Набор для выявления коронавируса sars-cov-2

Изобретение относится к области медицины и биологии. Описан набор синтетических олигонуклеотидов, фланкирующих несколько выбранных участков на РНК коронавируса SARS-CoV2 (праймеры), а также синтетических олигонуклеотидов, несущих в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней. Изобретение позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени. 2 табл., 8 пр., 6 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и биологии и позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени.

В настоящее время метод ПЦР в реальном времени рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для выявления коронавируса SARS-CoV-2 как в биологических образцах, так и в образцах, взятых из окружающей среды. Данный метод позволяет быстро детектировать РНК коронавируса с высокой специфичностью. На сайте ВОЗ представлена таблица с некоторыми известными последовательностями праймеров и зондов для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-per-panel-primer-probes.html

Однако использование отдельных последовательностей для выявления РНК вируса чревато ложноотрицательным результатом, так как вследствие эволюции РНК вируса постоянно изменяется. В результате изменения нуклеотидной последовательности в месте узнавания праймеров и/или зонда может не произойти специфического узнавания участка РНК вируса, выбранного для анализа, что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того, к ложноотрицательным результатам при анализе может приводить низкое содержание РНК вируса в образце. Таким образом, основной задачей при детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 является устранение ложноотрицательных результатов, вызванных мутациями в геноме вируса, а также повышение чувствительности реакции.

Одним из известных аналогов нашего изобретения является патент на изобретение RU2727054. Он описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР с использованием специфичных праймеров к генам orflab (1 локус, длина амплифицируемого фрагмента 158 п.н.) и N коронавируса SARS-CoV-2 (2 локуса, длина амплифицируемых фрагментов 203 и 250 п.н.). После проведения ПЦР продукты реакции разделяют в электрофорезе с маркером длины. По наличию и длине ампликонов способ позволяет выявлять и идентифицировать наличие вируса SARS-CoV-2 в биологическом материале. Достоинством этого способа является простота применения и отсутствие дорогостоящих приборов, необходимых для детекции результатов. К недостаткам относятся наличие в анализе дополнительной стадии (электрофоретическое разделение продуктов амплификации), что увеличивает время анализа и может служить потенциальным источником контаминации лаборатории продуктами амплификации.

Также известно изобретение RU2732608, которое описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием специфичных праймеров и флуоресцентно меченного зонда к гену orflab (позиции нуклеотидных остатков 5327-5518). К достоинствам метода следует отнести применение лиофильно высушенных компонентов реакции, что допускает возможность транспортировки набора реагентов без соблюдения требований «холодовой цепи» и наличие в составе набора положительного контрольного образца. К недостаткам следует отнести наличие в составе набора специфичных праймеров и зонда только к одному локусу на вирусной РНК, что может привести к ложноотрицательному результату при мутации в месте отжига специфичных праймеров или зонда.

Еще одним аналогом является изобретение RU2733665, которое описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием специфичных праймеров и флуоресцентно меченного зонда к гену N вируса SARS-CoV-2. Достоинство способа состоит в высокой специфичности именно к вирусу SARS-CoV-2, высокой чувствительности, отсутствию стадии электрофореза. Недостатком данного способа, как и в предыдущем, является наличие специфичных праймеров и зонда только к одному локусу на вирусной РНК, что может привести к ложноотрицательному результату при мутации в месте отжига специфичных праймеров или зонда.

Прототипом нашего изобретения следует считать патент на изобретение RU2720713. Он описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием 6 пар специфичных праймеров. Достоинством данного метода является обеспечение универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. Недостатком метода является то, что авторы, для увеличения надежности, выбрали для анализа высококонсервативные участка вируса, что может привести к ложноположительныму результату анализа при наличии в исследуемом образце РНК других коронавирусов человека и животных.

Выбранные нами последовательности праймеров и зондов с различными флуоресцентными метками позволяют использовать для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 несколько участков генома вируса, что увеличивает специфичность и чувствительность анализа, и, таким образом, позволяет решить поставленную задачу. В качестве контроля выделения РНК используются праймеры и зонд к человеческому гену GAPDH, представленные в перечне последовательностей нуклеотидов SEQ ID No 25-27. Последовательности праймеров и зондов, выбранных нами для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2, представлены в таблице 1 и в перечне последовательностей нуклеотидов SEQ ID No 1-27

Подобранные нами пары праймеров и зонды могут использоваться для проведения ПЦР в реальном времени как с кДНК, полученной ранее при проведении реакции обратной транскрипции (ОТ) на матрице РНК, выделенной из биологического образца, так и в совмещенной реакции ОТ-ПЦР в реальном времени. Во втором случае в одной пробирке совмещаются реакции ОТ и ПЦР в реальном времени, что значительно сокращает время анализа. Состав компонентов для проведения реакции приведен в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый набор включает в себя синтетические олигонуклеотиды, фланкирующие несколько выбранных нами участков на РНК коронавируса SARS-CoV-2 (праймеры), а также синтетические олигонуклеотиды, несущие в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV-2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней.

Примеры использования

Пример 1

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF1_F(Seq ID NO 1), обратный праймер ORF1_R(Seq ID NO 2), флуоресцентный зонд ORF1_P(Seq ID NO 3), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам ROX и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 1 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF1 (Seq ID NO 1-3), комплементарных гену ORFlab коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 16,47. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену ORF_lab коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,13. Поскольку величина Ct для гена ORFlab составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах ROX и Су5 со значением Ct<38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 2

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF1.1_F(Seq ID NO 4), обратный праймер ORF1.1_R(Seq ID NO 5), флуоресцентный зонд ORF1.1_P(Seq ID NO 6), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам FAM и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 2 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF1.1 (Seq ID NO 4-6), комплементарных гену ORF lab коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 17,52. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену ORF lab коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 29,72. Поскольку величина Ct для гена ORFlab составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах FAM и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 3

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер N1_F(Seq ID NO 7), обратный праймер N1_R(Seq ID NO 8), флуоресцентный зонд N1_P(Seq ID NO 9), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам R6G и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 3 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров N1 (Seq ID NO 7-9), комплементарных гену N коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,73. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену N коронавируса SARS-CoV-2.

Ct для этого гена составляет в данном случае 31,29. Поскольку величина Ct для гена N коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах R6G и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 4

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер N3 F (Seq ID NO 10), обратный праймер N3_R (Seq ID NO 11), флуоресцентный зонд N3_P (Seq ID NO 12), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам Су3 и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 4 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров N3 (Seq ID NO 10-12), комплементарных гену N коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,83. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену N коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,02. Поскольку величина Ct для гена N коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах Су3 и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 5

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер S1_F(Seq ID NO 13), обратный праймер S1_R(Seq ID NO 14), флуоресцентный зонд S1_P(Seq ID NO 15), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам FAM и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции)/

На фиг. 5 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров S1 (Seq ID NO 13-15), комплементарных гену S коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 20,16. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену S коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,26. Поскольку величина О для гена S коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах FAM и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 6

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер M1_F (Seq ID NO 16), обратный праймер M1_R(Seq ID NO 17), флуоресцентный зонд M1_P (Seq ID NO 18), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAPJP (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам ROX и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 6 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров M1 (Seq ID NO 16-18), комплементарных гену М коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18, 17. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 30,63. Поскольку величина Ct для гена М коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах ROX и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 7

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер M2 F (Seq ID NO 19), обратный праймер M2_R (Seq ID NO 20), флуоресцентный зонд M2_P (Seq ID NO 21), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам VIC и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 7 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров М2 (Seq ID NO 19-21), комплементарных гену М коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,39. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,23. Поскольку величина Ct для гена М коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах VIC и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 8

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF7a_F (Seq ID NO 22), обратный праймер ORF7a_R (Seq ID NO 23), флуоресцентный зонд ORF7a_P (Seq ID NO 24), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам Су3 и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 8 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF7a (Seq ID NO 22-24), комплементарных гену ORF7a коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,39. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,95. Поскольку величина Ct для гена ORF7a коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах Су3 и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской

академии наук (ИТЭБ РАН)

<120> Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2

<140> 2021102274

<141> 02.02.2021

<160> SEQ ID NO: 27

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

gctgctcttcaacctgaagaaga

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

tccatctctaattgaggttgaacct

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 26

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

rox-tggtcaacaagacggcagtgaggaca-bhq2

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

ggccaattctgctgtcaaat

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

catcagtgcaagcagtttgt

<210> SEQ ID NO: 6

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

fam-cctgttgcactacgacagatg-bhq1

<210> SEQ ID NO: 7

<211> 18

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

ggccgcaaattgcacaat

<210> SEQ ID NO: 8

<211> 17

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

ccaatgcgcgacattcc

<210> SEQ ID NO: 9

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

r6g-cccccagcgcttcagcgttct-bhq1

<210> SEQ ID NO: 10

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

accccaaaatcagcgaaatg

<210> SEQ ID NO: 11

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

ttctggttactgccagttgaatctg

<210> SEQ ID NO: 12

<211> 24

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

cy3-accccgcattacgtttggtggacc-bhq2

<210> SEQ ID NO: 13

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

ttggtgcaggtatatgcgcta

<210> SEQ ID NO: 14

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

taattctcctcggcgggcacgtagt

<210> SEQ ID NO: 15

<211> 24

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

fam-actgaattttctgcaccaagtgac-bhq1

<210> SEQ ID NO: 16

<211> 22

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

ggcttgatgtggctcagctact

<210> SEQ ID NO: 17

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

tggattgaatgaccacatgga

<210> SEQ ID NO: 18

<211> 27

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

rox-cattgcttctttcagactgtttgcgcg-bhq2

<210> SEQ ID NO: 19

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

catgtggtcattcaatccagaaa

<210> SEQ ID NO: 20

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

ctagaagcggtctggtcagaatagt

<210> SEQ ID NO: 21

<211> 30

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

vic-taacattcttctcaacgtgccactccatgg-bhq1

<210> SEQ ID NO: 22

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

agaaccttgctcttctggaacatac

<210> SEQ ID NO: 23

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

gctaaagcaagtcagtgcaaatttg

<210> SEQ ID NO: 24

<211> 30

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

cy3-agggcaattcaccatttcatcctctagctg-bhq2

<210> SEQ ID NO: 25

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

gacagtcagccgcatcttct

<210> SEQ ID NO: 26

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

gcgcccaatacgaccaaatc

<210> SEQ ID NO: 27

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

cy5-tcgccagccgagccacatcgctc-bhq2

<---

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для выявления коронавируса SARS-CoV-2, комплементарных к выбранным участкам на РНК коронавируса, соответствующих генам ORF1ab, М, N, S, ORF7a, и синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, комплементарных к выбранному участку гена человека GAPDH, где прямой (F), обратный (R) праймеры и зонды (Р) имеют последовательности:



 

Похожие патенты:

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к иммунологии, патофизиологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор для определения уровня экспрессии гена, кодирующего PEDF кролика Oryctolagus cuniculus методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к способу получения модифицированного олигонуклеотида, включающего олигонуклеотидную часть и полиалкокси часть, применяемого в терапевтических целях. Способ включает: a) активирование карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, включающего полиалкокси часть и карбоксильную группу, реагентом конденсации в смешиваемом с водой органическом растворителе; и b) взаимодействие активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с аминогруппой второго взаимодействующего вещества с получением модифицированного олигонуклеотида.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены набор и способ для диагностики рака мочевого пузыря с помощью мутаций C228T и C250T в промоторе гена hTERT.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ определения наличия микроорганизмов у индивидуума (варианты), способ определения наличия патологического состояния у индивидуума, способ диагностики инфекционного заболевания, вызванного микроорганизмами, у индивидуума, а также машиночитаемый носитель данных и компьютерная система для осуществления указанных способов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для выявления мутации мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области молекулярной биологии. Сущностью заявленного технического решения является генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости культуры клеток насекомого P.

Группа изобретений относится к способам оценки качества партии композиции на основе лекарственных трав. Способ оценки качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав, включающий анализ тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из: (a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, который включает измерение ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, против одного или более сигнальных путей, выбранных из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, IFNa-stat1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-alpha, ER-beta, DHT-AR и альдостерона-MR; и (b) анализа экспрессии генов, где анализ экспрессии генов включает количественное определение одного или нескольких генов, кодирующих белки, выбранных из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23; и затем сравнение результатов биологического анализа тестируемой партии с результатами, полученными для известной партии композиции на основе лекарственных трав, которая имеет известный уровень in vivo активности; где, если результаты, полученные для тестируемой партии, имеют коэффициент корреляции от 0,95 до 1,0 с результатами, полученными для известной партии, тестируемую партию определяют как имеющую качество, в достаточной степени соответствующее качеству известной партии, и потенциальную in vivo активность (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в детской ортопедии для лабораторной и клинической диагностики идиопатического сколиоза. Изобретение позволяет выявить молекулярно-генетические маркеры наиболее сложного, быстропрогрессирующего типа подросткового идиопатического сколиоза с целью диагностики на доклиническом этапе.

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии и молекулярной биологии. Может быть использовано при экспертизе лекарственных средств, имеющих почечный путь выведения, а также на доклиническом этапе при разработке новых лекарственных средств, изобретение позволяет оценить транспорт отрицательно заряженных лекарственных средств – субстратов транспортера ОАТ1 путем сравнения уровней экспрессии гена SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A и Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к иммунологии, патофизиологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор для определения уровня экспрессии гена, кодирующего PEDF кролика Oryctolagus cuniculus методом ПЦР в режиме реального времени.
Наверх