Новая среда для ферментации для роста метанотрофных бактерий и способы получения указанной среды

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма, среда для ферментации, полученная этим способом, и способ ферментации метанотрофного организма на среде, полученной заявленным способом. Способ представления среды включает смешивание основного раствора для роста, содержащего одно или несколько соединений кальция, с раствором металлических микроэлементов, содержащего по меньшей мере одно преципитирующее соединение железа; причем предварительно добавляют кислоту к преципитирующему соединению железа или к металлическим микроэлементам, затем их смешивают. Изобретения обеспечивают повышение скорости роста и количества биомассы метанотрофных микроорганизмов. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Техническая область изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованной среде для ферментации для культивирования метанотрофных организмов. В частности, настоящее изобретение относится к обработке для предоставления усовершенствованной среды для ферментации.

Предпосылки изобретения

Один из основных пищевых ресурсов для человека может происходить из мяса животных и рыбы, фасоли и гороха, яиц, обработанных соевых продуктов, орехов, семян и т. д. по причине высокого содержания белка в продукте, который оказывает важный алиментарный полезный эффект на организм и развитие человека.

Не только человек имеет возрастающую потребность в богатой белком диете, но также животных (домашних или сельскохозяйственных животных) и рыбу кормят больше богатой белком диетой для того, чтобы ускорять рост и развитие и для благополучия животного.

Однако, в условиях растущей мировой популяции, которая достигнет 9 миллиардов к 2050 году, и возрастающей потребности в белке в отрасли животноводства и домашних животных, имеет место убедительное доказательство того, что сельское хозяйство не будет способно отвечать этим потребностям и что имеет место серьезный риск нехватки продуктов питания.

Показано, что для удовлетворения этой потребности производство белка отдельных клеток (SCP) является очень интересным кандидатом, поскольку эти SCP можно растить посредством ферментации биомассы через рост микроорганизмов на углеводороде, азоте и других субстратах. Получение SCP дает возможности отказоустойчивого массового производства пищи, которое позволяет получать пищу надежно по всему миру и даже в условиях сурового климата.

Продукт SCP можно использовать непосредственно в пище или кормовых продуктах, например, в виде жидкого продукта или в виде высушенного распылением продукта. Альтернативно SCP или биомассу можно дополнительно обрабатывать, например, посредством гидролиза и/или разделения, чтобы предоставлять особые фракции, удалять примеси или концентрировать компоненты, перед использованием в пище или кормовом продукте.

Например, для коммерческого получения SCP процесс ферментации включает 3 этапа ферментации:

– Порционная ферментация; которая представляет собой начальное размножение организмов, где все необходимые материалы, кроме организмов, деконтаминируют посредством предварительного автоклавирования, загружают в реактор вместе с организмами и начинают процесс. Используемый организм проходит через все фазы роста (лаг–фаза, экспоненциальная фаза и стационарная фаза. В этом режиме работы условия непрерывно меняют с течением времени в нестационарной системе, что требует большого количества усилий и вовлечения.

– Порционная ферментация с подпиткой; представляет собой биотехнологических рабочий процесс, где одно или несколько питательных веществ подают в биореактор в ходе культивирования и где продукт(ы) остается в биореакторе до конца прогона. Порционная ферментация с подпиткой повторяет порционную ферментацию и предусмотрена для того, чтобы достигать очень высоких концентраций клеток организма, поскольку порционная ферментация будет требовать ингибирующе высоких концентраций питательных веществ и, следовательно, не будет возможной. Порционная ферментация с подпиткой представляет собой подготовку клеточной культуры для непрерывной ферментации.

– Непрерывная ферментация; представляет собой режим получения для процесса ферментации, где микроорганизм питают стерильной средой для ферментации, которую используют для культивирования организма, и, одновременно, удаляют часть ферментационной жидкости, содержащей клетки с отработанной средой, из системы. Это создает уникальный признак непрерывной культуры, который является таким, что можно достигать равновесного состояния, зависящего от времени, и который позволяет определять зависимости между условиями окружающей среды и микробным поведением, включая генетическую и фенотипическую экспрессию.

По финансовым причинам имеет место интерес и стремление в промышленности запустить непрерывную и устойчивую ферментацию как можно быстрее, чтобы экономить время и затраты, а также предоставлять на рынке продукт SCP быстрее и выгоднее.

Следовательно, в традиционно предусмотренных процессах используют нитратное соединение в качестве источника азота в ходе порционной ферментации, которая представляет собой мелкомасштабную ферментацию. При смене на порционную с подпиткой, которая представляет собой крупномасштабную ферментацию, где содержание биомассы должно расти и потребность в азоте значительно увеличена по сравнению с порционной фазой. Таким образом, чтобы ускорять рост организма и сокращать расходы на питательные вещества, источник азота меняют на соединение аммония. В течение непрерывной ферментации, устойчивой ферментации, которая представляет собой крупномасштабное получение SCP, где постоянное количество ферментационной жидкости, содержащей биомассу, изымают из реактора для ферментации вместе с добавлением постоянного объема среды для ферментации. В течение этой непрерывной ферментации, устойчивой ферментации, источник азота меняют на соединение аммония.

Перемена с использованием аммония в качестве источника азота состоит в том, что имеет место значимый повышенный риск отравления ферментационной жидкости нитритом, который может образовываться, когда аммиак окисляют в процессе нитрификации, что является стадией нитрификации, ограничивающей скорость. В ходе нитрификации микроорганизм находится в условиях чрезвычайного стресса и может образовываться нитрит. Поскольку нитрит не может быть полностью превращен в нитрат, ферментацию нужно останавливать и выбрасывать, а также начинать новую порцию. Этот процесс называют путем гибели ферментации, и его боятся все производители белка отдельных клеток.

Таким образом, будет благоприятна усовершенствованная среда для ферментации и, в частности, будет благоприятно предоставлять среду для ферментации, более эффективную, более надежную, способную обеспечивать более быстрый рост, снижающую риск отказа и без угрозы для расходования средств в промышленности.

Сущность изобретения

Таким образом, цель настоящего изобретения относится к усовершенствованной среде для ферментации.

В частности, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить новый способ предоставления усовершенствованной среды для ферментации, который решает указанные выше проблемы известного уровня техники с расходами, эффективностью, скоростью ферментации, риском отказа и расходами.

Таким образом, один аспект изобретения относится к способу предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или для культивирования комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм, способ включает стадию:

(i) предоставления основного раствора для роста;

(ii) необязательно стерилизации основного раствора для роста, предоставленного на стадии (i);

(iii) предоставления раствора металлических микроэлементов;

(iv) смешивания основного раствора для роста (как предоставлено на стадии (i) или (ii)) с раствором металлических микроэлементов, предоставленным на стадии (iii), и предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или для культивирования комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм,

где раствор металлических микроэлементов предоставляют в двухстадийной процедуре и где двухстадийная процедура включает:

(v) предоставления по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента;

(vi) предоставления одного или нескольких металлических микроэлементов,

(vii) смешивания по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента (предоставляемого на стадии (v)) и одного или нескольких металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов;

где кислоту добавляют к преципитирующему соединению металлического микроэлемента или к одному или нескольким металлическим микроэлементам или как к преципитирующему соединению металлического микроэлемента, так и к одному или нескольким металлическим микроэлементам, предоставляя кислую растворенную композицию, прежде чем смешивают по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента (предоставляемое на стадии (v)) и один или несколько металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов.

Другой аспект настоящего изобретения относится к среде для ферментации, получаемой с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к среде для ферментации, содержащей следующие составляющие: вода; одно или несколько соединений кальция, в частности хлорид кальция; кислое растворенное преципитирующее соединение металлического микроэлемента; один или несколько металлических микроэлементов; и один или несколько буферных растворов, где ни одна из составляющих не преципитирует.

Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к реактору для ферментации, содержащему бак реактора, один или несколько впусков среды для ферментации, выпуск ферментационной жидкости для изъятия ферментационной жидкости из реактора для ферментации и датчик или анализатор ионов.

Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к процессу ферментации для получения биомассы посредством культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм, способ включает стадию:

(a) добавления по меньшей мере одного метанотрофного организма в реактор для ферментации;

(b) подачи среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением в реактор для ферментации,

(c) предоставления по меньшей мере одному метанотрофному организму, присутствующему в среде для ферментации, возможности ферментировать, предоставляя ферментационную жидкость; и

(d) извлечения ферментационной жидкости из реактора для ферментации, предоставляя биомассу.

Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к продукту биомассы, получаемому посредством процесса ферментации в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к белковому продукту, получаемому посредством процесса ферментации в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к пище или кормовому продукту, содержащему продукт биомассы в соответствии с настоящим изобретением; или белковый продукт в соответствии с настоящим изобретением.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к использованию кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением для получения корма для рыб или корма для животных, такого как корм для свиней, корм для коров или корм для кур.

Подробное описание изобретения

Метанотрофный организм, такой как бактерии семейства Methylococcaceae (которые известны в качестве потребляющих метан в качестве основного источника углерода), ранее размножали в ходе порционной ферментации и порционной ферментации с подпиткой в различных средах, таких как среда нитратных минеральных солей (NMS) или аммониевых минеральных солей (AMS) с низкой скоростью роста, ведущих к порционному процессу ферментации приблизительно 120 часов и ведущих к порционному процессу ферментации с подпиткой приблизительно 480 часов. Как указано выше в обсуждении известного уровня техники, все еще сохраняется потребность в предоставлении усовершенствованных сред для размножения метанотрофных организмов, использующих метан, таких как бактерии семейства Methylococcaceae, эти среды могут вести к более высокой скорости роста, более высокому выходу клеток и клеток, обладающих усовершенствованной жизнеспособностью, снижая шанс преципитации композиции субстрата, минимизируя риск контаминации в ходе процесса, и, кроме того, обладают некоторыми преимуществами в отношении предотвращения ингибирования в случае формирования любого токсичного продукта и уменьшают время до начала перед непрерывной ферментацией (получение ферментацией), тем самым снижая расходы на получение.

Соответственно, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или для культивирования комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм, способ включает стадию:

(i) предоставления основного раствора для роста;

(ii) необязательно стерилизации основного раствора для роста, предоставленного на стадии (i);

(iii) предоставления раствора металлических микроэлементов;

(iv) смешивания основного раствора для роста (как предоставлено на стадии (i) или (ii)) с раствором металлических микроэлементов, предоставленным на стадии (iii) и предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или для культивирования комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм.

где раствор металлических микроэлементов предоставляют в двухстадийной процедуре и где двухстадийная процедура включает:

(v) предоставление по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента;

(vi) предоставление одного или нескольких металлических микроэлементов;

(vii) смешивание по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента (предоставляемого на стадии (v)) и одного или нескольких металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов;

где по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента; один или несколько металлических микроэлементов; или как преципитирующее соединение металлического микроэлемента, так и один или несколько металлических микроэлементов можно растворять перед тем, как смешивают по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента (предоставляемое на стадии (v)) и один или несколько металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов.

В контексте настоящего изобретения термин «основной раствор для роста» относится к части среды для ферментации, содержащей соединение кальция среды для ферментации. Предпочтительно, соединение кальция предоставляют в форме соли кальция, такой как хлорид кальция.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента; один или несколько металлических микроэлементов; или как преципитирующее соединение металлического микроэлемента, так и один или несколько металлических микроэлементов можно растворять посредством обработки по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента; одного или нескольких металлических микроэлементов; или как преципитирующего соединения металлического микроэлемента, так и одного или нескольких металлических микроэлементов, с использованием кислоты или хелатирующего соединения (например хелатирующего буферного раствора), предоставляя кислую растворенную композицию или хелатированную растворенную композицию.

Кислая растворенная композиция предпочтительно может иметь pH 5,0 или менее, например, pH 4,5 или менее, например, pH 4,0 или менее, например, pH 3,5 или менее, например, pH 3,0 или менее, например, pH 2,5 или менее, например, pH 2,0 или менее, например, pH 1,5 или менее, например, pH 1,0 или менее, например, pH 0,5 или менее, например, pH в диапазоне pH 0,5–5,0, например, в диапазоне pH 0,75–3, например, pH в диапазоне pH 1,0–2,0, например, в диапазоне pH 1,25–1,5.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кислота, используемая для того, чтобы предоставлять кислую растворенную композицию, может представлять собой неорганическую кислоту. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кислоту, используемую для того, чтобы предоставлять кислую растворенную композицию, или неорганическую кислоту, можно выбирать из серной кислоты или соляной кислоты или их комбинации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кислота, используемая для того, чтобы предоставлять кислую растворенную композицию, может представлять собой по меньшей мере 80% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 85% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 90% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 92% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 95% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 96% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 97% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 98% концентрированную кислоту, например, по меньшей мере 99% концентрированную кислоту.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения основной рост содержит одно или несколько соединений кальция, в частности соль кальция, такую как хлорид кальция.

Как указано выше, некоторые из благоприятных по настоящему изобретению состоят в том, что новая среда для ферментации может вести к новому процессу метанотрофных организмов, который может иметь более высокую скорость роста, может обеспечивать более высокий выход клеток и предоставляемые клетки могут иметь усовершенствованную жизнеспособность, снижая шанс преципитации композиции субстрата и/или минимизируя риск контаминации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один метанотрофный организм может представлять собой метанотрофную бактериальную клетку, выбранную из штамма Methylococcus.

В другом дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм Methylococcus может представлять собой Methylococcus capsulatus.

В другом дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один метанотрофный организм выбирают из M. capsulatus; Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и/или Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288). Предпочтительно, по меньшей мере один метанотрофный организм содержит комбинацию M. capsulatus; Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288).

В контексте настоящего изобретения термин «раствор металлических микроэлементов» относится к раствору, содержащему подмножество металлических микроэлементов; то есть, металлы, обычно присутствующие в небольших, но поддающихся измерению количествах в клетках и тканях животных и растений, которые являются необходимой частью питания и физиологии. Глотание или экспонирование чрезмерных количеств металлических микроэлементов может быть токсичным. Однако недостаточные уровни определенных металлических микроэлементов в плазме или тканях могут вызывать патологию, как в случае железа. Металлические микроэлементы могут включать железо, магний, литий, цинк, медь, хром, никель, кобальт, ванадий, мышьяк, молибден, марганец, селен и другие. Металлические микроэлементы представляют собой металлы, которые необходимы живым организмам для функционирования должным образом и истощаются через расходование энергии в различных метаболических процессах в живых организмах.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения металлический микроэлемент можно предоставлять в форме соли металла.

Металлический микроэлемент можно предоставлять в форме жидкой композиции, концентрата или твердой композиции. Предпочтительно, металлический микроэлемент можно предоставлять в форме жидкой композиции.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, раствор металлических микроэлементов может содержать металлический микроэлемент, выбранный из группы, состоящей из одной или нескольких солей меди, таких как сульфат меди; одной или нескольких солей цинка, таких как сульфат цинка; одной или нескольких солей марганца, таких как хлорид марганца; одной или нескольких солей молибдатов, таких как молибдат натрия; одной или нескольких солей кобальта, таких как хлорид кобальта; одной или нескольких солей никеля, таких как хлорид никеля; одной или нескольких солей железа, таких как сульфат железа (II) или хлорид железа (II); или их комбинации.

Раствор металлических микроэлементов предпочтительно можно предоставлять в двухстадийной процедуре. В данном контексте, термин двухстадийная процедура относится к процессу разделения получения раствора металлических микроэлементов на две стадии, где некоторые ингредиенты раствора металлических микроэлементов смешивают на одной стадии, предоставляя первый раствор металлических микроэлементов, и другие (например, остальные) ингредиенты смешивают на другой стадии, предоставляя второй раствор металлических микроэлементов. Первый раствор металлических микроэлементов и второй раствор металлических микроэлементов впоследствии или можно смешивать до того, как раствор металлических микроэлементов смешивают с основным раствором для роста на стадии (iv) способа в соответствии с настоящим изобретением; или первый раствор металлических микроэлементов и второй раствор металлических микроэлементов можно добавлять отдельно в основной раствор для роста на стадии (iv) способа в соответствии с настоящим изобретением.

В контексте настоящего изобретения термин «преципитирующий металлический микроэлемент» относится к металлическим микроэлементам, которые склонны преципитировать или вызывать преципитацию в ходе получения раствора металлических микроэлементов и/или в ходе получения среды для ферментации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента может представлять собой соль по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента. Предпочтительно, по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента может представлять собой соединение железа (Fe–соединение). Предпочтительно, преципитирующий металлический микроэлемент может представлять собой ионы железа.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента или Fe–соединение можно выбирать из Fe³⁺–соединений или Fe²⁺–соединений, таких как FeCl₃.6H₂O или FeSO₄.7H₂O.

По меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента можно растворять посредством обработки его кислотой или хелатирующим соединением (например, хелатирующим буферным раствором), предоставляя кислую растворенную композицию или хелатированную растворенную композицию.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хелатирующее соединение можно выбирать из группы, состоящей из EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); лимонной кислот*ы; соединений порфиринов; или соединений хлорофилла, предпочтительно хелатирующее соединение можно выбирать из EDTA или лимонной кислоты, даже более предпочтительно, хелатирующее соединение может представлять собой EDTA.

Даже хелатирующие соединения можно использовать для того, чтобы растворять преципитирующее соединение металлического микроэлемента, кислое растворенное соединение может быть предпочтительным в качестве хелатирующих соединений, в дополнение к растворению преципитирующего соединения металлического микроэлемента также добавляют источник углерода в среду для ферментации, который может вести к росту нежелательных микроорганизмов, которые будут влиять на предполагаемый процесс ферментации или нарушать его.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения один или несколько металлических микроэлементов можно выбирать из группы, состоящей из соединения лития, соединения цинка, соединения меди, соединения хрома, соединения никеля, соединения кобальта, соединения ванадия, молибдена, соединения марганца и соединения свинца.

Предпочтительно, один или несколько металлических микроэлементов могут содержать комбинацию по меньшей мере двух из соединения цинка, соединения меди, соединения никеля, соединения кобальта, молибдена, соединения марганца, например, по меньшей мере 3 соединений, например, по меньшей мере 4 соединений, например, по меньшей мере 5 соединений, например, все 6 соединений.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения раствор металлических микроэлементов может представлять собой прозрачный раствор металлических микроэлементов. Предпочтительно, раствор металлических микроэлементов может представлять собой прозрачный раствор металлических микроэлементов без какой–либо преципитации. Даже более предпочтительно раствор металлических микроэлементов может представлять собой прозрачный раствор металлических микроэлементов без какой–либо преципитации, имеющий легкую зеленоватую окраску (когда Cu, медь, является преобладающим металлическим микроэлементом); легкую розоватую окраску (когда Co, кобальт, является преобладающим металлическим микроэлементом); легкую белесую (когда Zn, цинк, является преобладающим металлическим микроэлементом); или легкую желтоватую (когда Fe, железо, является преобладающим металлическим микроэлементом). В контексте настоящего изобретения термин «преобладающий металлический микроэлемент» относится к металлическому микроэлементу, присутствующему в самой высокой концентрации в растворе металлических микроэлементов.

Среда для ферментации может содержать дополнительные ингредиенты, усовершенствующие функциональность среды.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации дополнительно содержит раствор пеногасителя и/или раствор против контаминации. Предпочтительно, смешивание основного раствора для роста (как предоставлено на стадии (i) или (ii)) с раствором металлических микроэлементов, предоставленным на стадии (iii), дополнительно включает смешивание раствора пеногасителя и/или раствора против контаминации с предоставлением среды для ферментации.

Среда для ферментации может содержать соединение магния, такое как соль магния, предпочтительно хлорид магния (MgCl₂).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации дополнительно содержит соединение магния, такое как соль магния, предпочтительно хлорид магния (MgCl₂). Соединение магния может быть частью основного раствора для роста, предоставляемого на стадии (i) или на стадии (ii).

Среда для ферментации также может содержать один или несколько буферных растворов. I, способ дополнительно включает стадию добавления буферного раствора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения буферный раствор можно добавлять в основную композицию после смешивания основной композиции с композицией металлических микроэлементов или смешивания основной композиции с раствором металлических микроэлементов и раствором пеногасителя и/или раствором против контаминации, предоставляя среду для ферментации.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения буферный раствор добавляют в среду для ферментации прежде, чем среду для ферментации добавляют в реактор для ферментации, содержащий по меньшей мере один метанотрофный организм или комбинацию организмов, содержащую по меньшей мере один метанотрофный организм.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, буферный раствор добавляют непосредственно в реактор для ферментации, содержащий по меньшей мере один метанотрофный организм или комбинацию организмов, содержащую по меньшей мере один метанотрофный организм.

Буферный раствор предпочтительно может содержать кислый буферный раствор, щелочной буферный раствор или хелатирующий буферный раствор. Многие различные буферные растворы можно использовать в ходе процесса ферментации, однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что буферный раствор предпочтительно содержит фосфатный буфер, такой как фосфат натрия или фосфат калия; сульфатный буфер, такой как сульфат магния или сульфат натрия; и/или хелатирующий буферный раствор, такой как буфер лимонной кислоты или буфер EDTA; и/или их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации дополнительно может содержать соединение азота, такое как нитратное соединение или соединение аммония, предпочтительно нитрат, такой как нитрат натрия (NaNO₃).

В зависимости от этапа, на котором среда для ферментации подлежит использованию, источник азота можно добавлять в один или несколько различных растворов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение азота представляет собой часть основного раствора, буферного раствора или обоих, предпочтительно соединение азота представляет собой часть основного раствора.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среду для ферментации можно использовать в процессе ферментации, выбранном из порционной ферментации; порционной ферментации с подпиткой; и/или непрерывной ферментации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации подлежит использованию в порционной ферментации и соединение азота может представлять собой часть основного раствора. Предпочтительно, источник азота в ходе порционной ферментации может представлять собой нитрат, такой как нитрат натрия (NaNO₃).

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для порционной ферментации, и содержание соединения азота находится в диапазоне 0,5–12 г/л, например, в диапазоне 0,7–10 г/л, например, в диапазоне 1,0–5 г/л, например, в диапазоне 1,2–3 г/л, например, в диапазоне 1,5–2,0 г/л, например, приблизительно 1,7 г/л.

Среду для ферментации можно использовать в порционной ферментации, и содержание одного или нескольких соединений кальция в среде для порционной ферментации, такого как хлорид кальция, может составлять 0,25 г/л или меньше, например, 0,2 г/л или меньше, например, 0,15 или меньше, например, 0,1 г/л или меньше, например, 0,05 или меньше, например, 0,01 г/л или меньше, например, 0,005 или меньше, например, в диапазоне 0,25–0,0001 г/л, например, в диапазоне 0,2–0,001 г/л, например, в диапазоне 0,15–0,01 г/л, например, в диапазоне 0,1–0,02 г/л, например, в диапазоне 0,08–0,03 г/л, например, в диапазоне 0,06–0,04 г/л.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации подлежит использованию в порционной ферментации с подпиткой, и соединение азота предпочтительно может представлять собой часть основного раствора. Предпочтительно, источник азота в ходе порционной ферментации с подпиткой может представлять собой нитратное соединение или соединение аммония, даже более предпочтительно соединение азота может представлять собой нитрат натрия (NaNO₃).

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для порционной ферментации с подпиткой, и содержание соединения азота может находиться в диапазоне 15–35 г/л, например, в диапазоне 17–30 г/л, например, в диапазоне 19–25 г/л, например, в диапазоне 20–23 г/л, например, приблизительно 21,5 г/л.

Среду для ферментации в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в порционной ферментации с подпиткой, и содержание одного или нескольких соединений кальция, таких как хлорид кальция, в среде для порционной ферментации с подпиткой может находиться в диапазоне 0,05–10 г/л, например, в диапазоне 0,1–7,5 г/л, например, в диапазоне 1–5 г/л, например, в диапазоне 2,0–4,5 г/л, например, в диапазоне 3–4,2 г/л, например, в диапазоне 3,5–4 г/л.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации подлежит использованию в непрерывной ферментации, и соединение азота предпочтительно может представлять собой часть основного раствора; буферного раствора; или как основного раствора, так и буферного раствора. Предпочтительно, источник азота в ходе порционной ферментации с подпиткой может представлять собой нитратное соединение или соединение аммония, даже более предпочтительно соединение азота может представлять собой соединение аммония, такое как хлорид аммония и/или нитрат аммония.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для непрерывной ферментации, и содержание соединения азота может находиться в диапазоне 15–35 г/л, например, в диапазоне 17–30 г/л, например, в диапазоне 19–25 г/л, например, в диапазоне 20–23 г/л, например, приблизительно 21,5 г/л.

Среду для ферментации в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в непрерывной ферментации, и содержание одного или нескольких соединений кальция, таких как хлорид кальция, в среде для непрерывной ферментации может находиться в диапазоне 0,05–10 г/л, например, в диапазоне 0,1–7,5 г/л, например, в диапазоне 1–5 г/л, например, в диапазоне 2,0–4,5 г/л, например, в диапазоне 3–4,2 г/л, например, в диапазоне 3,5–4 г/л.

Среда для ферментации в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может представлять собой водную среду. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может содержать водопроводную воду; деминерализованную воду или их комбинацию. Предпочтительно, среда для ферментации содержит деминерализованную воду.

Вода, добавляемая к различным ингредиентам для того, чтобы предоставлять среду для ферментации, может влиять на композицию, поскольку водопроводная вода может содержать различные минералы, которые можно учитывать при получении среды для ферментации. Поскольку содержание минералов в водопроводной воде может колебаться, непрерывные анализы могут быть необходимы для того, чтобы избегать недостаточного или чрезмерного дозирования среды для ферментации.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к среде для ферментации, содержащей следующие составляющие: вода; одно или несколько соединений кальция, в частности хлорид кальция; кислое растворенное преципитирующее соединение металлического микроэлемента; один или несколько металлических микроэлементов; и один или несколько буферных растворов, где ни одна из составляющих не преципитирует.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для порционной ферментации. Среду для порционной ферментации можно использовать для начального размножения организмов, где все необходимые материалы, за исключением организмов, можно деконтаминировать посредством автоклавирования перед загрузкой в реактор вместе с организмами и начинать процесс. Используемый организм может проходить через все фазы роста (лаг–фаза, экспоненциальная фаза и стационарная фаза. В этом режиме работы условия можно непрерывно менять с течением времени в нестационарной системе, что требует больших усилий и вовлечения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для порционной ферментации с подпиткой. Среду для порционной ферментации с подпиткой можно подавать в биореактор в ходе культивирования, где продукт/ы остаются в биореакторе до конца прогона. Среду для порционной ферментации с подпиткой можно использовать для того, чтобы обеспечивать высокие концентрации клеток организма.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации может представлять собой среду для непрерывной ферментации. Среду для непрерывной ферментации добавляют в ходе режима получения в процессе ферментации, где микроорганизм питают стерильной средой для непрерывной ферментации и одновременно из системы удаляют часть ферментационной жидкости, содержащей клетки с отработанной средой.

Автор настоящего изобретения к удивлению обнаружил, что посредством получения среды для ферментации, как раскрыто в настоящем описании, ни одна из составляющих не преципитирует. В данном контексте термин «ни одна из составляющих не преципитирует» относится к преципитации одного или нескольких ингредиентов из среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, термин «ни одна из составляющих не преципитирует» относится к содержанию твердых веществ в среде для ферментации, которое составляет самое большее 5 г/л, например, самое большее 1 г/л, например, самое большее 0,5 г/л, например, неподдающееся обнаружению количество твердых веществ (т. е. приблизительно 0 г/л).

Конкретные ингредиенты среды для ферментации могут отвечать за преципитацию. В настоящем изобретении, ионы кальция; ионы железа; и/или ионы фосфора могут отвечать за преципитацию среды для ферментации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации содержит меньше чем 0,05 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,03 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,01 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,005 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,001 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,0005 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,0001 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,00005 г/л преципитированного кальция, например, меньше чем 0,00001 г/л преципитированного кальция.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации содержит меньше чем 0,005 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,003 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,001 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,0005 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,0001 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,00005 г/л преципитированного железа, например, меньше чем 0,00001 г/л преципитированного железа.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации содержит меньше чем 0,4 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,3 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,1 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,05 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,01 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,001 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,0001 г/л преципитированного фосфора, например, меньше чем 0,00001 г/л преципитированного фосфора.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, раствор металлических микроэлементов и/или среда для ферментации в соответствии с настоящим изобретением может иметь срок хранения по меньшей мере 3 месяца без наблюдения какой–либо преципитации, например, по меньшей мере 6 месяцев, например, по меньшей мере 8 месяцев, например, по меньшей мере 10 месяцев, например, по меньшей мере 12 месяцев, например, по меньшей мере 15 месяцев, например, по меньшей мере 18 месяцев, например, по меньшей мере 24 месяца.

Настоящее изобретение относится к реактору для ферментации, содержащему бак реактора, один или несколько впусков среды для ферментации, выпуск ферментационной жидкости для изъятия ферментационной жидкости из реактора для ферментации и датчик или анализатор ионов.

В реактор для ферментации реактор для ферментации можно подавать среду для ферментации в соответствии с настоящим изобретением.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения реактор для ферментации может представлять собой U–петлевой реактор, содержащий петлевую часть с циркуляционным насосом; и бак дегазирования. Бак дегазирования может представлять собой верхний бак, где ферментационную жидкость можно подвергать дегазированию, удаляя отработанные газы из ферментационной жидкости.

Может быть важно управлять содержанием различных минералов и ионов в ферментационной жидкости в ходе ферментации. Таким образом, в реакторе для ферментации предусмотрен датчик или анализатор ионов для определения содержания одной или нескольких ионных частиц в ферментационной жидкости. Предпочтительно одну или несколько ионных частиц можно выбирать из фосфата, кальция, водорода, нитрата, аммония и/или их комбинации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения один или несколько впусков среды для ферментации можно предусматривать для введения среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением в реактор для ферментации. Реактор для ферментации в соответствии с настоящим изобретением может иметь по меньшей мере 2 впуска среды для ферментации, например, по меньшей мере 3 впуска ферментации, например, по меньшей мере 4 впуска ферментации.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения впуск среды для ферментации можно предусматривать для индивидуального введения основного раствора для роста в реактор для ферментации.

В данном контексте термин «индивидуальное введение» относится к отдельному впуску, предусматривающему только указанную среду для ферментации или часть среды для ферментации, в реактор для ферментации. Таким образом, не нужно предоставлять отдельные смесительные баки и отдельное смесительное оборудование. Кроме того, это позволяет подавать определенный ингредиент, но не другие, если в среде для ферментации недостает только некоторых ингредиентов, но не других.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения впуск среды для ферментации можно предоставлять для индивидуального введения буферного раствора в реактор для ферментации.

В другом дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения впуск среды для ферментации можно предоставлять для индивидуального введения раствора металлических микроэлементов в реактор для ферментации.

Примеры конструкции реактора для ферментации; использования датчиков и анализаторов; и управления реактором для ферментации описаны в WO 2010/069313; и/или WO 2000/70014, обе они включены, таким образом, посредством ссылки.

Настоящее изобретение также относится к процессу ферментации для получения биомассы посредством культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма или комбинации организмов, содержащей по меньшей мере один метанотрофный организм, способ включает стадию:

(a) подачи среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением в реактор для ферментации;

(b) добавления по меньшей мере одного метанотрофного организма в реактор для ферментации;

(c) предоставления по меньшей мере одному метанотрофному организму, присутствующему в среде для ферментации, возможности ферментировать, предоставляя ферментационную жидкость; и

(d) извлечения ферментационной жидкости из реактора для ферментации, предоставляя биомассу.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения реактор для ферментации может представлять собой петлевой реактор как раскрыто в настоящем описании или как описано в WO 2010/069313; и/или WO 2000/70014, обе они включены, таким образом, посредством ссылки.

Среда для ферментации может содержать основной раствор для роста, буферный раствор и/или раствор металлических микроэлементов, где основной раствор для роста, буферный раствор и/или раствор металлических микроэлементов можно добавлять отдельно или совместно в реактор для ферментации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для ферментации, подаваемая на стадии (a), может включать стартовую среду для ферментации (a1), которую подают в ходе порционной ферментации и/или порционной ферментации с подпиткой. Стартовая среда для ферментации (a1) может представлять собой среду для порционной ферментации или среду для порционной ферментации с подпиткой.

Источник азота стартовой среды для ферментации может представлять собой нитратное соединение, такое как нитрат натрия (NaNO₃). Когда стартовая среда для ферментации представляет собой среду для порционной ферментации с подпиткой, нитратное соединение может представлять собой нитратное соединение или соединение аммония; нитратное соединение, такое как нитрат натрия (NaNO₃), может быть предпочтительным.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения среда для ферментации, подаваемая на стадии (a), включает производственную среду для ферментации (a2), подаваемую в ходе непрерывной ферментации, среду для непрерывной ферментации. Источник азота производственной среды для ферментации может представлять собой соединение аммония, такое как хлорид аммония и/или нитрат аммония.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения процесс ферментации, в ходе работы, начинают как процесс порционной ферментации (с использованием среды для порционной ферментации), непрерывный с процессом порционной ферментации с подпиткой (с использованием среды для порционной ферментации с подпиткой), где источник азота в среде для порционной ферментации и в среде для порционной ферментации с подпиткой может представлять собой нитратное соединение, такое как нитрат натрия (NaNO₃). Процесс ферментации представляет собой непрерывную ферментацию, где добавляют производственную среду для ферментации и где источник азота производственной среды для ферментации меняют на соединение аммония.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения процесс ферментации включает процесс порционной ферментации и процесс порционной ферментации с подпиткой с использованием среды для ферментации, имеющей нитратное соединение в качестве источника азота, такое как нитрат натрия, и процесс непрерывной ферментации с использованием аммония в качестве источника азота.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, часть порционной ферментации с подпиткой можно подпитывать с использованием среды для порционной ферментации с подпиткой, содержащей нитратное соединение в качестве источника азота, такое как нитрат натрия (NaNO₃), и другую часть порционной ферментации с подпиткой можно подпитывать с использованием среды для порционной ферментации с подпиткой, содержащей соединение аммония в качестве источника азота, такое как хлорид аммония и/или нитрат аммония.

Предпочтительно, процесс ферментации изменяют с порционной ферментации или порционной ферментации с подпиткой на непрерывную ферментацию, когда содержание биомассы составляет по меньшей мере 15 г/л (например 5–8×10⁶ клеток/мл), например, по меньшей мере 17,5 г/л, например, по меньшей мере 20 г/л, например, по меньшей мере 25 г/л, например, по меньшей мере 30 г/л, например, по меньшей мере 35 г/л, например, по меньшей мере 40 г/л.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, среду для ферментации меняют со среды для порционной ферментации или среды для порционной ферментации с подпиткой на среду для непрерывной ферментации, когда содержание биомассы составляет по меньшей мере 15 г/л (например 5–8×10⁶ клеток/мл), например, по меньшей мере 17,5 г/л, например, по меньшей мере 20 г/л, например, по меньшей мере 25 г/л, например, по меньшей мере 30 г/л, например, по меньшей мере 35 г/л, например, по меньшей мере 40 г/л.

Для того чтобы обеспечивать достаточно минералов и/или ионов в ферментационной жидкости, одну или несколько ионных частиц ферментационной жидкости можно анализировать в ходе процесса ферментации. Предпочтительно, одну или несколько ионных частиц выбирают из фосфата, кальция, водорода, нитрата и/или аммония.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения датчик или анализатор можно использовать для того, чтобы анализировать одну или несколько ионных частиц, предпочтительно, датчик или анализатор представляет собой датчик в линии или анализатор в линии.

Как отмечено предварительно, способ в соответствии с настоящим изобретением ведет к усовершенствованному получению биомассы и увеличенной скорости роста микроорганизма, такого как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению предусматривает скорость роста микробов в ходе процесса ферментации по меньшей мере 0,04 ч^–1, например, по меньшей мере 0,05 ч^–1, например, по меньшей мере 0,06 ч^–1, например, по меньшей мере 0,08 ч^–1, например, по меньшей мере 0,10 ч^–1, например, по меньшей мере 0,12 ч^–1, например, по меньшей мере 0,14 ч^–1, например, по меньшей мере 0,15 ч^–1, например, по меньшей мере 0,16 ч^–1, например, по меньшей мере 0,17 ч^–1, например, по меньшей мере 0,18 ч^–1, например, по меньшей мере 0,19 ч^–1, например, по меньшей мере 0,20 ч^–1, например, по меньшей мере 0,22 ч^–1, например, по меньшей мере 0,25 ч^–1, например, по меньшей мере 0,27 ч^–1, например, по меньшей мере 0,30 ч^–1, например, по меньшей мере 0,32 ч^–1, например, по меньшей мере 0,35 ч^–1, например, по меньшей мере 0,37 ч^–1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 2,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 2,6 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 2,7 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 2,8 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 2,9 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 3,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 3,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 4,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 4,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 5,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 5,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 6,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 6,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 7,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 7,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 10,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 12,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 15,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 17,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 20,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 22,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 25,0 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 27,5 г/л по сухому веществу, например, можно обеспечивать получение биомассы по меньшей мере 30,0 г/л по сухому веществу.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, в дополнение к усовершенствованному получению биомассы и увеличенной скорости роста, что высокого получения биомассы (или максимального получения биомассы (в выражении г/л по сухому веществу) можно достигать значительно быстрее, чем в традиционных способах. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения высокого получения биомассы (или максимального получения биомассы (в выражении г/л по сухому веществу) можно достигать меньше чем за 5 суток, например, меньше чем за 4 суток, например, меньше чем за 3 суток, например, меньше чем за 2 суток, например, меньше чем за 24 часа, например, меньше чем за 20 часов, например, меньше чем за 16 часов, например, меньше чем за 14 часов, например, меньше чем за 12 часов, например, меньше чем за 10 часов, например, меньше чем за 8 часов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения получение биомассы по меньшей мере 3,5 г/л по сухому веществу обеспечивают в пределах меньше чем 24 часов, например, получение биомассы по меньшей мере 4,0 г/л по сухому веществу обеспечивают в пределах меньше чем 20 часов, например, получение биомассы по меньшей мере 4,5 г/л по сухому веществу обеспечивают в пределах меньше чем 14 часов, например, получение биомассы по меньшей мере 5,0 г/л по сухому веществу обеспечивают в пределах меньше чем 10 часов, например, получение биомассы по меньшей мере 5,5 г/л по сухому веществу обеспечивают в пределах меньше чем 8 часов.

В виду среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением, биомассу, получаемую в процессе ферментации с использованием среды для ферментации, можно считать отличающейся от биомассы, получаемой в процессах ферментации известного уровня техники.

Как отмечено предварительно, среда для ферментации в соответствии с настоящим изобретением не имеет или в значительной мере не имеет преципитации, в частности преципитации кальция; преципитации железа; и/или преципитации фосфата; как часто происходит в случае традиционной среды для ферментации. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения продукт биомассы может иметь меньше чем 10 мг/кг преципитированного кальция, фосфата кальция, фосфата или железа, например, меньше чем 5 мг/кг, например, меньше чем 1 мг/кг, например, меньше чем 0,5 мг/кг, например, меньше чем 0,1 мг/кг, например, не поддающиеся обнаружению количества.

Белковый продукт, получаемый посредством процесса ферментации в соответствии с настоящим изобретением с использованием уникальной среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением, может вести к уникальному белковому продукту, где белковый продукт предпочтительно имеет меньше чем 10 мг/кг преципитированного кальция, фосфата кальция, фосфата или железа, например, меньше чем 5 мг/кг, например, меньше чем 1 мг/кг, например, меньше чем 0,5 мг/кг, например, меньше чем 0,1 мг/кг, например, не поддающиеся обнаружению количества.

Биомасса, получаемая посредством настоящего изобретения, которая может представлять собой белок отдельных клеток, представляет собой съедобный одноклеточный микроорганизм. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белковый продукт в соответствии с настоящим изобретением и/или биомассу в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в кормовом продукте или в пищевом продукте.

Белковый продукт в соответствии с настоящим изобретением и/или биомассу в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в корме для рыб или корме для животных, таком как корм для свиней, корм для коров или корм для кур.

Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов и/или одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам и/или другим вариантам осуществления изобретения.

Все патентные и непатентные источники, цитируемые в настоящей заявке, включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.

Изобретение далее описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.

Примеры

Пример 1

Данный пример осуществляли для того, чтобы анализировать преципитацию металлических микроэлементов в растворе металлических микроэлементов.

FeCl₃ смешивали с 10 мл 96% H₂SO₄, обеспечивая концентрацию 0,1 г/л FeCl₃, и получали кислую растворенную композицию, содержащую FeSO₄, имеющую pH приблизительно 2.

Затем кислую растворенную композицию смешивали со смесью из одного или нескольких металлических микроэлементов, содержащих 0,04 г/л CuCl₂; 0,03 г/л ZnCl₂; <0,005 г/л NaMoO₄; <0,005 г/л CoCl₂; <0,005 г/л MnCl₄; и <0,005 г/л NiCl₂, предоставляя раствор металлических микроэлементов.

Когда преципитацию наблюдают в растворе металлических микроэлементов, образуется окраска от оранжевой до коричневой, которая очевидна при визуального осмотре. Раствор металлических микроэлементов, предоставляемый в соответствии с настоящим изобретением, как проиллюстрировано в этом примере, демонстрировал светло–желтоватый полностью прозрачный раствор металлических микроэлементов без какой–либо преципитации вовсе.

Пример 2

Данный пример осуществляли для того, чтобы анализировать преципитацию металлических микроэлементов в растворе металлических микроэлементов.

Смесь одного или нескольких металлических микроэлементов, содержащую CuCl₂; ZnCl₂; NaMoO₄; CoCl₂; MnCl₄; и NiCl₂, смешивали с 10 мл 96% H₂SO₄ и получали кислую растворенную композицию, содержащую 0,04 г/л CuCl₂; 0,03 г/л ZnCl₂; <0,005 г/л NaMoO₄; <0,005 г/л CoCl₂; <0,005 г/л MnCl₄; и <0,005 г/л NiCl₂ и имеющую pH приблизительно 2.

Затем кислую растворенную композицию смешивали с 0,1 г/л FeCl₃, предоставляя раствор металлических микроэлементов.

Когда наблюдают преципитацию в растворе металлических микроэлементов, образуется окраска от оранжевой до коричневой, которая очевидна при визуальном осмотре. Раствор металлических микроэлементов, предоставляемый в соответствии с настоящим изобретением, как проиллюстрировано в этом примере, демонстрировал светло–желтоватый, полностью прозрачный раствор металлических микроэлементов без какой–либо преципитации вовсе.

Пример 3

Тест срока хранения растворов металлических микроэлементов, предоставленных в примерах 1 и 2.

Растворы металлических микроэлементов, предоставленные в примерах 1 и 2, оставляли при комнатной температуре без воздействия света в течение 10 месяцев. После периода хранения в двух растворах металлических микроэлементов не наблюдали окраску и преципитацию.

Пример 4

Стандартная среда NMS содержит нитратную соль, сульфатную соль и хлорид с источниками натрия, магния, кальция и буфер, такой как фосфатный буфер, а также раствор металлических микроэлементов.

В данном эксперименте получали две среды для ферментации, стандартную среду NMS для ферментации и среду для ферментации в соответствии с настоящим изобретением (как описано в примере 1). Присутствие слишком большого количества кальция, как используют в стандартной среде NMS, демонстрировало преципитацию в присутствии фосфатного буфера. Из–за преципитации стандартной среды NMS, происходит замедление роста бактерий, и рост ингибируют или снижают от 0,17 ч^–1 до 0,05–0,1 ч^–1. В стандартной NMS, металлический микроэлемент также всегда стремится формировать преципитацию.

В среде для ферментации в соответствии с настоящим изобретением (S–NMS) среду для ферментации получали как описано в настоящей заявке и избегали преципитации кальция, фосфата и металлических микроэлементов, в частности железа, что ведет к скорости роста по меньшей мере 0,16–0,2 ч^–1.

Среда для ферментации в соответствии с настоящим изобретением также демонстрировала форсирование стартовых условий (порционная ферментация) и демонстрировала более сильный эффект, оказываемый на порционное культивирование с подпиткой и непрерывное культивирование, чем стандартные процессы ферментации. В этой среде для ферментации состав раствора металлических микроэлементов также выполняют таким образом, что будет возникать преципитация металлических микроэлементов.

Поскольку аммиак дешевле, чем нитрат, аммиак может представлять собой стандарт или предпочтительный выбор для любой компании в качестве субстрата. Но аммиак образует нитрит при любых стрессовых условиях и бактерии не могут расти при определенных уровнях нитрита. Нитрит вызывает ингибирование роста бактерий, что является состоянием, которое не подлежит сохранению и результатом которого является так называемый «путь гибели».

Следовательно, новая ферментационная среда для выращивания, как описано в настоящем изобретении, где нитрат можно использовать вместо аммиака в порционной фазе с подпиткой после порционной фазы с тем, чтобы бактерии росли хорошо без образования нитрита (и таким образом, со сниженным риском «пути гибели»). Используя среду для ферментации в соответствии с настоящим изобретением, возможно достигать содержания биомассы в диапазоне 20–30 г/л. Этот уровень биомассы может представлять собой очень привлекательный уровень для достижения перед началом непрерывного культивирования, поскольку риск выйти на «путь гибели» очень мал, почти не существует. Среда для ферментации в соответствии с настоящим изобретением позволяет достигать количества биомассы 20–30 г/л в пределах 120 часов вместо отказа порционного процесса с подпиткой и запуска снова и снова, используя среду на основе аммиака. Эти среды не только экономят время, но также экономят деньги для запуска других порций.

В заключение, результаты показывали, что максимальная удельная скорость роста (μ^max; 1/ч) была значительно, и к удивлению, выше при культивировании бактерий семейства Methylococcaceae, Methylococcus capsulatus, в среде для ферментации в соответствии с настоящим изобретением (среда S–NMS), чем при использовании стандартной 2NMS.

Результаты демонстрировали явное указание на более высокую скорость роста при использовании среды для ферментации в соответствии с настоящим изобретением, где преципитация в среде 2NMS ингибирует рост. Усовершенствованная среда также демонстрировала снижение времени культивирования в ходе порционной ферментации с подпиткой со 120 часов до 24 часов, что ведет к почти в 4 раза более высокой удельной скорости роста. 

Источники

WO 2010/069313

WO 2000/70014.

1. Способ предоставления среды для ферментации, включающий стадии:

(i) предоставления основного раствора для роста, содержащего одно или несколько соединений кальция;

(ii) необязательно стерилизации основного раствора для роста, предоставленного на стадии (i);

(iii) предоставления раствора металлических микроэлементов;

(iv) смешивания основного раствора для роста (как предоставлено на стадии (i) или (ii)) с раствором металлических микроэлементов, предоставленным на стадии (iii), и предоставления среды для ферментации для культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма,

где раствор металлических микроэлементов предоставляют в двухстадийной процедуре и где двухстадийная процедура включает:

(v) предоставление по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента, где указанное по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента является соединением железа;

(vi) предоставление одного или нескольких металлических микроэлементов, где указанное одно или несколько металлических микроэлементов выбирают из группы, состоящей из соединения лития, соединения цинка, соединения меди, соединения хрома, соединения никеля, соединения кобальта, соединения ванадия, молибдена, соединения марганца и соединения свинца,

(vii) смешивание по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента (предоставляемого на стадии (v)) и одного или нескольких металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов;

где кислоту добавляют к преципитирующему соединению металлического микроэлемента или к одному или нескольким металлическим микроэлементам или как к преципитирующему соединению металлического микроэлемента, так и к одному или нескольким металлическим микроэлементам, предоставляя кислую растворенную композицию, перед смешиванием по меньшей мере одного преципитирующего соединения металлического микроэлемента (предоставляемого на стадии (v)) и одного или нескольких металлических микроэлементов (предоставляемых на стадии (vi)), предоставляя раствор металлических микроэлементов.

2. Способ в соответствии с п. 1, в котором по меньшей мере одно преципитирующее соединение металлического микроэлемента выбирают из Fe³⁺–соединений или Fe²⁺–соединений, таких как FeCl₃⋅6H₂O или FeSO₄⋅7H₂O.

3. Способ в соответствии с любым одним из пп. 1, 2, в котором кислая растворенная композиция и/или раствор металлических микроэлементов имеет pH 5,0 или менее, например pH 4,5 или менее, например pH 4,0 или менее, например pH 3,5 или менее, например pH 3,0 или менее, например pH 2,5 или менее, например pH 2,0 или менее, например pH 1,5 или менее, например pH 1,0 или менее, например pH 0,5 или менее, например pH в диапазоне 0,5–5,0, например pH в диапазоне 0,75–3, например pH в диапазоне pH 1,0–2,0, например pH в диапазоне 1,25–1,5.

4. Способ в соответствии с любым одним из пп. 1–3, в котором кислоту, используемую для предоставления кислой растворенной композиции, выбирают из серной кислоты или соляной кислоты.

5. Способ в соответствии с любым одним из пп. 1–4, в котором кислота представляет собой по меньшей мере 80% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 85% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 90% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 92% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 95% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 96% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 97% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 98% концентрированную кислоту, например по меньшей мере 99% концентрированную кислоту.

6. Способ в соответствии с любым одним из предшествующих пунктов, в котором один или несколько металлических микроэлементов содержат комбинацию по меньшей мере двух из соединения цинка, соединения меди, соединения никеля, соединения кобальта, молибдена, соединения марганца, например по меньшей мере 3 соединений, например по меньшей мере 4 соединений, например по меньшей мере 5 соединений, например всех 6 соединений.

7. Способ в соответствии с любым одним из пп. 1–6, в котором среда для ферментации подлежит использованию в порционной ферментации, и содержание одного или нескольких соединений кальция в среде для порционной ферментации, такого как хлорид кальция, составляет 0,25 г/л или меньше, например 0,2 г/л или меньше, например 0,15 или меньше, например 0,1 г/л или меньше, например 0,05 или меньше, например 0,01 г/л или меньше, например 0,005 или меньше, например в диапазоне 0,25–0,0001 г/л, например в диапазоне 0,2–0,001 г/л, например в диапазоне 0,15–0,01 г/л, например в диапазоне 0,1–0,02 г/л, например в диапазоне 0,08–0,03 г/л, например в диапазоне 0,06–0,04 г/л.

8. Способ в соответствии с любым одним из пп. 1–7, в котором среда для ферментации подлежит использованию в порционной ферментации с подпиткой или непрерывной ферментации, и содержание одного или нескольких соединений кальция, таких как хлорид кальция, в среде для ферментации находится в диапазоне 0,05–10 г/л, например в диапазоне 0,1–7,5 г/л, например в диапазоне 1–5 г/л, например в диапазоне 2,0–4,5 г/л, например в диапазоне 3–4,2 г/л, например в диапазоне 3,5–4 г/л.

9. Среда для ферментации, получаемая с помощью способа в соответствии с любым одним из пп. 1–8, содержащая меньше чем 0,05 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,03 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,01 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,005 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,001 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,0005 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,0001 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,00005 г/л преципитированного кальция, например меньше чем 0,00001 г/л преципитированного кальция; и/или где среда для ферментации содержит меньше чем 0,005 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,003 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,001 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,0005 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,0001 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,00005 г/л преципитированного железа, например меньше чем 0,00001 г/л преципитированного железа, и/или где среда для ферментации содержит меньше чем 0,4 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,3 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,1 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,05 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,01 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,001 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,0001 г/л преципитированного фосфора, например меньше чем 0,00001 г/л преципитированного фосфора.

10. Способ ферментации для получения биомассы посредством культивирования по меньшей мере одного метанотрофного организма, включающий стадии:

(a) подачи среды для ферментации по п. 9 или среды для ферментации, получаемой с помощью способа по пп. 1–8, в реактор для ферментации;

(b) добавления по меньшей мере одного метанотрофного организма в реактор для ферментации,

(c) предоставления по меньшей мере одному метанотрофному организму, присутствующему в среде для ферментации, возможности ферментировать, предоставляя ферментационную жидкость; и

(d) извлечения ферментационной жидкости из реактора для ферментации, предоставляя биомассу.

11. Способ ферментации по п. 10, где процесс ферментации представляет собой процесс порционной ферментации или процесс порционной ферментации с подпиткой и где среда для ферментации содержит источник азота, предпочтительно источник азота представляет собой нитратное соединение, такое как нитрат натрия (NaNO₃), или где процесс ферментации представляет собой непрерывную ферментацию, где производственную среду для ферментации добавляют и где источник азота производственной среды для ферментации меняют на соединение аммония.