Основанный на механизме контроль качества лекарственного средства растительного происхождения
Группа изобретений относится к способам оценки качества партии композиции на основе лекарственных трав. Способ оценки качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав, включающий анализ тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из: (a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, который включает измерение ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, против одного или более сигнальных путей, выбранных из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, IFNa-stat1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-alpha, ER-beta, DHT-AR и альдостерона-MR; и (b) анализа экспрессии генов, где анализ экспрессии генов включает количественное определение одного или нескольких генов, кодирующих белки, выбранных из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23; и затем сравнение результатов биологического анализа тестируемой партии с результатами, полученными для известной партии композиции на основе лекарственных трав, которая имеет известный уровень in vivo активности; где, если результаты, полученные для тестируемой партии, имеют коэффициент корреляции от 0,95 до 1,0 с результатами, полученными для известной партии, тестируемую партию определяют как имеющую качество, в достаточной степени соответствующее качеству известной партии, и потенциальную in vivo активность (варианты). Вышеописанные способы, включающие биологические анализы, такие как анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, или анализ экспрессии генов, эффективно предсказывают потенциальную in vivo активность тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав лучше, чем ЖХ-МС химический анализ. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании 35 U.S.C. 119(e) согласно предварительной заявки США № 62/353313, поданной 22 июня 2016 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
Заявление относительно федерально спонсированных исследований или разработок
Настоящее изобретение было создано при государственной поддержке в соответствии с CA154295, выданным Национальным институтом здравоохранения (NIH). Правительство имеет определенные права на изобретение.
Предпосылки создания изобретения
Травяные и растительные лекарственные средства широко используются во всем мире уже много столетий. В настоящее время композиции на основе лекарственных трав, экстракты лекарственных растений и соединения, выделенные из лекарственных растений, играют важную роль в лечении целого ряда заболеваний и расстройств, и многие из широко применяемых сегодня лекарственных средств, таких как аспирин, первоначально представляли собой растительные лекарственные средства.
Чтобы можно было уверенно использовать лекарственные средства растительного происхождения для лечения заболеваний, важен строгий контроль качества. В отличие от синтетических лекарственных композиций, которые намного легче можно контролировать и формулировать, растительные лекарственные средства получают из биологических веществ растительного происхождения. Каждое растение может содержать ряд соединений в различных концентрациях в зависимости от генетической вариативности, условий выращивания, времени посадки и сбора урожая, а также возраста растительного материала на момент изготовления лекарственого средства из растительного сырья.
Из-за этих колебаний обычно замечают, что разные партии одного и того же средства на основе лекарственных трав могут иметь разную активность in vivo в зависимости от отличий индивидуальных растительных компонентов, а также различий в способах получения. Также часто замечают, что, несмотря на различную активность in vivo, различные партии средства на основе лекарственных трав могут все же иметь очень похожие химические профили, определенные стандартными методами химического анализа, такими как хроматография и масс-спектрометрия. Возможно, что незначительные примеси или изменения композиции, которые нельзя обнаружить этими методами химического анализа, могут иметь существенное влияние на общую активность лекарственного средства на основе растительного сырья. Таким образом, просто с помощью методов химического анализа трудно определить, будет ли конкретная партия композиции на основе лекарственных трав обладать желаемой активностью in vivo.
PHY906 представляет собой экстракт смеси лекарственных трав на основе растительной смеси Huang Qin Tang, которая была впервые описана в китайских текстах 1800 лет назад и использовалась для лечения желудочно-кишечных симптомов. PHY906 состоит из четырех лекарственных растений: Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z). PHY906 в настоящее время изготавливают в соответствии с cGMP (текущая надлежащая производственная практика). В клинических испытаниях показано, что PHY906 повышает терапевтический индекс химиотерапии против рака.
Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в данной области техники в способах определения качества и потенциальной эффективности лекарственных средств растительного происхождения и других композиций на основе лекарственных трав, которые не полагаются исключительно на химический анализ. Настоящее изобретение удовлетворяет эту существующую потребность.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает способ оценки качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав, включающий анализ тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции; и
(b) анализа экспрессии генов;
и затем сравнение результатов биологического анализа тестируемой партии с результатами, полученными для известной партии композиции на основе лекарственных трав, которая имеет известный уровень in vivo активности;
где измерение разницы между результатами, полученными для тестируемой партии, и результатами, полученными для известной партии, обеспечивает оценку качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав.
В некоторых вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав включает одну или несколько композиций, выбранных из группы, состоящей из экстрактов лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z), любых их фракций и любых активных химических веществ, присутствующих в экстрактах этих лекарственных растений или их фракциях. В других вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав представляет собой PHY906, где PHY906 включает экстракты лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z) в соотношении 3: 2: 2: 2 (S: G: P: Z).
В некоторых вариантах осуществления анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, включает один или несколько анализов, выбранных из группы, состоящей из люциферазных репортерных анализов и ферментных анализов.
В некоторых вариантах осуществления анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, включает измерение ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, на основании одного или нескольких ферментов, выбранных из ферментов воспаления, ферментов клеточного роста и дифференциации и эндокринных ферментов и гормонов. В других вариантах осуществления один или несколько ферментов выбраны из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, INFa-state1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-альфа, ER-бета, DHT-AR и альдостерон-MR.
В некоторых вариантах осуществления анализ экспрессии генов включает: обработку HepG2 клеток композицией на основе лекарственных трав в течение 24 часов, экстрагирование продуцированной мРНК и количественный анализ мРНК методом количественной ПЦР с обратной транскриптазой (кОТ-ПЦР).
В некоторых вариантах осуществления анализ экспрессии генов включает количественное определение одного или нескольких генов, кодирующих белки, имеющие функцию, выбранную из воспаления, антиокисления, роста и дифференциации, метаболизма и межклеточного взаимодействия. В других вариантах осуществления один или несколько генов выбраны из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько методов биологического анализа определяют различия между активной партией композиции на основе лекарственных трав и неактивной партией композиции на основе лекарственных трав лучше, чем химические методы анализа композиций. В других вариантах осуществления химические методы анализа композиций включают ЖХ-МС (жидкостная хроматография - масс-спектрометрия).
В некоторых вариантах осуществления, если результаты, полученные для тестируемой партии, составляют от около 90% до около 110% от результатов известной партии, тогда тестируемую партию определяют как имеющую качество, в достаточной степени соответствующее качеству известной партии, и потенциальную in vivo активность.
В некоторых вариантах осуществления качество тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав также анализируют при помощи ЖХ-МС.
Изобретение также обеспечивает способ лечения субъекта, страдающего раком, включающий оценку качества и потенциальной in vivo эффективности тестируемой партии PHY906 путем анализа композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции; и
(b) анализа экспрессии генов;
сравнение результатов биологического анализа с результатами, полученными для известной партии PHY906, которая имеет известный уровень in vivo активности;
где измерение разницы между результатами, полученными для тестируемой партии, и результатами, полученными для известной партии, обеспечивает оценку качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав,
и, если тестируемая партия PHY906 показывает активность в биологических анализах, подобную активности известной партии PHY906, введение тестируемой партии PHY906 субъекту.
Краткое описание чертежей
Следующее подробное описание конкретных вариантов осуществления изобретения будет более понятно при прочтении вместе с прилагаемыми чертежами. С целью иллюстрации изобретения на чертежах показаны конкретные варианты осуществления. Однако должно быть понятно, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями и инструментальными средствами вариантов осуществления, показанными на чертежах.
Фиг. 1A-1D иллюстрируют сравнение между активностями in vivo и химическое сходство между различными партиями PHY 906 и F (коммерческая смесь экстракта Huang Qin Tang). Представленные результаты указывают на отсутствие взаимосвязи между химическим анализом и биологическим эффектом. Фиг. 1А представляет эффект различных партий PHY906 и F на противоопухолевую активность СРТ11 и защиту массы тела мышей BDF1 с опухолями толстой кишки. Фиг. 1В представляет данные анализа химического сходства PHY906, полученные при помощи ЖХ-МС. Фиг. 1C представляет таблицу, показывающую химическое сходство между различными партиями PHY906 и F, где ʺ1ʺ означает идентичный химический профиль, а ʺ0ʺ означает совершенно другой химический профиль без какого-либо совпадения. Фиг. 1D представляет информацию Фиг. 1С как кластерный анализ на основе химических профилей.
Фиг. 2А-2С представляет данные анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, для различных партий PHY906 и F. Показанные результаты указывают на тесную корреляцию между ответом, связанным с трансдукционной активностью, и биологической активностью. На фигуре 2А показан эффект различных партий PHY906 и F на ответ, связанный с активностью сигнальной трансдукции, с использованием различных люциферазных репортерных клеточных линий и ферментных анализов. Фиг. 2B представляет таблицу, представляющую корреляционный анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, для разных партий PHY906 и F, где ʺ1ʺ означает идентичную активность сигнальной трансдукции, а ʺ0ʺ означает совершенно другую активность сигнальной трансдукции. Фиг. 2C представляет информацию Фиг. 2B как кластерный анализ на основе ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции.
Фиг. 3А-3С представляют анализ экспрессии генов для различных партий PHY906 и F. Представленные результаты указывают на тесную корреляцию между экспрессией генов и биологической активностью. Фиг. 3А показывает эффект различных партий PHY906 и F на экспрессию выбранного гена. Клетки HepG2 обрабатывали при помощи PHY906 или F в течение 24 часов, и мРНК выделяли для анализа методом кОТ-ПЦР. Фиг. 3B представляет таблицу, представляющую корреляционный анализ генной экспрессии для PHY906 и F, где ʺ1ʺ означает идентичную генную экспрессию, а ʺ0ʺ означает совершенно другую генную экспрессию. Фиг. 3C представляет информацию Фиг. 3В как кластерный анализ, основанный на экспрессии генов.
Подробное описание изобретения
Изобретение в одном аспекте относится неожиданному открытию, что композиции на основе лекарственных трав с практически идентичными профилями химического анализа могут иметь сильно различающуюся активность in vivo. Изобретение также относится к неожиданному открытию, что биологические анализы, включая анализы ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, и анализы экспрессии генов, лучше предсказывают потенциальную in vivo активность композиции на основе лекарственных трав, чем профили химических анализов.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам оценки качества партии композиции на основе лекарственных трав, включающим осуществление анализа композиции на основе лекарственных трав с использованием одного или нескольких методов биологического анализа. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав включает одну или несколько композиций, выбранных из группы, состоящей из экстрактов лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z), любых их фракций и любых активных химических веществ, присутствующих в экстрактах этих лекарственных растений или их фракциях.
Определения
Как используется в настоящей заявке, каждый из следующих терминов имеет значение, ассоциируемое с ним в этом разделе.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, которое хорошо известно специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя при осуществлении на практике или испытании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, представлено описание иллюстративных способов и материалов.
Как правило, номенклатура, используемая в настоящей заявке, и лабораторные процедуры, используемые в фармакологии, химии природных соединений и органической химии, хорошо известны и широко используются в данной области.
Как используется в настоящей заявке, артикли ʺаʺ и ʺanʺ относятся к одному или нескольким (то есть, по меньшей мере, к одному) грамматическим объектам, определяемым этим артиклем. Например, ʺэлементʺ означает один элемент или более чем один элемент.
Как используется в настоящей заявке, термин ʺракʺ определяется как заболевание, характеризующееся быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части тела. Примеры различных видов рака включают, но не ограничиваются этим, рак костей, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и т.п.
В одном аспекте термины ʺсовместно вводимыйʺ и ʺсовместное введениеʺ, как относящиеся к субъекту, относятся к введению субъекту соединения и/или композиции по изобретению вместе с соединением и/или композицией, которые также могут лечить или предотвратить заболевание или расстройство, рассматриваемое в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления совместно вводимые соединения и/или композиции вводят отдельно или в виде любой комбинации как часть единого терапевтического подхода. Совместно вводимое соединение и/или композицию можно сформулировать в виде любых комбинаций типа смесей твердых и жидких веществ в различных твердых, гелеобразных и жидких композициях и в виде раствора.
В контексте настоящей заявки, термин ʺэкстрактʺ относится к концентрированному препарату или раствору соединения или лекарственного средства, полученного из природного источника, такого как трава или другой растительный материал. Экстракты можно получить различными способами, включая погружение растительного сырья в раствор или сушку и измельчение растительного сырья в порошок и растворение порошка в растворе. Экстракт затем можно концентрировать путем удаления части растворителя после растворения определенного количества желаемого соединения в растворе. Также экстракт можно подвергнуть фильтрации или центрифугированию для удаления любого твердого вещества из раствора.
В контексте настоящей заявки, термин ʺHuang Qin Tangʺ относится к композиции на основе лекарственных трав, включающей Glycyrrhiza uralensis Fisch (G), Paeonia lactiflora Pall (P), Scutellaria baicalensis Georgi (S) и Ziziphus jujuba Mill (Z). Huang Qin Tang может быть представлен в виде различных препаратов, включая PHY906 и F.
Фраза ʺингибироватьʺ, как используется в настоящей заявке, означает уменьшение экспрессии, стабильности, функции или активности молекулы, реакции, взаимодействия, гена и/или белка на измеряемое количество или полное предотвращение. Ингибиторы представляют собой соединения, которые, например, связываются с белком, частично или полностью блокируют стимуляцию, уменьшают, предотвращают, задерживают активацию, инактивируют, десенсибилизируют или осуществляют даун-регуляцию стабильности, экспрессии, функции и активности белка или гена, например, антагонисты.
В контексте настоящей заявки, термин ʺPHY906ʺ относится к специфической композиции на основе лекарственных трав, включающей Glycyrrhiza uralensis Fisch (G), Paeonia lactiflora Pall (P), Scutellaria baicalensis Georgi (S) и Ziziphus jujuba Mill (Z). PHY906 может относиться, например, к специфической композиции, включающей S, G, P и Z в соотношении 3: 2: 2: 2, полученной в соответствии со стандартной процедурой.
В контексте настоящей заявки, термин ʺсубъектʺ, ʺпациентʺ или ʺиндивидуумʺ, для которого предусматривается введение, включает, но не ограничивается этим, людей (то есть мужчин или женщин любой возрастной группы, например, педиатрического субъекта (например, младенец, ребенок, подросток) или взрослого субъекта (например, молодой взрослый человек, взрослый среднего возраста или пожилой человек)) и/или других приматов (например, обезьяны Cynomolgus, обезьяны-резус); млекопитающих, включая коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы, кошки и/или собаки; и/или птиц, включая коммерчески значимых птиц, таких как куры, утки, гуси, перепела и/или индюки.
В контексте настоящей заявки, термин ʺтерапевтически эффективное количествоʺ означает количество соединения по изобретению, которое при введении пациенту лечит, минимизирует и/или облегчает симптом заболевания или расстройства. Количество соединения по изобретению, которое составляет ʺтерапевтически эффективное количествоʺ, будет варьироваться в зависимости от соединения, болезненного состояния и его тяжести, возраста пациента, подлежащего лечению, и т.п. Терапевтически эффективное количество может рутинным образом определить специалист в данной области на основании его собственных знаний и настоящего раскрытия.
В контексте настоящей заявки, термин ʺлечениеʺ или ʺосуществлять лечениеʺ определяется как применение или введение терапевтического средства, то есть соединения, полезного в рамках изобретения (отдельно или в комбинации с другим фармацевтическим средством), субъекту или применение или введение терапевтического средства в ткань или клеточную линию, выделенную у субъекта (например, для диагностики или применения ex vivo), который имеет рак, симптом рака или потенциал к развитию рака, с целью излечения, лечения, уменьшения тяжести, облегчения, изменения, ликвидации, улучшения состояния, регрессии или воздействия на рак, симптомы рака или потенциал к развитию рака. Такое лечение может быть специально адаптировано или модифицировано на основе знаний, полученных в области фармакогеномики.
Диапазоны: повсеместно в настоящем раскрытии различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Должно быть понятно, что описание в формате диапазона представлено исключительно для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как специально раскрывающее поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные и парциальные значения в этом диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.
В настоящем описании используются следующие аббревиатуры:
| cGMP | текущая надлежащая производственная практика |
| F | Коммерческий препарат Huang Qin Tang |
| G | Glycyrrhiza uralensis Fisch, также известный как китайская солодка |
| HQT | Huang Qin Tang |
| P | Paeonia lactiflora Pall, также известный как пион китайский |
| ПЦР | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) |
| кОТ-ПЦР | Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой |
| S | Scutellaria baicalensis Georgi, также известный как байкальский шлемник или скутеллария |
| STAR | Ответ, связанный с активностью сигнальной трансдукции |
| Z | Ziziphus jujube Mill, также известный как красный финик или китайский финик |
Способы определения качества
Изобретение включает способы оценки качества и потенциальной in vivo эффективности партии композиции на основе лекарственных трав, при этом способ включает осуществление анализа композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции; и
(b) анализа экспрессии генов;
и затем сравнение результатов биологического анализа с результатами, полученными для партии композиции на основе лекарственных трав, которая имеет известный уровень in vivo активности, где измерение разницы между результатами, полученными для тестируемой партии, и результатами, полученными для известной партии, обеспечивает оценку качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав.
В некоторых вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав включает одну или несколько композиций, выбранных из группы, состоящей из экстрактов лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z), любых их фракций и любых активных химических веществ, присутствующих в экстрактах этих лекарственных растений или их фракциях. В других вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав представляет собой PHY906, где PHY906 включает экстракты лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z) в соотношении 3: 2: 2: 2 (S: G: P: Z). В других вариантах осуществления композиция на основе лекарственных трав может включать композицию или экстракт, полученный из любого другого растительного или травяного источника, любых их фракций, или любых активных химических веществ, присутствующих в растительном или травяном источнике или его фракциях.
В некоторых вариантах осуществления качество и потенциальную эффективность тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав можно определить при помощи анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, выбранного из одного или нескольких люциферазных репортерных анализов и/или ферментных анализов. В других вариантах осуществления анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, измеряет один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, INFa-state1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-альфа, ER-бета, DHT-AR и альдостерон-MR.
В некоторых вариантах осуществления качество и потенциальную эффективность тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав можно определить при помощи анализа экспрессии генов, который включает обработку HepG2 клеток композицией на основе лекарственных трав в течение около 24 часов, экстрагирование продуцированной мРНК и количественный анализ мРНК методом кОТ-ПЦР. В других вариантах осуществления экспрессию генов измеряют для одного или нескольких генов, кодирующих белки, отвечающие за функцию, выбранную из воспаления, антиокисления, роста и дифференциации, метаболизма и межклеточного взаимодействия. В некоторых других вариантах осуществления экспрессию генов измеряют для одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23.
В некоторых вариантах осуществления способы биологического анализа по изобретению более точно устанавливают различие между активными партиями композиции на основе лекарственных трав и неактивной партией композиции на основе лекарственных трав, чем химические методы анализа композиций. В некоторых вариантах осуществления результаты биологических анализов по изобретению обеспечивают более точное сопоставление активных партий композиции на основе лекарственных трав друг с другом, чем стандартные методы химического анализа. В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению могут устанавливать различие между активными партиями композиции на основе лекарственных трав и неактивной партией композиции на основе лекарственных трав, даже когда они имеют одинаковые профили химического анализа с более чем 90% сходством. В других вариантах осуществления методы биологического анализа определяют отличие активных партий композиции на основе лекарственных трав от неактивной партии композиции на основе лекарственных трав лучше, чем химические методы анализа композиций. В других вариантах осуществления тестируемая партия считается обладающей в достаточной степени соответствующим качеством и потенциальной in vivo активностью, если результаты, полученные для тестируемой партии, составляют от около 85% до около 115% от результатов известной партии. В других вариантах осуществления тестируемая партия считается обладающей в достаточной степени соответствующим качеством и потенциальной in vivo активностью, если результаты, полученные для тестируемой партии, составляют от около 90% до около 110% от результатов известной партии. В других вариантах осуществления тестируемая партия считается обладающей в достаточной степени соответствующим качеством и потенциальной in vivo активностью, если результаты, полученные для тестируемой партии, составляют от около 95% до около 105% от результатов известной партии.
В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению, кроме того, включает анализ партии композиции на основе лекарственных трав методом ЖХ-МС.
В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению можно использовать для определения качества и/или потенциальной in vivo эффективности партии любой композиции на основе лекарственных трав или растений.
Способы лечения
Изобретение также обеспечивает способы лечения субъекта, страдающего раком, при этом такой способ включает оценку качества и потенциальной in vivo эффективности тестируемой партии PHY906 путем анализа композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции; и
(b) анализа экспрессии генов;
сравнение результатов биологического анализа с результатами, полученными для известной партии PHY906, которая имеет известный уровень in vivo активности; и, если тестируемая партия PHY906 показывает активность в биологических анализах, подобную активности известной партии PHY906, введение тестируемой партии PHY906 субъекту.
В некоторых вариантах осуществления способы лечения по изобретению можно адаптировать для любой известной композиции или лекарственного средства на основе лекарственных растений или трав. В других вариантах осуществления способы лечения по изобретению можно адаптировать для лечения других заболеваний или расстройств.
Наборы
Изобретение также относится к наборам для определения качества и потенциальной in vivo активности партии композиции на основе лекарственных трав. В некоторых вариантах осуществления набор включает материалы для одного или нескольких биологических анализов, выбранных из анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, и анализа экспрессии генов. В других вариантах осуществления набор также включает инструкции по определению качества и потенциальной in vivo активности партии композиции на основе лекарственных трав с использованием анализов по изобретению.
Специалистам в данной области будут понятны, или они смогут установить с использованием не более чем рутинного экспериментирования, различные эквиваленты конкретных процедур, вариантов осуществления, формулы изобретения и примеров, описанных в настоящей заявке. Такие эквиваленты рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения и охватываемые прилагаемой формулой изобретения. Например, должно быть понятно, что модификации реакционных условий, включая, но не ограничиваясь этим, время, размер/объем реакции и экспериментальные реагенты, с признанными в данной области альтернативами и с использованием не более чем рутинного экспериментирования, входят в объем настоящего изобретения.
Должно быть понятно, что, если в настоящей заявке приводятся значения и диапазоны, описание в формате диапазона представлено исключительно для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, все значения и диапазоны, охватываемые этими значениями и диапазонами, предусматриваются как охватываемые объемом настоящего изобретения. Кроме того, все значения, которые попадают в эти диапазоны, а также верхние или нижние пределы диапазона значений, также рассматриваются настоящим изобретением. Описание диапазона следует рассматривать как специально раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне и, при необходимости, парциальные значения в пределах диапазонов. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует считать как включающее специально раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют аспекты настоящего изобретения. Однако они никоим образом не являются ограничением принципов или раскрытия настоящего изобретения, как оно изложено в настоящей заявке.
ПРИМЕРЫ
Далее изобретение будет описано со ссылкой на следующие Примеры. Эти Примеры представлены только в целях иллюстрации, и изобретение никоим образом не следует рассматривать как ограничивающееся этими Примерами, но его следует рассматривать как охватывающее любые возможные варианты, которые будут очевидны как результат раскрытия, представленного в настоящей заявке.
Материалы и методы
Получение экстрактов лекарственных растений
PHY906 состоит из полученного традиционным способом вытяжки горячей водой экстракта из четырех лекарственных растений: Scutelleria baicalensis Georgi (S), Paeonia lactiflora Pall. (P), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (G) и Ziziphus jujuba Mill (Z) в соотношении 3: 2: 2: 2, соответственно, и который получают с использованием стандартных процедур. Этот экстракт включает сложную смесь множества фитохимических веществ с различными биологическими и фармакологическими свойствами. В настоящее время невозможно идентифицировать подмножество соответствующих биологически активных фитохимических веществ из общей смеси. По этой причине для характеристики продукта PHY906 использовали большое количество химических и биологических показателей.
Исходные ингредиенты PHY906 предварительно отбирают для соответствия жестким требованиям, установленным PHYTOCEUTICATM, для принятия компанией-изготовителем Sun Ten Pharmaceuticals на Тайване.
Высушенный PHY906 (100 мг) растворяли в одном мл 80°C воды. Смесь перемешивали вихревым способом в течение одной минуты, помещали на 80°C водяную баню еще на 30 минут, с одной минутой перемешивания вихревым способом через каждые десять минут. Образец затем охлаждали на водяной бане с температурой окружающей среды в течение пяти минут, центрифугировали в течение десяти минут при 10000 об/мин (центрифуга Eppendorf Model 5810R, USA) и полученный супернатант стерилизовали фильтрованием (0,2 мкм). Для последующего ЖХ/МС анализа 20 мкл аликвоту этого светло-коричневого экстракта разбавляли 980 мкл воды. Конечная номинальная концентрация после экстракции и разведения составила 2 мг сухого веса PHY906 порошкового экстракта на мл воды. Для биологических экспериментов исходный раствор 100 мг/мл номинальной концентрации разбавляли в подходящем буфере или среде до требуемой конечной концентрации.
PHY906 экстракт включал больше чем 75% низкомолекулярных фитохимических соединений меньше чем 1000 а.е.м., 10% макромолекулярных компонентов, включая белок, нуклеиновую кислоту, сложные углеводы, и 5% воды. Кроме того, 10% масс. эксципиента, такого как нерастворимая целлюлоза, добавляли на стадии распылительной сушки при изготовлении. Концентрации тяжелых металлов (Pb, Hg, Cd, As) все были меньше чем 0,5 ч/млн, при этом концентрация ртути и кадмия меньше чем 0,03 ч/млн, как было определено атомно-абсорбционной спектрометрией. Концентрации пестицидов (BHC, DDT, PCNB) были меньше чем 0,2 ч/млн по данным ЖХ-МС или ГХ-МС. Суммарное количество бактерий составляло 260 КОЕ/г, при этом виды E. coli и Salmonella не были обнаружены. Более 90% масс. PHY906, за исключением содержания воды (5%) и нерастворимого крахмального эксципиента (10%), можно повторно экстрагировать. Конечный PHY906 жидкий экстракт (100 мг/мл) стабилен в течение 18 часов при комнатной температуре, и хранимый должным образом объемный сухой экстракт (в вакуумной упаковке, защищенный от света и 4°C), как оказалось, является стабильным в течение более трех лет. Более подробную информацию о PHY906 можно найти в: Lam W, Bussom S, Guan F, Jiang Z, Zhang W, Gullen EA, Liu SH, Cheng YC, 2010, ʺThe Four-Herb Chinese Medicine PHY906 Reduces Chemotherapy-Induced Gastrointestinal Toxicityʺ, Sci. Transl. Med. 2(45):45ra59.
Мышиные модели in vivo
Клетки толстой кишки мыши 38 (1-2×106 клеток в 0,1 мл фосфатно-солевого буферного раствора, PBS) трансплантировали подкожно самкам BDF1 мышей возраста четыре-шесть недель (Charles River Laboratories). Через 10-14 дней отбирали мышей с размером опухоли 150-300 мм3. Если не указано иное, каждая из групп обработки состояла из пяти мышей. Размер опухоли, массу тела и смертность мышей контролировали ежедневно. Объем опухоли определяли с использованием формулы длина × ширина(2) × π/6. Если не указано иное, каждая из групп обработки состояла из пяти мышей. PHY906 (партии номер 6, 10, 11 и F, который представляет собой коммерческий Huang Qin Tang) вводили перорально (п/о) в течение четырех дней (два раза в день (b.i.d), 500 мг/кг) примерно в 10:00 часов утра и 3:00 часа дня), тогда как CPT-11 (360 мг/кг) вводили интраперитонеально (и/п.) в день 1. В день 1 PHY906 вводили за 30 минут до введения CPT-11. В контрольных группах мышам вводили носитель либо PBS для и/п введения, либо воду для перорального введения. Данные анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (GraphPad Prism 6). разница считалась статистически значимой, когда ++ (P<0,001),+(P < 0,05) и - (P>0,05).
ЖХ-МС анализ для определения химических профилей метаболитов PHY906
ЖХ-МС анализ осуществляли на системе Agilent 1200 series HPLC, соединенной с AB SCIEX 4000 QTRAP масс-спектрометром. Разделение осуществляли на колонке Alltima™ HP HPLC (5 мм, 4,6×250 мм). Подвижная фаза представляла собой ацетонитрил (A) и воду с 0,1% муравьиной кислоты (B), с градиентным элюированием: 0 мин, 5% A; 10 мин, 20% A; 20 мин, 25% A; 40 мин, 30% A; 45 мин, 35% A; 55 мин, 45% A; 60 мин, 70% A; 62 мин, 90% A; 67 мин, 90% A; 68 мин, 5% A; и 75 мин, 5% A. Скорость потока составляла 1,0 мл/мин, и температуру колонки устанавливали при 30°C. Масс-спектрометрию с ESI в отрицательном режиме при скорости сканирования 4000 а.м.е./сек осуществляли с использованием следующих параметров ионизации: CAD: высокая; Темп.: 550,00°C; GS1: 55,00; GS2: 50,00; ihe: вкл.; IS: -4250,00; DP: -40,00; CES 0,00; CE:-5,00. Диапазон массы для детекции составлял 120-800 а.м.е. С использованием специальной программы, интегрированной в MZmine программу, сравнивали пики и осуществляли кластерный анализ.
Алгоритм для определения коэффициентов корреляции
Для определения коэффициентов корреляции использовали программу Graphpad Prism 6. Каждый ряд ʺесли заполненʺ таблицы представляет разные гены или разные сигнальные пути. Каждая колонка представляет разные партии. Входные данные включали значения экспрессии генов или IC50 или AC50 значения. Функцию программы ʺанализы колонокʺ выбирали для корреляционного анализа. Корреляцию между каждыми парами из колонки осуществляли, исходя из пула образцов с гауссовым распределением. Также рассчитывали коэффициенты корреляции.
Кластерный анализ осуществляли с использованием программы Minitab 17. Каждый ряд ʺесли заполненʺ таблицы представляет разные гены или разные сигнальные пути. Каждая колонка представляет разные партии. Входные данные включали значения экспрессии генов или IC50 или AC50 значения. Выбирали кластерную вариабельную функцию. Для кластерного анализа выбирали метод полной связи и меру расстояния-корреляцию.
STAR платформа
Люциферазные репортерные клеточные линии для разных сигнальных путей представлены в следующей таблице.
| Таблица 1 | |||
| Клеточная линия | ДНК последовательность ответного элемента | Клеточная линия/трансфекция рецептора | Промотор/путь |
| CRE | SEQ ID NO: 1 agcctgacgtcagagag x4 |
HEK293 | cAMP/PKA |
| NFkB | SEQ ID NO: 2 gggaatttcc x4 |
HEK293/HepG2 | NFkB |
| TLR2 | SEQ ID NO: 3 gggaatttcc x4 |
TLR2/HEK293 | TLR2 |
| TLR4 | SEQ ID NO: 4 gggaatttcc x4 |
TLR4/HEK293 | TLR4 |
| GAS (INF γ) |
SEQ ID NO: 5 atattactctaaatc x6 |
Интерферон γ/ HEK293 | STAT1/STAT2 |
| IFN-α/β | SEQ ID NO: 6 tagtttcactttccc x5 |
IFN-α/β/HEK293 | STAT1/STAT2 |
| STAT3 | SEQ ID NO: 7 tgcattcccgtaa x6 |
HEK293/HEPG2 | STAT3 |
| Lefx12 | SEQ ID NO: 8 agatcaaagggggta x12 |
HEK293 | Wnt3a |
| TGFbx4 | SEQ ID NO: 9 gagtatgtctagact x4 |
HEK293/HepG2 | TGFb |
| AR | PSA промотор | 22RV1 | Андроген |
| ER-a | SEQ ID NO: 10 ggtcacagtgaccta x4 |
ER-a/HEK293 | Эстроген |
| ER-b | SEQ ID NO: 11 ggtcacagtgaccta x4 |
ER-b/HEK293 | Эстроген |
| VDR | SEQ ID NO: 12 gatccacaaggttcacgaggttca x3 |
Hela | Рецептор витамина D |
| PRE | SEQ ID NO: 13 gggacatggtgttct x4 |
T47D | прогестерон |
| MR | SEQ ID NO: 14 ggtacattttgttct x4 (такая же, как GRE) |
MR/HEK293 | минералокортикоид |
| NRF2 | SEQ ID NO: 15 tcacagtgactcagcaaaatt x4 |
HEK293/HepG2 | Антиокислительный ответ |
| Таблица 1 (продолжение) | |||
| Клеточная линия | Лиганд | Транскрипционный фактор(факторы) | Соответствующая функция |
| CRE | форсколин | CREBP | Клеточный рост |
| NFkB | TNF-a | NF-kB | воспаление |
| TLR2 | PGN | NF-kB | врожденный иммунитет |
| TLR4 | LPS | NF-kB | врожденный иммунитет |
| GAS (INF γ) |
INF γ | STAT1/ STAT2 | воспаление |
| IFN-α/β | IFNα | STAT1/ STAT2 | воспаление |
| STAT3 | IL6 | Stat3 | воспаление |
| Lefx12 | Wnt3a | b-катенин | рост стволовых клеток |
| TGFbx4 | TGFb | Smad2/3 | Заживление ран/Дифференциация |
| AR | DHT | AR | Рост клеток предстательной железы |
| ER-a | E2 Эстрадиол |
ER-a | Эндокринный/гормон |
| ER-b | E2 Эстрадиол |
ER-b | Эндокринный/гормон |
| VDR | Витамин D3 | рецептор витамина D | Эндокринный/гормон |
| PRE | прогестерон | рецептор прогестерона | Эндокринный/гормон |
| MR | Альдостерон | минералокортикоидный рецептор | Эндокринный/гормон |
| NRF2 | андрографолид | NRF2 | Эндокринный/гормон |
Клетки высевали в 96-луночный микропланшет с половинным объемом лунок при плотности 20000 клеток/лунка в 40 мл среды и выдерживали в течение ночи в инкубаторе при 37°C 5% CO2. Разные дозы водного экстракта PHY906 от 750 мкг/мл до 83 мкг/мл добавляли к клеткам и помещали в 37°C 5% CO2 инкубатор. После удаления среды через 6 часов можно использовать 10 мл лизисного буфера (Tris-HC 25 мМ при pH 7,8, DTT 2 мМ, CDTA 2 мМ, глицерин 10%, Triton X-100 1%) для лизиса клеток, и добавляли 40 мл буфера для реакции люциферазы (Tris-HCI 20 мМ при pH 7,8, NaHCO3 1 мМ, MgSO4 2,5 мМ, DTT 10 мМ, кофермент-A литий 60 мМ, калий люциферин 225 мМ, АТФ 250μ) для считывания люминесценции с использованием микропланшетного ридера для измерения люминесценции. IC50 (концентрация, требуемая для ингибирования 50% от контроля) или EC50 (концентрация, требуемая для достижения 50% от максимальной активации) определяли на основании кривой доза-ответ.
Анализ активности Cox-2
Ферментные реакции Cox-2 (Cayman Chemical) осуществляли в соответствии с инструкциями изготовителя. Для остановки реакции использовали четырехкратный объем ацетонитрила-метанола (2:1). После центрифугирования осуществляли количественную оценку простаноидного продукта в супернатанте при помощи ЖХ-МС. Хроматографическое разделение осуществляли с использованием колонки ZORBAX SB-C18 (100 × 2,1 мм, Agilent) при 30°C. Подвижная фаза состояла из линейных градиентов 0,05% (об/об) муравьиной кислоты (A) и метанола (B): 0,01-5,0 мин, 60-60% B (об/об); 5,0-5,5 минут, 60-80% B; 5,5-35 минут, 80-80% B; 35-35,5 минут, 80-60% B; 35,5-40 минут, 60-60% B. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,3 мл/мин. Все масс-спектрометрические эксперименты осуществляли на масс-спектрометре API 4000 Q-Traq. Инжекторы ортогонального Turbo-V источника нагревали до 550°C для обеспечения соединения с ВЭЖХ без разделения потока подвижной фазы. Азот (N2) сверхвысокой чистоты использовали в качестве газового источника ионов (GS1, GS2), защищающего потока газа (CUR) и газа для соударений (CAD), и скорости потоков были 55, 50, 35 и высокая, соответственно. Мониторинг множественных реакций (MRM) в режиме отрицательной ионизации осуществляли для детекции ионных переходов при m/z: 303→259, 351,1→315 для арахидоновой кислоты и PGE2, соответственно. Энергии столкновений были установлены при -20, -26В для арахидоновой кислоты и PGE2, соответственно. Сбор данных контролировали с использованием программы Analyst 1.4.2.
Анализ активности iNOS
Активность iNOS измеряли колориметрическим методом определения нитрит-иона. Одну единицу iNOS фермента (Cayman Chemical) использовали в 50 мкл реакции, состоящей из 2 мМ MgAc2, 0,2 мМ NADPH, 64 мкМ тетрагидро-L-биоптерина, 1 мг/мл BSA, 40 мкМ DTT, 3 мкМ HbO2 смеси в 0,1M 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) при pH 7,3. Затем добавляли 100мл L-аргинина с или без экстракта лекарственных растений и смесь инкубировали в течение двух часов при 37°C. Затем добавляли 100 мл реагента Грисса (1% сульфаниламида, 0,1% N-(1-нафтил)-этилендиамин дигидро и 10% HCl) и измеряли оптическую плотность при 540 нм.
Методы кОТ-ПЦР
Осуществляли контактирование 2×105 HepG2 клеток с PHY906 (партии номер 6, 10, 11 и F, который представляет собой коммерческий Huang Qin Tang) и высевали в 12-луночные планшеты для тканевых культур в RPMI1640 среду с 5% фетальной бычьей сыворотки и инкубировали в течение ночи при 37°C 5% CO2. HepG2 клетки затем обрабатывали водным экстрактом PHY906-6, PHY906-10, PHY906-11, F при конечной концентрации 850 мкг/мл или водой в качестве контроля с инкубацией при 37°C 5% CO2 в течение 24 часов. Из HepG2 клеток экстрагировали мРНК с использованием набора High Pure RNA Isolation Kit от Roche. кДНК синтезировали с использованием случайных праймеров и MMLV обратной транскриптазы (New England Biolabs, Ipswich, MA). кПЦР анализы осуществляли с использованием iTaq™ SYBR® Green Supermix и системы детекции ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Актин использовали в качестве внутреннего контроля. Наборы праймеров представлены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Ген | Прямой праймер | Обратный праймер |
| ICAM |
SEQ ID NO: 16
TATGGCAACGACTCCTTC |
SEQ ID NO: 17
CATTCAGCGTCACCTTGG |
| IRF5 |
SEQ ID NO: 18
ATGCTGCCTCTGACCGACCTGGAGA |
SEQ ID NO: 19
CTTGCTCCAGGCTTATGGGGCCGAA |
| AKR1C1 |
SEQ ID NO: 20
CCAGAGCACTATAGGCAACCA |
SEQ ID NO: 21
AACAAGCCAGGGCTCAAGTA |
| HO1 |
SEQ ID NO: 22
TCCTGCTCAACATCCAGCTCTTTG |
SEQ ID NO: 23
GGGCAGAATCTTGCACTTTGTTG |
| GCLC |
SEQ ID NO: 24
CTTTCTCCCCAGACAGGACC |
SEQ ID NO: 25
CAAGGACGTTCTCAAGTGGG |
| GCLM |
SEQ ID NO: 26
GTATCAGTGGGCACAGGTAAAAC |
SEQ ID NO: 27
CTTGCTTCAGAAAGCAGTTCTT |
| Axin2 |
SEQ ID NO: 28
CTGGCTCCAGAAGATCACAAAG |
SEQ ID NO: 29
ATCTCCTCAAACACCGCTCCA |
| GDF15 |
SEQ ID NO: 30
CTCCGAAGACTCCAGATTCCGAGAG |
SEQ ID NO: 31
CAGCCGCACTTCTGGCGTGAGTAT |
| IGFBP3 |
SEQ ID NO: 32
CCAGCGCCGCCAGCTCCAGGAAATG |
SEQ ID NO: 33
CCTTTCTTGATGATGATTATCTTTG |
| OKL38 |
SEQ ID NO: 34
CTCCCGGTCATCATTGTGGGTAAC |
SEQ ID NO: 35
GGTAGTCCAGGTCCTGGTCCAG |
| PIM1 |
SEQ ID NO: 36
CACCAAGCTGGCGCCCGGCAAGGAG |
SEQ ID NO: 37
ACGTGTTTGATGGCCACCGGCAAG |
| SERTAD |
SEQ ID NO: 38
GGAGGAGAAGGAACCTCTGGCAGTC |
SEQ ID NO: 39
ACTCTGCTGCAGGCTGTGGTGGAGC |
| SOS1 |
SEQ ID NO: 40
TACTTTGAACTTTTGAAGCAGTTAG |
SEQ ID NO: 41
AACCGACATGCAGATTCACTCAGTC |
| CPT1A |
SEQ ID NO: 42
CCACCAAGATCTGGATGGGTATG |
SEQ ID NO: 43
CACCGACTGTAGATACCTGTTCAC |
| SLC7A11 |
SEQ ID NO: 44
GTGGGGTCCTGTCACTATTTGGAGC |
SEQ ID NO: 45
AGCAGTAGCTGCAGGGCGTATTATG |
| BHMT2 |
SEQ ID NO: 46
CTTTGGACTGGAGTCCAGAGTTG |
SEQ ID NO: 47
ATACTCCCTTCGAGCCCTTGCTC |
| CD24 |
SEQ ID NO: 48
ACTGCTCCTACCCACGCAGATTT |
SEQ ID NO: 49
CACGAAGAGACTGGCTGTTGAC |
| EMP2 |
SEQ ID NO: 50
GTTCATTGCCACCGTCGACAATGCCTG |
SEQ ID NO: 51
GCAGCGTGGAGTACTCTTGAAAGCT |
| KRT23 |
SEQ ID NO: 52
CTGCAGACACAGTACAGCACGAAATC |
SEQ ID NO: 53
CTTTGATTCTTCCCGTGTCCCTTCAC |
| Актин |
SEQ ID NO: 54
GCCACGGCTGCTTCCAGCTCC |
SEQ ID NO: 55
TTGTGCTGGGTGCCAGGGCAGTGA |
Пример 1: Соотнесение химического анализа и in vivo активности
Стандартные протоколы химической детекции тестировали на их точность в предсказании in vivo эффективности разных партий композиций на основе лекарственных трав. In vivo активность разных партий PHY 906 и F (коммерческая смесь Huang Qin Tang экстракта) испытывали путем совместного введения композиции на основе лекарственных трав и CPT11 мышам BDF1 с опухолями толстой кишки 38. Определяли противоопухолевую активность HQT/CPT11 лечения, а также эффект лечения на массу тела субъектов. Было обнаружено, что три из HQT композиций, PHY906-6, PHY906-10 и PHY906-11, полученные с использованием PHY906 состава, имели одинаковую противоопухолевую и препятствующую потере веса активность, но, как было обнаружено, четвертая HQT композиция, коммерческая партия HQT, F, имела более низкую противоопухолевую активность и не препятствовала потере массы тела у субъектов (Фиг. 1A).
Четыре партии HQT затем анализировали при помощи ЖХ-МС в соответствии с руководством ВОЗ для определения химического профиля каждой композиции. 73 характеристических пика было определено в ЖХ-МС спектрах, и затем их использовали для анализа сходства (Фиг. 1B). С использованием специальной программы, интегрированной в MZmine программу, пики сравнивали и осуществляли кластерный анализ (Фиг. 1C-1D). Результаты ЖХ-МС анализа показали, что все четыре партии HQT имели одинаковые химические профили, но что партии PHY906-10 и PHY906-11 были более схожи друг с другом, чем с партиями PHY906-6 или F, и что партии PHY906-6 и F были более схожи друг с другом, чем с партиями PHY906-10 или PHY906-11. Этот результат прямо противоположен in vivo результатам, где можно было бы ожидать, что PHY906-6, PHY906-10 и PHY906-11 все будут иметь схожие химические профили, и что F будет исключением.
Пример 2: Анализы ответов, связанных с активностью сигнальной трансдукции
Чтобы найти более точный способ определения качества и потенциальной in vivo активности партии композиции на основе лекарственных трав, четыре партии HQT (F, PHY906-6, PHY906-10 и PHY906-11) скринировали в платформе анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции (STAR) (Фиг. 2A). STAR платформа включала 17 механизм-связанных люциферазных репортерных клеточных линий и 2 ферментных анализа для определения действия HQT in vivo, включая TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, INFa-state1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-альфа, ER-бета, DHT-AR и альдостерон-MR. Было обнаружено, что три партии PHY906 показали схожие IC50 значения в люциферазных репортерных клеточных линиях и ферментных анализах, за исключением F партии (Фиг. 2B-2C). Результаты корреляционного анализа, основанные на результатах анализов STAR платформы, показали, что PHY906 партии имели схожий друг с другом коэффициент корреляции 0,95 или выше, тогда как F партия показала более низкие значения коэффициента корреляции. Эти результаты показывают, что результаты биологических анализов STAR платформы лучше предсказывают потенциальную in vivo активность партии HQT композиции на основе лекарственных трав, чем ЖХ-МС химический анализ.
Пример 3: Анализ экспрессии генов
Четыре партии HQT также анализировали с использованием анализа экспрессии генов. HQT партии тестировали относительно панели генов, связанных с полученными ранее in vivo данными набора ДНК, а также генов, связанных с предполагаемым механизмом действия PHY906, включая ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23. Клетки рака печени HepG2 обрабатывали партией одной из HQT композиций в течение 24 часов. Генерированную мРНК затем экстрагировали и анализировали при помощи кОТ-ПЦР (Фиг. 3A). Было обнаружено, что PHY906-6, PHY906-10 и PHY906-11 имели очень схожую активность в анализах экспрессии генов, тогда как F снова был исключением (Фиг. 3B-3C). Эти результаты показывают, что анализ экспрессии генов лучше предсказывает потенциальную in vivo активность партии HQT композиции на основе лекарственных трав, чем ЖХ-МС химический анализ.
Раскрытие каждого патента, патентной заявки и публикации, цитируемых в настоящей заявке, включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте. Хотя изобретение было раскрыто со ссылкой на конкретные варианты осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и варианты настоящего изобретения могут быть разработаны другими специалистами в данной области техники без отступления от истинной сущности и объема изобретения. Прилагаемую формулу изобретения следует рассматривать как включающую все такие варианты осуществления и эквивалентные варианты.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Yale University
Cheng, Yung-Chi
<120> Основанный на механизме контроль качества лекарственного средства
растительного происхождения
<130> 047162-7094WO1 (00581)
<150> US 62/353,313
<151> 2016-06-22
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 68
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CRE agcctgacgt cagagag
<400> 1
agcctgacgt cagagagagc ctgacgtcag agagagcctg acgtcagaga gagcctgacg 60
tcagagag 68
<210> 2
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента NFkB
<400> 2
gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc 40
<210> 3
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента TLR2
<400> 3
gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc 40
<210> 4
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента TLR4
<400> 4
gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc 40
<210> 5
<211> 90
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента GAS / INF гамма
<400> 5
atattactct aaatcatatt actctaaatc atattactct aaatcatatt actctaaatc 60
atattactct aaatcatatt actctaaatc 90
<210> 6
<211> 75
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента IFN-a/B
<400> 6
tagtttcact ttccctagtt tcactttccc tagtttcact ttccctagtt tcactttccc 60
tagtttcact ttccc 75
<210> 7
<211> 78
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента STAT3
<400> 7
tgcattcccg taatgcattc ccgtaatgca ttcccgtaat gcattcccgt aatgcattcc 60
cgtaatgcat tcccgtaa 78
<210> 8
<211> 180
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента Lefx12
<400> 8
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta 60
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta 120
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta 180
<210> 9
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента TGFbx4
<400> 9
gagtatgtct agactgagta tgtctagact gagtatgtct agactgagta tgtctagact 60
<210> 10
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента ER-a
<400> 10
ggtcacagtg acctaggtca cagtgaccta ggtcacagtg acctaggtca cagtgaccta 60
<210> 11
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента ER-b
<400> 11
ggtcacagtg acctaggtca cagtgaccta ggtcacagtg acctaggtca cagtgaccta 60
<210> 12
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента VDR
<400> 12
gatccacaag gttcacgagg ttcagatcca caaggttcac gaggttcaga tccacaaggt 60
tcacgaggtt ca 72
<210> 13
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента PRE
<400> 13
gggacatggt gttctgggac atggtgttct gggacatggt gttctgggac atggtgttct 60
<210> 14
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента MR
<400> 14
ggtacatttt gttctggtac attttgttct ggtacatttt gttctggtac attttgttct 60
<210> 15
<211> 84
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК ответного элемента NRF2
<400> 15
tcacagtgac tcagcaaaat ttcacagtga ctcagcaaaa tttcacagtg actcagcaaa 60
atttcacagt gactcagcaa aatt 84
<210> 16
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ICAM прямой праймер
<400> 16
tatggcaacg actccttc 18
<210> 17
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ICAM обратный праймер
<400> 17
cattcagcgt caccttgg 18
<210> 18
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IRF5 прямой праймер
<400> 18
atgctgcctc tgaccgacct ggaga 25
<210> 19
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IRF5 обратный праймер
<400> 19
cttgctccag gcttatgggg ccgaa 25
<210> 20
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AKR1C1 прямой праймер
<400> 20
ccagagcact ataggcaacc a 21
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AKR1C1 обратный праймер
<400> 21
aacaagccag ggctcaagta 20
<210> 22
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HO1 прямой праймер
<400> 22
tcctgctcaa catccagctc tttg 24
<210> 23
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HO1 обратный праймер
<400> 23
gggcagaatc ttgcactttg ttg 23
<210> 24
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GCLC прямой праймер
<400> 24
ctttctcccc agacaggacc 20
<210> 25
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GCLC обратный праймер
<400> 25
caaggacgtt ctcaagtggg 20
<210> 26
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GCLM прямой праймер
<400> 26
gtatcagtgg gcacaggtaa aac 23
<210> 27
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GCLM обратный праймер
<400> 27
cttgcttcag aaagcagttc tt 22
<210> 28
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Axin2 прямой праймер
<400> 28
ctggctccag aagatcacaa ag 22
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Axin2 обратный праймер
<400> 29
atctcctcaa acaccgctcc a 21
<210> 30
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GDF15 прямой праймер
<400> 30
ctccgaagac tccagattcc gagag 25
<210> 31
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GDF15 обратный праймер
<400> 31
cagccgcact tctggcgtga gtat 24
<210> 32
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IGFBP3 прямой праймер
<400> 32
ccagcgccgc cagctccagg aaatg 25
<210> 33
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IGFBP3 обратный праймер
<400> 33
cctttcttga tgatgattat ctttg 25
<210> 34
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> OKL38 прямой праймер
<400> 34
ctcccggtca tcattgtggg taac 24
<210> 35
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> OKL38 обратный праймер
<400> 35
ggtagtccag gtcctggtcc ag 22
<210> 36
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PIM1 прямой праймер
<400> 36
caccaagctg gcgcccggca aggag 25
<210> 37
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PIM1 обратный праймер
<400> 37
acgtgtttga tggccaccgg caag 24
<210> 38
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SERTAD прямой праймер
<400> 38
ggaggagaag gaacctctgg cagtc 25
<210> 39
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SERTAD обратный праймер
<400> 39
actctgctgc aggctgtggt ggagc 25
<210> 40
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SOS1 прямой праймер
<400> 40
tactttgaac ttttgaagca gttag 25
<210> 41
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SOS1 обратный праймер
<400> 41
aaccgacatg cagattcact cagtc 25
<210> 42
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPT1A прямой праймер
<400> 42
ccaccaagat ctggatgggt atg 23
<210> 43
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPT1A обратный праймер
<400> 43
caccgactgt agatacctgt tcac 24
<210> 44
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SLC7A11 прямой праймер
<400> 44
gtggggtcct gtcactattt ggagc 25
<210> 45
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SLC7A11 обратный праймер
<400> 45
agcagtagct gcagggcgta ttatg 25
<210> 46
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> BHMT2 прямой праймер
<400> 46
ctttggactg gagtccagag ttg 23
<210> 47
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> BHMT2 обратный праймер
<400> 47
atactccctt cgagcccttg ctc 23
<210> 48
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD24 прямой праймер
<400> 48
actgctccta cccacgcaga ttt 23
<210> 49
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD24 обратный праймер
<400> 49
cacgaagaga ctggctgttg ac 22
<210> 50
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EMP2 прямой праймер
<400> 50
gttcattgcc accgtcgaca atgcctg 27
<210> 51
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EMP2 обратный праймер
<400> 51
gcagcgtgga gtactcttga aagct 25
<210> 52
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KRT23 прямой праймер
<400> 52
ctgcagacac agtacagcac gaaatc 26
<210> 53
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KRT23 обратный праймер
<400> 53
ctttgattct tcccgtgtcc cttcac 26
<210> 54
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Актин прямой праймер
<400> 54
gccacggctg cttccagctc c 21
<210> 55
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Актин обратный праймер
<400> 55
ttgtgctggg tgccagggca gtga 24
<---
1. Способ оценки качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав, включающий анализ тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, который включает измерение ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, против одного или более сигнальных путей, выбранных из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, IFNa-stat1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-alpha, ER-beta, DHT-AR и альдостерона-MR; и
(b) анализа экспрессии генов, где анализ экспрессии генов включает количественное определение одного или нескольких генов, кодирующих белки, выбранных из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23;
и затем сравнение результатов биологического анализа тестируемой партии с результатами, полученными для известной партии композиции на основе лекарственных трав, которая имеет известный уровень in vivo активности;
где, если результаты, полученные для тестируемой партии, имеют коэффициент корреляции от 0,95 до 1,0 с результатами, полученными для известной партии, то тестируемую партию определяют как имеющую качество, в достаточной степени соответствующее качеству известной партии, и потенциальную in vivo активность.
2. Способ по п. 1, где композиция на основе лекарственных трав включает одну или несколько композиций, выбранных из группы, состоящей из экстрактов лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z), любых их фракций и любых активных химических веществ, присутствующих в экстрактах этих лекарственных растений или их фракциях.
3. Способ по п. 2, где композиция на основе лекарственных трав представляет собой PHY906, где PHY906 включает экстракты лекарственных растений Scutellaria baicalensis (S), Glycyrrhiza uralensis (G), Paeonia lactiflora (P) и Ziziphus jujuba (Z) в соотношении 3:2:2:2 (S:G:P:Z).
4. Способ по п. 1, где анализ ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, включает один или несколько анализов, выбранных из группы, состоящей из люциферазных репортерных анализов и ферментных анализов.
5. Способ по п. 1, где анализ экспрессии генов включает: обработку HepG2 клеток композицией на основе лекарственных трав в течение 24 часов, экстрагирование продуцированной мРНК и количественный анализ мРНК методом кОТ-ПЦР.
6. Способ по п. 1, где химические методы анализа композиций включают ЖХ-МС (жидкостная хроматография - масс-спектрометрия).
7. Способ по п. 1, где качество тестируемой партии композиции на основе лекарственных трав также анализируют при помощи ЖХ-МС.
8. Способ оценки качества и потенциальной in vivo активности тестируемой партии PHY906 путем анализа композиции на основе лекарственных трав одним или несколькими методами биологического анализа, выбранными из:
(a) анализа ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, который включает измерение ответа, связанного с активностью сигнальной трансдукции, против одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из TNFa-NFkB, TLR2-NFkB, TLR4-NFkB, IL6-stat3, IFNg-stat1/1, IFNa-stat1/2, DEX-GR, COX-2, iNOS, NRF2, TGFb-Smad2/3, TPA-AP1, CREB, wnt3a-Lef/b-cat, VD3-VDR, ER-alpha, ER-beta, DHT-AR и альдостерона-MR; и
(b) анализа экспрессии генов, где анализ экспрессии генов включает количественное определение одного или нескольких генов, кодирующих белки, выбранных из группы, состоящей из ICAM, IRF5, AKR1C1, HO1, GCLC, GCLM, Axin2, GDF15, IGFBP3, OKL38, PIM1, SERTAD, SOS1, BHMT2, CPT1A, SLC7A11, CD24, EMP2 и KRT23;
сравнение результатов биологического анализа с результатами, полученными для известной партии PHY906, которая имеет известный уровень in vivo активности;
где, если результаты, полученные для тестируемой партии, имеют коэффициент корреляции от 0,95 до 1,0 с результатами, полученными для известной партии, то тестируемую партию определяют как имеющую качество, в достаточной степени соответствующее качеству известной партии, и потенциальную in vivo активность.
