Плотная питательная среда с гидролизатом чайного гриба, стимулирующим накопление бактериальной массы бруцелл

Изобретение относится к микробиологии. Плотная питательная среда для накопления бактериальной массы бруцелл содержит пептон сухой ферментативный, дрожжевую воду, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба, агар микробиологичесикй и дистиллированную воду при заданном соотношении ингредиентов. Изобретение позволяет повысить концентрацию микробных клеток в получаемой биомассе бруцелл. 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно, к приготовлению микробиологических питательных сред для накопления бактериальной массы бруцелл.

Известна питательная среда - мясопептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), используемая для выращивания биомассы бруцелл, ее применение регламентировано ГОСТ 33675-2015. Для изготовления 1 л среды используется 500 мл мясного бульона и 500 мл печеночного экстракта, 3% агар-агара, 1% пептона, 0,5% хлорида натрия, рН 7,2-7,3. После кипячения и расплавления агар-агара в среду добавляют 2% глицерина и 1% глюкозы, после чего ее разливают в литровые колбы по 250 мл и стерилизуют при температуре 121°С в течение 30 минут. Однако при использовании этой среды не всегда удается получить достаточное количество бактериальной массы и высокую концентрацию бруцелл. Кроме того, использование мяса в производстве экономически не оправдано, а снижение качества мяса, используемого для производства, приводит к необходимости введения в состав среды сыворотки КРС, что, в свою очередь, ведет к еще большему удорожанию конечного продукта.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению относится питательная среда-заменитель Альбими следующего состава: пептон сухой - 20 г/л, дрожжевая вода - 20 мл/л, натрий хлористый - 5 г/л, агар микробиологический - 20 г/л, глюкоза - 1 г/л, метабисульфит натрия - 0,1 г/л, дистиллированная вода - до 1 л (МУК 3.1.7.3402-16 Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза).

Недостатком данной среды является выход малого количества бактериальной массы бруцелл, не удовлетворяющего производственным потребностям.

Целью изобретения является разработка плотной питательной среды для накопления бактериальной массы бруцелл с высокой концентрацией микробных клеток вакцинных штаммов Brucella abortus 19 ΒΑ и Brucella melitensis Rev 1, используемых в производстве диагностических МИБП.

Сущность изобретения состоит в использовании в составе питательной среды гидролизата субстанции микробного происхождения - чайного гриба (Medusomyces gysevii), продуктами метаболизма которого является целый ряд биологически активных веществ и стимулирующее влияние которого позволяет повысить концентрацию микробных клеток в получаемой биомассе бруцелл.

Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда содержит в качестве питательной основы пептон сухой ферментативный, а также дрожжевую воду и натрий хлористый, в качестве стимуляторов роста бруцелл в состав включены глюкоза, глицерин, метабисульфит натрия и кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба, при следующем соотношении ингредиентов:

Пептон сухой ферментативный	20 г
Дрожжевая вода	20 мл
Натрий хлористый	5 г
Глюкоза	2 г
Глицерин	4 г
Метабисульфит натрия	0,1 г
Гидролизат чайного гриба	50 мл
Агар микробиологический	13 г
Дистиллированная вода	до 1 л

Пептон сухой ферментативный, ГОСТ 13805-76, с массовой долей истинного пептона не менее 70%, используют в качестве питательной основы многих микробиологических сред.

Дрожжевая вода используется в качестве полноценного и дешевого источника факторов роста - таких, как витамины группы В, витамин D, пуриновые и пиримидиновые основания. Дрожжи содержат до 53% белка и 25-40% углеводов (Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э., Питательные среды для медицинской микробиологии. - СПБ.: Элби - СПб., 2002, с. 14).

Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77. Натрий хлористый необходим для поддержания изотоничности среды. Растворенные в питательной среде и находящиеся в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Глюкоза, ГОСТ 975-88. Глюкоза является легкодоступным источником углерода для обеспечения роста бруцелл. Она также выполняет роль редуцирующего вещества, связывающего токсичные перекисные соединения (Телишевская, Л.Я. Питание и метаболизм патогенных микроорганизмов / Л.Я. Телишевская, Н.К. Букова А.А. Комаров, В.Т. Ночевный. - М.: Издательский дом «Научная библиотека», 2016. - 156 с.).

Глицерин, ГОСТ 6259-75. Трехатомный спирт глицерин используется в качестве стимулятора роста бруцелл, нередко в достаточно высоких концентрациях (патент №2687373 МПК C12N 1/20, A61K 39/10, A61K 39/40, G01N 33/569 Способ получения биомассы бруцелл вакцинных штаммов при глубинном выращивании с использованием жидкой питательной среды минимизированного состава [Текст] / Пяткова Н.В., и др.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации: - №2016152370; заявл. 28.12.2016; опубл. 13.05.2019; Бюл. №14. - 9 с.).

Метабисульфит натрия, ГОСТ-195-77. Является для микроорганизмов дополнительным источником серы, которая стимулирует протеолитические ферменты, а также необходима для сохранения окислительно-восстановительного потенциала бактериальной клетки (Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств. Учебное пособие / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 264 с.).

Кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба (Medusomyces gysevii), примененный в качестве стимулятора роста микроорганизмов, представляет собой прозрачную жидкость коричневого цвета, содержание сухого остатка 4,7±0,8%. Зооглея Medusomyces gysevii, используемая для изготовления гидролизата, состоит из микробной массы уксуснокислых бактерий и дрожжей, которая является продуцентом широкого спектра метаболитов, - таких, как витамины группы В, витамин С, органические кислоты, спирт, моносахариды и др.

Агар микробиологический (европейский тип), прочность студня - не менее 350±40 г. Необходимый желирующий компонент плотных питательных сред. Считается, что агар не утилизируется культивируемыми клетками, а служит инертным носителем и обеспечивает осмотический потенциал среды (Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В.И. Негрука: Предисл. Р.Г. Бутенко. - М.: Наука, 1989. - 360 с.).

Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72, отвечает всем санитарно-гигиеническим требованиям. Вода играет важную роль во всех физиологических функциях бактериальной клетки, является средой для биохимических реакций и источником кислорода в процессах метаболизма и гидролиза.

Дрожжевую воду готовили в соответствии с МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза». К 1 л дистиллированной воды добавляли 1 кг хлебных дрожжей и кипятили до растворения. Затем фильтровали через полотняный фильтр. Хранили под хлороформом в темноте не более двух недель.

Кислотно-ферментативный гидролизат зооглеи чайного гриба (Medusomyces gysevii) готовили следующим образом.

Выращенную в лабораторных условиях зооглею чайного гриба отбирали и тщательно отмывали под проточной водой, измельчали, замораживали при минус 40°С в течение 72 часов и подвергали сублимационной сушке в течение 30 ч при температуре сублиматора минус 35°С, затем полученную массу измельчали до однородного порошка.

Сублимат зооглеи растворяли в дистиллированной воде в соотношении 1:125, перемешивали, и затем к раствору добавляли HCl (конц. 35%) до ее концентрации 0,5%, выдерживали при температуре 50°С в течение 60 мин при перемешивании в шейкер-термостате. Затем полученную массу автоклавировали при 125°С в течение 60 мин в паровом стерилизаторе, а после нейтрализовали 1М NaOH до рН 7,8-8,0. Далее в субстанцию вносили 2 мг/мл панкреатина и выдерживали 48 ч при температуре 37°С и перемешивании в шейкер-термостате, с периодическим подщелачиванием. Ферментацию останавливали нагревом до температуры 90°С в течение 10 мин, затем гидролизат фильтровали через бумажные фильтры и автоклавировали при температуре 120°С в течение 10 мин в паровом стерилизаторе.

Приготовление плотной питательной среды с гидролизатом чайного гриба, стимулирующим накопление бактериальной массы бруцелл.

Для приготовления питательной среды взвешивают пептона сухого ферментативного - 20 г; натрия хлорида - 5 г; глюкозы - 2 г; метабисульфита натрия - 0,1 г; агара микробиологического - 13 г; отмеряют дрожжевой воды - 20 мл; кислотно-ферментативного гидролизата чайного гриба - 50 мл. Затем соединяют ингредиенты в эмалированной емкости и добавляют дистиллированную воду до 1 л, тщательно перемешивают до образования однородной массы, устанавливают рН 7,2-7,3 при помощи раствора соляной кислоты (1:1) или 20% раствором гидроксида натрия, подогревают до кипения и кипятят до полного растворения агара в течение 2 минут. Готовая среда прозрачна, имеет светло-желтый цвет.Готовую среду разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50 мл и автоклавируют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации охлаждают до температуры 56°С, затем скашивают на специально смонтированных подставках.

В качестве примера испытывали культуры вакцинных штаммов В. abortus 19 ΒΑ и В. melitensis Rev 1, выращенные в пробирках на скошенном соево-казеиновом агаре. В стерильном 0,9% растворе натрия хлорида готовили взвеси двухсуточных культур тест-штаммов, соответствующие 10 единицам по оптическому стандарту мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентные 1,7×10⁹ м.к./мл, затем полученные взвеси последовательно разводили 0,9% раствором натрия хлорида в 1,7 раза для получения концентрации 1,0×10⁹ м.к./мл, и 1:1, таким образом получая содержание в 1 мл 500 млн микробных клеток. Из данного разведения взвеси культур высевали по 1 мл в 3 флакона (матраца), покачиванием распределяли по скошенной поверхности агара, оставляли на специально смонтированных подставках на 30 минут для впитывания жидкости, и в скошенном состоянии помещали в термостат.Выращивали в течение 48±2 ч при температуре 37±1°С.

Учет результатов проводили через 48±2 ч. Выращенные культуры смывали 5 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида из каждого флакона (матраца) путем отсасывания биомассы стерильной пипеткой в градуированную пробирку объемом 25 мл. Для определения концентрации микробных клеток в исследуемой взвеси стерильной пипеткой отбирали 0,5 мл в пробирку из набора (ОСО 42-28-85 П) и последовательно добавляли 0,9% раствор натрия хлорида до получения мутности взвеси, соответствующей 1 млрд микробных клеток. Полученное значение умножали на 1,7 и на 2, таким образом определяя концентрацию (количество млрд микробных клеток в смывной жидкости). Затем вычисляли количество микробных клеток, полученных с 1 мл питательной среды, для чего умножали объем полученной взвеси на общую концентрацию микробных клеток, полученное значение делили на объем питательной среды во флаконах (матрацах).

Аналогичные манипуляции параллельно производили на среде-заменителе Альбими (контроль). Количество бактериальной массы, собранной со всех флаконов (матрацев) контрольной группы, составило 54,4 млрд м.к. для В. abortus 19 ΒΑ и 47,6 млрд м.к. для В. melitensis Rev 1. При пересчете на 1 мл питательной среды количество полученной бактериальной массы для В. abortus 19 ΒΑ было 4,7 млрд м.к./мл, для В. melitensis Rev 1 - 4,1 млрд м.к./мл.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали во флаконах (матрацах) с питательной средой, содержащей: пептон сухой ферментативный - 17 г; дрожжевую воду - 15 мл; натрий хлористый - 4 г; глюкозу - 0,8 г; натрия метабисульфит - 0,05 г; глицерин - 3 г; агар микробиологический - 10 г; кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба - 25 мл; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество бактериальной массы, собранной со всех флаконов (матрацев) опытной группы, составило для В. abortus 19 ΒΑ 41,48 млрд м.к., для В. melitensis Rev 1 - 42,1 млрд м.к., соответственно. При пересчете на 1 мл питательной среды количество полученной бактериальной массы для В. abortus 19 ΒΑ составило 5,0, а для В. melitensis Rev 1 - 4,5 млрд м.к./мл, соответственно.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали во флаконах (матрацах) с питательной средой, содержащей: пептон сухой ферментативный - 20 г; дрожжевую воду - 20 мл; натрий хлористый - 5 г; глюкозу - 1 г; натрия метабисульфит - 0,1 г; глицерин - 4 г; агар микробиологический - 13 г; кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба - 50 мл; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество бактериальной массы, собранной со всех флаконов (матрацев) опытной группы, составило для В. abortus 19 ΒΑ 157,9 млрд м.к., для В. melitensis Rev 1 - 125,4 млрд м.к., соответственно. При пересчете на 1 мл питательной среды количество полученной бактериальной массы для В. abortus 19 ΒΑ составило 19,7, а для В. melitensis Rev 1 - 13,8 млрд м.к./мл, соответственно.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали во флаконах (матрацах) с питательной средой, содержащей: пептон сухой ферментативный - 25 г; дрожжевую воду - 23 мл; натрий хлористый - 6 г; глюкозу - 1,2 г; натрия метабисульфит - 0,15 г; глицерин - 5 г; агар микробиологический - 16 г; кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба - 75 мл; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество бактериальной массы, собранной со всех флаконов (матрацев) опытной группы, составило для В. abortus 19 ΒΑ 61,8 млрд м.к., для В. melitensis Rev 1 - 39,8 млрд м.к., соответственно. При пересчете на 1 мл питательной среды количество полученной бактериальной массы для В. abortus 19 ΒΑ составило 4,2, а для В. melitensis Rev 1-3,6 млрд м.к./мл, соответственно.

Таким образом, содержание в заявленной плотной питательной среде с гидролизатом чайного гриба, стимулирующим накопление бактериальной массы бруцелл, 50 мл/л кислотно-ферментативного гидролизата чайного гриба (пример 2) является оптимальным и позволяет повысить концентрацию микробных клеток в получаемой биомассе вакцинных штаммов В. abortus 19 ΒΑ и В. melitensis Rev 1, используемых в производстве диагностических МИБП.

Плотная питательная среда для накопления бактериальной массы бруцелл, содержащая пептон сухой ферментативный, дрожжевую воду, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, кислотно-ферментативный гидролизат чайного гриба, агар микробиологический и дистиллированную воду при следующем соотношении ингредиентов:

пептон сухой ферментативный	20 г
дрожжевая вода	20 мл
натрий хлористый	5 г
глюкоза	2 г
глицерин	4 г
метабисульфит натрия	0,1 г
кислотно-ферментативный
гидролизат чайного гриба	50 мл
агар микробиологический	13 г
дистиллированная вода	до 1 л