Матричные рибонуклеиновые кислоты для усиления иммунных ответов и способы их применения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым липидным наночастицам, несущим терапевтические агенты, и может быть применимо в медицине. Изобретение позволяет получить липосому, несущую терапевтически эффективное количество мРНК, кодирующую полипептид, способный усиливать иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Такие как иммуномодулирующие полипептиды активируют сигнальный путь интерферона типа I или сигнальный путь NFkB и выбираются из группы: STING, IRF3, IRF7, MyD88, TRAM, IRF1, IRF8, IRF9, TBK1, IKKi, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, c-FLIP, IKKi, RIPK1, TAK-TAB1, DIABLO, Btk, самоактивирующейся каспазы–1 и Flt3. Изобретение может быть использовано в медицинской практике при терапии различных заболеваний, в частности для стимуляции противораковых иммунных ответов или противопатогенных иммунных ответов. 6 н. и 27 з.п. ф-лы, 70 ил., 24 табл., 29 пр.

 

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США, серийный №62/412,933, поданной 26 октября 2016 г.; предварительной заявке на патент США с серийным №62/467,034, поданной 3 марта 2017 г.; предварительной заявке на патент США с серийным №62/490,522, поданной 26 апреля 2017 года; и предварительной заявке на патент США с серийным №62/558,206, поданной 13 сентября 2017 г.Полное содержание вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством данной ссылки.

Уровень техники

Способность модулировать иммунный ответ полезна в различных клинических ситуациях, включая лечение рака и патогенных инфекций, а также в усилении ответов на вакцину для обеспечения защитного иммунитета. Существует ряд терапевтических средств для модуляции функции биологических путей и/или молекул, которые вовлекаются в такие заболеваниях, как рак и патогенные инфекции. Данные средства включают, например, низкомолекулярные ингибиторы, цитокины и терапевтические антитела. Некоторые из этих средств функционируют посредством модуляции иммунных реакций у субъекта, такие как цитокины, которые модулируют активность клеток в иммунной системе, или антитела-ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как анти-CTLA-4 или анти-PD-L1, которые модулируют регуляцию иммунных ответов.

Кроме того, вакцины уже давно используются для стимуляции иммунного ответа против антигенов патогенов, чтобы тем самым обеспечить защитный иммунитет против последующего воздействия патогенов. Совсем недавно были разработаны вакцины с использованием антигенов, обнаруженных в опухолевых клетках, чтобы таким образом повысить противоопухолевую иммунореактивность. В дополнение к антигену(ам), используемому в вакцине, другие агенты могут быть включены в вакцинный препарат или использованы в комбинации с вакцинным препаратом для дальнейшего усиления иммунного ответа на вакцину. Такие агенты, которые повышают реактивность к вакцинам, упоминаются в данной области техники как адъюванты. Примеры обычно используемых вакцинных адъювантов включают гели и соли алюминия, монофосфориллипид А, MF59, эмульсию типа масло в воде, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, детергенты и сапонины растений. Данные адъюванты обычно используются с вакцинами на основе белков или пептидов. В настоящее время разрабатываются альтернативные виды вакцин, такие как вакцины на основе РНК.

В данной области техники существует потребность в дополнительных эффективных агентах, которые усиливают иммунные ответы на представляющий интерес антиген.

Сущность изобретения

Данное раскрытие обеспечивает матричные РНК (мРНК), кодирующие полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), называемый в данном документе как иммуностимуляторные конструкты. В некоторых вариантах осуществления матричные РНК (мРНК) являются химически модифицированными, называемыми в данном документе как модифицированная мРНК (ммРНК), причем ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. Альтернативно, мРНК может содержать в целом немодифицированные нуклеотидные основания. В одном варианте осуществления иммуностимуляторный конструкт относится к матричной РНК (мРНК), кодирующей полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта (необязательно при этом указанная мРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований), и причем иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:

(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;

(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;

(iii) стимуляцией воспалительного ответа;

(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или

(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и

(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).

В некоторых вариантах осуществления конструкт имммуностимуляторной мРНК (или комбинация конструктов имммуностимуляторных мРНК) усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в несколько раз, например, по отношению к иммунному ответу на антиген в отсутствии иммуностимулятора, или по отношению к низкомолекулярному агонисту, который усиливает иммунный ответ на антиген. Например, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 0,3-1000 раз, 1-750 раз, 5-500 раз, 7-250 раз или в 1-100 раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раза, 7,5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 75 раз, или более раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген.

Представляющий интерес антиген может быть эндогенным антигеном у субъекта (например, эндогенный опухолевый антиген) или экзогенный антиген, который предоставляется субъекту с помощью иммуностимуляторного конструкта (например, экзогенный опухолевый антиген или антиген патогена, включая вакцинные антигены). Таким образом, иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию полезны для потенцирования или усиления иммунного ответа in vivo против представляющих интерес антигенов, таких как опухолевые антигены при лечении рака или антигенов патогена при лечении, или вакцинации против инфекционных заболеваний.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген является эндогенным антигеном, таким как опухолевый антиген, и конструкт иммуностимуляторной мРНК предоставляется субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции или усиления иммунного ответа против опухолевого антигена. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммунностимуляторной мРНК вводят в комбинации с одним или более дополнительными агентами, например, конструктами мРНК, для стимуляции высвобождения эндогенных антигенов, например, путем индукции иммуногенной гибели клеток, такой как некроптоз или пироптоз. Соответственно, в другом аспекте изобретение обеспечивает конструкты мРНК (например, ммРНК), которые кодируют полипептид, который индуцирует иммуногенную гибель клеток, такую как некроптоз или пироптоз. В некоторых аспектах иммуногенная клеточная гибель, вызванная мРНК, приводит к высвобождению цитозольных компонентов из клетки (например, опухолевой клетки), так что иммунный ответ против клеточных антигенов (например, эндогенных опухолевых антигенов) стимулируется in vivo.

В других вариантах осуществления представляющий интерес антиген является экзогенным антигеном, который кодируется мРНК, такой как химически модифицированная мРНК (ммРНК), представленной в той же самой мРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторную и антигенную мРНК составляют (или совместно составляют) и вводят (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена у субъекта.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, конструкт ммРНК), которая кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ, например, посредством стимуляции сигнального пути интерферона типа I, стимуляции сигнального пути NFkB, стимуляции воспалительного ответа, стимуляции продукции цитокинов или стимуляции развития, активности или мобилизации дендритных клеток. Усиление иммунного ответа на представляющего интерес антиген при помощи иммуностимуляторной мРНК приводит, например, к стимуляции продукции цитокинов, стимуляции клеточного иммунитета (Т-клеточных ответов), такого как антигенспецифические CD8⁺или CD4⁺Т-клеточные ответы, и/или к стимуляции гуморального иммунитета (B-клеточные ответы), такого как образование антигенспецифических антител, или к любой комбинаций вышеуказанных ответов.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который функционирует в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который стимулирует ответ интерферона типа I, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который стимулирует NFkB-опосредованный провоспалительный ответ, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является внутриклеточным адаптерным белком, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является внутриклеточным сигнальным белком, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является фактором транскрипции, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который вовлечен в некроптоз или в образование некроптосом, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который участвует в пироптозе или в образовании инфламмасом, примеры которого приведены в данном документе. Также предлагаются композиции, которые содержат комбинации двух или более иммуностимуляторных мРНК (одного и того же типа класса или разных типов класса).

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид STING человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из V147L, N154S, V155M, R284M, R284K, R284T, E315Q, R375A и их комбинаций. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M (например, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320). В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации V147L/N154S/V155M. В других аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации R284M/V147L/N154S/V155M. В других аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-10 и 224. В другом аспекте конститутивно активный полипептид STING человека кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 199-208, 225, 1319, 1320, 1442-1450 и 1466.

В других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид IRF3 человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 человека содержит мутацию S396D. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 человек содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 210 или SEQ ID NO: 1452. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 представляет собой полипептид IRF3 мыши, например, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 1453.

В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7 человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S475D, S476D, S477D, S479D, L480D, S483D, S487D и их комбинаций; делецию аминокислот 247-467; и комбинации вышеуказанных мутаций и/или делеций. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 14-18. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IRF7 человека кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 213-217 и 1454-1459.

В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из MyD88, TRAM, IRF1, IRF8, IRF9, TBK1, IKKi, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, c-FLIP, IKKα, IKKβ, RIPK1, гибрида TAK-TAB1, DIABLO, Btk, самоактивирующейся каспазы-1 и Flt3.

В других аспектах раскрытие обеспечивает композиции мРНК (например, композиции ммРНК), содержащие один или более конструктов мРНК (например, конструкты ммРНК), кодирующих представляющий интерес антиген(ы), и полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов), причем антиген(ы) и полипептид кодируются или одним и тем же конструктом мРНК (ммРНК), или отдельными конструктами мРНК (ммРНК), которые можно комбинировать и вводить одновременно или последовательно субъекту, нуждающемуся в этом. Любая из иммуностимуляторных мРНК (например, ммРНК), описанная в данном документе (одна или в комбинации), полезна в одной или более композициях для усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы).

Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, и вторую мРНК (например, ммРНК), кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген, необязательно при этом указанные первая и вторая мРНК содержат одну или более модифицированных нуклеотидных оснований, и причем полипептид усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген, когда композицию вводят субъекту. В одном аспекте композиция содержит один конструкт мРНК (например, ммРНК), кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес антиген, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген. В другом аспекте композиция содержит два конструкта мРНК (например, ммРНК), один из которых кодирует по меньшей мере один представляющий интерес антиген, а другой кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген. В некоторых аспектах, когда композиция содержит два конструкта мРНК, два конструкта мРНК (например, ммРНК) совместно составляют в одной и той же композиции (такой как, например, липидная наночастица) и совместно вводят субъекту. В других аспектах, когда предоставляются два или более конструктов мРНК, такие конструкты мРНК могут быть составлены в различных композициях (таких как, например, две или более липидные наночастицы) и введены (например, одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом.

В других аспектах раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, и вторую мРНК (например, ммРНК), кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген является по меньшей мере одним опухолевым антигеном. В одном аспекте по меньшей мере один опухолевый антиген представляет собой по меньшей мере один мутантный антиген KRAS. В одном аспекте по меньшей мере один мутантный антиген KRAS содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G13D, G12C и их комбинаций. В одном аспекте по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 95-106 и 131-132. В других аспектах композиция содержит конструкт мРНК, кодирующий по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека и конститутивно активный полипептид STING человека, например, при этом мРНК кодирует аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 107-130. Иллюстративные нуклеотидные последовательности мРНК для конструктов, кодирующих по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека и конститутивно активный полипептид STING человека, приведены в SEQ ID NO: 220-223 и 1462-1465. В других аспектах опухолевый антиген представляет собой антиген онковируса (например, антиген вируса папилломы человека (HPV), такой как антиген HPV16 E6 или HPV E7, или их комбинация).

В других аспектах композиции согласно раскрытию по меньшей мере один представляющий интерес антиген является по меньшей мере одним антигеном патогена. В одном аспекте по меньшей мере один патогенный антиген относится к патогену, выбранному из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов. В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один вирусный антиген. В одном аспекте по меньшей мере один вирусный антиген представляет собой по меньшей мере один антиген вируса папилломы человека (HPV). В одном аспекте антиген HPV представляет собой антиген HPV16 E6 или HPV E7, или их комбинацию. В одном аспекте антиген HPV содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 36-94. В других аспектах композиции согласно раскрытию по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один бактериальный антиген. В одном варианте осуществления по меньшей мере один бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой один или более антигенов онкогенного вируса, такого как вирус папилломы человека (HPV), вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), Т-лимфотропный вирус человека типа I (HTLV-I), герпесвирус саркомы Капоши (KSHV) или полиомавирус клеток Меркеля (MCV). В одном аспекте представляющий интерес антиген онкогенного вируса кодируется мРНК (например, химически модифицированной мРНК) и представляется на той же самой мРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представляется на другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. В некоторых аспектах иммуностимуляторную мРНК и вирусный антиген(ы) составляют (или совместно составляют) и вводят (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) онкогенного вируса у субъекта. В данном документе описаны подходящие антигены онкогенного вируса для применения с иммуностимуляторами.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой один или более опухолевых антигенов, которые включают персонализированную противораковую вакцину. В одном аспекте раскрытие обеспечивает вакцинный препарат, который включает мРНК (например, ммРНК), кодирующую один или более раковых антигенов, специфических для больного раком, называемых неоэпитопами, вместе с иммуностимуляторным конструктом, причем раковые антигены и иммуностимуляторы кодируются одинаковыми или разными мРНК (например, ммРНК). В данном документе описаны способы выбора раковых антигенов, специфических для больного раком, и создания персонализированных противораковых вакцин на их основе. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает персонализированную противораковую вакцину, содержащую один или более опухолевых антигенов, специфических для больного раком (например, один или более неоэпитопов), кодируемых одной или более мРНК (например, химически модифицированными мРНК), при этом раковые неоэпитопы кодируются одной и той же мРНК или разными мРНК (например, каждый раковый неоэпитоп кодируется в отдельном конструкте мРНК). В некоторых аспектах раковый неоэпитоп(ы) кодируется в том же самом конструкте мРНК, что и в иммуностимуляторном конструкте, или кодируется в другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные мРНК и мРНК ракового антигена(ов) можно составлять (или совместно составлять) и вводить (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена(ов) у субъекта.

В одном аспекте конструкт мРНК кодирует персонализированный раковый антиген, который представляет собой конкатемерный раковый антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов. В другом аспекте конкатемерный раковый антиген содержит одно или более: а) 2-100 пептидных эпитопов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению; b) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную непосредственно друг с другом без линкера; c) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную с одним или другим с помощью одного нуклеотидного линкера; d) каждый пептидный эпитоп, содержащий 25-35 аминокислот и включающий центрально расположенную SNP-мутацию; e) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса I от субъекта; f) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса II от субъекта; g) по меньшей мере 50% пептидных эпитопов, имеющих заявленную аффинность связывания ИК>500 нМ для HLA-A, HLA-B и/или DRB1; h) мРНК, кодирующую 20 пептидных эпитопов; i) 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса I, и 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса II; и/или j) мРНК, кодирующую пептидные эпитопы, расположенную таким образом, что пептидные эпитопы упорядочиваются для минимизации псевдоэпитопов.

В некоторых аспектах конкатемерный раковый антиген содержит 2-100 пептидных эпитопов, при этом каждый пептидный эпитоп содержит 31 аминокислоту и содержит центрально расположенную SNP-мутацию с 15 фланкирующими аминокислотами на каждой стороне SNP-мутации. В некоторых аспектах пептидные эпитопы представляют собой Т-клеточные эпитопы, В-клеточные эпитопы или комбинацию Т-клеточных эпитопов и В-клеточных эпитопов. В некоторых аспектах пептидные эпитопы включают по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса I и по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса II. В некоторых аспектах по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса I, или по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса II.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой по меньшей мере один бактериальный антиген, например, бактериальную вакцину, которая содержит по меньшей мере один бактериальный антиген и иммуностимуляторный конструкт, кодируемую в тех же или отдельных мРНК (например, ммРНК). В одном аспекте раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, которая содержит мРНК, кодирующую один или более бактериальных антигенов, вместе с иммуностимуляторным конструктом, при этом бактериальные антигены и иммуностимулятор кодируются одинаковыми или разными мРНК. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, содержащую один или более бактериальных антигенов (например, поливалентная вакцина) (например, кодируемых одной или более химически модифицированными мРНК), при этом бактериальные антигены кодируются одной и той же мРНК или разными мРНК (например, каждый бактериальный антиген кодируется в отдельном конструкте мРНК). В некоторых аспектах бактериальные антигены кодируются в том же конструкте мРНК, что и в иммуностимуляторном конструкте, или кодируются другим конструктом мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные мРНК и мРНК бактериального антигена(ов) могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против бактериального антигена(ов) у субъекта

В некоторых вариантах осуществления бактериальную вакцину вводят субъекту для обеспечения профилактического лечения (т.е. предотвращает инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальную вакцину вводят субъекту для обеспечения терапевтического лечения (т.е. лечит инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ у субъекта (то есть продукцию антител, специфических к представляющему интерес бактериальному антигену). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует адаптивный иммунный ответ у субъекта. Неограничивающие примеры подходящих бактерий включают Staphylococcus aureus.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих одинаковые или разные эпитопы), чтобы тем самым усиливать иммунный ответ против поливалентного антигена. В одном аспекте поливалентный антиген представляет собой конкатемерный антиген. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе мРНК-вакцины содержат мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемерный антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов (например, одинаковых или разных эпитопов). В одном варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой раковый антиген. В другом варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой бактериальный антиген. Неограничивающие примеры поливалентных антигенов описаны в данном документе.

Конструкт мРНК (например, ммРНК) согласно раскрытию (например, иммуностимуляторная мРНК, антигенкодирующая мРНК или их комбинация) может содержать, например, 5'-НТО, оптимизированную по кодонам открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, 3'-НТО и 3'-хвостовую область связанных нуклеозидов. В одном варианте осуществления мРНК дополнительно содержит один или более сайтов связывания микроРНК (миРНК).

В одном варианте осуществления конструкт модифицированной мРНК согласно раскрытию является полностью модифицированным. Например, в одном варианте осуществления ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (m⁵C), 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ) и 5-метилцитидин (m⁵C), 2-тиоуридин (s²U), 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (m⁵C), 5-метоксиуридин (mo⁵U), 5-метоксиуридин (mo⁵U) и 5-метилцитидин (m⁵C), 2'-O-метилуридин, 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (m⁵C), N6-метиладенозин (m⁶A) или N6-метиладенозин (m⁶A) и 5-метилцитидин (m⁵C). В другом варианте осуществления ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин, или их комбинации. В еще одном варианте осуществления ммРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 5-метоксиуридин (mo⁵U), 5-метилцитидин (m⁵C), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или α-тиоаденозин, или их комбинации.

В другом аспекте раскрытие относится к липидной наночастице, содержащей мРНК (например, модифицированную мРНК) согласно раскрытию. В одном варианте осуществления липидная наночастица представляет собой липосому. В другом варианте осуществления липидная наночастица содержит катионный и/или ионизируемый липид. В одном варианте осуществления катионный и/или ионизируемый липид представляет собой 2,2-дилинолеил-4-метиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) или дилинолеилметил-4-диметиламинобутират (DLin-MC3-DMA). В одном варианте осуществления липидная наночастица дополнительно содержит нацеливающий фрагмент, конъюгированный с наружной поверхностью липидной наночастицы.

В другом аспекте раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей мРНК (например, ммРНК) согласно раскрытию или липидную наночастицу согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из предшествующих или связанных вариантов осуществления, при этом каждую мРНК составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы) (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген), составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же липидную наночастицу-носитель, а каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же липидную наночастицу-носитель, а каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в одну и ту же липидную наночастицу-переносчик, как и каждую мРНК, кодирующую представляющую интерес антиген(ы). В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в другую липидную наночастицу-носитель, и каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в ту же липидную наночастицу-носитель, как и каждую мРНК, кодирующую каждый представляющий интерес антиген(ы) (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген).

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, при этом иммуномодулирующую терапевтическую композицию составляют в виде липидной наночастицы, причем липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого аминолипида: 5-25% фосфолипида: 25-55% стерола; и содержит 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых аспектах ионизируемый аминолипид выбирают из группы, состоящей, например, из 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (DLin-KC2-DMA), дилинолеилметил-4-диметиламинобутирата (DLin-MC3-DMA) и ди((Z) -нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата (L319).

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из предшествующих или связанных вариантов осуществления, при этом каждая мРНК содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. В некоторых аспектах химическую модификацию выбирают из группы, состоящей из псевдоуридина, N1-метилпсевдоуридина, 2-тиоуридина, 4'-тиоуридина, 5-метилцитозина, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридина, 2-тио-1-метилпсевдоуридина, 2-тио-5-азауридина, 2-тиодигидропсевдоуридина, 2-тиодигидроуридина, 2-тиопсевдоуридина, 4-метокси-2-тиопсевдоуридина, 4-метоксипсевдоуридина 4-тио-1-метилпсевдоуридина, 4-тиопсевдоуридина, 5-азауридина, дигидропсевдоуридина, 5-метилуридина, 5-метилуридина, 5-метоксиуридина и 2'-O-метилуридина.

В других аспектах раскрытие обеспечивает липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:

(i) мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV; или

мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV16; или

мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV18; или

мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV E6; или

мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV E7; или

мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV Е6 и по меньшей мере один антиген HPV Е7; и

(ii) мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и

фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах вышеуказанной липидной наночастицы-носителя конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит 3'-НТО, содержащую по меньшей мере один сайт связывания микроРНК miR-122. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает липидную наночастицу по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого аминолипида: 5-25% фосфолипида: 25-55% стерола; и содержит 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых аспектах ионизируемый аминолипид выбирают из группы, состоящей, например, из 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (DLin-KC2-DMA), дилинолеилметил-4-диметиламинобутирата (DLin-MC3-DMA) и ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата (L319). В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит Соединение 25 (в качестве ионизируемого аминолипида), DSPC (в качестве фосфолипида), холестерин (в качестве стерола) и ПЭГ-DMG (в качестве ПЭГ-модифицированного липида). В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60%, Соединения 25: 5-25%, DSPC: 25-55% холестерина; и содержит 0,5-15% ПЭГ-DMG. В одном варианте осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение около 50% Соединения 25: около 10% DSPC: около 38,5% холестерина: около 1,5% ПЭГ-DMG (то есть Соединение 25: DSPC: холестерин: ПЭГ-DMG в соотношении около 50: 10: 38,5: 1,5). В одном варианте осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение 50% Соединения 25: 10% DSPC: 38,5% холестерина: 1,5% ПЭГ-DMG (то есть Соединение 25: DSPC: холестерин: ПЭГ-DMG в соотношении 50:10:38.5:1,5).

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любую из вышеуказанных или сходных липидных наночастиц-носителей, для применения в терапии, например, для профилактического или терапевтического лечения (например, лечения рака), необязательно с инструкциями по применению в такой терапии.

В некоторых аспектах, относящихся к вышеуказанному лекарственному препарату или вакцине, данное раскрытие обеспечивает первую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один первый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает вторую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает третью липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает четвертую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В других аспектах раскрытие обеспечивает первую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает вторую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает третью липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает четвертую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В некоторых аспектах вышеупомянутого лекарственного препарата или вакцины каждая из первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-переносчиков содержит пептидный антиген, имеющий длину 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот. В некоторых аспектах каждый пептидный антиген содержит 25 аминокислот в длину.

В некоторых аспектах вышеупомянутых первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей, причем антиген(ы) HPV содержит одну или более аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 36-72. В некоторых аспектах антиген(ы) HPV содержит одну или более аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 73-94.

В некоторых аспектах вышеупомянутых первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит 3'-НТО, содержащую по меньшей мере один сайт связывания микроРНК miR-122. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любую из вышеуказанных или сходных липидных наночастиц-носителей, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении (например, лечения рака), необязательно с инструкциями по применению в терапии. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любой из вышеуказанных первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей, для применения в терапии рака, необязательно с инструкциями по применению в терапии рака.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая первую, вторую, третью и четвертую липидные наночастицы-носители, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении (например, терапии рака), необязательно с инструкциями по применению в терапии, в которой:

(i) первая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один первый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;

(ii) вторая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;

(iii) третья липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель; и

(iv) четвертая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В любом из вышеперечисленных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает способ лечения субъекта, включающий: введение субъекту, нуждающемуся в этом, любую из вышеуказанных или связанных иммуномодулирующих терапевтических композиций, или любую из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц-носителей. В некоторых аспектах иммуномодулирующую терапевтическую композицию или липидную наночастицу-носитель вводят в комбинации с другим терапевтическим агентом (например, противораковым терапевтическим агентом). В некоторых аспектах иммуномодулирующую терапевтическую композицию или липидную наночастицу-носитель вводят в комбинации с полипептидом-ингибитором контрольной точки. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из PD-1, PD-L1, TIM-3, VISTA, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR и LAG3.

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает композицию (например, вакцину), содержащую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген, и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING), причем мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген (Аг), и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор (ИС), например, полипептид STING), составляют при массовом соотношении Аг : ИС 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 или 20:1. Альтернативно, массовое соотношение ИС : Аг может быть, например: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 или 1:20. В некоторых аспектах композицию составляют в массовом соотношении 5:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антигена (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (т.е. соотношение Аг:ИС 5:1 или, альтернативно, соотношение ИС : Аг 1:5). В некоторых аспектах композицию составляют в массовом соотношении 10:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (т.е. соотношение Аг:ИС 10:1 или, альтернативно, соотношение ИС:Аг 1:10).

В другом аспекте раскрытие относится к способу усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции ммРНК согласно раскрытию, кодирующей представляющий интерес антиген(ы) и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта. В одном аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию продукции цитокинов (например, β(или ФНО-α). В другом аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию антигенспецифической активности CD8⁺Т-клеток, например, примирование, пролиферацию и/или выживаемость (например, увеличение популяции эффекторных Т-клеток/Т-клеток памяти). В одном аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию антигенспецифической активности CD4⁺Т-клеток (например, повышение активности Т-хелперов). В других аспектах усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию B-клеточных ответов (например, увеличение продукции антител).

В некоторых аспектах усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию продукции цитокинов, стимуляцию антигенспецифических ответов CD8⁺T-клеток, стимуляцию антигенспецифических ответов CD4⁺клеток-хелперов, увеличение популяции эффекторных CD62L^lo T-клеток памяти, стимуляцию активности B-клеток или стимуляцию продукции антигенспецифических антител или любую комбинацию вышеуказанных ответов.

В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает стимуляцию продукции цитокинов, причем цитокин представляет собой ИФН-γ или ФНО-α, или и то и другое. В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает стимуляцию антигенспецифических ответов CD8⁺T-клеток, причем антигенспецифический ответ CD8⁺T-клеток включает пролиферацию CD8⁺T-клеток или продукцию цитокинов CD8⁺T-клеток, или и то и другое. В некоторых аспектах продукция цитокинов CD8⁺Т-клетками увеличивается на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.

В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает антигенспецифический ответ CD8⁺T-клеток, причем ответ CD8⁺T-клеток включает пролиферацию CD8⁺T-клеток, и при этом процент CD8⁺T-клеток в общей популяции T-клеток увеличивается на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.

В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает антигенспецифический ответ CD8⁺T-клеток, причем ответ CD8⁺T-клеток включает увеличение процента эффекторных CD62L^lo T-клеток памяти среди CD8⁺T-клеток.

В другом аспекте раскрытие относится к способу усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), причем способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции мРНК согласно раскрытию, кодирующей представляющий интерес антиген(ы) и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта, при этом иммунный ответ на представляющий интерес антиген поддерживается в течение более 10 суток, более 15 суток, более 20 суток, более 25 суток, более 30 суток, более 40 суток, более 50 суток, более 60 суток, более 70 суток, более 80 суток, более 90 суток, более 100, 120, 150, 200, 250, 300 суток или 1 года, или более.

В одном аспекте раскрытие обеспечивает способы усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), причем субъекту вводят два разных конструкта иммуностимуляторных мРНК (например, ммРНК) (при этом один или оба конструкта также кодируют, или вводятся с конструктом мРНК (например, ммРНК), который кодирует представляющий интерес антиген(ы)), или одновременно, или последовательно. В одном аспекте субъекту вводят композицию иммуностимуляторной(ых) мРНК, которая стимулирует развитие или активность дендритных клеток, до введения субъекту композиции иммуностимуляторной(ых) ммРНК, которая стимулирует сигнальный путь интерферона типа I.

В других аспектах раскрытие обеспечивает способы стимуляции иммунного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий опухолевый антиген(ы) и конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который усиливает иммунный ответ на опухолевый антиген(ы), или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на опухоль стимулируется у субъекта. В одном аспекте опухоль представляет собой рак печени, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), меланому, рак шейки матки или рак головы или шеи. В некоторых аспектах субъект представляет собой человека.

В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает способ предотвращения или лечения рака, ассоциированного с вирусом папилломы человека (HPV), у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген HPV и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена HPV, так что иммунный ответ на по меньшей мере один интересующий антиген HPV усиливается. В одном варианте осуществления полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена(ов) HPV, представляет собой полипептид STING. В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген HPV представляет собой по меньшей мере один антиген E6, по меньшей мере один антиген E7 или комбинацию по меньшей мере одного антигена E6 и по меньшей мере одного антигена E7 (например, растворимых или внутриклеточных форм E6 и/или E7). В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген HPV и полипептид кодируются на отдельных мРНК и совместно составляют в липидную наночастицу перед введением субъекту. Альтернативно, антиген(ы) HPV и полипептид могут быть закодированы в одной и той же мРНК. В одном варианте осуществления субъект подвергается риску воздействия HPV, и композицию вводят до воздействия HPV. В другом варианте осуществления субъект инфицирован HPV или имеет рак, ассоциированный с HPV. В одном варианте осуществления рак, ассоциированный с HPV, выбирают из группы, состоящей из рака шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и ротоглотки. В одном варианте осуществления субъекта, страдающего раком, также лечат ингибитором иммунной контрольной точки.

В другом аспекте раскрытие обеспечивает способы стимуляции иммунного ответа на патоген у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий антиген(ы) патогена и конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) патогена, или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на патоген стимулируется у субъекта. В одном аспекте патоген выбирают из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов. В одном аспекте патоген представляет собой вирус, такой как вирус папилломы человека (HPV). В одном аспекте патоген представляет собой бактерию. В одном аспекте субъект представляет собой человека.

В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию составляют для внутримышечной доставки.

В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию для применения в усилении иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума), причем лечение включает введение композиции в комбинации со второй композицией, при этом вторая композиция содержит полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.

В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает использование липидной наночастицы и необязательного фармацевтически приемлемого носителя при изготовлении лекарственного средства для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума), причем лекарственное средство содержит липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель, и при этом лечение включает введение лекарственного средства, необязательно в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.

В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий контейнер, содержащий липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума). В некоторых аспектах листок-вкладыш дополнительно содержит инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции отдельно или в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума).

В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий лекарственное средство, содержащее липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению лекарственного средства отдельно или в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума). В некоторых аспектах набор дополнительно содержит листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению первого лекарственного средства до, во время или после введения второго лекарственного средства для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума).

В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу, композицию или их применение, или набор, содержащий липидную наночастицу или композицию, как описано в данном документе, при этом полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.

В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ снижения или уменьшения размера опухоли, или ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеизложенных или связанных композиций согласно раскрытию.

В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ индукции противоопухолевого ответа у субъекта, страдающего раком, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеупомянутых или связанных композиций согласно раскрытию. В некоторых аспектах противоопухолевый ответ включает Т-клеточный ответ. В некоторых аспектах Т-клеточный ответ включает CD8+Т-клетки.

В некоторых аспектах вышеуказанных способов композицию вводят при помощи внутримышечной инъекции.

В некоторых аспектах вышеупомянутых способов способ дополнительно включает введение второй композиции, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.

В некоторых аспектах любого из вышеуказанных или связанных способов композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят при помощи внутривенной инъекции. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2-3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2 недели или один раз каждые 3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят до, одновременно или после введения липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 представлена гистограмма, демонстрирующая стимуляцию продукции ИФН-β в клетках TF1a, трансфицированных конститутивно активными конструктами мРНК STING.

На Фиг. 2 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами STING. Варианты STING 23a и 23b соответствуют SEQ ID NO: 1, вариант STING 42 соответствует SEQ ID NO: 2, варианты STING 19, 21a и 21b соответствуют SEQ ID NO: 3, вариант STING 41 соответствует SEQ ID NO: 4, вариант STING 43 соответствует SEQ ID NO: 5, вариант STING 45 соответствует SEQ ID NO: 6, вариант STING 46 соответствует SEQ ID NO: 7, вариант STING 47 соответствует SEQ ID NO: 8, вариант STING 56 соответствует SEQ ID NO: 9 и вариант STING 57 соответствует SEQ ID NO: 10.

На Фиг. 3A-3B представлены гистограммы, демонстрирующие активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами IRF3 (Фиг. 3А) или конститутивно активными конструктами IRF7 (Фиг. 3B). Варианты IRF3 1, 3 и 4 соответствуют SEQ ID NO: 12, и варианты IRF3 2 и 5 соответствуют SEQ ID NO: 11 (варианты имеют разные метки). Вариант IRF7 36 соответствует SEQ ID NO: 18 и вариант 31 представляет собой мышиную версию SEQ ID NO: 18. Вариант IRF7 32 соответствует SEQ ID NO: 17 и вариант IRF7 33 соответствует SEQ ID NO: 14.

На Фиг. 4 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию репортерного гена NFκB-люциферазы конститутивно активными конструктами мРНК cFLIP и IKKβ.

На Фиг. 5 представлен график, демонстрирующий активацию репортерного гена NFκB-люциферазы конститутивно активными конструктами мРНК RIPK1.

На Фиг. 6 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию ФНО-α в клетках SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO.

На Фиг. 7 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию интерлейкина-6 (ИЛ-6) в клетках SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO.

На Фиг. 8А-8В представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7 на 21-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 8A показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 8B показаны Е7-специфические ответы для ICS на ФНО-α.

На Фиг. 9A-9B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7. На Фиг. 9A показаны Е6-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 9B показаны 67-специфические ответы для ICS на ФНО-α.

На Фиг. 10A-10B представлены графики, демонстрирующие E7-специфические ответы для внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ на 21-е сутки (Фиг. 10А) или 53-е сутки (Фиг. 10 В) для CD8⁺спленоцитов от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 11A-11B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов на ИФН-γ на 21-е или 53-е сутки у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7. На Фиг. 11А показаны E7-специфические ответы от мышей, иммунизированных внутриклеточным E6/E7. На Фиг. 11B показаны E7-специфические ответы от мышей, иммунизированных растворимым E6/E7.

На Фиг. 12А-12В представлены графики, демонстрирующие процент CD8b⁺клеток среди живых CD45⁺клеток на 21-е сутки (Фиг. 12А) или на 53-е сутки (Фиг. 12 В) для клеток селезенки от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 13А-13В представлены графики, демонстрирующие окрашивание E7-MHC1-тетрамером (специфическое для эпитопа RAHYNIVTF) на 21-е сутки (Фиг. 13А) или на 53-е сутки (Фиг. 13 В) для CD8b⁺спленоцитов от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 14A-14D представлены графики, демонстрирующие, что большинство E7-тетрамер⁺CD8⁺имеют фенотип эффекторных CD62L^lo памяти, при этом сравнение клеток E7-тетрамер⁺CD8 на 21-е сутки и 53-е сутки демонстрирует, что этот фенотип эффекторных CD62L^lo памяти сохранялся на протяжении всего исследования. На Фиг. 14А (21-е сутки) и 14 В (53-е сутки) показано увеличение % CD8 с фенотипом эффекторных CD62Llo^lo памяти. На Фиг. 14C и 14D показано увеличение % E7-тетрамера+CD8, являющихся CD62L^lo, в случае, когда мышей иммунизировали конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 15A-15B представлены графики, демонстрирующие ответы, специфические к неоантигену MC38, для внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ на 21-е сутки (Фиг. 15A) или 35-е сутки (Фиг. 15 В) для CD8⁺спленоцитов от мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе неоантигена MC38 (ADRvax), объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 16А-16В представлены графики, демонстрирующие процент клеток CD8b⁺среди живых CD45⁺клеток в селезенке или МКПК (Фиг. 16А) или процент CD62L^lo клеток среди CD8b⁺клеток в селезенке или МКПК (Фиг. 16B) от мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе неонтигена MC38 (ADRvax), объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.

На Фиг. 17 представлен график, демонстрирующий сравнения титров антител у мышей, получавших указанные конструкты мРНК бактериального антигена отдельно (по 0,2 мкг) или получавших конструкты мРНК бактериального пептида, объединенные в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING.

На Фиг. 18 показана частота мутаций NRAS и KRAS при колоректальном раке, как определено с использованием cBioPortal.

На Фиг. 19А-19С представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших профилактическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING (отдельно или в комбинации с лечением анти-CTLA-4 или анти-PD1 на 6-е, 9-е и 12-е сутки) или до, или во время заражения опухолью TC1, которая экспрессирует E7 HPV, демонстрируя ингибирование роста опухоли посредством лечения E6/E7 HPV+STING. Некоторых мышей лечили на -14-е и -7-е сутки растворимым E6/E7+STING (Фиг. 19A) или внутриклеточным E6/E7+STING (Фиг. 19B), с заражением опухолью на 1-е сутки. Других мышей лечили на 1-е и 8-е сутки растворимым E6/E7+STING (Фиг. 19C), с заражением опухолью на 1-е сутки.

На Фиг. 20A-20I представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших терапевтическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING (Фиг. 20A), отдельно или в комбинации с лечением анти-CTLA-4 на 13-е, 16-е и 19-е сутки (Фиг. 20B) или с лечением анти-PD1 на 13-е, 16-е и 19-е сутки (Фиг. 20C), после заражения опухолью TC1, которая экспрессирует E7 HPV, демонстрируя ингибирование роста опухоли посредством лечения E6/E7 HPV+STING. На Фиг. 20D-20I показано лечение лигандом DMXAA мышиного STING.

На Фиг. 21 представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших терапевтическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING у мышей с опухолями объемом 200 мм³ (верхние графики) или объемом 300 мм³ (нижние графики).

На Фиг. 22 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали или композицией мутантных антигенов ADR (содержащей три пептида), или композицией ADR дикого типа (в качестве контроля).

На Фиг. 23 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов для ФНО- (у мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали или композицией мутантных антигенов ADR (содержащей три пептида), или композицией ADR дикого типа (в качестве контроля).

На Фиг. 24A-24C представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали мутантным пептидом или пептидом дикого типа (в качестве контроля), содержащимся в композиции антигенов ADR. На Фиг. 24А показаны ответы на пептид Adpk1 в композиции ADR. На Фиг. 24B показан ответ на пептид Reps1 в композиции ADR. На Фиг. 24C показан ответ на пептид Dpagt1 в композиции ADR.

На Фиг. 25 представлен график, демонстрирующий антигенспецифические Т-клеточные ответы на эпитопы ГКГС класса I в отношении вакцины CA-132, измеренные методом иммуноферментных пятен (ELISpot) для ИФН-γ, у мышей, которых лечили комбинированным препаратом CA-132 и иммуностимулятора STING, при указанных различных соотношениях Аг: STING.

На Фиг. 26 представлена гистограмма, демонстрирующая антигенспецифические Т-клеточные ответы на эпитопы ГКГС класса I в отношении вакцины CA-132, после повторной стимуляции пептидом СА-87, как измерено методом иммуноферментных пятен для ИФН-γ, у мышей, которых лечили комбинированным препаратом CA-132 и иммуностимулятора STING, при указанных различных соотношениях Аг: STING.

На Фиг. 27 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины E7 HPV16, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации.

На Фиг. 28А-28С представлены гистограммы, демонстрирующие результаты внутриклеточного окрашивания на ФНО-α (ICS) для CD8+Т-клеток от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING, с последующей стимуляцией ex vivo или пулом пептидом Е6 HPV16 (Фиг. 28A), пулом пептидом Е7 HPV16 (Фиг. 28B) или средой (отрицательный контроль) (Фиг. 28C).

На Фиг. 29А-29С представлены гистограммы, демонстрирующие результаты внутриклеточного окрашивания на ИЛ-2 (ICS) для CD8+Т-клеток от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING, с последующей стимуляцией ex vivo или пептидами Е6 HPV16 (Фиг. 29A), пулом пептидом Е7 HPV16 (Фиг. 29B) или средой (отрицательный контроль) (Фиг. 29C).

На Фиг. 30 представлен график, демонстрирующий результаты ИФА для анти-E6 IgG в сыворотке от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING.

На Фиг. 31 представлен график, демонстрирующий результаты ИФА для анти-E7 IgG в сыворотке от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING.

На Фиг. 32 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов для ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING, с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V. ex vivo stimulation with KRAS-G12V peptide.

На Фиг. 33 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.

На Фиг. 34 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.

На Фиг. 35 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.

На Фиг. 36 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) CD8+спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных конкатемером вирусного эпитопа A11 со STING или с нетранслируемыми контрольными конструктами мРНК (NTFIX), с последующей стимуляцией ex vivo отдельными вирусными эпитопами.

На Фиг. 37A-37B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8+спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины против HPV, объединенными в состав или с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3/IRF7 или IRF3/IRF7/IKKβ, на 21-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 37A показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 37B показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ФНО-α.

На Фиг. 38A-38C представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, TAK1, TRAM или MyD88, на 25-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 38A показаны OVA-специфические ответы для ICS на ИФН-γ. На Фиг. 38B показаны OVA-специфические ответы для ICS на ФНО-α. На Фиг. 38C показаны OVA-специфические ответы для ICS на ИЛ-2.

На Фиг. 39 представлена гистограмма, демонстрирующая внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктами иммуностимуляторными мРНК или STING, MAVS, IKKβ, каспазы 1+каспазы 4+IKKβ, MLKL или MLKL+STING на 21-е сутки после первой иммунизации. DMXAA, химический активатор STING, был использован в качестве препарата для сравнения.

На Фиг. 40 представлена гистограмма, демонстрирующая внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктами иммуностимуляторными мРНК или STING, MAVS, IKKβ, каспазы 1+каспазы 4+IKKβ, MLKL или MLKL+STING на 50-е сутки после первой иммунизации. DMXAA, химический активатор STING, был использован в качестве препарата для сравнения.

На Фиг. 41A-41B представлены гистограммы, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенных в состав или совместно введенных с указанными конститутивно активными мутантными конструктами STING. На Фиг. 41A показаны 21-е сутки после иммунизации. На Фиг. 41B показаны 90-е сутки после иммунизации.

На Фиг. 42A-42B представлены гистограммы, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8⁺спленоцитов на ИФН-γ от мышей, истощенных по CD4, иммунизированных конструктами вакцины против HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING. На Фиг. 42A показаны 21-е сутки после иммунизации. На Фиг. 42B показаны 50-е сутки после иммунизации.

На Фиг. 43 приведены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей с опухолями TC1 HPV, которых лечили вакциной HPV-STING или отдельно, или в комбинации с анти-CD4 (для истощения CD4 Т-клеток) или анти-CD8 (для истощения CD8 Т-клеток).

На Фиг. 44А-44В представлены графики, демонстрирующие процент CD62L^lo клеток среди CD4^hiCD8⁺клеток из селезенки мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе антигена МС38, объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING при указанных дозах Аг и STING. На Фиг. 44А показаны результаты для клеток селезенки на 21-е сутки. На Фиг. 44B показаны результаты для клеток селезенки на 54-е сутки.

На Фиг. 45 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (CA-132), в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению со стандартными адъювантами или необъединенными в состав (неинкапсулированными в LNP). Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса II (CA-82 и CA-83), закодированных в конкатемере.

На Фиг. 46 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (CA-132), в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению со стандартными адъювантами или необъединенными в состав (неинкапсулированными в LNP). Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса I (CA-87, CA-90 и CA-93), закодированных в конкатемере.

На Фиг. 47 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (СА-132) в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, причем конструкт STING вводили или одновременно с вакциной, 24 часа спустя или 48 часов спустя. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса II (CA-82 и CA-83) или эпитопов класса I (CA-87, CA-90 и CA-93), закодированных в конкатемере.

На Фиг. 48 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-82 класса II, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 49 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-83 класса II, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 50 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-87 класса I, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 51 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-93 класса I, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 52 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-113 класса I, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 53 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-90 класса II, закодированному в конкатемере.

На Фиг. 54 представлена гистограмма, демонстрирующая жизнеспособность клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, при измерении с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®.

На Фиг. 55 представлен график, демонстрирующий жизнеспособность клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, при измерении с использованием системы считывания YOYO-3^® для определения жизнеспособности клеток.

На Фиг. 56 представлен график, демонстрирующий высвобождение АТФ из клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, что указывает на некроптоз.

На Фиг. 57 представлен график, демонстрирующий высвобождение HMGB1 из клеток HeLa, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, что указывает на некроптоз.

На Фиг. 58 представлен график, демонстрирующий окрашивание клеточной поверхности кальретикулина на клетках, или ложно-трансфицированных, трансфицированных конструктом, индуцирующим апоптоз («PUMA»), или трансфицированных конструктом MLKL, указывая на некроптоз конструктом MLKL.

На Фиг. 59А-59С представлены гистограммы, демонстрирующие жизнеспособность клеток HeLa (Фиг. 59A), клеток B16F10 (Фиг. 59B), или клеток MC38 (Фиг. 59C), трансфицированных конструктами мРНК MLKL, GSDMD или RIP3K, как измерено с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®. * P<0,05; *** р<0,001 в сравнении с L2K ## р<0,01 в сравнении с HsMLKL (1-180).

На Фиг. 60 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию гибели в клетках NIH3T3, трансфицированных мультимеризующими конструктами мРНК RIPK3.

На Фиг. 61 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию высвобождения DAMP (высвобождение HMGB1) в клетках B16F10, трансфицированных мультимеризующим конструктом RIPK3, что указывает на некроптоз.

На Фиг. 62 представлена гистограмма, демонстрирующая жизнеспособность клеток SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO, при измерении с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®.

На Фиг. 63 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию клеточной гибели в клетках HeLa, трансфицированных конструктами мРНК каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11. Результаты демонстрируют среднее±СОС из четырех независимых экспериментов.

На Фиг. 64 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию клеточной гибели в клетках HeLa, трансфицированных конструктами ммРНК NLRP3, пирина или ASC. Результаты демонстрируют среднее±СОС из четырех независимых экспериментов.

На Фиг. 65A-65B представлены гистограммы, демонстрирующие активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами IRF3 (Фиг. 65A) или конструктами IRF7 (Фиг. 65B).

На Фиг. 66 представлена схема дизайна исследования для экспериментальных результатов, приведенных на Фиг. 67.

На Фиг. 67 представлена гистограмма, демонстрирующая высвобождение ИЛ-18 клетками HeLa, примированными иммуностимулятором, как указано, и трансфицированными конструктом каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11, как указано.

На Фиг. 68A-68K представлены графики, демонстрирующие эффект лечения указанными конструктами исполнительной мРНК, отдельно или в комбинации с указанным ингибитором иммунной контрольной точки, на рост опухолей MC38 у мышей.

На Фиг. 69A-69B представлены графики, демонстрирующие эффект лечения указанными конструктами исполнительной мРНК, отдельно или в комбинации с указанным иммуностимулятором и/или ингибитором иммунной контрольной точки, на рост опухолей MC38 у мышей (Фиг. 69A) и на процент выживаемости мышей (Фиг. 69B).

На Фиг. 70A-70B представлены графики, демонстрирующие эффект лечения конструктом мРНК STING в комбинации с анти-PD-1 по сравнению с одним носителем или контролем NT (пустым вектором)+анти-PD-1 на рост опухолей MC38 у мышей (Фиг. 70A) и на процент выживаемости мышей (Фиг. 70B).

Подробное описание сущности изобретения

Данное раскрытие обеспечивает композиции, такие как конструкты мРНК, кодирующие полипептид, который усиливает иммунные ответы на представляющий интерес антиген, называемые в данном документе конструктами иммуностимуляторных мРНК или иммуностимуляторными мРНК, включая химически модифицированные мРНК (ммРНК). Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают иммунные ответы, например, активируя сигнальный путь интерферона типа I, стимулируя сигнальный путь NFkB или и тот и другой, так что стимулируются антигенспецифические ответы на представляющий интерес антиген. Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают иммунные ответы на эндогенный антиген у субъекта, которому вводят иммуностимуляторную мРНК, или усиливают иммунные ответы на экзогенный антиген, который вводят субъекту с иммуностимуляторной мРНК (например, с конструктом мРНК, кодирующим представляющий интерес антиген, который совместно составляют и совместно вводят с иммуностимуляторной мРНК, или с конструктом мРНК, кодирующим представляющий интерес антиген, который составляют и вводят отдельно от иммуностимуляторной мРНК).

Неожиданно было обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК согласно данному раскрытию (например, мРНК, кодирующей конститутивно активный полипептид STING) или комбинации иммуностимуляторных мРНК субъекту стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) стимулирует антигенспецифические ответы эффекторных CD8⁺клеток, стимулирует антигенспецифические ответы CD4⁺клеток-хелперов, увеличивает популяцию эффекторных CD62L^lo Т-клеток памяти и стимулирует продукцию антигенспецифических антител к представляющему интерес антигену.

Как подробно описано в примерах, было обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК (или комбинации иммуностимуляторных мРНК) увеличивает процент CD8⁺Т-клеток, которые являются положительными по ICS для одного или более цитокинов (например, ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2) в ответ на антиген и увеличивает процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток (например, Пример 5 и Фиг. 8-12). Примечательно, что эти эффекты были длительными, поскольку более высокий процент антигенспецифических CD8⁺Т-клеток, положительных по ICS для одного или более цитокинов, сохранялся в течение периода длительностью до 7 недель in vivo (Фиг. 11). Также было обнаружено, что введение конструкта мРНК (или комбинации иммуностимуляторных мРНК) увеличивает популяцию эффекторных CD62L^lo Т-клеток памяти (например, Примеры 5, 6 и Пример 19), и что данный эффект сохраняется с течением времени (Пример 19 и Фиг. 44). Важно, что стимуляция антигенспецифических Т-клеточных ответов и продукции антител на мРНК-вакцину также было продемонстрировано у приматов, отличных от человека (например, Пример 12 и Фиг. 28-31).

В отношении бактериальной вакцины было показано, что введение конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливает гуморальный ответ на бактериальную вакцину за счет увеличения образования антигенспецифических антител in vivo (например, Пример 7 и Фиг. 17).

В отношении противораковой вакцины было показано, что введение иммуностимуляторной мРНК приводит к устойчивому и длительному иммунному ответу против раковых неоэпитопов (Пример 6) и, как было показано, эффективно ингибирует рост опухоли при профилактической и терапевтической вакцинации вакциной против онковируса (Пример 10). Например, введение иммуностимуляторной мРНК с вакциной против HPV было эффективным (отдельно или в комбинации с ингибитором контрольной точки) в предотвращении роста HPV-экспрессирующих опухолевых клеток, in vivo (Фиг. 19), и терапевтическая вакцинация (т.е. после заражения опухолью) вакциной против HPV вместе с иммуностимуляторной мРНК (отдельно или в комбинации с ингибитором контрольной точки) была эффективной в индукции регрессии HPV-экспрессирующих опухолей in vivo (Фиг. 20). Примечательно, что введение иммуностимуляторной мРНК с терапевтической вакциной также показало эффективность в ингибировании крупных, определенных опухолей in vivo (Фиг. 21).

В отношении персонализированной противораковой вакцины было показано, что введение конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливает антигенспецифические Т-клеточные ответы и образование антител на мРНК, кодирующую персонализированную противораковую вакцину (конкатемер), индуцирующую ответы ГКГС как класса I, так и класса II (например, Пример 20 и Фиг. 45-53). Было также обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК потенцирует иммунные ответы на мРНК, кодирующую раковые антигены KRAS в различных форматах (мономеры и конкатемеры) (например, Пример 13 и Фиг. 32-36).

Также было продемонстрировано, что комбинации иммуностимуляторных мРНК, кодирующих индукторы интерферона типа I и активаторы NFκB (например, Пример 14 и Фиг. 37), также как иммуностимуляторные мРНК, кодирующие компоненты внутриклеточных сигнальных путей, которые функционируют в сигнальном пути ниже TLR (например, Пример 15 и Фиг. 38), усиливают антигенспецифические Т-клеточные ответы. Дополнительные комбинации иммуностимуляторных мРНК, кодирующих адаптерные белки (например, STING или MAVS), активаторы NFκB (например, IKKβ), индукторы инфламмасомы (например, каспазы 1/4) и индукторы некроптосомы (например, MLKL) также потенцируют антигенспецифические Т-клеточные ответы. Неожиданно, комбинация мРНК, кодирующей белок-адаптер (например, STING), и мРНК, кодирующей индуктор некроптосомы (например, MLKL), проявляла повышенную активность по сравнению с мРНК, кодирующей только MLKL (например, Пример 16 и Фиг. 39-40). Результаты на 90 сутки демонстрируют, что иммуностимуляторный эффект был длительным (например, Пример 18 и Фиг. 41).

Неожиданно было обнаружено, что добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор (например, STING), среди большинства соотношений антиген: иммуностимулятор (Аг: ИС) улучшало антигенспецифические Т-клеточные ответы по сравнению с одним антигеном (например, в Примере 20). Широта реактивности была неожиданной. Для четырех из шести протестированных антигенов (эпитопов) добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор, к антигену последовательно вызывало более высокие Т-клеточные ответы, чем один антиген. Таким образом, было обнаружено, что имеется широкая кривая нормального распределения в соотношении антиген: иммуностимулятор для улучшения иммуногенности.

Также было обнаружено, что добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор (например, STING), ко всем тестируемым антигенам, потенцирует иммунный ответ на антиген по сравнению с одним антигеном. В большинстве ситуаций было выявлено как минимум 2-кратное увеличение иммунной стимуляции, а для некоторых антигенов - еще большее усиление иммунной стимуляции (например, усиление более чем в 5 раз, более чем в 10 раз, более чем в 20 раз, более чем в 30 раз, более чем в 50 раз или более чем в 75 раз) (например, Пример 21).

Соответственно, данное раскрытие обеспечивает композиции, содержащие один или более конструктов мРНК (например, один или более конструкты ммРНК), причем один или более конструктов мРНК кодируют представляющий интерес антиген(ы) и, в том же или отдельном конструкте мРНК, кодируют полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает наночастицы, например, липидные наночастицы, которые содержат иммуностимуляторную мРНК, которая усиливает иммунный ответ, отдельно или в комбинации с мРНК, кодирующими представляющий интерес антиген. Раскрытие также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе, или наночастицы, например, липидные наночастицы, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе.

В другом аспекте раскрытие обеспечивает композиции, содержащие один или более конструктов мРНК (например, один или более конструктов ммРНК), которые кодируют полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, например, некроптоз или пироптоз. Такие конструкты мРНК могут быть использованы в комбинации с конструктом иммуностимуляторной мРНК, согласно раскрытию для усиления высвобождения эндогенных антигенов in vivo, тем самым стимулируя иммунный ответ против эндогенных антигенов. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает наночастицы, например липидные наночастицы, которые содержат мРНК, индуцирующую иммуногенную клеточную гибель, отдельно или в комбинации с иммуностимуляторной мРНК. Раскрытие также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе, или наночастицы, например, липидные наночастицы, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе.

В других аспектах раскрытие обеспечивает способы усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы) путем введения субъекту только конструкта иммуностимуляторной мРНК (для эндогенных антигенов) или путем введения одной или более мРНК, кодирующих представляющий интерес антиген(ы), и мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или их липидной наночастицы или их фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта. Способы усиления иммунного ответа можно использовать, например, для стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, для стимуляции иммуногенного ответа на патоген у субъекта или для усиления иммунного ответа на вакцину у субъекта.

Иммуностимуляторные мРНК

Один аспект раскрытия относится к мРНК, которые кодируют полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ против одного или более представляющих интерес антигенов. Такие мРНК, которые усиливают иммунные ответы на представляющие интерес антиген(ы), упоминаются в данном документе как конструкты иммуностимуляторных мРНК или иммуностимуляторные мРНК, включая химически модифицированные мРНК (ммРНК). Иммуностимулятор согласно раскрытию усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Усиленный иммунный ответ может быть клеточным ответом, гуморальным ответом или и тем и другим. Используемый в данном документе термин «клеточный» иммунный ответ предназначен для охвата иммунных ответов, которые вовлекают или опосредованы Т-клетками, тогда как «гуморальный» иммунный ответ предназначен для охвата иммунных ответов, которые вовлекают или опосредуются В-клетками. Иммуностимулятор может усиливать иммунный ответ, например,

(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;

(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;

(iii) стимуляцией воспалительного ответа;

(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или

(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и

(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).

Используемый в данном документе термин «стимуляция сигнального пути интерферона типа I» предназначен для включения активации одного или более компонентов сигнального пути интерферона типа I (например, модификации фосфорилирования, димеризации или тому подобного таких компонентов для активации тем самым пути), стимуляции транскрипции интерферон-стимулируемым реагирующим элементом (ISRE) и/или стимуляции продукции или секреции интерферона типа I (например, ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и/или ИФН-ω). Используемый в данном документе термин «стимуляция сигнального пути NFkB» предназначен для включения активации одного или более компонентов сигнального пути NFkB (например, модификации фосфорилирования, димеризации или тому подобное таких компонентов для активации тем самым пути), стимуляции транскрипции в сайте NFkB и/или стимуляции продукции генного продукта, экспрессия которого регулируется NFkB. Используемый в данном документе термин «стимуляция воспалительного ответа» предназначен для охвата стимуляции продукции воспалительных цитокинов (включая, но не ограничиваясь этим, интерфероны типа I, ИЛ-6 и/или ФНО-α). Используемый в данном документе термин «стимуляция развития, активности или мобилизации дендритных клеток» подразумевает прямую или косвенную стимуляцию созревания, пролиферации и/или функциональной активности дендритных клеток.

В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в несколько раз, например, по отношению к иммунному ответу на антиген в отсутствии иммуностимулятора, или по отношению к низкомолекулярному агонисту, который усиливает иммунный ответ на антиген. Например, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 7,5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 75 раз или более по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 0,3-1000 раз, 1-750 раз, 5-500 раз, 7-250 раз или в 10-100 раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. Кратность усиления иммуностимуляторного конструкта может быть измерена с использованием стандартных способов, известных в данной области техники (например, как описано в Примерах). Например, уровень антигенспецифических Т-клеток, экспрессирующих воспалительные цитокины (например, ИФН-γ и/или ФНО-α), можно оценивать, например, с помощью метода внутриклеточного окрашивания (ICS) или анализа методом иммуноферментных пятен, как описано в Примерах

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ у субъекта, нуждающегося в этом (например, потенцирует иммунный ответ у субъекта), например, индуцируя адаптивный иммунитет (например, посредством стимуляции продукции интерферона типа I), стимулируя воспалительный ответ, стимулируя сигнальный путь NFkB и/или стимулируя развитие, активность или мобилизацию дендритных клеток (ДК) у субъекта. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК нуждающемуся в этом субъекту усиливает клеточный иммунитет (например, Т-клеточный иммунитет), гуморальный иммунитет (например, В-клеточный иммунитет) или как клеточный, так и гуморальный иммунитет у субъекта. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов), стимулирует антигенспецифические ответы эффекторных CD8⁺клеток, стимулирует антигенспецифические ответы CD4⁺клеток-хелперов, увеличивает популяцию эффекторных CD62L^lo T-клеток памяти, стимулирует активность В-клеток или стимулирует продукцию антигенспецифических антител, включая комбинации вышеуказанных ответов. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует антигенспецифические ответы CD8⁺эффекторных клеток. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует антигенспецифические ответы CD4⁺клеток-хелперов. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и увеличивает популяцию эффекторных CD62L^lo Т-клеток памяти. В некоторых аспектах введение эффекторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует активность В-клеток или стимулирует продукцию антигенспецифических антител.

В одном варианте осуществления иммуностимулятор усиливает антигенспецифические ответы CD8⁺эффекторных клеток (клеточный иммунитет). Например, иммуностимулятор может увеличивать один или более показателей антигенспецифической активности CD8⁺эффекторных клеток, включая, но не ограничиваясь, пролиферацию CD8+Т-клеток и продукцию CD8+Т-клеток. Например, в одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает продукцию ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2 антигенспецифическими CD8+T-клетками. В различных вариантах осуществления иммуностимулятор может увеличивать продукцию цитокинов CD8+Т-клетками (например, продукцию ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2) в ответ на антиген (по сравнению с продукцией цитокинов CD8+T-клетками в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%. Например, Т-клетки, полученные от субъекта, получившего лечение, можно стимулировать in vitro с использованием представляющего интерес антигена, а продукцию цитокинов CD8+Т-клетками можно оценивать in vitro. Продукцию цитокинов CD8+T-клетками можно определять стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, измерение секретируемых уровней продукции цитокинов (например, ИФА или другим подходящим способом, известным в данной области техники для определения количества цитокинов в супернатанте) и/или определение процента CD8+Т-клеток, которые являются положительными по внутриклеточному окрашиванию (ICS) на цитокин. Например, внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8+T-клеток на экспрессию ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2 можно проводить способами, известными в данной области техники (см., например, Примеры). В одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает процент CD8+Т-клеток, которые являются положительными по ICS на один или более цитокинов (например, ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2) в ответ на антиген (по сравнению с процентом CD8+Т-клеток, которые являются положительными по ICS на цитокин(ы) в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.

В еще одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток (например, селезеночных Т-клеток и/или МКПК) по сравнению с процентом CD8+Т-клеток в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может увеличить процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере, на 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с процентом CD8+Т-клеток в отсутствии иммуностимулятора. Общий процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток может быть определено стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS) или сортировку магнитно-активированных клеток (MACS).

В другом варианте осуществления иммуностимулятор усиливает ответ опухолеспецифических иммунных клеток, что определяется уменьшением объема опухоли in vivo в присутствии иммуностимулятора по сравнению с объемом опухоли в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может уменьшить объем опухоли на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с объемом опухоли в отсутствии иммуностимулятора. Измерение объема опухоли может быть определено способами, хорошо известными в данной области техники.

В другом варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает активность B-клеток (гуморальный иммунный ответ), например, путем увеличения количества продукции антигенспецифических антител по сравнению с продукцией антигенспецифических антител в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может увеличить продукцию антигенспецифических антител на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с продукцией антигенспецифических антител в отсутствии иммуностимулятора. В одном варианте осуществления оценивают продукцию антигенспецифического IgG. Продукцию антигенспецифических антител можно оценивать способами, хорошо известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, ИФА, РИА и тому подобное, которые измеряют уровень антигенспецифического антитела (например, IgG) в образце (например, образце сыворотки).

В другом варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает популяцию эффекторных CD62L^lo Т-клеток памяти. Например, иммуностимулятор может увеличивать общий % CD62L^lo T-клеток среди CD8+T-клеток. Среди других функций было показано, что популяция эффекторных CD62L^lo Т-клеток памяти играет важную функцию в транспорте лимфоцитов (см., например, Schenkel, J.M. and Masopust, D. (2014) Immunity 41:886-897). В различных вариантах осуществления иммуностимулятор может увеличивать общий процент эффекторных CD62L^lo T-клеток памяти среди CD8+T-клеток в ответ на антиген (по сравнению с общим процентом CD62L^lo T-клеток в популяции CD8+T-клеток в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%. Общий процент эффекторных CD62L^lo T-клеток памяти среди CD8+T-клеток может быть определен стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS) или сортировку магнитно-активированных клеток (MACS).

Было показано, что способность конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливать иммунный ответ на представляющий интерес антиген является длительной, причем усиленная иммуногенность наблюдается в течение длительных периодов времени, например, вплоть до 90 суток. Соответственно, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК может усиливать антигенспецифические иммунные ответы в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 9 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 11 недель, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев или дольше.

Способность конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливать иммунный ответ на представляющий интерес антиген можно оценить на системах мышиных моделей, известных в данной области техники. В одном варианте осуществления используется система иммунокомпетентной мышиной модели. В одном варианте осуществления система мышиной модели включает мышей C57/Bl6 (например, для оценки антигенспецифических ответов CD8+T-клеток на представляющий интерес антиген, такой как описанный в Примерах). В другом варианте осуществления система мышиной модели включает мышей BalbC или мышей CD1 (например, для оценки ответов B-клеток, таких как образование антигенспецифических антител).

В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторный полипептид согласно раскрытию функционирует в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуностимулятор не является TLR, но представляет собой молекулу в сигнальном пути TLR ниже от самого рецептора.

В некоторых вариантах осуществления полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН). Неограничивающие примеры полипептидов, которые стимулируют ответ ИФН типа I, которые подходят для применения в качестве иммуностимулятора, включают STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16. Конкретные примеры полипептидов, которые стимулируют ответ интерферона типа I (ИФН), описаны ниже.

В другом варианте осуществления полипептид стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры полипептидов, которые стимулируют NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, включают STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. Конкретные примеры полипептидов, которые стимулируют NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, описан ниже.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный адаптерный белок. В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры внутриклеточных адаптерных белков включают STING, MAVS и MyD88. Конкретные примеры внутриклеточных адаптерных белков описаны ниже.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок сигнального пути TLR. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры внутриклеточных сигнальных белков включают MyD88, IRAK 1, IRAK2, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TAK1, TAB2, TAB3, TAK-TAB1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, IKKα, IKKβ, TRAM, TRIF, RIPK1, и TBK1. Конкретные примеры внутриклеточных сигнальных белков описаны ниже.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой фактор транскрипции. В одном варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры факторов транскрипции включают IRF3 или IRF7. Конкретные примеры факторов транскрипции описаны ниже.

В другом варианте осуществления полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом. Полипептид «участвует» в некроптозе или образовании некроптосом, если белок сам опосредует некроптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании некроптоза и/или в образовании некроптосом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образовании некроптосом, включают MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD. Конкретные примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образование некроптосом, описаны ниже.

В другом варианте осуществления полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом. Полипептид «участвует» в пироптозе или образовании инфламмасом, если белок сам опосредует пироптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании пироптоза и/или в образовании инфламмасом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, включают каспазу 1, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 11, GSDMD, NLRP3, пириновый домен и ASC/PYCARD. Конкретные примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, описаны ниже.

В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию, кодирующая иммуностимулятор, может содержать одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. Подходящие модификации дополнительно обсуждаются ниже.

В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию, кодирующая иммуностимулятор, входит в состав липидной наночастицы. В одном варианте осуществления липидная наночастица дополнительно содержит мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген. В одном варианте осуществления липидную наночастицу вводят субъекту для усиления иммунного ответа против представляющего интерес антигена у субъекта. Подходящие наночастицы и способы применения дополнительно обсуждаются ниже.

В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает композиции, которые содержат комбинации двух или более иммуностимуляторных мРНК. Две или более иммуностимуляторных мРНК могут быть иммуностимуляторами одного и того же типа (например, два или более иммуностимулятора, которые стимулируют ответ интерферона типа I (ИФН)) или могут быть иммуностимуляторами различных типов. Соответственно, в одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую матричную РНК (мРНК), кодирующую первый полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта, вторую мРНК, кодирующую второй полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта и, необязательно третью мРНК, кодирующую третий полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта (и, необязательно, четвертую, пятую, шестую или более мРНК, кодирующие иммуностимуляторы),

причем иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:

(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;

(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;

(iii) стимуляцией воспалительного ответа;

(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или

(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и

(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).

В некоторых вариантах осуществления первый, второй и/или необязательно третий полипептид (и необязательно четвертый, пятый, шестой или более полипептидов) функционируют в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ.

В различных вариантах осуществления комбинированные композиции:

(i) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ;

(ii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом;

(iii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом;

(iv) первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом;

(v) первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом;

(vii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а третий полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом; или

(viii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а третий полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом.

Подходящие неограничивающие примеры каждой из этих категорий иммуностимуляторов перечислены выше и более подробно описаны ниже. Рассматриваются все комбинации перечисленных иммуностимуляторов.

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (IFN) и выбирается из группы, состоящей из STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16; и второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ и выбирается из группы, состоящей из STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активный IRF3, а второй полипептид представляет собой конститутивно активный IKKβ. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7 (то есть композиция содержит мРНК, кодирующую конститутивно активный IRF3, конститутивно активный полипептид IRF7 и конститутивно активный IKKβ

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН) и выбирается из группы, состоящей из STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16; и второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом и выбирается из группы, состоящей из MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активный STING, а второй полипептид представляет собой полипептид MLKL.

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ и выбирается из группы, состоящей из STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7; и второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом и выбирается из группы, состоящей из каспазы 1, каспазы 4, каспазы 5, каспазы 11, GSDMD, NLRP3, пиринового домена и ASC/PYCARD. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активную IKKβ, а второй полипептид представляет собой полипептид каспазы-1. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит мРНК, кодирующую полипептид каспазы-4 (то есть композиция содержит мРНК, кодирующую конститутивно активную IKKβ, полипептид каспазы-1 и полипептид каспазы-4).

В некоторых вариантах осуществления комбинированная композиция согласно раскрытию, кодирующая два или более иммуностимуляторов, содержит одну или более мРНК, которые содержат одну или более модифицированных нуклеотидных оснований. Подходящие модификации дополнительно обсуждаются ниже.

В некоторых вариантах осуществления комбинированная композиция согласно раскрытию, кодирующая два или более иммуностимуляторов, входит в состав липидной наночастицы. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица дополнительно содержит мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления липидную наночастицу вводят субъекту для усиления иммунного ответа против представляющего интерес антигена у субъекта. Подходящие наночастицы и способы применения дополнительно обсуждаются ниже.

Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют интерферон типа I

В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК, кодирующую полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена путем стимуляции или усиления сигнального пути интерферона типа I, тем самым стимулируя или усиливая продукцию интерферона типа I (ИФН). Было установлено, что для успешной индукции противоопухолевого или противомикробного адаптивного иммунитета требуется сигналинг ИФН типа I (см., например, Fuertes, M.B. et al. (2013) Trends Immunol. 34:67-73). Продукция ИФН типа I (включая ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и ИФН-ω) играет роль в устранении микробных инфекций, таких как вирусные инфекции. Также было оценено, что ДНК клетки-хозяина (например, полученная из поврежденных или умирающих клеток) способна индуцировать продукцию интерферона типа I и что сигнальный путь ИФН I типа играет роль в развитии адаптивного противоопухолевого иммунитета. Тем не менее, многие патогены и раковые клетки развили механизмы для снижения или ингибирования ответов интерферона I типа. Таким образом, активация (включая стимуляцию и/или усиление) сигнального пути ИФН типа I у субъекта, нуждающегося в этом, путем обеспечения иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию субъекту стимулирует или усиливает иммунный ответ у субъекта в широком диапазоне клинических ситуаций, включая лечение рака и патогенных инфекций, а также для потенцирования ответов на вакцину для обеспечения защитного иммунитета.

Интерфероны типа I (ИФН) представляют собой провоспалительные цитокины, которые быстро продуцируются во множестве различных типов клеток, обычно при вирусной инфекции, и, как известно, обладают широким спектром эффектов. Классическими последствиями продукции ИФН типа I in vivo являются активация антимикробных клеточных программ и развитие врожденных и адаптивных иммунных ответов. ИФН типа I индуцирует внутреннее антимикробное состояние клеток в инфицированных и соседних клетках, что ограничивает распространение инфекционных агентов, особенно вирусных патогенов. ИФН типа I также модулирует активацию врожденных иммунных клеток (например, созревание дендритных клеток), чтобы способствовать презентации антигена и функциям натуральных клеток-киллеров. ИФН типа I также способствует развитию высокоаффинных антигенспецифических Т- и В-клеточных ответов и иммунологической памяти (Ivashkiv and Donlin (2014) Nat Rev Immunol 14(1):36-49)

ИФН типа I активирует дендритные клетки (ДК) и повышает их способность стимулировать Т-клетки посредством аутокринного сигналинга (Montoya et al., (2002) Blood 99:3263-3271). Воздействие ИФН типа I облегчает созревание ДК посредством увеличения экспрессии хемокиновых рецепторов и молекул адгезии (например, для стимуляции миграции ДК в дренирующие лимфатические узлы), костимулирующих молекул и презентации антигенов ГКГС класса I и класса II. ДК, которые созревают после воздействия ИФН типа I, могут эффективно стимулировать защитные Т-клеточные ответы (Wijesundara et al., (2014) Front Immunol 29(412) и ссылки в нем).

ИФН типа I может стимулировать или ингибировать активацию, пролиферацию, дифференцировку и выживание T-клеток, в значительной степени зависящие от времени сигналинга ИФН типа I относительно сигналинга T-клеточных рецепторов (Crouse et al., (2015) Nat Rev Immunol 15:231-242). Ранние исследования показали, что экспрессия ГКГС-I повышается в ответ на ИФН типа I во множестве типов клеток (Lindahl et al., (1976), J Infect Dis 133(Suppl):A66-A68; Lindahl et al., (1976) Proc Natl Acad Sci USA 17:1284-1287), что является необходимым условием для оптимальной стимуляции, дифференцировки, размножения и цитолитической активности Т-клеток. ИФН типа I может оказывать мощные костимулирующие эффекты на CD8 T-клетки, усиливая пролиферацию и дифференцировку CD8 T-клеток (Curtsinger et al., (2005) J Immunol 174:4465-4469; Kolumam et al., (2005) J Exp Med 202:637-650).

Подобно воздействиям на T-клетки, сигналинг ИФН типа I оказывает как положительное, так и отрицательное влияние на B-клеточные ответы в зависимости от времени и контекста воздействия (Braun et al., (2002) Int Immunol 14(4):411-419; Lin et al, (1998) 187(1):79-87). Сигналинг ИФН типа I может ингибировать выживаемость и созревание незрелых В-клеток. В отличие от незрелых В-клеток, воздействие ИФН типа I способствует активации В-клеток, продукции антител и переключению изотипа после вирусной инфекции или после экспериментальной иммунизации (Le Bon et al., (2006) J Immunol 176:4:2074-2078; Swanson et al., (2010) J Exp Med 207:1485-1500).

Был установлен ряд компонентов, участвующих в сигналинге ИФН типа I, включая STING, регуляторные факторы интерферонов, такие как IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, и IRF9, TBK1, IKKi, MyD88, MAVS и TRAM. Дополнительные компоненты, участвующие в сигнальном пути ИФН типа I, включают IKKα, TRAF3, TRAF6, IRAK-1, IRAK-4, TRIF, IPS-1, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-8, TLR-9, RIG-1, DAI и IFI16.

Соответственно, в одном варианте осуществления иммуностимуляторная мРНК кодирует любой из вышеупомянутых компонентов, участвующих в сигнальном пути ИФН типа I.

Иммуностимуляторная мРНК, кодирующая STING

Данное раскрытие охватывает мРНК (включая ммРНК), кодирующую STING, включая конститутивно активные формы STING, в качестве иммуностимуляторов. STING (стимулятор генов интерферона; также известный как трансмембранный белок 173 (TMEM173), медиатор активации IRF3 (MITA), метионин-пролин-тирозин-серин (MPYS) и стимулятор ИФН ЭР (ERIS)) представляет собой 379 аминокислот, резидентный трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума (ЭР), который функционирует как сигнальная молекула, контролирующая транскрипцию генов иммунного ответа, включая ИФН I типа и провоспалительные цитокины (Ishikawa & Barber, (2008) Nature 455:647-678; Ishikawa et al., (2009) Nature 461:788-792; Barber (2010) Nat Rev Immunol 15(12):760-770).

STING функционирует как сигнальный адаптер, связывающий цитозольное обнаружение ДНК с сигнальной осью TBK1/IRF3/ИФН типа I. Функции сигнального адаптера STING активируются посредством прямого распознавания циклических динуклеотидов (CDN). Примеры CDN включают циклический ди-ГМФ (гуанозин-5'-монофосфат), циклический ди-АМФ (аденозин-5'-монофосфат) и циклический ГМФ-АМФ (cGAMP). CDN, изначально характеризуемые как повсеместно распространенные бактериальные вторичные мессенджеры, в настоящее время известны как класс патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP), которые активируют сигнальную ось TBK1/IRF3/ИФН типа I посредством прямого взаимодействия со STING. STING способен распознавать аберрантные виды ДНК и/или CDN в цитозоле клетки, включая CDN, полученные от бактерий, и/или от белка циклической ГМФ-АМФ-синтазы (cGAS) хозяина. Белок cGAS представляет собой ДНК-сенсор, который вырабатывает cGAMP в ответ на обнаружение ДНК в цитозоле (Burdette et al., (2011) Nature 478:515-518; Sun et al., (2013) Science 339:786-791; Diner et al., (2013) Cell Rep 3:1355-1361; Ablasser et al., (2013) Nature 498:380-384).

При связывании с CDN, STING димеризуется и подвергается конформационному изменению, которое способствует образованию комплекса с TANK-связывающей киназой 1 (TBK1) (Ouyang et al., (2012) Immunity 36(6):1073-1086). Этот комплекс транслоцируется в перинуклеарное пространство Гольджи, что приводит к доставке TBK1 в эндолизосомные компартменты, где он фосфорилирует факторы транскрипции IRF3 и NF-κB (Zhong et al., (2008) Immunity 29:538-550). Недавнее исследование показало, что STING функционирует как каркас, связываясь как с TBK1, так и с IRF3, чтобы специфически стимулировать фосфорилирование IRF3 с помощью TBK1 (Tanaka & Chen, (2012) Sci Signal 5(214):ra20). Активация IRF3-, IRF7- и NF-κB-зависимых сигнальных путей индуцирует продукцию цитокинов и других белков, связанных с иммунным ответом, таких как ИФН типа I, которые стимулируют антипатогенную и/или противоопухолевую активность.

В ряде исследований было исследовано использование CDN-агонистов STING в качестве потенциальных вакцинных адъювантов или иммуномодулирующих агентов для вызова гуморальных и клеточных иммунных ответов (Dubensky et al., (2013) Ther Adv Vaccines 1(4):131-143 и ссылки в нем). Первоначальные исследования показали, что введение CDN, ц-ди-ГМФ, ослабляет инфекцию Staphylococcus aureus in vivo, сокращая количество восстановленных бактериальных клеток в мышиной модели инфекции, однако ц-ди-ГМФ не оказывал заметного ингибирующего или бактерицидного действия на бактериальные клетки in vitro, что указывает на то, что сокращение бактериальных клеток было связано с влиянием на иммунную систему хозяина (Karaolis et al., (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:1029-1038; Karaolis et al., (2007) Infect Immun 75:4942-4950). Недавние исследования показали, что синтетические молекулы производные CDN, объединенные с противораковыми вакцинами, продуцирующими гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (называемые STINGVAX), вызывают усиление противоопухолевых эффектов in vivo на терапевтических животных моделях рака по сравнению с иммунизацией только вакциной, продуцирующей ГМ-КСФ (Fu et al., (2015) Sci Transl Med 7(283):283ra52), что указывает на то, что CDN являются сильными вакцинными адъювантами.

Описаны мутантные белки STING, возникающие в результате полиморфизмов, картированных с геном TMEM173 человека, проявляющих мутацию с приобретением функции или конститутивно активный фенотип. Было показано, что при экспрессии in vitro мутантные аллели STING эффективно стимулируют индукцию ИФН типа I (Liu et al., (2014) N Engl J Med 371:507-518; Jeremiah et al., (2014) J Clin Invest 124:5516-5520; Dobbs et al., (2015) Cell Host Microbe 18(2):157-168; Tang & Wang, (2015) PLoS ONE 10(3):e0120090; Melki et al., (2017) J Allergy Clin Immunol In Press; Konig et al., (2017) Ann Rheum Dis 76(2):468-472; Burdette et al. (2011) Nature 478:515-518).

В данном документе представлены мРНК (включая химически модифицированные мРНК (ммРНК)), кодирующие конститутивно активные формы STING, в том числе мутантные изоформы STING человека для применения в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STING (например, ммРНК), включая мутантные изоформы STING человека, изложены в перечне последовательностей, приведенном в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов STING человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 379 аминокислотных остатков человеческого STING дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_938023.

Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК (например, ммРНК), кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию по аминокислотному остатку 155, в частности аминокислотную замену, такую как мутация V155M. В одном варианте осуществления мРНК (например, ммРНК) кодирует аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления мутант STING V155M кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320. В одном варианте осуществления мРНК (например, ммРНК) содержит последовательность 3'-НТО, приведенную в SEQ ID NO: 209, которая содержит сайт связывания miR122.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 284, такую как аминокислотная замена. Неограничивающие примеры остатков 284 замен включают R284T, R284M и R284K. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284T, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 200 или SEQ ID NO: 1442. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284M, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 1443. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284K, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4 или 224, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 202, 225, 1444 или 1466.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 154, такую как аминокислотная замена, такую как мутация N154S. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию N154S, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 203 или SEQ ID NO: 1445.

В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 147, такую как аминокислотная замена, такую как мутация V147L. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию V147L, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 204 или SEQ ID NO: 1446.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 315, такую как аминокислотная замена, такую как мутация E315Q. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию E315Q, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 205 или SEQ ID NO: 1447.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 375, такую как аминокислотная замена, такую как мутация R375A. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию R375A, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 206 или SEQ ID NO: 1448.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий одну или более, или комбинацию из двух, трех, четырех или более вышеуказанных мутаций. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: V147L, N154S, V155M, R284T, R284M, R284K, E315Q и R375A, и их комбинации. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из: V155M и R284T; V155M и R284M; V155M и R284K; V155M и V147L; V155M и N154S; V155M и E315Q; и V155M и R375A.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий V155M и одну, две, три или более из следующих мутаций: R284T; R284M; R284K; V147L; N154S; E315Q; и R375A. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L и N154S. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и необязательно мутацию в аминокислоте 284. В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и мутацию в аминокислоте 284, выбранную из R284T, R284M и R284K. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284T. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284M. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284K.

В других вариантах осуществления раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий комбинацию мутаций в аминокислотном остатке 147, 154, 155 и, необязательно, 284, в частности аминокислотные замены, такие как V147L, N154S, V155M и, необязательно, R284M. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутации V147N, N154S и V155M, такие как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 9, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 207 или SEQ ID NO: 1449. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутации R284M, V147N, N154S и V155M, такие как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 10, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 208 или SEQ ID NO: 1450.

В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, который является конститутивно активной усеченной формой полноразмерного белка дикого типа из 379 аминокислот, такой как конститутивно активный полипептид STING человека, состоящий из аминокислот 137-379.

Иммуностимуляторная мРНК, кодирующая регуляторный фактор интерферона (IRF)

Данное раскрытие обеспечивает мРНК (включая ммРНК), кодирующую регуляторные факторы интерферона, такие как IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8 и IRF9 в качестве иммуностимуляторов. Семейство факторов транскрипции IRF участвует в регуляции экспрессии генов, что приводит к продукции интерферонов I типа (ИФН) во время врожденных иммунных ответов. На сегодняшний день идентифицировано девять IRF человека (IRF-1-IRF-9), причем каждый член семейства обладает обширной гомологией последовательностей в своих N-концевых связывающих доменах (DBD) (Mamane et al., (1999) Gene 237:1-14; Taniguchi et al., (2001) Annu Rev Immunol 19:623-655). В семействе IRF IRF1, IRF3, IRF5 и IRF7 специфически участвуют в качестве позитивных регуляторов транскрипции гена ИФН типа I (Honda et al., (2006) Immunity 25(3):349-360). IRF1 был первым членом семейства, для которого обнаружили, что он активирует промоторы гена ИФН типа I (Miyamoto et al., (1988) Cell 54:903-913). Хотя исследования демонстрируют, что IRF1 участвует в экспрессии гена ИФН типа I, нормальная индукция ИФН типа I наблюдалась в инфицированных вирусом IRF1-/- мышиных фибробластах, что свидетельствует об их заменимости (Matsuyama et al., (1993) Cell 75:83-97). Было также показано, что IRF5 не является обязательным для индукции ИФН типа I вирусами или агонистами TLR (Takaoka et al., (2005) Nature 434:243-249).

Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активные формы IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8 и IRF9 человека в качестве иммуностимуляторов. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активные формы человеческого IRF3 и/или IRF7.

Во время врожденных иммунных ответов IRF-3 играет критическую роль в ранней индукции ИФН типа I. Фактор транскрипции IRF3 конститутивно экспрессируется и перемещается между ядром и цитоплазмой клеток в латентной форме с преимущественно цитозольной локализацией до фосфорилирования (Hiscott (2007) J Biol Chem 282(21):15325-15329; Kumar et al., (2000) Mol Cell Biol 20(11):4159-4168). После фосфорилирования сериновых остатков на С-конце с помощью TBK-1 (TANK-связывающая киназа 1; также известная как T2K и NAK) и/или IKKε (индуцибельная IκB-киназа; также известная как IKKi), IRF3 транслоцируется из цитоплазмы в ядро (Fitzgerald et al., (2003) Nat Immuno 4(5):491-496; Sharma et al., (2003) Science 300:1148-1151; Hemmi et al., (2004) J Exp Med 199:1641-1650). Транскрипционная активность IRF3 опосредуется этими событиями фосфорилирования и транслокации. Модель для активации IRF3 предполагает, что С-концевое фосфорилирование вызывает конформационное изменение в IRF3, которое способствует гомо- и/или гетеродимеризации (например, с IRF7; см. Honda et al., (2006) Immunity 25(3):346-360), ядерной локализации и ассоциации с транскрипционными коактиваторами CBP и/или p300 (Lin et al., (1999) Mol Cell Biol 19(4):2465-2474). В то время как неактивный IRF3 конститутивно перемещается в и из ядра, фосфорилированные белки IRF3 остаются связанными с CBP и/или p300, сохраняются в ядре и индуцируют транскрипцию ИФН и других генов (Kumar et al., (2000) Mol Cell Biol 20(11):4159-4168).

В отличие от IRF3, IRF7 демонстрирует низкий уровень экспрессии в большинстве клеток, но сильно индуцируется сигналингом, опосредованным ИФН типа I, подтверждая мнение, что IRF3 в первую очередь ответственен за раннюю индукцию генов ИФН и что IRF7 участвует в поздней фазе индукции (Sato et al., (2000) Immunity 13(4):539-548). Связывание лиганда с рецептором ИФН типа I приводит к активации гетеротримерного активатора транскрипции, называемого ИФН-стимулируемым генным фактором 3 (ISGF3), который состоит из IRF9, STAT1 и STAT2 и отвечает за индукцию гена IRF7 (Marie et al., (1998) EMBO J 17(22):6660-6669). Как и IRF3, IRF7 может делиться между цитоплазмой и ядром после серинового фосфорилирования его С-концевой области, что обеспечивает его димеризацию и ядерную транслокацию. IRF7 образует гомодимер или гетеродимер с IRF3, и каждый из этих разных димеров по-разному действует на членов семейства генов ИФН типа I. IRF3 более сильным в активации гена ИФН-β, чем генов ИФН-α, тогда как IRF7 эффективно активирует гены ИФН-α и ИФН-β (Marie et al., (1998) EMBO J 17(22):6660-6669).

В данном документе представлены мРНК, кодирующие конститутивно активные формы IRF3 и IRF7, включая мутантные человеческие изоформы IRF3 и мутантные человеческие изоформы IRF7 для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы IRF3 и IRF7, включая мутантные человеческие изоформы IRF3 и IRF7, изложены в Перечне последовательностей в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов IRF3 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 427 аминокислотных остатков человеческого IRF3 дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001562. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов IRF7 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 503 аминокислотных остатков человеческого IRF7 дикого типа (изоформа а), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001563.

Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок IRF3 человека, который является конститутивно активным, например, имеющим мутацию в аминокислотном остатке 396, такую как аминокислотная замена, например, мутацию S396D, например, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 1463. В других аспектах конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IRF3 мыши, содержащий мутацию S396D, например, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 210 или SEQ ID NO: 1452.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок IRF7 человека, который является конститутивно активным. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий одну или более точечных мутаций (аминокислотные замены по сравнению с диким типом). В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий усеченную форму белка (аминокислотные делеции по сравнению с диким типом). В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий усеченную форму белка, которая также содержит одну или более точечных мутаций (комбинация аминокислотных делеций и аминокислотных замен по сравнению с диким типом).

Аминокислотная последовательность дикого типа человеческого IRF7 (изоформа а) указана в SEQ ID NO: 13, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 212 или SEQ ID NO: 1454. Был получен ряд конститутивно активных форм человеческого IRF7, содержащий точечные мутации, делеции или и те и другие, по сравнению с последовательностью дикого типа. В одном аспекте раскрытие обеспечивает конструкт имуностимуляторной мРНК, кодирующий конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий одну или более из следующих мутаций: S475D, S476D, S477D, S479D, L480D, S483D и S487D, и их комбинации. В других аспектах раскрытие обеспечивает ммРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S477D и S479D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 213 или SEQ ID NO: 1455. В другом аспекте раскрытие обеспечивает к мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S475D, S477D и L480D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 214 или SEQ ID NO: 1456. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S475D, S476D, S477D, S479D, S483D и S487D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 215 или SEQ ID NO: 1457. В другом аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий делецию аминокислотных остатков 247-467 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-246 и 468-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 216 или SEQ ID NO: 1458. В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий делецию аминокислотных остатков 247-467 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-246 и 468-503) и дополнительно содержащий мутации S475D, S476D, S477D, S479D, S483D и S487D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 217 или SEQ ID NO: 1459.

В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую усеченный неактивный «нулевой» полипептидный конструкт IRF7, содержащий делецию остатков 152-246 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-151 и 247-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 218 или SEQ ID NO: 1460 (используется, например, в целях контроля). В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую усеченный неактивный «нулевой» полипептидный конструкт IRF7, содержащий делецию остатков 1-151 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 152-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 1461 (используется, например, в целях контроля).

Дополнительные иммуностимуляторные мРНК, которые активируют ИФН типа I

В дополнение к конструктам мРНК STING и IRF, описанным выше, раскрытие обеспечивает конструкты мРНК, кодирующие дополнительные компоненты сигнального пути ИФН типа I, которые можно использовать в качестве иммуностимуляторов для усиления иммунных ответов посредством активации сигнального пути ИФН типа I. Например, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок MyD88. В данной области техники известно, что MyD88 передает сигнал выше в направлении от IRF7. В одном аспекте раскрытие обеспечивает ммРНК, кодирующую конститутивно активный белок MyD88, такой как мутантный белок MyD88, имеющий одну или более точечных мутаций. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок MyD88 человека или мыши, имеющий замены L265P, как указано в SEQ ID NO: 134 (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1409 или SEQ ID NO: 1480) и 135, соответственно.

В другом аспекте конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок MAVS (митохондриальный антивирусный сигнал). В данной области техники известно, что MAVS передает сигнал выше в направлении от IRF3/IRF7. Было показано, что MAVS играет важную роль в защитном интерфероновом ответе на двухцепочечные РНК-вирусы. Например, мыши, инфицированные ротавирусами, не имеющие MAVS, продуцируют значительно меньше ИФН-β и повышенные количества вируса, чем мыши с MAVS (Broquet, A.H. et al. (2011) J. Immunol. 186:1618-1626). Более того, было показано, что сигналинг RIG-1 или MDA5 через MAVS необходим для активации продукции ИФН-β клетками, инфицированными ротавирусом (Broquet et al., ibid). Также было показано, что MAVS является критическим для ответов интерферона I типа на вирус Коксаки В, опосредованный вместе с MDA5. (Wang, J.P. et al. (2010) J. Virol. 84:254-260). Кроме того, было показано, что, хотя различные классы рецепторов ответственны за распознавание РНК и ДНК в клетках, последующие сигнальные компоненты физически и функционально взаимосвязаны, и существует перекрестное взаимодействие между путями распознавания РНК RIG-1/MAVS и распознавания ДНК cGAS-STING в потенцировании эффективных противовирусных ответов, включая интерфероновые ответы (Zevini, A. et al. (2017) Trends Immunol. 38:194-205). В одном аспекте раскрытие охватывает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок MAVS, такой как мутантный белок MAVS, имеющий одну или более точечных мутаций. В другом аспекте раскрытие охватывает белок MAVS дикого типа, который сверхэкспрессируется. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую белок MAVS, как показано в SEQ ID NO: 1387. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок MAVS SEQ ID NO: 1387 приведена в SEQ ID NO: 1413 и SEQ ID NO: 1484.

В другом аспекте конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок TRAM (TICAM2). В данной области техники известно, что TRAM передает сигнал выше IRF3. В одном аспекте раскрытие включает ммРНК, кодирующую конститутивно активный белок TRAM, такой как мутантный белок TRAM, имеющий одну или более точечных мутаций. В другом аспекте раскрытие охватывает белок TRAM дикого типа, который сверхэкспрессируется. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую белок TRAM мыши, как показано в SEQ ID NO: 136. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TRAM SEQ ID NO: 136, приведена в SEQ ID NO: 1410 или SEQ ID NO: 1481.

В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, кодирующей TANK-связывающую киназу 1 (TBK1) или индуцибельную IκB-киназу (IKKi, также известную как IKKε), включая конститутивно активные формы TBK1 или IKKi, в качестве иммуностимуляторов. Было показано, что TBK1 и IKKi являются компонентами активируемой вирусом киназы, которая фосфорилирует IRF3 и IRF7, таким образом, действуя выше в направлении от IRF3 и IRF7 в сигнальном пути ИФН типа I (Sharma, S. et al. (2003) Science 300:1148-1151). TBK1 и IKKi участвуют в фосфорилировании и активации факторов транскрипции (например, IRF3/7 и NF-κB), которые индуцируют экспрессию генов ИФН типа I, а также генов, индуцируемых ИФН. (Fitzgerald, K.A. et al., (2003) Nat Immunol 4(5):491-496).

Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая кодирует белок TBK1, включая конститутивно активную форму TBK1, включая мутантные изоформы TBK1 человека. В еще одних других аспектах конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок IKKi, включая конститутивно активную форму IKKi, включая мутантные изоформы IKKi человека.

Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют воспалительные ответы

В других аспектах раскрытие обеспечивает конструкты иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ путем стимуляции воспалительного ответа. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют воспалительный ответ, включают STAT1, STAT2, STAT4 и STAT6. Соответственно, раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, кодирующий один или комбинацию этих индуцирующих воспаление белков, включая конститутивно активную форму.

В данном документе предложены мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STAT6, включая мутантные изоформы STAT6 человека для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STAT6, включая мутантные изоформы STAT6 человека, изложены в приведенном в данном документе Перечне последовательностей. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов STAT6 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 847 аминокислотных остатков человеческого STAT6 дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001171550.1.

В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, кодирующий конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий одну или более аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из S407D, V547A, T548A, Y641F и их комбинаций. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации V547A и T548A, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 137. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутацию S407D, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 138. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации S407D, V547A и T548A, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 139. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации V547A, T548A и Y641F, такие как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 140.

Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют сигналинг NFkB

В других аспектах раскрытие обеспечивает конструкты иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ путем стимуляции сигналинга NFkB, который, как известно, участвует в стимуляции иммунных ответов. Неограничивающие примеры белков, которые стимулируют сигналинг NFkB, включают STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. Соответственно, конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию может кодировать любой из этих белков, индуцирующих путь NFkB, например, в конститутивно активной форме.

Подходящие конструкты STING, которые могут служить в качестве конструктов иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ посредством стимуляции сигналинга NFkB, описаны выше в подразделе по конструктам иммуностимуляторных мРНК, которые активируют ИФН типа I.

Подходящие конструкты MyD88, которые могут служить в качестве конструктов иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ посредством стимуляции сигналинга NFkB, описаны выше в подразделе по конструктам иммуностимуляторных мРНК, которые активируют ИФН типа I.

В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирующих белок c-FLIP (клеточный белок, ингибирующий каспазу 8 (FLICE)) (также известный в данной области техники как CASP8 и FADD-подобный регулятор апоптоза), включая конститутивно активный c-FLIP. В данном документе представлены ммРНК, кодирующие конститутивно активные формы c-FLIP, включая мутантные изоформы c-FLIP человека для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. ммРНК, кодирующие конститутивно активные формы c-FLIP, включая мутантные изоформы c-FLIP человека, изложены в Перечне последовательностей в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов c-FLIP человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 480 аминокислотных остатков человеческого c-FLIP дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_003870.

В одном варианте осуществления мРНК кодирует длинную (L) изоформу c-FLIP, содержащую два домена DED, домен p20 и домен p12, такую как имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 141. В другом варианте осуществления мРНК кодирует короткую (S) изоформу c-FLIP, кодирующую аминокислоты 1-227, содержащую два домена DED, такую как имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 142. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p22, кодирующий аминокислоты 1-198, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 143. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p43, кодирующий аминокислоты 1-376, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 144. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p12, кодирующий аминокислоты 377-480, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 145. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки c-FLIP, обсуждаемые выше, приведены в SEQ ID NO: 1398-1402 и 1469-1473.

В другом варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, который активирует сигналинг NFκB, кодирует конститутивно активный конструкт мРНК IKKα или конститутивно активный конструкт мРНК IKKβ. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ человека содержит мутации S177E и S181E, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 146. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ человека содержит мутации S177A и S181A, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 147. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKβ мыши. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ содержит мутации S177E и S181E, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 148. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ мыши содержит мутации S177A и S181A, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 149. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок SEQ ID NO: 146, приведена в SEQ ID NO: 1414 и SEQ ID NO: 1485. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKα человека или мыши, содержащий мутацию PEST, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 150 (человек) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 151 или SEQ ID NO: 28) или 154 (мышь) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 1429). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKβ человека или мыши, содержащий мутацию PEST, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 152 (человек) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 153 или SEQ ID NO: 1397) или 156 (мышь) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 157 или SEQ ID NO: 1430).

В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, который активирует сигналинг NFκB, кодирующий взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 1 (RIPK1). Структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK1, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны в данной области техники, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК, которые приведены в данном документе, также для активации сигналинга NFkB (см. Примеры). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домен IZ, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 158 (человек) или 161 (мышь). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домены EE и DM, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID N: 159 (человек) или 162 (мышь). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домены RR и DM, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID N: 160 (человек) или 163 (мышь). Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды RIPK1, описанные выше, приведены в SEQ ID NO: 1403-1408 и 1474-1479.

В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует полипептид Btk, такой как мутантный полипептид Btk, такой как полипептид Btk (E41K) (например, кодирующий аминокислотную последовательность ОРС, приведенную в SEQ ID NO: 173).

В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует белок TAK1, такой как конститутивно активный TAK1.

В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует белок TAK-TAB1, такой как конститутивно активный TAK-TAB1. В одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок TAK-TAB1 человека, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 164. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TAK-TAB1 SEQ ID NO: 164, приведена в SEQ ID NO: 1411 или SEQ ID NO: 1482.

Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие внутриклеточные адаптерные белки

В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой внутриклеточный адаптерный белок. Внутриклеточные адаптеры (также называемые адаптерными белками, передающими сигналы) представляют собой белки, которые являются аксессуарами для основных белков в пути передачи сигналов. Адаптерные белки содержат множество белок-связывающих модулей, которые связывают белок-связывающих партнеров вместе и облегчают создание более крупных сигнальных комплексов. Эти белки, как правило, сами по себе не обладают какой-либо внутренней ферментативной активностью, но вместо этого опосредуют специфические белок-белковые взаимодействия, которые управляют образованием белковых комплексов.

В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ.

В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок STING, такой как конститутивно активная форма полипептида STING, включая мутантные изоформы STING человека. STING был определен в данной области техники как адаптер эндоплазматического ретикулума, который облегчает сигналинг врожденного иммунитета, и было показано, что он активирует как NFkB-опосредованный, так и IRF3/IRF7-опосредованный пути транскрипции для индукции экспрессии ИФН I типа (см., например, Ishikawa, H. and Barber, G.H. (2008) Nature 455:674-678). Например, STING действует в качестве адаптерного белка при активации TBK1 (выше в направлении от NFkB-опосредованной и IRF3/IRF-опосредованной транскрипции) после активации cGAS и IFI16 при помощи двухцепочечной ДНК (например, вирусной ДНК). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие STING, подробно описаны выше в разделе иммуностимуляторов, которые активируют интерферон типа I.

В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок MAVS, такой как конститутивно активная форма полипептида MAVS, включая мутантные изоформы MAVS человека. MAVS также известен в данной области техники как VISA (вирус-индуцированный сигнальный адаптер), IPS-1 или Cardif. В данной области было установлено, что MAVS действует как внутриклеточный адаптерный белок в активации TBK1 (выше в направлении от NFkB-опосредованной и IRF3/IRF-опосредованной транскрипции) после активации цитоплазматической РНК-хеликазы RIG-1 и MDA5 с помощью двухцепочечной РНК (например, двухцепочечные РНК-вирусы). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие MAVS, подробно описаны выше в подразделе иммуностимуляторов, которые активируют интерферон типа I.

В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок MyD88, такой как конститутивно активная форма полипептида MyD88, включая мутантные изоформы MyD88 человека. MyD88 был определен в данной области техники как внутриклеточный адаптерный белок, который используется TLR для активации ответов ИФН типа I и NFkB-опосредованных провоспалительных ответов (см., например, O'Neill, L.A. et al. (2003) J. Endotoxin Res. 9:55-59). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие MyD88, подробно описаны выше в подразделе об иммуностимуляторах, которые активируют ответы ИФН типа I.

Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие внутриклеточные сигнальные белки

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой внутриклеточный сигнальный белок. Используемый в данном документе термин «внутриклеточный сигнальный белок» относится к белку, участвующему в пути передачи сигнала и обычно обладающему ферментативной активностью (например, киназной активностью). В одном варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок сигнального пути TLR (то есть полипептид представляет собой внутриклеточную молекулу, которая функционирует в трансдукции TLR-опосредованного сигналинга, но не является самим TLR). В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ.Неограничивающие примеры внутриклеточных сигнальных белков включают MyD88, IRAK 1, IRAK2, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TAK1, TAB2, TAB3, TAK-TAB1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, IKKα, IKKβ, TRAM, TRIF, RIPK1, и TBK1. Конкретные примеры внутриклеточных сигнальных белков описаны в подразделах об иммуностимуляторах, которые активируют интерферон типа I или активируют сигналинг NFκB.

Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие факторы транскрипции

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой фактор транскрипции. Фактор транскрипции содержит по меньшей мере один специфический для последовательности ДНК-связывающий домен и функционирует для регуляции скорости транскрипции гена(ов) в мРНК. В одном варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры факторов транскрипции включают IRF3 или IRF7. Конкретные примеры конструктов IRF3 и IRF7 описаны в подразделе об иммуностимуляторах, которые активируют интерферон типа I.

Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие полипептиды, участвующие в некроптозе или образовании некроптосом

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, участвует в некроптозе или образовании некроптосом. Полипептид «участвует» в некроптозе или образовании некроптосом, если белок сам опосредует некроптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании некроптоза и/или в образовании некроптосом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образовании некроптосом, включают MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD.

Подходящие конструкты мРНК, кодирующие RIPK1, подробно описаны выше в разделе иммуностимуляторов, которые активируют сигналинг NFκB.

В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой псевдокиназу смешанного происхождения (MLKL). Конструкты MLKL индуцируют некроптотическую клеточную гибель, характеризующуюся высвобождением DAMP. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих MLKL, или их фрагмента, индуцирующего иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1327 и 1328, соответственно. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок MLKL SEQ ID NO: 1327, приведена в SEQ ID NO: 1412 и SEQ ID NO: 1483.

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК является взаимодействующий с рецептором протеинкиназой-3 (RIPK3). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который мультимеризуется сам с собой (гомоолигомеризация). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который димеризуется с RIPK1. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен и домен RHIM в RIPK3. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен RIPK3, домен RHIM в RIPK3 и два домена FKBP (F>V). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и домен IZ (например, тример IZ). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и один или более доменов EE или RR (например, доменов 2xEE или доменов 2xRR). Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK3, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK3, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1329-1344 и 1379. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид RIPK3 SEQ ID NO: 1339, приведена в SEQ ID NO: 1415 и SEQ ID NO: 1486.

В другом варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок с низкой pI, прямо связывающий IAP, (DIABLO) (также известный как SMAC/DIABLO). Как описано в приведенных в данном документе примерах, конструкты DIABLO индуцируют высвобождение цитокинов. В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, кодирующий последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO дикого типа, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 165 (соответствует 239-аминокислотному предшественнику изоформы 1 DIABLO человека, раскрытому в данной области техники под номером доступа Genbank NP_063940.1). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 DIABLO человека, содержащую мутацию S126L, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 166. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 DIABLO человека, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 167. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 DIABLO человека и содержит мутацию S126L, такой как имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 168. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO дикого типа, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169 (соответствует 195-аминокислотной изоформы 3 DIABLO человека, раскрытой в данной области техники под номером доступа Genbank NP_001265271.1). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 DIABLO человека, содержащую мутацию S82L, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 170. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-195 изоформы 3 DIABLO человека, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 171. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-195 изоформы 3 DIABLO человека и содержит мутацию S82L, такой как имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 172. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DIABLO SEQ ID NO: 169, приведена в SEQ ID NO: 1416 и SEQ ID NO: 1487.

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой FADD (белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора). Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих FADD, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1345-1351. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки FADD, приведены в SEQ ID NO: 1417-1422 и 1488-1493.

Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие полипептиды, вовлеченные в пироптоз или образование инфламмасом

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, участвует в пироптозе или образовании инфламмасом. Полипептид «участвует» в пироптозе или образовании инфламмасом, если белок сам опосредует пироптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании пироптоза и/или в образовании инфламмасом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, включают каспазу 1, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 11, GSDMD, NLRP3, пириновый домен и ASC/PYCARD.

В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой каспазу 1. В одном варианте осуществления полипептид каспазы 1 представляет собой полипептид самоактивирующейся каспазы-1 (например, кодирующий любую из аминокислотных последовательностей ОРС, приведенных в SEQ ID NO: 175-178), который может способствовать расщеплению про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 до их соответствующих зрелых форм.

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой каспазу-4 или каспазу-5, или каспазу-11. В различных вариантах осуществления конструкты каспазы-4, -5 или -11 могут кодировать (i) полноразмерную каспазу-4, каспазу-5 или каспазу-11 дикого типа; (ii) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен IZ; (iii) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен IZ; (iv) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен DM; или (v) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен DM. Примеры форм каспазы-4 и каспазы-11 c удаленным N-концом содержат аминокислотные остатки 81-377. Пример формы каспазы-5 c удаленным N-концом содержит аминокислотные остатки 137-434. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-4, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1352-1356. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-5, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1357-1361. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-11, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1362-1366.

В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой гасдермин D (GSDMD). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность человеческого GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-275 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 276-484 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует мышиный GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-276 мышиного GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 277-487 мышиного GSDMD. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих GSDMD, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1367-1372.

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой NLRP3. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих NLRP3, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1373 или 1374.

В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок, содержащий CARD (ASC/PYCARD) или его фрагмент, такой как домен. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина. В другом варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина, содержащий мутацию V726A. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих домен B30.2 пирина, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1375 или 1376. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих ASC, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1377 или 1378.

Дополнительные иммуностимуляторные мРНК

Данное раскрытие обеспечивает дополнительные конструкты иммуностимуляторных мРНК. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует полипептид SOC3 (например, кодирующий аминокислотную последовательность ОРС, приведенную в SEQ ID NO: 174).

В еще одних других вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок, который модулирует активность дендритных клеток (ДК), такую как стимуляция продукции, активности или мобилизации ДК. Неограничивающим примером белка, который стимулирует мобилизацию ДК, является FLT3. Соответственно, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок FLT3.

Конструкт иммуностимуляторной мРНК обычно содержит, помимо полипептид-кодирующих последовательностей, структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Подходящие компоненты конструкта мРНК являются такими, как описано в данном документе.

Представляющие интерес антигены, включая мРНК

Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию полезны в комбинации с любым типом антигена, для которого желательно усиление иммунного ответа, включая последовательности мРНК, кодирующие по меньшей мере один представляющий интерес антиген (или в том же, или в отдельном конструкте мРНК), для усиления иммунных ответов против представляющего интерес антигена, такого как опухолевый антиген или антиген патогена. Таким образом, иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают, например, ответы мРНК-вакцины, тем самым действуя в качестве генетических адъювантов. В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой опухолевый антиген. В другом варианте осуществления антиген(ы) представляющий интерес антиген(ы) представляет собой антиген патогена. В различных вариантах осуществления антиген(ы) патогена может быть из патогена, выбранного из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов.

В одном варианте осуществления антиген представляет собой эндогенный антиген, такой как опухолевый антиген или антиген патогена, высвобождаемый in situ. Альтернативно, антиген представляет собой экзогенный антиген. Экзогенный антиген может быть введен совместно с конструктом иммуностимуляторной мРНК или, альтернативно, может быть введен до или после конструкта иммуностимуляторной мРНК. Экзогенный антиген может быть объединен в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК или, альтернативно, может быть составлен отдельно от конструкта иммуностимуляторной мРНК. В одном варианте осуществления экзогенный антиген кодируется конструктом мРНК (например, конструктом ммРНК), или таким же или другим конструктом мРНК, отличным от того, который кодирует иммуностимулятор. В других вариантах осуществления антиген может представлять собой, например, белок, пептид, гликопротеин, полисахарид или липид.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой опухолевый антиген. В одном варианте осуществления опухолевый антиген содержит опухолевый неоэпитоп, например, мутантный пептид из опухолевого антигена. В одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген Ras. В данной области техники описано полный анализ мутаций Ras при раке (Prior, I.A. et al. (2012) Cancer Res. 72:2457-2467). Соответственно, аминокислотная последовательность Ras, содержащая по меньшей мере одну мутацию, связанную с раком, может быть использована в качестве представляющего интерес антигена. В одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой мутантный антиген KRAS. Мутантные антигены KRAS участвуют в приобретенной устойчивости к определенным терапевтическим агентам (см., например, Misale, S. et al. (2012) Nature 486:532-536; Diaz, L.A. et al. (2012) Nature 486:537-540). Кроме того, противоопухолевые вакцины, содержащие по меньшей мере один мутантный пептид RAS и антиметаболитный химиотерапевтический агент, были описаны в данной области техники (патент США №9,757,399, полное содержание которого специально включено в данный документ посредством ссылки). Соответственно, любой из мутантных пептидов RAS, описанных в патенте США №9,757,349, может быть использован в качестве антигена согласно раскрытию, например, в комбинации с иммуностимулятором согласно раскрытию для усиления противоопухолевого иммунного ответа против опухолевого антигена Ras.

В одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS содержит аминокислотную последовательность, имеющую одну или более мутаций, выбранных из G12D, G12V, G13D и G12C и их комбинаций. Неограничивающие примеры мутантных антигенов KRAS включают те, которые содержат одну или более аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 95-106 и 131-132. В одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 15-мерных пептидов KRAS, содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 95-97. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 25-мерных пептидов KRAS, содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 98-100 и 131. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 3×15-мерных пептидов KRAS (3 копии 15-мерного пептида), содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 101-103. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 3×25-мерных пептидов KRAS (три копии 25-мерного пептида), содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 104-106 и 132. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой 100-мерный конкатемерный пептид из 25-мерных пептидов, содержащих мутации G12D, G12V, G13D и G12C (то есть 100-мерный конкатемер SEQ ID NO: 98, 99, 100 и 131). Соответственно, в одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS содержит конструкт мРНК, кодирующий SEQ ID NO: 98, 99, 100 и 131. Дополнительное описание мутантных антигенов KRAS, их аминокислотных последовательностей и кодирующих их последовательностей мРНК раскрыто в заявке США, серийный номер 62/453,465, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой 100-мерный конкатемерный пептид из 25-мерных пептидов, содержащих мутации G12D, G12V, G13D и G12C, кодируемые нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1321 или 1322.

В одном варианте осуществления опухолевый антиген кодируется конструктом мРНК, которая также содержит иммуностимулятор (то есть также кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ против опухолевого антигена). Неограничивающие примеры таких конструктов включают конструкты KRAS-STING, кодирующие одну из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 107-130. Неограничивающие примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих конструкты KRAS-STING, приведены в SEQ ID NO: 220-223.

В еще одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген онкогенного вируса. В одном варианте осуществления онкогенный вирус представляет собой вирус папилломы человека (HPV), а антиген(ы) HPV представляет собой антиген E6 и/или E7. Неограничивающие примеры антигенов Е6 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-72. Неограничивающие примеры антигенов Е7 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73-94. В других вариантах осуществления антиген HPV представляет собой белок E1, E2, E4, E5, L1 или L2 или его последовательность антигенного пептида. Подходящие антигены HPV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления опухолевый антиген кодируется противораковой мРНК-вакциной. Подходящие противораковые мРНК-вакцины подробно описаны в заявке PCT №PCT/US2016/044918, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

В еще одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой эндогенный опухолевый антиген, такой как опухолевый антиген, который высвобождается при разрушении опухолевых клеток in situ. В данной области техники установлено, что существуют естественные механизмы, которые приводят к гибели клеток in vivo, приводящей к высвобождению внутриклеточных компонентов, так что иммунный ответ может стимулироваться против внутриклеточных компонентов. Такие механизмы упоминаются в данном документе как иммуногенная клеточная гибель и включают некроптоз и пироптоз. Соответственно, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию вводят субъекту, имеющему опухоль, в условиях, при которых происходит эндогенная иммуногенная клеточная гибель, так что высвобождается один или более эндогенных опухолевых антигенов, тем самым усиливая иммунный ответ против опухолевых антигенов. В одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК вводят субъекту, имеющему опухоль, вместе со вторым конструктом мРНК, кодирующим «конструкт исполнительной мРНК», который стимулирует иммуногенную клеточную гибель опухолевых клеток у субъекта. Примеры конструктов исполнительной мРНК включают конструкты, кодирующие MLKL, RIPK3, RIPK1, DIABLO, FADD, GSDMD, каспазу-4, каспазу-5, каспазу-11, пирин, NLRP3 и ASC/PYCARD. Конструкты исполнительной мРНК и их применение в комбинации с конструктом иммуностимуляторной мРНК более подробно описаны в заявке США №62/412,933, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой патогенный антиген. В одном варианте осуществления антиген патогена содержит вирусный антиген. В одном варианте осуществления вирусный антиген представляет собой антиген вируса папилломы человека (HPV). В одном варианте осуществления антиген HPV представляет собой антиген E6 или E7. Неограничивающие примеры антигенов Е6 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-72. Неограничивающие примеры антигенов Е7 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73-94. В других вариантах осуществления антиген HPV представляет собой белок E1, E2, E4, E5, L1 или L2 или его последовательность антигенного пептида. Подходящие антигены HPV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления вирусный антиген представляет собой антиген вируса простого герпеса (HSV), такой как антиген HSV-1 или HSV-2. Например, вирусный антиген может представлять собой гликопротеин B, гликопротеин C, гликопротеин D, гликопротеин E, гликопротеин I, антиген ICP4 или ICP0 HSV (HSV-1 или HSV-2). Подходящие антигены HSV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления антиген патогена представляет собой бактериальный антиген. В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы). В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой антиген Chlamydia, такой как антиген MOMP, OmpA, OmpL, OmpF или OprF. Подходящие антигены Chlamydia описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления антиген патогена кодируется конструктом мРНК, которая также содержит иммуностимулятор (то есть также кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ против опухолевого антигена).

Конструкт мРНК, кодирующий представляющий интерес антиген(ы), обычно содержит, в дополнение к последовательностям, кодирующим антиген, другие структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Подходящие компоненты конструкта мРНК являются такими, как описано в данном документе.

Онковирусы

В одном варианте осуществления иммуностимуляторный конструкт используют для усиления иммунного ответа против одного или более антигенов из онкогенного вируса (онковируса). Вирусные инфекции являются причиной значительной части всех онкологических заболеваний человека. Было подсчитано, что примерно 12% всех случаев злокачественных новообразований человека во всем мире имеют вирусную этиологию (Parkin (2006) Int J Cancer 118:3030-3044). Термин «онковирус» относится к любому вирусу с ДНК- и/или РНК-геномом, способным вызывать рак, и может использоваться как синоним терминам «вирус опухоли» или «вирус рака». Международное агентство по изучению рака при Всемирной организации здравоохранения (IARC) признало семь онковирусов человека в качестве биологических канцерогенов группы 1, для которых имеются «достаточные данные, указывающие на наличие канцерогенности для людей», включая вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирусы папилломы человека высокого риска (HPV), Т-лимфотропный вирус человека типа 1 (HTLV-1), вирус иммунодефицита человека (HIV) и герпесвирус саркомы Капоши (KSHV) (Bouvard et al., (2009) Lancet Oncol 10:321-322). Полиомавирус клеток Меркеля (MCV) представляет собой недавно открытый онковирус, который IARC классифицирует как биологический канцероген группы 2А (Feng et al., (2008) Science 319 (5866): 1096-1100).

Значительные достижения в области безопасности, эффективности и способности охватить экономически неблагополучные группы населения вакцинами против патогенных вирусов (например, полиомиелит, грипп) явились причиной разработки и внедрения стратегии профилактической и терапевтической вакцинации против онковирусов (Schiller and Lowy (2010) Ann Rev Microbiol 64:23-41). Соответственно, в одном аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов онкогенного вируса. Например, представляющий интерес антиген(ы) из онкогенного вируса может кодироваться химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) онкогенного вируса у субъекта Неограничивающие примеры онкогенных вирусов и их подходящих антигенов для применения в комбинации с иммуностимуляторным конструктом для усиления иммунного ответа против онкогенного вируса описаны ниже.

А. Папилломавирусы человека (HPV)

В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу папилломы человека (HPV). Рак шейки матки является четвертым наиболее распространенным во всем мире злокачественным заболеванием, поражающим женщин (Wakeham and Kavanagh (2014) Curr Oncol Rep 16(9):402). Инфекция вируса папилломы человека (HPV) связана почти со всеми случаями рака шейки матки и является причиной нескольких других видов рака, включая: рак полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и ротоглотки (Forman et al., (2012) Vaccine 30 Suppl 5:F12-23; Maxwell et al., (2016) Annu Rev Med 67:91-101). На сегодняшний день было выявлено и секвенировано более 300 папилломавирусов, включая более 200 типов HPV, которые классифицированы в соответствии с их онкогенным потенциалом. Связь между развитием рака шейки матки и инфекцией типов HPV высокого риска хорошо известна и дает обоснование для анализа ДНК HPV во время скрининга шейки матки и для разработки профилактических вакцин (Egawa et al., (2015) Viruses 7(7):3863-3890). Среди типов HPV высокого риска HPV16 и HPV18 являются основными типами вируса папилломы, ответственными за около 70% случаев рака шейки матки (Walboomers et al., (1999) J Pathol 189 (1):12-19; Clifford et al., (2002) Bri J Cancer 88:63-73).

Идентификация HPV в качестве этиологического агента рака шейки матки и других злокачественных новообразований мочеполовой системы дала возможность снизить заболеваемость и смертность, вызванные HPV-ассоциированным раком, путем вакцинации и других терапевтических стратегий, направленных на инфекцию HPV (zur Hausen (2002) Nat Rev Cancer 2(5):342-350). Существуют профилактические вакцины против ВПЧ, нацеленные на основной капсидный белок L1 вирусной частицы HPV (Harper et al., (2010) Discov Med 10(50):7-17; Kash et al., (2015) J Clin Med 4(4):614-633). Эти вакцины не позволили неинфицированным людям заразиться HPV -инфекцией, также как предварительно инфицированным пациентам от повторного инфицирования. Однако доступные в настоящее время вакцины против HPV не способны лечить или устранять определенные HPV-инфекции и поражения, связанные с HPV (Ma et al., (2012) Expert Opin Emerg Drugs 17(4):469-492). Терапевтические вакцины против HPV представляют собой потенциальный подход к лечению существующих HPV-инфекций и связанных с ними заболеваний. В отличие от профилактических вакцин против HPV, которые могут генерировать нейтрализующие антитела против вирусных частиц, терапевтические вакцины против HPV могут стимулировать клеточные иммунные ответы для специфического нацеливания и уничтожения инфицированных клеток.

Хотя многие HPV-инфекции остаются бессимптомными и устраняются иммунной системой, могут развиться персистентные HPV-инфекции, которые в дальнейшем могут перерасти в внутриэпителиальную неоплазию шейки матки и/или карциному шейки матки низкой или высокой степени тяжести (Ostor (1993) Int J Gynecol pathol 12(2):186-192; Ghittoni et al., (2015) Ecancermedicalscience 9:526). Вирусная ДНК HPV интегрируется в геном хозяина при многих HPV -ассоциированных поражениях и злокачественных новообразованиях. Эта интеграция может привести к удалению ранних (E1, E2, E4 и E5) и поздних (L1 и L2) генов. Удаление L1 и L2 во время процесса интеграции исключает использование профилактических вакцин против HPV-ассоциированных злокачественных новообразований. Кроме того, Е2 является негативным регулятором для онкогенов Е6 и Е7 HPV. Удаление E2 во время интеграции приводит к увеличению экспрессии E6 и E7 и, как полагают, способствует HPV-ассоциированному канцерогенезу. Онкобелки E6 и E7 необходимы для инициации и поддержания HPV-ассоциированных злокачественных новообразований и экспрессируются в трансформированных клетках. Терапевтические вакцины против HPV, нацеленные на Е6 и Е7, могут обойти проблему иммунной толерантности к аутоантигенам, потому что эти кодируемые вирусом онкогенные белки являются чужеродными белками для человеческого организма. По этим причинам онкобелки Е6 и Е7 HPV служат идеальной мишенью для терапевтических вакцин против HPV.

Соответственно, в одном аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов HPV. Например, представляющий интерес антиген(ы) из HPV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HPV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HPV у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HPV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HPV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HPV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HPV выбирают из E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 и L2 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид выбирают из E1, E2, E4, E5, E6 и E7. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой E6, E7 или комбинацию E6 и E7. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой L1, L2 или комбинацию L1 и L2.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин представляет собой L1. В некоторых вариантах осуществления белок L1 получают из серотипов HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 30, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 или 82.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой L1, L2 или комбинацию L1 и L2 и E6, E7, или комбинацию E6 и E7.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 16-ого типа (HPV16), HPV 18-ого типа (HPV18), HPV 26-ого типа (HPV26), HPV 31-ого типа (HPV31), HPV 33-ого типа (HPV33), HPV 35-ого типа (HPV35), HPV 45-ого типа (HPV45), HPV 51-ого типа (HPV51), HPV 52-ого типа (HPV52), HPV 53-ого типа (HPV53), HPV 56-ого типа (HPV56), HPV 58-ого типа (HPV58), HPV 59-ого типа (HPV59), HPV 66-ого типа (HPV66), HPV 68-ого типа (HPV68), HPV 82-ого типа (HPV82) или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV16, HPV18 или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 6-ого типа (HPV6), HPV 11-ого типа (HPV11), HPV 13-ого типа (HPV13), HPV 40-ого типа (HPV40), HPV 42-ого типа (HPV42), HPV 43-ого типа (HPV43), HPV 44-ого типа (HPV44), HPV 54-ого типа (HPV54), HPV 61-ого типа (HPV61), HPV 70-ого типа (HPV70), HPV 72-ого типа (HPV72), HPV 81-ого типа (HPV81), HPV 89-ого типа (HPV89) или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 30-ого типа (HPV30), HPV 34-ого типа (HPV34), HPV 55-ого типа (HPV55), HPV 62-ого типа (HPV62), HPV 64-ого типа (HPV64), HPV 67-ого типа (HPV67), HPV 69-ого типа (HPV69), HPV 71-ого типа (HPV71), HPV 73-ого типа (HPV73), HPV 74-ого типа (HPV74), HPV 83-ого типа (HPV83), HPV 84-ого типа (HPV84), HPV 85-ого типа (HPV85) или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) белок E1, E2 Е4, Е5, Е6, Е7, L1 и L2, полученный из HPV, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять или шесть) полипептид, выбранный из белка E1, E2, E4, Е5, Е6 и Е7, полученный из HPV, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид, выбранный из белка Е6 и Е7, полученного из HPV, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, выбранный из белка L1 или L2, полученного из HPV, или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HPV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HPV с инфицируемой клеткой.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HPV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HPV).

В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, возникающего и/или причинно связанного с инфекцией HPV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения инфекции HPV или по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией HPV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения риска развития рака шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала или ротоглотки у субъекта. В каждом из этих способов одна или более из композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HPV).

Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HPV, предоставляется лекарственное средство, содержащее иммуностимуляторный конструкт и одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HPV и/или на клетки субъекта, инфицированные HPV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HPV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HPV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HPV.

B. Вирус гепатита В (HBV)

В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу гепатита B (HBV). Вирус гепатита В (HBV) представляет собой вирус, содержащий двухцепочечную ДНК, принадлежащий к семейству Hepadnaviridae. При заражении людей HBV вызывает заболевание гепатитом B. Помимо того, что оно вызывает гепатит, заражение HBV может привести к развитию цирроза и гепатоцеллюлярной карциноме. Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса гепатита B (HBV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HBV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HBV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HBV у субъекта.

Геном HBV кодирует четыре перекрывающиеся открытые рамки считывания (то есть гены), обозначенные буквами S, C, P и X (Ganem et al., (2001) Fields Virology 4^th ed.; Hollinger et al., (2001) Fields Virology 4^th ed.). Ген S кодирует поверхностные белки вирусной оболочки, HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В), и может быть структурно и функционально разделен на области пре-S1, пре-S2 и S. Существует три формы HBsAG: малая (S), средняя (M) и большая (L). Коровый или С-ген имеет прекоровые и коровые области. Множество кодонов инициации трансляции в рамке считывания являются особенностью генов S и C, которые дают родственные, но функционально отличные белки. Ген C кодирует или вирусный нуклеокапсидный HBcAg, или E-aнтиген гепатита B (HBeAg) в зависимости от того, инициируется ли трансляция из коровых или прекоровых областей, соответственно. Коровый белок самостоятельно собирается в капсидоподобную структуру. Прекоровая ОРС кодирует сигнальный пептид, который направляет продукт трансляции в эндоплазматический ретикулум инфицированной клетки, где белок дополнительно процессируется с образованием секретируемого HBeAg. Функция HBeAg в значительной степени не охарактеризована, хотя он вовлечен в иммунную толерантность, функция которой заключается в обеспечении персистентной инфекции (Milich and Liang (2003) Hepatology 38:1075-1086. Полимераза (pol) представляет собой большой белок из приблизительно 800 аминокислот и кодируется ОРС P. Pol функционально разделена на три домена: концевой белковый домен, который участвует в капсидировании и инициации синтеза минус-цепи; домен обратной транскриптазы (ОТ), который катализирует синтез генома; и домен рибонуклеазы H, который разрушает предгеномную РНК и облегчает репликацию. ОРС X HBV кодирует белок длиной 16,5 кДа (HBxAg) с множеством функций, включая сигнальную трансдукцию, транскрипционную активацию, репарацию ДНК и ингибирование деградации белка (Cross et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:8078-8082; Bouchard and Schneider (2004) J Virol 78:12725-12734). Механизм этой активности и биологическая функция HBxAg в жизненном цикле вируса остаются в основном неизвестными. Однако хорошо известно, что HBxAg необходим для развития инфекции HBV in vivo и может способствовать онкогенному потенциалу HBV (Liang (2009) Hepatology 49 (Suppl S5):S13-S21).

Несмотря на наличие эффективной профилактической вакцины, более 240 миллионов человек остаются хронически инфицированными HBV, и более 500000 человек ежегодно умирают от заболеваний печени, вызванных хронической инфекцией (информационный бюллетень по гепатиту B FS204 Всемирной организации здравоохранения (2015)). Доступные в настоящее время варианты лечения инфекции HBV включают аналоги нуклеоз(т)идов и альфа-интерферон (ИФН-α). Однако эти способы лечения имеют несколько ограничений. Аналоги нуклеоз(т)идов эффективно подавляют репликацию вируса, но не устраняют инфекцию. После прекращения лечения аналогами нуклеоз(т)идов вирус быстро восстанавливается у инфицированного человека. Кроме того, длительное лечение противовирусными препаратами может привести к образованию устойчивых к лекарственным средствам мутантных вирусов. В отличие от аналогов нуклеоз(т)идов, ИФН-α, который обладает как противовирусной, так и иммуномодулирующей активностью, может давать более стойкие результаты у некоторых пациентов. Однако лечение ИФН-α часто ассоциируется с высокой частотой побочных эффектов, что делает его неоптимальным вариантом лечения. Таким образом, разработка новых эффективных способов лечения связанных с HBV инфекции и заболевания имеет важное значение. (Reynolds et al., (2015) J Virol 89(20):10407-10415).

Инфекция HBV и ее лечение обычно контролируются путем обнаружения вирусных антигенов и/или антител против антигенов. При заражении HBV первым обнаруживаемым антигеном является поверхностный антиген гепатита B (HBsAg), за которым следует антиген «e» гепатита B (HBeAg). Клиренс вируса выявляется появлением антител IgG в сыворотке против HBsAg и/или против корового антигена (HBcAg), также известный как сероконверсия. Многочисленные исследования демонстрируют, что на репликацию вируса, уровень виремии и прогрессирование до хронического состояния у HBV-инфицированных индивидуумов прямо и косвенно влияет HBV-специфический клеточный иммунитет, опосредованный CD4⁺хелперными (T_R) и CD8⁺цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Пациенты с прогрессирующим хроническим заболеванием имеют тенденцию иметь отсутствующие, более слабые или узко направленные HBV-специфические Т-клеточные ответы по сравнению с пациентами, которые устраняют острую инфекцию (см., например, Chisari, 1997, J Clin Invest 99: 1472- 1477; Maini et al, 1999, Gastroenterology 117: 1386-1396; Rehermann et al, 2005, Nat Rev Immunol 2005; 5:215-229; Thimme et al, 2001, J Virol 75: 3984-3987; Urbani et al, 2002, J Virol 76: 12423-12434; Wieland and Chisari, 2005, J Virol 79: 9369-9380; Webster et al, 2000, Hepatology 32: 1117-1124; Penna et al, 1996, J Clin Invest 98: 1185- 1194; Sprengers et al, 2006, J Hepatol 2006; 45: 182-189.)

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HBV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HBV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HBV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HBV выбирают из HBsAg (S, M или L), HBcAg, HBeAg, HBxAg, Pol и их комбинаций.

Основываясь на межгрупповой дивергенции между секвенированными геномами, HBV был классифицирован филогенетически на 9 генотипов, A-I, с предполагаемым 10-м генотипом, J, выделенным из одного индивидуума. Генотипы HBV дополнительно подразделяют на по меньшей мере 35 субгенотипов. Различия в генотипе влияют на степень тяжести заболевания, течение заболевания и вероятность осложнений, ответ на лечение и, возможно, ответ на вакцинацию (Kramvis et al., (2005), Vaccine 23 (19): 2409-2423; Magnius and Norder, (1995), Intervirology 38 (1-2): 24-34).

Генотип A HBV дополнительно подразделяют на субгенотипы A1, A2, A4 и квази-субгенотип A3, последняя группа последовательностей не соответствует критериям классификации субгенотипов. Генотип B HBV дополнительно подразделяют на 6 субгенотипов B1, B2, B4-B6 и квази-субгенотип B3. Генотип C HBV, самый старый генотип HBV, дополнительно подразделяют на 16 субгенотипов C1-C16, что отражает продолжительную эндемичность в популяции людей. Генотип D HBV дополнительно подразделяют на 6 субгенотипов D1-D6. Генотип F HBV дополнительно подразделяют на 4 субгенотипа F1-F4. Генотип I дополнительно подразделяют на 2 субгенотипа I1 и I2. Кроме того, HBV классифицировали по серологии на 4 основных серотипа adr, adw, ayr и ayw на основе антигенных эпитопов, присутствующих в белках оболочки HBV (Kramvis (2014) Intervirology 57:141-150).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HBV относится к генотипу A HBV (например, любому из субгенотипов A1-A4), генотипу B HBV (например, любому из субгенотипов B1-B6), генотипу C HBV (например, любому из субгенотипов C1-C16), генотипу D HBV (например, любому из субгенотипов D1-D6), генотипу E HBV, генотипу F HBV (например, любому из субгенотипов F1-F4), генотипу G HBV или генотипу I HBV (например, любому из субгенотипов I1-I2).

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HBV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HBV).

В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, возникающего и/или причинно связанного с инфекцией HBV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения инфекции HBV или по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией HBV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ уменьшения повреждения печени у субъекта. В каждом из этих способов одна или более из композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HBV).

Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HBV, предоставляется лекарственное средство, содержащее иммуностимуляторный конструкт и одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HBV и/или на клетки субъекта, инфицированные HBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HBV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HBV.

В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способен вызывать иммунный ответ на HBV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из HBsAg, HBcAg, HBeAg, HBxAg или Pol.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных и/или подтвержденных генотипов и/или субгенотипов HBV. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных или неопределенных генотипов или субгенотипов HBV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HBV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание вируса HBV с инфицируемой клеткой.

C. Вирус гепатита С (HCV)

В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу гепатита C (HCV). Вирус гепатита С (HCV) представляет собой малый вирус c оболочкой, содержащий положительно-полярную одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту, который вызывает гепатит С, вирусное инфекционное заболевание, поражающее в первую очередь печень. Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса гепатита С (HCV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HCV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HCV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HCV у субъекта.

РНК-геном HCV кодирует большой полипротеин из 3010 аминокислот, который совместно посттрансляционно процессируется протеазами и пептидазами, кодируемыми клетками и вирусами, для получения зрелых структурных и неструктурных (NS) белков. Структурные белки HCV включают коровый белок (альтернативно C или p22) и два гликопротеина оболочки E1 и E2 (альтернативно gp35 и gp70, соответственно). Неструктурные (NS) белки включают NS1 (альтернативно p7), NS2 (альтернативно p23), NS3 (альтернативно p70), NS4A (альтернативно p8), NS4B (альтернативно p27), NS5A (альтернативно p56/58) и NS5B (альтернативно p68) (Ashfaq et al., (2011) Virol J 8:161).

На основании филогенетического анализа и секвенирования всех геномов вируса, варианты HCV в настоящее время подразделены на 7 отдельных генотипов и более 80 подтвержденных и предварительных подтипов (Smith et al., (2014) Hepatology 59(1):318-327). Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) поддерживает и регулярно обновляет таблицы эталонных изолятов, подтвержденных и предварительных подтипов, неопределенных изолятов HCV, номеров доступа и аннотированных выравниваний (http://talk.ictvonline.org/links/hcv/hcv-classification.htm). Подтипы HCV 1a, 1b, 2a и 3a считаются «эпидемическими подтипами», которые распространены по всему миру и составляют значительную часть случаев инфекций HCV в странах с высоким уровнем дохода. Считается, что эти подтипы быстро распространились за годы до открытия передачи HCV через зараженную кровь, препараты крови, внутривенное употребление наркотиков и другие пути (Smith et al., (2005) J Gen Virol 78(Pt2):321-328; Pybus et al., (2005) Infect Genet Evol 5:131-139; Magiorkinis et al., (2009) PLoS Med 6:e1000198). Другие подтипы HCV, которые считаются «эндемичными» штаммами, являются сравнительно редкими и распространяются в течение более длительных периодов времени в более ограниченных регионах. Эндемичные штаммы генотипов 1 и 2 в основном локализованы в Западной Африке, 3 в Южной Азии, 4 в Центральной Африке и на Ближнем Востоке, 5 в Южной Африке и 6 в Юго-Восточной Азии. (Simmonds (2001) J Gen Virol 82:693:712; Pybus et al., (2009) J Virol 83:1071-1082). На сегодняшний день зарегистрировано только одно заражение генотипом 7 (Murphy et al., (2007) J Clin Microbiol 45:1102-1112).

HCV естественным образом заражает только людей, хотя было показано, что шимпанзе подвержены экспериментальному заражению (Pfaender et al., (2014) Emerg Microbes Infect 3:e21). Хроническая вирусная инфекция, вызванная HCV, является основной причиной цирроза, заболеваний печени, портальной гипертензии, ухудшения функции печени и рака (например, гепатоцеллюлярная карцинома, ГЦК). (Webster et al., (2015) Lancet 385(9973):1124-1135). По оценкам, более 160-170 миллионов человек во всем мире страдают гепатитом С, что в конечном итоге приводит к смерти около 350000 человек в год (Zaltron et al., (2012) BMC Infect Dis 12(Suppl 2):S2; Lavanchy (2011) Clin Microbiol Infect 17:107-115). Во всем мире примерно четверть всех случаев цирроза и ГЦК связана с инфекцией HCV. Однако в областях с высокой эндемичностью HCV обычно составляет более 50% случаев ГЦК и цирроза печени (Perz et al., (2006) J Hepatol 45(4):529-538). Хронически инфицированные люди имеют более низкое качество жизни по сравнению с населением в целом (Bezemer et al., (2012) BMC Gastroenterol 12:11).

Переливание крови и компонентов крови ранее было основным путем передачи HCV до внедрения универсального скрининга (Zou et al., (2010) Transfusion 50(7):1495-1504). В настоящее время чрескожная передача посредством внутривенного употребления наркотиков является основным путем передачи в развитых странах (Cornberg et al., (2011) Liver Int 31(Suppl 2):30-60; Nelson et al., (2011) Lancet 378(9791:571-583). Социальные услуги, такие как программы обмена игл и шприцев (NSP) и опиоидная заместительная терапия (OST), могут эффективно снизить передачу HCV среди людей, употребляющих инъекционные наркотики (PWID), но этих подходов может быть недостаточно для снижения распространенности HCV до низких уровней (Turner et al., (2011) Addiction 106(11)1978-1988; Vikermann et al., (2012) Addiction 107(11):1984-1995). Совсем недавно были разработаны и использованы высокоэффективные противовирусные препараты прямого действия (DAA) для лечения инфекций HCV (например, боцепревир, телапревир, симепревир, софосбувир, ледипасвир, омбитасвир, паритапревир, ритонавир, дасабувир, даклатасвир, элбасвир, гразопревир, велпатасвир). Поскольку DAA может приводить к устойчивому вирусологическому ответу (УВО, альтернативно «вирусное излечение») у многих пациентов, эти препараты демонстрируют потенциал для подхода «лечение как профилактика» для снижения распространенности HCV (Smith-Palmer et al., (2015) BMC Infect Dis 15:19). Тем не менее, высокие финансовые затраты и проблемы, связанные с решениями о возмещении убытков, в отношении этих методов лечения, в настоящее время ограничивают их широкое применение (Martin et al., (2011) J Hepatol 54(6):1137-1144; Martin et al., (2012) Hepatology 55(1):49-57; Brennan and Shrank (2014) JAMA 312(6):593-594).

Вакцинация против HCV является альтернативной стратегией лечения и/или профилактики для снижения распространенности HCV. Ранние исследования вакцины против HCV у экспериментально инфицированных шимпанзе показали, что субъединичная вакцина, состоящая из гликопротеинов вирусной оболочки E1 (gp35) и E2 (gp72), выявила высокую эффективность гуморального ответа, которая эффективно контролировала и облегчала клиренс гомологичного вируса генотипа 1a HCV (Choo et al., (1994) Proc Nat Acad Sci USA 91(4):1294-1298). Исследования Фазы I, проведенные на людях, продемонстрировали, что вакцина, содержащая гликопротеины E1 и E2, вызывает широко реактивные нейтрализующие антитела (Law et al., (2013) PLoS ONE 8(3):e59776). Альтернативный подход к вакцинации, разработанный для генерации Т-клеточных ответов против HCV, также был протестирован в исследованиях Фазы 1 с участием людей и продемонстрировал высокую иммуногенность (Barnes et al., (2012) Sci Trans Med 4(115):115ra1). Эти исследования продемонстрировали, что как гуморальные, опосредованные антителами иммунные ответы, так и/или адаптивные, опосредованные Т-клетками ответы являются многообещающими подходами для разработки профилактической и/или терапевтической вакцины против HCV.

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HCV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HCV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HCV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HCV выбирают из корового белка (C, p22), E1 (gp35), E2 (gp70), NS1 (p7), NS2 (p23), NS3 (p70), NS4A (p8), NS4B (p27), NS5A (p56/58), NS5B (p68) и их комбинации.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HCV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HCV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HCV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HCV и/или на клетки субъекта, инфицированные HCV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HCV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HCV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HCV.

В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способный вызывать иммунный ответ на HCV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из корового белка (C, p22), E1 (gp35), E2 (gp70), NS1 (p7), NS2 (p23), NS3 (p70), NS4A (p8), NS4B (p27), NS5A (p56/58), NS5B (p68) и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из подтвержденных генотипов и/или подтипов HCV 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1g, 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 1n, 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 2q, 2r, 2t, 2u, 3, 3a, 3b, 3d, 3e, 3g, 3h, 3i, 3k, 4, 4a, 4b, 4c, 4d, 4f, 4g, 4k, 4l, 4m, 4n, 4o, 4p, 4q, 4r, 4s, 4t, 4v, 4w, 5, 5a, 6, 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6f, 6g, 6h, 6i, 6j, 6k, 6l, 6m, 6n, 6o, 6p, 6q, 6r, 6s, 6t, 6u, 6v, 6w, 6xa, 6xb, 6xc, 6xd, 6xe, 7 или 7a. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных генотипов и/или подтипов HCV 1f, 2g, 2h, 2n, 2o, 2p, 2s, 3c, 3f, 4e, 4h, 4i или 4j. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных или неопределенных изолятов HCV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HCV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HCV с инфицируемой клеткой.

D. Вирус Эпштейна-Барр (EBV)

В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу Эпштейна-Барр (EBV). Вирус Эпштейна-Барр (EBV), альтернативно вирус герпеса человека 4 типа (HHV-4), является этиологическим агентом инфекционного мононуклеоза и связан с большим количеством доброкачественных и злокачественных заболеваний, включая несколько видов рака человека (например, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, рак молочной железы, гепатоцеллюлярные карциномы, рак желудочно-кишечного тракта/желудка, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), лимфома центральной нервной системы (ЦНС), рак носоглотки, рассеянный склероз, EBV-ассоциированные лимфомы, волосистая лейкоплакия полости рта, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, СПИД-ассоциированная лимфома) (Jha et al., (2016) Front Microbiol 7(1602) и ссылки в ней). EBV является чрезвычайно распространенным вирусом, инфицирующим>95% взрослого населения мира (Cohen (2000) N Engl J Med 343:481-492). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса Эпштейна-Барр (EBV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из EBV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена EBV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) EBV у субъекта.

Геном EBV представляет собой молекулу линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) длиной примерно 172 т.п.н. Геном EBV обладает кодирующим потенциалом для примерно 80 вирусных белков, многие из которых остаются не охарактеризованными. Характерные гены EBV, включая соответствующие им генные продукты и предполагаемую функцию, если они известны, включают BKRF1 (EBNA1) [поддержание плазмиды, репликация ДНК, регуляция транскрипции], BYRF1 (EBNA2) [транс-активация], BLRF3/BERF1 (EBNA3A, альтернативно EBNA3) [регуляция транскрипции], BERF2a/b (EBNA3B, альтернативно EBNA4), BERF3/4 (EBNA3C, альтернативно EBNA6) [регуляция транскрипции], BWRF1 (EBNA-LP, альтернативно EBNA5) [транс-активация], BNLF1 (LMP1) [В-клеточная выживаемость, антиапоптоз], BNRF1 (LMP2A/B, альтернативно TP1/2) [поддержание латентности], BARF0 (A73, RPMS1), EBER1/2 (малые РНК) [регуляция врожденного иммунитета], BZLF1 (ZEBRA/Zta/EB1) [транс-активация, инициация литического цикла], BRLF1 [транс-активация, инициация литического цикла], BILF4 [транс-активация, инициация литического цикла], BMRF1 [транс-активация], BALF2 [связывание ДНК], BALF5 [ДНК-полимераза], BORF2 [субъединица рибонуклеотидредуктазы], BARF1 [субъединица рибонуклеотидредуктазы], BXLF1 [тимидинкиназа], BGLF5 [щелочная экзонуклеаза], BSLF1 [праймаза], BBLF4 [хеликаза], BKRF3 [урацил-ДНК-гликозилаза], BLLF1 (gp350/220) [главный гликопротеин оболочки], BXLF2 (gp85, альтернативно gH) [слияние оболочки вируса-хозяина], BKRF2 (gp25, альтернативно gL) [слияние оболочки вируса-хозяина], BZLF2 (gp42) [слияние оболочки вируса-хозяина, связывает ГКГС класса II], BALF4 (gp110, альтернативно gB), BDLF3 (gp100-150), BILF2 (gp55-78), BCRF1 [вирусный интерлейкин-10], и BHRF1 [вирусный аналог bcl-2] (Liebowitz and Kieff (1993) Epstein-Barr virus. In: The Human Herpesvirus. Roizman B, Whitley RJ, Lopez C, editors, New York, pp.107-172; Li et al., (1995) J Virol 69:3987-3994; Nolan and Morgan (1995) J Gen Virol 76:1381-1392; Thompson and Kurzrock (2004) Clin Cancer Res 10:803-821; Young and Murray (2003) Oncogene 22:5108-5121).

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена EBV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена EBV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на EBV). Любой из вышеупомянутых белков EBV можно использовать в качестве антигенного полипептида EBV. Иммуногенные белки EBV и их эпитопы были описаны в данной области техники (например, Rajcani J. et al. (2014) Recent Pat. Antiinfect. Drug Discover. 9:62-76). В некоторых вариантах осуществления антигенный полипептид EBV выбирают из группы, состоящей из BLLF1 (gp350/220), BZLF1/Zta, EBNA2, EBNA3, EBNA6, LMP1, LMP2A и их комбинаций.

Известно, что два основных типа EBV заражают людей: EBV-1 и EBV-2 (альтернативно известные как типы A и B или как штамм B95-8 и штамм AG876, соответственно). Два типа EBV различаются по последовательности генов, которые кодируют ядерные антигены EBV EBNA-2, EBNA-3A/3, EBNA-3B/4, и EBNA-3C/6 (Sample et al., (1990) J Virol 64:4084-4092; Dambaugh et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:7632-7636). В пределах двух основных типов EBV наблюдается значительное разнообразие штаммов EBV, выделенных из клинических образцов, что может играть роль в типе и степени тяжести заболевания. Первая полная последовательность генома EBV, B95-8, была опубликована в 1984 году (Baer et al., (1984) Nature 310:207-211). Сообщалось о последовательностях генома 22 дополнительных EBV (AG876, GD1, GD2, HKNPC1, Akata, Mutu, C666-1, M81, Raji, K4123-Mi и K4413-Mi), а также восьми последовательностей EBV, полученных из клинических образцов карциномы носоглотки, и три генома EBV, полученные в рамках проекта «1000 геномов» (Tsai et al., (2013) Cell Rep 5:458-470; Dolan et al., (2006) Virology 350-164-170; Palser et al., (2015) J Virol 89(10):5222-5237, а также приведенные там ссылки). В недавнем отчете были проанализированы геномные последовательности 71 нового генома EBV, включая первый геном EBV, секвенированный непосредственно из слюны. Эти новые геномные последовательности EBV были проанализированы в комбинации с 12 ранее опубликованными штаммами. Данный анализ продемонстрировал, что установленная генетическая карта генома EBV (NC_007605) является репрезентативной для изолятов EBV из разных географических мест и разных типов инфекции. Общепринятая классификация EBV типа 1 и типа 2 была пересмотрена в этом исследовании, и было установлено, что она остается основной формой вариации, в основном объясняемой вариациями в EBNA2 и EBNA3A, -B и -C (Palser et al., (2015) J Virol 89(10):5222-5237).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид EBV относится к EBV-1 или EBV-2.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции EBV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид EBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения EBV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию EBV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид EBV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на EBV и/или на клетки субъекта, инфицированные EBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса EBV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-EBV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные EBV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид EBV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание EBV с инфицируемой клеткой.

E. Т-лимфотропный вирус человека типа 1 (HTLV-1)

В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к Т-лимфотропному вирусу человека типа 1 (HTLV-1). Человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа 1 (HTLV-1, альтернативно Т-лимфотропный вирус человека или вирус Т-клеточной лимфомы человека) представляет собой ретровирус, способный вызывать персистентную инфекцию у людей. HTLV-1 инфицирует около 10-20 миллионов человек во всем мире, и хотя у большинства людей инфекция протекает бессимптомно, у 3% - 5% инфицированных людей развивается очень злокачественная и терапевтически некурабельная Т-клеточная лейкемия/лимфома взрослых (ATL) (Gessain et al., (2012) Front Microbiol 3:388; Taylor et al., (2005) Oncogene 24:6047-6057). Инфекция HTLV также причинно связана с несколькими воспалительными и иммуноопосредованными расстройствами, в первую очередь с HTLV-ассоциированной миелопатией/тропическим спастическим парапарезом (HAM/TSP). Приблизительно у 0,25% -3,8% людей, инфицированных HTLV-1, развивается HAM/TSP (Yamano and Sato (2012) Front Microbiol 3:389). Передача HTLV-1 человеком требует переноса инфицированных вирусом клеток посредством грудного вскармливания, полового акта, переливания компонентов крови, содержащих клетки, и совместного использования игл и/или шприцев (например, внутривенное употребление наркотиков). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов человеческого лимфотропного Т-клеточного вируса типа 1 (HTLV-1). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HTLV-1 может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HTLV-1 могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HTLV-1 у субъекта.

HTLV-1 представляет собой сложный ретровирус; в дополнение к стандартному репертуару структурных белков и ферментов, общих для всех ретровирусов (gag, pol, pro и env), 3'-область генома HTLV-1 (альтернативно называемой областью pX) кодирует вспомогательные гены tax, rex, p12, p21, p13, p30 и HBZ. Tax и HBZ незаменимы в онкогенном процессе ATL (Giam and Semmes (2016) Viruses 8(6):161). Подобно другим ретровирусам, после передачи вирусная обратная транскриптаза генерирует провирусную ДНК из геномной РНК вируса. Провирус интегрируется в геном хозяина с помощью вирусной интегразы. Впоследствии считается, что инфекция HTLV-1 распространяется только через делящиеся клетки с минимальным образованием частиц. Количественное определение провируса отражает количество клеток, инфицированных вирусом HTLV-1, что определяет провирусную нагрузку (Concalves et al., (2010) Clin Microbiol Rev 23(3):577-589).

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HTLV-1 в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HTLV-1 или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HTLV-1). В некоторых вариантах осуществления антигенный полипептид HTLV-1 выбирают из группы, состоящей из gag, pol, pro, env, tax, rex, p12, p21, p13, p30, HBZ, и их комбинаций.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HTLV-1 у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HTLV-1 или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HTLV-1). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HTLV-1, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид HTLV-1 или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HTLV-1 и/или на клетки субъекта, инфицированные HTLV-1. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HTLV-1 и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HTLV-1 антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HTLV-1.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HTLV-1.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HTLV-1 с инфицируемой клеткой.

F. Герпесвирус саркомы Капоши (KSHV)

В другом варианте осуществления онковирусный антиген относится к герпесвирусу саркомы Капоши (KSHV). Герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши (KSHV; альтернативно, человеческий герпесвирус-8, HHV-8) представляет собой γ-герпесвирус, содержащий двухцепочечную ДНК, принадлежащий роду Rhadinovirus из семейства Herpesviridae. KSHV является этиологическим агентом всех форм саркомы Капоши, рака, обычно встречающегося у пациентов со СПИДом, и причинно связан с первичной выпотной лимфомой (PEL; альтернативно лимфома полостей тела, BCBL), некоторыми типами многоочаговой болезни Кастлемана (MCD); альтернативно плазмобластной лимфомой, связанной с многоочаговой болезнью Кастлемана (MCD), и воспалительным цитокиновым синдромом, вызванным KSHV (KICS) (Chang et al., (1994) Science 266:1865-1869; Dupin et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:4546-4551; Boshoff & Weiss (2002) Nat Rev Cancer 2(5):373-382; Yarchoan et al., (2005) Nat Clin Pract Oncol 2(8):406-415; Cesarman et al., (1995) N Engl J Med 332(18):1186-1191; Staudt et al., (2004) Cancer Res 64(14):4790-4799; Soulier et al., (1995) Blood 86:1276-1280; Uldrick et al., (2010) Clin Infect Dis 51:350-358)). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов герпесвируса саркомы Капоши (KSHV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из KSHV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена KSHV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) KSHV у субъекта.

Геном KSHV содержит молекулу дцДНК размером приблизительно 165 т.п.н. и демонстрирует высокую степень идентичности последовательностей среди вирусных штаммов и изолятов. Две основные области гена, K1/VIP (вариабельный иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив, кодируемый 5'-концом генома KSHV) и K15/LAMP (мембранный белок, ассоциированный с латентностью, кодируемый 3'-концом генома KSHV), расположенные на концевых областях вирусного генома, сильно изменчивы по сравнению с центральной геномной областью (Zong et al., (1999) J Virol 73:4156-4170; Poole et al., (1999) 73:6646-6660).

Изменчивость последовательности гена K1 привела к определению пяти основных подтипов KSHV (A, B, C, D и E), демонстрируя до 35% вариабельности на уровне аминокислот по вирусным штаммам. Секвенирование гена K15 привело к дополнительному разделению последовательностей KSHV с вариантами, обозначенными как аллели P, M или N, различающимися на уровне аминокислот до 70% (Hayward & Zong (2007) Curr Top Microbiol Immunol 312:1-42). Девять других вирусных геномных локусов (приблизительно 5,6% генома) содержат дополнительную вариабельность (T0,7/K12, K2, K3, ORF18/19, ORF26, K8, ORF73), а также два локуса в пределах областей гена ORF75, в пределах центральной, более консервативной области генома KSHV. На основании вариабельности K1/K15, классификации штаммов и вариабельности девяти ОРF известные геномы KSHV в настоящее время подразделены на 12 основных генотипов (Strahan et al., (2016) Viruses 8(4):92).

По существу, все случаи саркомы Капоши характеризуются KSHV, а для онкогенеза требуется постоянное присутствие KSHV. Геном KSHV обладает кодирующим потенциалом примерно для 90 белков, многие из которых, как известно, опосредуют репликацию вируса, взаимодействия вирус-хозяин, онкогенез, и подавление иммунного ответа и ускользание от иммунологического надзора (Dittmer & Damania (2013) Curr Opin Virol 3:238-244), и которые могут считаться потенциальными терапевтическими целями. Характерные гены KSHV, включая соответствующие им генные продукты и/или предполагаемую функцию, если они известны, включают ORFK1 (гликопротеин; сигнальный белок ITAM KSHV, KIS), ORF4 (контрольный белок комплемента Капоши, KCP; капошица), ORF6 (оцДНК-связывающий белок), ORF11 (дУТФаза-связанный белок, DURP), ORFK2 (вирусный гомолог интерлейкина-6, vIL6), ORF70 (тимидилатсинтаза), ORFK4 (vCCL-2, vMIP-II, MIP-1b), ORFK4.1 (vCCL-3, vMIP-III, BCK), ORFK5 (модулятор иммунного ответа 2, MIR-2; E3 убиквитинлигаза), ORFK6 (vCCL-1, vMIP-I, MIP-1a), PAN (экспрессия позднего гена), ORF16 (vBCL2, гомолог Bcl2), ORF17.5 (каркасный белок или белок сборки, SCAF), ORF18 (регуляция позднего гена), ORF34 (связывается с HIF-1α), ORF35 (требуется для эффективной реактивации литического вируса), ORF36 (вирусная серин/треонин-специфическая протеинкиназа), ORF37 (sox), ORF38 (белок суперкапсида), ORF39 (гликопротеин M, gM), ORF45 (белок суперкапсида; активатор RSK), ORF46 (урацил-дегликозилаза), ORF47 (гликопротеин L, gL), ORF50 (RTA), ORFK8 (k-bZIP; белок, ассоциированный с репликацией, RAP), ORF57 (экспорт/сплайсинг мРНК), ORF58, ORF59 (фактор процессивности), ORF60 (рибонуклеопротеинредуктаза), ORF61 (рибонуклеопротеинредуктаза), ORFK12 (капошин), ORF71 (vFLIP, ORFK13), ORF72 (vCyclin, vCYC), ORF73 (латентный ассоциированный ядерный антиген 1, LANA1), ORF8 (гликопротеин B, gB), ORF9 (ДНК-полимераза), ORF10 (регулятор функции интерферона), ORFK3 (модулятор иммунного ответа 1, MIR-1; E3 убиквитинлигаза), K5/6-AS, ORF17 (протеаза), ORF21 (тимидинкиназа), ORF22 (гликопротеин H, gH), ORF23 (спрогнозированный гликопротеин), ORF24 (важный для репликации), ORF25 (главный белок капсида, MCP), ORF26 (минорный белок капсида; триплексный компонент 2, TRI-2), ORF27 (гликопротеин), ORF28 (гомолог BDLF3 EBV), ORF29 (упаковка белка), ORF30 (регуляция позднего гена), ORF31 (ядерный и цитоплазматический), ORF32 (белок суперкапсида), ORF33 (белок суперкапсида), ORF40/41 (геликаза-праймаза), ORF42 (белок суперкапсида), ORF43 (портальный белок капсида), ORF44 (геликаза), ORF45.1, ORFK8.1A (гликопротеин, gp8.1A), ORFK8.1B (гликопротеин gp8.1B, ORF52 (белок суперкапсида), ORF53 (гликопротеин N, gN), ORF54 (дУТФаза/иммуномодулирующий), ORF55 (белок суперкапсида), ORF56 (репликация ДНК), ORFK9 (vIRF1), ORFK10 (vIRF4), ORFK10.5 (vIRF3, LANA2), ORFK11 (vIRF2), ORF62 (триплексный компонент 1, TRI-1), ORF65 (малый белок капсида; малый капсомер-взаимодействующий белок, SCIP), ORF66 (капсид), ORF67 (ядерный эгрессивный комплекс), ORF67.5, ORF68 (гликопротеин), ORF69 (ядерный эгрессивный BRLF2), ORFK14 (vOX2), ORF74 (vGPCR), ORF75 (FGARAT), ORF2 (дигидрофолатредуктаза), ORF7 (вирионный белок, vGPCR), ORF48, ORF49 (активирует JNK/p38), ORF63 (гомолог NLR), ORF64 (деубиквитиназа), ORFK15 (LMP1/2), и ORFK7 (вирусный ингибитор апоптоза, vIAP).

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена KSHV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена KSHV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на KSHV). Любой из вышеупомянутых белков KSHV можно использовать в качестве антигенного полипептида KSHV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид KSHV относится к подтипу A KSHV, подтипу B KSHV, подтипу C KSHV, подтипу D KSHV или подтипу E KSHV.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции KSHV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид KSHV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения KSHV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию KSHV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид KSHV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на KSHV и/или на клетки субъекта, инфицированные KSHV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса KSHV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-KSHV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные KSHV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид KSHV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание KSHV с инфицируемой клеткой.

G. Полиомавирус клеток Меркеля (MCPyV)

В другом варианте осуществления онковирусный антиген относится к полиомавирусу клеток Меркеля (MCPyV). Полиомавирус клеток Меркеля (MCPyV) представляет собой, вирус без оболочки, содержащий двухцепочечную ДНК, из семейства Polyomaviridae и является этиологическим агентом карциномы из клеток Меркеля (MCC). MCC является редкой, но агрессивной формой рака кожи, связанной с пожилым возрастом, чрезмерным воздействием ультрафиолетового излучения, иммунодефицитными состояниями и наличием MCPyV. Приблизительно 1500 новых случаев MCC диагностируется в год в США, что представляет собой относительно редкий рак; однако, заболеваемость МСС за последние два десятилетия утроилась, и количество диагнозов продолжают увеличиваться на 5-10% ежегодно. Несмотря на свою редкость, MCC является одним из самых смертельных и агрессивных онкологических заболеваний кожи со смертностью более 30% (Agelli and Clegg (2003) J Am Acad Dermatol 49:832-841; Becker et al., (2009) Cell Mol Life Sci 66:1-8; Calder and Smoller (2010) Adv Anat Pathol 17:155-161; Hodgson, (2005) J Sur Oncol 89:1-4; Lemos and Nghiem, (2007) J Invest Dermatol 127:2100-2103). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов полиомавируса клеток Меркеля (MCPyV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из MCPyV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена MCPyV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) MCPyV у субъекта.

MCC возникает из злокачественной трансформации клеток Меркеля (альтернативно клеток Меркеля-Ранвье или осязательных эпителиоцитов), которые являются механорецепторными клетками, участвующими в восприятии прикосновения и/или тактильном ощущении (Woo et al., (2016) Trends Cell Biol 25(2):74-81). MCPyV присутствует в 80% - 85% клинических образцов опухолей MCC (Feng et al., (2008) Science 319:1096-1100; Dalianis and Hirsch (2013) Virology 437:63-72, а также приведенные в них ссылки). MCPyV считается единственным полиомавирусом человека на сегодняшний день, вызывающим опухоли у его естественного хозяина (Arora et al., (2012) Curr. Opin. Virol 2:489-498; Spurgeon and Lambert (2013) Virology 435:118-130).

Вирусная ДНК MCPyV клонально интегрирована в 80%-85% опухолей MCC. Геном прототипного вируса (MCV350) представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, содержащую 5387 пар оснований. Секвенированные геномы всех штаммов MCPyV составляли в среднем ~ 5,4 тысяч пар нуклеотидов. Геном MCPyV содержит раннюю и позднюю кодирующие области, экспрессируемые в двух направлениях и разделенные некодирующей регуляторной областью, которая содержит точку начала репликации вируса. Ранняя область MCPyV (альтернативно «Т-антигенный локус») имеет размер приблизительно 3 т.п.н. и кодирует гены, которые экспрессируются первыми при заражении (Feng et al., (2011) PLoS ONE 6:e22468; Feng et al., (2008) Science 319:1096-1100; Neumann et al., (2011) PLoS ONE 6:e29112). Ранняя область MCPyV экспрессирует три T-антигена (белка): большой T-антиген (LT), малый T-антиген (sT) и T-антиген массой 57 кДа (57kT) (Shuda et al., (2009) Int J Cancer 125 (6):1243-9; Shuda et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105 (42):16272-7). В дополнение к трем Т-антигенам локус раннего гена MCPyV также кодирует четвертый белок, альтернативную открытую рамку считывания Т-антигена (ALTO). ALTO транскрибируется из 200-аминокислотной области MUR LT и, по-видимому, эволюционно связан со средним T-антигеном мышиного полиомавируса (Carter et al., (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110:12744-12749).

Область позднего гена MCPyV кодирует открытые рамки считывания для основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), и минорных капсидных белков 2 и 3 (VP2 и VP3). Геном MCPyV экспрессирует 22-нуклеотидную вирусную миРНК (MCV-miR-M1-5p) из поздней цепи, которая, скорее всего, автоматически регулирует экспрессию ранних вирусных генов во время поздней фазы инфекции (Lee et al., (2011) J Clin Virol 52(3):272-5; Seo et al., (2009) Virology 383(2):183-7). Исследования подтверждают, что конститутивная экспрессия вирусных Т-антигенов необходима для вирус-индуцированной трансформации (Spurgeon and Lambert (2013) Virology 435 (1): 118-130, а также приведенные в них ссылки).

В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена MCPyV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена MCPyV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на MCPyV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент выбирают из большого T-антигена (LT), малого T-антигена (sT), Т-антигена массой 57 кДа (57kT), альтернативного T-антигена (ALTO), основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), минорных капсидных вирусных белков 2 или 3 (VP2 или VP3) и их комбинаций.

Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции MCPyV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения MCPyV).

В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, вызванного и/или причинно связанного с инфекцией MCPyV, при этом одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения MCPyV).

Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию MCPyV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на MCPyV и/или на клетки субъекта, инфицированные MCPyV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса MCPyV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-MCPyV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные MCPyV.

В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способен вызывать иммунный ответ на MCPyV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из большого T-антигена (LT), малого T-антигена (sT), T-антигена массой 57 кДа (57kT), альтернативного T-антигена (ALTO), основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), минорных капсидных вирусных белков 2 или 3 (VP2 или VP3) и их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных и/или подтвержденных генотипов и/или подтипов MCPyV (например, см. Martel-Jantin et al., (2014) J Clin Microbiol 52(5):1687-1690; Hashida et al., 2014 J. Gen. Virol. 95:135-141; Matsushita et al., (2014) Virus Genes 48:233-242; Baez et al., (2016) Virus Res 221:1-7, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки).. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из неопределенных изолятов MCPyV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид MCPyV.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание вируса MCPyV с инфицируемой клеткой.

Персонализированные противораковые вакцины

В некоторых аспектах данное раскрытие обеспечивает персонализированную противораковую вакцину, содержащую один или более конструктов мРНК, причем один или более конструктов мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ (то есть иммуностимулятор) на представляющий интерес раковый антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес раковый антиген кодируется или тем же самым, или отдельным конструктом мРНК. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес раковый антиген является специфическим для субъекта. Например, представляющий интерес раковый антиген (например, выбранный и/или сконструированный, как описано ниже) может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК ракового антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена(ов) у субъекта. В данном документе описаны подходящие раковые антигены, включая персонализированные антигены, специфические для субъекта, страдающего раком, для применения с иммуностимуляторами.

Например, вакцина может включать мРНК, кодирующую один или более раковых антигенов, специфических для каждого субъекта, называемых неоэпитопами. Антигены, которые экспрессируются в опухолевых клетках или опухолевыми клетками, называются «опухолеассоциированными антигенами». Конкретный опухолеассоциированный антиген может или не может также экспрессироваться в нераковых клетках. Многие опухолевые мутации хорошо известны в данной области техники. Опухолеассоциированные антигены, которые не экспрессируются или редко экспрессируются в нераковых клетках или экспрессия которых в нераковых клетках достаточно снижена по сравнению с экспрессией в раковых клетках и которые вызывают иммунный ответ, индуцированный при вакцинации, называются неоэпитопами. Неоэпитопы являются полностью чужеродными для организма и, следовательно, не вызывают иммунного ответа против здоровых тканей и не маскируются защитными компонентами иммунной системы. В некоторых воплощениях желательны персонализированные вакцины на основе неоэпитопов, поскольку такие вакцинные композиции будут максимизировать специфичность в отношении конкретной опухоли пациента. Неоэпитопы, происходящие из мутаций, могут возникать в результате точечных мутаций, несинонимичных мутаций, приводящих к различным аминокислотам в белке; мутаций с прочитанным терминатором, в которых стоп-кодон модифицирован или удален, что приводит к трансляции более длинного белка с новой опухолеспецифической последовательностью на С-конце; мутаций сайта сплайсинга, которые приводят к включению интрона в зрелую мРНК и, таким образом, к уникальной опухолеспецифической последовательности белка; хромосомных перестроек, которые приводят к образованию химерного белка с опухолеспецифическими последовательностями на стыке 2 белков (например, слияние генов); мутаций или делеций со сдвигом рамки считывания, которые приводят к новой открытой рамке считывания с новой опухолеспецифической белковой последовательностью; и транслокаций.

Способы создания персонализированных противораковых вакцин обычно включают идентификацию мутаций, например, с использованием методов глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков, идентификации неоэпитопов, например, с использованием утвержденных алгоритмов прогнозирования связывания пептид-ГКГС или других аналитических методов для создания набора кандидатных T-клеточных эпитопов, которые могут связываться с аллелями HLA пациента и основаны на мутациях, присутствующих в опухолях, необязательной демонстрации антигенспецифических Т-клеток против выбранных неоэпитопов или демонстрации того, что кандидат-неоэпитоп связан с белками HLA на поверхности опухоли, и разработку вакцины.

Примеры методов идентификации мутаций включают, но не ограничиваются ими, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), микропланшетный диагональный электрофорез в геле (MADGE), пиросеквенирование, олигонуклеотид-специфическое лигирование, систему TaqMan, а также различные технологии ДНК-чипов, т.е. чипы Affymetrix SNP и методы, основанные на генерации малых сигнальных молекул путем инвазивного расщепления с последующей масс-спектрометрией или иммобилизацией замыкающими кольцо зондами и амплификацией по типу катящегося кольца.

Методы глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков известны в данной области техники. Можно использовать любой метод секвенирования. Например, секвенирование нуклеиновой кислоты может быть выполнено для целых опухолевых геномов, опухолевых экзомов (ДНК, кодирующая белок) или опухолевых транскриптомов. Технологии одномолекулярного секвенирования в реальном времени путем синтеза основана на обнаружении флуоресцентных нуклеотидов, так как они включены в растущую цепь ДНК, которая дополняет секвенируемую матрицу. Существуют и другие методы быстрого высокопроизводительного секвенирования. Секвенирование белков может быть выполнено на опухолевых протеомах. Кроме того, масс-спектрометрия белков может быть использована для идентификации или подтверждения наличия мутированных пептидов, связанных с белками ГКГС, на опухолевых клетках. Пептиды могут быть элюированы кислотой из опухолевых клеток или из молекул HLA, которые иммунопреципитируют из опухоли, а затем идентифицируют с использованием масс-спектрометрии. Результаты секвенирования можно сравнить с известными контрольными наборами или с секвенированием, выполненным для нормальной ткани пациента.

В некоторых вариантах осуществления эти неоэпитопы связываются с белками HLA класса I с большей аффинностью, чем пептид дикого типа, и/или способны активировать противоопухолевые CD8 Т-клетки. Идентичные мутации в любом конкретном гене редко обнаруживаются в опухолях.

Белки ГКГС класса I присутствуют на поверхности практически всех клеток организма, включая большинство опухолевых клеток. Белки ГКГС класса I нагружены антигенами, которые обычно происходят из эндогенных белков или из патогенов, присутствующих в клетках, и затем представляются цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ). Т-клеточные рецепторы способны распознавать и связывать пептиды, образующие комплексы с молекулами ГКГС класса I. Каждый цитотоксический Т-лимфоцит экспрессирует уникальный Т-клеточный рецептор, который способен связывать специфические комплексы ГКГС/пептид.

Используя компьютерные алгоритмы, можно прогнозировать потенциальные неоэпитопы, такие как Т-клеточные эпитопы, то есть пептидные последовательности, которые связаны молекулами ГКГС класса I или класса II в форме пептид-презентирующего комплекса, и затем, в этой форме распознаются Т-клеточными рецепторами Т-лимфоцитов. Примеры программ, полезных для идентификации пептидов, которые будут связываться с ГКГС, включают, например: Lonza Epibase, SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) и HLA_BIND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175).

Как только предполагаемые неоэпитопы выбраны, они могут быть дополнительно протестированы с использованием анализов in vitro и/или in vivo. Стандартные лабораторные анализы in vitro, такие как анализы методом иммуноферментных пятен, могут использоваться с изолятом от каждого пациента, чтобы уточнить перечень неоэпитопов, выбранных на основе алгоритма прогнозирования.

В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают эпитопы или антигены, основанные на специфических мутациях (неоэпитопах) и экспрессируемых генами зародышевой линии рака (антигены, общие для опухолей, обнаруженных у множества пациентов, называемые в данном документе «традиционными раковыми антигенами» или «общими раковыми антигенами»). В некоторых вариантах осуществления традиционный антиген представляет собой тот, который, как известно, обнаруживается при онкологических заболеваниях или опухолях вообще, или при конкретном типе рака или опухоли. В некоторых вариантах осуществления традиционный раковый антиген представляет собой немутированный опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления традиционный раковый антиген представляет собой мутированный опухолевый антиген.

В некоторых вариантах осуществления вакцины могут дополнительно содержать мРНК, кодирующую один или более немутированных опухолевых антигенов. В некоторых вариантах осуществления вакцины могут дополнительно содержать мРНК, кодирующую один или более мутированных опухолевых антигенов.

Многие опухолевые антигены известны в данной области техники. В некоторых вариантах раковый или опухолевый антиген является одним из следующих антигенов: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79, CD137, 4- IBB, 5T4, AGS-5, AGS-16, ангиопоэтин 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, раково-эмбриональный антиген, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, фибронектин, рецептор фолиевой кислоты, ганглиозид GM3, GD2, глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли (GITR), gpl00, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, интегрин av, интегрин ανβ, LAG-3, антиген Ley, мезотелин, c-MET, мембранный антиген карбоангидраза IX, MUC1, MUC16, нектин-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, синдекан-1, TACI, TAG-72, тенасцин, TIM3, TRAILRl, TRAILR2,VEGFR- 1, VEGFR-2, VEGFR-3, и их варианты.

Используемый в данном документе эпитоп, также известный как антигенная детерминанта, представляет собой часть антигена, который распознается иммунной системой в соответствующих условиях, в частности антителами, В-клетками или Т-клетками. Эпитопы включают В-клеточные эпитопы и Т-клеточные эпитопы. В-клеточные эпитопы представляют собой пептидные последовательности, которые необходимы для распознавания специфическими антителообразующими В-клетками. В-клеточные эпитопы относятся к определенной области антигена, которая распознается антителом. Часть антитела, которая связывается с эпитопом, называется паратопом. Эпитоп может представлять собой конформационный эпитоп или линейный эпитоп, основанный на структуре и взаимодействии с паратопом. Линейный или непрерывный эпитоп определяется первичной аминокислотной последовательностью определенной области белка. Последовательности, которые взаимодействуют с антителом, расположены рядом друг с другом последовательно на белке, и эпитоп обычно может быть имитирован одним пептидом. Конформационные эпитопы представляют собой эпитопы, которые определяются конформационной структурой нативного белка. Эти эпитопы могут быть непрерывными или прерывистыми, то есть компоненты эпитопа могут располагаться на различных частях белка, которые в структуре свернутого нативного белка располагаются близко друг к другу.

Т-клеточные эпитопы представляют собой пептидные последовательности, которые в ассоциации с белками на АПК, необходимы для распознавания специфическими Т-клетками. Т-клеточные эпитопы подвергаются процессингу внутри клеток и презентации на поверхности АПК, где они связаны с молекулами ГКГС, включая ГКГС класса II и MHC класса I.

В других аспектах противораковая вакцина согласно изобретению содержит мРНК-вакцину, кодирующую множество пептидных эпитопных антигенов, расположенных с одним или более перемежающимися универсальными Т-клеточными эпитопами типа II. Универсальные Т-клеточные эпитопы типа II включают, но не ограничиваются ими, ILMQYIKANSKFIGI (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 226), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 227), QYIKANSKFIGITE (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 228) QSIALSSLMVAQAIP (дифтерийный токсин; SEQ ID NO: 229), и AKFVAAWTLKAAA (пан DR эпитоп (PADRE); SEQ ID NO: 230). В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцина содержит один и тот же универсальный Т-клеточный эпитоп типа II. В других вариантах осуществления мРНК-вакцина содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 различных универсальных Т-клеточных эпитопов типа II. В некоторых вариантах осуществления один или более универсальный Т-клеточный эпитоп(-ов) типа II распределен между каждым раковым антигеном. В других вариантах осуществления один или более универсальный Т-клеточный эпитоп(ов) типа II находится между каждыми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 100 раковыми антигенами.

Эпитопы могут быть идентифицированы с использованием бесплатной или коммерческой базы данных (например, Lonza Epibase, antitope). Такие инструменты полезны для прогнозирования наиболее иммуногенных эпитопов в целевом антигенном белке. Затем выбранные пептиды могут быть синтезированы и подвергнуты скринингу на панелях HLA человека, и наиболее иммуногенные последовательности могут быть использованы для конструирования мРНК, кодирующих антиген(ы). Одна стратегия картирования эпитопов цитотоксических Т-клеток основана на генерации эквимолярных смесей четырех С-концевых пептидов для каждого номинального 11-мерного белка в его пределах. Эта стратегия позволит получить антиген из библиотеки, который содержит все возможные активные эпитопы ЦТЛ.

Пептидный эпитоп может быть любой длины, приемлемой для эпитопа. В некоторых воплощениях пептидный эпитоп состоит из 9-30 аминокислот.В других вариантах осуществления длина составляет 9- 22, 9-29, 9-28, 9-27, 9-26, 9-25, 9-24, 9-23, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 10-22, 10-21, 10-20, 11-22, 22-21, 11-20, 12-22, 12-21, 12-20,13-22, 13-21, 13-20, 14-19, 15-18, или 16-17 аминокислот.

Персонализированные противораковые вакцины содержат несколько эпитопов. В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины кодируют 48-54 персонализированных раковых антигенов. В одном варианте осуществления персонализированные противораковые вакцины кодируют 52 персонализированных раковых антигена. В некоторых вариантах осуществления каждый из персонализированных раковых антигенов кодируется отдельной открытой рамкой считывания. В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины состоят из 45 или более, 46 или более, 47 или более, 48 или более, 49 или более, 50 или более, 51 или более, 52 или более, 53 или более, 54 или более, или 55 или более антигенов. В других вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины состоят из 1000 или менее, 900 или менее, 500 или менее, 100 или менее, 75 или менее, 50 или менее, 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее или 100 или менее эпитопов. В еще одних других вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины имеют 3-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 65-100, 70-100, 75-100, 80-100, 90-100, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 100-150, 100-200, 100-300, 100-400, 100-500, 50-500, 50-800, 50-1000 или 100-1000 раковых антигенов.

В некоторых вариантах осуществления оптимальная длина пептидного эпитопа может быть получена с помощью следующей процедуры: синтезирования V5-метки конкатемер-тестируемого протеазного сайта, его введения в ДК (например, с использованием процедуры РНК-сжатия), лизиса клеток и затем выполнения вестерн-блоттинга против V5 для оценки расщепления в сайтах протеаз.

Способ сдавливания РНК представляет собой метод внутриклеточной доставки, с помощью которого различные вещества могут доставляться в широкий спектр живых клеток. Клетки подвергаются микрофлюидному конструированию, которое вызывает быструю механическую деформацию. Деформация приводит к временному разрушению мембраны и вновь образованным временным порам. Затем вещество пассивно диффундирует в цитозоль клетки через временные поры. Данный способ может быть использован для различных типов клеток, включая первичные фибробласты, эмбриональные стволовые клетки и множество иммунных клеток, и было показано, что он обладает относительно высокой эффективностью для большинства применений и не повреждает нестойкие вещества, такие как квантовые точки или белки, посредством своих воздействий. Sharei et al., PNAS (2013); 110(6):2082-7.

Неоэпитопы могут быть сконструированы так, чтобы оптимально связываться с ГКГС, чтобы стимулировать устойчивый иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления каждый пептидный эпитоп содержит антигенную область и область, стабилизирующую ГКГС.Область, стабилизирующая ГКГС, представляет собой последовательность, которая стабилизирует пептид в ГКГС.Область, стабилизирующая ГКГС, может иметь длину 5-10, 5-15, 8-10, 1-5, 3-7 или 3-8 аминокислот.В еще других вариантах осуществления антигенная область имеет длину 5-100 аминокислот.Пептиды взаимодействуют с молекулами ГКГС класса I путем конкурентного аффинного связывания в эндоплазматической сети, прежде чем они будут представлены на поверхности клетки. Аффинность отдельного пептида напрямую связана с его аминокислотной последовательностью и наличием специфических мотивов связывания в определенных положениях внутри аминокислотной последовательности. Представляемый пептид в ГКГС удерживается дном пептидсвязывающей полости в центральной области α1/α2 -гетеродимера (молекулы, состоящей из двух неидентичных субъединиц). Последовательность остатков дна пептидсвязывающей полости определяет, какие именно пептидные остатки он связывает.

Оптимальные области связывания могут быть идентифицированы с помощью компьютерного сравнения аффинности сайта связывания (карман ГКГС) для конкретной аминокислоты в каждой аминокислоте в сайте связывания для каждого из целевых эпитопов, чтобы идентифицировать идеальную связывающую область для всех исследованных антигенов. Области, стабилизирующие ГКГС, эпитопов могут быть идентифицированы с использованием матриц прогнозирования аминокислот точек данных для сайта связывания. Матрица прогнозирования аминокислот представляет собой таблицу, в которой первая и вторая оси определяют точки данных. Матрицы прогнозирования могут быть сгенерированы, как показано в Singh, H. and Raghava, G.P.S. (2001), “ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.” Bioinformatics, 17(12), 1236-37).

В некоторых вариантах осуществления область, стабилизирующая ГКГС, разработана на основе конкретной ГКГС субъекта. Таким образом, область, стабилизирующая ГКГС, может быть оптимизирована для каждого пациента.

В некоторых случаях каждый эпитоп антигена может содержать область, стабилизирующую ГКГС. Все области, стабилизирующие ГКГС, внутри эпитопов могут быть одинаковыми или они могут быть разными. Области, стабилизирующие ГКГС, могут находиться в N-концевой части пептида или в C-концевой части пептида. Альтернативно, области, стабилизирующие ГКГС, могут находиться в центральной области пептида. Неоэпитопы в некоторых вариантах осуществления имеют длину 13 остатков или менее и обычно состоят из около 8-11 остатков, в частности, 9 или 10 остатков. В других вариантах осуществления неоэпитопы могут быть сконструированы так, чтобы быть более длинными. Например, неоэпитопы могут иметь удлинения в 2-5 аминокислот в направлении N- и C-конца каждого соответствующего генного продукта. Использование более длинного пептида может обеспечить эндогенный процессинг клетками пациента и может привести к более эффективной презентации антигена и индукции Т-клеточных ответов.

Неоэпитопы, выбранные для включения в вакцину, обычно будут пептидами с высокой аффинностью связывания. В некоторых аспектах неоэпитоп связывает белок HLA с большей аффинностью, чем пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления неоэпитоп имеет ИК50 по меньшей мере менее 5000 нМ, по меньшей мере менее 500 нМ, по меньшей мере менее 250 нМ, по меньшей мере менее 200 нМ, по меньшей мере менее 150 нМ, по меньшей мере менее 100 нМ, по меньшей мере менее 50 нМ или менее. Как правило, пептиды с прогнозированной ИК50<50 нМ обычно рассматривают как пептиды со средней или высокой аффинностью связывания, и отбирают для проверки их аффинности эмпирическим путем с использованием биохимических анализов связывания HLA. Наконец, будет определено, может ли иммунная система человека создавать эффективные иммунные ответы против этих мутированных опухолевых антигенов и, таким образом, эффективно убивать опухоли, но не нормальные клетки.

Неоэпитопы, имеющие желаемую активность, могут быть модифицированы при необходимости, чтобы обеспечить определенные желаемые свойства, например, улучшенные фармакологические характеристики, в то же время увеличивая или по меньшей мере сохраняя практически всю биологическую активность немодифицированного пептида для связывания желаемой молекулы ГКГС и активации соответствующей Т-клетки или В-клетки. Например, неоэпитопы могут подвергаться различным изменениям, таким как замены, или консервативные, или неконсервативные, где такие изменения могут обеспечивать определенные преимущества при их использовании, такие как улучшенное связывание ГКГС.Под консервативными заменами подразумевается замена аминокислотного остатка другим, который биологически и/или химически сходен, например, один гидрофобный остаток на другой или один полярный остаток на другой. Замены включают комбинации, такие как Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; и Phe, Tyr. Эффект единичных аминокислотных замен также может быть исследован с использованием D-аминокислот. Такие модификации могут быть сделаны с использованием хорошо известных способов синтеза пептидов, как описано, например, в Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp.1-284 (1979); и Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984).

Неоэпитопы также можно модифицировать путем увеличения или уменьшения аминокислотной последовательности соединения, например путем добавления или удаления аминокислот.Пептиды, полипептиды или аналоги также могут быть модифицированы путем изменения порядка или состава определенных остатков, при этом легко понять, что определенные аминокислотные остатки, необходимые для биологической активности, например, остатки в критических контактирующих сайтах или консервативные остатки, обычно не могут быть изменены без вредного влияния на биологическую активность.

Как правило, для определения влияния электростатического заряда, гидрофобности и т.д. на связывание используют серию пептидов с единичными аминокислотными заменами. Например, для определения различных паттернов чувствительности к различным молекулам ГКГС и рецепторам Т-клеток или В-клеток по длине пептида делают ряд замен положительно заряженных (например, Lys или Arg) или отрицательно заряженных (например, Glu) аминокислот.Кроме того, может быть сделано множество замен с использованием небольших относительно нейтральных фрагментов, таких как Ala, Gly, Pro или подобных остатков. Замены могут быть гомоолигомерами или гетероолигомерами. Количество и типы остатков, которые замещаются или добавляются, зависят от необходимого расстояния между основными точками контакта и определенными требуемыми функциональными характеристиками (например, гидрофобность в противовес гидрофильности). С помощью таких замен можно также повысить аффинность связывания с молекулой ГКГС или Т-клеточным рецептором по сравнению с аффинностью исходного пептида. В любом случае в таких заменах должны использоваться аминокислотные остатки или другие молекулярные фрагменты, выбранные таким образом, чтобы избежать, например, стерических помех и влияния заряда, которые могут нарушить связывание.

Неоэпитопы также могут содержать изостеры двух или более остатков в неоэпитопах. Как определено в данном документе изостер представляет собой последовательность из двух или более остатков, которые могут быть заменены второй последовательностью, поскольку стерическая конформация первой последовательности соответствует сайту связывания, специфическому для второй последовательности. Данный термин, в частности, включает модификации пептидного остова, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие модификации включают модификации амидного азота, альфа-углеродного атома, амидного карбонила, полную замену амидной связи, удлинения, делеции или сшивки остова. См., в общем, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.VII (Weinstein ed., 1983).

Анализ иммуногенности является важной частью при выборе оптимальных неоэпитопов для включения в вакцину. Иммуногенность может быть оценена, например, путем анализа ГКГС-связывающей способности неоэпитопа, разнородности HLA, положения мутации, прогнозируемой реактивности T-клеток, фактической реактивности T-клеток, структуры, приводящей к определенным конформациям и получающимся в результате воздействия растворителя, и представления специфических аминокислот. Известные алгоритмы, такие как алгоритм прогнозирования NetMHC, можно использовать для прогнозирования способности пептида связываться с общими аллелями HLA-A и -B. Структурную оценку пептида, связанного с ГКГС, также можно проводить с помощью программ для 3-мерного анализа in silico и/или для стыковки белков. Использование спрогнозированной структуры эпитопа при связывании с молекулой ГКГС, например, полученной при помощи алгоритма Rosetta, можно использовать для оценки степени воздействия растворителя аминокислотных остатков эпитопа, когда эпитоп связан с молекулой ГКГС. Реактивность Т-клеток может быть оценена экспериментально с использованием эпитопов и Т-клеток in vitro. Альтернативно, реактивность Т-клеток может быть оценена с использованием наборов данных Т-клеточный ответ/последовательность.

Важным компонентом неоэпитопа, включенного в вакцину, является отсутствие аутореактивности. Предполагаемые неоэпитопы могут быть подвергнуты скринингу для подтверждения того, что эпитоп ограничен опухолевой тканью, например, возникающей в результате генетических изменений в злокачественных клетках. Предпочтительно, эпитоп не должен присутствовать в нормальной ткани пациента, и, следовательно, подобные эпитопы отфильтровываются из набора данных.

В других аспектах раскрытие обеспечивает способ получения противораковой мРНК-вакцины путем выделения образца у субъекта, идентификации множества раковых антигенов в образце, определения Т-клеточных эпитопов из множества раковых антигенов, приготовления противораковой мРНК-вакцины, имеющей открытую рамку считывания, кодирующую антиген и полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген, при этом антиген содержит по меньшей мере один из Т-клеточных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение силы связывания Т-клеточных эпитопов с ГКГС субъекта. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает определение поверхности Т-клеточного рецептора (поверхность TCR) для каждого эпитопа и выбор эпитопов, имеющих поверхность TCR с низким сходством с эндогенными белками. Т-клеточные эпитопы могут быть оптимизированы для обеспечения силы связывания с ГКГС субъекта. В некоторых вариантах осуществления поверхность TCR для каждого эпитопа имеет низкое сходство с эндогенными белками.

Например, технология, называемая JanusMatrix (Epivax), которая исследует перекрестно-реактивные Т-клеточные эпитопы как с HLA-связывающей, так и с обращенной к TCR сторонам, позволяющая проводить сравнения между различными большими базами данных геномных последовательностей, может быть использована для идентификации эпитопов, имеющих предпочтительную поверхность к TCR и силу связывания с ГКГС. Набор алгоритмов может использоваться отдельно или вместе с JanusMatrix для оптимизации выбора эпитопа. Например, EpiMatrix использует перекрывающиеся 9-мерные рамки, полученные из консервативных последовательностей целевого белка, и оценивает их по потенциальной аффинности связывания с панелью аллелей HLA класса I или класса II; каждый анализ рамка-в-аллеле, которое имеет высокие оценки и, по прогнозам, будет связываться, представляет собой предполагаемый Т-клеточный эпитоп. ClustiMer получает выходные данные EpiMatrix и идентифицирует кластеры из 9-меров, которые содержат большое количество предполагаемых Т-клеточных эпитопов. BlastiMer автоматизирует процесс отправки ранее идентифицированных последовательностей в BLAST, чтобы определить, имеют ли они сходство с геномом человека; любые подобные сходные последовательности могут быть допущены или могут вызвать нежелательный аутоиммунный ответ.EpiAssembler использует консервативные иммуногенные последовательности, идентифицированные Conservatrix и EpiMatrix, и объединяет их вместе для формирования высокоиммуногенных консенсусных последовательностей. JanusMatrix может использоваться для скрининга последовательностей, которые могут потенциально вызывать нежелательный аутоиммунный или ответ регуляторных Т-клеток из-за гомологии с последовательностями, кодируемыми геномом человека. VaccineCAD может быть использован для связывания эпитопов-кандидатов в структуру в виде «бус на нитке» при минимизации неспецифических соединительных эпитопов, которые могут быть созданы в процессе связывания.

Способы получения персонализированных противораковых вакцин в соответствии с раскрытием включают идентификацию мутаций с использованием таких методов, как методы глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков, как описано в данном документе, для образцов ткани. В некоторых вариантах осуществления выполняется первоначальная идентификация мутаций в транскриптоме пациента. Данные из транскриптома пациента сравнивают с информацией о последовательностях из экзома пациента для идентификации специфических для пациента и специфических для опухоли мутаций, которые экспрессируются. Сравнение обеспечивает набор предполагаемых неоэпитопов, называемых мутаномом. Мутаном может включать приблизительно 100-10000 мутаций-кандидатов на пациентов. Мутаном подвергается тщательному анализу данных с использованием набора запросов или алгоритмов для определения оптимального набора мутаций для генерации неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцина на основе неоантигенов разрабатывают и изготавливают.Затем пациента лечат с использованием вакцины.

В некоторых вариантах осуществления весь способ от начала процесса идентификации мутации до начала лечения пациента выполняют менее чем за 2 месяца. В других вариантах осуществления весь процесс осуществляют за 7 недель или менее, 6 недель или менее, 5 недель или менее, 4 недели или менее, 3 недели или менее, 2 недели или менее, или менее 1 недели. В некоторых вариантах осуществления весь способ выполняют менее чем за 30 суток.

Процесс идентификации мутации может включать анализ транскриптома и экзома или только анализ транскриптома или экзома. В некоторых вариантах осуществления анализ транскриптома выполняют первым, а анализ экзома выполняют вторым. Анализ проводят на биологическом образце или образце ткани. В некоторых вариантах осуществления биологический образец или образец ткани представляет собой образец крови или сыворотки. В других вариантах осуществления образец представляет собой образец тканей из банка или трансформацию B-клеток с использованием EBV.

После синтеза мРНК-вакцины, ее вводят пациенту. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят по графику в течение периода длительностью до двух месяцев, до трех месяцев, до четырех месяцев, до пяти месяцев, до шести месяцев, до семи месяцев, до восьми месяцев, до девяти месяцев. до десяти месяцев, до одиннадцати месяцев, до 1 года, до 1½ лет, до двух лет, до трех лет или до четырех лет. График может быть одинаковым или может изменяться. В некоторых вариантах осуществления график составляется еженедельно в течение первых 3 недель, а затем ежемесячно.

В любой момент лечения пациент может быть обследован для определения того, являются ли мутации в вакцине по-прежнему целесообразными. На основании этого анализа вакцина может быть скорректирована или изменена для включения одной или более различных мутаций или для удаления одной или более мутаций.

Было признано и оценено, что путем анализа определенных свойств мутаций, связанных с раком, можно оценить и/или отобрать оптимальные неоэпитопы для включения в мРНК-вакцину. Свойство неоэпитопа или набора неоэпитопов может включать, например, оценку экспрессии на уровне гена или транскрипта у пациента при помощи РНК-секвенирования или другого анализа нуклеиновых кислот, тканеспецифическую экспрессию в доступных базах данных, известных антионкогенов/онкосупрессоров, вариант оценки достоверности стимуляции, аллель-специфическую экспрессию RNA-seq, консервативное или неконсервативное замещение AA, положение точечной мутации (оценка центрирования в отношении увеличения вовлечения TCR), положение точечной мутации (оценка закрепления в отношении дифференциального связывания HLA), а именно:<100% гомологии основного эпитопа с данными WES пациента, ИК50 для 8-мерного -11-мерного HLA-A и -B, ИК50 для 15-мерных -20-мерных HLA-DRB1, показатель разнородности (т.е. число HLA пациентов, для которых прогнозируется связывание), ИК50 для 8-мерных-11-мерных HLA-C, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DRB3-5, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DQB1/A1, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DPB1/A1, соотношение между классом I и классом II, разнообразие пациентов HLA-A охваченные аллотипы -B и DRB1, доля точечной мутации в сравнении со сложными эпитопами (например, сдвигом рамки считывания) и/или показателями связывания псевдоэпитопа HLA.

В некоторых вариантах осуществления свойства ассоциированных с раком мутаций, используемых для идентификации оптимальных неоэпитопов, представляют собой свойства, связанные с типом мутации, количеством мутаций в образце пациента, иммуногенностью, отсутствием аутореактивности и природой пептидной композиции.

Тип мутации должен быть определен и рассмотрен как фактор, определяющий, должен ли предполагаемый эпитоп быть включен в вакцину. Тип мутации может варьироваться. В некоторых случаях может быть желательно включить несколько разных типов мутаций в одну вакцину. В других случаях один тип мутации может быть более желательным. Значение для конкретной мутации может быть оценено и рассчитано.

Обилие мутаций в образце пациента также может учитываться и приниматься во внимание при принятии решения о том, следует ли включать предполагаемый эпитоп в вакцину. Многочисленные мутации могут способствовать более устойчивому иммунному ответу.

В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые мРНК-вакцины, описанные в данном документе, могут использоваться для лечения рака.

Противораковые мРНК-вакцины могут вводиться профилактически или терапевтически как часть схемы активной иммунизации здоровым людям или на ранней или поздней стадиях рака и/или на стадии метастатического рака. В одном варианте осуществления эффективное количество противораковой мРНК-вакцины, предоставленной клетке, ткани или субъекту, может быть достаточным для иммунной активации и, в частности, антигенспецифической иммунной активации.

В некоторых вариантах осуществления противораковая мРНК-вакцина может вводиться с противораковым терапевтическим средством, включая, но не ограничиваясь этим, традиционную противораковую вакцину. Противораковая мРНК-вакцина и противораковое терапевтическое средство можно комбинировать для дальнейшего усиления иммунотерапевтических ответов. Противораковая мРНК-вакцина и другое терапевтическое средство могут вводиться одновременно или последовательно. В тех случаях, когда другие терапевтические агенты вводят одновременно, их могут вводить в тех же или разных составах, тем не менее вводят в одно и то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно друг с другом и с противораковой мРНК-вакциной, если введение других терапевтических агентов и противораковой мРНК-вакцины временно разделено. Разделение во времени между введением этих соединений может занимать считанные минуты или может быть более длительным, например, часы, дни, недели, месяцы. Другие терапевтические агенты включают, но не ограничиваются ими, противораковое терапевтическое средство, адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т.д.

В другом варианте осуществления пептидные эпитопы находятся в форме конкатемерного ракового антигена, состоящего из 2-100 пептидных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления конкатемерный раковый антиген содержит одно или более из: a) 2-100 пептидных эпитопов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению; b) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную непосредственно друг с другом без линкера; c) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную с одним или другим с помощью одного нуклеотидного линкера; d) каждый пептидный эпитоп, содержащий 25-35 аминокислот и включающий центрально расположенную SNP-мутацию; e) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса I от субъекта; f) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса II от субъекта; g) по меньшей мере 50% пептидных эпитопов, имеющих заявленную аффинность связывания ИК>500 нМ для HLA-A, HLA-B и/или DRB1; h) мРНК, кодирующую 45-55 пептидных эпитопов; i) мРНК, кодирующую 52 пептидных эпитопов j) 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса I, и 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса II; k) мРНК, кодирующую пептидные эпитопы, расположенную таким образом, что пептидные эпитопы упорядочиваются для минимизации псевдоэпитопов l) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, являющихся пептидами, связывающими ГКГК класса I длиной 15 аминокислот; и/или m) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, являющихся пептидами, связывающими ГКГС класса II длиной 21 аминокислота.

Бактериальные вакцины

В некоторых аспектах данное раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, содержащую один или более конструктов мРНК, причем один или более конструктов мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ (то есть иммуностимулятор) на представляющий интерес бактериальный антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес бактериальный антиген кодируется тем же или отдельным конструктом мРНК. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина содержит один или более конструктов мРНК, кодирующих полипептид, который усиливает иммунный ответ, и один или более конструктов мРНК, кодирующих по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген. Например, представляющий интерес бактериальный антиген может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК бактериального антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена у субъекта. В данном документе описаны подходящие бактериальные антигены для применения с иммуностимуляторами.

В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина является профилактической (то есть предотвращает инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина является терапевтической (то есть лечит инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ (то есть продукцию антител, специфических к представляющему интерес бактериальному антигену). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует адаптивный иммунный ответ.Адаптивный иммунный ответ возникает в ответ на столкновение с антигеном или иммуногеном, где иммунный ответ специфичен для антигенных детерминант антиген/иммуноген. Примерами адаптивных иммунных ответов являются индукция продукции антигенспецифических антител или антигенспецифическая индукция/активация Т-хелперных лимфоцитов или цитотоксических лимфоцитов.

В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует защитный адаптивный иммунный ответ, причем у субъекта индуцируется антигенспецифический иммунный ответ как реакция на иммунизацию (искусственную или естественную) антигеном, при этом иммунный ответ способен защитить субъект против последующих проблем с антигеном или связанным с патологией агентом, который содержит антиген.

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе бактериальная вакцина используется для лечения инфекции, вызванной Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина, описанная в данном документе, используется для лечения инфекции устойчивым к антибиотикам Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина, описанная в данном документе, используется для лечения инфекции, вызванной метициллин-резистентной Staphylococcus aureus (MRSA).

Нозокомиальные инфекции являются одной из наиболее распространенных и дорогостоящих проблем для системы здравоохранения США, причем S. aureus является второй по значимости причиной таких инфекций. MRSA ответственна за 40-50% всех нозокомиальных инфекций S. aureus. Кроме того, недавние исследования демонстрируют, что S. aureus также является основным медиатором эндопротезной инфекции. Одним из наиболее важных механизмов, используемых S. aureus для подавления иммунного ответа хозяина и развития ее в персистентную инфекцию, является образование хорошо сформированной биопленки. Биопленка представляет собой микробное сообщество, в котором бактериальные клетки прикреплены к гидратированной поверхности и встроены в полисахаридную матрицу. Бактерии в биопленке проявляют измененный фенотип в своем росте, экспрессии генов и продукции белка.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления бактериальные вакцины, описанные в данном документе, предотвращают возникновение опосредованных биопленкой хронических инфекций S. aureus. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет интерес, если он обнаружен в биопленке, образуемой S. aureus. Примеры таких антигенов описаны в патенте США №9265820, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина содержит по меньшей мере один полипептид, экспрессируемый планктонной формой бактерий, и по меньшей мере один полипептид, экспрессируемый биопленочной формой бактерий.

В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес бактериальный антиген получают из S. aureus. Устойчивый к лекарственным средствам S. aureus экспрессирует ряд представленных на поверхности белков, которые являются кандидатами в качестве мишеней вакцин, а также кандидатами в качестве иммунизирующих агентов для получения антител, которые нацелены на S. aureus. Примеры таких антигенов описаны в публикациях РСТ №WO 2012/136653 и WO 2015/082536 и в Ramussen, K. et al, Vaccine, Vol.34: 4602-4609 (2016), каждая из которых включен в данный документ путем ссылки во всей их полноте.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что идентичность, количество и размер различных белков S. aureus, которые могут кодироваться мРНК, для бактериальных вакцин, описанных в данном документе, могут варьироваться. Например, вакцина может содержать мРНК, кодирующую только части полноразмерных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления вакцина может содержать мРНК, кодирующую комбинацию частей и полноразмерных полипептидов.

Идентичность экспрессируемых планктонной и биопленочной формами полипептидов, кодируемых мРНК, включенной в бактериальные вакцины, описанные в данном документе, конкретно не ограничена, но каждый представляет собой полипептид из штамма S. aureus. В некоторых вариантах полипептид представляется на поверхности бактерий.

В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы, такие как конкатермерный антиген).

В другом варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой антиген Chlamydia, такой как антиген MOMP, OmpA, OmpL, OmpF или OprF. Подходящие антигены Chlamydia описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.

Поливалентные вакцины

Иммуностимулирный конструкт может быть использован в комбинации с поливалентным антигеном (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы, такие как конкатермерный антиген), чтобы тем самым усилить иммунный ответ против поливалентного антигена. В одном варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой раковый антиген. В другом варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой бактериальный антиген. Например, представляющий интерес поливалентный антиген (например, сконструированный, как описано ниже) может быть кодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК поливалентного антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против поливалентного антигена у субъекта. Подходящие поливалентные антигены, в том числе раковые антигены и бактериальные антигены, для применения с иммуностимуляторами описаны в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе мРНК-вакцины содержат мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемерный антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе конкатемерные вакцины могут включать множество копий одного неоэпитопа, множество разных неоэпитопов, основанных на одном типе мутации, то есть точечной мутации, множество разных неоэпитопов, основанных на множестве типов мутаций, неоэпитопы и другие антигены, такие как опухолеассоциированные антигены или сенсибилизирующие антигены.

В некоторых вариантах осуществления конкатемерный антиген может включать сенсибилизирующий антиген, также иногда называемый антигеном памяти. Сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген, с которым ранее сталкивался человек, и для которого есть предсуществующие лимфоциты памяти. В некоторых вариантах осуществления сенсибилизирующий антиген может представлять собой антиген инфекционного заболевания, с которым индивидуум, вероятно, сталкивался, такой как антиген гриппа. Сенсибилизирующий антиген помогает стимулировать более сильный иммунный ответ.

В дополнение к пептидным эпитопам конкатемерный антиген может иметь одну или более нацеливающих последовательностей. Используемая в данном документе нацеливающая последовательность относится к пептидной последовательности, которая облегчает поглощение пептида внутриклеточными компартментами, такими как эндосомы, для процессинга и/или презентации в детерминантах ГКГС класса I или II.

Нацеливающая последовательность может присутствовать на N-конце и/или С-конце эпитопа конкатемерного антигена, или непосредственно примыкает к нему, или разделена линкером сайта, чувствительного к расщеплению. Нацеливающие последовательности имеют различные длины, например, длину в 4-50 аминокислот.

Нацеливающая последовательность может представлять собой, например, эндосомную нацеливающую последовательность. Эндосомная нацеливающая последовательность представляет собой последовательность, полученную из эндосомного или лизосомального белка, о котором известно, что он находится в компартментах процессинга Аг ГКГС класса II, таких как инвариантная цепь, лизосом-ассоциированные мембранные белки (LAMP1,4 LAMP2) и дендритная клетка (DC) -LAMP или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с ней. Кроме того, могут быть использованы иллюстративная нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент сигнального пептида ГКГС класса I (78 п.н., сигнал секреции (sec)) и трансмембранный и цитозольный домены, включая стоп-кодон (сигнал направленной миграции ГКГС класса I (MITD), 168 п.н.), оба амплифицированы из активированных МКПК, (смысловая sec 5'-aag ctt agc ggc cgc acc atg cgg gtc acg gcg ccc cga acc-3 '(SEQ ID NO: 1314); антисмысловая sec, 5′-ctg cag gga gcc ggc cca ggt ctc ggt cag-3′ (SEQ ID NO: 1315); смысловая MITD, 5′-gga tcc atc gtg ggc att gtt gct ggc ctg gct-3′ (SEQ ID NO: 1316); и антисмысловая MITD, 5′-gaa ttc agt ctc gag tca agc tgt gag aga cac atc aga gcc-3′ (SEQ ID NO: 1317).

Представление ГКГС класса I обычно является неэффективным процессом (фактически представлен только 1 пептид из 10000 деградированных молекул). Примирование CD8 T-клеток с АПК обеспечивает недостаточную плотность поверхностных комплексов пептид/ГКГС I, что приводит к слабым ответам у пациентов, которые проявляются нарушенной секрецией цитокинов и уменьшенным пулом памяти. Способы, описанные в данном документе, способны повысить эффективность представления ГКГС класса I. Последовательности, нацеленные на ГКГС класса I, включают последовательности сигнала направленной миграции ГКГС класса I (MITD) и последовательности PEST (усиливают антигенспецифические CD8 Т-клеточные ответы, предположительно, путем нацеливания на белки для быстрой деградации).

В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцины можно комбинировать с агентами для стимуляции образования антигенпрезентирующих клеток (АПК), например, путем превращения не-АПК в псевдо-АПК. Презентация антигена является ключевым этапом в инициации, усилении и продолжительности иммунного ответа. В этом процессе фрагменты антигенов представляются через главный комплекс гистосовместимости (ГКГС) или человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) Т-клеткам, вызывая антигенспецифический иммунный ответ.Для иммунопрофилактики и иммунотерапии усиление этого ответа важно для повышения эффективности. мРНК-вакцины согласно изобретению могут быть сконструированы или усовершенствованы для обеспечения эффективной презентации антигена. Одним из способов усиления процессинга и презентации АПК является обеспечение лучшего нацеливания мРНК-вакцин на антигенпрезентирующие клетки (АПК). Другой подход включает активацию АПК клеток с помощью иммуностимулирующих составов и/или компонентов.

Альтернативно, способы перепрограммирования не-АПК в АПК могут быть использованы с мРНК-вакцинами, описанными в данном документе. Важно отметить, что большинство клеток, которые поглощают составы мРНК и являются мишенями их терапевтического действия, не являются АПК. Следовательно, разработка способа превращения этих клеток в АПК была бы полезна для эффективности. Способы и подходы к доставке РНК-вакцин, например мРНК-вакцин в клетки, в то же время способствуют изменению не-АПК в АПК, представлены в данном документе. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, включена в мРНК-вакцину или вводится совместно с мРНК-вакциной.

Молекула перепрограммирования АПК, используемая в данном документе, представляет собой молекулу, которая способствует переходу не-АПК клетки к АПК-подобному фенотипу. АПК-подобный фенотип представляет собой свойство, которое обеспечивает процессинг ГКГС класса II. Таким образом, клетка АПК, имеющая АПК-подобный фенотип, представляет собой клетку, имеющую одну или более экзогенных молекул (молекула перепрограммирования АПК), которая обладает улучшенными процессинговыми способностями ГКГС класса II по сравнению с той же клеткой, не имеющей одну или более экзогенных молекул. В некоторых вариантах осуществления молекула перепрограммирования АПК представляет собой CIITA (центральный регулятор экспрессии ГКГС класса II); шаперон, такой как CLIP, HLA-DO, HLA-DM и т.д. (усилители загрузки фрагментов антигена в ГКГС класса II) и/или костимулирующую молекулу, такую как CD40, CD80, CD86 и т.д. (усилители распознавания Т-клеточных антигенов и Т-клеточной активации).

Белок CIITA представляет собой трансактиватор, который усиливает активацию транскрипции генов ГКГС класса II (Steimle et al., 1993, Cell 75:135-146) путем взаимодействия с консервативным набором ДНК-связывающих белков, которые связываются с промоторной областью класса II. Функция активации транскрипции CIITA была сопоставлена с аминоконцевым кислотным доменом (аминокислоты 26-137). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который взаимодействует с CIITA, называется CIITA-взаимодействующим белком 104 (также называемым в данном документе CIP104). Было показано, что как CITTA, так и CIP104 усиливают транскрипцию с промоторов ГКГС класса II и, таким образом, являются полезными в качестве молекулы перепрограммирования АПК согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула перепрограммирования АПК представляет собой полноразмерную CIITA, CIP104 или другие родственные молекулы или их активные фрагменты, такие как аминокислоты 26-137 CIITA, или аминокислоты, имеющие по меньшей мере 80% идентичность последовательности с ними и сохраняющие способность усиливать активацию транскрипции генов ГКГС класса II.

В некоторых вариантах осуществления молекулу перепрограммирования АПК доставляют субъекту в форме мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. По существу, описанные в данном документе мРНК-вакцины могут включать мРНК, кодирующую молекулу перепрограммирования АПК. В некоторых вариантах осуществления мРНК является моноцистронной. В других вариантах осуществления она является полицистроннной. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующая один или более антигенов, находится в отдельном составе от мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. В других вариантах осуществления мРНК, кодирующая один или более антигенов, находится в том же составе, что и мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующую один или более антигенов, вводят субъекту одновременно с мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. В других вариантах осуществления мРНК, кодирующую один или более антигенов, вводят субъекту в другое время, чем мРНК, кодирующую молекулу перепрограммирования АПК. Например, мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, можно вводить до мРНК, кодирующей один или более антигенов. мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, может быть введена непосредственно до, по меньшей мере за 1 час до, по меньшей мере за 1 сутки до, по меньшей мере за одну неделю до или, по меньшей мере за один месяц до мРНК, кодирующей антигены. Альтернативно, мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, можно вводить после мРНК, кодирующей один или более антигенов. мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, может быть введена сразу после, по меньшей мере через 1 час, по меньшей мере через 1 сутки, по меньшей мере через одну неделю или по меньшей мере через один месяц после мРНК, кодирующей антигены.

В других вариантах осуществления нацеливающая последовательность представляет собой сигнал убиквитинирования, который присоединен на одном или обоих концах кодируемого пептида. В других вариантах осуществления нацеливающая последовательность представляет собой сигнал убиквитинирования, который присоединен к внутреннему сайту кодируемого пептида и/или к любому концу. Таким образом, мРНК может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал убиквитинирования на одном или обоих концах нуклеотидов, кодирующих конкатемерный пептид. Убиквитинирование, посттрансляционная модификация, представляет собой процесс присоединения убиквитина к субстратному целевому белку. Сигнал убиквитинирования представляет собой пептидную последовательность, которая обеспечивает нацеливание и процессинг пептида в одну или более протеасом. Посредством нацеливания и процессинга пептида с помощью сигнала убиквитинирования внутриклеточный процессинг пептида может более точно воспроизводить процессинг антигена в антигенпрезентирующих клетках (АПК).

Убиквитин является регуляторным белком массой 8,5 кДа, который содержится почти во всех тканях эукариотических организмов. В геноме человека есть четыре гена, которые продуцируют убиквитин: UBB, UBC, UBA52, и RPS27A. UBA52 и RPS27A кодируют одну копию убиквитина, слитого с рибосомными белками L40 и S27a, соответственно. Гены UBB и UBC кодируют белки-предшественники полиубиквитина. Есть три этапа к убиквитинированию, выполняемые тремя ферментами. Активирующие убиквитин ферменты, также называемые ферментами E1, модифицируют убиквитин так, чтобы он находился в реактивном состоянии. Е1 связывается как с АТФ, так и с убиквитином, катализируя ацил-аденилирование С-конца убиквитина. Затем убиквитин переносится в цистеиновый остаток активного сайта, высвобождая АМФ. В конечном итоге, тиоэфирная связь образуется между С-концевой карбоксильной группой убиквитина и сульфгидрильной группой цистеина E1. В геноме человека UBA1 и UBA6 являются двумя генами, которые кодируют ферменты E1.

Активированный убиквитин затем подвергают воздействию убиквитин-конъюгирующих ферментов Е2, которые переносят убиквитин из Е1 на цистеин активного центра Е2 посредством реакции транс(тио)эстерификации. Е2 связывается как с активированным убиквитином, так и с ферментом Е1. У людей есть 35 различных ферментов E2, характеризующихся их высоко консервативной структурой, которая известна как убиквитин-конъюгирующая каталитическая складка (UBC). Убиквитин-лигазы Е3 облегчают заключительную стадию каскада убиквитинирования. Обычно они создают изопептидную связь между лизином целевого белка и С-концевым глицином убиквитина. Существуют сотни лигаз Е3; некоторые также активируют ферменты E2. Ферменты Е3 функционируют как модули распознавания субстрата системы и взаимодействуют как с Е2, так и с субстратом. Ферменты обладают одним из двух доменов: домен гомологичного карбоксильному концу E6-AP (HECT) или домен действительно интересного нового гена (RING) (или близкородственный домен U-бокса). Ферменты E3 с доменом HECT временно связывают убиквитин, когда образуется облигатный тиоэфирный промежуточный продукт с цистеином активного центра E3, тогда как ферменты E3 с доменом RING катализируют прямой перенос от фермента E2 к субстрату.

Число убиквитинов, добавленных к антигену, может повысить эффективность стадии процессинга. Например, при полиубиквитинировании дополнительные молекулы убиквитина добавляются после того, как первая была присоединена к пептиду. Получающаяся в результате убиквитиновая цепь создается путем связывания глицинового остатка молекулы убиквитина с лизином убиквитина, связанным с пептидом. Каждый убиквитин содержит семь остатков лизина и N-конец, который может служить сайтом для убиквитинирования. Когда четыре или более молекул убиквитина присоединены к остатку лизина на пептидном антигене, 26S протеасома распознает комплекс, интернализует его и разлагает белок до небольших пептидов.

Убиквитин дикого типа имеет следующую последовательность (Homo sapiens):

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (SEQ ID NO: 1318)

В некоторых вариантах осуществления эпитопы связаны сайтом, чувствительным к расщеплению. Сайт, чувствительный к расщеплению, представляет собой пептид, который чувствителен к расщеплению ферментом или протеазой. Эти сайты также называют сайтами расщепления протеазой. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой внутриклеточный фермент.В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в антигенпрезентирующей клетке (АПК). Таким образом, сайты расщепления протеазой соответствуют протеазам с высоким содержанием (высоко экспрессируемых) в АПК. Сайт, чувствительный к расщеплению, который чувствителен к ферменту АПК, называется сайтом, чувствительным к расщеплению АПК. Протеазы, экспрессируемые в АПК, включают, но не ограничиваются ими, цистеиновые протеазы, такие как: катепсин B, катепсин H, катепсин L, катепсин S, катепсин F, катепсин Z, катепсин V, катепсин O, катепсин C и катепсин K, и аспарагиновые протеазы, такие как катепсин D, катепсин E и аспарагиновая эндопептидаза.

Ниже приведены примеры сайтов, чувствительных к расщеплению АПК:

Катепсин B: расщепление на карбоксильной стороне связей Arg-Arg

Катепсин D имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:

P6 P5 P4 P3 P2 P1 ↓ P1′ P2′ P3′ P4′

Xaa Xaa Xaa Xaa гидро гидро ↓ гидро Xaa Xaa Xaa

Xaa Xaa Xaa Xaa Glu гидро ↓ гидро Xaa Xaa Xaa,

где Xaa=любой аминокислотный остаток, гидро=Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp или Tyr и ↓=сайт расщепления

Катепсин Н: Arg-↓-NHMec; Bz-Arg-↓-NhNap; Bz-Arg-↓NHMec; Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec; Pro-Gly-↓-Phe

Катепсин S и F: Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-Xaa

где Xaa=любой аминокислотный остаток

Катепсин V: Z-Phe-Arg-NHMec; Z-Leu-Arg-NHMec; Z-Val-Arg-NHMec

Катепсин О: Z-Phe-Arg-NHMec и Z-Arg-Arg-NHMec

Катепсин C имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:

P2	P1	↓	P1′	P2′	P3′	P4′
не Arg	не Pro	↓	не Pro	Xaa	Xaa	Xaa
не Lys	не Pro	↓	не Pro	Xaa	Xaa	Xaa,

где Xaa=любой аминокислотный остаток и ↓=сайт расщепления

Катепсин Е: Arg-X, Glu-X, и Arg-Arg

Аспарагиновая эндопептидаза: после остатков аспарагина

Катепсин L имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:

P6 P5 P4 P3 P2 P1 ↓ P1′ P2′ P3′ P4′

Xaa Xaa Xaa гидрофобный Phe Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa

Xaa Xaa Xaa ароматический Phe Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa

Xaa Xaa Xaa гидрофобный Arg Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa

Xaa Xaa Xaa ароматический Arg Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa,

где Xaa=любой аминокислотный остаток, гидрофобный=Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp или Tyr, ароматический=Phe, Trp, His, или Tyr и ↓=сайт расщепления

В некоторых вариантах осуществления сайт, чувствительный к расщеплению, представляет собой сайты, чувствительные к катепсину B или S. Иллюстративные сайты, чувствительные к катепсину В, включают, но не ограничиваются ими, сайты, указанные в SEQ ID NO: 226-615. Иллюстративные сайты, чувствительные к катепсину S включают, но не ограничиваются ими, сайты, указанные в SEQ ID NO: 616-1313.

В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают мРНК, кодирующую конкатемерный раковый антиген, состоящий из одного или более неоэпитопов и одного или более традиционных раковых антигенов. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более традиционных раковых антигенов в дополнение к закодированным неоэпитопам.

В некоторых вариантах осуществления конкатемерный антиген кодирует 5-10 раковых пептидных эпитопов. В еще других вариантах осуществления конкатемерный антиген кодирует 25-100 раковых пептидных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают эпитопы или антигены, основанные на специфических мутациях (неоэпитопах) и экспрессируемых генами зародышевой линии рака (антигены, общие для опухолей, обнаруженных у множества пациентов). В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают один или более традиционных эпитопов или антигенов, например, один или более эпитопов или антигенов, которые можно найти в традиционной противораковой вакцине.

Неоэпитопы, выбранные для включения в конкатемерный антиген, обычно будут пептидами с высокой аффинностью связывания. Неоэпитопы в конкатемерном конструкте могут быть одинаковыми или разными, например, они могут различаться по длине, аминокислотной последовательности или и тому и другому.

В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы перемежаются линкерами.

В некоторых вариантах осуществления вакцина может представлять собой полицистронную вакцину, содержащую несколько неоэпитопов, или одну или более одиночных мРНК-вакцин, или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления бактериальные мРНК-вакцины и способы вакцинации включают мРНК, кодирующую конкатемерный бактериальный антиген, состоящий из одного или более бактериальных антигенов. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более бактериальных антигенов.

Композиции иммуностимуляторных мРНК и представляющих интерес антигенов

В другом аспекте раскрытие обеспечивает композицию, содержащую по меньшей мере одну химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген; и (ii) по меньшей мере один полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена, когда по меньшей мере одну ммРНК вводят субъекту, при этом указанная ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. Таким образом, раскрытие относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуностимуляторную мРНК и по меньшей мере одну мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген, при этом один конструкт мРНК может кодировать как представляющий интерес антиген(ы), так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) или, альтернативно, композиция может содержать два или более отдельных конструктов мРНК, первую мРНК и вторую мРНК, причем первая мРНК кодирует по меньшей мере один представляющий интерес антиген, а вторая мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) (т.е. вторая мРНК содержит иммуностимулятор).

В этих вариантах осуществления, включающих первую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), и вторую мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), первую мРНК и вторую мРНК можно совместно комбинировать (например, перед совместным введением), например, совместно составлены в одной и той же липидной наночастице.

В этих вариантах осуществления, включающих одну мРНК, кодирующую как представляющий интерес антиген(ы), так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), последовательности, кодирующие полипептид, могут быть расположены в конструкте мРНК по ходу или против хода транскрипции от последовательностей, кодирующих представляющих интерес антиген. Например, неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих как антиген, так и иммуностимуляторный полипептид, включают такие, которые кодируют по меньшей мере один мутантный антиген KRAS и конститутивно активный полипептид STING, например, кодирующие аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 107-130. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид STING расположен на N-терминальном конце конструкта (т.е. по ходу транскрипции от последовательностей, кодирующих антиген), как показано в SEQ ID NO: 107-118. В другом варианте осуществления конститутивно активный полипептид STING расположен на С-терминальном конце конструкта (т.е. против хода транскрипции от последовательностей, кодирующих антиген), как показано в SEQ ID NO: 119-130.

Различные мРНК, кодирующие представляющие интерес антигены (например, мРНК-вакцины), которые можно использовать в комбинации с иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию, описаны более подробно ниже.

Конструкты мРНК, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель

В другом аспекте раскрытие обеспечивает конструкты мРНК (например, ммРНК), кодирующие полипептиды, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, такую как некроптоз или пироптоз. Иммуногенная клеточная гибель, индуцированная мРНК, приводит к высвобождению цитозольных компонентов из клетки, так что иммунный ответ против клетки стимулируется in vivo. Таким образом, мРНК согласно изобретению можно использовать для стимуляции иммунного ответа in vivo против представляющих интерес клеток, таких как опухоли, при лечении рака. мРНК, кодирующую полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, можно использовать отдельно или, альтернативно, можно использовать в комбинации с одним или более дополнительными агентами, которые стимулируют или усиливают иммунологическую реактивность. Такие дополнительные агенты включают агенты, которые стимулируют адаптивный иммунитет, например, стимуляцию продукции интерферона типа I, агенты, которые индуцируют активацию или примирование Т-клеток, и/или агенты, которые модулируют одну или более иммунных контрольных точек. Такие дополнительные агенты также могут представлять собой мРНК или, альтернативно, могут представлять собой агент другого типа, такой как белок, антитело или малая молекула. В одном варианте осуществления дополнительный агент представляет собой один или более конструктов иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию.

Иммуногенная клеточная гибель отличается от неиммуногенной клеточной гибели клеток тем, что иммуногенная клеточная гибель приводит к высвобождению внутриклеточных компонентов из клетки в окружающую среду, так что эти компоненты становятся доступными для стимуляции иммунного ответа. Был идентифицирован ряд внутриклеточных компонентов, которые обычно высвобождаются во время иммуногенной клеточной гибели, называемых «молекулярные структуры, ассоциированные с повреждениями» или DAMP, включая АТФ, HMGB1, ИЛ-1a, мочевую кислоту, фрагменты ДНК, гистоны и содержимое митохондрий. DAMP могут высвобождаться внеклеточно, или определенные DAMP транслоцируются из внутренней части клетки на клеточную поверхность (например, кальретикулин, который транслоцируется из просвета эндоплазматического ретикулума на клеточную поверхность). Таким образом, высвобождение DAMP служит индикатором иммуногенной клеточной гибели. Иммуногенная клеточная гибель также характеризуется стимуляцией провоспалительных цитокинов.

Два типа иммуногенной клеточной гибели представляет собой некроптоз и пироптоз. Каждый из этих типов запрограммированной гибели клеток имеет характерные особенности, которые отличают их друг от друга и от апоптоза, который является формой запрограммированной неиммуногенной клеточной гибели. Отличительными характеристиками апоптоза является то, что он зависит от каспазы (например, зависит от каспаз-инициаторов, таких как каспаза-8 и -10 для апоптоза, индуцируемого рецептором смерти, или каспаза-9 для самоиндуцируемого апоптоза, и самим собой) и приводит к уплотнению цитоплазмы и сжатию клеток, блеббингу плазматической мембраны (но не потере целостности плазматической мембраны), повышенной внутриклеточной концентрации кальция и пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны (MOMP). Важно отметить, что апоптоз не приводит к высвобождению внутриклеточных компонентов в окружающую среду и считается толерогенным. Напротив, некроптоз не зависит от активности каспазы, но зависит от активности киназы, называемой взаимодействующей с рецептором протеинкиназой 1 (RIPK1). Фактически, активация каспаз ингибирует некроптоз, поскольку, например, активированные каспаза-8 и -10 инактивируют RIPK1. Когда RIPK1 активирован, он взаимодействует с RIPK3, что приводит к образованию комплекса некросом. Гибель клеток в результате некроптоза также зависит от псевдокиназы смешанного происхождения (MLKL). Некроптоз характеризуется клеточным коллапсом и потерей целостности плазматической мембраны, включая высвобождение DAMP. Пироптоз также характеризуется высвобождением DAMP, но отличается от некроптоза тем, что он зависит от гасдермина D (GSDMD), белка-3 семейства NLR, содержащего пириновый домен (NLRP3; кодирует криопирин) и каспазы-1, а также от каспазы-4 и каспазы-5 у людей и каспазы-11 у мышей, что приводит к индукции инфламмасом. Дополнительные формы независимой от каспазы иммуногенной клеточной гибели, которые приводят к разрыву плазматической мембраны и воспалению, включают регулируемый некроз, зависимый от проницаемости митохондрий (MPT-RN), ферроптоз, партанатоз и нетоз (для обзора см., например, Linkermann, A. et al. (2014) Nat. Rev. Immunol. 14:759-767).

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует некроптоз. В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует пироптоз. В еще других вариантах осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует MPT-RN, ферроптоз, партанатоз или нетоз.

В одном варианте осуществления полипептид, который индуцирует некроптоз, представляет собой псевдокиназу смешанного происхождения (MLKL), или ее фрагмент, вызывающий иммуногенную клеточную гибель. Как описано далее в Примерах 22-23, конструкты MLKL индуцируют некроптотическую клеточную гибель, характеризующуюся высвобождением DAMP. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши. В одном варианте осуществления конструкт MLKL содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт MLKL содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих MLKL, или их фрагмента, индуцирующего иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1327 и 1328, соответственно.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 3 (RIPK3) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. Как описано далее в Примере 24, конструкты RIPK3 индуцируют некроптотическую клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который мультимеризуется сам с собой (гомоолигомеризация). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который димеризуется с RIPK1. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен и домен RHIM в RIPK3. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен RIPK3, домен RHIM в RIPK3 и два домена FKBP (F>V). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и домен IZ (например, тример IZ). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и один или более доменов EE или RR (например, доменов 2xEE или доменов 2xRR). Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK3, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. В одном варианте осуществления конструкт RIPK3 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт RIPK3 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK3, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1329-1344.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 1 (RIPK1) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-155 полипептида RIPK1 человека или мыши. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и домен IZ. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и домен DM. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и один или более доменов EE или RR. Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK1, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. В одном варианте осуществления конструкт RIPK1 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт RIPK1 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK1, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 158-163.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой белок с низкой pI, прямо связывающий IAP, (DIABLO) (также известный как SMAC/DIABLO), или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. Как описано в примерах, конструкты DIABLO индуцируют клеточную гибель и высвобождение цитокинов. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO, содержащую мутацию S126L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 человеческого DIABLO. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 человеческого DIABLO и содержит мутацию S126L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO, содержащую мутацию S27L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-240 изоформы 3 человеческого DIABLO. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-240 изоформы 3 человеческого DIABLO и содержит мутацию S27L. В одном варианте осуществления конструкт DIABLO содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт DIABLO содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих DIABLO, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 165-172.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой FADD (белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт FADD содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт FADD содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих FADD, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1345-1351.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует пироптоз. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой гасдермин D (GSDMD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность человеческого GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-275 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 276-484 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует мышиный GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-276 мышиного GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 277-487 мышиного GSDMD. В одном варианте осуществления конструкт GSDMD содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт GSDMD содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих GSDMD или, их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, кодируют любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1367-1372.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой каспазу-4 или каспазу-5, или каспазу-11 или их фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В различных вариантах осуществления конструкты каспазы-4, -5 или -11 могут кодировать (i) полноразмерную каспазу-4, каспазу-5 или каспазу-11 дикого типа; (ii) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен IZ; (iii) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен IZ; (iv) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен DM; или (v) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен DM. Примеры форм каспазы-4 и каспазы-11 c удаленным N-концом содержат аминокислотные остатки 81-377. Пример формы каспазы-5 c удаленным N-концом содержит аминокислотные остатки 137-434. В одном варианте осуществления конструкт каспазы-4, -5 или -11 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт каспазы-4, -5 или -11 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-4, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1352-1356. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-5, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1357-1361. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-11, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1362-1366.

В одном варианте осуществления полипептид представляет собой NLRP3 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт NLRP3 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт NLRP3 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих NLRP3, или их фрагментов, индуцирующих иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1373 или 1374.

В другом варианте осуществления полипептид представляет собой апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок, содержащий CARD (ASC/PYCARD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель, такой как пириновый домен. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина. В другом варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина, содержащий мутацию V726A. В одном варианте осуществления конструкт ASC/PYCARD или пирина содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт ASC/PYCARD или пирина содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих домен B30.2 пирина, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1375 или 1376. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих ASC, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1377 или 1378.

мРНК согласно изобретению, кодирующие полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, можно использовать в комбинации с другими агентами, которые стимулируют воспалительную и/или иммунную реакцию и/или регулируют иммунореактивность. Чтобы иммунный ответ против раковых клеток был эффективным в уничтожении раковых клеток, был описан ряд событий, которые должны происходить поэтапно и иметь возможность развиваться и расширяться многократно. Данный процесс называется противораковым иммунным циклом (см., например, Chen, D.S. and Mellman, I. (2013) Immunity, 39:1-10). Эти последовательные события включают: (i) высвобождение антигенов раковых клеток; (ii) презентацию ракового антигена (например, дендритными клетками или другими антигенпрезентирующими клетками); (iii) примирование и активацию Т-клеток; (iv) миграцию Т-клеток (например, ЦТЛ) в опухоль; (v) инфильтрацию Т-клеток в опухоль; (vi) распознавание раковых клеток Т-клетками; и (vii) уничтожение раковых клеток.

Соответственно, другой аспект изобретения относится к дополнительным агентам, которые можно использовать в комбинации с мРНК согласно изобретению, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, чтобы стимулировать или усиливать иммунный ответ против клеточных антигенов из клетки-мишени, подлежащей уничтожению. Такие дополнительные агенты могут стимулировать или способствовать воспалительному и/или иммунному ответу. Дополнительно или альтернативно, такие дополнительные агенты могут регулировать иммунологическую реактивность, например, действуя в качестве модулятора иммунной контрольной точки. Дополнительным агентом также может быть мРНК, например, имеющая структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Альтернативно, дополнительный агент может представлять собой агент, не являющийся мРНК, такой как белок, антитело или малая молекула.

В одном варианте осуществления дополнительный агент усиливает иммунный ответ, например, индуцирует адаптивный иммунитет (например, стимулируя продукцию интерферона типа I), стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFkB и/или стимулирует мобилизацию дендритных клеток (DC). В одном варианте осуществления агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, представляет собой интерферон типа I. Например, фармацевтическая композиция, содержащая интерферон типа I, может быть использована в качестве агента. Альтернативно, в другом варианте осуществления дополнительный агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, представляет собой агент, который стимулирует продукцию интерферона типа I. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют продукцию интерферона типа I, включают STING, IRF1, IRF3, IRF5, IRF6, IRF7 и IRF8. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют воспалительный ответ, включают STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, NFAT и C/EBPb. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют сигналинг NFkB, включают IKKβ, c-FLIP, RIPK1, ИЛ-27, ApoF и PLP. Неограничивающим примером агента, который стимулирует мобилизацию ДК, является FLT3. Еще один агент, который потенцирует иммунные ответы, представляет собой DIABLO (SMAC/DIABLO).

В одном варианте осуществления агент, который потенцирует иммунный ответ, представляет собой конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию, неограничивающие примеры которой включают конструкты, кодирующие полипептид STING, IRF3, IRF7, STAT6, Myd88, Btk(E41K), TAK-TAB1, DIABLO (SMAC/DIABLO), TRAM(TICAM2) или полипептид самоактивирующейся каспазы-1, конструкты мРНК конститутивно активной IKKβ, конститутивно активной IKKα, c-FLIP и RIPK1.

В другом варианте осуществления дополнительный агент индуцирует активацию или примирование Т-клеток. Например, дополнительный агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, может представлять собой цитокин или хемокин. Неограничивающие примеры цитокинов или хемокинов, которые индуцируют активацию или примирование Т-клеток, включают ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 и CCL21. В одном варианте осуществления агент представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит цитокин или хемокин. В другом варианте осуществления агент представляет собой агент, который индуцирует продукцию цитокина или хемокина. В другом варианте осуществления агент представляет собой конструкт мРНК, кодирующий цитокин или хемокин. В другом варианте осуществления агент представляет собой конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который индуцирует хемокин или цитокин.

В другом варианте осуществления дополнительный агент модулирует иммунную контрольную точку. В данной области техники были описаны различные ингибиторы иммунных контрольных точек, включая ингибиторы PD-1, ингибиторы PD-L1 и ингибиторы CTLA-4. Другие модуляторы иммунных контрольных точек могут быть нацелены на OX-40, OX-40L или ICOS. В одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой антитело. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой белок или низкомолекулярный модулятор. В другом варианте осуществления агент (такой как мРНК) кодирует модулятор-антитело иммунной контрольной точки.

В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на PD-1. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на PD-1, включают пембролизумаб, алемтузумаб, атезолизумаб, ниволумаб, ипилимумаб, пидилизумаб, офатумумаб, ритуксимаб, MEDI0680 и PDR001, AMP-224, PF-06801591, BGB-A317, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, авелумаб, дурвалумаб и аффимер.

В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на PD-L1. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на PD-L1, включают авелумаб (MSB0010718C), атезолизумаб (MPDL3280A), дурвалумаб (MEDI4736) и BMS936559.

В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на CTLA-4. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на CTLA-4, включают ипилимумаб, тремелимумаб и AGEN1884.

В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на OX-40 или OX-40L. В одном варианте осуществления агент, который нацелен на OX-40 или OX-40L, представляет собой конструкт мРНК, кодирующий полипептид Fc-OX-40L. В еще других вариантах осуществления агент, который нацеливается на OX-40 или OX-40L, представляет собой иммуностимулирующее агонистическое анти-OX-40 или анти-OX-40L антитело, примеры которого известны в данной области техники, включают MEDI6469 (агонистическое анти-OX40 антитело) и MOXR0916 (агонистическое анти-OX40 антитело).

В еще одном другом варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой агонист пути ICOS.

Компоненты конструкта мРНК

мРНК может быть природной или не встречающейся в природе мРНК. мРНК может содержать одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов, как описано ниже, и в этом случае ее можно назвать «модифицированной мРНК» или «ммРНК». Как описано в данном документе «нуклеозид» определяется как соединение, содержащее молекулу сахара (например, пентозу или рибозу) или ее производное в комбинации с органическим основанием (например, пурином или пиримидином) или его производным (также упоминается в данном документе как «нуклеотидное основание»). Как описано в данном документе, «нуклеотид» определяется как нуклеозид, содержащий фосфатную группу.

мРНК может содержать 5'-нетранслируемую область (5'-НТО), 3'-нетранслируемую область (3'-НТО) и/или кодирующую область (например, открытую рамку считывания). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21. Другая иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23. мРНК может содержать любое подходящее количество пар оснований, включая десятки (например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100), сотни (например, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900) или тысячи (например, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000) пар оснований. Любое количество (например, все, некоторые или ни одного) нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов может быть аналогом канонических типов, замещенного, модифицированного или иного не встречающегося в природе. В определенных вариантах осуществления все конкретные типы нуклеотидных оснований могут быть модифицированы.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, как описано в данном документе, может содержать структуру 5'-кэп, терминирующий нуклеотид, необязательно последовательность Козак (также известную как консенсусная последовательность Козак), «шпильку», поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования.

Структура 5'-кэп или типы кэп-структур представляют собой соединение, содержащее две части нуклеозида, соединенные линкером, и могут быть выбраны из природной кэп-структуры, не встречающейся в природе кэп-структуры или аналога кэп-структуры или аналога кэп-структуры с правильной ориентацией (ARCA). Тип кэп-структуры может содержать один или более модифицированных нуклеозидов и/или линкерных фрагментов. Например, природная кэп-структура мРНК может содержать гуаниновый нуклеотид и гуаниновый нуклеотид (G), метилированный в положении 7, соединенные трифосфатной связью в их 5'положениях, например, m⁷G(5')ppp(5')G, обычно записывается как m⁷GpppG. Тип кэп-структуры также может быть аналогом кэп-структуры с правильной ориентацией. Неограничивающий перечень возможных типов кэп-структур включает m⁷GpppG, m⁷Gpppm⁷G, m⁷3′dGpppG, m₂^7,O3′GpppG, m₂^7,O3′GppppG, m₂^7,O2′GppppG, m⁷Gpppm⁷G, m⁷3′dGpppG, m₂^7,O3′GpppG, m₂^7,O3′GppppG, и m₂^7,O2′GppppG.

мРНК может вместо или дополнительно содержать терминирующий нуклеозид. Например, терминирующий нуклеозид может включать те нуклеозиды, которые дезоксигенированы в 2' и/или 3' положениях их сахарной группы. Такие типы могут включать 3'дезоксиаденозин (кордицепин), 3'дезоксиуридин, 3'дезоксицитозин, 3'дезоксигуанозин, 3'дезокситимин, и 2',3'дидезоксинуклеозиды, такие как 2',3'дидезоксиаденозин, 2',3'дидезоксиуридин, 2',3'дидезоксицитозин, 2',3'дидезоксигуанозин, и 2',3'дидезокситимин. В некоторых вариантах осуществления включение терминирующего нуклеотида в мРНК, например при 3'-конце, может привести к стабилизации мРНК, как описано, например, в международной патентной публикации №WO 2013/103659.

мРНК может вместо или дополнительно содержать «шпильку», такую как гистоновую шпильку. «Шпилька» может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более пар нуклеотидных оснований. Например, шпилька может содержать 4, 5, 6, 7 или 8 пар нуклеотидных оснований. Шпилька может быть расположена в любой области мРНК. Например, шпилька может быть расположена в, до или после нетранслируемой области (5'-нетранслируемой области или 3'-нетранслируемой области), кодирующей области или последовательности или поли(А)-хвоста. В некоторых вариантах осуществления шпилька может влиять на одну или более функций мРНК, таких как инициация трансляции, эффективность трансляции и/или терминация транскрипции.

мРНК может вместо или дополнительно содержать поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. Поли(А)-последовательность может состоять полностью или в основном из адениновых нуклеотидов или их аналогов или производных. Поли(А)-последовательность может представлять собой хвост, расположенный рядом с 3'-нетранслируемой областью мРНК. В некоторых вариантах осуществления поли(А)-последовательность может влиять на ядерный экспорт, трансляцию и/или стабильность мРНК.

мРНК может вместо или дополнительно содержать сайт связывания микроРНК.

В некоторых вариантах осуществления мРНК представляет собой бицистронную мРНК, содержащую первую кодирующую область и вторую кодирующую область с промежуточной последовательностью, содержащей последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES), которая позволяет инициировать внутреннюю трансляцию между первой и второй кодирующими областями, или с промежуточной последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид, такой как пептид 2А. Последовательности IRES и пептиды 2А обычно используются для усиления экспрессии множества белков из одного и того же вектора. Множество последовательностей IRES известны и доступны в данной области техники и могут быть использованы, включая, например, IRES вируса энцефаломиокардита.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды согласно данному раскрытию могут содержать последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид. Саморасщепляющийся пептид может представлять собой, но не ограничиваясь этим, пептид 2А. Разнообразные пептиды 2А известны и доступны в данной области техники и могут быть использованы, включая, например, пептид 2А вируса ящура, пептид 2А вируса ринита А, пептид 2А вируса Thosea asigna и пептид 2А тешовируса-1 свиней. Пептиды 2A используются несколькими вирусами для синтеза двух белков из одного транскрипта путем ухода с рибосомы, так что нормальная пептидная связь нарушается в пептидной последовательности 2A, в результате чего в одном трансляционном событии образуются два прерывистых белка. В качестве неограничивающего примера, пептид 2А может иметь последовательность белка: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 24), его фрагменты или варианты. В одном варианте осуществления пептид 2А расщепляется между последним глицином и последним пролином. В качестве другого неограничивающего примера, полинуклеотиды согласно данному раскрытию могут содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую пептид 2А, имеющий последовательность белка GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 24), его фрагменты или варианты. Одним из примеров полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид 2А, является: GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 25). В одном иллюстративном варианте осуществления пептид 2А кодируется следующей последовательностью: 5'-TCCGGACTCAGATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTG ATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC-3'(SEQ ID NO: 26). Полинуклеотидная последовательность пептида 2А может быть модифицирована или оптимизирована по кодонам способами, описанными в данном документе, и/или известными в данной области техники.

В одном варианте осуществления эта последовательность может использоваться для разделения кодирующих областей двух или более представляющих интерес полипептидов. В качестве неограничивающего примера, последовательность, кодирующая пептид F2A, может находиться между первой кодирующей областью A и второй кодирующей областью B (A-F2Apep-B). Присутствие пептида F2A приводит к расщеплению одного длинного белка между глицином и пролином в конце пептидной последовательности F2A (NPGP расщепляется с образованием NPG и P), образуя тем самым отдельный белок A (с 21 аминокислотой присоединенного пептида F2A, заканчивающегося NPG) и отдельный белок B (с 1 аминокислотой P присоединенного пептида F2A). Аналогично, для других пептидов 2A (P2A, T2A и E2A) присутствие пептида в длинном белке приводит к расщеплению между глицином и пролином в конце последовательности пептида 2A (NPGP расщепляется с образованием NPG и P). Белок А и белок В могут представлять собой одинаковые или разные представляющие интерес пептиды или полипептиды. В конкретных вариантах осуществления белок A представляет собой полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, а белок B представляет собой другой полипептид, который стимулирует воспалительный и/или иммунный ответ, и/или регулирует иммунологическую реактивность (как описано далее ниже).

Модифицированные мРНК

Хотя в некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию полностью содержит немодифицированные нуклеотидные основания, нуклеозиды или нуклеотиды, в некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов (называемых «модифицированными мРНК» или «ммРНК»). В некоторых вариантах осуществления модифицированные мРНК могут иметь полезные свойства, включая повышенную стабильность, внутриклеточную задержку, улучшенную трансляцию и/или отсутствие значительной индукции врожденного иммунного ответа клетки, в которую вводится мРНК, по сравнению с эталонной немодифицированной мРНК. Следовательно, использование модифицированных мРНК может повышать эффективность продукции белка, внутриклеточное удержание нуклеиновых кислот, а также сохранять пониженную иммуногенность.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит одно или более (например, 1, 2, 3 или 4) различных модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления мРНК cодержит одно ли более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более) различных модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированная мРНК может иметь пониженную деградацию в клетке, в которую введена мРНК, по сравнению с соответствующей немодифицированной мРНК.

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный урацил. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный урацил, включают псевдоуридин (ψ), пиридин-4-один рибонуклеозид, 5-азауридин, 6-азауридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиоуридин (s²U), 4-тиоуридин (s⁴U), 4-тиопсевдоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 5-гидроксиуридин (ho⁵U), 5- аминоаллилуридин, 5-галоуридин (например, 5-иодуридин 5-бромуридин), 3-метилуридин (m³U), 5-метоксиуридин (mo⁵U), уридин-5-оксиуксусную кислоту (cmo⁵U), метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты (mcmo⁵U), 5-карбоксиметилуридин (cm⁵U), 1-карбоксиметилпсевдоуридин, 5-карбоксигидроксиметилуридин (chm⁵U), метиловый эфир 5-карбоксигидроксиметилуридина (mchm⁵U), 5-метоксикарбонилметилуридин (mcm⁵U), 5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин (mcm⁵s²U), 5-аминометил-2-тиоуридин (nm⁵s²U), 5-метиламинометилуридин (mnm⁵U), 5-метиламинометил-2-тиоуридин (mnm⁵s²U), 5-метиламинометил-2-селеноуридин (mnm⁵se²U), 5-карбамоилметилуридин (ncm⁵U), 5-карбоксиметиламинометилуридин (cmnm⁵U), 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин (cmnm⁵s²U), 5-пропинилуридин, 1-пропинилпсевдоуридин, 5-тауринометилуридин (τm⁵U), 1-тауринометилпсевдоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин (τm⁵s²U), 1-тауринометил-4-тиопсевдоуридин, 5-метилуридин (m⁵U, т.е. имеющий основание нуклеиновой кислоты дезокситимин), 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 5-метил-2-тиоуридин (m⁵s²U), 1-метил-4-тиопсевдоуридин (m¹s⁴ψ), 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 3-метилпсевдоуридин (m³ψ), 2-тио-1-метилпсевдоуридин, 1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, дигидроуридин (D), дигидропсевдоуридин, 5,6-дигидроуридин, 5-метилдигидроуридин (m⁵D), 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тиоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, N1-метилпсевдоуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин (acp³U), 1-метил-3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридин (acp³ ψ), 5-(изопентениламинометил)уридин (inm⁵U), 5-(изопентениламинометил)-2-тиоуридин (inm⁵s²U), (-тиоуридин, 2'-O-метилуридин (Um), 5,2'-O-диметилуридин (m⁵Um), 2'-O-метилпсевдоуридин (ψm), 2-тио-2'-O-метилуридин (s²Um), 5-метоксикарбонилметил-2'-O-метилуридин (mcm⁵Um), 5-карбамоилметил-2'-O-метилуридин (ncm⁵Um), 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метилуридин (cmnm⁵Um), 3,2'-O-диметилуридин (m³Um),и 5-(изопентениламинометил)-2'-O-метилуридин (inm⁵Um), 1-тиоуридин, дезокситимидин, 2'-F-арауридин, 2'-F-уридин, 2'-OH-арауридин, 5-(2-карбометоксивинил)уридин и 5-[3-(1-Е-пропениламино)уридин].

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный цитозин, включают 5-азацитидин, 6-азацитидин, псевдоизоцитидин, 3-метилцитидин (m³C), N4-ацетилцитидин (ac⁴C), 5-формилцитидин (f⁵C), N4-метилцитидин (m⁴C), 5-метилцитидин (m⁵C), 5-галогенцитидин (например, 5-иодцитидин), 5-гидроксиметилцитидин (hm⁵C), 1-метилпсевдоизоцитидин, пирролоцитидин, пирролопсевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин (s²C), 2-тио-5-метилцитидин, 4-тиопсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-1-дезазапсевдоизоцитидин, 1-метил-1-дезазапсевдоизоцитидин, зебуларин, 5-азазебуларин, 5-метилзебуларин, 5-аза-2-тиозебуларин, 2-тиозебуларин, 2-метоксицитидин, 2-метокси-5-метилцитидин, 4-метоксипсевдоизоцитидин, 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидин, лизидин (k₂C), α-тиоцитидин, 2'-O-метилцитидин (Cm), 5,2'-O-диметилцитидин (m⁵Cm), N4-ацетил-2'-O-метилцитидин (ac⁴Cm), N4,2'-O-диметилцитидин (m⁴Cm), 5-формил-2'-O-метилцитидин (f⁵Cm), N4,N4,2'-O-триметилцитидин (m⁴₂Cm), 1-тиоцитидин, 2'-F-арацитидин, 2'-F-цитидин и 2'-OH-арацитидин.

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный аденин, включают α-тиоаденозин, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 2-амино-6-галогенпурин (например, 2-амино-6-хлорпурин), 6-галогенпурин (например, 6-хлорпурин), 2-амино-6-метилпурин, 8-азидоаденозин, 7-дезазааденин, 7-дезаза-8-азааденин, 7-дезаза-2-аминопурин, 7-дезаза-8-аза-2-аминопурин, 7-дезаза-2,6-диаминопурин, 7-дезаза-8-аза-2,6-диаминопурин, 1-метиладенозин (m¹A), 2-метиладенин (m²A), N6-метиладенозин (m⁶A), 2-метилтио-N6-метиладенозин (ms²m⁶A), N6-изопентениладенозин (i⁶A), 2-метилтио-N6-изопентениладенозин (ms²i⁶A), N6-цис-гидроксиизопентенил)аденозин (io⁶A), 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин (ms²io⁶A), N6-глицинилкарбамоиладенозин (g⁶A), N6-треонилкарбамоиладенозин (t⁶A), N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин (m⁶t⁶A), 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин (ms²g⁶A), N6,N6-диметиладенозин (m⁶₂A), N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (hn⁶A), 2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (ms²hn⁶A), N6-ацетиладенозин (ac⁶A), 7-метиладенин, 2-метилтиоаденин, 2-метоксиаденин, α-тиоаденозин, 2'-O-метиладенозин (Am), N6,2'-O-диметиладенозин (m⁶Am), N6,N6,2'-O-триметиладенозин (m⁶₂Am), 1,2'-O-диметиладенозин (m¹Am), 2'-O-рибозиладенозин (фосфат) (Ar(p)), 2-амино-N6-метилпурин, 1-тиоаденозин, 8-азидоаденозин, 2'-F-арааденозин, 2'-F-аденозин, 2'-OH-арааденозин и N6-(19-аминопентаоксанонадецил)-аденозин.

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный гуанин, включают α-тиогуанозин, инозин (I), 1-метилинозин (m¹I), виозин (imG), метилвиозин (mimG), 4-деметилвиозин (imG-14), изовиозин (imG2), вибутозин (yW), пероксивибутозин (o₂yW), гидроксивибутозин (OhyW), недостаточно модифицированный гидроксивибутозин (OhyW*), 7-дезазагуанозин, квеуозин (Q), эпоксиквеуозин (oQ), галактозилквеуозин (galQ), маннозилквеуозин (manQ), 7-циано-7-дезазагуанозин (preQ₀), 7-аминометил-7-дезазагуанозин (preQ₁), археозин (G⁺), 7-дезаза-8-азагуанозин, 6-тиогуанозин, 6-тио-7-дезазагуанозин, 6-тио-7-дезаза-8-азагуанозин, 7-метилгуанозин (m⁷G), 6-тио-7-метилгуанозин, 7-метилинозин, 6-метоксигуанозин, 1-метилгуанозин (m¹G), N2-метилгуанозин (m²G), N2,N2-диметилгуанозин (m²₂G), N2,7-диметилгуанозин (m^2,7G), N2,N2,7-диметилгуанозин (m^2,2,7G), 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксо-гуанозин, 1-метил-6-тиогуанозин, N2-метил-6-тиогуанозин, N2,N2-диметил-6-тиогуанозин, α-тиогуанозин, 2'-O-метилгуанозин (Gm), N2-метил-2'-O-метилгуанозин (m²Gm), N2,N2-диметил-2'-O-метилгуанозин (m²₂Gm), 1-метил-2'-O-метилгуанозин (m¹Gm), N2,7-диметил-2'-O-метилгуанозин (m^2,7Gm), 2'-O-метилинозин (Im), 1,2'-O-диметилинозин (m¹Im), 2'-O-рибозилгуанозин (фосфат) (Gr(p)), 1-тиогуанозин, О6-метилгуанозин, 2'-F-арагуанозин и 2'-F-гуанозин.

В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований). В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), и мРНК согласно раскрытию полностью модифицирована N1-метилпсевдоуридином (m¹ψ). В некоторых вариантах осуществления N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ) представляет 75-100% урацилов в мРНК. В некоторых вариантах осуществления N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ) представляет 100% урацилов в мРНК.

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный цитозин, включают N4-ацетилцитидин (ac⁴C), 5-метилцитидин (m⁵C), 5-галогенцитидин (например, 5-иодцитидин), 5-гидроксиметилцитидин (hm⁵C), 1-метил-псевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин (s²C), 2-тио-5-метилцитидин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный аденин, включают 7-дезазааденин, 1-метиладенозин (m¹A), 2-метиладенин (m²A), N6-метиладенозин (m⁶A). В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).

В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный гуанин, включают инозин (I), 1-метилинозин (m¹I), виозин (imG), метилвиозин (mimG), 7-дезазагуанозин, 7-циано-7-дезазагуанозин (preQ₀), 7-аминометил-7-дезазагуанозин (preQ₁), 7-метилгуанозин (m⁷G), 1-метилгуанозин (m¹G), 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксогуанозин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).

В некоторых вариантах осуществления модифициованное основание представляет собой 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ), 5-метоксиуридин (mo⁵U), 5-метилцитидин (m⁵C), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или α-тиоаденозин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит псевдоуридин (ψ). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (m⁵C). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (m¹ψ) и 5-метилцитидин (m⁵C). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2-тиоуридин (s²U). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (m⁵C). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5-метоксиуридин (mo⁵U). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5-метоксиуридин (mo⁵U) и 5-метилцитидин (m⁵C). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2'-O-метилуридин. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (m⁵C). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит N6-метиладенозин (m⁶A). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит N6-метиладенозин (m⁶A) и 5-метилцитидин (m⁵C).

В определенных вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию является равномерно модифицированной (то есть полностью модифицированной, модифицированной по всей последовательности) для конкретной модификации. Например, мРНК может быть равномерно модифицирована 5-метилцитидином (m⁵C), что означает, что все остатки цитозина в последовательности мРНК заменены 5-метилцитидином (m⁵C). Подобным образом, мРНК согласно раскрытию может быть равномерно модифицирована для любого типа нуклеозидного остатка, присутствующего в последовательности, путем замены модифицированным остатком, таким как указанные выше.

В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию может быть модифицирована в кодирующей области (например, в открытой рамке считывания, кодирующей полипептид). В других вариантах осуществления мРНК может быть модифицирована в областях помимо кодирующей области. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены 5'-НТО и/или 3'-НТО, причем одна или обе могут независимо содержать одну или более различных модификаций нуклеозидов. В таких вариантах осуществления модификации нуклеозидов также могут присутствовать в кодирующей области.

Примеры модификаций нуклеозидов и их комбинаций, которые могут присутствовать в ммРНК согласно данному раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, описанные в публикациях заявок на патенты PCT: WO2012045075, WO2014081507, WO2014093924, WO2014164253 и WO2014159813.

ммРНК согласно раскрытию может содержать комбинацию модификаций сахара, нуклеотидного основания и/или межнуклеозидной связи. Эти комбинации могут содержать любую одну или более модификаций, описанных в данном документе.

Примеры модифицированных нуклеозидов и комбинаций модифицированных нуклеозидов представлены ниже в Таблице 1 и Таблице 2. Данные комбинации модифицированных нуклеотидов могут быть использованы для образования ммРНК согласно раскрытию. В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеозиды могут быть частично или полностью замещены природными нуклеотидами мРНК согласно раскрытию. В качестве неограничивающего примера природный уридиновый нуклеотид может быть замещен модифицированным нуклеозидом, описанным в данном документе. В другом неограничивающем примере природный нуклеозид уридин может быть частично замещен (например, около 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99,9% природных уридинов) по меньшей мере одним модифицированным нуклеозидом, раскрытым в данном документе.

Таблица 1. Комбинации модификаций нуклеозидов

Модифицированный нуклеотид	Комбинация модифицированных нуклеотидов
α-тиоцитидин	α-тиоцитидин/5-иодуридин
	α-тиоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
	α-тиоцитидин/α-тиоуридин
	α-тиоцитидин/5-метилуридин
	α-тиоцитидин/псевдоуридин
около 50% цитозинов представляют собой α-тио-цитидин
псевдоизоцитидин	псевдоизоцитидин/5-иодуридин
	псевдоизоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
	псевдоизоцитидин/α-тиоуридин
	псевдоизоцитидин/5-метилуридин
	псевдоизоцитидин/псевдоуридин
	около 25% цитозинов представляют собой псевдоизоцитидин
	псевдоизоцитидин/около 50% уридинов представляют собой N1-метил-псевдоуридин и около 50% уридинов представляют собой псевдоуридин
псевдоизоцитидин/около 25% уридинов представляют собой N1-метилпсевдоуридин и около 25% уридинов представляют собой псевдоуридин
пирролоцитидин	пирролоцитидин/5-иодуридин
	пирролоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
	пирролоцитидин/α-тиоуридин
	пирролоцитидин/5-метилуридин
	пирролоцитидин/псевдоуридин
около 50% цитозинов представляют собой пирролоцитидин
5-метилцитидин	5-метилцитидин/5-иодуридин
	5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
	5-метилцитидин/α-тиоуридин
	5-метилцитидин/5-метилуридин
	5-метилцитидин/псевдоуридин
	около 25% цитозинов представляют собой 5-метилцитидин
	около 50% цитозинов представляют собой 5-метилцитидин
	5-метилцитидин/5-метоксиуридин
	5-метилцитидин/5-бромуридин
	5-метилцитидин/2-тиоуридин
	5-метилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин
около 50% уридинов представляют собой 5-метилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин
N4-ацетилцитидин	N4-ацетилцитидин/5-иодуридин
	N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
	N4-ацетилцитидин/α-тиоуридин
	N4-ацетилцитидин/5-метилуридин
	N4-ацетилцитидин/псевдоуридин
	около 50% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин
	около 25% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин
	N4-ацетилцитидин/5-метоксиуридин
	N4-ацетилцитидин/5-бромуридин
	N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин
около 50% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин

Таблица 2. Модифицированные нуклеозиды и их комбинации

1-(2,2,2-трифторэтил)псевдо-УТФ

1-этилпсевдо-УТФ

1-метилпсевдо-У-альфа-тио-ТФ

1-метилпсевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ

1-метилпсевдо-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

1-метилпсевдо-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ

1-пропилпсевдо-УТФ

25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

25% 5-карбокси-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-карбокси-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-этил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-этил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-этинил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-этинил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-фтор-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-фтор-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-формил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-формил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-гидроксиметил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-гидроксиметил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-иод-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-иод-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-метокси-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-метокси-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/5-метокси-УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ

25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-фенил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-фенил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

25% N4-Ac-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% N4-Ac-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% N4-Bz-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% N4-Bz-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% N4-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% N4-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% псевдоизо-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

25% псевдоизо-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

25% 5-бром-ЦТФ/75% ЦТФ/псевдо-УТФ

25% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

25% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

25% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

25% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ

25% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

2-амино-АТФ

2-тио-ЦТФ

2-тиопсевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ

2-тиопсевдо-УТФ

2-тио-УТФ

3-метил-ЦТФ

3-метилпсевдо-УТФ

4-тио-УТФ

50% 5-бром-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-гидроксиметил-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/5-метокси-УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

50% 5-трифторметил-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

50% 5-бром-ЦТФ/50% ЦТФ/псевдо-УТФ

50% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

50% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

50% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

50% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ

5-аминоаллил-ЦТФ

5-аминоаллил-ЦТФ/ 5-метокси-УТФ

5-аминоаллил-УТФ

5-бром-ЦТФ

5-бром-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-бром-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

5-бром-ЦТФ/псевдо-УТФ

5-бромцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ

5-бром-УТФ

5-карбокси-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-этил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-этинил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-фтор-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-формил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-гидроксиметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-гидроксиметил-ЦТФ

5-гидроксиметил-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

5-гидроксиметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-гидроксиметилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ

5-иод-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-Me-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-метоксикарбонил метил-УТФ

5-метокси-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-метоксиуридин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ

5-метокси-УТФ

5-метокси-УТФ

5-метокси-УТФ/N6-изопентенил-АТФ

5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ

5-метил-2-тио-УТФ

5-метиламинометил-УТФ

5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ (кэп 0)

5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ (без кэпа)

5-метил-ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ

5-метил-ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

5-метил-ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ

5-метил-ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ

5-метил- ЦТФ/5-метокси-УТФ/N6-Ме-АТФ

5-метил-ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ

5-метил-ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

5-фенил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-трифторметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-трифторметил-ЦТФ

5-трифторметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

5-трифторметил-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

5-трифторметил-ЦТФ/псевдо-УТФ

5-трифторметил-УТФ

5-трифторметилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ

75% 5-аминоаллил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-аминоаллил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-бром-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-бром-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-карбокси-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-карбокси-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-этил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-этил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-этинил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-этинил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-фтор-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-фтор-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-формил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-формил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-гидроксиметил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-гидроксиметил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-иод-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-иод-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-метокси-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-метокси-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/5-метокси-УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ

75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-фенил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-фенил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

75% N4-Ac-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% N4-Ac-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% N4-Bz-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% N4-Bz-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% N4-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% N4-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% псевдоизо-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

75% псевдоизо-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

75% 5-бром-ЦТФ/25% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

75% 5-бром-ЦТФ/25% ЦТФ/псевдо-УТФ

75% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

75% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

75% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ

75% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ

8-аза-АТФ

Альфа-тио-ЦТФ

ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ

ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ

ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ

ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ

ЦТФ/5-Метокси-УТФ

ЦТФ/5-метокси-УТФ (кэп 0)

ЦТФ/5-метокси-УТФ (без кэпа)

ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ

ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ

ЦТФ/УТФ (без кэпа)

N1-Me-ГТФ

N4-Ac-ЦТФ

N4Ac-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ

N4Ac-ЦТФ/5-метокси-УТФ

N4-ацетилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ

N4-Bz-ЦТФ/5-метокси-УТФ

N4-метил ЦТФ

N4-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ

Псевдоизо-ЦТФ/5-метокси-УТФ

псевдо-У-альфа-тио-ТФ

псевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ

псевдо-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ

метиловый эфир УТФ-5-оксиуксусной кислоты

Ксантозин

В соответствии с раскрытием полинуклеотиды согласно раскрытию могут быть синтезированы, чтобы содержать комбинации или отдельные модификации из Таблицы 1 или Таблицы 2.

Если указана одна модификация, указанный нуклеозид или нуклеотид представляет 100 процентов того нуклеотида или нуклеозида, A, U, G или C, который был модифицирован. Там, где указаны проценты, они представляют собой процентное содержание данного конкретного трифосфата нуклеотидного основания A, U, G или C от общего количества присутствующего трифосфата A, U, G или C. Например, комбинация: 25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/ 25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ относится к полинуклеотиду, где 25% цитозинтрифосфаты представляют собой 5-аминоаллил-ЦТФ, в то время как 75% цитозинов представляют собой ЦТФ; тогда как 25% урацилов представляют собой 5-метокси-УТФ, в то время как 75% урацилов представляют собой УТФ. Если в списке нет модифицированных УТФ, то встречающиеся в природе АТФ, ЦТФ, ГТФ и/или ЦТФ используются в 100% сайтов этих нуклеотидов, обнаруженных в полинуклеотиде. В этом примере все нуклеотиды ГТФ и АТФ остаются немодифицированными.

мРНК согласно данному раскрытию, или их области могут быть оптимизированы по кодонам. Методы оптимизации кодонов известны в данной области техники и могут быть полезны для различных целей: согласования частот кодонов в организмах-хозяевах для обеспечения надлежащего свертывания, сдвига в данных содержания GC для повышения стабильности мРНК или уменьшения вторичных структур, минимизации тандемных повторных кодонов или базовых прогонов, которые могут нарушать конструирование или экспрессию генов, настраивания области контроля транскрипции и трансляции, вставки или удаления последовательности переноса белков, удаления/добавления сайтов посттрансляционной модификации в кодируемых белках (например, сайты гликозилирования), добавления, удаления или перетасовке белковых доменов, вставки или удаления сайтов рестрикции, модификации сайтов связывания рибосом и сайтов деградации мРНК, регуляции скорости трансляции, чтобы позволить различным доменам белка правильно сворачиваться, или уменьшать или устранять проблемные вторичные структуры в полинуклеотиде. В данной области техники известны инструменты, алгоритмы и сервисы оптимизации; неограничивающие примеры включают сервисы от GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park, CA) и/или проприетарные методы. В одном варианте осуществления последовательность мРНК оптимизируют с использованием алгоритмов оптимизации, например, для оптимизации экспрессии в клетках млекопитающих или повышения стабильности мРНК.

В определенных вариантах осуществления данное раскрытие включает полинуклеотиды, имеющие по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с любой из полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе.

мРНК согласно данному раскрытию могут быть получены способами, доступными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию in vitro (IVT) и методы синтеза. Можно использовать ферментативные (IVT), твердофазные, жидкофазные, комбинированные методы синтеза, синтез малых областей и способы лигирования. В одном варианте осуществления мРНК получают с использованием методов ферментативного синтеза IVT. Способы получения полинуклеотидов с помощью IVT известны в данной области техники описаны в международной заявке PCT/US2013/30062, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. Соответственно, данное раскрытие также включает полинуклеотиды, например ДНК, конструкты (например, плазмиды) и векторы (например, вирусные векторы), которые можно использовать для транскрипции in vitro мРНК, описанной в данном документе.

Неприродные модифицированные нуклеотидные основания могут быть введены в полинуклеотиды, например, мРНК, во время синтеза или после синтеза. В определенных вариантах осуществления модификации могут быть на межнуклеозидных связях, пуриновых или пиримидиновых основаниях или сахаре. В конкретных вариантах осуществления модификация может быть введена на конце полинуклеотидной цепи или где-либо еще в полинуклеотидной цепи; с использованием химического синтеза или полимеразы. Примеры модифицированных нуклеиновых кислот и их синтез раскрыты в заявке PCT №PCT/US2012/058519. Синтез модифицированных полинуклеотидов также описан в Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998).

Для конъюгирования полинуклеотидов или их областей с различными функциональными группами, такими как нацеливающие агенты или агенты доставки, флуоресцентные метки, жидкости, наночастицы и т.д. можно использовать или методы ферментативного, или химического лигирования. Конъюгаты полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидов рассматриваются в Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990).

Сайты связывания микроРНК (миРНК)

Полинуклеотиды согласно раскрытию могут содержать регуляторные элементы, например сайты связывания микроРНК (миРНК), сайты связывания фактора транскрипции, структурированные последовательности и/или мотивы мРНК, искусственные сайты связывания, сконструированные так, чтобы действовать в качестве псевдорецепторов для молекул, связывающих эндогенную нуклеиновую кислоту, и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие такие регуляторные элементы, упоминаются как содержащие «сенсорные последовательности». Неограничивающие примеры сенсорных последовательностей описаны в публикации США 2014/0200261, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, рибонуклеиновая кислота (РНК), например, матричная РНК (мРНК)) согласно раскрытию содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую представляющий интерес полипептид, и дополнительно содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК. Включение или вставка сайта(ов) связывания миРНК обеспечивает регуляцию полинуклеотидов согласно раскрытию и, в свою очередь, полипептидов, кодируемых из них, на основе тканеспецифической и/или специфической для клеточного типа экспрессии природных миРНК.

миРНК, например природная миРНК, представляет собой некодирующую РНК длиной 19-25 нуклеотидов, которая связывается с полинуклеотидом и подавляет экспрессию генов или путем снижения стабильности, или путем ингибирования трансляции полинуклеотида. Последовательность миРНК содержит «затравочную» область, то есть последовательность в области положений 2-8 зрелой миРНК. Затравочная область миРНК может содержать положения 2-8 или 2-7 зрелой миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 7 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-8 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденозином (A), противоположным положению 1 миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 6 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-7 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденозином (A), противоположным положению 1 миРНК. См., например, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105. Профилирование миРНК целевых клеток или тканей может проводиться для определения наличия или отсутствия миРНК в клетках или тканях. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, рибонуклеиновая кислота (РНК), например, матричная РНК (мРНК)) согласно раскрытию содержит один или более сайтов связывания микроРНК, целевые последовательности РНК, комплементарные последовательности микроРНК или комплементарные последовательности затравочной области микроРНК. Такие последовательности могут соответствовать, например, иметь комплементарность с любой известной микроРНК, такой как те, которые описаны в публикации США US2005/0261218 и публикации США US2005/0059005, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Используемый в данном документе термин «сайт связывания микроРНК (миРНК или miR)» относится к последовательности в пределах полинуклеотида, например, в пределах ДНК или в пределах транскрипта РНК, в том числе в 5'-НТО и/или 3'-НТО, которая имеет достаточную комплементарность ко всей или к области миРНК для взаимодействия, соединения с или связывания с миРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит ОРС, кодирующую представляющий интерес полипептид, и дополнительно содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК. В иллюстративных вариантах осуществления 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида (например, рибонуклеиновой кислоты (РНК), например, матричной РНК (мРНК)) содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК.

Сайт связывания миРНК, имеющий достаточную комплементарность с миРНК, относится к степени комплементарности, достаточной для облегчения миРНК-опосредованной регуляции полинуклеотида, например, миРНК-опосредованной репрессии трансляции или деградации полинуклеотида. В иллюстративных аспектах раскрытия, сайт связывания миРНК, имеющий достаточную комплементарность к миРНК, относится к степени комплементарности, достаточной для облегчения миРНК-опосредованной деградации полинуклеотида, например, расщепления мРНК, опосредованного направляемым миРНК РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC). Сайт связывания миРНК может иметь комплементарность, например, с последовательностью миРНК из 19-25 нуклеотидов, с последовательностью миРНК из 19-23 нуклеотидов или с последовательностью миРНК из 22 нуклеотидов. Сайт связывания миРНК может быть комплементарен только части миРНК, например, части менее 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов природной полноразмерной последовательности миРНК. Полная или абсолютная комплементарность (например, полная комплементарность или абсолютная комплементарность по всей или значительной части длины природной миРНК) является предпочтительной, если желаемой регуляцией является деградация мРНК.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая имеет комплементарность (например, частичную или полную комплементарность) с затравочной последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая обладает полной комплементарностью с затравочной последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая имеет комплементарность (например, частичную или полную комплементарность) с последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая обладает полной комплементарностью с последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК обладает полной комплементарностью с последовательностью миРНК, но для 1, 2 или 3 нуклеотидных замен, концевых добавлений и/или усечений.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет ту же длину, что и соответствующая миРНК. В других вариантах осуществления сайт связывания миРНК на один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать нуклеотидов короче, чем соответствующая миРНК на 5'-конце, 3'- конце или обоих. В других вариантах осуществления сайт связывания микроРНК на два нуклеотида короче, чем соответствующая микроРНК на 5'-конце, 3'-конце или обоих. Сайты связывания миРНК, которые короче, чем соответствующие миРНК, по-прежнему способны разрушать мРНК, содержащую один или более сайтов связывания миРНК, или предотвращать трансляцию мРНК.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывает соответствующую зрелую миРНК, которая является частью активного RISC, содержащего дайсер. В другом варианте осуществления связывание сайта связывания миРНК с соответствующей миРНК в RISC приводит к деградации мРНК, содержащую сайт связывания миРНК, или препятствует трансляции мРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК обладает достаточной комплементарностью по отношению к миРНК, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, расщепляет полинуклеотид, содержащий сайт связывания миРНК. В других вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет неполную комплементарность, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, индуцирует нестабильность в полинуклеотиде, содержащем сайт связывания миРНК. В другом варианте осуществления сайт связывания миРНК имеет неполную комплементарность, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, репрессирует транскрипцию полинуклеотида, содержащего сайт связывания миРНК.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать несоответствий с соответствующей миРНК.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет по меньшей мере около десяти, по меньшей мере около одиннадцати, по меньшей мере около двенадцати, по меньшей мере около тринадцати, по меньшей мере около четырнадцати, по меньшей мере около пятнадцати, по меньшей мере около шестнадцати, по меньшей мере около семнадцати, при по меньшей мере около восемнадцати, по меньшей мере около девятнадцати, по меньшей мере около двадцати или по меньшей мере около двадцати одного смежных нуклеотидов, комплементарных по меньшей мере около десяти, по меньшей мере около одиннадцати, по меньшей мере около двенадцати, по меньшей мере около тринадцати, по меньшей мере около четырнадцати, по меньшей мере около пятнадцати, по меньшей мере около шестнадцати, по меньшей мере около семнадцати, по меньшей мере около восемнадцати, по меньшей мере около девятнадцати, по меньшей мере около двадцати или по меньшей мере около двадцати одного, соответственно, смежного нуклеотидам соответствующей миРНК.

Путем встраивания одного или более сайтов связывания миРНК в полинуклеотид согласно раскрытию, полинуклеотид может быть нацелен на деградацию или пониженную трансляцию, при условии наличия рассматриваемой миРНК. Это может уменьшить нежелательные эффекты при доставке полинуклеотида. Например, если полинуклеотид согласно раскрытию не предназначен для доставки в ткань или клетку, но в конечном итоге является указанной тканью или клеткой, то миРНК, присутствующая в ткани или клетке, может ингибировать экспрессию представляющего интерес гена, если один или множество сайтов связывания миРНК встроены в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида.

Наоборот, сайты связывания миРНК могут быть удалены из полинуклеотидных последовательностей, в которых они встречаются в природе, для увеличения экспрессии белка в определенных тканях. Например, сайт связывания для конкретной миРНК может быть удален из полинуклеотида для улучшения экспрессии белка в тканях или клетках, содержащих миРНК.

В одном варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере один сайт связывания миРНК в 5'-НТО и/или 3'-НТО для регуляции цитотоксических или цитопротекторных терапевтических средств на основе мРНК к конкретным клеткам, таким как, но не ограничиваясь этим, нормальные клетки и/или раковые клетки. В другом варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более сайтов связывания миРНК в 5'-НТО и/или 3'-НТО для регуляции цитотоксических или цитопротекторных терапевтических средств на основе мРНК к конкретным клеткам, таким как, но не ограничиваясь этим, нормальные клетки и/или раковые клетки.

Регуляция экспрессии во множестве тканях может быть достигнута путем введения или удаления одного или более сайтов связывания миРНК, например, одного или более отдельных сайтов связывания миРНК. Решение о том, удалять или вставлять сайт связывания миРНК, может быть принято на основе паттернов экспрессии миРНК и/или их профилирования в тканях и/или клетках в процессе развития и/или болезни. Сообщалось об идентификации миРНК, сайтов связывания миРНК, а также об их паттернах экспрессии и роли в биологии (например, Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 и ссылки, цитируемые в них; каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки).

миРНК и сайты связывания миРНК могут соответствовать любой известной последовательности, включая неограничивающие примеры, описанные в публикациях США №2014/0200261, 2005/0261218 и 2005/0059005, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.

Примеры тканей для которых известно, что миРНК регулирует мРНК и тем самым экспрессию белка, включают, но не ограничиваются ими, печень (miR-122), мышцы (miR-133, miR-206, miR-208), эндотелиальные клетки (miR -17-92, miR-126), миелоидные клетки (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), жировую ткань (let-7, miR-30c), эпителиальные клетки сердца (miR-1d, miR-149), почек (miR-192, miR-194, miR-204) и легких (let-7, miR-133, miR-126).

В частности, известно, что миРНК дифференциально экспрессируются в иммунных клетках (также называемых гемопоэтическими клетками), таких как антигенпрезентирующие клетки (АПК) (например, дендритные клетки и макрофаги), макрофаги, моноциты, B-лимфоциты, T-лимфоциты, гранулоциты, природные клетки-киллеры и т.д. миРНК, специфические для иммунных клеток, участвуют в иммуногенности, аутоиммунности, иммунном ответе на инфекцию, воспалении, а также в нежелательном иммунном ответе после генной терапии и трансплантации тканей/органов. Специфические для иммунных клеток миРНК также регулируют многие аспекты развития, пролиферации, дифференцировки и апоптоза гемопоэтических клеток (иммунных клеток). Например, miR-142 и miR-146 экспрессируются исключительно в иммунных клетках, особенно в больших количества в миелоидных дендритных клетках. Было продемонстрировано, что иммунный ответ на полинуклеотид можно блокировать путем добавления сайтов связывания miR-142 к 3'-НТО полинуклеотида, что обеспечивает более стабильный перенос генов в тканях и клетках. miR-142 эффективно разрушает экзогенные полинуклеотиды в антигенпрезентирующих клетках и подавляет цитотоксическую элиминацию трансдуцированных клеток (например, Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161; Brown BD, et al., Nat med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., blood, 2007, 110(13): 4144-4152, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

Антиген-опосредованный иммунный ответ может относиться к иммунному ответу, запускаемому чужеродными антигенами, которые при попадании в организм подвергаются процессингу антигенпрезентирующими клетками и отображаются на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Т-клетки могут распознавать представленный антиген и вызывать цитотоксическую элиминацию клеток, которые экспрессируют антиген.

Введение сайта связывания miR-142 в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию может избирательно подавлять экспрессию гена в антигенпрезентирующих клетках посредством опосредованной miR-142 деградации, ограничивая презентацию антигена в антигенпрезентирующих клетках (например, в дендритных клетках) и тем самым предотвращая антиген-опосредованный иммунный ответ после доставки полинуклеотида. Затем полинуклеотид стабильно экспрессируется в целевых тканях или клетках без запуска цитотоксической элиминации.

В одном варианте осуществления сайты связывания для миРНК, которые, как известно, экспрессируются в иммунных клетках, в частности в антигенпрезентирующих клетках, могут быть встроены в полинуклеотид согласно раскрытию для подавления экспрессии полинуклеотида в антигенпрезентирующих клетках посредством миРНК-опосредованной деградации РНК, ослабляя антиген-опосредованный иммунный ответ.Экспрессия полинуклеотида поддерживается в неиммунных клетках, в которых специфические для иммунных клеток миРНК не экспрессируются. Например, в некоторых вариантах осуществления для предотвращения иммуногенной реакции против специфического для печени белка может быть удален любой сайт связывания miR-122, а сайт связывания miR-142 (и/или mirR-146) может быть встроен в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию.

Для дополнительной стимуляции селективной деградации и подавления в АПК и макрофаге, полинуклеотид согласно раскрытию может содержать дополнительный негативный регуляторный элемент в 5'-НТО и/или 3'-НТО, один или в комбинации с сайтами связывания miR-142 и/или miR-146. В качестве неограничивающего примера, еще одним негативным регуляторным элементом является конститутивный элемент деградации (CDE).

Специфические для иммунных клеток миРНК включают, но не ограничиваются ими, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184, hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p,miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p,, miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p и miR-99b-5p. Кроме того, новые миРНК могут быть идентифицированы в иммунных клетках посредством гибридизации на микрочипах и анализа срезов (например, Jima DD et al, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288, содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в печени, включают, но не ограничиваются ими, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p и miR-939-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для печени миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в печени. Специфические для печени сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в легких, включают, но не ограничиваются ими, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p и miR-381-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для легких миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в легком. Специфические для легкого сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в сердце, включают, но не ограничиваются ими, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p и miR-92b-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для сердца микроРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в сердце. Специфические для сердца сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в нервной системе, включают, но не ограничиваются ими, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p,miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p,miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p и miR-9-5p. миРНК, находящиеся в значительном количестве в нервной системе, дополнительно включают те, которые специфически экспрессируются в нейронах, включая, но не ограничиваясь, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922 и те, которые специфически экспрессируются в глиальных клетках, включая, но не ограничиваясь, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p и miR-657. Сайты связывания миРНК из любой специфической для ЦНС миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в нервной системе. Специфические для нервной системы сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в поджелудочной железе, включают, но не ограничиваются ими, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p и miR-944. Сайты связывания миРНК из любой специфической для миРНК поджелудочной железы могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в поджелудочной железе. Специфические для поджелудочной железы сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в почках, включают, но не ограничиваются ими, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p и miR-562. Сайты связывания миРНК из любой специфической для почки миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в почке. Специфические для почки сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в мышцах, включают, но не ограничиваются ими, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p и miR-25-5p.Сайты связывания миРНК из любой специфической для мышц миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в мышце. Специфические для мыщц сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.

миРНК также дифференцированно экспрессируются в различных типах клеток, таких как, но не ограничиваясь ими, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и адипоциты.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в эндотелиальных клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p и miR-92b-5p. Многие новые миРНК обнаружены в эндотелиальных клетках в результате глубокого секвенирования (например, Voellenkle C. et al., RNA, 2012, 18, 472-484, включенная в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Сайты связывания миРНК из любой специфической для эндотелиальных клеток миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в эндотелиальных клетках.

миРНК, которые, как известно, экспрессируются в эпителиальных клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 и miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p, специфические для респираторных реснитчатых эпителиальных клеток, семейство let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126, специфические для эпителиальных клеток легкого, miR-382-3p, miR-382-5p специфические для эпителиальных клеток почки, и miR-762, специфические для эпителиальных клеток роговицы. Сайты связывания миРНК из любой специфической для эпителиальных клеток миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в эпителиальных клетках.

Кроме того, большая группа миРНК, находящиеся в значительном количестве в эмбриональных стволовых клетках, контролируя самообновление стволовых клеток, а также развитие и/или дифференцировку различных клеточных линий, таких как нервные клетки, кардиомиоциты, гемопоэтические клетки, клетки кожи, остеогенные клетки, и мышечные клетки (например, Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA and Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev. 2012, 21(11), 2049-2057, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки). миРНК, находящиеся в значительном количестве в эмбриональных стволовых клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-548l, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941,miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p и miR-99b-5p. Многие спрогнозированные новые миРНК обнаруживаются путем глубокого секвенирования в эмбриональных стволовых клетках человека (например, Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496-2505, содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

В одном варианте осуществления сайты связывания специфических для эмбриональных стволовых клеток миРНК могут быть включены или удалены из 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию для модуляции развития и/или дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, чтобы ингибировать старение стволовых клеток при дегенеративном состоянии (например, дегенеративные заболевания) или для стимуляции старения и апоптоза стволовых клеток при патологическом состоянии (например, раковых стволовых клеток).

Многие исследования экспрессии миРНК проводятся для профилирования дифференциальной экспрессии миРНК в различных раковых клетках/тканях и других заболеваниях. Некоторые миРНК аномально сверхэкспрессируются в определенных раковых клетках, а другие недостаточно экспрессируются. Например, миРНК дифференциально экспрессируются в раковых клетках (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO2011/157294); раковых стволовых клетках (US2012/0053224); злокачественных новообразованиях и заболеваниях поджелудочной железы (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); астме и воспалении (US8415096); раке простаты (US2013/0053264); гепатоцеллюлярной карциноме (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); клетки рака легкого (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); Т-клеточной лимфоме кожи (WO2013/011378); клетки колоректального рака (WO2011/0281756, WO2011/076142); лимфатических узлах положительных по раку (WO2009/100430, US2009/0263803); раке носоглотки (EP2112235); хронической обструктивной болезни легких (US2012/0264626, US2013/0053263); раке щитовидной железы (WO2013/066678); клетках рака яичников (US2012/0309645, WO2011/095623); клетках рака молочной железы (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), лейкозе и лимфоме (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563), содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

В качестве неограничивающего примера, сайты связывания миРНК для миРНК, которые сверхэкспрессируются в определенных раковых и/или опухолевых клетках, могут быть удалены из 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию, восстанавливая экспрессию, подавленную сверхэкспрессированными миРНК, в раковых клетках, таким образом улучшая соответствующую биологическую функцию, например, стимуляцию и/или репрессию транскрипции, остановку клеточного цикла, апоптоз и гибель клеток. Нормальные клетки и ткани, в которых экспрессия миРНК не повышена, останутся без изменений.

миРНК также может регулировать сложные биологические процессы, такие как ангиогенез (например, miR-132) (Anand и Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). В полинуклеотидах согласно раскрытию сайты связывания миРНК, которые участвуют в таких процессах, могут быть удалены или введены для того, чтобы адаптировать экспрессию полинуклеотидов к биологически соответствующим типам клеток или соответствующим биологическим процессам. В этом контексте полинуклеотиды согласно раскрытию определяются как ауксотрофные полинуклеотиды.

В некоторых вариантах терапевтическое окно и/или дифференциальная экспрессия (например, тканеспецифическая экспрессия) полипептида согласно раскрытию может быть изменена путем включения сайта связывания миРНК в мРНК, кодирующую полипептид. В одном примере мРНК может содержать один или более сайтов связывания миРНК, которые связаны миРНК, которые имеют более высокую экспрессию в одном типе ткани по сравнению с другим. В другом примере мРНК может содержать один или более сайтов связывания миРНК, которые связаны миРНК, которые имеют более низкую экспрессию в раковой клетке по сравнению с нераковой клеткой той же ткани по происхождению. Когда он присутствует в раковой клетке, которая экспрессирует низкие уровни такой миРНК, полипептид, кодируемый мРНК, обычно проявляет повышенную экспрессию.

Клетки рака печени (например, клетки гепатоцеллюлярной карциномы) обычно экспрессируют низкие уровни miR-122 по сравнению с нормальными клетками печени. Следовательно, мРНК, кодирующая полипептид, который содержит по меньшей мере один сайт связывания miR-122 (например, в 3'-НТО мРНК), обычно будет экспрессировать сравнительно низкие уровни полипептида в нормальных клетках печени и сравнительно высокие уровни полипептида в раковых клетках печени. Если полипептид способен индуцировать иммуногенную клеточную гибель, это может вызвать преимущественное иммуногенное клеточное уничтожение клеток рака печени (например, клеток гепатоцеллюлярной карциномы) по сравнению с нормальными клетками печени.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один сайт связывания miR-122, по меньшей мере два сайта связывания miR-122, по меньшей мере три сайта связывания miR-122, по меньшей мере четыре miR-122 или по меньшей мере пять сайтов связывания miR-122. В одном аспекте сайт связывания миРНК связывает miR-122 или является комплементарным к miR-122. В другом аспекте сайт связывания миРНК связывается с miR-122-3p или miR-122-5p.В конкретном аспекте сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 1326, причем сайт связывания миРНК связывается с miR-122. В другом аспекте сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 26, причем сайт связывания миРНК связывается с miR-122. Данные последовательности приведены ниже в Таблице 3.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит сайт связывания миРНК, причем сайт связывания миРНК содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из Таблицы 3, включая одну или более копий любой одной или более последовательностей сайта связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более одинаковых или разных сайтов связывания миРНК, выбранных из Таблицы 3, включая любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывается с miR-142 или является комплементарным к miR-142. В некоторых вариантах осуществления miR-142 содержит SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывается с miR-142-3p или miR-142-5p. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания miR-142-3p содержит SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания miR-142-5p содержит SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 31.

Таблица 3. Репрезентативные микроРНК и сайты связывания микроРНК

SEQ ID NO.	Описание	Последовательность
127	mmiR-142	GACAGUGCAGUCACCCAUAAAGUAGAAAGCACUACUAACAGCACUGGAGGGUGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGAUGAGUGUACUGUG
128	mmiR-142-3p	UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA
129	сайт связывания mmiR-142-3p	UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA
130	mmiR-142-5p	CAUAAAGUAGAAAGCACUACU
131	сайт связывания mmiR-142-5p	AGUAGUGCUUUCUACUUUAUG
1324	miR-122	CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC
32	miR-122-3p	AACGCCAUUAUCACACUAAAUA
1325	сайт связывания miR-122-3p	UAUUUAGUGUGAUAAUGGCGUU
33	miR-122-5p	UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG
1326	сайт связывания miR-122-5p	CAAACACCAUUGUCACACUCCA

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют в полинуклеотид согласно раскрытию в любом положении полинуклеотида (например, 5'-НТО и/или 3'-НТО). В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО содержит сайт связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления 3'-НТО содержит сайт связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО и 3'-НТО содержат сайт связывания миРНК. Сайт вставки в полинуклеотид может находиться где угодно в полинуклеотиде, пока вставка сайта связывания миРНК в полинуклеотид не мешает трансляции функционального полипептида в отсутствии соответствующей миРНК; и в присутствии миРНК вставка сайта связывания миРНК в полинуклеотид и связывание сайта связывания миРНК с соответствующей миРНК способны расщеплять полинуклеотид или предотвращать трансляцию полинуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через по меньшей мере около 30 нуклеотидов по ходу транскрипции от стоп-кодона ОРС в полинуклеотиде согласно раскрытию, который содержит ОРС. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через по меньшей мере около 10 нуклеотидов, по меньшей мере около 15 нуклеотидов, по меньшей мере около 20 нуклеотидов, по меньшей мере около 25 нуклеотидов, по меньшей мере около 30 нуклеотидов, по меньшей мере около 35 нуклеотидов, по меньшей мере около 40 нуклеотидов, по меньшей мере около 45 нуклеотидов, по меньшей мере около 50 нуклеотидов, по меньшей мере около 55 нуклеотидов, по меньшей мере около 60 нуклеотидов, по меньшей мере около 65 нуклеотидов, по меньшей мере около 70 нуклеотидов, по меньшей мере около 75 нуклеотидов, по меньшей мере около 80 нуклеотидов, по меньшей мере около 85 нуклеотидов, по меньшей мере около 90 нуклеотидов, по меньшей мере около 95 нуклеотидов или по меньшей мере около 100 нуклеотидов по ходу транскрипции от стоп-кодона ОРС в полинуклеотиде согласно раскрытию. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через от около 10 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, от около 20 нуклеотидов до около 90 нуклеотидов, от около 30 нуклеотидов до около 80 нуклеотидов, от ок