Четырехвалентные антитела к psgl-1 и их применения

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты четырехвалентного антитела, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1. Четырехвалентные антитела содержат димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два вариабельных домена легкой цепи и два вариабельных домена тяжелой цепи. Также предложены выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело, включающие указанный полинуклеотид экспрессионный вектор и клетка-хозяин. Также предложен способ получения четырехвалентного антитела, включающий культивирование указанной клетки-хозяина. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, наборам и способам лечения опосредованных T-клетками воспалительных заболеваний или лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации, с применением указанных антител. Изобретение позволяет получать четырехвалентные антитела к PSGL-1, не зависящие от кросc-линкера/FcR-экспрессирующих клеток, которые демонстрируют повышенную эффективность по сравнению с двухвалентными антителами. 13 н. и 45 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 1 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/276,806, поданной 8 января 2016 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

[0002] Содержание следующего документа в текстовом файле ASCII включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (имя файла: 606592001340SEQLIST.TXT, дата записи:3 января, 2017 года, размер: 70 KB).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] В данном документе приведены четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с человеческим гликопротеиновым лигандом 1 P-селектина (PSGL-1), а также полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева, способы, фармацевтические композиции, наборы и связанные с ними применения. Эти четырехвалентные антитела могут найти применение во множестве диагностических и терапевтических способов, включая, без ограничений, лечение опосредованных T-клетками воспалительных заболеваний, трансплантации и переливания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Воспалительные реакции на инфекцию или повреждение инициируются прилипанием лейкоцитов к стенке сосуда (McEver и соавт, 1997 год, J. Clin. Invest., 100 (3):485-492). Селектин представляет собой семейство гликопротеинов, которые опосредуют первые взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками и лейкоцитов с тромбоцитами во время воспаления. Семейство селектинов, которое состоит из L-селектина, E-селектина и P-селектина, содержит NH₂-концевой домен лектина, за которым следует EGF-подобный домен, серия консенсусных повторов, трансмембранный домен и короткий цитоплазматический концевой сегмент. Лектиновые домены селектинов взаимодействуют с конкретными гликоконъюгатными лигандами с целью облегчения адгезии клеток. L-селектин, экспрессируемый на большинстве лейкоцитов, связывается с лигандами на некоторых эндотелиальных клетках и других лейкоцитах. E-селектин, экспрессируемый на активированных цитокином эндотелиальных клетках, связывается с лигандами на большинстве лейкоцитов. P-селектин, экспрессируемый на активированных тромбоцитах и эндотелиальных клетках, также связывается с лигандами на большинстве лейкоцитов.

[0005] Гликопротеиновый лиганд 1 P-селектина ("PSGL-1"), также известный как SELPLG или CD162 (кластер дифференциации162), представляет собой человеческий гликопротеиновый лиганд муцинового типа для всех трех селектинов (Constantin, Gabriela, 2004 год, Drug News Perspect., 17(9):579-585; McEver и соавт., 1997 год, J. Clin. Invest., 100 (3):485-492). PSGL-1 представляет собой дисульфид-связанный гомодимер с двумя субъединицами 120 кДа и экспрессируемый на поверхности моноцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и в некоторых стволовых клетках CD34⁺. PSGL-1, вероятно, будет способствовать рекрутированию патологического лейкоцита во многих воспалительных заболеваниях, поскольку он способствует адгезионным взаимодействиям селектинов. Кроме того, показано, что PSGL-1 имеет уникальную регуляторную роль в Т-клетках. Мыши с дефицитом PSGL-1 демонстрируют повышенные пролиферативные ответы и аутоиммунность, что указывает на то, что PSGL-1 играет важную роль в подавлении ответов Т-клеток (Krystle M. и соавт. J. Immunol. 2012 год; 188:1638-1646. Urzainqui и соавт. Ann Rheum Dis 2013 год; 71:650; Pérez-Frías A, и соавт. Arthritis Rheumatol. ноябрь 2014 года; 66(11):3178-89.; Angiari и соавт. J Immunol. 2013 год; 191(11):5489-500).

[0006] Было разработано несколько антител к PSGL-1 (см., например, международные патентные заявки № WO 2005/110475, WO 2003/013603 и WO 2012/174001; Constantin, Gabriela, 2004 год, Drug News Perspect., 17(9):579-585, Chen и соавт. Blood. 2004 год; 104(10):3233-42, Huang и соавт, Eur J Immunol. 2005 год; 35(7):2239-49; и патент США № 7,604,800). Некоторые из существующих агонистических антител PSGL-1 преимущественно индуцируют апоптоз активированных Т-клеток на поздней стадии, но не других клеток, экспрессирующих PSGL-1; поэтому такие антитела могут применяться в качестве противовоспалительных терапевтических средств или применяться при трансплантациях и/или переливаниях. Однако существует потребность в улучшенных антителах к PSGL-1 с большей эффективностью in vivo, чем существующие антитела.

[0007] Все публикации, патенты и заявки на патент, которые приводятся в данном документе, тем самым включены в своем полном объеме посредством ссылки для всех целей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Для удовлетворения этой потребности в данном документе приведены четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с человеческим PSGL-1, а также полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева, способы, фармацевтические композиции, наборы и связанные с ними применения. Данное описание демонстрирует, что четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с человеческим PSGL-1, обладают большей эффективностью и активностью, чем обычные (например, двухвалентные) PSGL-1. Как таковые, эти четырехвалентные антитела могут применяться, наряду с прочим, в диагностических и/или терапевтических способах, применениях и композициях, связанных с функцией Т-клеток, таких как лечение опосредованных T-клетками воспалительных заболеваний, переливаний и/или трансплантаций.

[0009] Соответственно, в одном аспекте, в данном документе представлено четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, четырехвалентное антитело, содержащее димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера включает одноцепочечный полипептид, содержащий:(a) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; (b) два вариабельных домена тяжелой цепи (VH), при этом каждый из двух доменов VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; и (c) домен Fc антитела, при этом каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH двух доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к человеческому PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из двух доменов VH содержит: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух доменов VH содержит: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения один или оба из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения один или оба из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из двух доменов VL содержит: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух доменов VL содержит: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения один или оба из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения один или оба из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VH двух доменов VH; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух доменов VL; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VH двух доменов VH; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения первая, вторая и третья последовательности линкеров каждая содержит два или более повторов аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья последовательности линкеров имеют одинаковую последовательность и содержат два повтора SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VH двух доменов VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL двух доменов VL; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух доменов VL; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VH двух доменов VH; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VH двух доменов VH; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VH двух доменов VH; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VL двух доменов VL; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения первая, вторая или третья последовательность линкера содержит два или более повторов аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения первая, вторая или третья последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья последовательности линкеров имеют одинаковую последовательность, содержащую пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0010] В другом аспекте, в данном документе представлено четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, четырехвалентное антитело, содержащее димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела; при этом легкая цепь антитела содержит: (i) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, (ii) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (iii) константный домен легкой цепи (CL); при этом тяжелая цепь антитела содержит: (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (ii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3); при этом первый и второй домены VH каждый содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, при этом каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к PSGL-1 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из первого и второго доменов VH содержит: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VH содержат: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из первого и второго доменов VL содержит: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VL содержат: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу: (a) первый домен VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL двух или более доменов VL; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух или более доменов VL; и (f) домен CL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) домен CL; (c) первую последовательность линкера; (d) первый домен VH; (e) вторую последовательность линкера; и (f) второй домен VL двух доменов VL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит два повтора SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) второй домен VH; и (b) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

[0011] В другом аспекте, в данном документе представлено четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, четырехвалентное антитело, содержащее димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела; при этом легкая цепь антитела содержит: (i) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH), (ii) первый вариабельный домен легкой цепи (VL) и (iii) константный домен легкой цепи (CL); при этом тяжелая цепь антитела содержит: (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH), (ii) второй вариабельный домен легкой цепи (VL) и (iii) константный домен тяжелой цепи, содержащий первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3); при этом каждый из первого и второго доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; при этом каждый из первого и второго доменов VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; при этом каждый из первого и второго доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH; и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к PSGL-1 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из первого и второго доменов VH содержит: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VH содержат: (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из первого и второго доменов VL содержит: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VL содержат: (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и/или второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL; и (d) домен CL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) второй домен VH; и (b) вторую последовательность линкера; (c) второй домен VL; и (d) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.

[0012] В некоторых вариантах реализации любого из вышеуказанных вариантов реализации изобретения домен Fc антитела представляет собой домен Fc антитела человека. В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc антитела представляет собой домен Fc IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc IgG4 человека содержит последовательность шарнирной области, содержащую одну или более аминокислотных замен, которые приводят к уменьшению перетасовки IgG4 по сравнению с шарнирной областью IgG4, не содержащей одной или более аминокислотных замен. В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc IgG4 человека содержит последовательность шарнирной области, содержащую замену серина на пролин в аминокислоте 228, нумерация согласно индексу EU. В некоторых вариантах реализации любого из вышеприведенных вариантов реализации изобретения шарнирная область антитела содержит замену серина на пролин в аминокислоте 228, нумерация согласно индексу EU. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению демонстрирует усиленную индукцию апоптоза в целевой клетке (например, клетке, экспрессирующей человеческий PSGL-1 или его эпитоп) по сравнению с обычным (например, двухвалентным) антителом, имеющим один или более доменов VH или VL, общих с четырехвалентным антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению демонстрирует усиленное ингибирование ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа) (например, в животной модели trans vivo) по сравнению с обычным (например, двухвалентным) антителом, имеющим один или более доменов VH или VL, общих с четырехвалентным антителом.

[0013] В другом аспекте данного изобретения предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий четырехвалентное антитело по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. В другом аспекте данного изобретения предложен вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения. В другом аспекте данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения и/или вектор по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения. В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения четырехвалентного антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения, так что производится четырехвалентное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает извлечение четырехвалентного антитела из клетки-хозяина.

[0014] В другом аспекте данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая четырехвалентное антитело по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте данного изобретения предложен набор, содержащий четырехвалентное антитело по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения и необязательный фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно содержит листок-вкладыш, содержащий инструкции для введения четырехвалентного антитела с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или патологического состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно содержит листок-вкладыш, содержащий инструкции для введения четырехвалентного антитела до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации. В другом аспекте данного изобретения предложено четырехвалентное антитело по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения для применения с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или патологического состояния. В другом аспекте данного изобретения предложено четырехвалентное антитело по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения для применения с целью лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации. В другом аспекте данного изобретения предложено применение четырехвалентного антитела по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения при изготовлении лекарственного средства с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или патологического состояния. В другом аспекте данного изобретения предложено применение четырехвалентного антитела по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения при изготовлении лекарственного средства с целью лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации. В другом аспекте данного изобретения предложен способ лечения, опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или патологического состояния, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества четырехвалентного антитела по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения. В другом аспекте данного изобретения предложен способ лечения пациента, нуждающегося в переливании или трансплантации, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества четырехвалентного антитела по любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации. В некоторых вариантах реализации опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание является аутоиммунным заболеванием. В некоторых вариантах реализации изобретения опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, болезни Крона, анкилозирующего спондилоартрита, диабета I типа, язвенного колита, рассеянного склероза и реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ). В некоторых вариантах реализации изобретения псориаз представляет собой бляшковидный псориаз, хронический бляшковидный псориаз, каплевидный псориаз, обратный псориаз, пустулезный псориаз или эритродермический псориаз. В некоторых вариантах реализации изобретения трансплантация представляет собой трансплантацию ткани, выбранной из группы, состоящей из костного мозга, почки, сердца, печени, нервной ткани, легкого, поджелудочной железы, кожи и кишечника. В некоторых вариантах реализации изобретения переливание представляет собой переливание, включающее одну или более белых клеток крови, красных клеток крови и тромбоцитов.

[0015] Должно быть понятно, что одно, некоторые или все свойства различных вариантов реализации изобретения, описанных в данном документе, могут быть объединены для формирования других вариантов реализации по данному изобретению. Эти и другие аспекты изобретения будут очевидными специалисту в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0016] На Фиг. 1A и 1B изображены схемы, иллюстрирующие типовые четырехвалентные антитела в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения. На Фиг. 1A проиллюстрированы следующие типовые форматы антител:(1) димер, состоящий из двух одноцепочечных диател слитых с доменом Fc (scDb₂-Fc), изображающий последовательности линкеров: (GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 33), GGGGSAAA (SEQ ID NO: 26) и (GGGGS)₂ (SEQ ID NO: 34)/(GGGGS)₂G (SEQ ID NO: 35)/(GGGGS)₂GG (SEQ ID NO: 36); (2) два разных формата антител, каждый из которых имеет димер двух тандемных одноцепочечных единиц вариабельных фрагментов (taFv₂-Fc), изображающих идентичные последовательности линкеров для обоих форматов:(GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 33), ASTGS (SEQ ID NO: 27), GGGGSAAA (SEQ ID NO: 26); и (3) три разных формата антител, на основе одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv-IgG), изображающих: последовательности линкеров scFv₂-LC-IgG4p (GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 33) и ASTGSG₄S (SEQ ID NO: 28), последовательности линкеров LC-scFv₂-IgG4p (GGGGS)₂ (SEQ ID NO: 34) и (GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 33), последовательности линкеров scFv₄-crlG4p (GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 33). На Фиг. 1B изображена еще одна иллюстрация трех форматов антител на основе scFv, с указанными затененными вариабельными фрагментами V2 scFv.

[0017] На Фиг. 2A-2C изображена проверка молекулярных масс и основных структур типовых четырехвалентных антител с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза с последующим окрашиванием Кумасси синим. Изображены невосстанавливающие (Фиг. 2A и 2B) и восстанавливающие (Фиг. 2C) условия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0018] В данном документе предложены четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с человеческим PSGL-1. Данное описание основано, по меньшей мере, частично на обнаружении, описанном в данном документе, что некоторые четырехвалентные антитела к PSGL-1 демонстрируют повышенную эффективность по сравнению с исходным антителом к PSGL-1 как in vitro, так и trans vivo. Эти четырехвалентные антитела демонстрировали более высокую эффективность в индукции апоптоза и повышенную эффективность в модели trans vivo для гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), чем исходное антитело к PSGL-1. В данном документе дополнительно приведены выделенные полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева, фармацевтические композиции, наборы, применения и способы, связанные с четырехвалентными антителами. Например, четырехвалентные антитела по данному изобретению могут найти применение при лечении опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или введения до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации.

[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентные антитела по данному изобретению содержат димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит одноцепочечный полипептид, содержащий:(a) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; (b) два вариабельных домена тяжелой цепи (VH), при этом каждый из двух доменов VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; и (c) домен Fc антитела, при этом каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH двух доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к человеческому PSGL-1. В других вариантах реализации изобретения четырехвалентные антитела по данному изобретению содержат димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела; при этом легкая цепь антитела содержит: (i) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, (ii) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (iii) константный домен легкой цепи (CL); при этом тяжелая цепь антитела содержит: (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (ii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3); при этом первый и второй домены VH каждый содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, при этом каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к PSGL-1 человека. В других вариантах реализации изобретения четырехвалентные антитела по данному изобретению содержат димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела; при этом легкая цепь антитела содержит: (i) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH), (ii) первый вариабельный домен легкой цепи (VL) и (iii) константный домен легкой цепи (CL); при этом тяжелая цепь антитела содержит: (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH), (ii) второй вариабельный домен легкой цепи (VL) и (iii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3); при этом каждый из первого и второго доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; при этом каждый из первого и второго доменов VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; при этом каждый из первого и второго доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH; и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к PSGL-1 человека.

I. Определения терминов

[0020] "Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с целью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид, и тому подобное с помощью, по меньшей мере, одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Применяемый в данном документе термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также полипептиды, содержащие их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv); одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), одноцепочечные диатела (scDb), единицы тандемных одноцепочечных фрагментов (scFv) (называемые taFv для тандемного scFv) и мутанты или другие их конфигурации; слитые белки, содержащие часть антитела; и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена.

[0021] В данном контексте термин "четырехвалентное" антитело может относиться к антителу, которое содержит четыре единицы связывания VH-VL антитела, при этом каждая единица связывания VH-VL содержит домен VH антитела и домен VL антитела. В данном контексте ссылка на "мономер" четырехвалентного антитела может включать как одноцепочечные полипептиды, так и многоцепочечные полипептиды. Например, мономер может относиться к одноцепочечному полипептиду или он может относиться к единице тяжелой цепи-легкой цепи антитела, где тяжелая цепь и легкая цепь кодируются отдельными полинуклеотидами и/или образованы из объединения отдельных полипептидов.

[0022] Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело не обязательно должно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины антитела можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов.

[0023] Антитела по данному изобретению дополнительно предназначены для включения биспецифических, мультиспецифических, химерных, гуманизированных и рекомбинантно сконструированных молекул, имеющих аффинность к полипептиду, которая предоставляется по меньшей мере одной областью CDR антитела. В данной области техники известны однодоменные антитела, которые являются либо вариабельным доменом тяжелой цепи антитела, либо вариабельным доменом легкой цепи. См., например, Holt и соавт., Trends Biotechnol. 21:484-490, 2003 год. Способы получения антител, содержащих либо вариабельный домен тяжелой цепи антитела, либо вариабельный домен легкой цепи антитела, содержащих три из шести встречающихся в природе областей, определяющих комплементарность из антитела, также известны в данной области техники. См., например, Muyldermans, Rev. Mol. Biotechnol. 74:277-302, 2001 год.

[0024] В данном документе термин "моноклональное антитело" относится к антителу в значительной степени однородных антител, то есть, отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела как правило являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одиночного антигенного сайта. Кроме того, по сравнению с препаратами поликлональных антител, которые как правило содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты антигена. Определение "моноклональное" указывает на то, что антитело получено из практически однородной популяции антител; его не следует интерпретировать как требование о продукции антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, которые будут применяться в соответствии с данным изобретением, могут быть получены с помощью гибридомного способа, впервые описанного Kohler and Milstein, 1975 год, Nature, 256:495, или могут быть получены с помощью методик рекомбинантных ДНК, таких как описано в патенте США № 4,816,567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, полученных с помощью способов, описанных, например, в McCafferty и соавт., 1990 год, Nature, 348:552-554.

[0025] Применяемый в данном документе термин "химерное антитело" относится к антителу, имеющему вариабельную область или часть вариабельной области от первого вида и константную область от второго вида. Интактное химерное антитело содержит две копии химерной легкой цепи и две копии химерной тяжелой цепи. Получение химерных антител известно в данной области техники (Cabilly и соавт. (1984 год), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277; Harlow and Lane (1988 год), Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Как правило, в этих химерных антителах вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей имитирует вариабельные области антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные участки гомологичны последовательностям антител, полученных из другого. Одним явным преимуществом таких химерных форм является то, что, например, вариабельные области могут быть легко получены из известных в настоящее время источников с применением легкодоступных гибридом или В-клеток из организмов-хозяев, не являющихся человеком, в сочетании с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. В то время как вариабельная область имеет преимущество в легкости получения, и ее специфичность не зависит от ее источника, константная область, являющаяся человеческой, при введении с меньшей вероятностью вызывает иммунный ответ от человека, чем константная область из источника, не являющегося человеком. Однако данное определение не ограничивается этим конкретным примером. В некоторых вариантах реализации изобретения модификации аминокислот производятся в вариабельной и/или константной области.

[0026] В данном документе "гуманизированные" антитела относятся к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулина или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR) реципиента заменяются остатками из CDR видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и функциональную возможность. В некоторых случаях остатки Fv каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях, но включены для дальнейшего улучшения и оптимизации эффективности антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все области CDR соответствуют таковому нечеловеческому иммуноглобулину, и все или практически все области FR являются такими, как консенсусная последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или домен (например, домен Fc), обычно иммуноглобулина человека. Антитела могут иметь области Fc, модифицированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (одну, две, три, четыре, пять или шесть), которые изменяются по отношению к первоначальному антителу, которые также называются одной или более CDR, "полученными из" одного или более CDR из первоначального антитела.

[0027] Термин "человеческое антитело" означает антитело имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, продуцируемому человеком, и/или полученному с применением любого из способов получения человеческих антител, известных в данной области техники или описанных в данном документе. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, включающее мышиную легкую цепь и полипептиды тяжелой цепи человека. Человеческие антитела можно получить, применяя различные методики, известные в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, причем эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan и соавт., 1996 год, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets и соавт., 1998 год, PNAS, (США) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991 год, J. Mol. Biol., 227:381; Marks и соавт., 1991 год, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела могут быть также получены путем введения локусов иммуноглобулина человека в трансгенных животных, например, мышей, в которых эндогенные гены иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патенте США № 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; и 5,661,016. В альтернативном варианте, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, которые продуцируют антитело, направленное против целевого антигена (такие В-лимфоциты могут быть выделены у индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole и соавт., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, ст. 77 (1985 год); Boerner и соавт., 1991 год, J. Immunol., 147 (1):86-95; и патент США № 5,750,373.

[0028] "Вариабельная область" (термин "вариабельный домен" может применяться в данном документе взаимозаменяемо) антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела (VL) или вариабельной области тяжелой цепи антитела (VH), как по отдельности, так и в сочетании. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи (домены VH и VL, соответственно) каждая состоит из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости от FR и с CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует как минимум два метода определения CDR:(1) подход, основанный на межвидовый вариабельности последовательностей (то есть, Kabat и соавт. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5-е изд., 1991 год, National Institutes of Health, Бетесда, штат Мэриленд); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani и соавт., (1997 год) J. Molec. Biol. 273:927-948)). В данном документе CDR может относиться к CDR, определенным либо подходом, либо комбинацией обоих подходов.

[0029] Ряд описаний HVR применяется и охватывается в данном документе. Области, определяющие комплементарность (CDR) по Кабату основаны на вариабельности последовательности и применяются наиболее часто (Kabat и соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е Изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Мэриленд. (1991 год)). Вместо этого, Chothia обращает внимание на локализацию структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987 год)). HVR АтМ представляют собой компромисс между HVR по Кабату и структурными петлями по Чотии и используются программным обеспечением для моделирования антител АтМ от Oxford Molecular. "Контакт" HVR основан на анализе имеющихся комплексов кристаллических структур. Остатки от каждого из этих HVR отмечены ниже.

Петля Кабат АтМ Чотиа Контакт

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (нумерация по Кабату)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (нумерация по Чотиа)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0030] Система нумерации по Кабату обычно применяется для названия остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat и соавт., Sequences of Immunological Interest. 5-е Изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Мэриленд. (1991 год)). Как правило, "система нумерации EU" или "индекс EU" применяется, когда речь идет об остатке в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, описанный в Kabat и соавт., выше, или и Edelman, G. M. и соавт. (1969 год) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85).

[0031] "Fv" как применяется в данном документе, может относиться к минимальному фрагменту антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Этот фрагмент обычно состоит из димера одного домена вариабельной области тяжелой цепи и одного домена вариабельной области легкой цепи в плотной, нековалентной связи. В результате фолдинга этих двух доменов получаются шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из H и L-цепи), которые вносят аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антигенсвязывающую специфичность к антителу. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащий только три HVR, специфичных для антигена), обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.

[0032] "Константная область" (термин "константный домен" может применяться в данном документе взаимозаменяемо) антитела относится к константной области легкой цепи антитела (СL) или константной области тяжелой цепи антитела (CH), как по отдельности, так и в сочетании. Константная область антитела обычно обеспечивает структурную стабильность и другие биологические функции, такие как ассоциация цепей антител, секреция, трансплацентарная мобильность и связывание комплемента, но не вовлечена в связывание с антигеном. Аминокислотная последовательность и соответствующие последовательности экзонов в генах константной области зависят от вида, из которого они получены; однако вариации в аминокислотной последовательности, приводящие к аллотипам, относительно ограничены для конкретных константных областей внутри вида. Вариабельная область каждой цепи соединяется с константной областью посредством связывающей полипептидной последовательности. Связывающая последовательность кодируется последовательностью "J" в гене легкой цепи и сочетанием последовательности "D" и последовательности "J" в гене тяжелой цепи. В зависимости от изотипа антитела константная область тяжелой цепи может включать в себя домен CH1, шарнирную область, домен CH2, домен CH3 и/или домен CH4. В некоторых вариантах реализации изобретения константная область тяжелой цепи содержит домен CH1, шарнирную область, домен CH2 и домен CH3.

[0033] Термин "область Fc " (термин "домен Fc" может быть использован в данном документе взаимозаменяемо) в данном документе применяется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, в том числе нативной последовательности областей Fc и вариантов областей Fc. Границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться; в некоторых вариантах реализации изобретения область Fc может включать одну или более аминокислот шарнирной области. В некоторых вариантах реализации изобретения область Fc тяжелой цепи IgG человека имеет протяженность от аминокислотного остатка в положении 216 по EU до его карбоксильного конца. Подходящие нативные последовательности областей Fc для применения в антителах по данному изобретению включают человеческие IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4.

[0034] "Одноцепочечный Fv" также сокращенно обозначаемый как "sFv" или "scFv" являются фрагментами антител, которые содержат домены V_H и V_L антител, связанные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора sFv см., Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том. 113, Rosenburg and Moore ред., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994 год).

[0035] Термин "диатела" относится к фрагментам антител, полученным путем конструирования фрагментов sFv (см. предыдущий параграф) с помощью коротких линкеров (например, около 5-12 остатков) между доменами V_H и V_L, так что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание доменов V, в результате чего получается двухвалентный фрагмент, то есть, фрагмент, имеющий два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры двух "кроссоверных" фрагментов sFv, в которых присутствуют домены V_H and V_L двух антител на разных полипептидных цепях. Диатела описаны более подробно в, например, EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993 год).

[0036] "Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательностям эталонных полипептидов определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в конкретной последовательности эталонного полипептида после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры выравнивания последовательностей, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

[0037] В данном документе термин "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "АЗКЦ" относится к реакции, опосредованной клетками, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы или макрофаги) распознают связанное антитело на целевой клетке и впоследствии вызывают лизис целевой клетки. Активность АЗКЦ молекулы, представляющей интерес может быть оценена с применением анализа АЗКЦ in vitro, такого как описанный в патенте США № 5,500,362 или 5,821,337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеары периферической крови (PBMC) и NK-клетки. В качестве альтернативы или дополнения, активность АЗКЦ молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, на животной модели, например, согласно описанию, в публикации Clynes и соавт., 1998 год, PNAS (США), 95:652-656.

[0038] Термин "комплементзависимая цитотоксичность" или "КЗЦ" относится к лизированию цели в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно выполнить анализ КЗЦ, например, как описано в публикации Gazzano-Santoro и соавт., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996 год).

[0039] Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" применяются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и в него можно встроить неаминокислоты. Термины также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями или модификациями, такими как конъюгация с меченым компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неестественные аминокислоты и тому подобное), а также другие модификации, известные в данной области техники. Понятно, что, поскольку полипептиды по данному описанию основаны на четырехвалентном антителе, полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или связанных цепей.

[0040] "Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", применяемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и/или РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер ДНК или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если имеет место, то модификация структуры нуклеотида может быть внесена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замещение одного или более естественных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как, например, с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, кабаматы и и тому подобное) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и тому подобное), теми, которые содержат боковые фрагменты, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и тому подобное), с интеркаляторами (например, акридином, псораленом и тому подобным), содержащими хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы итому подобное), теми, которые содержат алкилаторы, с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и тому подобное), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5' и 3'-концы ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или частями органической кепирующей группы от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть производными до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны в данной области техники, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, аналоги карбоциклического сахара, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы, ликсосы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и аналогии с нуклеозидов с удаленным азотистым основанием, такие как метилрибозиды. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связующими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты реализации изобретения в которых фосфат заменен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR₂ ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталь"), где каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный, или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или арадил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Предыдущее описание относится ко всем полинуклеотидам, указанным в данном документе, включая РНК и ДНК.

[0041] В данном документе термин "вектор" означает конструкцию, которая способна доставлять и экспрессировать на желаемом уровне один или более ген(нов) или последовательность(и), представляющую интерес в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы, векторы экспрессии голой ДНК или РНК, векторы плазмиды, космиды или фага, векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и определенные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

[0042] В данном документе термин "последовательность контроля экспрессии" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность контроля экспрессии может быть промотором, таким как конститутивный или индуцибельный промотор, или энхансером. Последовательность контроля экспрессии функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрибированию.

[0043] В данном документе термин "эффективная доза" или "терапевтически эффективное количество" лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для получения полезных, желаемых и/или терапевтических результатов. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают такие результаты, как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или задержку начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, возникающие при развитии заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение одного или более симптомов, возникающих в результате заболевания, повышение качества жизни людей, страдающих этим заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения болезни, повышение эффекта другого лекарственного средства, например, посредством нацеливания, задержку прогрессирования заболевания и/или продление выживания. В случае лечения человека, ожидающего трансплантации, например, эффективное количество лекарственного средства может в определенной степени снизить уровень аллоантител и/или PRA у человека. В случае лечения человека, получающего трансплантацию или переливание, эффективное количество лекарственного средства может оказывать влияние и/или облегчать в какой-то мере один или более симптомов, или патологических состояний (таких как отторжение трансплантата), связанных с трансплантацией или переливанием. Эффективное количество можно вводить в одном или более введениях. Для целей данного описания эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения прямо или косвенно. Эффективную дозу можно вводить в одном или более введениях. Для целей данного описания эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения прямо или косвенно. Как понятно в клиническом контексте, эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнута или может не быть достигнута в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективная доза" может быть рассмотрена в контексте введения одного или более терапевтических агентов, и один агент может считаться предоставленным в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими агентами желательный результат может быть достигнут или достигнут.

[0044] В данном документе термин "в сочетании с" относится к применению одного способа лечения в дополнение к другому способу лечения. Таким образом, "в сочетании с" относится к применению одного метода лечения до, во время или после применения другого способа лечения индивидуума.

[0045] В данном документе термин "лечение" или "лечить" представляет собой подход для получения полезных или желаемых результатов, включая желательные клинические результаты. Полезные, желаемые и/или терапевтические клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, одно или более из следующих: уменьшение или подавление одного или более симптомов воспаления или аутоиммунности (например, вызванных опосредованным Т-клетками воспалительным заболеванием), повышение вероятности успешного результата лечения пациента и/или уменьшение одного или более противопоказаний или вредных последствий, связанных с лечением (например, связанных с трансплантацией или переливанием), уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, повышение качества жизни тех, кто страдает из-за болезни, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, задержку развития заболевания и/или увеличение выживаемости индивидуумов.

[0046] В данном документе термин "задержка развития болезни" означает отложение, затруднение, замедление, отставание, стабилизацию и/или отсрочку развития болезни (такой как рак). Эта задержка может быть разной продолжительности, в зависимости от истории болезни и/или индивидуума, который получает лечение. Как очевидно специалисту в данной области техники, достаточная или значительная задержка может, по сути, включать профилактику, поскольку заболевание не развивается у индивидуума. Например, симптом воспалительного заболевания, такого как опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание, может задерживаться.

[0047] "Индивид" или "субъект" является млекопитающим, более желательно человеком. Млекопитающие также включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки или лошади), приматов, мышей и крыс.

[0048] В данном документе термин "специфически распознает" или "специфически связывает" относится к измеримым и воспроизводимым взаимодействиям, таким как притяжение или связывание между целью и антителом (например, полноразмерным антителом, фрагментом антитела или единицей связывания VH-VL антитела), которое является определяющим для присутствия цели в присутствии гетерогенной популяции молекул, включая биологические молекулы. Например, антитело, фрагмент антитела или единица связывания VH-VL антитела, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами цели или нецелевыми эпитопами. Также понятно, прочитав это определение, что, например, антитело, фрагмент антитела или единица связывания VH-VL антитела, которое специфически или предпочтительно связывается с первой целью, может или не может специфически или предпочтительно связываться со второй целью. Таким образом, "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" необязательно требует (хотя и может включать) исключительного связывания. Антитело, фрагмент антитела или единица связывания VH-VL антитела, которое специфически связывается с мишенью, может иметь константу ассоциации, больше чем или около 10 ³ M ^-1 или около 10 ⁴ M ^-1, иногда около 10 ⁵ M ^-1 или около 10 ⁶ M ^-1, в других случаях около 10 ⁶ M ^-1 или около 10 ⁷ M ^-1, от около 10 ⁸ M ^-1 до около 10 ⁹ M ^-1, или от около 10 ¹⁰ M ^-1 до около 10 ¹¹ M ^-1 или выше. Для выбора антител, фрагментов антител или единиц связывания VH-VL антител, которые специфически иммунореактивны с конкретным белком, могут быть применены различные форматы иммуноанализа. Например, твердофазные иммуноанализы ИФА обычно применяются для отбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных с белком. См., например, Harlow and Lane (1988 год) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Нью-Йорк, для описания форматов иммуноанализа и условий, которые могут быть применены для определения специфической иммунореактивности.

[0049] "Листок-вкладыш" относится к инструкциям, обычно включенным в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, обычно включаемых в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введению, противопоказаниях, других лекарственных средствах, которые должны быть объединены с упакованным продуктом, и/или предупреждениях, касающихся применения таких медикаментов, и тому подобное.

[0050] В данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, ссылка на "антитело" представляет собой ссылку на от одного до многих антител, такую как молярные количества, и включает их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и так далее.

[0051] Ссылка на "около" значения или параметра включает в себя (и описывает) варианты реализации изобретения по данному документу, которые направлены на это значение или параметр как таковой. Например, описание, относящееся к "около X", включает описание "X".

[0052] Подразумевается, что аспект и варианты данного описания, описанные в данном документе, включают "состоящий" и/или "состоящий в основном из" аспектов и вариаций.

II. Четырехвалентные антитела

[0053] Некоторые аспекты данного описания относятся к четырехвалентным антителам, которые специфически связываются с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает димер двух мономеров. Как описано ниже, мономеры могут быть соединены с применением любых способов, известных в данной области техники, включая без ограничения взаимодействия дикого типа между доменами или областями Fc антитела, измененные или мутированные взаимодействия между доменами или областями Fc антитела (например, с применением мутации в шарнирной области, описанной в данном документе) или других искусственных ковалентных или нековалентных взаимодействий (например, перекрестное связывание или линкер). Типовые четырехвалентные антитела и форматы антител описаны ниже и проиллюстрированы на Фиг. 1A и 1B.

[0054] Человеческий PSGL-1 можно также назвать лигандом селектина P, SELPG, CLA, CD162 или PSGL1. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению связывается с полипептидом, кодируемым геном SELPG человека, например, как описано в NCBI RefSeq Gene ID № 6404. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению связывается с полипептидом PSGL-1 человека, содержащим 15 или 16 декамерных повторов. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 и связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 31 отображает полноразмерный человеческий PSGL-1, номер доступа GenBank™ AAA74577. 1, GL902797, а аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 32 отображает более короткий 402 аминокислотный человеческий белок PSGL-1 (номер доступа GenBank™ XP_005269133). В конкретных вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с человеческим PSGL-1, как определено, например, с помощью ИФА или другого антигенсвязывающего анализа, известного в данной области техники или описанного в данном документе.

[0055] В некоторых вариантах реализации изобретения домен VH и домен VL по данному изобретению образуют единицу связывания VH-VL (например, которая специфически связывает эпитоп, такой как эпитоп человеческого PSGL-1). Как описано в данном документе, единица связывания VH-VL может быть образована между доменом VH и доменом VL с применением взаимодействий VH-VL дикого типа, или единица связывания VH-VL может быть дополнительно стабилизирована с применением одной или более мутаций, или химических связей (например, дисульфидной связи, такой как дисульфидная связь vH44-vL100 вводимой цистеиновыми заменами, в домен VH и VL SEQ ID NOs:29 и 30, соответственно).

[0056] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению содержит димер двух мономеров, где каждый мономер димера содержит одноцепочечный полипептид.

[0057] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид с одной цепью, тяжелой цепью и/или легкой цепью по данному изобретения содержит линкерную последовательность. Можно соответствующим образом применять множество линкерных последовательностей, например, для связывания доменов VH и VL единицы связывания VH-VL, чтобы связать домен VH или VL единицы связывания VH-VL с доменом VH или VL другой единицы связывания VH-VL или связать домен VH или VL единицы связывания VH-VL с константной областью антитела, такой как домен или область Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер по данному описанию может присутствовать между доменами или областями. В некоторых вариантах реализации изобретения два домена или области по данному описанию могут быть объединены без линкера, или линкер, соединяющий два домена или области, может быть удален. Связывание таких одноцепочечных фрагментов с применением различных линкеров описано в Kortt и соавт., 1997 год, Protein Engineering, 10:423-433. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит 1-50 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит 5-12 аминокислот. Типовые последовательности линкеров описаны в данном документе и проиллюстрированы на Фиг. 1A. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит один или более повторов аминокислотной последовательности ggggs (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит один, два, три, четыре или пять повторов аминокислотной последовательности ggggs (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность ggggsaaa (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность astgs (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность линкера по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность astgsggggs (SEQ ID NO: 28).

[0058] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению содержит димер двух одноцепочечных диател (scDb), которые могут быть необязательно слиты с константной областью антитела, такой как домен Fc.

[0059] В некоторых вариантах реализации изобретения каждый мономер димера содержит одноцепочечный полипептид, содержащий (a) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, и при этом указанные два домена VL являются специфичными к человеческому PSGL-1; (b) два вариабельных домена тяжелой цепи (VH), при этом каждый из двух доменов VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 и при этом два домена VH специфичны к человеческому PSGL-1; и (c) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH двух доменов VH.

[0060] В определенных вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VH двух доменов VH; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух доменов VL; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VH двух доменов VH; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения первый домен VL образует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VH, а первый домен VH образует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VL.

[0061] В некоторых вариантах реализации изобретения первая, вторая и третья последовательности линкеров каждая содержит два или более повторов аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения первая, вторая или третья последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья последовательности линкеров имеют одинаковую последовательность и содержат два повтора SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

[0062] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению содержит димер двух единиц тандемных одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) (называемых taFv для тандемного scFv), которые могут быть необязательно слиты с константным доменом антитела, таким как домен Fc константной области тяжелой цепи.

[0063] В определенных вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VH двух доменов VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL двух доменов VL; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух доменов VL; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VH двух доменов VH; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения первый домен VL образует единицу связывания VH-VL со первым доменом VH, а второй домен VH образует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VL. В других вариантах реализации изобретения каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VH двух доменов VH; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VH двух доменов VH; (f) третью последовательность линкера; (g) второй домен VL двух доменов VL; (h) четвертую последовательность линкера; и (i) константный домен тяжелой цепи, содержащий домен Fc антитела.

[0064] В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья последовательности линкеров имеют одинаковую последовательность, содержащую пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

[0065] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению содержит димер двух мономеров, где каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела.

[0066] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает легкую цепь, содержащую (i) два вариабельных домена легкой цепи (VL), при этом каждый из двух доменов VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, и при этом два домена VL специфичны к человеческому PSGL-1, (ii) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (iii) константный домен легкой цепи (CL); и/или тяжелую цепь, содержащую (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH), и (ii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VH каждый содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VH специфичны к человеческому PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из двух доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH.

[0067] В определенных вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL двух или более доменов VL; (d) вторую последовательность линкера; (e) второй домен VL двух или более доменов VL; и (f) домен CL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В других вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL лямбда. В некоторых вариантах реализации изобретения первый домен VL образует единицу связывания VH-VL со первым доменом VH, а второй домен VH образует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VL.

[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

[0069] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя легкую цепь, содержащую от N-конца к С-концу:(a) первый домен VL двух доменов VL; (b) домен CL; (c) первую последовательность линкера; (d) первый домен VH; (e) вторую последовательность линкера; и (f) второй домен VL двух доменов VL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В других вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL лямбда.

[0070] В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит два повтора SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25.

[0071] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя тяжелую цепь, содержащую от N-конца к С-концу:(a) второй из двух доменов VH; и (b) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc антитела содержит константный домен 2 тяжелой цепи (CH2) и константный домен 3 тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения первый домен VL образует единицу связывания VH-VL со первым доменом VH, а второй домен VH образует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VL.

[0072] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя легкую цепь, содержащую (i) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и (ii) первый вариабельный домен легкой цепи (VL), и (iii) константный домен легкой цепи (CL); и/или тяжелую цепь, содержащую (i) второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH), (ii) второй вариабельный домен легкой цепи (VL), и (iii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из первого и второго доменов VL содержат CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VL специфичны к человеческому PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из первого и второго доменов VH содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. В некоторых вариантах реализации изобретения первый и второй домены VH специфичны к человеческому PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из первого и второго доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH.

[0073] В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) первый домен VH; (b) первую последовательность линкера; (c) первый домен VL; и (d) домен CL. В некоторых вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL каппа. В других вариантах реализации изобретения домен CL представляет собой домен CL лямбда.

[0074] В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25.

[0075] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:(a) второй из двух доменов VH; и (b) вторую линкерную последовательность; (c) второй из двух доменов VL; и (d) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc антитела содержит константный домен 2 тяжелой цепи (CH2) и константный домен 3 тяжелой цепи (CH3).

[0076] В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность линкера содержит пять повторов SEQ ID NO: 25.

[0077] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или более доменов VH, содержащих одну или более CDR, выбранных из (i) CDR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SFGMH (SEQ ID NO: 17); (ii) CDR-H2, содержащего аминокислотную последовательность YINGGSSTIFYANAVKG (SEQ ID NO: 18); и (iii) CDR-H3, содержащего аминокислотную последовательность YASYGGGAMDY (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или более доменов VH, содержащих (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению представляет собой димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два домена VH, причем каждый домен VH, содержит одну или более CDR, выбранных из (i) CDR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SFGMH (SEQ ID NO: 17); (ii) CDR-H2, содержащего аминокислотную последовательность YINGGSSTIFYANAVKG (SEQ ID NO: 18); и (iii) CDR-H3, содержащего аминокислотную последовательность YASYGGGAMDY (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению представляет собой димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два домена VH, причем каждый домен VH, содержит (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

[0078] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VH, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения a четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя мономер, содержащий два домена VH, причем каждый домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VH, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации изобретения a четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя мономер, содержащий два домена VH, причем каждый домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.

[0079] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VH, содержащих последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два домена VH, причем каждый домен VH содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 23.

[0080] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VH, содержащих последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два домена VH, причем каждый домен VH содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах реализации последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 29.

[0081] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или более доменов VL, содержащих одну или более CDR, выбранных из (i) CDR-L1, содержащего аминокислотную последовательность RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (ii) CDR-L2, содержащего аминокислотную последовательность KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); и (iii) CDR-L3, содержащего аминокислотную последовательность FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или более доменов VL, содержащих (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению представляет собой димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два домена VL, причем каждый домен VL содержит одну или более CDR, выбранных из (i) a CDR-L1, содержащего аминокислотную последовательность RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (ii) CDR-L2, содержащего аминокислотную последовательность KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); и (iii) CDR-L3, содержащего аминокислотную последовательность FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению представляет собой димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два домена VL, причем каждый домен VL содержит (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22).

[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VL, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения a четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя мономер, содержащий два домена VL, причем каждый домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VL, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации изобретения a четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя мономер, содержащий два домена VL, причем каждый домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.

[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VL, содержащих последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два домена VL, причем каждый домен VL содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 24.

[0084] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя один или боле доменов VL, содержащих последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два домена VL, причем каждый домен VL содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах реализации последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 30.

[0085] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя одноцепочечный полипептид, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два одноцепочечных полипептида, причем каждый одноцепочечный полипептид содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5. В некоторых вариантах реализации последовательность одноцепочечного полипептида, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 1, 3 или 5. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два одноцепочечных полипептида, причем каждый содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 3 или 5.

[0086] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя одноцепочечный полипептид, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную одноцепочечному полипептиду, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит два одноцепочечных полипептида, причем каждый одноцепочечный полипептид содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную одноцепочечному полипептиду, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В некоторых вариантах реализации последовательность одноцепочечного полипептида, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот в одноцепочечном полипептиде, кодируемом полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя два одноцепочечных полипептида, причем каждый кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6.

[0087] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя полипептид легкой цепи, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, 9 или 13. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и каждая легкая цепь содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, 9 или 13. В некоторых вариантах реализации последовательность полипептида легкой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 7, 9 или 13. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, где каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, и каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 9 или 13.

[0088] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя полипептид легкой цепи, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду легкой цепи, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10 или 14. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и каждая легкая цепь содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду легкой цепи, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10 или 14. В некоторых вариантах реализации последовательность полипептида легкой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот в полипептиде легкой цепи, кодируемом полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10 или 14. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, где каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, и каждая легкая цепь содержит полипептид легкой цепи, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, 10 или 14.

[0089] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя полипептид тяжелой цепи, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или 15. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и каждая тяжелая цепь содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или 15. В некоторых вариантах реализации последовательность полипептида тяжелой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 11 или 15. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, где каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, и каждая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 15.

[0090] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя полипептид тяжелой цепи, содержащий последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду тяжелой цепи, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12 или 16. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и каждая тяжелая цепь содержит последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную полипептиду тяжелой цепи, кодируемому полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12 или 16. В некоторых вариантах реализации последовательность полипептида тяжелой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело к человеческому PSGL-1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот в полипептиде тяжелой цепи, кодируемом полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12 или 16. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению включает в себя димер двух мономеров, причем каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, и каждая тяжелая цепь содержит полипептид легкой цепи, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:12 или 16.

[0091] Данное изобретение охватывает модификации описанных в данном документе антител или полипептидов, включая функционально эквивалентные антитела, которые не оказывают существенного влияния на их свойства и варианты, которые имеют повышенную или уменьшенную активность и/или аффинность. Модификация полипептидов является обычной практикой в данной области техники и не нуждается в подробном описании в данном документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или более делециями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного вредного влияния на функциональную активность, или применяют химические аналоги.

[0092] Вставки в аминокислотную последовательность включают N- и/или C-концевые гибриды длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или более аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина или антитело, слитое с меткой эпитопа. Другие вставочные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или C-концом антитела фермента или полипептида, что увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки крови.

[0093] Варианты замен имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле антитела, и другой остаток вставленный на его место. Сайты, представляющие наибольший интерес для мутагенеза с применением замещений, включают гипервариабельные области, но также предполагают изменения FR. Консервативные замены показаны в таблице ниже под заголовком "консервативные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные как "типовые замены" в таблице ниже или, как описано далее ниже, применительно к аминокислотным классам, а продукты скринированы.

Аминокислотные замены

Исходный остаток	Консервативные замены	Типовые замены
Ala (A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg (R)	Lys	Lys; Gln; Asn
Asn (N)	Gln	Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu; Asn
Cys (C)	Ser	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gln
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин
Leu (L)	Ile	Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gln; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe (F)	Tyr	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин

[0094] Существенные модификации биологических свойств антитела осуществляются путем выбора замен, которые существенно различаются по их влиянию на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замещения, например, в виде складчатого слоя или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (в) объема боковой цепи. Остатки естественного происхождения делятся на группы, основанные на общих свойствах боковой цепи:

(1) Неполярные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Полярные без заряда: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Кислые (отрицательно заряженные): Asp, Glu;

(4) Основные (положительно заряженные): Lys, Arg;

(5) Остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и

(6) Ароматические: Trp, Tyr, Phe, His

[0095] Неконсервативные замены производятся путем замены представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

[0096] Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также можно заменить, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения неправильного перекрестного связывания. И наоборот, цистеиновая связь(и) может быть добавлена к антителу для улучшения его стабильности, в частности когда антитело является фрагментом антитела, таким как фрагмент Fv. Типичные цистеиновые мутации описаны в данном документе (например, мутация G44C домена VH SEQ ID NO: 29 или мутация Q10°C домена VL SEQ ID NO: 30).

[0097] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению содержит домен Fc антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc антитела представляет собой домен Fc человека. В определенных вариантах реализации изобретения домен Fc антитела представляет собой домен Fc IgG4 человека.

[0098] В некоторых вариантах реализации изобретения модифицируют один или более аминокислотных остатков в константной области тяжелой цепи и/или константной области легкой цепи антитела. Например, могут быть модифицированы аминокислотные остатки антител, описанные в Примерах. В некоторых вариантах реализации изобретения область Fc антител модифицирована для усиления или уменьшения активности АЗКЦ и/или КЗЦ антител. См., Shields и соавт., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001 год); Presta и соавт., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002 год).

[0099] В некоторых вариантах реализации изобретения область Fc антител модифицируется для улучшения образования и/или стабильности димера или для уменьшения гетерогенности димера (например, перетасовки). Было продемонстрировано, что мутация серин на пролин в положении 241 с применением нумерации Кабата (Kabat и соавт. 1991 год, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Пятое издание, U. S. Министерство здравоохранения и социальных служб США, NIH Publication № 91-3242) или в позиции 228 с применением индекса EU (Edelman и соавт., 1969 год, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1):78-85) в шарнирной области человеческого IgG4 приводит к значительному уменьшению образования внутрицепочечной дисульфидной связи, что приводит к уменьшению молекул "полу-антител" IgG4 и уменьшенной гетерогенности/перетасовке молекул IgG4 (Bloom и соавт., 1997 год, Protein Sci, 6:407- 415; Angal и соавт., 1993 год, Molecular Immunology, 30(1):105-108)). Также опубликованы сообщения о том, что эта мутация шарнира может уменьшить перетасовку IgG4 и увеличить период полувыведения молекул IgG4 in vivo (Labrijn, и соавт., 2009 год, Nat Biotechnol 27:767-771; Stubenrauch, и соавт., 2010 год, Drug Metab Dispos 38:84-91). Van der Neut Kolfschoten и соавт., сообщали, что домен C_H3 IgG4, а не шарнир кора, преимущественно участвует в реакции обмена Fab-фрагментами (см., Van der Neut Kolfschoten и соавт., 2007 год, Science, 317:1554-1557 ("Van der Neut Kolfschoten") на стр. 1555, col. 2). Van der Neut Kolfschaten сообщил, что обмен домена C_H3 IgGl на домен C_H3 IgG4 активировал обмен фрагментом Fab для IgGl, в то время как обмен домена C_H3 IgG4 аннулировал обмен фрагментом Fab для IgG4 (см., стр. 1555 и Фиг. 2D).

[0100] В конкретном варианте реализации изобретения в данном документе представлены четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с PSGL-1 и которые содержат одну или более аминокислотных замен в шарнирной области IgG4, при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент сохраняет специфическое связывание с указанным PSGL-1 и при этом перетасовка IgG4 снижается по сравнению с антителом, содержащим шарнирную область IgG4, не содержащую указанную одну или более аминокислотных замен. В конкретном варианте реализации изобретения шарнирная область IgG4 содержит только одну аминокислотную замену. Примером "шарнирной области человеческого IgG4" является область тяжелой цепи антитела IgG4 между доменами C_HI и C_H2, как указано в Angal и соавт., 1993 год, Molecular Immunology, 30(1):105-108.

[0101] В конкретном варианте реализации изобретения снижение перетасовки IgG4 определяют путем обнаружения более низкого количества молекул полуантитела или обмена молекулами "плечей", полученных из описанного в данном документе антитела, которые содержат одну или более аминокислотных замен в шарнирной области по сравнению с количеством молекул полуантитела или обмена молекулами "плечей", полученных из молекулы IgG4, содержащей шарнирную область IgG4, не содержащую указанную одну или более аминокислотных замен. Любой известный в данной области техники анализ может быть применен для определения образования полуантител и молекул биспецифических антител. См., например, Van der Neut Kolfschoten и соавт., 2007 год, Science, 317:1554-1557, для примеров анализов для выявления продукции биспецифических антител.

[0102] В конкретном варианте реализации изобретения в данном документе представлены четырехвалентные антитела, которые специфически связываются с PSGL-1 и включают домен Fc IgG4 человека, содержащий аминокислотную замену серина на пролин в аминокислотном положении 228 тяжелой цепи, пронумерованной в соответствии с индексом EU (также известное как положение 241 с применением нумерации Кабата).

[0103] Модификации включают также гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилируются в консервативных положениях в их константных областях (Jefferis and Lund, 1997 год, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997 год, TibTECH 15:26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd и соавт., 1996 год, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990 год, Biochem. 29:4175-4180) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, которое может влиять на конформацию и представляет собой трехмерную поверхность гликопротеина (Hefferis and Lund, выше; Wyss and Wagner, 1996 год, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Олигосахариды могут также применяться для нацеливания данного гликопротеина на определенные молекулы на основе конкретных распознающих структур. Сообщалось также, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). В частности, клетки СНО с регулируемой тетрациклином экспрессией β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), катализирующие гликозилтрансферазой образование биссектирующего N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), как сообщается, улучшают активность АЗКЦ (Umana и соавт. 1999 год, Mature Biotech. 17:176-180).

[0104] Гликозилирование антител обычно является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин, аспарагин-X-треонин и аспарагин-X-цистеин, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также могут быть применены 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

[0105] Добавление сайтов гликозилирования к антителу обычно осуществляют путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более описанных выше трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение может также быть сделано добавлением, или замещением, одного или более остатков серина или треонина в последовательность исходного антитела (для сайтов с O-связанным гликозилированием).

[0106] Профиль гликозилирования антител также может быть изменен без изменения лежащей в их основе нуклеотидной последовательности. Гликозилирование во многом зависит от клетки-хозяина, применяемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клеток, применяемый для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например, антител, в качестве потенциальной терапии редко является нативной клеткой, можно ожидать изменений в профиле гликозилирования антител (см., например, Hse и соавт., 1997 год, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

[0107] В дополнение к выбору клеток-хозяев факторы, которые влияют на гликозилирование при рекомбинантном продуцировании антител, включают в себя режим роста, состав культуральной среды, плотность культуры, оксигенацию, рН, схемы очистки и тому подобное. Предложены различные способы изменения профиля гликозилирования, достигнутого в конкретном организме-хозяине, включая введение или сверхэкспрессирование определенных ферментов, участвующих в производстве олигосахаридов (патенты США № 5,047,335; 5,510,261; и 5,278,299). Гликозилирование или определенные типы гликозилирования могут быть ферментативно удалены из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидазы H (Эндо H), N-гликозидазы F, эндогликозидазы F1, эндогликозидазы F2 или эндогликозидазы F3. Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин может быть генетически сконструированной, чтобы быть дефектной при производстве некоторых типов полисахаридов. Эти и подобные методы хорошо известны в данной области техники.

[0108] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело по данному изобретению модифицировано с применением методов связывания, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации могут применяться, например, для прикрепления меток для иммуноанализа.

[0109] Четырехвалентное антитело или полипептид по данному изобретению могут быть конъюгированы (например, связаны) с агентом, таким как терапевтический агент или метка. Примерами терапевтических агентов являются радиоактивные фрагменты, цитотоксины и химиотерапевтические молекулы.

[0110] Четырехвалентное антитело (или полипептид) по данному изобретению может быть связано с меткой, такой как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула, фермент или любые другие метки, известные в данной области техники. Применяемый в данном документе термин "метка" относится к любой молекуле, которая может быть выявлена. В определенном варианте реализации изобретения антитело может быть помечено путем введения радиоактивно меченной аминокислоты. В определенном варианте реализации изобретения биотиновые фрагменты, которые могут быть обнаружены помеченным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть обнаружены оптическими или колориметрическими методами) могут быть присоединены к антителу. В некоторых вариантах реализации изобретения метка может быть включена или присоединена к другому реагенту, который, в свою очередь, связывается с антителом, представляющим интерес. Например, метка может быть включена или присоединена к антителу, которое, в свою очередь, специфически связывает антитело, представляющее интерес. В некоторых вариантах реализации изобретения метка или маркер также могут быть терапевтическими. Могут быть применены различные способы маркировки полипептидов и гликопротеинов, известные в данной области техники. Некоторые общие классы меток включают, но не ограничиваются ими, ферментативные, флуоресцентные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы и радионуклеотиды (например,³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I или ¹³¹I), флуоресцентные метки (например, флуоресцеин-изотиоцианат (FITC), родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов или фикоэритрин (PE)), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу, глюкозооксидазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, алкогольдегидрогеназу, малатдегидрогеназу, пенициллиназу или люциферазу), хемилюминесцентные, биотинильные группы, предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновой застежки, сайты связывания вторичных антител, металлосвязывающие домены или метки эпитопа). В некоторых вариантах реализации изобретения метки прикрепляются с помощью спейсерных групп различной длины для уменьшения потенциальных стерических несоответствий.

[0111] Основываясь на приведенном в данном документе описании, четырехвалентное антитело по данному изобретению может быть испытано в соответствии со множеством in vitro и in vivo анализов, известных в данной области техники. Такие анализы могут включать, например, анализы связывания, направленные на способность четырехвалентного антитела или его фрагмента связывать представляющий интерес эпитоп или полипептид (например, человеческий PSGL-1 или его эпитоп) или функциональные анализы, направленные на одно или более функциональных свойств четырехвалентного антитела или его фрагмента.

[0112] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению может быть проверено на активность связывания с человеческим PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения связывание четырехвалентного антитела с человеческим PSGL-1 или его эпитопом может быть протестировано в анализе связывания in vitro. В данной области техники известны различные анализы связывания. Такие анализы связывания могут представлять собой клеточные анализы (например, испытание способности четырехвалентного антитела связывать клетку, экспрессирующую PSGL-1 человека или его эпитоп) или они могут быть на основе полипептидов (например, испытание способности четырехвалентного антитела связывать PSGL-1 человека или его эпитоп). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению испытывают на связывание с клеткой, экспрессирующей человеческий PSGL-1 (например, клеткой Sp2, как показано в примере ниже) с помощью проточной цитометрии, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - метода резонансного переноса энергии флуоресценции), гистохимических анализов и тому подобного. Другие подходящие анализы связывания могут включать, без ограничения, равновесные методы (например, ферментный иммуносорбентный анализ (ИФА), радиоиммуноанализ (RIA), анализ Biacore™, непрямой анализ связывания, анализ конкурентного ингибирования, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), иммунопреципитацию, гель-электрофорез и хроматографию (например, гель-фильтрацию).

[0113] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению может быть проверено на один или более функциональных анализов для функционирования PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению может быть проверено на индукцию апоптоза в клетке(клетках), экспрессирующих PSGL-1 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению демонстрирует усиленную индукцию апоптоза в целевой клетке (например, клетке, экспрессирующей человеческий PSGL-1 или его эпитоп) по сравнению с обычным (например, двухвалентным) антителом, имеющим один или более доменов VH или VL, общих с четырехвалентным антителом (например, исходным антителом). Как показано в данном документе, четырехвалентные антитела по данному изобретению проявляют большую эффективность в индуцировании апоптоза в целевых клетках, чем исходные антитела, имеющие общий домен VH и/или VL. Анализы апоптоза описаны в данной области техники и могут быть легко выполнены специалистом в данной области техники (см., например, Muppidi, J., Porter, M. and Siegel, R. M. 2004 год. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3. 17. 1-3. 17. 36). Выбранные анализы для обнаружения апоптоза (например, окрашивание аннексином V или пропидиум иодидом) приведены в качестве примеров выше. Термин "индуцировать" или "индуцирование" означает начало или увеличение апоптоза выше контрольного уровня. Апоптоз активированных Т-клеток может индуцироваться на около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 100%, около 125%, около 150% или более по сравнению с контролем (например, апоптоз активированных Т-клеток в отсутствие описанных в данном документе антител или в присутствии неспецифического антитела).

[0114] Т-клетки и линии Т-клеток, которые подходят для применения в описанных в данном документе анализах, относящихся к активности PSGL-1, легко доступны (например, ARR, DU. 528, Юркат, H-SB2, RPMI 8402, CML-T1, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-T1, SUP-T3, MOLT 3/4, P12-Ichikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL- 1, MOLT 16/17, TALL- 104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Bel3, HUT 78/H9, HUT 102, MT- 1, DEL, JB6, Karpas 299, SU-DHL1, 12H5, 3D054. 8, 3DO11. 10, 8D051. 15 или 3D018. 3) или могут быть легко идентифицированы с применением способов, известных в данной области техники (см., например, Thornton, A. M. 2003 год. Fractionation of T and B Cells Using Magnetic Beads. Current Protocols in Immunology. 55:3. 5A. l-3. 5A. i l., Hathcock, K. 2001 год. T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and Accessory Cells. Current Protocols in Immunology. 00:3. 3. 1-3. 3. 5., Horgan, K., Shaw, S. and Boirivant, M. 2009 год. Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 85:7. 4. 1-7. 4. 9., и Kanof, M. E. 2001 год. Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 00:7. 3. 1-7. 3. 5). В конкретных вариантах реализации изобретения клетки или клеточные линии для применения в анализах пролиферации клеток могут экспрессировать PSGL-1, эндогенно или рекомбинантно. Клетки или клеточные линии для применения в анализах жизнеспособности клеток могут экспрессировать PSGL-1, эндогенно или рекомбинантно, и проявляют изменения в жизнеспособности клеток в ответ на лиганд PSGL-1 или связывание антитела к PSGL-1. Клетки или клеточные линии для применения в анализах апоптоза могут экспрессировать PSGL-1, эндогенно или рекомбинантно, и проявляют изменения в апоптозе в ответ на лиганд PSGL-1 или связывание антитела к PSGL-1. Предпочтительно клетки или клеточные линии являются человеческими (например, ARR, DU. 528, Юркат, H-SB2, RPMI 8402, CML-Tl, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-Tl, SUP-T3, MOLT 3/4, P12-Ichikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-Tl, TALL-1, MOLT 16/17, TALL-104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Bel3, HUT 78/H9, HUT 102, MT-1, DEL, JB6, Karpas 299 или SU-DHL1).

[0115] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению может быть протестировано на ингибирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению демонстрирует усиленное ингибирование ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа) (например, в животной модели trans vivo) по сравнению с обычным (например, двухвалентным) антителом, имеющим один или более доменов VH или VL, общих с четырехвалентным антителом (например, исходным антителом). Как показано в данном документе, четырехвалентные антитела по данному изобретению проявляют большую эффективность при ингибировании ГЗТ в модели отека лапки мышей trans vivo, чем исходные антитела, имеющие общий домен VH и/или VL. Анализы ГЗТ описаны в данной области техники и приведены в качестве примера ниже и могут быть легко выполнены специалистом в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело по данному изобретению может проявлять активность ингибирования ГЗТ, которое может быть увеличено на около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 100%, около 125%, около 150%, около 200%, около 300%, около 400%, около 500%, около 600% или более по сравнению с контролем (например, ингибирование ГЗТ с помощью обычного или двухвалентного антитела, такого как исходное антитело).

III. Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и продуцирование антител

[0116] В данном изобретении также предложены полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, кодирующий любое из четырехвалентных антител и/или полипептидов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептиды содержат последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой выделенный полинуклеотид (например, выделенный из клетки-хозяина или из одного, или более различных полинуклеотидов).

[0117] В данном документе представлены полинуклеотиды, кодирующие любые четырехвалентные антитела или полипептидные составляющие (например, мономеры, такие как одноцепочечные полипептиды, тяжелые цепи антитела и/или легкие цепи антитела), описанные в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид по данному изобретению кодирует полипептидную последовательность, выбранную SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17-31. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид по данному изобретению содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид по данному изобретению содержит один или более интронов. В других вариантах реализации изобретения полинуклеотид по данному изобретению не содержит интрон, например, кДНК или процессированную последовательность мРНК.

[0118] Специалистам в данной области техники понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют описанный в данном документе полипептид. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Таким образом, полинуклеотиды, которые различаются в зависимости от различных применений кодонов, являются специально предусмотренными данным изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, представленные в данном документе, входят в объем данного изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученная мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с применением стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей базы данных).

[0119] Также в данном документе представлены полинуклеотиды, которые оптимизированы, например, путем оптимизации кодонов/РНК, замены гетерологичными сигнальными последовательностями и элиминацией элементов нестабильности мРНК. Способы получения оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих четырехвалентное антитело или его полипептид для рекомбинантной экспрессии путем введения изменений кодонов и/или элиминации ингибиторных областей в мРНК, могут быть осуществлены путем адаптации методов оптимизации, описанных, например, в патентах США № 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414, 132; и 6,794,498, соответственно. Например, потенциальные сайты сплайсинга и элементы нестабильности (например, элементы, богатые на A/T или A/U) в РНК могут быть мутированы без изменения аминокислот, кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, с целью повышения стабильности РНК для рекомбинантной экспрессии. Эти изменения используют вырожденность генетического кода, например, используя альтернативный кодон для идентичной аминокислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения может быть желательным изменить один или более кодонов для кодирования консервативной мутации, например, подобной аминокислоты с аналогичной химической структурой и свойствами и/или функцией в качестве исходной аминокислоты. Такие способы могут увеличить экспрессию четырехвалентного антитела к PSGL-1 или его полипептида по отношению к экспрессии бивалентного антитела к PSGL-1 или его полипептида, кодируемого полинуклеотидами, которые не были оптимизированы. Кроме того, полинуклеотидные последовательности могут быть сконструированы так, чтобы соответствовать предпочтительному использованию кодонов в клетке-хозяине, например, использованию кодонов E. coli или использованию кодонов CHO.

[0120] Оптимизированная полинуклеотидная последовательность, кодирующая описанное в данном документе четырехвалентное антитело или его полипептид, может гибридизоваться с неоптимизированной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей четырехвалентное антитело или его полипептид, описанное в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая описанное в данном документе четырехвалентное антитело или его полипептид, гибридизуется в условиях высокой жесткости с неоптимизированной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей четырехвалентное антитело или его полипептид, описанное в данном документе. В конкретном варианте реализации изобретения оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая описанное в данном документе четырехвалентное антитело или его полипептид, гибридизуется в условиях высокой, средней или низкой жесткости гибридизации с неоптимизированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей четырехвалентное антитело или его полипептид, описанное в данном документе. Информация о условиях гибридизации была описана, см., например, в публикации заявки на патент США № 2005/0048549 (например, параграфы 72-73), содержание которой включено в данной документ во всей полноте посредством ссылки.

[0121] Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть получены с применением химического синтеза, рекомбинантных способов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотида хорошо известны в данной области техники и не нуждаются в подробном описании в данном документе. Специалист в данной области техники может применять предоставленные в данном документе последовательности и коммерческий синтезатор ДНК для получения желаемой последовательности ДНК.

[0122] Для получения полинуклеотидов с применением рекомбинантных способов, полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, может быть вставлен в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно описано в данном документе. Полинуклеотиды могут быть вставлены в клетки-хозяева любыми способами, известными в данной области техники. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида путем прямого поглощения, эндоцитоза, трансфекции, с применением плазмиды F или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться внутри клетки в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрироваться в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид можно выделить из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области техники. См., например, Sambrook и соавт. (1989 год).

[0123] В альтернативном варианте, ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области техники и описана в патентах США № 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065; и 4,683,202, а также ПЦР: The Polymerase Chain Reaction, Mullis и соавт. изд., Birkauswer Press, Boston (1994 год).

[0124] Данное изобретение также обеспечивает векторы (например, клонирующие векторы или экспрессионные векторы), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из полипептидов (включая антитела), описанных в данном документе. Подходящие клонирующие векторы могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методами или могут быть выбраны из большого количества клонирующих векторов, доступных в данной области техники. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьироваться в зависимости от клетки-хозяина, предназначенной для применения, полезные клонирующие векторы, как правило, обладают способностью к саморепликации, могут обладать одной целью для конкретной эндонуклеазы рестрикции и/или могут нести гены для маркера, который может применяться при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ДНК фагов и "челночные" векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

[0125] Экспрессионные векторы обычно являются реплицируемыми полинуклеотидными конструкциями, которые содержат полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Экспрессионный вектор может реплицироваться в клетках-хозяевах либо в виде эпистолы, либо как интегральная часть хромосомной ДНК. Подходящие экспрессионные векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессионный вектор(ы), описанные в публикации PCT №WO 87/04462. Компоненты вектора могут включать, но не ограничиваются ими, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; источник репликации; один или более маркерных генов; и подходящие контролирующие транскрипцию элементы (такие как промоторы, энхансеры или терминаторы). Для экспрессии (то есть, трансляции) обычно требуются один или более контролирующих транскрипцию элементов, таких как сайты связывания рибосомы, сайты инициации трансляции или стоп-кодоны.

[0126] Способы получения антител и полипептидов, полученных из антител, известны в данной области техники и описаны в данном документе. Хорошо известные способы могут быть применены для идентификации антител к PSGL (например, антител которые специфически связываются с человеческим PSGL-1), из которых вариабельные домены (например, домены VH и/или VL) могут быть применены в четырехвалентных антителах по данному изобретению. Типовые антитела к человеческому PSGL-1, а также способы скрининга, продуцирования и очистки таких антител описаны в международной патентной заявке № WO 2012/174001.

[0127] Дополнительные антитела к человеческому PSGL-1 могут быть идентифицированы с применением способов, известных в данной области техники, таких как те, что описаны в международной патентной заявке № WO 2012/174001 и выше. Например, моноклональные антитела могут быть получены с применением гибридомной технологии, такой как описанные Kohler and Milstein (1975 год), Nature, 256:495. В гибридомном методе мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируют иммунизирующим агентом (например, клеткой, экспрессирующей человеческий PSGL-1 или его фрагмент) для индукции выработки лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфически связываются с иммунизирующим агентом. В альтернативном варианте, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной линией клеток с применением подходящего фактора, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986 год) стр. 59-1031). Иммортализованные линии клеток обычно представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности миеломные клетки грызунов, кроликов, быков или клетки человеческого происхождения. Как правило применяют линии клеток миеломы крысы или мыши. Клетки гибридомы можно культивировать в подходящей культуральной среде, которая желательно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, иммортализованных клеток. Например, если исходным клеткам не хватает фермента, гипоксантин гуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда ГАТ"), которые предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.

[0128] Желательными иммортализованными клеточными линиями являются те, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную экспрессию антител на высоком уровне выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к среде, такой как среда ГАТ. Более желательными иммортализованными клеточными линиями являются линии миеломы мыши, которые могут быть получены, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, штат Калифорния и Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек также описаны для производства человеческих моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol. (1984 год), 133:3001; Brodeur и соавт., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк, (1987 год) стр. 51-63).

[0129] Культуральную среду, в которой культивируют гибридомные клетки, можно затем анализировать на присутствие моноклональных антител. Антитело может быть подвергнуто скринингу на предмет специфического связывания с полипептидом ORP150 (например, связывание с эпитопом во внеклеточном домене полипептида ORP150), полученным или экспрессированным на клеточной поверхности плазмоцитомы, множественной миеломы, колоректального рака, рака желудка или пищевода, или опухолевых клеток. Для скрининга могут применяться раковые клетки или полипептид ORP150 (или его фрагмент, содержащий внеклеточный домен полипептида ORP150). Например, для скрининга могут применяться клетки RPMI8226, U266, NCI-H929, L363, Colo205, DLD-1, HT29, SNU-1, Kato-III или CE146T. Полипептид, содержащий аминокислоты 673-800, 701-800, 673-752 или 723-732 SEQ ID NO: 17, также может применяться для скрининга.

[0130] В некоторых вариантах реализации изобретения специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммунологический анализ (RIA) или ферментный иммуносорбентный анализ (ИФА). Такие методы и анализы известны в данной области техники. Аффинность связывания моноклонального антитела может, например, определяться с помощью анализа Scatchard Munson and Pollard (1980 год), Anal. Biochem., 107:220.

[0131] После идентификации желаемых клеток гибридомы клоны могут быть субклонированы путем процедуры предельного разведения и выращены с помощью стандартных способов (Goding, выше). Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, среду Игла в модификации Дульбекко или среду RPMI-1640. В альтернативном варианте, клетки гибридомы можно выращивать in vivo в виде асцита у млекопитающего.

[0132] Моноклональные антитела могут быть получены путем культивирования клеток гибридомы, и антитела, секретируемые клетками гибридомы, могут быть дополнительно выделены или очищены. Антитела могут быть выделены или очищены от культуральной среды или асцитной жидкости обычными процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на носителе белок A-сефароза или хроматография с гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

[0133] Четырехвалентные антитела или полипептиды по данному изобретению могут быть получены путем скрининга библиотеки антител или полипептидов для отбора антител или полипептидов, которые связываются с человеческим PSGL-1, например, экспрессируются на клеточной поверхности клетки. Могут применяться библиотеки фагового дисплея антитела, известные в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела в библиотеке (например, "отображаемые" на фаге) являются одноцепочечными фрагментами Fv (scFv) или фрагментом Fab. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела в библиотеке (например, "отображаемые" на фаге) являются однодоменными антителами. Например, однодоменное антитело может полностью или частично содержать вариабельный домен тяжелой цепи или полностью, или частично содержать вариабельный домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела в библиотеке представляют собой человеческие антитела. Идентифицированные антитела могут дополнительно проверяться на их способности индуцировать гибель клеток (например, апоптоз) и/или связывать PSGL-1 человека с применением способов, известных в данной области техники и описанных в данном документе.

[0134] Четырехвалентные антитела по данному изобретению могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патентах США № 4,816,567 и 6,331,415. Например, ДНК, кодирующая вариабельную или константную область любого из четырехвалентных антител по данному изобретению (или одноцепочечных полипептидов, полипептидов тяжелой или легкой цепи, которые являются их составляющими), может быть легко выделена и секвенирована с применением обычных процедур (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы по данному изобретению служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые иным способом не производят белок иммуноглобулина для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замещения кодирующей последовательности на константные домены тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4,816,567) или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида. Такой неиммуноглобулиновый полипептид может быть заменен на константные домены антитела по данному изобретению или может быть заменен вариабельными доменами одного антигенсвязывающего активного центра антитела по данному изобретению для создания химерного двухвалентного антитела.

[0135] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентные антитела по данному изобретению экспрессируются двумя экспрессионными векторами. Например, каждый экспрессионный вектор может экспрессировать один мономер димера по данному изобретению (например, одноцепочечный полипептид или полипептид тяжелой, или легкой цепи антитела). В альтернативном варианте, оба мономера димера по данному изобретению экспрессируются одним экспрессионным вектором.

[0136] Обычно экспрессионный вектор имеет транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, которые получены из вида, совместимого с клеткой-хозяином. Кроме того, вектор обычно несет определенный ген(ы), который(которые) способен обеспечивать отбор по фенотипу в трансформированных клетках.

[0137] Широкое разнообразие рекомбинантных экспрессионных систем вектор-хозяин для эукариотических клеток является известным и может быть применено в данном изобретении. Например, Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи наиболее часто применяются среди эукариотических микроорганизмов, хотя имеется ряд других штаммов, таких как Pichia pastoris. В качестве хозяев могут также применяться клеточные линии, полученные из многоклеточных организмов, такие как Sp2/0 или яичник китайского хомячка (CHO), которые доступны из ATCC. Типичными векторными плазмидами, подходящими для трансформации эукариотических клеток, являются, например, pSV2neo и pSV2gpt (ATCC), pSVL и pSVK3 (Pharmacia) и pBPV-1/pML2d (International Biotechnology, Inc.).

[0138] Эукариотические клетки-хозяева, применяемые в данном документе, представляют собой, например, клетки гибридомы, миеломы, плазмоцитомы или лимфомы. Однако другие эукариотические клетки-хозяева могут быть соответствующим образом применены, если клетки-хозяева млекопитающих способны распознавать транскрипционные и трансляционные последовательности ДНК для экспрессии белков; процессировать лидерный пептид путем расщепления лидерной последовательности и секреции белков; и обеспечивать посттрансляционные модификации белков, например, гликозилирование.

[0139] Соответственно, данное описание относится к клеткам-хозяевам (например, эукариотическим клеткам-хозяевам), которые трансформируются рекомбинантными экспрессионными векторами, содержащими конструкции ДНК, описанные в данном документе, и которые способны экспрессировать четырехвалентные антитела или полипептиды по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения трансформированные клетки-хозяева по данному изобретению содержат по меньшей мере одну конструкцию ДНК, содержащую полинуклеотид по данному изобретению, или полинуклеотид, экспрессирующий мономер, димер или четырехвалентное антитело по данному изобретению, а также транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, которые расположены относительно кодирующих последовательностей ДНК для непосредственной экспрессии антител или полипептидов.

[0140] Любые клетки-хозяева, способные сверхэкспрессировать гетерологичную ДНК, могут быть применены с целью выделения генов, кодирующих антитело, полипептид или белок, представляющие интерес. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки COS, HeLa и CHO. См., также публикацию PCT №WO 87/04462. Подходящие клетки-хозяева, не относящиеся к млекопитающим, включают клетки прокариот (такие как E. coli или B. subtillis) и дрожжей (такие как S. cerevisae, S. pombe или K. lactis).

[0141] Клетки-хозяева, применяемые в данном изобретении, могут быть трансформированы различными способами с помощью стандартных процедур трансфекции, хорошо известных в данной области техники. К числу стандартных процедур трансфекции, которые могут быть применены, относятся методы электропорации, слияния протопластов и методы осаждения фосфатом кальция. Такие методы в общем описаны в F. Toneguzzo и соавт. (1986 год), Mol. Cell. Biol., 6:703-706; G. Chu и соавт., Nucleic Acid Res. (1987 год), 15:1311-1325; D. Rice и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979 год), 79:7862-7865; и V. Oi и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983 год), 80:825-829. Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих средств, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; баллистическую трансфекцию; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус коровьей оспы). Выбор вводящихся векторов или полинуклеотидов часто зависит от особенностей клетки-хозяина.

[0142] В случае двух экспрессионных векторов, два экспрессионных вектора могут переноситься в клетку-хозяина один за другим отдельно или вместе (совместный перенос или котрансфекция).

[0143] Данное изобретение также обеспечивает способ получения антител или полипептидов, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор(ы), кодирующий антитела или полипептиды, и выделение антител или полипептидов из культуры способами, хорошо известными специалисту в данной области техники.

[0144] Кроме того, желаемые антитела могут быть получены в трансгенном животном. Подходящее трансгенное животное может быть получено в соответствии со стандартными способами, которые включают микроинъекцию в яйцеклетки соответствующих экспрессионных векторов, перенос яйцеклеток в псевдобеременную самку и выбор потомка, экспрессирующего желаемое антитело.

[0145] Данное изобретение также относится к химерным четырехвалентным антителам, которые специфически связывают PSGL-1 человека. Например, вариабельные и константные области четырехвалентного антитела относятся к отдельным видам. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи происходят из описанных в данном документе мышиных антител. Химерное антитело по данному изобретению может быть получено способами, хорошо известными в данной области техники. См., например, патент США № 6,808,901; патент США № 6,652,852; патент США № 6,329,508; патент США № 6,120,767; и патент США № 5,677,427, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. В общем, химерное антитело может быть получено путем получения кДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител, вставки кДНК в экспрессионный вектор, который после введения в эукариотические клетки-хозяева экспрессирует химерное антитело по данному изобретению. Желательно, чтобы экспрессионный вектор содержал функционально полную константную последовательность тяжелых или легких цепей, так что любая вариабельная последовательность тяжелых или легких цепей может быть легко вставлена в экспрессионный вектор.

[0146] Данное изобретение обеспечивает гуманизированное четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1. Гуманизированное антитело, как правило, представляет собой человеческое антитело, в котором остатки из CDR заменяются остатками из CDR видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса или кролик, обладающих желаемой специфичностью, аффинностью и функциональной возможностью. В некоторых случаях остатки каркаса Fv человеческого антитела заменяются соответствующими нечеловеческими остатками.

[0147] Существует четыре общих этапа гуманизации моноклонального антитела. В их число входят:(1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности легких и тяжелых вариабельных доменов начального антитела, (2) проектирование гуманизированного антитела, то есть, определение того, какую область каркаса антитела использовать во время процесса гуманизирования, (3) фактические методики/технические приемы гуманизирования и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США № 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 6,180,370; и 6,548,640. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы больше походить на человеческие константные области, во избежание иммунного ответа, в случае если антитело применяется в клинических испытаниях и лечении людей. См., например, патенты США № 5,997,867 и 5,866,692.

[0148] Важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и другим благоприятным биологическим свойствам. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть получены путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей кандидатных иммуноглобулинов. Проверка этих изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности кандидатного иммуноглобулина, то есть, анализировать остатки, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены из консенсуса и последовательности импорта, так что достигается желательная характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену(нам). Как правило, остатки CDR непосредственно и наиболее существенно влияют на связывание антигена. Гуманизированные антитела могут также содержать модификации в шарнирной области для улучшения одной или более характеристик антитела.

[0149] В другом альтернативном варианте антитела могут быть подвергнуты скринингу и созданы рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея. См., например, патенты США № 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743 и 6,265,150; и Winter и соавт., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994 год). В альтернативном варианте, технология фагового дисплея (McCafferty и соавт., Nature 348:552-553 (1990 год)) может быть применена для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro, из хранилищ гена вариабельных (V) доменов иммуноглобулина у неиммунизированных доноров. Согласно этой технологии, гены домена V антитела клонируются в рамке в основной или минорный ген белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и отображаются как функциональные фрагменты антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитевидная частица содержит одноцепочечную копию ДНК фагового генома, отборы, основанные на функциональных свойствах антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей может выполняться в различных форматах; для обзора см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993 год). Для фагового дисплея можно применять несколько источников сегментов гена V. Clackson и соавт., Nature 352:624-628 (1991 год) выделили разнообразные антитела к оксазолону из небольшой случайной комбинаторной библиотеки генов V, полученных из селезенки иммунизированных мышей. Можно создать набор генов V от неиммунизированных человеческих доноров, а антитела к разнообразному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделить по существу применяя методы, описанные Марк и соавт., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 год), или Griffith и соавт., EMBO J. 12:725-734 (1993 год). В естественном иммунном ответе гены антител накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая сверхмутация). Некоторые из внесенных изменений дадут более высокую аффинность, и В-клетки, демонстрирующие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно реплицируются и дифференцируются во время последующей антигенной стимуляции. Этот естественный процесс можно имитировать, используя метод, известный как "перетасовка цепи". Marks и соавт., Bio/Technol. 10:779-783 (1992 год)). В этом способе аффинность "первичных" человеческих антител, полученных с помощью фагового дисплея, может быть улучшена путем последовательной замены генов области V тяжелой и легкой цепей из хранилищ встречающихся в природе вариантов (репертуаров) генов домена V, полученных от неиммунизированных доноров. Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител с аффинностью в диапазоне пМ-нМp. Стратегия создания очень больших хранилищ фаговых антител (также известная как "мать-все-библиотек") была описана Waterhouse и соавт., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993 год). Генная перетасовка может также применяться для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет подобные аффинности и специфичности к начальному антителу грызунов. В соответствии с этим способом, который также упоминается как "эпитопный импринтинг", ген домена V тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученных методом фагового дисплея, заменяется репертуаром генов домена V человека, создавая таким образом химеры грызун-человек. Отбор антигена приводит к выделению вариабельных областей человека, способных восстанавливать функциональный антигенсвязывающий сайт, то есть, эпитоп регулирует (запечатлевает) выбор партнера. Когда процесс повторяется с целью замены оставшегося домена V грызуна, получают человеческое антитело (см., Публикацию PCT №WO 93/06213, опубликованную 1-го апреля 1993 года). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов с помощью пересадки CDR, этот метод обеспечивает полностью человеческие антитела, которые не имеют каркасных остатков или остатков CDR происходящих из грызунов. Очевидно, что, хотя вышеупомянутое обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие принципы, которые обсуждаются, применимы для модифицирования антител с целью применения, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров.

[0150] В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой полностью человеческое антитело. Нечеловеческие антитела, которые специфически связывают антиген, могут быть применены для получения полностью человеческого антитела, которое связывается с этим антигеном. Например, квалифицированный специалист может использовать метод замены цепи, в котором тяжелая цепь нечеловеческого антитела, коэкспрессируется с экспрессионной библиотекой, экспрессирующей различные легкие цепи человека. Полученные гибридные антитела, содержащие одну легкую цепь человека и одну нечеловеческую тяжелую цепь, затем подвергают скринингу на связывание антигена. Легкие цепи, которые участвуют в связывании антигена, затем коэкспрессируются с библиотекой тяжелых цепей антител человека. Полученные человеческие антитела еще раз скринируют на связывание антигена. Такие методы, как этот, дополнительно описаны в патенте США 5,565,332. Кроме того, антиген может быть применен для инокуляции животного, которое является трансгенным на гены иммуноглобулина человека. См., например, патент США 5,661,016.

[0151] Данное описание также обеспечивает биспецифические антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичности связывания по меньшей мере для двух разных антигенов (включая различные эпитопы). В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифическое антитело по данному изобретению включает в себя два или более разных домена VH и/или VL, которые специфически связывают PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения два или более разных домена VH и/или VL специфически связывают один и тот же эпитоп PSGL-1. В некоторых вариантах реализации изобретения два или более разных домена VH и/или VL специфически связывают различные эпитопы PSGL-1, которые могут быть или не быть перекрывающимися эпитопами.

[0152] Биспецифическое антитело (моноклональное антитело, которое имеет специфичности связывания по меньшей мере двух разных антигенов) может быть получено с применением описанных в данном документе антител. Способы получения биспецифических антител известны в данной области техники (см., например, Suresh и соавт., 1986 год, Methods in Enzymology 121:210). Традиционно рекомбинантное продуцирование биспецифических антител было основано на коэкспрессии двух пар легкой цепи-тяжелой цепи иммуноглобулина, причем две тяжелые цепи имели разную специфичность (Millstein and Cuello, 1983 год, Nature 305, 537-539). В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифическое четырехвалентное антитело может быть получено с применением способов, представленных в качестве примера выше.

[0153] Согласно одному из подходов создания биспецифических антител, вариабельные домены антител с желаемой специфичностью связывания (сайты, связывающие антитело-антиген) слиты с последовательностями константного домена иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации изобретения слияние осуществляется с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть областей шарнира, СН2 и СН3. В некоторых вариантах реализации изобретения первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствует, по меньшей мере, в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессионные векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в регулировании взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах реализации изобретения, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, применяемых в конструкции, обеспечивают оптимальные выходы продукта. Однако, является возможным вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, в случае если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам продукта или в случае если соотношения не имеют особого значения.

[0154] Гетероконъюгатные антитела, содержащие два ковалентно присоединенных мономера или антитела, также лежат в пределах объема данного изобретения. Такие антитела применялись для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4,676,980) и для лечения ВИЧ-инфекции (Публикации PCT №WO 91/00360 и WO 92/200373; и EP 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с применением любых подходящих способов перекрестного связывания. Подходящие сшивающие агенты и способы хорошо известны в данной области техники и описаны в патенте США № 4,676,980.

[0155] Некоторые аспекты данного описания относятся к вариабельным доменам антител и/или фрагментам антител, например, которые могут быть применены в качестве компонента четырехвалентного антитела, описанного в данном документе. Фрагменты антитела могут содержать активную область связывания антител, такую как фрагменты Fab, F(ab')₂, scFv, Fv и тому подобное. Различные способы, известные в данной области техники, могут быть применены для получения и/или выделения фрагментов антител, которые могут быть включены в четырехвалентное антитело по данному изобретению, например, с помощью стандартных рекомбинантных методов, известных в данной области техники, на основе концепций, описанных в данном документе.

[0156] Могут быть получены одноцепочечные фрагменты Fv, такие как описанные в Iliades и соавт., 1997 год, FEBS Letters, 409:437-441. Связывание таких одноцепочечных фрагментов с применением различных линкеров описано в Kortt и соавт., 1997 год, Protein Engineering, 10:423-433. В данной области техники хорошо известны различные методы рекомбинантного получения и манипулирования антителами. Такие фрагменты могут быть получены из моноклональных антител, описанных в данном документе, с применением методов, хорошо известных в данной области техники (Rousseaux и соавт. (1986 год), в Methods Enzymol., 121:663-69 Academic Press).

[0157] Способы получения фрагментов антител хорошо известны в данной области техники. Например, фрагмент антитела может быть получен ферментативным расщеплением антител с пепсином для получения фрагмента 100 кДа, обозначенного как F(ab')₂. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с применением восстанавливающего агента на основе тиола и, необязательно, блокирующей группы на сульфгидрильные группы, образующиеся в результате расщепления дисульфидных связей, с получением моновалентных фрагментов Fab' 50 кДа. В альтернативном варианте, ферментативное расщепление с применением папаина дает сразу два моновалентных фрагмента Fab и непосредственно фрагмент Fc. Эти способы описаны, например, в патентах США № 4,036,945 и 4,331,647 и в ссылках, содержащихся в них, причем эти патенты включены в данный документ посредством ссылки. Также, см., Nisonoff и соавт. (1960 год), Arch Biochem. Biophys. 89:230; Porter (1959 год), Biochem. J. 73:119; Smyth (1967 год), Methods in Enzymology 11:421-426. В альтернативном варианте, Fab может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей Fab антитела, в экспрессионный вектор для прокариот или экспрессионный вектор для эукариот и введения данного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии Fab.

IV. Способы и применения

[0158] Некоторые аспекты данного изобретения относятся к способам и применениям четырехвалентных антител, описанных в данном документе. Эти способы и применения основаны, по меньшей мере частично, на свойствах четырехвалентных антител, как описано в данном документе, включая, без ограничения, их повышенное количество доменов связывания эпитопа, потенциал для меньшей зависимости от перекрестного связывания in vitro и/или in vivo, дифференциальную активность индукции апоптоза (например, клеток, экспрессирующих PSGL-1 человека), и/или улучшенную эффективность in vivo или trans vivo.

[0159] Как описано в данном документе, известно, что PSGL-1 участвует в воспалении и биологии Т-клеток. Четырехвалентные антитела по данному изобретению, которые специфически связываются с PSGL-1 человека, могут найти применение, помимо всего прочего, при лечении индивидуумов с заболеваниями, связанными с функцией Т-клеток (например, опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание) или индивидуумов, нуждающихся в медицинских процедурах, которые могут приводить к воспалительным процессам, таким как иммунологические реакции, или для которых такие патологические состояния контролируются заранее (например, трансплантация или переливание).

[0160] В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание. Неограничивающие примеры расстройств и заболеваний, которые можно лечить, либо один или более симптомов которых могут быть устранены или предотвращены при применении четырехвалентных антител, описанных в данном документе, включают псориаз, болезнь Крона, анкилозирующий спондилоартрит, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит и псориатический артрит), сахарный диабет, рассеянный склероз, энцефаломиелит, миастению, системную красную волчанку, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), синдром Шегрена, афтозную язву, ирит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, диабет I типа, воспалительные заболевания кишечника, язвенный колит, астму, аллергическую астму, кожную красную волчанку, склеродермию, вагинит, проктит, лекарственную сыпь, обратимую лепрозную реакцию, узловатую лепрозную эритему, аутоиммунный увеит, аллергический энцефаломиелит, острую некротизирующую геморрагическую энцефалопатию, идиопатическую двустороннюю прогрессирующую нейросенсорную тугоухость, апластическую анемию, истинную эритроцитарную анемию, идиопатическую тромбоцитопению, полихондрит, гранулематоз Вегенера, хронический активный гепатит, синдром Стивенса-Джонсона, идиопатическую стеаторею, красный плоский лишай, болезнь Грейвса, реакцию "трансплант против хозяина" (РТПХ), саркоидоз, первичный билиарный цирроз, задний увеит, интерстициальный фиброз легких, аллергические реакции, такие как атопическая аллергия, СПИД и T-клеточные новообразования, такие как лейкозы или лимфомы. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание является аутоиммунным заболеванием.

[0161] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой бляшковидный псориаз. Бляшковидный псориаз или вульгарный псориаз является наиболее распространенной формой псориаза и характеризуется возвышенными эритематозными бляшками на коже, с четкими краями, покрытыми серебристым чешуйкой. Существует предрасположенность очагов поражения затрагивать разгибательные поверхности конечностей, пояснично-крестцовый отдел и кожу головы. Соответствующие гистопатологические данные включают значительную воспалительную клеточную инфильтрацию дермы и эпидермиса, увеличение количества расширенных сосудов и существенное утолщение эпидермиса с нарушенной дифференциацией кератиноцитов и гиперкератозом. Примерно треть пациентов с бляшковидным псориазом классифицируются как имеющие болезнь средней или тяжелой степени тяжести и, следовательно, являются кандидатами на терапию, выходящую за рамки только местного лечения.

[0162] В другом варианте реализации изобретения, болезнь, которую лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой хронический бляшковидный псориаз. Симптомы хронического бляшковидного псориаза включают, но не ограничиваются ими, единичные или множественные возвышенные покрасневшие пятна на коже, варьирующие от размера монеты до большего размера, на любой части тела, включая, но не ограничиваясь, колени, локти, пояснично-крестцовый отдел, кожу головы и ногти.

[0163] В другом варианте реализации изобретения, болезнь, которую лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой каплевидный псориаз. Симптомы каплевидного псориаза включают в себя, но не ограничиваются ими, высыпания на коже чешуйчатых бляшек каплеобразной формы, сопровождаемые инфекцией, такой как стрептококковая инфекция горла.

[0164] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой обратный псориаз. Симптомы обратного псориаза включают, но не ограничиваются ими, гладкие, обычно влажные участки кожи, красные и воспаленные, которые, в отличие от связанного с бляшковидным псориазом образования чешуек, расположены в одной или более из следующих частей тела: подмышках, пахе, зоне под грудью, а также в других складках кожи вокруг половых органов и ягодиц.

[0165] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой пустулезный псориаз. Симптомы пустулезного псориаза включают, но не ограничиваются ими, заполненные гноем пузырьки, которые различаются по размеру и месторасположению, но главным образом встречаются на руках и ногах.

[0166] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой эритродермический псориаз. Симптомы эритродермического псориаза включают, но не ограничиваются ими, периодическое обширное пылающее покраснение кожи и, скорее, слущивание чешуек пластами, а не мелкими хлопьями. Покраснение и слущивание кожи часто сопровождаются сильным зудом и болью, увеличением частоты сердечных сокращений и колеблющейся температурой тела.

[0167] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой ревматоидный артрит. Симптомы ревматоидного артрита включают в себя, но не ограничиваются ими, усталость, потерю аппетита, небольшой жар, опухшие железы, слабость, боль в суставах запястий, локтей, плеч, бедер, колен, лодыжек, пальцев ног, челюсти, руках, пальцах и/или шее, утренняя скованность, боль в груди при дыхании (плеврит), жжение, зуд и выделения из глаз, узелки под кожей, онемение, покалывание или жжение в руках и ногах.

[0168] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой болезнь Крона. Симптомы болезни Крона включают в себя, но не ограничиваются ими, спастическую боль в животе (область живота), лихорадку, усталость, потерю аппетита, боль при дефекации (тенезмы), постоянный водянистый понос, необъяснимое снижение массы тела, запор, воспаление глаз, свищи (обычно вокруг ректальной области, может вызвать дренаж гноя, слизи или стула), боли в суставах, воспаление печени, язвы во рту, ректальное кровотечение и кровавый стул, узелки или раны (язвы) на коже и опухшие десны.

[0169] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой анкилозирующий спондилоартрит. Симптомы анкилозирующего спондилоартрита включают, но не ограничиваются ими, частые боли и жесткость в нижней части спины и ягодицах, позвоночнике и/или шее; а также боль и чувствительность, распространяющиеся на ребра, лопатки, боковые поверхности таза и бедра, бедра и пятки; воспаление глаза (иридоциклит и увеит), вызывающее покраснение, боль в глазах, потерю зрения, "мушки" перед глазами и светобоязнь; усталость; и тошноту.

[0170] В другом варианте реализации изобретения, заболевание или расстройство, которое лечили в соответствии с описанными в данном документе способами, представляет собой сахарный диабет. Симптомы сахарного диабета включают, но не ограничиваются ими, потерю веса, полиурию (частое мочеиспускание), полидипсию (повышенную жажду), многофагию (повышенный голод), сердечно-сосудистые заболевания, диабетическую ретинопатию, диабетическую невропатию, гиперосмолярное некетотическое состояние и диабетический кетоацидоз.

[0171] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело или композицию по данному изобретению можно вводить индивидууму до, одновременно с и/или после трансплантации. Например, как описано более подробно ниже, четырехвалентное антитело или композиция по данному изобретению может быть введена для увеличения вероятности благоприятного результата лечения, снижения вероятности неблагоприятного результата и/или облегчение или предотвращения симптомов, или неблагоприятных результатов, возникающих до, одновременно с или после завершения трансплантации.

[0172] Как применимо в данном документе, лечение индивидуума, нуждающегося в трансплантации, может относиться к одному или более терапевтическому воздействию и профилактическим или превентивным мерам (например, увеличивающим вероятность благоприятного результата лечения, такого как выживаемость трансплантата, функция трансплантата, или снижение вероятности неблагоприятного результата, например неблагоприятного ответа на лечение, или патологического состояния, которое снижает вероятность того, что благоприятное лечение, такое как трансплантация, произойдет). Лечение может включать, без ограничения, облегчение или предотвращение патологических состояний и симптомов, связанных с расстройством или патологическим состоянием, и/или проблем или патологических состояний, которые препятствуют или ограничивают доступ индивидуума к вариантам лечения расстройства или патологического состояния, таких как сенсибилизация, повышенная чувствительность, высокий уровень панельных реактивных антител (PRA - panel reactive antibodies) и/или наличие уже существующих аллогенных антител, что ограничивает доступность трансплантатов человеку, ожидающему трансплантации. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет расстройство или патологическое состояние, а также тех, у кого расстройство или патологическое состояние должны быть предотвращены. Лечение расстройства или патологического состояния может подавлять иммуноопосредованные осложнения, связанные с расстройством или патологическим состоянием, устранять симптомы расстройства или патологического состояния, уменьшать степень тяжести расстройства или патологического состояния, изменять динамику развития расстройства или патологического состояния и/или устранить или излечить основное расстройство или патологическое состояние.

[0173] Например, успешное лечение индивидуума, ожидающего трансплантации, включает, но не ограничивается этим, снижение уровня аллогенных антител, снижение панельных реактивных антител (PRA), что позволяет индивидууму иметь больше совместимых доноров, увеличивая вероятность или возможность индивидуума получить трансплантат, сократить период ожидания индивидуумом трансплантата, снизить чувствительность индивидуума, снизить риск возникновения связанных с трансплантацией симптомов или патологических состояний (таких как иммуноопосредованные осложнения, как описано ниже) или любую их комбинацию.

[0174] Например, успешное лечение индивидуума, которому предоставляется трансплантация, включает, но не ограничивается этим, защиту и поддержание трансплантированного органа или ткани в течение длительного времени, которое включает в себя контроль, реверсию, облегчение, задержку или предотвращение одного или более симптомов или нежелательных патологических состояний, связанных с трансплантацией органов, таких как иммуноопосредованные осложнения, включая, но не ограничиваясь ими, продуцирование донор-специфических аллогенных антител (DSA - donor-specific alloantibodies), РТПХ, антитело-опосредованное отторжение (АОО), сверхострое отторжение трансплантата, хроническое отторжение трансплантата, недостаточность трансплантата и отторжение трансплантата, измеряемые по функциональным или гистологическим признакам симптома или патологического состояния. Лечение, способное контролировать расстройство или патологическое состояние (например, отторжение трансплантата), может включать лечение, замедляющее развитие патологического процесса, когда оно начинается после того, как наблюдаются функциональные или гистологические признаки расстройства или патологического состояния (например, отторжения трансплантата). Дополнительно, лечение, способное обратить вспять заболевание или патологическое состояние (например, отторжение трансплантата), может включать лечение, которое, когда начинается после того, как наблюдаются функциональные или гистологические признаки заболевания или патологического состояния (например, отторжения трансплантата), обращает вспять патологический процесс и восстанавливает функциональные и гистологические показатели ближе к норме. Лечение, способное "задерживать развитие" расстройства или патологического состояния (например, отторжение трансплантата), может включать отложение, затруднение, замедление, отставание, стабилизацию и/или отсрочку развития расстройства или патологического состояния (например, отторжения трансплантата). Эта задержка может быть разной продолжительности, в зависимости от истории болезни и/или индивидуума, который получает лечение. Как очевидно специалисту в данной области техники, достаточная или значительная задержка может, по сути, заключать в себе профилактику в том смысле, что у индивидуума, например, индивидуума, подверженного риску развития расстройства или патологического состояния, не развивается расстройство или патологическое состояние.

[0175] В некоторых вариантах реализации изобретения трансплантация по данному изобретению может представлять собой трансплантацию одной или более ткани, или органов, включая, но не ограничиваясь ими, костный мозг, почку, сердце, печень, нервную ткань, легкое, поджелудочную железу, кожу и кишечника (например, тонкий и/или толстый кишечник, а также любые его подткани).

[0176] В дополнение к этому, четырехвалентные антитела являются пригодными для профилактики и/или лечения определенных расстройств и заболеваний, связанных с или вызванных (полностью или частично) повышением пролиферации и/или количества активированных Т-клеток по отношению к пролиферации и/или количеству активированных Т-клеток у здоровых индивидуумов или индивидуумов, не имеющих конкретного расстройства или заболевания. Неограничивающие примеры расстройств и заболеваний, которые могут быть предотвращены и/или вылечены применением четырехвалентных антител, описанных в данном документе, включают реакцию "трансплантата против хозяина" и случаи отторжения при трансплантации (включая отторжение при трансплантации с применением аллогенных или ксеногенных тканей), такие как трансплантация костного мозга, трансплантация печени, трансплантация почек или трансплантация любого органа или ткани.

[0177] В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело или композицию по данному изобретению можно вводить индивидууму до, одновременно с и/или после переливания. Например, как описано более подробно ниже, четырехвалентное антитело или композиция по данному изобретению может быть введена для увеличения вероятности благоприятного результата лечения, снижения вероятности неблагоприятного результата и/или облегчение или предотвращения симптомов, возникающих до, одновременно с или после завершения переливания.

[0178] Как применимо в данном документе, лечение индивидуума, нуждающегося в переливании, может относиться к одному или более терапевтическому воздействию и профилактическим или превентивным мерам (например, увеличивающим вероятность благоприятного результата лечения, такого, как замена или добавление компонентов/клеток крови, или снижение вероятности неблагоприятного результата, такого, как неблагоприятный ответ на лечение, неэффективность лечения или иммунологическая реакция, или патологическое состояние, которое снижает вероятность того, что благоприятное лечения, такое как переливание, произойдет). Лечение может включать, без ограничения, облегчение или предотвращение патологических состояний и симптомов, связанных с расстройством или патологическим состоянием, и/или проблем или патологических состояний, которые мешают или ограничивают доступ индивидуума к вариантам лечения расстройства или патологического состояния. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет расстройство или патологическое состояние, а также тех, у кого расстройство или патологическое состояние должны быть предотвращены. Лечение расстройства или патологического состояния может подавлять иммуноопосредованные осложнения, связанные с расстройством или патологическим состоянием, устранять симптомы расстройства или патологического состояния, уменьшать степень тяжести расстройства или патологического состояния, изменять динамику развития расстройства или патологического состояния и/или устранить или излечить основное расстройство или патологическое состояние.

[0179] В некоторых вариантах реализации изобретения переливание представляет собой переливание, включающее одну или более белых клеток крови, красных клеток крови и тромбоцитов. В некоторых вариантах реализации изобретения переливание включает цельную кровь или один или более препаратов крови, включая, без ограничения, белые клетки крови, красные клетки крови, тромбоциты, свежезамороженную плазму, криопреципитат или факторы свертывания крови, антитела и/или кровезаменители. Типовые патологические состояния, которые могут поддаваться лечению с переливанием (например, переливанием крови или препарата крови), включают, без ограничения, кровоизлияния или кровопотери, пониженный гематокрит или гемоглобин (например, анемия), серповидно-клеточную болезнь, талассемию, добавление крови во время или после хирургических процедур, заболевание сердца, травматическое повреждение, дефицит одного или более факторов крови (например, гемофилию, болезнь фон Виллебранда, гипофибриногенемию или дефицит фактора II, V, VII, IX, X или XI), патологические состояния, требующие добавления фибриногена (например, заболевание печени, переливание крови и тому подобное), недостаточность костного мозга, нарушения функции тромбоцитов, тромбоцитопению, иммунодефицит (например, в результате терапии или болезни) и тому подобное. Описания практических подходов, дозировки, ответов, показаний к применению и приготовлений, связанных с переливаниями, можно найти, например, в Сборнике руководств Американского Красного Креста по практике переливания крови.

[0180] Введение четырехвалентного антитела или полипептида в соответствии с описанными в данном документе способами может быть непрерывным или прерывистым, в зависимости от, например, физиологического состояния реципиента, является ли цель введения терапевтической или профилактической, и других факторов, известных квалифицированным практикам. Введение антитела или полипептида, по сути, может быть непрерывным в течение предварительно выбранного периода времени или может быть разделено на серии доз.

[0181] Дозировка и частота введения четырехвалентного антитела, описанного в данном документе, или его фармацевтической композиции вводятся в соответствии со способами для профилактики и/или лечения при минимизации побочных эффектов. Точная дозировка четырехвалентного антитела, описанного в данном документе для введения конкретному субъекту, или его фармацевтической композиции, может быть определена практикующим врачом в свете факторов, связанных с субъектом, который требует лечения. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают степень тяжести заболевания, общее состояние здоровья субъекта, возраст и вес субъекта, диету, время и частоту введения, сочетание(я) с другими терапевтическими агентами или лекарственными средствами, чувствительность к реакции, и толерантность/ответ на терапию. Дозировка и частота введения четырехвалентного антитела, описанного в данном документе, или его фармацевтической композиции могут быть скорректированы с течением времени, чтобы обеспечить достаточные уровни антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полученного из антитела, или для поддержания желаемого эффекта.

[0182] Точная доза, которая будет использоваться в лекарственной форме, также будет зависеть от способа введения и серьезности воспалительного заболевания или расстройства, и должна определяться в соответствии с суждением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента.

[0183] Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-эффект, полученных из систем испытаний in vitro или на животных моделях.

[0184] В одном варианте осуществления любая из описанных в данном документе композиций формулируется для введения внутрибрюшинными, внутривенными, подкожными или внутримышечными инъекциями, или другими формами введения, такими как оральное, через слизистую, посредством ингаляции, подъязычный, и тому подобное. В одном варианте реализации изобретения парентеральное введение, характеризующееся инъекцией либо подкожно, либо внутримышечно, либо внутривенно, также рассматривается в данном документе. Инъекционные лекарственные средства могут быть приготовлены в обычных формах либо в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, пригодных для создания раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Инъекционные лекарственные средства, растворы и эмульсии также содержат один или более вспомогательных веществ. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин или этанол. Кроме того, при необходимости, фармацевтические композиции, которые нужно вводить, могут также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные агенты, стабилизаторы, усилители растворимости и другие подобные агенты. Другие способы введения могут включать: введение в кишечник, внутримозговое введение, назальное введение, внутриартериальное введение, внутрисердечное введение, внутрикостную инфузию, интратекальное введение, внутривенную инфузию, подкожную имплантацию или инъекцию, внутримышечное введение, ректальный способ введения, внутривагинальное введение, внутрижелудочное введение, внутритрахеальное введение, внутрилегочное введение и внутрибрюшинное введение. Приготовления для парентерального введения включают стерильные растворы, готовые для инъекции, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые к смешиванию с растворителем непосредственно перед применением, включая стерильные суспензии, готовые для инъекции, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые к объединению с носителем непосредственно перед применением, и стерильные эмульсии. Растворы могут быть либо водными, либо неводными. При внутривенном введении подходящие носители включают физиологический раствор или фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), воду и растворы, содержащие загустители и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, и их смеси.

[0185] В другом варианте реализации изобретения данное изобретение также предусматривает введение композиции, содержащей антитела или полипептиды по данному изобретению, конъюгированные с другими молекулами, такими как детектируемые метки, или терапевтические или цитотоксические агенты. Агенты могут включать, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, токсины, токсоиды, воспалительные агенты, ферменты, антисмысловые молекулы, пептиды, цитокины и химиотерапевтические агенты. Способы конъюгирования антител с такими молекулами обычно известны специалистам в данной области техники. См., например, Публикации PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США № 5,314,995; и EP 396,387.

[0186] В одном варианте реализации изобретения композиция содержит антитело или полипептид, конъюгированный с цитотоксическим агентом. Цитотоксические агенты могут включать любые агенты, которые вредны для клеток. Типовый класс цитотоксических агентов, которые могут быть конъюгированы с антителами или фрагментами, может включать, но не ограничивается ими, паклитаксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и их аналоги или гомологи.

V. Фармацевтические композиции

[0187] Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим четырехвалентные антитела или полипептиды, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнители. Фармацевтические композиции могут найти применение, например, в способах, применениях и/или наборах по данному изобретению.

[0188] Фармацевтически приемлемые носители или наполнители известны в данной области техники и являются относительно инертными веществами, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, наполнитель может придавать форму или консистенцию, или действовать как разбавитель. Подходящие наполнители включают, но не ограничиваются ими, стабилизирующие агенты, смачивающие и эмульгирующие агенты, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проникновения через кожу. В некоторых вариантах реализации изобретения четырехвалентное антитело, описанное в данном документе, находится в жидкой фармацевтической композиции. Жидкие фармацевтически приемлемые композиции могут быть получены, например, путем растворения, диспергирования или иного смешивания антитела, описанного в данном документе, в носителе, таком как, например, вода, физиологический раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, гликоли, этанол и тому подобное, с целью образования раствора или суспензии. При желании, фармацевтическая композиция, подлежащая введению, может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты, эмульгирующие агенты, солюбилизирующие агенты и рН-буферные агенты и тому подобное. Наполнители, а также составы для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственного средства изложены в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20-е Изд. Mack Publishing (2000 год).

[0189] Фармацевтические композиции предназначены для введения людям и животным в виде единичных дозированных форм, таких как стерильные парентеральные растворы или суспензии, содержащие подходящие количества четырехвалентного антитела, описанного в данном документе. Четырехвалентное антитело, в одном варианте реализации изобретения, составлено и введено в виде единичных дозированных форм или в виде многодозовых форм. Единичные дозированные формы, применяемые в данном документе, относятся к физически дискретным единицам, подходящим для людей и животных, и упакованных по отдельности, как известно в данной области техники. Каждая единичная доза содержит предопределенное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полученного из антитела, достаточное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем, наполнителем или разбавителем. Примеры единичных дозированных форм включают ампулы и шприцы. Единичные дозированные формы можно вводить в виде фракций или в виде множества фракций. Многократная дозированная форма представляет собой множество идентичных единичных дозированных форм, упакованных в один контейнер, который должен вводиться в виде отдельных единичных дозированных форм. Примеры многократных дозированных форм включают флаконы или бутылки объемом 0,47 л или 3,785 л. Следовательно, многократная дозированная форма представляет собой множество единичных дозированных форм, которые не разделены в упаковке.

[0190] Концентрация четырехвалентного антитела в фармацевтической композиции будет зависеть от, например, физико-химических характеристик антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полученного из антитела, схемы применения и вводимого количества, а также других факторов, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции обеспечивают дозу от около 0,001 мг до около 100 мг четырехвалентного антитела на килограмм массы тела в день. Фармацевтические единичные дозированные формы могут быть приготовлены для обеспечения от около 0,001 мг до около 100 мг и/или комбинации других необязательных основных ингредиентов на единицу дозированной формы.

[0191] В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение обеспечивает четырехвалентные антитела и композиции (такие как описанные в данном документе фармацевтические композиции) для применения в любом из способов, описанных в данном документе, независимо от того, применяются ли они в качестве лекарственного средства и/или применяются для изготовления лекарственного средства.

VI. Наборы

[0192] Некоторые аспекты данного изобретения относятся к наборам или изделиям, которые содержат четырехвалентное антитело по данному изобретению. Необязательно, описанные в данном документе наборы могут содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей, таких как типовые носители, описанные в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения набор по данному изобретению включает фармацевтическую композицию по данному изобретению. Наборы, описанные в данном документе, могут найти применение, например, в способах или применениях по данному изобретению.

[0193] Наборы могут необязательно предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретирующую информацию. Как правило, набор содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш(и) внутри или соединенные с контейнером. Контейнеры могут представлять собой одноразовые дозы, многоразовые дозы (например, мультидозовые упаковки) или субъединичные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах по данному изобретению, обычно представляют собой инструкции на этикетке или листок-вкладыш (например, лист бумаги, включенный в набор), но также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, которые хранятся на магнитном или оптическом диске).

[0194] В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно включают листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению четырехвалентного антитела с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно включают листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению четырехвалентного антитела до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации.

[0195] Наборы по данному изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается ими, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и тому подобное. Также рассматриваются упаковки для применения в сочетании с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, аэрозольный ингалятор) или инфузионное устройство, такое как мини-насос. Набор может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может быть пакетом раствора для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер может также иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может быть пакетом раствора для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой четырехвалентное антитело или полипептид, описанный в данном документе. Контейнер может дополнительно содержать второй фармацевтически активный агент. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно включать любой другой материал или устройство, пригодные для лечения (например, переливания или трансплантации), включая, без ограничения, один или более контейнеров, систем для внутривенных инфузий, стерилизующих средств или оборудования, катетеров, шприцев и тому подобного.

ПРИМЕРЫ

[0196] Изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Однако они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Понятно, что примеры и варианты реализации изобретения, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и различные модификации или изменения в свете этого будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу применения данной заявки и объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Производство и характеристика четырехвалентных антител к PSGL-1

[0197] Гликопротеиновый лиганд 1 P-селектина (PSGL-1) экспрессируется в самых разных гемопоэтических клетках, включая популяции миелоидных, лимфоидных, дендритных и CD34+ стволовых клеток (см., например, Spertini и соавт. 1996 год, J Cell Biol. 135(2):523-31). Ранее были идентифицированы некоторые мышиные антитела, специфичные к PSGL-1 и способные индуцировать апоптоз в Т-клетках. Среди этих мышиных антител антитело (h15A7), которое не мешало взаимодействию между P-селектином и PSGL-1, что необходимо для эффективной локализации Т-клеток и нейтрофилов для нацеливания на воспалительные ткани, было выбрано для клинических исследований и изменено на гуманизированную легкую цепь каппа, содержащую моноклональное антитело IgG4, чтобы минимизировать АЗКЦ и КЗЦ на клетках, экспрессирующих PSGL-1 (см., например, в патенте США № 7,604,800). Впоследствии h15A7 был дополнительно сконструирован для получения h15A7H, который имеет мутацию SER228PRO в шарнирной области h15A7 (международная патентная заявка № WO 2012/174001). Эта мутация была введена для того, чтобы уменьшить перетасовку антител, межмолекулярный обмен между антителами IgG4 in vivo. Исследования in vitro показали, что h15A7/h15A7H преимущественно индуцирует апоптоз активированных Т-клеток на поздней стадии, но не других клеток, экспрессирующих PSGL-1. Не желая привязываться к теории, считается, что механизм действия h15A7H, по-видимому, зависит, по меньшей мере частично, от перекрестного связывания молекул PSGL-1 человека, которое опосредуется крос-линкером антитела in vitro и, возможно, клетками, экспрессирующими FcR in vivo.

[0198] Пример, представленный далее, описывает разработку нескольких четырехвалентных антител, полученных из h15A7H, не зависящих от кросc-линкера/FcR-экспрессирующих клеток (Фиг. 1A & 1B). Не желая привязываться к теории, четырехвалентные антитела могут обладать преимуществами по сравнению с h15A7H для клинических исследований, например, лечения опосредованных T-клетками воспалительных заболеваний. Данные результаты показывают, что четырехвалентные антитела h15A7H демонстрируют повышенную эффективность по сравнению с исходным антителом h15A7H как in vitro, так и trans vivo.

Методы

Клетки и реактивы

[0199] Sp2/0-Ag14 (ATCC^®CRL-1581^TM) и Sp2/0-hPSGL-1 культивировали в 90% DMEM (GIBCO^®, Cat. №11965-092 ^TM) с добавлением 10% ФБС (GIBCO^®, Cat. № 26140-079), 100 Ед/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (GIBCO^®, Cat. №15140) и 1 мM пирувата натрия (GIBCO^®, Cat. №11360).

[0200] Антитело h15A7H было описано в международной патентной заявке № WO 2012/174001. Четырехвалентные антитела h15A7H, используемые в исследовании, были получены из стабильной клеточной линии CHO Flp-In, очищены с помощью аффинной хроматографии на основе связывания с белком A и поддерживались в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (GIBCO^® Cat. №21600-069)/0,02% Твин-20 (JT Baker^® X251-07). Человеческий IgG4p/κ в качестве нерелевантного антитела для изотипического контроля был получен из клеток Flp-In CHO. 12H5. 5 представляет собой антиидиотипическое антитело IgG1 мыши к h15A7/h15A7H.

Животные

[0201] Самки мышей B6 в возрасте 6-8 недель были получены от BioLASCO Taiwan Co., Ltd, Тайбэй, Тайвань. Все мыши поддерживались в свободных от специфической патогенной микрофлоры условиях. Все исследования на животных проводились в соответствии с положениями Институционального комитета по содержанию и использованию лабораторных животных.

Конструирование вариантов четырехвалентного антитела к PSGL-1

scDb₂-Fc

[0202] scDb₂-Fc (Фиг. 1A, слева) включало 2 домена одноцепочечных диател (scDb), слитых параллельно с N-концами Fc IgG4 человека с мутацией в шарнирной области для минимизации обмена полуантител in vivo. Каждый домен scDb содержал не только доменную последовательность VL-VH- VL- VH, но также линкер (G₄S₁)₅ (SEQ ID NO:33) между VH и VL и два идентичных линкера (например, SEQ ID NO:34) между VL и VH. Несколько scDb-Fc с указанными линкерами различной длины были созданы для оптимизации

taFv₂-Fc

[0203] taFv₂-Fc (Фиг. 1A, посередине) включало в себя 2 тандемных одноцепочечных блока вариабельного фрагмента (scFv) (называемый taFv для тандемного scFv), слитых параллельно N-концами Fc IgG4 человека с мутацией в шарнирной области для минимизации обмена полуантител in vivo. Для построения taFv использовались три различных типа scFv, включая версии v2 (VH-VL), v3 (VL-VH) и v4 (VL-VH), содержащие линкер (G₄S₁)₅ (SEQ ID NO:33) между VH и VL. Среди них v2 и v4 были структурно ограниченными путем образования дисульфидной связи VH44-VL100. Дисульфидная связь VH44-VL100 была введена в scFv в ориентациях VL-VH и VH-VL для повышения конформационной стабильности (см. SEQ ID NO:29 и 30). Каждый taFv имел либо последовательные v2-v3, либо последовательные v4-v2 scFv к PSGL-1 с линкером ASTGS (SEQ ID NO:27) между двумя scFv.

scFv-IgG

[0204] Для создания 3-х вариантов scFv-IgG4p применяли ограниченную посредством дисульфидной связи версию v2 scFv к PSGL-1 (Фиг. 1A, справа), включая scFv₄-crIgG4p, scFv₂-LC-IgG4p и LC-scFv₂-IgG4p. scFv₄-crIgG4p имело 4 блока scFv, слитых параллельно с N-концами как константных областей легкой цепи каппа, так и тяжелой цепи IgG4p (crIgG) без линкера. scFv₂-LC-IgG4p имело 2 блока scFv, слитых параллельно с N-концами константных областей легких цепей каппа IgG h15A7H с линкером ASTGSG₄S (SEQ ID NO:28) между ними, тогда как LC-scFv₂-IgG4p имело 2 блока scFv, слитых параллельно с С-концами константных областей легких цепей каппа IgG h15A7H с линкером (G₄S)₂ (SEQ ID NO:34) между ними. Легкие цепи форматов LC-scFv₂ IgG4p и scFv₂-LC IgG4p были отдельно субклонированы в вектор pcDNA5/FRT, который кодировал интактную последовательность тяжелой цепи h15A7H для экспрессии антител. На Фиг. 1B изображена другая диаграмма данных форматов четырехвалентного антитела с затененными вариабельными фрагментами.

[0205] кДНК всех четырехвалентных антител клонировали в вектор pcDNA5/FRT (Invitrogen^™, Cat. №V6010-20) для экспрессии четырехвалентных антител.

Получение стабильных клеточных линий, экспрессирующих варианты четырехвалентного антитела к PSGL-1

[0206] Варианты четырехвалентного антитела к PSGL1 стабильно экспрессировались и продуцировались в клетках CHO Flp-In (Invitrogen^™, Cat. №R708-07). Последовательности кДНК вариантов четырехвалентного антитела были вставлены в вектор pcDNA5/FRT (Invitrogen^™, Cat. №V6010-20) совместно трансфицировали с pOG44 (Invitrogen^™, Cat. № V6005-20) в соответствии со стандартной процедурой, предоставленной поставщиком. Культуральные супернатанты сформированных клеточных линий собирали и очищали с помощью шариков протеин-A-сефарозы (GE Healthcare^™, Cat. №17-5280-04). Для определения качества антител, очищенные белки анализировали как с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза, так и с помощью эксклюзионной хроматографии.

ДСН-ПААГ-электрофорез в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия)

[0207] Очищенные четырехвалентные антитела к PSGL-1 подвергали электрофорезу в 10% восстанавливающих и невосстанавливающих ДСН полиакриламидных гелях. Для восстанавливающих ДСН полиакриламидных гелей 2 мкг антитела смешивали с 5Х ДСН буфером для образцов (300 нМ Трис, pH 6,8, 10% ДСН, 50% глицерина, 5% 2- меркаптоэтанола и 0,06% бромфенолового синего) и кипятили в течение 10 мин при 100°C перед загрузкой. Для невосстанавливающих ДСН полиакриламидных гелей 2 мкг антител смешивали с 5X невосстанавливающим буфером для образцов (300 нМ Трис, pH 6,8, 10% ДСН, 50% глицерина и 0,06% бромфенолового синего) и кипятили в течение 10 мин при 100°C перед загрузкой. Восстановленные и невосстановленные образцы белка загружали в те же ДСН-полиакриламидные гели, где проводили электрофорез. Окрашивание Кумасси синим использовалось для обнаружения белков на геле после электрофореза.

Анализ связывания вариантов четырехвалентного антитела к PSGL-1

[0208] Клетки Sp2/0, трансфицированные человеческим PSGL-1 (Sp2/0-hPSGL1), использовали в качестве линии клеток, экспрессирующих PSGL-1. Клетки Sp2/0-hPSGL1 центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин. Клеточную массу ресуспендировали в FACS-буфере (ФСБ, содержащий 1% ФБС) и пипетировали в 96-луночный планшет (1×10⁵ клетки/ лунка). В каждую лунку добавляли 100 мкл супернатантов, содержащих гуманизированные 15A7H(h15A7H)/четырехвалентные антитела, и их инкубировали в течение 60 мин при 4 °C. Клетки промывали три раза холодным FACS-буфером и затем инкубировали с 100 мкл мышиного антитела к IgG человека₄ pFc'-PE (SouthernBiotech Cat. №. 9190-09) при концентрации 1 мкг/мл в течение 60 мин при 4°C. Затем клетки трижды промывали холодным FACS-буфером и анализировали с помощью анализа FACS. Все проточные цитометрические анализы проводили на проточном цитометре BD-LSR (Becton Dickinson) с применением программного обеспечения Cell Quest.

Анализ апоптоза вариантов четырехвалентного антитела к PSGL-1

[0209] 1×10⁵ клеток Sp2/0-hPSGL1 высевали в лунки 96-луночных планшетов. Аликвоты очищенных четырехвалентных и контрольных антител к PSGL-1 в концентрациях титрования были свежеприготовленными и добавлялись в каждую лунку. Для анализа клеточного апоптоза обработанные клетки выдерживали при 37 °C в течение 6 ч перед анализом FACS.

[0210] Для анализа клеточного апоптоза применялся набор для детекции апоптоза Annexin-V-FITC (Strong Biotech, Cat. №AVK250) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, обработанные клетки собирали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для связывания с Annexin V, содержащем 0,5 мкл Annexin V-FITC, при комнатной температуре. После 15-минутной инкубации в темноте клетки дважды промывали 200 мкл буфера для связывания с Annexin V. Перед анализом FACS добавляли по 1 мкл пропидиум иодида (PI) на образец. Все проточные цитометрические анализы проводили на проточном цитометре BD-LSR (Бектон Дикинсон) с использованием программного обеспечения Cell Quest. Annexin V позитивные и/или PI-позитивные клетки считаются апоптотическими клетками.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК, РВМС - peripheral blood mononuclear cells)

[0211] 500 мл цельной крови собирали у здоровых доноров, которые ранее тестировались как пациенты с удовлетворительным ответом на столбняк. Кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 6 мин. Верхний слой плазмы выкидывали, а остальную кровь разбавляли эквивалентным объемом ФСБ. Разведенную цельную кровь осторожно добавляли через слой фиколла (GE, Ficoll Plaque Plus, Cat #17-1440-02) и центрифугировали при 2400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре. Лейкоцитарную пленку, содержащую мононуклеарные клетки, собирали и три раза промывали ФСБ, чтобы минимизировать загрязнение тромбоцитами. Клетки ресуспендировали в ФСБ и оставляли на льду перед применением.

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) trans-vivo

[0212] 8-10×10⁶ клетки МКПК, вместе с 0,25LF единиц диализованного в ФСБ столбнячного анатоксина (АС, Kuo Kwang, Cat № K4103-11) или ФСБ, вводили в конечном объеме 50 мкл в заднюю лапку самки мышей B6. Во всех экспериментах применяли мышей в возрасте от 6 до 8 недель. Толщина ноги была измерена до и через 24 часа после инъекции с применением индикаторного толщиномера. Значение, полученное до инъекции, вычиталось из значения, полученного после инъекции, чтобы получить фактическую толщину лапы. Все значения измерений были зарегистрированы в миллиметрах (мм). h15A7H и четырехвалентные антитела h15A7H, титрованные в ФСБ, внутривенно вводили в указанных дозах мышам B6 за один час до введения МКПК и АС. ФСБ применяли в качестве контрольного носителя. Испытывали 2 или 4 лапы (1 или 2 мыши) на лечение. Образцы плазмы собирали через 24 часа после введения Ат для проверки концентрации вариантов антитела. Процент ингибирования толщины лапы рассчитывали следующим образом:100 X (Δ толщина лапы_{носитель} - Δ толщина лапы_Ат)/(Δ толщина лапы_{носитель} - Δ толщина лапы_{только МКПК}).

ИФА для определения концентрации антител в плазме мыши

[0213] 96-луночные микротитровальные планшеты были покрыты антиидиотипическим антителом 12H5. 5 при 0,5мкг/мл в буфере для покрытия ИФА (30 мМ Na₂CO₃/100 мМ NaHCO₃) при 4°C в течение ночи. Затем планшеты блокировали 200 мкл/лунка 0,5% БСА в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали 3 раза промывочным буфером ИФА (0,05% Твин-20 в ФСБ), с последующим добавлением 50 мкл/лунка калибровочного стандарта или образцов. Калибровочные стандарты при серийном разбавлении были сперва получены в плазме нормальной мыши. Калибровочный стандарт или образцы предварительно разбавляли 1000X в растворе для разведения (0,1% БСА и 0,05% Твин-20 в ФСБ), чтобы получить конечную концентрацию 0,1% мышиной плазмы в растворах для разведения до дозирования в планшеты. Последующие разведения, в случае необходимости, были приготовлены с использованием растворов для разведения, содержащих 0,1% плазмы нормальной мыши. После 1 ч инкубации при комнатной температуре и 5 раз промывки с помощью промывочного буфера ИФА, вторичное антитело мыши к IgG₄ человека₄ pFc'-HRP (SouthernBiotech Cat. №9190-05; разбавление 1:15000) добавляли при 50 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты затем промывали 5 раз промывочным буфером ИФА с последующим добавлением субстрата ТМБ для проявления цвета. Реакции останавливали с помощью 0,5 н H₂SO_4, и измеряли значение оптической плотности при 450 нм в микротитрационном планшет-ридер (Molecular Device VERSAmax).

Результаты

ДСН-ПААГ-электрофорез гуманизированных 15A7H четырехвалентных антител в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях

[0214] Как изображено на Фиг. 2A-2C, ДСН-ПААГ-электрофорез с последующим окрашиванием Кумасси синим применяли для проверки молекулярного веса и базовой структуры четырехвалентных антител к PSGL-1 в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. V2-V3, V4-V2 и LH10-g4pFc h15A7H в невосстанавливающих условиях дали основную полосу белка с молекулярной массой около 150 кДа (Фиг. 2A). В тех же условиях scFv₂-LC IgG4p, LC-scFv₂ IgG4p и scFv₄-crIgG4p h15A7H дали основную полосу белка с молекулярной массой около 200 кДа (Фиг. 2B).

[0215] В восстанавливающих условиях V2-V3, V4-V2 и LH10 g4pFc h15A7H показали одну полосу с ожидаемой молекулярной массой около 75 кДа, тогда как и scFv₂-LC, и LC-scFv₂ h15A7H показали две основные полосы с одинаковой молекулярной массой около 50 кДа (Фиг. 2C). Одной из полос являлся слитый белок scFv-LC или LC-scFv, а другой - тяжелая цепь h15A7H дикого типа. scFv₄-crIgG4p также показал две основные полосы, одна представляла собой слитый белок scFv-CH1-шарнир-CH2-CH3 (около 62,5 кДа), а другая - scFv-каппа-слитый белок (около 37,5 кДа) (Фиг. 2C). В качестве контроля, h15A7H давал единую полосу с ожидаемой молекулярной массой 150 кДа в невосстанавливающих гелях (Фиг. 2A и 2B) и две основные полосы (тяжелая цепь:50 кДа, легкая цепь:25 кДа) в восстанавливающих условиях (Фиг. 2C).

Связывание гуманизированных вариантов четырехвалентного антитела 15A7H с SP2/O-hPSGL-1 и SP2/O

[0216] Связывающую способность четырехвалентных антител h15A7H оценивали в клетках PSGL-1 SP2/O человека. Четырехвалентное антитело h15A7H положительно связывалось с SP2/O-hPSGL-1, но не с исходной SP2/O клеткой, лишенной антигена hPSGL-1 (ниже в таблице А). Дополнительно, h15A7H дикого типа и все четырехвалентные антитела h15A7H дали аналогичную активность связывания на SP2/O-hPSGL-1 (таблица A). Эти результаты показали, что четырехвалентные антитела h15A7H сохраняют связывающую реакционную способность к молекуле hPSGL-1.

Таблица А. Активность связывания (измеренная по средней интенсивности флуоресценции) гуманизированных четырехвалентных антител 15A7H к SP2/O-hPSGL-1 и SP2/O.

	SP2/O-hPSGL-1	SP2/O
(мкг/мл)	3	1	0,3	0,1	3	1	0,3	0,1
h15A7H	4667	6400	5943	3410	17	26	8	8
LH10-g4pFc h15A7H	4627	6677	5410	2902	19	18	31	30
V2-V3-g4pFc h15A7H	4535	6260	5731	3156	33	22	26	17
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	4382	5744	7060	5543	24	12	11	24
V4-V2-g4pFc h15A7H	4923	6779	6454	3953	23	20	21	14
scFv4-crIgG4p h15A7H	5938	6013	4637	2640	30	28	18	8
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	6026	5822	3477	3042	24	23	25	3
hIgG4p (контроль)	28	НВ	НВ	НВ	33	НВ	НВ	НВ

НВ: Не выполнено

Апоптоз клеток SP2/O-hPSGL-1in vitro, индуцированный гуманизированными четырехвалентными антителами 15A7H

[0217] Индукцию апоптоза оценивали с помощью окрашивания Annexin V и/или PI в клетках SP2/O-hPSGL-1 после инкубации с h15A7H или четырехвалентным антителом. Как показано ниже в таблице B, исходное антитело h15A7H не индуцирует апоптоз в клетках SP2/O-hPSGL-1 при тестируемой концентрации 0,5 и 0,0625 мкг/мл в отсутствие крос-линкера. При тестируемых концентрациях 0,5 мкг/мл все четырехвалентные антитела h15A7H индуцировали апоптоз (в пределах от 18 до 36%). При самой низкой тестируемой концентрации (0,0625 мкг/мл) 3 из 6 четырехвалентных антител h15A7H, LH10-g4pFc, V2-V3-g4pFc и scFv₂-LC-IgG4p, индуцировали апоптоз в 12-16% клеток, тогда как V4-V2-g4pFc, scFv₄-crIgG4p и LC-scFv₂-IgG4p h15A7H не индуцируют гибель клеток SP2/O-hPSGL-1 при такой низкой дозе. Эти данные наглядно демонстрируют, что все четырехвалентные антитела h15A7H обладают способностью индуцировать апоптоз, но некоторые четырехвалентные антитела делают это с большей эффективностью.

Таблица В Апоптоз клеток SP2/O-hPSGL-1in vitro, индуцированный гуманизированными четырехвалентными антителами 15A7H.

% Апоптоза (фон субстрата, n=4)	0,5 мкг/мл	0,0625 мкг/мл
среднее значение	СО	среднее значение	СО
h15A7H	2,75	3,95	1,5	3,32
LH10-g4pFc h15A7H	26,75	11,32	11,75*	5,50
V2-V3-g4pFc h15A7H	26,5	5,69	13,5*	5,45
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	23,75	9,00	15,5*	5,69
V4-V2-g4pFc h15A7H	30	4,55	0,5	3,00
scFv4-crIgG4p h15A7H	35,75	7,63	1,75	2,87
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	18	9,83	0,5	4,20

СО: Стандартное отклонение

* P-значение T-теста <0,05 (по сравнению с обработкой V4-V2-g4pFc, scFv₄-crIgG4p и LC-scFv₂-IgG4p).

Эффективность h15A7H и четырехвалентных антител h15A7H при ингибировании ответа ГЗТ у мышей B6 trans-vivo

[0218] Описанные выше четырехвалентные антитела h15A7H и h15A7H были испытаны на их эффективность при ингибировании ответа ГЗТ у мышей B6 trans vivo. Антитело h15A7H вводили внутривенно мышам в дозах 10 и 1 мг/кг, тогда как четырехвалентные антитела вводили внутривенно мышам в дозах 1 и 0,3 мг/кг. Эксперименты проводили с использованием МКПК от четырех разных доноров, и % ингибирования был рассчитан для оценки ингибирующей эффективности in vivo.

[0219] Как показано ниже в таблице C, антитело h15A7H может ингибировать набухание лапы в среднем на 93% при дозе 10 мг/кг. Эффект ингибирования снижался до 23% при низкой дозе 1 мг/кг. Что касается четырехвалентных антител 15A7H, то такие варианты, как LH10-g4p Fc, V2-V3-g4pFc и scFv₂-LC-IgG4p h15A7H, оставались эффективными в ингибировании даже при дозах 1 или 0,3 мг/кг (с ингибированием 59-76%).

Таблица С. Влияние h15A7H и четырехвалентных антител h15A7H на ГЗТ trans-vivo.

% ингибирования при 10 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Среднее значение	СОС
h15A7H	71	104	82	116	93	10,2
% ингибирования при 1 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Среднее значение	СОС
h15A7H	15	28	18	32	23	4,0
LH10-g4pFc h15A7H	75	51	109	69	76	12,1
V2-V3-g4pFc h15A7H	29	33	100	91	63	18,7
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	53	34	104	93	71	16,3
V4-V2-g4pFc h15A7H	НВ	НВ	11	44	27	16,5
scFv4-crIgG4p h15A7H	14	2	-18	6	1	6,8
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	-17	16	14	29	10	9,8
% ингибирования при 0,3 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Среднее значение	СОС
LH10-g4pFc h15A7H	28	73	109	50	65	17,2
V2-V3-g4pFc h15A7H	24	47	127	80	69	22,3
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	74	24	66	73	59	11,8
V4-V2-g4pFc h15A7H	НВ	НВ	-16	11	-2	13,7
scFv4-crIgG4p h15A7H	2	9	-7	6	3	3,6
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	-4	19	5	15	9	5,2

НВ: не выполнено; СОС: стандартная ошибка среднего

[0220] Уровни h15A7H и четырехвалентных антител h15A7H в плазме также измеряли через 24 часа после в/в введения (таблица D). Все антитела демонстрировали уровни в плазме около 6513-9025 нг/мл при 1 мг/кг, за исключением V4-V2-g4pFc, которое не обнаруживалось после 24 часов циркуляции in vivo. Не желая связывать себя теорией, считается, что эти результаты могут указывать на то, что разница в эффективности среди h15A7H и четырехвалентных вариантов может быть в основном обусловлена различиями в способности индуцировать апоптоз, как показано в таблице B.

Таблица D. Концентрации h15A7H и h15A7H четырехвалентных антител в плазме мышей B6.

Конц. (нг/мл) при 10 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Сред нее значе ние	СОС
h15A7H	103411	100189	104471	110820	104723	2227
Конц. (нг/мл) при 1 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Сред нее значе ние	СОС
h15A7H	9087	8578	8316	10118	9025	398
LH10-g4pFc h15A7H	5698	7333	6335	6686	6513	508
V2-V3-g4pFc h15A7H	6488	8173	6982	6478	7030	576
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	5766	7082	7452	5979	6570	786
V4-V2-g4pFc h15A7H	-	-	НПКО (<100)	НПКО (<100)	-	-
scFv4-crIgG4p h15A7H	6156	6924	5997	6353	6358	292
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	7323	8432	9014	9006	8444	535
Конц. (нг/мл) при 0,3 мг/кг	Эксп. 1	Эксп. 2	Эксп. 3	Эксп. 4	Сред нее значе ние	СОС
LH10-g4pFc h15A7H	1419	1853	1906	1793	1743	160
V2-V3-g4pFc h15A7H	1567	2284	2202	2065	2029	239
scFv2-LC-IgG4p h15A7H	1344	1968	2112	1632	1764	241
V4-V2-g4pFc h15A7H	-	-	НПКО (<100)	НПКО (<100)	-	-
scFv4-crIgG4p h15A7H	1256	1909	1772	1668	1651	205
LC-scFv2-IgG4p h15A7H	1765	2493	2325	2356	2235	225

НПКО: ниже предела количественного определения; СОС: стандартная ошибка среднего

[0221] Таким образом, эти данные показывают, что различные четырехвалентные антитела h15A7H обладают дифференциальными способностями индукции апоптоза in vitro, которые коррелируют с дифференциальными способностями ингибирования ответа ГЗТ на мышиной модели ГЗТ trans vivo. Те четырехвалентные антитела, которые имели более высокую эффективность индукции апоптоза, показали повышенную эффективность по сравнению с h15A7H на модели ГЗТ trans-vivo. Эти результаты указывают на то, что некоторые из этих четырехвалентных вариантов h15A7H могут иметь потенциальные преимущества перед h15A7H для дальнейших клинических исследований.

[0222] Хотя, для ясности понимания, вышеприведенные варианты реализации изобретения были описаны более подробно посредством иллюстрации и примера, описания и примеры не должны толковаться как ограничивающие объем данного изобретения.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Все полипептидные последовательности представлены от N-конца к С-концу, если не указано другое. Все полинуклеотидные последовательности представлены от 5' до 3', если не указано другое. Три CDR в каждой цепи подчеркнуты, а области линкера показаны строчными буквами.

Аминокислотная последовательность LH10-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 1)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsaaaESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность кДНК LH10-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 2)

GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggaggcggaggttccgcggccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Аминокислотная последовательность V2-V3-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 3)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKastgsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsaaaESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность кДНК V2-V3-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 4)

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAgcttcaaccggttcaGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggaggcggaggttccgcggccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Аминокислотная последовательность V4-V2-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 5)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSastgsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKggggsaaaESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность кДНК V4-V2-g4pFc h15A7H (SEQ ID NO: 6)

GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAgcttcaaccggttcaGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggaggcggaggttccgcggccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Аминокислотная последовательность легкой цепи scFv₂-LC-IgG4p h15A7H (SEQ ID NO: 7)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKastgsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Последовательность кДНК легкой цепи scFv₂-LC-IgG4p h15A7H (SEQ ID NO: 8)

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAgcttcaaccggttcaggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

Аминокислотная последовательность легкой цепи LC- scFv₂-IgG4p h15A7H (SEQ ID NO: 9)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKAAAHHHHHHHHHH

Последовательность кДНК легкой цепи LC- scFv₂-IgG4p h15A7H (SEQ ID NO: 10)

GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTggtggaggcggttcaggcggaggtggctctGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGCGGCCGCACATCATCATCATCATCACCACCACCACCACTAG

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи scFv₂-LC-IgG4p h15A7H и LC- ScFv₂ -IgG4p h15A7 (SEQ ID NO: 11)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность кДНК тяжелой цепи scFv₂-LC-IgG4p h15A7H и LC- scFv₂ -IgG4p h15A7 (SEQ ID NO: 12)

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Аминокислотная последовательность легкой цепи scFv₄-crIgG4p h15A7H (SEQ ID NO:13)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Последовательность кДНК легкой цепи scFv₄-crIgG4p h15A7H (SEQ ID NO:14)

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи scFv₄-crIgG4p h15A7H (SEQ ID NO:15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность кДНК тяжелой цепи scFv₄-crIgG4p h15A7H (SEQ ID NO:16)

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Аминокислотная последовательность CDR-H1 h15A7H (SEQ ID NO: 17)

SFGMH

Аминокислотная последовательность CDR-H2 h15A7H (SEQ ID NO: 18)

YINGGSSTIFYANAVKG

Аминокислотная последовательность CDR-H3 h15A7H (SEQ ID NO: 19)

YASYGGGAMDY

Аминокислотная последовательность CDR-L1 h15A7H (SEQ ID NO: 20)

RSSQSIVHNDGNTYFE

Аминокислотная последовательность CDR-L2 h15A7H (SEQ ID NO: 21)

KVSNRFS

Аминокислотная последовательность CDR-L3 h15A7H (SEQ ID NO: 22)

FQGSYVPLT

Аминокислотная последовательность VH h15A7H (SEQ ID NO: 23)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность VL h15A7H (SEQ ID NO: 24)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIK

Аминокислотная последовательность повторений последовательности линкера (SEQ ID NO: 25)

ggggs

Аминокислотная последовательность линкера с Fc (SEQ ID NO: 26)

ggggsaaa

Аминокислотная последовательность линкера taFv (SEQ ID NO: 27)

astgs

Аминокислотная последовательность линкера легкой цепи scFv (SEQ ID NO: 28)

astgsggggs

Аминокислотная последовательность VH G44C h15A7H (SEQ ID NO: 29)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность VL Q10°C h15A7H (SEQ ID NO: 30)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIK

Аминокислотная последовательность PSGL-1 человека (SEQ ID NO: 31)

MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRRQATEYEYLDYDFLPETEPPEMLRNSTDTT

PLTGPGTPESTTVEPAARRSTGLDAGGAVTELTTELANMGNLSTDSAAMEIQTTQPAATEAQTTQPVPTE

AQTTPLAATEAQTTRLTATEAQTTPLAATEAQTTPPAATEAQTTQPTGLEAQTTAPAAMEAQTTAPAAME

AQTTPPAAMEAQTTQTTAMEAQTTAPEATEAQTTQPTATEAQTTPLAAMEALSTEPSATEALSMEPTTKR

GLFIPFSVSSVTHKGIPMAASNLSVNYPVGAPDHISVKQCLLAILILALVATIFFVCTVVLAVRLSRKGH

MYPVRNYSPTEMVCISSLLPDGGEGPSATANGGLSKAKSPGLTPEPREDREGDDLTLHSFLP

Аминокислотная последовательность более короткого варианта PSGL-1 человека (SEQ ID NO: 32)

MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRRQATEYEYLDYDFLPETEPPEMLRNSTDTT

PLTGPGTPESTTVEPAARRSTGLDAGGAVTELTTELANMGNLSTDSAAMEIQTTQPAATEAQTTPLAATE

AQTTRLTATEAQTTPLAATEAQTTPPAATEAQTTQPTGLEAQTTAPAAMEAQTTAPAAMEAQTTPPAAME

AQTTQTTAMEAQTTAPEATEAQTTQPTATEAQTTPLAAMEALSTEPSATEALSMEPTTKRGLFIPFSVSS

VTHKGIPMAASNLSVNYPVGAPDHISVKQCLLAILILALVATIFFVCTVVLAVRLSRKGHMYPVRNYSPT

EMVCISSLLPDGGEGPSATANGGLSKAKSPGLTPEPREDREGDDLTLHSFLP

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> LIN, Rong-Hwa

LIN, Shih-Yao

TSAI, Yu-Ying

<120> ЧЕТЫРЕХВАЛЕНТНЫЕ АНТИТЕЛА К PSGL-1 И

ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 606592001340

<150> 62/276,806

<151> 2016-08-01

<160> 36

<170> FastSEQ для Windows версии 4,0

<210> 1

<211> 746

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly

165 170 175

Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr

210 215 220

Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr

290 295 300

Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

305 310 315 320

Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

325 330 335

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

340 345 350

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu

355 360 365

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

385 390 395 400

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

405 410 415

Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

420 425 430

Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe

435 440 445

Tyr Ala Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

450 455 460

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

465 470 475 480

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met

485 490 495

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

500 505 510

Gly Ser Ala Ala Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

515 520 525

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

530 535 540

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

545 550 555 560

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

565 570 575

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

580 585 590

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

595 600 605

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

610 615 620

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

625 630 635 640

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

645 650 655

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

660 665 670

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

675 680 685

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

690 695 700

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

705 710 715 720

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

725 730 735

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

740 745

<210> 2

<211> 2241

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

gacattcaga tgacccaatc tccgagctct ttgtctgcgt ctgtagggga tagggtcact 60

atcacctgca gatctagtca gagcattgta cataatgatg gaaacaccta ttttgaatgg 120

taccaacaga aaccaggaaa ggcacccaag cttctcatct ataaagtttc caatcgattt 180

tctggtgtcc catccaggtt tagtggcagt gggtctggga cacacttcac cctcaccatc 240

tcttctctgc agccggagga tttcgcaacc tattactgtt ttcaaggttc atatgttcct 300

ctcacgttcg gtcaaggcac caaggtggaa atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 360

ggctctgaag tgcaactggt ggagtctggg ggaggcttag tgcagcctgg aggaagcttg 420

agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct ttggaatgca ctgggttcgc 480

caggctccag ggaagggact cgagtgggtc gcatacatta atggtggcag tagtaccatc 540

ttctatgcaa acgcagtgaa gggccgattc accatctcca gagataatgc caagaacacc 600

ctgtacctgc aaatgaattc tctgagggct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 660

tatgctagtt acggaggggg tgctatggac tattggggcc aaggcaccct ggtcacagtc 720

tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc cggaggcgga 780

ggttccggag gtggcggaag tgacattcag atgacccaat ctccgagctc tttgtctgcg 840

tctgtagggg atagggtcac tatcacctgc agatctagtc agagcattgt acataatgat 900

ggaaacacct attttgaatg gtaccaacag aaaccaggaa aggcacccaa gcttctcatc 960

tataaagttt ccaatcgatt ttctggtgtc ccatccaggt ttagtggcag tgggtctggg 1020

acacacttca ccctcaccat ctcttctctg cagccggagg atttcgcaac ctattactgt 1080

tttcaaggtt catatgttcc tctcacgttc ggtcaaggca ccaaggtgga aatcaaaggt 1140

ggaggcggtt caggcggagg tggctctgaa gtgcaactgg tggagtctgg gggaggctta 1200

gtgcagcctg gaggaagctt gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc 1260

tttggaatgc actgggttcg ccaggctcca gggaagggac tcgagtgggt cgcatacatt 1320

aatggtggca gtagtaccat cttctatgca aacgcagtga agggccgatt caccatctcc 1380

agagataatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgaatt ctctgagggc tgaggacacg 1440

gccgtgtatt actgtgcaag atatgctagt tacggagggg gtgctatgga ctattggggc 1500

caaggcaccc tggtcacagt ctcctcagga ggcggaggtt ccgcggccgc agagtccaaa 1560

tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 1620

ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 1680

gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 1740

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 1800

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1860

aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1920

cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1980

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2040

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2100

ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 2160

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 2220

tccctgtctc tgggtaaatg a 2241

<210> 3

<211> 756

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

145 150 155 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

165 170 175

Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

180 185 190

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr

210 215 220

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln

225 230 235 240

Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile

245 250 255

Lys Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

260 265 270

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser

275 280 285

Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

385 390 395 400

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

405 410 415

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

420 425 430

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

435 440 445

Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys

450 455 460

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

465 470 475 480

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

485 490 495

Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

500 505 510

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Glu

515 520 525

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

530 535 540

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

545 550 555 560

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

565 570 575

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

580 585 590

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

595 600 605

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

610 615 620

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

625 630 635 640

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

645 650 655

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

660 665 670

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

675 680 685

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

690 695 700

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

705 710 715 720

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

725 730 735

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

740 745 750

Ser Leu Gly Lys

755

<210> 4

<211> 2271

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggaag cttgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgccaggct 120

ccagggaagt gtctcgagtg ggtcgcatac attaatggtg gcagtagtac catcttctat 180

gcaaacgcag tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga attctctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatgct 300

agttacggag ggggtgctat ggactattgg ggccaaggca ccctggtcac agtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatccggagg cggaggttcc 420

ggaggtggcg gaagtgacat tcagatgacc caatctccga gctctttgtc tgcgtctgta 480

ggggataggg tcactatcac ctgcagatct agtcagagca ttgtacataa tgatggaaac 540

acctattttg aatggtacca acagaaacca ggaaaggcac ccaagcttct catctataaa 600

gtttccaatc gattttctgg tgtcccatcc aggtttagtg gcagtgggtc tgggacacac 660

ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccg gaggatttcg caacctatta ctgttttcaa 720

ggttcatatg ttcctctcac gttcggttgt ggcaccaagg tggaaatcaa agcttcaacc 780

ggttcagaca ttcagatgac ccaatctccg agctctttgt ctgcgtctgt aggggatagg 840

gtcactatca cctgcagatc tagtcagagc attgtacata atgatggaaa cacctatttt 900

gaatggtacc aacagaaacc aggaaaggca cccaagcttc tcatctataa agtttccaat 960

cgattttctg gtgtcccatc caggtttagt ggcagtgggt ctgggacaca cttcaccctc 1020

accatctctt ctctgcagcc ggaggatttc gcaacctatt actgttttca aggttcatat 1080

gttcctctca cgttcggtca aggcaccaag gtggaaatca aaggtggagg cggttcaggc 1140

ggaggtggct ctggcggtgg cggatccgga ggcggaggtt ccggaggtgg cggaagtgaa 1200

gtgcaactgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaggaagctt gagactctcc 1260

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tttggaatgc actgggttcg ccaggctcca 1320

gggaagggac tcgagtgggt cgcatacatt aatggtggca gtagtaccat cttctatgca 1380

aacgcagtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacac cctgtacctg 1440

caaatgaatt ctctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag atatgctagt 1500

tacggagggg gtgctatgga ctattggggc caaggcaccc tggtcacagt ctcctcagga 1560

ggcggaggtt ccgcggccgc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccagca 1620

cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 1680

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 1740

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1800

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1860

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 1920

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 1980

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 2040

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 2100

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 2160

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 2220

ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaatg a 2271

<210> 5

<211> 756

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser

180 185 190

Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245 250 255

Ser Ala Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

275 280 285

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

290 295 300

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile

305 310 315 320

Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

325 330 335

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

340 345 350

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala

355 360 365

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

405 410 415

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser

420 425 430

Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr

435 440 445

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser

450 455 460

Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

465 470 475 480

Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

485 490 495

Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys

500 505 510

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Glu

515 520 525

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

530 535 540

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

545 550 555 560

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

565 570 575

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

580 585 590

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

595 600 605

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

610 615 620

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

625 630 635 640

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

645 650 655

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

660 665 670

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

675 680 685

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

690 695 700

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

705 710 715 720

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

725 730 735

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

740 745 750

Ser Leu Gly Lys

755

<210> 6

<211> 2271

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

gacattcaga tgacccaatc tccgagctct ttgtctgcgt ctgtagggga tagggtcact 60

atcacctgca gatctagtca gagcattgta cataatgatg gaaacaccta ttttgaatgg 120

taccaacaga aaccaggaaa ggcacccaag cttctcatct ataaagtttc caatcgattt 180

tctggtgtcc catccaggtt tagtggcagt gggtctggga cacacttcac cctcaccatc 240

tcttctctgc agccggagga tttcgcaacc tattactgtt ttcaaggttc atatgttcct 300

ctcacgttcg gttgtggcac caaggtggaa atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 360

ggctctggcg gtggcggatc cggaggcgga ggttccggag gtggcggaag tgaagtgcaa 420

ctggtggagt ctgggggagg cttagtgcag cctggaggaa gcttgagact ctcctgtgca 480

gcctctggat tcactttcag tagctttgga atgcactggg ttcgccaggc tccagggaag 540

tgtctcgagt gggtcgcata cattaatggt ggcagtagta ccatcttcta tgcaaacgca 600

gtgaagggcc gattcaccat ctccagagat aatgccaaga acaccctgta cctgcaaatg 660

aattctctga gggctgagga cacggccgtg tattactgtg caagatatgc tagttacgga 720

gggggtgcta tggactattg gggccaaggc accctggtca cagtctcctc agcttcaacc 780

ggttcagaag tgcaactggt ggagtctggg ggaggcttag tgcagcctgg aggaagcttg 840

agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct ttggaatgca ctgggttcgc 900

caggctccag ggaagtgtct cgagtgggtc gcatacatta atggtggcag tagtaccatc 960

ttctatgcaa acgcagtgaa gggccgattc accatctcca gagataatgc caagaacacc 1020

ctgtacctgc aaatgaattc tctgagggct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 1080

tatgctagtt acggaggggg tgctatggac tattggggcc aaggcaccct ggtcacagtc 1140

tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc cggaggcgga 1200

ggttccggag gtggcggaag tgacattcag atgacccaat ctccgagctc tttgtctgcg 1260

tctgtagggg atagggtcac tatcacctgc agatctagtc agagcattgt acataatgat 1320

ggaaacacct attttgaatg gtaccaacag aaaccaggaa aggcacccaa gcttctcatc 1380

tataaagttt ccaatcgatt ttctggtgtc ccatccaggt ttagtggcag tgggtctggg 1440

acacacttca ccctcaccat ctcttctctg cagccggagg atttcgcaac ctattactgt 1500

tttcaaggtt catatgttcc tctcacgttc ggttgtggca ccaaggtgga aatcaaagga 1560

ggcggaggtt ccgcggccgc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccagca 1620

cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 1680

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 1740

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1800

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1860

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 1920

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 1980

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 2040

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 2100

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 2160

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 2220

ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaatg a 2271

<210> 7

<211> 486

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

145 150 155 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

165 170 175

Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

180 185 190

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr

210 215 220

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln

225 230 235 240

Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile

245 250 255

Lys Ala Ser Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr

290 295 300

Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

305 310 315 320

Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

325 330 335

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

340 345 350

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu

355 360 365

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

370 375 380

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

385 390 395 400

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

405 410 415

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

420 425 430

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

435 440 445

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

450 455 460

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

465 470 475 480

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

485

<210> 8

<211> 1461

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggaag cttgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgccaggct 120

ccagggaagt gtctcgagtg ggtcgcatac attaatggtg gcagtagtac catcttctat 180

gcaaacgcag tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga attctctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatgct 300

agttacggag ggggtgctat ggactattgg ggccaaggca ccctggtcac agtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatccggagg cggaggttcc 420

ggaggtggcg gaagtgacat tcagatgacc caatctccga gctctttgtc tgcgtctgta 480

ggggataggg tcactatcac ctgcagatct agtcagagca ttgtacataa tgatggaaac 540

acctattttg aatggtacca acagaaacca ggaaaggcac ccaagcttct catctataaa 600

gtttccaatc gattttctgg tgtcccatcc aggtttagtg gcagtgggtc tgggacacac 660

ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccg gaggatttcg caacctatta ctgttttcaa 720

ggttcatatg ttcctctcac gttcggttgt ggcaccaagg tggaaatcaa agcttcaacc 780

ggttcaggag gtggcggaag tgacattcag atgacccaat ctccgagctc tttgtctgcg 840

tctgtagggg atagggtcac tatcacctgc agatctagtc agagcattgt acataatgat 900

ggaaacacct attttgaatg gtaccaacag aaaccaggaa aggcacccaa gcttctcatc 960

tataaagttt ccaatcgatt ttctggtgtc ccatccaggt ttagtggcag tgggtctggg 1020

acacacttca ccctcaccat ctcttctctg cagccggagg atttcgcaac ctattactgt 1080

tttcaaggtt catatgttcc tctcacgttc ggtcaaggca ccaaggtgga aatcaaacga 1140

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 1200

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 1260

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 1320

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 1380

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 1440

ttcaacaggg gagagtgtta g 1461

<210> 9

<211> 499

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

225 230 235 240

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

245 250 255

Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Cys Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe

275 280 285

Tyr Ala Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

290 295 300

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

305 310 315 320

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met

325 330 335

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

340 345 350

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

370 375 380

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser

385 390 395 400

Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln

405 410 415

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

420 425 430

Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

435 440 445

His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

450 455 460

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly

465 470 475 480

Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala His His His His His His His

485 490 495

His His His

<210> 10

<211> 1500

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

gacattcaga tgacccaatc tccgagctct ttgtctgcgt ctgtagggga tagggtcact 60

atcacctgca gatctagtca gagcattgta cataatgatg gaaacaccta ttttgaatgg 120

taccaacaga aaccaggaaa ggcacccaag cttctcatct ataaagtttc caatcgattt 180

tctggtgtcc catccaggtt tagtggcagt gggtctggga cacacttcac cctcaccatc 240

tcttctctgc agccggagga tttcgcaacc tattactgtt ttcaaggttc atatgttcct 300

ctcacgttcg gtcaaggcac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtggt 660

ggaggcggtt caggcggagg tggctctgaa gtgcaactgg tggagtctgg gggaggctta 720

gtgcagcctg gaggaagctt gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc 780

tttggaatgc actgggttcg ccaggctcca gggaagtgtc tcgagtgggt cgcatacatt 840

aatggtggca gtagtaccat cttctatgca aacgcagtga agggccgatt caccatctcc 900

agagataatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgaatt ctctgagggc tgaggacacg 960

gccgtgtatt actgtgcaag atatgctagt tacggagggg gtgctatgga ctattggggc 1020

caaggcaccc tggtcacagt ctcctcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 1080

ggtggcggat ccggaggcgg aggttccgga ggtggcggaa gtgacattca gatgacccaa 1140

tctccgagct ctttgtctgc gtctgtaggg gatagggtca ctatcacctg cagatctagt 1200

cagagcattg tacataatga tggaaacacc tattttgaat ggtaccaaca gaaaccagga 1260

aaggcaccca agcttctcat ctataaagtt tccaatcgat tttctggtgt cccatccagg 1320

tttagtggca gtgggtctgg gacacacttc accctcacca tctcttctct gcagccggag 1380

gatttcgcaa cctattactg ttttcaaggt tcatatgttc ctctcacgtt cggttgtggc 1440

accaaggtgg aaatcaaagc ggccgcacat catcatcatc atcaccacca ccaccactag 1500

<210> 11

<211> 447

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 12

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggaag cttgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgccaggct 120

ccagggaagg gactcgagtg ggtcgcatac attaatggtg gcagtagtac catcttctat 180

gcaaacgcag tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga attctctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatgct 300

agttacggag ggggtgctat ggactattgg ggccaaggca ccctggtcac agtctcctca 360

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320

ctctccctgt ctctgggtaa atga 1344

<210> 13

<211> 364

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

145 150 155 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

165 170 175

Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

180 185 190

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr

210 215 220

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln

225 230 235 240

Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile

245 250 255

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

260 265 270

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

275 280 285

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

290 295 300

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

325 330 335

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

340 345 350

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

355 360

<210> 14

<211> 1095

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggaag cttgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgccaggct 120

ccagggaagt gtctcgagtg ggtcgcatac attaatggtg gcagtagtac catcttctat 180

gcaaacgcag tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga attctctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatgct 300

agttacggag ggggtgctat ggactattgg ggccaaggca ccctggtcac agtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatccggagg cggaggttcc 420

ggaggtggcg gaagtgacat tcagatgacc caatctccga gctctttgtc tgcgtctgta 480

ggggataggg tcactatcac ctgcagatct agtcagagca ttgtacataa tgatggaaac 540

acctattttg aatggtacca acagaaacca ggaaaggcac ccaagcttct catctataaa 600

gtttccaatc gattttctgg tgtcccatcc aggtttagtg gcagtgggtc tgggacacac 660

ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccg gaggatttcg caacctatta ctgttttcaa 720

ggttcatatg ttcctctcac gttcggttgt ggcaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg 780

gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 840

tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 900

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 960

agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 1020

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1080

aggggagagt gttag 1095

<210> 15

<211> 584

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

145 150 155 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

165 170 175

Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

180 185 190

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr

210 215 220

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln

225 230 235 240

Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile

245 250 255

Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

260 265 270

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

275 280 285

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

290 295 300

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

305 310 315 320

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

325 330 335

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

340 345 350

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

355 360 365

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

370 375 380

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

385 390 395 400

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

405 410 415

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

420 425 430

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

435 440 445

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

450 455 460

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

465 470 475 480

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

485 490 495

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

500 505 510

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

515 520 525

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

530 535 540

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

545 550 555 560

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

565 570 575

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

580

<210> 16

<211> 1755

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggaag cttgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgccaggct 120

ccagggaagt gtctcgagtg ggtcgcatac attaatggtg gcagtagtac catcttctat 180

gcaaacgcag tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga attctctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatgct 300

agttacggag ggggtgctat ggactattgg ggccaaggca ccctggtcac agtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatccggagg cggaggttcc 420

ggaggtggcg gaagtgacat tcagatgacc caatctccga gctctttgtc tgcgtctgta 480

ggggataggg tcactatcac ctgcagatct agtcagagca ttgtacataa tgatggaaac 540

acctattttg aatggtacca acagaaacca ggaaaggcac ccaagcttct catctataaa 600

gtttccaatc gattttctgg tgtcccatcc aggtttagtg gcagtgggtc tgggacacac 660

ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccg gaggatttcg caacctatta ctgttttcaa 720

ggttcatatg ttcctctcac gttcggttgt ggcaccaagg tggaaatcaa agcttccacc 780

aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 840

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 900

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 960

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 1020

aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 1080

cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 1140

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 1200

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1260

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 1320

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1380

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1440

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1500

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1560

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1620

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1680

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1740

tctctgggta aatga 1755

<210> 17

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu

1 5 10 15

<210> 21

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 23

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Ala Ser Thr Gly Ser

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Ala Ser Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 31

<211> 412

<212> ПРТ

<213> Homo Sapiens

<400> 31

Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu

20 25 30

Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr

35 40 45

Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg

50 55 60

Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser

65 70 75 80

Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu

100 105 110

Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala

115 120 125

Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr

130 135 140

Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala

195 200 205

Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr

210 215 220

Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu

225 230 235 240

Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu

245 250 255

Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu

260 265 270

Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val

275 280 285

Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser

290 295 300

Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys

305 310 315 320

Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val

325 330 335

Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr

340 345 350

Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu

355 360 365

Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg

385 390 395 400

Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro

405 410

<210> 32

<211> 402

<212> ПРТ

<213> Homo Sapiens

<400> 32

Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu

20 25 30

Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr

35 40 45

Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg

50 55 60

Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser

65 70 75 80

Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu

100 105 110

Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala

115 120 125

Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr

130 135 140

Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro

165 170 175

Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala

195 200 205

Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu

225 230 235 240

Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro

245 250 255

Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu

260 265 270

Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met

275 280 285

Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His

290 295 300

Ile Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val

305 310 315 320

Ala Thr Ile Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser

325 330 335

Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met

340 345 350

Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala

355 360 365

Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro

370 375 380

Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe

385 390 395 400

Leu Pro

<210> 33

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 34

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<---

1. Четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, где указанное четырехвалентное антитело содержит димер двух мономеров, при этом каждый мономер указанного димера содержит одноцепочечный полипептид, содержащий от N-конца к C-концу:

(a) первый вариабельный домен легкой цепи (VL);

(b) первую линкерную последовательность;

(c) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH);

(d) вторую линкерную последовательность;

(e) второй домен VL;

(f) третью линкерную последовательность;

(g) второй домен VH;

(h) четвертую линкерную последовательность; и

(i) домен Fc антитела,

при этом каждый из первого и второго доменов VL содержит (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; при этом каждый из первого и второго доменов VH содержит (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; где первый домен VL формирует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VH и первый домен VH формирует единицу связывания VH-VL со вторым доменом VL, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к человеческому PSGL-1.

2. Четырехвалентное антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 23.

3. Четырехвалентное антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 29.

4. Четырехвалентное антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 24.

5. Четырехвалентное антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 30.

6. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что первая, вторая и третья линкерные последовательности каждая содержит два или более повтора аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 или первая, вторая и третья линкерные последовательности содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36.

7. Четырехвалентное антитело по п. 6, отличающееся тем, что первая и третья линкерные последовательности имеют одинаковую последовательность и содержат два повтора SEQ ID NO: 25.

8. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что вторая линкерная последовательность содержит пять повторов SEQ ID NO: 25.

9. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что четвертая линкерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

10. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1.

11. Четырехвалентное антитело по п. 10, отличающееся тем, что каждый из двух одноцепочечных полипептидов кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

12. Четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, где указанное четырехвалентное антитело содержит димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера включает в себя одноцепочечный полипептид, содержащий от N-конца к C-концу:

(a) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH);

(b) первую линкерную последовательность;

(c) первый вариабельный домен легкой цепи (VL);

(d) вторую линкерную последовательность;

(e) второй домен VL;

(f) третью линкерную последовательность;

(g) второй домен VH;

(h) четвертую линкерную последовательность; и

(i) домен Fc антитела,

при этом каждый из первого и второго доменов VL содержит (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; при этом каждый из первого и второго доменов VH содержит (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и при этом каждый из первого и второго доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к человеческому PSGL-1.

13. Четырехвалентное антитело по п. 12, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 23.

14. Четырехвалентное антитело по п. 12, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 29.

15. Четырехвалентное антитело по п. 12, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 24.

16. Четырехвалентное антитело по п. 12, отличающееся тем, что каждый из двух доменов VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 30.

17. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 12-16, отличающееся тем, что первая и третья линкерные последовательности имеют одинаковую последовательность, содержащую пять повторов SEQ ID NO: 25.

18. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 12-17, отличающееся тем, что вторая линкерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.

19. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 12-18, отличающееся тем, что четвертая линкерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

20. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 12-19, отличающееся тем, что каждый из двух одноцепочечных полипептидов содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 3.

21. Четырехвалентное антитело по п. 20, отличающееся тем, что каждый из двух одноцепочечных полипептидов кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.

22. Четырехвалентное антитело, которое специфически связывается с человеческим PSGL-1, где указанное четырехвалентное антитело содержит димер двух мономеров, при этом каждый мономер димера содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела;

при этом легкая цепь антитела содержит от N-конца к С-концу:

(i) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH),

(ii) первую линкерную последовательность,

(iii) первый вариабельный домен легкой цепи (VL),

(iv) вторую линкерную последовательность,

(v) второй домен VL и

(vi) константный домен легкой цепи (CL);

при этом тяжелая цепь антитела содержит:

(i) второй домен VH и

(ii) константную область тяжелой цепи, содержащую первый домен константной области тяжелой цепи (CH1), шарнирную область антитела, второй домен константной области тяжелой цепи (CH2) и третий домен константной области тяжелой цепи (CH3);

при этом каждый из первого и второго доменов VL содержит (i) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (iii) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; при этом каждый из первого и второго доменов VH содержит (i) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (ii) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (iii) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и при этом каждый из первого и второго доменов VL образует единицу связывания VH-VL с соответствующим доменом VH первого и второго доменов VH, и при этом каждая из двух единиц связывания VH-VL специфична к человеческому PSGL-1.

23. Четырехвалентное антитело по п. 22, отличающееся тем, что каждый первый и второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 23.

24. Четырехвалентное антитело по п. 22, отличающееся тем, что каждый первый и второй домены VH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 29.

25. Четырехвалентное антитело по п. 22, отличающееся тем, что каждый первый и второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 24.

26. Четырехвалентное антитело по п. 22, отличающееся тем, что каждый первый и второй домены VL содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 30.

27. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 22-26, отличающееся тем, что домен CL представляет собой домен CL каппа.

28. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 22-27, отличающееся тем, что первая линкерная последовательность содержит пять повторов SEQ ID NO: 25.

29 Четырехвалентное антитело по любому из пп. 22-28, отличающееся тем, что вторая линкерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

30. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 22-29, отличающееся тем, что легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 7.

31. Четырехвалентное антитело по п. 30, отличающееся тем, что легкая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8.

32. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 22-31, отличающееся тем, что тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 11.

33. Четырехвалентное антитело по п. 32, отличающееся тем, что тяжелая цепь антитела кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

34. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-33, отличающееся тем, что домен Fc антитела представляет собой домен Fc антитела человека.

35. Четырехвалентное антитело по п. 34, отличающееся тем, что домен Fc антитела представляет собой домен Fc IgG4 человека.

36. Четырехвалентное антитело по п. 35, отличающееся тем, что домен Fc IgG4 человека содержит последовательность шарнирной области, содержащую одну или более из аминокислотных замен, которые приводят к уменьшению перетасовки IgG4 по сравнению с шарнирной областью IgG4, не содержащей одной или более аминокислотных замен.

37. Четырехвалентное антитело по п. 35 или 36, отличающееся тем, что домен Fc IgG4 человека содержит последовательность шарнирной области, содержащую замену серина на пролин в аминокислоте 228, нумерация согласно индексу EU.

38. Выделенный полинуклеотид, кодирующий четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-37.

39. Выделенный полинуклеотид по п. 38, отличающийся тем, что указанный выделенный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.

40. Экспрессионный вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 38 или 39.

41. Клетка-хозяин для экспрессии полинуклеотида, кодирующего четырехвалентное антитело, содержащая полинуклеотид по п. 38 или 39 или вектор по п. 40.

42. Способ получения четырехвалентного антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 41 таким образом, что продуцируется четырехвалентное антитело.

43. Способ по п. 42, дополнительно включающий выделение четырехвалентного антитела из клетки-хозяина.

44. Фармацевтическая композиция для лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации, содержащая эффективное количество четырехвалентного антитела по любому из пп. 1-37 и фармацевтически приемлемый носитель.

45. Набор для лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания или лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации, содержащий четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-37 и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.

46. Набор по п. 45, дополнительно содержащий листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению четырехвалентного антитела с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания.

47. Набор по п. 45, дополнительно содержащий листок-вкладыш, содержащий инструкции для введения четырехвалентного антитела до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации.

48. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-37 для применения с целью лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания.

49. Четырехвалентное антитело по любому из пп. 1-37 для применения с целью лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации.

50. Применение четырехвалентного антитела по любому из пп. 1-37 при изготовлении лекарственного средства для лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания.

51. Применение четырехвалентного антитела по любому из пп. 1-37 при изготовлении лекарственного средства с целью лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации.

52. Способ лечения опосредованного Т-клетками воспалительного заболевания, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества четырехвалентного антитела по любому из пп. 1-37.

53. Способ лечения индивидуума, нуждающегося в переливании или трансплантации, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества четырехвалентного антитела по любому из пп. 1-37 до, одновременно с и/или после переливания или трансплантации.

54. Набор по п. 46, четырехвалентное антитело по п. 48, применение по п. 50 или способ по п. 52, отличающиеся тем, что опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

55. Набор по п. 46, четырехвалентное антитело по п. 48, применение по п. 50 или способ по п. 52, отличающиеся тем, что опосредованное Т-клетками воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, болезни Крона, анкилозирующего спондилоартрита, диабета типа I, язвенного колита, рассеянного склероза, аллергии, атопического дерматита, астмы, Т-клеточной неоплазии и реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ).

56. Набор, четырехвалентное антитело, применение или способ по п. 55, отличающиеся тем, что псориаз представляет собой бляшковидный псориаз, хронический бляшковидный псориаз, каплевидный псориаз, обратный псориаз, пустулезный псориаз или эритродермический псориаз.

57. Набор по п. 47, четырехвалентное антитело по п. 49, применение по п. 51 или способ по п. 53, отличающиеся тем, что трансплантация представляет собой трансплантацию ткани, выбранной из группы, состоящей из костного мозга, почки, сердца, печени, нервной ткани, легкого, поджелудочной железы, кожи и кишечника.

58. Набор по п. 47, четырехвалентное антитело по п. 49, применение по п. 51 или способ по п. 53, отличающиеся тем, что переливание представляет собой переливание, включающее (содержащее) одно или более из белых клеток крови, красных клеток крови и тромбоцитов.