Способ микрокапсулирования хлореллы

Изобретение относится к биотехнологии и нанотехнологии. Предложен способ микрокапсулирования хлореллы в полимерной оболочке, включающий получение суспензии нативной формы хлореллы, диспергированной в 50%-ном растворе поливинилпирролидона, внесение полученной суспензии дозатором со скоростью 2,0 мл/мин в 30%-ный раствор танина с высоты 20-25 см при перемешивании 50-60 об/мин в течение 30-60 мин; затем микрокапсулы промывают и высушивают при 30-35°С. Изобретение обеспечивает повышение биологических свойств целевого продукта, оказывающего более выраженное стимулирующее действие на метаболизм у животных. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области нанотехнологии и пищевой промышленности.

В настоящее время известен способ получения нанокапсул экстракта хлореллы в альгинате натрия, характеризующийся тем, что в качестве оболочки используется альгинат натрия, а в качестве ядра – хлорелла (Патент Р.Ф. №2655620, авт. Кролевец А.А. – 2018г.). Недостатком данного способа является использование в технологическом процессе сухого экстракта хлореллы, биологические свойства которой значительно уступают нативной форме хлореллы, а также применение петролейного эфира, вещества обладающего токсичностью и огнеопасностью.

В качестве прототипа выбран способ нанокапсулирования хлореллы в пектине (Патент Р.Ф. №2672065, авт. Кролевец А.А. и др.). Данный способ характеризуется тем, что в качестве оболочки нанокапсул используется высоко – или низкоэтерифицированный яблочный или цитрусовый пектин, а в качестве ядра – экстракт хлореллы. При этом экстракт хлореллы добавляют в суспензию пектина в гексане в присутствии поверхностно активного вещества Е472с и перемешивают при 1000 об/мин. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.

К недостаткам способа, взятого за прототип, можно отнести: использование в качестве ядра сухого экстракта хлореллы, имеющего относительно низкие биологические свойства по сравнению с нативной формой хлореллы; использование в технологическом процессе гексана, являющегося токсичным, огнеопасным и взрывоопасным веществом.

Технической задачей изобретения является повышение биологических свойств препарата за счет микрокапсулирования нативной формы хлореллы и использования в технологическом процессе безопасных веществ.

Решение технической задачи достигается тем, что 5,0 мл концентрата нативной формы хлореллы с содержанием 1,5 – 2,0 млрд/мл живых клеток диспергируют в 15,0 мл 50% -ного водного раствора поливинилпирролидона до образования однородной устойчивой суспензии. Полученную суспензию с использованием специального устройства–дозатора нашей конструкции (Патент Р.Ф. №194572 – 2019 г., авт. О.Б. Сеин и др.) вносят в 10-15 мл 30% -ного водного раствора танина с высоты 20-25 см при постоянном перемешивании в магнитной мешалке со скоростью вращения 50-60 об/мин в течение 30-60 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С. Микрокапсулы представляют собой сферические образования желто-серого цвета.

Выход готовых микрокапсул составляет 100%. Массовое соотношение в микрокапсулах ядро : оболочка составляет 1:3.

Отличительной особенностью разработанного способа получения микрокапсул хлореллы является использование в качестве ядра микрокапсул нативной формы хлореллы которая, в отличие от сублимированной сухой формы, содержит большое количество биологически активных веществ неразрушающихся в процессе микрокапсулирования.

Использованная в способе микроводоросль хлорелла содержит большое количество биологически активных веществ. В состав её клеток входят заменимые и незаменимые аминокислоты. Более 70% жирных кислот хлореллы относятся к ненасыщенным кислотам, являющихся предшественниками простагландинов и обеспечивающих гормональную регуляцию многих физиологических процессов. В хлорелле содержатся много каротина (провитамина А), витаминов группы В, витаминов С, К, РР, Е, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты и биотина. Хлорелла богата макро- и микроэлементами. В ней содержится много хлорофилла. Экспериментально подтверждено, что хлорелла профилактирует дисбактериоз, нормализует функциональную активность печени и кишечника, является мощным иммуномодулятором. На основе хлореллы в настоящее время производятся биодобавки и фитонапитки, рекомендуемые для пожилых людей и спортсменов («Хлорелла aLIVE», «Красный клён», Россия; «Now Foods», США).

Поливинилпирролидон был выбран в качестве оболочки микрокапсул в связи с тем, что он не токсичен и индифферентен для организма. Поливинилпирролидон хорошо растворим в неорганических растворителях, в том числе и в воде. В виде добавки Е1201 он разрешен к применению в пищевой промышленности в качестве загустителя, стабилизатора, а также как диспергирующий агент. Попадая в организм с продуктами питания, поливинилпирролидон не расщепляется ферментами, не всасывается в кровь и практически в неизменном виде выводится через кишечник. Раздражающего действия на слизистые оболочки поливинилпирролидон не оказывает.

Используемый в заявляемом технологическом процессе танин относится к водорастворимым полифенолам растительного происхождения. Получают его из коры дуба, каштана и акации. В пищевой промышленности танин используют в виде добавки Е-181 для придания вяжущего вкуса при изготовлении различных напитков. В медицине танин применяют как кровоостанавливающее, противодиарейное и антигеморроидальное средство.

Результатом предлагаемого способа является получение микрокапсул хлореллы в поливинилпирролидоне имеющих высокие биологические свойств.

Пример получения микрокапсул хлореллы с использованием разработанного способа и способа прототипа.

Пример 1 (разработанный способ)

5,0 мл концентрата нативной формы хлореллы с содержанием 2,0 млрд/мл живых клеток диспергируют в 15,0 мл 50% -ного водного раствора поливинилпирролидона до образования устойчивой суспензии. Полученную суспензию с использованием специального устройства–дозатора диспергируют со скоростью 2,0 мл/ мин в 15 мл 30%-ного водного раствора танина с высоты 20 см. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании в магнитной мешалке со скоростью вращения 60 об/мин в течение 30 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С. Микрокапсулы представляют собой сферические образования жёлто-серого цвета. Выход микрокапсул составляет 100%, при массовом соотношении ядро : оболочка 1:3.

Пример 2 (способ прототип)

1,0 экстаркта хлореллы медленно добавляют в суспензию 3,0 низкоэтерифицированного яблочного пектина в гексане в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1000 об/мин. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Микрокапсулы представляют собой сфорические образования желто-серого цвета. Выход микрокапсул составляет 100%, при массовом соотношении ядро : оболочка 1:3.

Пример сравнительной оценки разработанного микрокапсулированного препарата хлореллы и препарата – прототипа на лабораторных животных (кроликах).

Испытания препаратов проводили в условиях вивария Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Было сформировано три группы кроликов – аналогов 3-месячного возраста породы советская шиншилла по 7 голов в каждой.

Животные 1 (контрольной) группы получали основной рацион. Кролики 2 группы получали препарат-прототип, а 3 группы – разработанный препарат в одинаковой дозировке 20 г/гол один раз в день в течение 20 дней подряд. Скармливали препараты в виде болюсов из хлебного мякиша.

Кролики всех групп содержались в типовых клетках расположенных в одном помещении. Основной рацион включал люцерно-клеверное сено и дерть ячменную.

До начала и в конце (21 день) эксперимента у кроликов брали кровь с использованием вакуумных пробирок TERUMO (Бельгия). В крови определяли общие гематологические показатели (скорость оседания эритроцитов, эритроциты, лейкоциты, гемоглобин) с применением общепринятых методик. Биохимические компоненты крови исследовали с использованием наборов ДиаВетТест (Россия) и Био-Ла-Тест (Чехия) и автоматического анализатора, ILAB-650.

В ходе проведенных исследований было установлено, что общее состояние, поведенческие реакции, аппетит у кроликов всех групп в период эксперимента находились в пределах физиологических норм.

При постановке подопытных животных на эксперимент абсолютная масса тела у них была практически одинаковой и колебалась в границах 2,51-2,53 кг. Однако в период эксперимента у кроликов опытных групп отличалась более высокая энергия роста. Так, если абсолютный прирост живой массы у животных контрольной группы за период эксперимента составил 262,0 г, то у кроликов 2 и 3 опытных групп он соответственно достигал 357,0 г и 380,0 г.

Исследование общих гематологических показателей свидетельствует (таблица 1), что у кроликов получавших микрокапсулированные препараты была более высокой гематокритная величина, содержалось больше эритроцитов и гемоглобина по сравнению с контрольными животными и фоновыми показателями. В то же время достоверные различия (p<0,05) отмечались только в содержании эритроцитов и гемоглобина у кроликов 3 опытной группы. В содержании лейкоцитов существенных изменений в крови кроликов «участвующих» в эксперименте выявлено не было, их показатели находились в пределах физиологических границ (6,5-9,5×10¹²/л).

Анализ биохимических компонентов крови указывает на то (таблица 2), что у кроликов получивших разработанный препарат в крови содержалось достоверно больше (р<0,05) общего белка, альбуминов, общих иммуноглобулинов, общего кальция, неорганического фосфора, каротина и витамина А по сравнению с контрольными животными. У кроликов 2 опытной группы достоверное увеличение (р<0,05) отмечалась только со стороны общего кальция, неорганического фосфора, каротина и витамина А.

Таким образом разработанный способ микрокапсулированной хлореллы, несмотря на одинаковый выход препарата со способом-прототипом (100%), позволяет получать препарат оказывающий более выраженное стимулирующее действие на метаболизм у подопытных кроликов. В частности, после его применения у животных повышается (р<0,05) содержание общего белка и альбуминов. Достоверное (р<0,05) увеличение общих иммуноглобулинов свидетельствуют о положительном влиянии разработанного препарата на факторы неспецифической резистентности организма животных.

Препарат можно рекомендовать к использованию в качестве дополнительного витамино-минерального источника при интенсивных физических нагрузках и в восстановительный период после соревнований спортсменов, а также во время реабилитации после перенесенных заболеваний.

Таблица 1. Общие гематологические показатели кроликов получивших препарат – прототип и разработанный препарат

Группа, показатели	Время исследования
до начала эксперимента	на 21 день эксперимента
1 контрольная СОЭ мм/час Гематокрит % Эритроциты∙10¹²/л Лейкоциты∙1012/л Гемоглобин∙г /л	1,80 ± 0,8 38,5 ± 2,12 6,10 ± 0,25 8,11 ± 0,53 106,5 ± 2,11	2,00 ± 0,08 38,0 ± 2,03 6,00 ± 0,36 8,19 ± 0,45 103,0 ± 2,18
2 опытная (препарат-прототип) СОЭ мм/час Гематокрит % Эритроциты∙10¹²/л Лейкоциты∙1012/л Гемоглобин∙г /л	1,91 ± 0,07 38,3 ± 1,90 6,14 ± 0,21 8,20 ± 0,44 103,7 ± 2,05	1,90 ± 0,07 39,7 ± 2,12 6,48 ± 0,30 8,11 ± 0,39 108,6 ± 2,10
3 контрольная (разработанный препарат) СОЭ. мм/час Гематокрит % Эритроциты∙10¹²/л Лейкоциты∙1012/л Гемоглобин∙г /л	1,85 ± 0,07 38,4 ± 2,10 6,11 ± 0,20 8,17 ± 0,51 103,2 ± 2,07	1,75 ± 0,08 40,4 ± 2,04 7,03 ± 0,24*• 8,20 ± 0,63 111,0 ± 2,00*•

Примечание: * - при р<0,05 по сравнению с показателями контрольной группы; ∙ - при р< 0,05 по сравнению с показателями до начала эксперимента

Таблица 2. Биохимические показатели у кроликов получавших препарат- прототип и разработанный препарат

Группа, показатели	Время исследования
до начала эксперимента	на 21 день эксперимента
1 контрольная Общий белок, г/л Альбумины, г/л Иммуноглобулины, г/л Глюкоза, ммоль/л Холестерин, ммоль/л Общий кальций, ммоль/л Неорганический фосфор, ммоль/л Каротин, мкг/100мл Витамин А, мкг/100мл	68,4 ± 2,15 31,1 ± 1,10 27,3 ± 0,97 4,45 ± 0,39 1,40 ± 0,19 2,33 ± 0,28 1,07 ± 1,19 0,23 ± 0,04 1,03 ± 0,05	67,0 ± 2,10 31,0 ± 1,05 27,7 ± 0,88 4,50 ± 0,31 1,51 ± 0,17 2,41 ± 0,33 1,12 ± 1,17 0,25 ± 0,04 1,09 ± 0,06
2 опытная (препарат-прототип) Общий белок, г/л Альбумины, г/л Иммуноглобулины, г/л Глюкоза, ммоль/л Холестерин, ммоль/л Общий кальций, ммоль/л Неорганический фосфор, ммоль/л Каротин, мкг/100мл Витамин А, мкг/100мл	68,8 ± 2,03 31,5 ± 1,00 27,7 ± 0,89 4,38 ± 0,37 1,49 ± 0,10 2,32 ± 0,14 1,10 ± 1,20 0,20 ± 0,04 1,06 ± 0,06	70,7 ± 1,84 33,4 ± 1,14 28,6 ± 0,77 4,53 ± 0,40 1,38 ± 0,15 2,77 ± 0,18*• 1,94 ± 0,17*• 0,41 ± 0,05*• 1,98 ± 0,07*•
3 контрольная (разработанный препарат) Общий белок, г/л Альбумины, г/л Иммуноглобулины, г/л Глюкоза, ммоль/л Холестерин, ммоль/л Общий кальций, ммоль/л Неорганический фосфор, ммоль/л Каротин, мкг/100мл Витамин А, мкг/100мл	68,3 ± 2,01 31,0 ± 1,15 26,9 ± 0,75 4,40 ± 0,80 1,44 ± 0,19 2,35 ± 0,11 1,09 ± 1,26 0,24 ± 0,03 1,05 ± 0,07	74,4 ± 1,42*• 37,4 ± 1,06*• 28,8 ± 0,84• 5,11 ± 0,77 1,30 ± 0,16 2,80 ± 0,11•* 2,15 ± 0,19*• 0,55 ± 0,05*• 2,47 ± 0,08*•

Способ микрокапсулирования хлореллы в полимерной оболочке, отличающийся тем, что в качестве оболочки используется поливинилпирролидон, а в качестве ядра - нативная форма хлореллы, которую диспергируют в 50%-ный раствор поливинилпирролидона, и полученную суспензию с использованием дозатора со скоростью 2,0 мл/мин вносят в 30%-ный раствор танина с высоты 20-25 см при перемешивании со скоростью 50-60 об/мин в течение 30-60 мин, сформировавшиеся микрокапсулы промывают и высушивают при 30-35°С.