Способ выявления тромбоцитов на гистологических препаратах

Изобретение относится к медико-биологическим наукам и может быть использовано в медицинской диагностике заболеваний сердечно-сосудистой системы. Способ выявления тромбоцитов на гистологических препаратах включает фиксацию препарата в 10% формалине в течение 24 ч при комнатной температуре, процедуру обезвоживания, заключение в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 микрометров, нанесение их на адгезивные предметные стекла, депарафинизацию в ксилоле, проводку по спиртам понижающей концентрации, промывку в течение 5 мин в 3% водном растворе перекиси водорода при комнатной температуре, экспозицию в течение 5 мин в 0,01 М фосфатно-солевом буфере c рН 7,4, экспозицию препаратов с блокировочным раствором в течение 10 мин при комнатной температуре. При этом после экспозиции гистологических препаратов с блокировочным раствором, его сливают и, не промывая препараты, наносят на них смесь антител к фактору Виллебранда в концентрации 3,3-4,0 мг/л. После чего препараты размещают во влажной камере и инкубируют в термостате. Затем препараты промывают в фосфатно-солевом буфере. Промакивают стекла фильтровальной бумагой. Наносят вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика. Размещают стекла во влажной камере и ставят их в термостат. Наносят на них рабочий раствор 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида, выдерживают, затем промывают препараты в трех сменах дистиллированной воды, обезвоживают препараты в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле и заключают в водорастворимую среду. Далее проводят световую микроскопию. При этом выявляются тромбоциты, окрашенные в коричневый цвет. Способ прост для воспроизведения, может быть использован для исследования архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках, обработки тонких срезов. 1 пр., 1 ил.

 

Изобретение относится к медико-биологическим наукам и может быть использовано в медицинской диагностике заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Тромбоциты являются форменными элементами крови, отвечающими за процесс ее свертываемости. Это пластинки овальной или круглой формы, имеющие гладкую поверхность. Созревают тромбоциты в костном мозге, на что уходит около восьми дней. Приблизительно столько же длится и период их жизнеспособности. Нормальным содержанием тромбоцитов в крови (PLT) считается их разброс по количеству в пределах 150-400×10⁹ клеток/л, то есть 150-400 тысяч в одном миллилитре.

В организме человека тромбоциты выполняют следующие функции:

• формируют первичный тромб при повреждении целостности кровеносных сосудов;

• участвуют в реакциях фагоцитоза (снижая риск инфицирования при повреждении сосуда);

• участвуют в стабилизации тромба;

• ускоряют реакции свертывания крови;

• участвуют в дальнейшем растворении тромба.

Согласно новейшим исследованиям, тромбоциты также принимают участие в процессе восстановления и заживления поврежденных тканей [Климовицкий В.Г., Соловьев И.А. Применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, в лечении повреждений мягких и костных тканей. Травма, 2015, т. 16, №6, с. 77-80]. Механизм их действия обусловлен способностью выделять специфические белковые молекулы (факторы роста), которые усиливают процессы роста и деления клеток.

Основным свойством тромбоцитов является их участие в процессе свертывания крови. К другим свойствам тромбоцитов относятся также адгезия (прилипание к поверхности) и адсорбция (осаждение) на поверхности.

Кровеостанавливающая функция этих клеток обеспечивается за счет их способности склеиваться друг с другом (агрегировать). При нормальных физиологических условиях это свойство тромбоцитов способствует поддержанию гомеостаза организма и препятствует большим кровопотерям. В условиях развития патологии в системе свертывания крови могут происходить сбои, в результате чего в сосудистом русле могут возникать тромбы.

Отклонения от нормального уровня тромбоцитов в крови может приводить к различным патологиям. Так, при снижении уровня тромбоцитов (тромбоцитопения) до показателя менее 150×10⁹ клеток/л крови может сопровождать заболевания крови или проявляться как отдельная патология, чаще аутоиммунного характера. К ее причинам относят нарушение процесса выработки тромбоцитов и их ускоренное разрушение.

Болезни, сопровождающиеся тромбоцитопенией:

• тромбоцитопеническая пурпура, при которой у человека начинают синтезироваться белковые антитела, разрушающие собственные здоровые тромбоциты. Летальный исход маловероятен;

• синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, при котором у человека наблюдаются сбои в процессе свертывания крови. Высокая вероятность формирования тромба в кровеносных сосудах различных органов и внутреннего кровотечения. Заболевание представляет большую опасность для жизни пациента, поэтому требует немедленной медицинской помощи;

• врожденные тромбоцитопении;

• лекарственные тромбоцитопении;

• спленомегалии;

• апластические анемии и миелофтизы;

• пароксизмальные ночные гемоглобинурии и т.д.

Обратное состояние, когда уровень тромбоцитов в крови превышает референсные значения, называется тромбоцитоз. Первичная форма тромбоцитоза характерна для людей, чей возраст более 60 лет. В костном мозге у человека вырабатывается избыточное количество тромбоцитов с нарушением морфологии и функциональной активности. Тромбоциты начинают скапливаться в сгустки, которые препятствуют нормальному току крови по сосудам. Причины патологии окончательно не установлены. Предполагается, что данное заболевание возникает в результате мутации в гене. Последствия: инсульт, инфаркт и кровотечения органов пищеварения.

У детей чаще наблюдается вторичный тромбоцитоз. При этом костный мозг функционирует правильно, однако количество клеток крови изменяется ввиду другого заболевания.

Болезни, сопровождающиеся тромбоцитозом:

• онкопатология желудка, легких или яичников. Клетки злокачественного новообразования способны синтезировать вещества, усиливающие образование тромбоцитов в костном мозге;

• инфекционные заболевания;

• переломы;

• хирургическое вмешательство.

Кроме того, известно, что повышенное содержание тромбоцитов в крови может способствовать развитию туберкулеза, ревматизма, язвенного колита и других заболеваний.

Таким образом, высока актуальность использования методов оценки количества тромбоцитов, необходимых для нормального баланса свертывающей и противосвертывающей систем крови.

При изучении механизмов и временных параметров свертывания можно использовать следующие методические подходы:

1. наблюдение за временем кровотечения;

2. анализ крови, взятой у испытуемого/пациента;

3. взятие гистологического материала и его исследование;

4. наблюдение за тромбом в реальном времени с использованием микроскопии или ядерного магнитного резонанса.

У человека для изучения процессов свертывания крови наиболее подходящими методами стоит считать 2 и 3. Первый метод не подходит в связи с возможным летальным исходом при больших кровопотерях.

Четвертый метод также не подходит в связи с огромной трудоемкостью и материальными затратами. Этот метод используется при изучении свертывания крови у животных в условиях тромбообразования, искусственно вызванного нарушением целостности сосудов (Shahrokh Falati, Peter Gross, Glenn Merrill-Skoloff, Barbara C. Furie, Bruce Furie. (2002). Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med. 8, 1175-1180).

Второй метод широко представлен в клинической практике. Существуют три способа определения количества тромбоцитов в крови:

1) Подсчет тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазовоконтрастной приставкой. Коэффициент вариации 25-30%.

2) Подсчет тромбоцитов в мазке крови (по Фонио), коэффициент вариации 10-15%. Достоинство - возможность оценить морфологические особенности тромбоцитов.

3) Определение количества тромбоцитов на гематологическом анализаторе, коэффициент вариации 4-10%.

Также существует, по меньшей мере, два способа оценки скорости агрегации тромбоцитов. Это исследование по Ли-Уайту и анализ по Сухареву.

Третий метод изучения состояния тромбоцитарного свертка - на гистологических срезах - активно не используется, так как имеет ряд существенных ограничений. В литературе нет доступных методик для выявления тромбоцитов в массиве гистологического материала. Эти клетки плохо окрашиваются доступными гистологическими красителями, что затрудняет их визуализацию и оценку. И тем не менее в ряде случаев, связанных с посмертной или прижизненной диагностикой тромбозов сосудов у человека, возникает необходимость изучения архивного или операционного гистологического материала с целью визуализации и оценки состояния тромбоцитов в русле фиксированных сосудов.

Для этих целей ними был разработан новый способ иммуноцитохимического выявления тромбоцитов на гистологических срезах.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Материал для исследования фиксируют в 10% формалине или цинк-этанол-формальдегиде в течение 24 ч при комнатной температуре. Обезвоживают и заливают материал в парафин любым из рекомендованных для иммуноцитохимических исследований способов. Из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы толщиной от 5 до 10 микрометров и наклеивают их на предметные стекла с заранее нанесенным адгезивным покрытием, например, Histo Bond (Marienfeld, Германия).

2. Удаляют из срезов парафин и регидратируют их обычным способом.

3. Предметные стекла со срезами переносят в стаканчик с 3% водным раствором перекиси водорода и оставляют там на 5 мин при комнатной температуре.

4. Срезы помещают в стаканчик с 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4 на 5 мин при комнатной температуре. Буферный раствор может быть приготовлен из таблетированной формы.

5. Аккуратно промакивают фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов для образования сухого поля и обводят срезы гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.), не допуская высыхания срезов.

6. Наносят на срезы блокировочный раствор, например, Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставляют при комнатной температуре на 10 мин.

7. Сливают излишек блокировочного раствора и, не промывая препараты, наносят на срезы смесь антител к фактору Виллебранда, например, (А008202, Agilent, США), в концентрации 3,3-4,0 мг/л. Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Размещают стекла во влажной камере (например, в квадратные чашки Петри 100×100 мм, SARSTEDT: 82.9923.422, Австралия) и ставят их в термостат 40°С на 60 мин. Перед началом инкубации в каждую влажную камеру необходимо налить примерно по 5-10 мл дистиллированной воды. В качестве подставок под предметные стекла можно использовать крышки от пластиковых чашек Петри для предотвращения контакта предметных стекол с водой.

8. Промывают препараты в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 в течение 10 мин.

9. Аккуратно промакивают стекла фильтровальной бумагой, после чего наносят вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика, например, реагент HRP Polymer из набора UltraVision Quanto Detection system (Thermo Scientific, США). Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Стекла размещают во влажной камере и ставят их в термостат при температуре 27°С на 20 мин.

10. Промывают препараты в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 в течение 10 мин.

11. Аккуратно промакивают стекла фильтровальной бумагой и наносят рабочий раствор 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида, например, DAB2-Component (Spring Bioscience, США). В течение 1-3 мин происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции. Этот процесс необходимо контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона.

12. Смывают раствор хромогена и промывают препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 5 мин в каждой.

13. При необходимости препараты подкрашивают гематоксилином.

14. Обезвоживают препараты в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле обычным образом.

15. Заключают препараты в заключающую среду, например, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды.

При проведении световой микроскопии иммунопозитивные структуры, содержащие тромбоциты, окрашиваются в коричневый цвет.

В качестве примера приведена микрофотография вены крупного калибра сердца крысы (фиг. 1), полученная с помощью заявленного способа. В просвете вены видны многочисленные тромбоциты, окрашенные в темно-коричневый цвет. Иммуногистохимическая реакция на фактор Виллебранда, визуализация с помощью ДАБ. Увеличение ок 10×, об 40×.

Метод прост для воспроизведения, может быть использован для исследования архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках, обработки тонких срезов.

Способ выявления тромбоцитов на гистологических препаратах, включающий фиксацию препарата в 10% формалине в течение 24 ч при комнатной температуре, процедуру обезвоживания, заключение в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 микрометров, нанесение их на адгезивные предметные стекла, депарафинизацию в ксилоле, проводку по спиртам понижающей концентрации, промывку в течение 5 мин в 3% водном растворе перекиси водорода при комнатной температуре, экспозицию в течение 5 мин в 0,01 М фосфатно-солевом буфере c рН 7,4, экспозицию препаратов с блокировочным раствором в течение 10 мин при комнатной температуре, отличающийся тем, что после экспозиции гистологических препаратов с блокировочным раствором, его сливают и, не промывая препараты, наносят на них смесь антител к фактору Виллебранда в концентрации 3,3-4,0 мг/л, после чего препараты размещают во влажной камере и инкубируют в термостате при температуре 40°С в течение 60 мин, затем препараты промывают в 0,01 М фосфатно-солевом буфере c рН 7,4 в течение 10 мин, промакивают стекла фильтровальной бумагой, наносят вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика, размещают стекла во влажной камере и ставят их в термостат при температуре 27°С на 20 мин, затем снова промывают их в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН 7,4 в течение 10 мин, после чего промакивают стекла фильтровальной бумагой, наносят на них рабочий раствор 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида, выдерживают в течение 1-3 мин, затем промывают препараты в трех сменах дистиллированной воды по 5 мин в каждой, обезвоживают препараты в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле и заключают в водорастворимую среду, далее проводят световую микроскопию, при этом выявляются тромбоциты, окрашенные в коричневый цвет.