Бета-казеины и кишечная микробиота

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для улучшения баланса полезной кишечной микробиоты у животных. Способ улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у животного осуществляется путем приема внутрь композиции, содержащей бета-казеин, или путем введения животному композиции, содержащей бета-казеин, при этом по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина. В другом воплощении представлен способ стимуляции роста бактерий в кишечнике животного, включающий прием внутрь или введение указанной композиции. Использование группы изобретений обеспечивает улучшение уровней полезной кишечной микробиоты и стимуляцию роста бактерий в кишечнике. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к белку молока бета-казеину и улучшению баланса полезной кишечной микробиоты у животных. В частности, изобретение относится к молоку и получаемым из молока пищевым продуктам, в составе бета-казеинов которыз преобладает бета-казеин А2 или близкие варианты бета-казеина. Заявитель обнаружил, что потребление молока, содержащего вариант А2 бета-казеина, связано с благоприятными изменениями уровней короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях и, соответственно, положительно влияет на состав кишечной микробиоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кишечная микробиота (или флора кишечника) состоит из сложного сообщества микроорганизмов, которые живут в пищеварительном тракте животных. Один из путей, которыми кишечные микроорганизмы приносят пользу хозяину, заключается в ферментации непереваренных углеводов и последующей выработке короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК, SCFA). Наиболее важными из этих КЦЖК являются уксусная кислота, пропановая кислота и бутановая кислота (иногда их называют ацетатами, пропионатами и бутиратами). Можно сказать в общем, что ацетаты метаболизируются мышечной тканью, пропионаты - печенью, а бутираты - эпителием толстой кишки. КЦЖК составляют приблизительно две трети от концентрации анионов в толстой кишке (70-130 ммоль/л), главным образом в виде ацетата, пропионата и бутирата, и вырабатываются в почти постоянном молярном соотношении 60:25:15. Б числе различных свойств КЦЖК - то, что они легко поглощаются слизистой оболочкой кишечника, имеют высокую калорийность, метаболизируются колоноцитами и эпатоцитами, стимулируют всасывание натрия и воды в толстой кишке (colon) и имеют трофическое значение для слизистой оболочки кишечника. Изучена роль бутирата в питании слизистой оболочки толстой кишки и в профилактике рака толстой кишки за счет стимуляции дифференцировки клеток, задержки клеточного цикла и апоптоза трансформированных колоноцитов, а также ингибирования фермента гистондеацетилазы и уменьшения превращения первичных желчных кислот во вторичные в результате создания кислой среды в толстой кишке. Соответственно, повышенное образование КЦЖК и потенциально повышенное попадание КЦЖК, прежде всего бутирата, в дистальную ободочную кишку может дать защитный эффект.

У всех младенцев первоначально происходит колонизация большим количеством Е. coli и streptococci. В течение первой недели жизни эти бактерии создают восстанавливающую среду, благоприятную для дальнейшего последовательного заселения бактерий видов, принадлежащих к родам Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium и Ruminococcus. В микробиоте детей, вскармливаемых грудным молоком, преобладают бифидобактерии, тогда как микробиота детей, вскармливаемых молочными смесями, показывает тенденцию к большему разнообразию и значительному количеству энтеробактврий, энтерококков, бифидобактерий, бактериоидов и клостридий.

Состав микробиоты остается нестабильным до созревания в возрасте примерно 3-4 лет. Колонизация кишечника дает два основных преимущества. Во-первых, микробиота развивает иммунную систему и повышает толерантность к микробным иммунодетерминантам. Во-вторых, микробиота действует как метаболический орган, который может расщеплять неперевариваемые компоненты пищи, разрушать потенциально токсичные пищевые соединения, такие как оксалаты, и синтезировать некоторые витамины и аминокислоты. У каждого индивидуума есть уникальный микробном, состав которого зависит от генотипа и физиологии хозяина, истории колонизации, факторов окружающей среды, пищи и лекарственных средств (например, антибиотиков).

Состав кишечной флоры также подвержен изменениям во времени и при изменении рациона. Кишечную флору можно изменить, придерживаясь долгосрочного рациона (режима питания). У людей с микробиотой, в которой преобладают бактериоиды (при рационе, основанном на высоком содержании белка и жира), при смене рациона на рацион, основанный в целом на высоких уровнях углеводов, в долгосрочной перспективе может развиться энтеротип Prevotella. Таким образом, долговременные изменения рациона могут дать возможность модулировать энтеротип индивидуума для улучшения здоровья.

В последние несколько десятилетий стало очевидным, что уровни КЦЖК в толстой кишке могут играть ключевую роль в профилактике и лечении метаболического синдрома, расстройств (заболеваний) кишечника и некоторых видов рака.^1-7 В некоторых клинических исследованиях введение КЦЖК положительно влияло на лечение язвенного колита, болезни Крона и диареи, связанной с антибиотиками.^8-13

Молоко, главным образом, коровье, которое потребляют популяции по всему миру, является важным источником белка в рационе человека и, соответственно, влияет на микробиоту кишечника. Обычно коровье молоко содержит приблизительно 30 грамм белка на литр. Казенны составляют самую большую часть (80%) указанного количества белка, а бета-казенны составляют приблизительно 37% казеинов. Последние два десятилетия растет объем данных, указывающих на роль казеиновых белков, особенно бета-казеинов, во многих нарушениях здоровья.

Бета-казенны можно разделить на бета-казеин А1 и бета-казеин А2. Указанные два белка являются преобладающими бета-казеинами в коровьем молоке, потребляемом в большинстве популяций людей. Бета-казеин А1 отличается от бета-казеина А2 одной аминокислотой. В положении 67 в последовательности из 209 аминокислот бета-казеина А1 расположена аминокислота гистидин, а в бета-казеине А2 в том же положении находится пролин. Однако это единственное различие в аминокислотах является критически важным для обеспечения ферментативного расщепления бета-казеинов в кишечнике. Присутствие гистидина в положении 67 обеспечивает образование при ферментативном расщеплении фрагмента белка, известного как бета-казоморфин-7 (БКМ-7), который содержит семь аминокислот. Таким образом, БКМ-7 является продуктом расщепления бета-казеина А1. В случае бета-казеина А2 в положении 67 находится пролин, который мешает расщеплению аминокислотной связи в этом месте. Таким образом, БКМ-7 не является продуктом расщепления бета-казеина А2.

В других вариантах бета-казеина, таких как варианты В, С, F, G и Н, в положении 67 также находится гистидин, тогда как в таких вариантах как A3, D, Е и I, как и в А2, в положении 67 находится пролин. Однако указанные варианты присутствуют только в очень низких количествах или вообще не присутствуют в молоке коров европейского происхождения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «бета-казеин А1» может относиться к любому бета-казеину с гистидином в положении 67, а термин «бета-казеин А2» может относиться к любому бета-казеину, имеющему пролин в положении 67.

БКМ-7 представляет собой опиоидный пептид и может связываться сопиоидными рецепторами и активировать указанные рецепторы во всем организме. БКМ-7 обладает способностью проходить через стенку желудочно-кишечного тракта и поступать в кровоток, что дает ему возможность влиять на системные и клеточные функции через опиоидные рецепторы. Заявитель и другие ранее установили нежелательную связь между потреблением бета-казеина А1, находящегося в молоке или молочных продуктах, и диабетом I типа, ¹⁴ ишемической болезнью сердца,¹⁵ неврологическими расстройствами,¹⁶ воспалением кишечника,¹⁷ симптомами непереносимости лактозы¹⁸ и уровнями глюкозы в крови.¹⁹

В ходе продолжающихся исследований связей между вариантами бета-казеина и биологическим ответом у людей заявитель обнаружил положительную связь между бета-казеином А2 и кишечной микробиотой. Связь основана на профиле КЦЖК фекалий индивидуумов, которые потребляли молоко, содержащее только вариант А2 бета-казеина.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является обеспечение способа улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у человека и других животных, или по меньшей мере обеспечение практически применимой альтернативы существующим способам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у животного путем приема внутрь композиции, содержащей бета-казеин, или путем введения животному композиции, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2, бета-казеин A3, бета-казеин D, бета-казеин Е или бета-казеин I. В предпочтительных вариантах реализации вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2. Количество бета-казеина А2 может представлять собой любое количество в диапазоне от 75% до 100% по массе бета-казеина, например, по меньшей мере 90% или даже 100%.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения улучшение кишечной микробиоты оценивают путем измерения уровней одной или более короткоцепочечных жирных кислот в образце фекалий. Одна или более короткоцепочечных жирных кислот могут быть выбраны из группы, включающей уксусную кислоту, пропановую кислоту и бутановую кислоту или сложный эфир указанной кислты.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения композиция представляет собой молоко или молочный продукт. Молоко может представлять собой свежее молоко, сухое (порошковое) молоко, жидкое молоко, восстановленное из порошка, обезжиренное молоко, гомогенизированное молоко, концентрированное молоко, выпаренное молоко, пастеризованное молоко или непастеризованное молоко. Молочный продукт может представлять собой детскую смесь, сливки, йогурт, творог, сыр, масло, мороженое или любой другой молочный продукт.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложена композиция для улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у животных, которая содержит бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение молока в изготовлении композиции для улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у животных, где молоко содержит бета-казеин и где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ стимуляции роста полезных бактерий в кишечнике животного, включающий прием внутрь животным композиции, содержащей бета-казеин, или введение указанному животному композиции, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стимуляция роста полезных бактерий в кишечнике позволяет избежать или снизить риск возникновения рака, заболеваний печени, системных инфекций, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, ожирения и метаболического синдрома, а также неврологических заболеваний.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая белок бета-казеин и ее применение для улучшения кишечной микробиоты у животных, в частности, у человека. Важно отметить, что указанный бета-казеин преимущественно является вариантом А2 бета-казеина или составляет по меньшей мере 75% по массе всех вариантов бета-казеина, присутствующих в композиции.

Подразумевается, что термин «кишечная микробиота» или «кишечная биота» или «микрофлора кишечника» или «флора кишечника» обозначает сложное сообщество микроорганизмов, которые живут в пищеварительных трактах людей и других животных,

Термин «бета-казоморфин-7» или «БКМ-7» относится к белковому фрагменту Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile, гептапепиду, образующемуся при ферменативном расщеплении вариантов коровьего бета-казеина, у которого в положении 67 аминокислотной последовательности находится гистидин, а не пролин.

Термин «короткоцепочечная жирная кислота» или «КЦЖК» относится к жирной кислоте с алифатическим хвостом, содержащим менее шести атомов углерода, и включает муравьиную кислоту (метановую кислоту), уксусную кислоту (этановую кислоту), пропионовую кислоту, масляную кислоту (бутановую кислоту), изомасляную кислоту (2-метилпропановую кислоту), валериановую кислоту (пентановую кислоту) и изовалериановую кислоту (3-метилбутановую кислоту). Уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота - преобладающие в организме КЦЖК.

Важность преобладания в композиции варианта А2 обусловлена тем фактом, что заявитель показал существование прямой связи между вариантом А2 и благоприятно измененными уровнями определенных КЦЖК в образцах фекалий, полученных от человека. Предполагается, что полученные заявителем данные, говорящие о том, что прием внутрь смеси бета-казеина А1 и бета-казеина А2 не обеспечивает такой же уровень улучшенной кишечной микробиоты, как прием внутрь сопоставимого количества бета-казеина А2 (то есть при отсутствии в рационе бета-казеина А1), связаны, по меньшей мере частично, с образованием ВСМ-7 в кишечнике из бета-казеина А1, но не из бета-казеина А2. ВСМ-7 вызывает воспаление в кишечнике, характеризуется неблагоприятным иммунным ответом и увеличивает время прохождения пищи по кишечнику. Таким образом, ВСМ-7 изменяет среду кишечника и, следовательно, может влиять на микробиоту кишечника, нивелируя пользу молока в качестве продукта питания.

Композиция согласно настоящему изобретению обуславливает полезное изменение уровней бактерий в кишечнике, относящихся к любому одному или нескольким из следующих родов Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium и Ruminococcus.

Высокие уровни некоторых бактерий, например клостридий, обуславливают высокие уровни пропионата, который, как предполагают, участвуют в нарушениях, связанных с развитием нервной системы, таких как аутизм. У индивидуумов с аутизмом часто нарушено переваривание и всасывание углеводов. В некоторых исследованиях получены данные, говорящие о том, что симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта коррелируют с тяжестью аутических симптомов у пациентов, и это связано с изменениями в составе кишечных бактерий.

В микробиоте желудочно-кишечного тракта человека существует сложная экосистема, насчитывающая приблизительно от 300 до 500 видов бактерий. При рождении весь кишечный тракт стерилен. Кишечник младенца сначала колонизируют бактерии матери и бактерии окружающей среды, а потом заселение продолжается при кормлении и других контактах. Известные факторы, влияющие на колонизацию, включают гестационный возраст, способ родов (вагинальные роды либо родоразрешающая операция), режим питания (грудное молоко либо детские смеси), уровень санитарии и воздействие антибиотиков. Для микробиоты кишечника новорожденных характерно низкое разнообразие и относительное преобладание типов Proteobacteria и Actinobacteria. После этого микробиота становится более разнообразной, и начинают преобладать Firmicutes и Bacteroidetes, характерные для микробиоты взрослого человека. К концу первого года жизни бактериологический профиль у каждого ребенка становится индивидуальным. К возрасту 2,5 года микробиота по составу полностью напоминает микробиоту взрослого человека. Этот период созревания микробиоты может быть критическим.

После младенческого возраста состав микрофлоры кишечника остается относительно постоянным до старческого возраста. В микробиоме взрослых описано три различных энтеротипа. В этих различных энтеротипах преобладают Prevotella, Ruminococcus и Bacteroides, и их проявление, по-видимому, не зависит от пола, возраста, национальности и индекса массы тела.

В толстой кишке присутствуют бактерии в концентрациях 10¹²КОЕ/мл, и в их состав входят в основном анаэробы, такие как Bacteroides, Porphyromonas, Bifidobacterium, Lactobacillus и Clostridium, при этом количество аэробных бактерий превышает количество анаэробных бактерий в соотношении от 100 до 1000: 1.

Поскольку основным, если не единственным источником бета-казеинов в рационе большинства популяций людей является молоко или продукты, полученные из молока, и поскольку большая часть потребляемого молока содержит смесь только вариантов А1 и А2 бета-казеина, потребление молока (или продуктов, сделанных из такого молока) с высоким содержанием варианта А2 будет обязательно означать низкое потребление варианта А1. Таким образом, если единственный источник бета-казеина в рационе содержит только вариант А2 и не содержит других вариантов, потребление варианта А1 в рационе устраняют, и, соответственно, можно ожидать, что нежелательное влияние БКМ-7 на здоровье кишечника также будет устранено.

Соответственно, изобретение, описанное в настоящей заявке, основано на снижении или устранении количества бета-казеина в рационе и повышении бета-казеина А2. Это достигают путем обеспечения того, чтобы бета-казеин в пищевых композициях, содержащих бета-казеин, особенно в молоке и молочных продуктах, представлял собой преимущественно или даже исключительно бета-казеин А2, или по меньшей мере один из вариантов бета-казеина, который не дает при расщеплении ВСМ-7.

В идеале 100% бета-казеина в композиции представляет собой бета-казеин А2. Однако здоровье кишечника может улучшить любая композиция, в которой бета-казеин представляет собой преимущественно бета-казеин А2, например, в любом количестве от 75% по массе и до 100%, включа, 80%, 90%, 95%, 98% и 99% по массе, но не ограничиваясь этим.

Композиция согласно настоящему изобретению обычно представляет собой молоко, но может также представлять собой любой полученный из молока продукт, такой как сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое. Композиция может также представлять собой немолочный продукт, содержащий бета-казеин, который получен из молока. Композиция может представлять собой сам бета-казеин, или может быть изготовлена из бета-казеина, при этом бета-казеин может быть в твердой форме, такой как порошок или гранулы, или в форме твердой плитки.

Хотя молоко может быть получено от любого млекопитающего, включая человека, коз, свиней и буйволов, но в предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения молоко представляет собой коровье молоко.

Молоко может быть в форме свежего молока, сухого молока, жидкого молока, восстановленного из порошка, обезжиренного молока, гомогенизированного молока, концентрированного молока, сгущенного молока, пастеризованного молока или не пастеризованного молока, или любой другой форме молока.

Композицию согласно настоящему изобретению применяют в первую очередь для потребления человеком, но следует понимать, что польза для здоровья также относится к некоторым другим животным, таким как кошки, собаки и другие домашние животные.

Данные, подтверждающие возможность реализации настоящего изобретения, приведены в Примере 1, описывающем исследование, в котором пациентам назначали потребление молока, содержащего бета-казенны А1 и А2 (называемого продуктом с бета-казеином А1/А2), и молока, содержащего только бета-казеин А2 (называемого продуктом только с бета-казеином А2). Микробиоту кишечника оценивали путем измерения концентраций в фекалиях уксусной, пропановой и бутановой кислот, а также общих КЦЖК. Результаты представлены в Таблице 2. Результаты дисперсионного анализа ANOVA смешанных эффектов показывают значимые различия между двумя последовательностями молочных продуктов, особенно для уксусной кислоты (Р=0,0052), бутановой кислоты (Р=0,0001) и общего количества КЦЖК (Р=0,0009).

Потребление продукта только с бета-казеином А2 привело к повышению уровней уксусной кислоты и бутановой кислоты (и общих уровней КЦЖК) по сравнению с потреблением продукта, содержащего бета-казеин А1/А2, и по сравнению с исходным уровнем. Напротив, в уровнях пропионовой кислоты никакой разницы не наблюдалось. Считается, что повышенные уровни уксусной и бутановой кислот, но не пропионовой кислоты, указывают на здоровые уровни кишечной микробиоты.

Поскольку уровни КЦЖК, измеренные при потреблении продукта, содержащего А1/А2 бета-казеин, приблизительно совпадают с измерениями на исходном уровне, предполагается, что потребление бета-казеина А2 оказывает положительное влияние на здоровье кишечника, либо же бета-казеин А1 нивелирует положительные эффекты других компонентов молока.

Эти исследования представляют первые четкие научные данные о связи между потреблением бета-казеина А2 и улучшенной кишечной микробиотой. На основании полученных заявителем данных понятно, что следует избегать потребления бета-казеинов, обеспечивающих образование БКМ-7 при расщеплении. В практическом отношении, полезные эффекты согласно настоящему изобретению для больших популяций можно обеспечить, приобретая молоко с содержанием бета-казеина, который преимущественно представляет собой бета-казеин А2, и производя продукты, полученные из этого молока, и обеспечивая доступность такого молока и таких продуктов в целях улучшения, усиления или поддержания здоровья кишечника.

Можно исследовать коровье молоко на соотношение бета-казеина А1 и бета-казеина А2. В качестве альтернативы можно проводить генетическое исследование коров на способность давать молоко, содержащее бета-казеин А1 (или другие варианты, способные образовывать БКМ-7), или проверять их способность давать молоко, содержащее бета-казеин А2 (или другие варианты, не способные образовывать БКМ-7), или их комбинацию. Эти методики являются общеизвестными.

Согласно настоящему изобретению предложено решение, которое сравнительно легко реализовать, а именно, избегать молока или молочных продуктов, которые содержат бета-казеин А1, и обеспечивать присутствие в рационе молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин, который представляет собой преимущественно бета-казеин А2, предпочтительно 100% бета-казеин А2.

Никакая ссылка на документы из уровня техники в настоящем описании не считается признанием того, что такой уровень техники широко известен или является частью общих знаний в этой области.

При использовании в этой заявке слов «содержит», «содержащий» и близких терминов их не следует интерпретировать в исключающем или исчерпывающем смысле. Другими словами, они предназначены для выражения значения «включая, но не ограничиваясь перечисленным».

Ниже настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры. Понятно, что не предполагается, что заявленное изобретение ограничивается указанными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Исследование молока и измерение КЦЖК в фекалиях

Дизайн исследования

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией с поправками, внесенными в Сеуле в 2008 г., и одобрено комитетом по этике Шанхайского общества питания (номер разрешения: SNSIRB №2014 [002]). Исследование зарегистрировано на ClinicalTrials.gov (идентификатор: NCT02406469). Все испытуемые перед включением в исследование дали письменное информированное согласие. Исследование представляло собой одноцентровое, двойное слепое, рандомизированное, контролируемое, 2×2 перекрестное исследование, предназначенное для оценки влияния молока, содержащего только бета-казеин типа А2, по сравнению с молоком, содержащим типа А1 и А2 бета-казеинов, на уровни маркеров иммунного ответа в сыворотке крови в корреляции с симптомами непереносимости. После скринингового визита, на котором испытуемые проходили полное клиническое обследование и качественные анализы на галактозу в моче, отвечающие требованиям испытуемые начали 2-недельный период «промывки». Затем испытуемые 2 недели участвовали в экспериментальном периоде 1, в котором они получали молоко, содержащее только вариант бета-казеина А2 (продукт только с бета-казеином А2) или молоко, содержащее варианты как бета-казеина А1, так и А2 (продукт, содержащий бета-казеин А1/А2) согласно схеме рандомизации. После второго 2-недельного периода «отмывки» испытуемые участвовали в экспериментальном периоде 2, в котором они получали другой молочный продукт. Визиты были запланированы в начале каждого экспериментального периода и на Дни 7 и 14 каждого экспериментального периода. В течение каждого периода «отмывки» с испытуемыми контактировали по телефону. Исследование проводили на кафедре гастроэнтерологии, в госпитале Синь Хуа при медицинском факультете Шанхайского университета Цзяо Тонг (Шанхай, Китай).

Эксперименты

Продукт, содержащий только бета-казеин А2, и продукт, содержащий бета-казеин А1/А2, предоставила компания «А2 инфант нутришн лимитед» (А2 Infant Nutrition Limited) (Окленд, Новая Зеландия), а в исследовательский центр их доставил китайский филиал фирмы SPRIM (Шанхай) (SPRIM China). Персонал китайского филиала фирмы SPRIM переупаковал и нанес маркировку на все продукты, чтобы гарантировать маскирование от исследователей и испытуемых того, какой продукт они получали в каждый экспериментальный период. В каждом экспериментальном периоде испытуемые получили инструкции потреблять 250 мл молока после 2 приемов пищи в день в течение 14 дней. Испытуемые вели дневник, где фиксировали потребление молока и соблюдение указаний в каждом эксперименте. Использованные и неиспользованные упаковки собирали на каждом визите, чтобы оценить соблюдение плана исследования и подтвердить сохранение маскирования. Испытуемых рандомизировали со стратификацией по полу в последовательность 1 (А1/А2→А2) или последовательность 2 (А2->А1/А2) в соответствии с присвоенным номером, вложенным в запечатанный конверт. Номер присваивали на основании сгенерированного компьютером списка, подготовленного китайским филиалом фирмы SPRIM.

Продукт только с бета-казеином А2 содержал (на 100 мл) 271 кДж энергии, 3,1 г белка, 3,6 г жира, 5,0 г углеводов, 48 мг натрия, 150 мг калия и 117 мг кальция. Соотношение бета-казеина А1 к бета-казеину А2 составляло приблизительно 40:60 в продукте, содержащем бета-казеин А1/А2, что было подтверждено высокоэффективной жидкостной хроматографией и масс-спектроскопией. Оба продукта были идентичны и содержали одинаковое количество белка.

Употребление молочных продуктов, отличающихся от предоставленных, во время исследования было запрещено. Во время каждого периода «отмывки» испытуемым разрешали потреблять продукты из искусственного молока, но не коровье молоко.

Испытуемые

Критерии включения были следующими: мужчина или женщина; возраст 25-68 лет; нерегулярное потребление молока (задокументированное с применением опросника о частоте потребления пищи); непереносимость коммерчески доступного молока со слов испытуемого; связанный с пищеварением дискомфорт после потребления молока со слов испытуемого; и нормальные показания электрокардиограммы (ЭЭГ) и артериального давления во время спокойного дыхания. Испытуемых включали в исследование, если они: согласились не принимать никаких лекарственных средств, пищевых добавок или других молочных продуктов, включая ацидофильное молоко, во время исследования; были готовы выполнить все требования и процедуры; дали подписанное информированное согласие; согласились не участвовать в других экспериментальных клинических исследованиях в ходе настоящего исследования; не соответствовали ни одному из критериев исключения; и полностью понимали характер, цель, преимущество и потенциальные риски и побочные эффекты исследования. Испытуемых набирали по объявлениям, размещенным на досках объявлений в общественных больницах. Сводные статистические данные приведены в Таблице 1.

Статистический анализ

Для оценки нормальности непрерывных переменных использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Переменные, не имевшие нормального распределения, подвергали квадратичному или логарифмическому преобразованию, чтобы аппроксимировать нормальное распределение. Параметры на исходном уровне представлены описательно как среднее ± стандартное отклонение (СО) или число (в процентах) испытуемых. Концентрации КЦЖК в фекалиях анализировали с помощью дисперсионного анализа смешанных эффектов, в котором выбранный эксперимент и экспериментальный период включали как фиксированные влияния, а испытуемый был включен как случайное влияние внутри последовательности исследования (то есть последовательность 1, А1/А2→А2; последовательность 2, А2→А1/А2). Чтобы исследовать, существовали ли различия между двумя экспериментами по средним значениям для каждой конечной точки, и менялись ли средние значения во время периодов исследования, применяли критерии III типас фиксированными влияниями, чтобы проверить влияние экспериментов и периодов исследования. Дополнительно, провели контрастные тесты, чтобы сравнить средние значения для каждого продукта. Наличие перекрестного влияния оценивали с использованием взаимодействия Эксперимент × Период. Если это взаимодействие не было статистически достоверным, оценивали данные по обоим периодам. Если взаимодействие было статистически достоверным, использовали только данные экспериментального периода 1.

Биомаркеры КЦЖК в фекалиях

Результаты лабораторных анализов фекалий представлены с 2. Не было отмечено влияния экспериментального периода или последовательности на какой-либо из лабораторных параметров. Однако, исходные значения для всех лабораторных параметров были значимо ковариантны. Как показано в Таблице 2, значимые различия по концентрациям в фекалиях уксусной кислоты (Р=0,0052), бутановой кислоты (Р=0,0001) и общих короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) (Р=0,0009) отсутствовали. Различий по пропионовой кислоте не наблюдалось.

Хотя настоящее изобретение описано посредством примера, следует понимать, что в него могут быть внесены вариации и модификации, не выходящие за пределы объема изобретения, определенного в формуле изобретения. Кроме того, в тех случаях, когда существуют известные эквиваленты конкретных признаков, такие эквиваленты включены так же, как если бы они были отдельно указаны в описании.

Цитируемые источники

1. Hu G. X., Chen G. R., Xu Н., Ge R. S., Lin J., Activation of the AMP activated protein kinase by short-chain fatty acids is the main mechanism underlying the beneficial effect of a high fiber diet on the metabolic syndrome. Med. Hypotheses. 74: 123-126, 2010.

2. Gao Z., Yin J., Zhang J., Ward R. E., Martin R. J., Lefevre M., Cefalu W. Т., Ye J., Butyrate improves insulin sensitivity and increases energy expenditure in mice. Diabetes. 58: 1509-1517, 2009.

3. Donohoe D. R., Garge N., Zhang X., Sun W., O'Connell Т. M., Bunger M. K., Bultman S. J., The microbiome and butyrate regulate energy metabolism and autophagy in the mammalian colon. Cell Metab. 13: 517-526, 2011.

4. Blouin J. M., Penot G., Collinet M., Nacfer M., Forest C, Laurent-Puig P., Coumoul X., Barouki R., Benelli C, Bortoli S., Butyrate elicits a metabolic switch in human colon cancer cells by targeting the pyruvate dehydrogenase complex. Int. J. Cancer. 128: 2591-2601, 2011.

5. Scharlau D., Borowicki A., Habermann N., Hofmann Т., Klenow S., Miene C, Munjal U., Stein K., Glei M., Mechanisms of primary cancer prevention by butyrate and other products formed during gut flora-mediated fermentation of dietary fibre. Mutat. Res. 682: 39-53, 2009.

6. Tang Y., Chen Y., Jiang H., Robbins G. Т., Nie D., G-protein-coupled receptor for short-chain fatty acids suppresses colon cancer. Int. J. Cancer. 128: 847-856, 2011.

7. Hamer H. M., Jonkers D., Venema K., Vanhoutvin S., Troost F. J., Brummer R. J., Review article: the role of butyrate on colonic function. Aliment. Pharmacol. Ther. 27: 104-119, 2008.

8. Binder H. J. 2010. Role of colonic short-chain fatty acid transport in diarrhea. Annu. Rev. Physiol. 72: 297-313.

9. Harig J. M., Soergel К. H., Komorowski R. A., Wood С.M., Treatment of diversion colitis with short-chain-fatty acid irrigation. N. Engl. J. Med. 320: 23-28, 1989.

10. Breuer R. I., Buto S. K., Christ M. L, Bean J., Vernia P., Paoluzi P., Di Paolo M. C, Caprilli R., Rectal irrigation with short-chain fatty acids for distal ulcerative colitis. Preliminary report. Dig. Dis. Sci. 36: 185-187, 1991.

11. Vernia P., Marcheggiano A., Caprilli R., Frieri G., Corrao G., Valpiani D., Di Paolo M. C, Paoluzi P., Torsoli A., Short-chain fatty acid topical treatment in distal ulcerative colitis. Aliment. Pharmacol. Ther. 9: 309-313, 1995.

12. Scheppach W., Treatment of distal ulcerative colitis with short-chain fatty acid enemas. A placebo-controlled trial. German-Austrian SCFA Study Group.Dig. Dis. Sci. 41: 2254-2259, 1996.

13. Di Sabatino A., Morera R., Ciccocioppo R., Cazzola P., Gotti S., Tinozzi F. P., Tinozzi S., Corazza G. R., Oral butyrate for mildly to moderately active Crohn's disease. Aliment.

Pharmacol. Ther. 22: 789-794, 2005.

14. WO 1996/014577

15. WO 1996/036239

16. WO 2002/019832

17. WO 2014/193248

18. WO 2015/005804

19. WO 2015/026245

1. Способ улучшения уровней полезной кишечной микробиоты у животного путем приема внутрь композиции, содержащей бета-казеин, или путем введения животному композиции, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2, бета-казеин A3, бета-казеин D, бета-казеин Е или бета-казеин I.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что бета-казеин содержит по меньшей мере 90% по массе бета-казеина А2.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что бета-казеин содержит 100% бета-казеина А2.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что улучшение микробиоты кишечника оценивают путем измерения уровней одной или более короткоцепочечных жирных кислот в образце фекалий.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что одну или более короткоцепочечных жирных кислот выбирают из группы, включающей уксусную кислоту, пропановую кислоту и бутановую кислоту или сложный эфир указанной кислоты.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанная композиция представляет собой молоко или молочный продукт.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанное молоко представляет собой свежее молоко, сухое молоко, жидкое молоко, восстановленное из порошка, обезжиренное молоко, детскую смесь, гомогенизированное молоко, концентрированное молоко, сгущенное молоко, пастеризованное молоко или непастеризованное молоко.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что молочный продукт представляет собой сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.

12. Способ стимуляции роста бактерий в кишечнике животного, включающий прием внутрь указанным животным композиции, содержащей бета-казеин, или введение указанному животному композиции, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который содержит пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что стимуляция роста бактерий в кишечнике позволяет избежать или снизить риск возникновения одного или более из группы, включающей рак, заболевание печени, системные инфекции, воспалительные и аутоиммунные заболевания, ожирение и метаболический синдром, а также неврологические заболевания.