиперэкспрессирующие клетки плоскоклеточной карциномы человека A431;

На фигуре 18 показана IC₅₀ для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, и злокачественные клетки представляют собой EGFRvIII-гиперэкспрессирующую линию клеток глиомы человека U87-EGFRvIII;

На фигуре 19 показана IC₅₀ для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4E1, и злокачественные клетки представляют собой C-met-высокоэкспрессирующую линию клеток глиомы U87-MG;

На фигуре 20 показана IC₅₀ для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3, и злокачественные клетки представляют собой trop2-высокоэкспрессирующую линию клеток рака поджелудочной железы BXPC-3;

Фигура 21 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 22 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 23 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 24 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 25 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 26 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE;

Фигура 27 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению фармакодинамического эффекта в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3 у несущих опухоль мышей; и

Фигура 28 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению фармакодинамического эффекта в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3 у несущих опухоль мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В следующем подробном описании приведены ссылки на сопутствующие чертежи, являющиеся его частью. На чертежах схожими символами, как правило, указаны схожие компоненты, если контекст не указывает на иное. Иллюстративные варианты осуществления, представленные в подробном описании, чертежах и формуле изобретения, не являются ограничивающими. Можно использовать другие варианты осуществления и можно осуществлять изменения без отклонения от сущности или объема изобретения, описанного в настоящей заявке. Следует понимать, что аспекты настоящего изобретения, в целом, описываемые в настоящей заявке и проиллюстрированные на фигурах, можно размещать, заменять, комбинировать, разделять и планировать в различных конфигурациях, все из которых конкретно предусмотрены в настоящем описании.

Пример 1: Синтез и получение mc

6-аминокапроновую кислоту (3,9 г, 0,03 моль) и малеиновый ангидрид(3,5 г, 0,036 моль) добавляли к ледяной уксусной кислоте (30 мл). После перемешивания при 120°C в течение 4-6 ч. реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Большую часть уксусной кислоты удаляли посредством концентрирования в вакууме при 60°C. Полученную коричневато-желтую вязкую жидкость наливали в воду, а затем экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3) и объединяли органические слои. Органические слои промывали водой и солевым раствором, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме для получения коричнево-желтого маслянистого вещества, которое перемешивали в 50 мл воды, и белых твердых веществ, осаждающихся из раствора, белые твердые вещества фильтровали и сушили продукт при пониженном давлении и 50°C, 5,08 г, выход 80%. Mp: 89-92°C. m/z: 212,2 [M+H]+. ¹H ЯМР (400Mz, DMSO): 13,21 (ш.с., 1H, COOH), 6,75 (с, 2H, COCH=CHCO), 3,63 (т, 2H, J=7,2 Гц, NCH2CH2), 2,42 (т, 2H, J=7,4 Гц, CH2COOH), 1,52-1,68 (м, 4H, NCH2CH2CH2CH2), 1,30-1,42 (м, 2H, NCH2CH2CH2CH2).

Пример 2: Синтез и получение Mc-OSu

В атмосфере азота к раствору смеси MC (4,7 г, 22 ммоль) и HOSu (25 г, 22 ммоль) в ацетонитриле (50 мл) при 0°C медленно добавляли DCC (4,5 г, 22 ммоль), растворенный в 25 мл ацетонитрила. Реакционный раствор реагировал при 0°C в течение 2 часов, а затем ему позволяли реагировать при комнатной температуре в течение ночи. После фильтрования фильтрационный осадок промывали ацетонитрилом (10 мл×3). Фильтрат концентрировали до высушивания при пониженном давлении. Полученное маслянистое вещество сушили при пониженном давлении и комнатной температуре в течение 6 ч. для получения 6,4 г светло-коричневого твердого вещества, выход 95% (для использования непосредственно на следующей стадии без очистки). m/z: 309,2 [M+H]+ ¹HNMR (400Mz, CDCl3): 1~2 (м, 6H, CCH2CH2CH2C), 2,68 (т, 2H, CH2CO), 2,95 (с, 4H, COCH2CH2CO), 3,68 (т, 2H, CH2N), 6,81 (с, 2H, CH=CH).

Пример 3: Синтез и получение Fmoc-Val-OSu

К раствору смеси Fmoc-Val (10 г) и HOSu (3,4 г) в THF (100 мл) при 0°C медленно добавляли DCC (6 г), растворенный в 50 мл ацетонитрила. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Осуществляли фильтрацию и промывали фильтрационный осадок THF. Прозрачное маслянистое вещество получали посредством концентрирования фильтратов при пониженном давлении. Маслянистое вещество использовали непосредственно на следующей стадии без дальнейшей очистки. m/z:437,4 [M+H]+.

Пример 4: Синтез и получение Fmoc-vc

К раствору Cit (4,0 г) в THF (20 мл) добавляли 60 мл водного раствора гидрокарбоната натрия (содержащего NaHCO₃, 2 г, 1,05 экв.). В смесь добавляли раствор Fmoc-Val-OSu (22,35 ммоль) в DME (60 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов в реакционную смесь добавляли 15% водный раствор лимонной кислоты (110 мл), а затем дважды экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы концентрировали в вакууме для получения белого твердого вещества. К белому материалу добавляли 100 мл метил-трет-бутилового эфира, смесь перемешивали, фильтровали и сушили фильтрационный осадок при пониженном давлении и 40°C в течение 4 ч. для получения 4,83 г продукта, выход 65%. m/z: 497,6 (M+H)+ ¹HNMR (400Mz, DMSO): 0,92 (6H, м), 1,35 ~ 1,65 (4H, м), 2,10 (1H, м), 3,01(2H, к), 3,99 (1H, т), 4,01 -4,45 (2H, м), 4,45 (2H, т), 5,46 (2H, ш.с.), 6,03(1H, т), 7,20-8,02 (8H, м), 8,25 (1H, д).

Пример 5: Синтез и получение Fmoc-vc-PABOH

К раствору Fmoc-vc (2 г, 4,2 ммоль) и PABOH(1,04 г, 2 экв.) в DCM/MeOH (2/1) (60 мл) добавляли EEDQ (2,0 г, 2 экв.) при 0°C. После перемешивания в течение 10 мин к смеси после частичного растворения медленно добавляли раствор (S)-1-фенилэтанамина (17,5 г, 144,2 ммоль) в MeOH (200 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней в темноте. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме при 40°C для получения белого твердого вещества. Белое твердое вещество собирали, промывали метил-трет-бутиловым эфиром (100 мл) и фильтровали. Фильтрационный осадок промывали метил-трет-бутиловым эфиром и полученное белое твердое вещество сушили при пониженном давлении и 40°C для получения 2,2 г белого твердого вещества, и выход 88%. m/z: 602,6 (M+H)+. ¹HNMR (400Mz, DMSO): 0,95 (6H, м), 1,45~1,69 (4H, м), 2,10 (1H, м), 3,11(2H, м), 3,99 (1H, м), 4,30 (2H, д), 4,05~-4,66 (2H, м), 4,55 (2H, д), 5,21 (1H, т), 5,51 (2H, ш.с.), 6,11(1H, т), 7,09 -8,10 (12H, м), 8,21 (1H, д), 10,51(1H, ш.с.).

Пример 6: Синтез и получение vc-PABOH

К раствору Fmoc-vc-PABOH (490 мг, 0,815 ммоль) в THF (10 мл) добавляли диэтиламин (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. К полученному продукту добавляли 20 мл DCM, смесь перемешивали и из реакционного раствора осаждали кристаллическое вещество. Кристаллическое вещество фильтровали и промывали фильтрационный осадок DCM, полученное твердое вещество сушили при пониженном давлении для получения 277 мг. Выход составлял 90%. m/z: 380,2 (M+H)+ ¹HNMR (400Mz, DMSO): 0,89 (6H, м), 1,31~1,61 (4H, м), 1,82 (1H, м), 2,86 (1H, м), 2,89(2H, д), 4,38 (2H, д), 4,44 (1H, м), 5,01 (1H, ш.с.), 5,35 (2H, ш.с.), 5,84 (1H, ш.с.), 7,14 (2H, д), 7,42 (2H, д), 8,08 (1H, ш.с.), 9,88 (1H, ш.с.).

Пример 7: Синтез и получение mc-vc-PABOH

VP-PABOH(205 мг, 0,54 ммоль) и MC-OSu (184 мг, 1,1 экв.) добавляли к 10 мл NMP и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 24 ч. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме при 40°C. К полученному маслянистому веществу добавляли метил-трет-бутиловый эфир (20 мл) и перемешивали для кристаллизации. После фильтрования кристаллического вещества и промывки фильтрационного осадка метил-трет-бутиловым эфиром получали 310 мг продукта. Выход составляет 100%. m/z: 573,3 (M+H)+ ¹HNMR (400Mz, DMSO): 0,89 (6H, м), 1,15-1,99 (10H, м), 2,11(1H, м), 2,31 (2H, т), 3,21(2H, м), 3,53 (2H, т), 4,32 (1H, т), 4,51 (1H, м), 4,59 (2H, ш.с.), 5,24 (1H, ш.с.), 5,56 (2H, ш.с.), 6,20(1H, ш.с.), 7,12(2H, с), 7,23(2H, д),7,58 (2H, д), 7,94 (1H, д), 8,1 7 (1H, д), 10,21 (1H, ш.с.)

Пример 8: Синтез и получение mc-vc-PAB-PNP

В атмосфере азота к раствору mc-vc-PABOH (166,0 мг, 0,294 ммоль) в безводном пиридине (5 мл) медленно добавляли PNP (179 мг, 3 экв.), растворенный в DCM (5 мл), при 0°C. После перемешивания при приблизительно 0°C в течение 10 мин убирали ледяную баню и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После завершения реакции добавляли EA (70 мл) и 15% водный раствор лимонной кислоты (100 мл) и разделяли и выделяли органический слой. Органический слой последовательно промывали лимонной кислотой, водой, солевым раствором, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении для получения светлого желтоватого маслянистого продукта. Добавление метил-трет-бутилового эфира для кристаллизации приводило к получению белого твердого вещества (86 мг). Выход составлял 40%. m/z: 738(M+H)+ ¹HNMR (400Mz, CDCl3/CD3OD): 0,84 (6H, м), 1,11-1,84 (10H, м), 2,05 (1H, м), 2,15 (2H, т), 3,09 (2H, м), 3,32 (2H, т), 4,12 (1H, м), 4,38 (1H, м), 5,15 (2H, с), 6,61 (2H, с), 6,84 (1H, д),7,61 (1H, д), 7,21 (2H, д), 7,50 (2H, д), 7,61 (2H, д), 8,18 (2H, д), 9,59 (1H, ш.с.)

Пример 9: Синтез и получение mc-vc-PAB-MMAE

20 мг mc-vc-PAB-PNP (1,5 экв.) и 3 мг HOBT добавляли к 2 мл DMF. После перемешивания при комнатной температуре в течение минуты добавляли 13 мг MMAE, 0,5 мл пиридина и 25 мкл DIEA. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. После завершения реакции реакционный раствор очищали с помощью препаративной колонки и желаемые компоненты собирали, концентрировали и лиофилизировали для получения приблизительно 10 мг продукта, выход составлял приблизительно 42%. m/z: 1317,1 (M+H)+.

Пример 10: Синтез и получение mc-vc-PAB-MMAF

Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 12,5 мг mc-vc-PAB-MMAF, выход составлял 45,2%.

Пример 11: Синтез и получение mc-vc-PAB-PBD

Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 9,5 мг mc-vc-PAB-PBD. Выход составлял 32,5%. m/z: 1325,4 (M+H)+.

Пример 12: Синтез и получение mc-vc-PAB-DOX

Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 11,2 мг mc-vc-PAB-DOX. Выход составлял 38,9%. m/z: 1143,2 (M+H)+.

Пример 14: Синтез и получение mc-vc-PAB-SN-38

100 мг 10-O-Boc-SN-38 растворяли в 10 мл сухого дихлорметана, к растворителю добавляли 25,6 мг (1 экв.) DMAP, по каплям добавляли раствор трифосгена в дихлорметане при 0°C (62 мг трифосгена растворяли в 2 мл дихлорметана) и продолжали реакцию при 0°C в течение 12 ч. Дихлорметан удаляли при пониженном давлении. Неочищенные продукты растворяли в 10 мл сухого DMF, затем добавляли 144 мг mc-vc-PABOH и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. 41 мг mc-vc-PAB-SN-38 выделяли посредством отделения жидкой фазы препарата, и общий выход в двух стадиях составлял 19,7%. m/z: 1063,2(M+H)+.

Пример 15: Экспрессия и очистка целевого антитела

Целевое антитело экспрессировали с использованием клеток Freestyle™ 293-F (Invitrogen) в суспензионной культуре. За день до трансфекции клетки высевали при плотности 6×10⁵ клетки/мл во встряхиваемой колбе емкостью 1 л, содержащей 300 мл полной среды F17 (экспрессионной среды Freestyle™ F17, Gibco), выращивали в течение ночи при встряхивании при 37°C, 5% CO₂, 120 об/мин в клеточном инкубаторе. На следующий день осуществляли трансфекцию плазмиды для экспрессии антитела с использованием PEI, где соотношение плазмида:PEI составляло 2:1. Через день после трансфекции добавляли питательную среду TN1 в количестве 2,5% (об./об.), продолжали культивирование в течение 4 дней и собирали супернатант посредством центрифугирования.

Собранный супернатант экспрессирующих клеток элюировали с помощью колонки для аффинной хроматографии белков (Mabselect Sure LX, GE) и 0,1 M лимонной кислоты (pH 3,0), захваченное антитело обрабатывали 1 M Трис-HCl (pH 9,0) и доводили до pH 7,0 при 1/10 (об./об.). Удаляли примеси, такие как мультимеры и эндотоксин, с помощью колонки для гель-фильтрации SEC (Superdex 200, GE) и одновременно буфер для антитела заменяли PBS (pH 7,4), образец с целевым пиком поглощения УФ при 280 нм собирали и концентрировали до 2 мг/мл с помощью центрифужной пробирки для ультрафильтрация (30 KD, Pall Corporation). Целевой мономер антитела (POI%), полученный этим способом, составлял более 90%, и его хранили для последующих экспериментов.

Пример 16: Синтез и получение TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 2A1-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0, и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 17: Синтез и получение образца TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 2A1-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 18: Синтез и получение образца TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 2A1-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0, и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 19: Синтез и получение образца TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4D3-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F.

Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 20: Синтез и получение образца TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4D3-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 21: Синтез и получение образца TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4D3-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 22: Синтез и получение образца TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4E1-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 23: Синтез и получение образца TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4E1-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 24: Синтез и получение образца TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE

Антитело 4E1-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.

Пример 25: Измерение соотношения токсин:антитело (DAR, соотношение лекарственного средства и антитела) посредством HIC-ВЭЖХ

Образец TDC анализировали посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с гидрофобными взаимодействиями и из соответствующей площади пика вычисляли соотношение лекарственное средство:антитело (DAR, также известное как соотношение токсин:антитело). Один конкретный способ подробно описан далее:

Колонка: Proteomix® HICBu^‐NP5 (5 мкм, 4,6×35 мм);

Подвижная фаза: Буфер A: 2 M сульфат аммония, 0,025 M фосфатный буфер, pH 7; буфер B: 0,025 M фосфатный буфер, pH 7; буфер C: 100% изопропанол;

Буфер A использовали для уравновешивания, буфер B и буфер C использовали для градиентной элюции, детекцию осуществляли при 25°C и длинах волн 214 нм и 280 нм. Учитывая данные, представленные на фигурах 1-3, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,7, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения. Учитывая данные, представленные на фигурах 4-6, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,95, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения. Учитывая данные, представленные на фигурах 7-8, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,9, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения.

Пример 26: Измерение соотношения токсин:антитело (DAR, соотношение лекарственного средства и антитела) посредством RP-ВЭЖХ

Соотношение токсина и антитела измеряли посредством RP-ВЭЖХ. Образцы, обработанные DTT, анализировали посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с гидрофобными взаимодействиями, и из соответствующей площади пика вычисляли DAR. Один конкретный способ подробно описан далее:

Колонка: Proteomix RP-1000 (5 мкм, 4,6×100 мм)

Подвижная фаза: Буфер A: 0,1% водный раствор TFA; буфер B: 0,1% раствор ацетонитрила.

Подвижную фазу A и подвижную фазу B использовали для элюции в пропорциональном градиенте при 80°C, измерение осуществляли при длинах волн 214 нм и 280 нм. Учитывая данные, представленные на фигуре 9, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло 1,82, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения.

Таблица I: Эффективность присоединения в соответствии с DAR в случае ADR TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE

В таблице I показано, что эффективность присоединения для сайт-специфических соединений TDC при модификации в виде мутации с инсерцией цистеина является однородно высокой (теоретический максимум составляет 2,0) с DAR≥1,6.

Пример 27: Измерение агрегации антитела-основы TDC посредством SEC-ВЭЖХ

Образцы антитела-основы TDC хранили при 37°C и их агрегацию анализировали посредством SEC-ВЭЖХ в дни 0, 7, 21 и 29, соответственно. Один конкретный способ подробно описан далее:

Хроматографические колонки: TSKgel SuperSW mAb HR (7,8 мм×30cm),

Подвижная фаза: 0,1 M сульфат натрия, 0,1 M фосфатный буфер, pH 6,7,

Измерения осуществляли при 25°C, 280 нм.

Как показано на фигурах 10-13, SEC-ВЭЖХ использовали для детекции и измерения агрегации антитела-основы TDC 4D3, 4D3-LC-Cys205ins, 4D3-LC-Cys206ins и 4D3-HC-Cys439ins. Образцы хранили при 37°C в течение 4 недель, и содержание агрегатов оставалось, по существу, неизменным.

Используя тот же способ детекции и измерения, измеряли агрегацию следующих TDC: TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC. Результаты представлены в таблице II

Таблица II: содержание целевого мономера TDC в случае TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE

Как показано в таблице II, содержание целевого мономера соединения TDC, соединенного посредством встроенного цистеина, составляет более 90%.

Пример 28: Измерение аффинностей антител-основ, подвергнутых сайт-специфическому мутагенезу и инсерционному мутагенезу для встраивания цистеина, и родительских антител к EGFRvIII, аффинностей антител 4E1 к c-met, аффинностей антител 4D3 к Trop2

Относительные аффинности 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins, 2A1-HC-Cys439ins и 2A1 к EGFRvIII сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:

Покрытый рекомбинантным антигеном EGFRvIII-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; антитела 2A1, 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins и 2A1-HC-Cys439ins соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации. Мутантные антитела 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins и 2A1-HC-Cys439ins, подвергнутые сайт-специфическому мутагенезу или инсерции цистеина, сохраняли аффинности к EGFRvIII, схожие с 2A1, о чем свидетельствуют близкие значения EC₅₀; эти результаты свидетельствуют о том, что сайт-специфический мутагенез V205C легкой цепи антитела 2A1, инсерционная мутация в положении 205 легкой цепи антитела, инсерционная мутация в положении 206 легкой цепи антитела или инсерционная мутация в положении 439 тяжелой цепи антитела не влияют на аффинность к антигену EGFRvIII.

Как показано на фигуре 14, антитела 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins, 2A1-HC-Cys439ins сохраняют аффинность 2A1 к антигену EGFRvIII.

Пример 29: Измерение аффинностей антител-основ, подвергнутых сайт-специфическому мутагенезу и инсерционному мутагенезу для встраивания цистеина и соединенных с токсином/лекарственным средством, против когнатных антигенов, аффинностей антител 4E1 к c-met, аффинностей антител 4D3 к Trop2

Относительные аффинности 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM и 4E1 к C-met сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:

Покрытый рекомбинантным антигеном C-met-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; TDC 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM и антитело 4E1 соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации, и результаты свидетельствовали о том, что антитела, имеющие сайт-специфическую мутацию с инсерцией цистеина, TDC4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM и 4E1-HC-Cys439ins-MVPM, сохраняли свои аффинности связывания с C-met, схожую с 4E1, на что указывают близкие значения EC₅₀; это свидетельствует о том, что инсерционная мутация в положении 205 или 206 легкой цепи 4E1 или в положении 439 тяжелой цепи 4E1 не влияет на аффинность связывания соответствующего TDC с антигеном c-met.

Относительные аффинности 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM и 4D3 к Trop2 сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:

Покрытый рекомбинантным антигеном Trop2-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; TDC 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM и антитело 4D3 соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации. TDC4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM и 4D3-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли свои аффинности связывания с Trop2, схожие с 4D3, на что указывают близкие значения EC₅₀; что свидетельствует о том, что инсерционная мутация в положении 205 или 206 легкой цепи 4D3 или в положении 439 тяжелой цепи 4D3 не влияет на аффинность связывания соответствующего TDC с антигеном Trop2.

Как показано на фигуре 15, антитела 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли аффинность 4E1 к антигену c-met.

Как показано на фигуре 16, антитела 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли аффинность 4D3 к антигену Trop2.

Пример 30: Тестирование цитотоксичности и фармацевтической эффективности

Цитотоксическую активность TDC определяли с помощью следующего эксперимента: TDC раздельно добавляли в среды для культивирования опухолевых клеток человека, в которых гиперэкспрессировался EGFR или экспрессировался EGFRVIII, и измеряли жизнеспособность клеток через 72 часа культивирования клеток. В настоящем описании клеточные анализы in vitro использовали для определения жизнеспособности клеток, цитотоксичности и TDC-индуцированного апоптоза.

Эффективность in vitro конъюгата «антитело-цитотоксин» определяли посредством анализа пролиферации клеток. В одном из вариантов осуществления анализ пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution является коммерчески доступным (Promega Corp., Madison, WI). Анализ пролиферации клеток (a) представляет собой детекцию реагента, в которой колориметрию используют для определения количества жизнеспособных клеток в экспериментах, касающихся пролиферации клеток и цитотоксичности. Этот реагент содержит новое соединение тетразолия [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS] и связующее вещество для электронного взаимодействия (этосульфат феназина; PES). PES имеет повышенную химическую стабильность, что позволяет смешивать его с MTS с получением стабильного раствора. Этот удобный режим "одного раствора" основан на первом поколении анализа CellTiter 96® AQueous, в котором связующее вещество для электронного взаимодействия PMS и раствор MTS поставляют раздельно. MTS (реагент Оуэна) биологически восстанавливается клетками до окрашенного формазанового продукта, растворимого непосредственно в среде (фигура 1). Это преобразование, вероятнее всего, происходит под действием NADPH или NADH, продуцируемых под действием дегидрогеназы в метаболически активных клетках. Для детекции небольшое количество реагента CellTiter 96® AQueous One Solution просто добавляют в лунку со средой для культивирования, инкубируют в течение 1-4 часов, а затем считывают поглощение при 490 нм с помощью микроспектрофотометра для чтения планшетов.

Количество формазанового продукта, определяемого при 490 нм, прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток в культуре. Т.к. гипертиреоидный продукт MTS растворим в средах для культивирования тканей, анализ CellTiter 96® AQueous One Solution включает меньше стадий, чем способ MTT или INT.

В настоящем описании A431 (EGFR-гиперэкспрессирующие клетки), U87-EGFRVIII (стабильную линию клеток с мутантным EGFR), U87-MG (линию клеток глиобластомы с высокоэкспрессируемым c-Met) и BXPC-3 (линию клеток рака поджелудочной железы с высокой экспрессией Trop2) используют в качестве исследовательских систем для тестирования эффективности лекарственного средства in vitro. В 96-луночный планшет высевали клетки при концентрации 6000 клеток/лунку и через 24 часа добавляли антитело. Исходная концентрация различных TDC, соответствующих линиям клеток A431 и U87-EGFRVIII, составляла 10 мкМ, которые последовательно разводили в соответствии с 5-кратным градиентом. Исходные концентрации различных TDC, соответствующих линиям клеток U87-MG и BXPC-3, составляли 1 мкМ, который последовательно разводили в соответствии с 5-кратным градиентом. Анализ MTS на жизнеспособность клеток осуществляли через 72 часа обработки

Таблица III: Определение IC₅₀ для цитотоксичности TDC, ADC в отношении EGFRwt-гиперэкспрессирующей линии клеток A431 и стабильной линии клеток, экспрессирующей EGFRvIII, U87-EGFRVIII

	Соединения	MTS
A431	U87MG-EGFRvIII	U87-MG	BXPC-3
Антитело 2A1	2A1	>10 мкМ	>10 мкМ	/	/
	2A1-LC-V205C	>10 мкМ	>10 мкМ	/	/
	2A1-LC-Cys205ins	>10 мкМ	>10 мкМ	/	/
	2A1-LC-Cys206ins	>10 мкМ	>10 мкМ	/	/
2A1-HC-Cys439ins	>10 мкМ	>10 мкМ	/	/
Сайт-специфическое присоединение (TDC)	2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE	92,16 нМ	296,11 нМ	/	/
	2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE	133,67 нМ	492,14 нМ	/	/
	2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE	179,26 нМ	457,48 нМ	/	/
2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE	26,62 нМ	118,52 нМ	/	/

Антитело 4E1	4E1	/	/	>1 мкМ	/
Сайт-специфическое присоединение (TDC)	4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	120,50nM	/
Сайт-специфическое присоединение (TDC)	4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	79,57nM	/
4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	7,41nM	/

Антитело 4D3	4D3	/	/	/	>1 мкМ
Сайт-специфическое присоединение (TDC)	4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	/	0,38 нМ
Сайт-специфическое присоединение (TDC)	4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	/	0,45 нМ
4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE	/	/	/	0,23 нМ

Данные из таблицы III свидетельствуют о том, что TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205Cins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE имеют сравнимую цитотоксическую активность в отношении EGFRwt-гиперэкспрессирующей линии клеток A431 и стабильной линии клеток, экспрессирующей EGFRvIII, U87-EGFRVIII, и активность TDC с инсерцией в положении 439 немного выше, чем у TDC с инсерцией в положении 205 и 206.

Наблюдали некоторую корреляцию между цитотоксической активностью и положением присоединения в случае TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE в клетках U87-MG. Активность TDC с инсерцией в положении 439 была немного лучше, чем у мутантов с инсерцией в положении 205 и 206. Активность TDC была значимо лучше, чем у родительского антитела.

Цитотоксические активности TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE в отношении линии клеток рака поджелудочной железы BXPC-3 были сравнимыми или схожими друг с другом, и активность TDC мутанта с инсерцией в положении 439 была немного лучше, чем у TDC с инсерцией в положении 205 и 206, и активность TDC была значимо лучше, чем у родительского антитела.

Пример 31: Тестирование стабильности в плазме

Брали некоторое количество образца ADC, добавляли к плазме человека, из которой удаляли IgG человека, использовали 2 пробирки для каждого ADC, инкубировали на водяной бане при 37°C, инкубировали в течение 0 ч, 72 ч, брали образцы ADC, добавляли 100 мкл протеина A (MabSelect SuReTM LX, кат. № 10221479 GE, промытого PBS), встряхивали в течение 2 ч с помощью вертикальной мешалки и подвергали стадиям промывки и элюции для получения ADC после инкубации. Образцы, подвергнутые инкубации в течение некоторого времени, подвергали HIC-ВЭЖХ и RP-ВЭЖХ для определения стабильности образцов в плазме.

На фигурах 21-23 показаны результаты тестирования стабильности в плазме человека для TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE. Способом детекции 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE являлась RP-ВЭЖХ; способом детекции TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc являлась HIC-ВЭЖХ.

На фигурах 24-26 показаны результаты тестирования стабильности в плазме человека для TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE. Способом детекции являлась HIC-ВЭЖХ

Таблица IV: Результаты тестирования стабильности TDC в плазме (вычисленной по изменению DAR)

Сайт-специфическое присоединение (TDC)	Соединение	DAR
	37°C, 0 ч.	37°C, 72 ч.
	TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,89	1,77
	TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,81	1,62
	TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,85	1,83
	TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,86	1,71
	TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,76	1,52
TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE	1,81	1,80

Указанные выше TDC были стабильными после инкубации при 37°C в течение 72 часов в образцах плазмы человека и имели хорошие свойства, касающиеся образования лекарственного средства. Для сравнения, TDC с инсерционными мутациями в положении 439 имели лучшую стабильность, после них следовали TDC с инсерционными мутациями в положениях 205 и 206.

Пример 32: Тестирования фармацевтической эффективности у несущих опухоль мышей

Как представлено в настоящем описании, разрабатывали модель несущих опухоль BXPC-3 мышей для оценки эффективности TDC и родительских антител in vivo. В одном из вариантов осуществления 3×10⁶ клеток BXPC-3 подкожно инъецировали в спину безтимусным мышам BALB/c Nude возрастом 4-8 недель и, когда средний размер опухоли у мышей достигал 400-500 мм³, их случайным образом распределяли по группам, по 5 мышей в каждую группу. В день 0 и день 7 TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE вводили в однократной внутривенной дозе 5 мг/кг, а родительское антитело 4D3 вводили в дозе 5 мг/кг. Данные A включают средний объем опухоли ± SE во время измерения, и данные B включают среднюю массу тела мыши во время измерения ± SE.

На фигуре 27 показаны результаты тестирования эффективности у несущих опухоль мышей в случае TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3. TDC демонстрировали значительный противоопухолевый эффект in vivo по сравнению с родительскими антителами.

На фигуре 28 показаны результаты тестирования эффективности у несущих опухоль мышей в случае TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3. Не наблюдали значимого изменения массы тела мышей, что подтвердило, что TDC не имеют токсичности или имеют незначительную активность in vivo.

Изобретение не ограничено объемом конкретных вариантов осуществления, представленных в описании вариантов осуществления, предназначенных для иллюстрирования нескольких аспектов изобретения, и любые варианты осуществления, являющиеся функциональными эквивалентами, входят в объем изобретения. Фактически, различные модификации изобретения очевидны специалистам в этой области и входят в объем формулы изобретения.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Таблица V: аминокислоты

Название	Символ или аббревиатура
Аланин	A или Ala
Аргинин	R или Arg
Аспарагин	N или Asn
Аспарагиновая кислота	D или Asp
Цистеин	C или Cys
Глутамин	Q или Gln
Глутаминовая кислота	E или Glu
Глицин	G или Gly
Гистидин	H или His
Изолейцин	I или Ile
Лейцин	L или Leu
Лизин	K или Lys
Метионин	M или Met
Фенилаланин	F или Phe
Пролин	P или Pro
Серин	S или Ser
Треонин	T или Thr
Триптофан	W или Trp
Тирозин	Y или Tyr
Валин	V или Val

SEQ ID NO: 1 Последовательность ДНК константной области тяжелой цепи (Fc)

>IgG1-Fc

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO: 2 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc)

>IgG1-Fc

SEQ ID NO: 3 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа)

>LC-каппа

ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO: 4 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа)

>LC-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 5 Последовательность ДНК константной области легкой цепи 2A1-LC-Cys205ins (каппа)

>LC-Cys205ins-каппа

SEQ ID NO: 6 Аминокислотная последовательность константная область легкой цепи (каппа) LC-Cys205ins

>LC-Cys205ins-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCVTKSFNRGEC

где C в GLSSPCVTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.

SEQ ID NO: 7 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206ins

>LC-Cys206ins-каппа

SEQ ID NO: 8 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206ins

>LC-Cys206ins-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVCTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 9 Последовательность ДНК константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins

>IgG1-Fc-Cys439ins

SEQ ID NO: 10 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins

>IgG1-Fc-Cys439ins

где C в последовательности TQKSLSCLSPGK является положением сайт-специфической конъюгации/присоединения, и его подвергают сайт-специфической конъюгации с mc-vc-PAB-нагрузкой.

SEQ ID NO: 11 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C

>LC-V205C-каппа

SEQ ID NO: 12 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C

>LC-V205C-каппа

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC

где C в последовательности GLSSPCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации/присоединения, и его подвергают сайт-специфической конъюгации с mc-vc-PAB-нагрузкой.

SEQ ID NO: 13 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C

GLSSPCVTKSF

SEQ ID NO: 14 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V206C

GLSSPVCTKS

SEQ ID NO: 15 Аминокислотная последовательность тяжелой цепи

TQKSLSCLSPGK

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SICHUAN BALI PHARM CO., LTD.

<120> КОНЪЮГАТ «ЦИСТЕИН-МОДИФИЦИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО»

И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

<130> SIBA1001US

<150> PCT/CN2017/104706

<151> 2017-09-30

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 2

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 3

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 3

acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgtta g 321

<210> 4

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 5

acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgccctg cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 6

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 6

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Cys Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 7

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 7

acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt ctgcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 8

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 8

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 9

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 9