Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения



Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
C07K2317/23 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2771964:

ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. (US)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α человека. Антитело способно связываться с внеклеточными доменами v1 и v2 полипептида SIRP–α. Также предложены конъюгаты, полинуклеотид, вектор экспрессии и клетка–хозяин, относящиеся к указанному антителу. Кроме того, изобретение относится к способам лечения или замедления прогрессирования рака, аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания. Изобретение позволяет эффективно индуцировать фагоцитоз опухолевых клеток макрофагами, активировать дендритные клетки и ингибировать рост опухоли in vivo при обработке анти–SIRP–α антителами. 9 н. и 50 з.п. ф-лы, 86 ил., 31 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/397752, поданной 21 сентября 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/515480, поданной 5 июня 2017, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ПОДАЧА ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

[0002] Содержание следующего поданного текстового файла ASCII в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки: машиночитаемая форма (МЧФ) Перечня последовательностей (название файла: 757972000140SEQLIST.txt, дата записи: 20 сентября 2017 г., размер: 411 Кбайт).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, которые связывают внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба, а также к полинуклеотидам, векторам, клеткам–хозяевам и способам, имеющим к ним отношение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Сигнал–регуляторный белок альфа (SIRP–α) является частью семейства рецепторов клеточной поверхности, которые играют важную роль в регуляции иммунной системы (смотрите, например, Barclay, A.N. and Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol, 6:457–64). SIRP–α экспрессируется на поверхности различных клеток, включая лейкоциты, такие как дендритные клетки, эозинофилы, нейтрофилы и макрофаги. SIRP–α содержит внеклеточный домен, который взаимодействует с внешними стимуляторами, такими как лиганды, и внутриклеточный домен, который опосредует ряд внутриклеточных сигналов.

[0005] Одной из основных ролей SIRP–α является регуляция иммунного ответа посредством взаимодействия с CD47. CD47 экспрессируется на поверхности ряда типов клеток. Когда домен IgSF CD47 связывает внеклеточный домен (например, домен D1) SIRP–α, экспрессируемого на иммунной клетке (например, макрофаге), это приводит к передаче SIRP–α–опосредованного сигнала в иммунную клетку, что предотвращает фагоцитоз CD47–экспрессирующей клетки. Таким образом, CD47 служит для передачи так называемого «не ешь меня»–сигнала иммунной системе, что предотвращает фагоцитоз здоровых клеток (смотрите, например, WO2015/138600 и Weiskopf, K. et al. (2013) Science 341:88–91). Однако также было показано, что CD47 экспрессируется на высоких уровнях при ряде раков, и считается, что его взаимодействие с SIRP–α в этом контексте позволяет опухолям имитировать здоровый «не ешь меня»–сигнал, чтобы избежать иммунологического надзора и фагоцитоза макрофагами (смотрите, например, Majeti, R. et al. (2009) Cell 138:286–99; Zhao, X.W. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:18342–7). Следовательно, существует высокая потребность в антителах, которые блокируют это взаимодействие.

[0006] Известно, что SIRP–α является высокополиморфным белком в организме людей, обезьян и мышей. Например, была выявлена 20–аминокислотная разница между белками SIRP–α в линиях мышей NOD и C57BL/6, и эти полиморфизмы приводят к функциональным последствиям, связанным со связыванием CD47 и прививанием человеческих гемопоэтических стволовых клеток в этих линиях мышей. У людей было идентифицировано по меньшей мере 10 разных аллелей гена SIRPΑ (Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313–23, Zhao, X. et al. (2011), PNAS. 108:18342–47; van der Heijden, J. (2014). Genetic variation in human Fc gamma receptors: Functional consequences of polymorphisms and copy number variation (Doctoral dissertation) (докторская диссертация по теме «Генетическая вариация в человеческих Fc–гамма–рецепторах: функциональные последовательности полиморфизмов и вариации числа копий»)).

[0007] Из–за важности взаимодействия SIRP–α–CD47 для нормальной иммунной функции и онкогенеза, а также полиморфной природы SIRP–α и существования других рецепторов семейства SIRP, выявление антител, имеющих разную специфичность связывания и внутри– и/или межвидовую перекрестную реактивность, представляет большой интерес для разработки клинических кандидатных средств, являющихся эффективными для людей, и изучения характеристик этих кандидатных средств в различных животных моделях. Таким образом, существует необходимость как в поисковых инструментах, так и в потенциальных клинических кандидатах, которые модулируют функцию SIRP–α, например, его взаимодействие связывания с CD47. Также существует необходимость в способах выделения антител с разной специфичностью связывания SIRP–α и действием на связывание CD47–SIRP–α, для понимания и эффективного нацеливания на это взаимодействие.

[0008] Все цитируемые в данном документе ссылки, включая патентные заявки, патентные публикации, непатентную литературу и номера доступа в UniProtKB/Swiss–Prot, в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки, как если бы каждая отдельная ссылка была специально и отдельно указана как включенная посредством ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Чтобы удовлетворить эти и другие потребности, в данном документе предложены, помимо прочего, выделенные антитела, которые связывают внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHF

PRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELS VRAKPS (SEQ ID NO:5). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFP RVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRA KPS (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHF PRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELS VRAKPS (SEQ ID NO:5), и связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFP

RVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации каждый из трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α содержит внеклеточный домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6 и 76–83. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации обезьяний полипептид SIRP–α представляет собой полипептид SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) по меньшей мере двух разных обезьяньих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, внеклеточный домен полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных мышиных вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен одного или более мышиных полипептидов SIRP–α, и при этом каждый из одного или более мышиных полипептидов SIRP–α содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7–10. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело не связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело не связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–β, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–β, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–γ, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации антитело модулирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой лейкоцит, выбранный из группы, состоящей из макрофага, дендритной клетки, нейтрофила, эозинофила и миелоидной супрессорной клетки (МСК). В некоторых вариантах реализации антитело ингибирует сигнализацию SIRP–α в макрофаге, экспрессирующем человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело усиливает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации антитело не связывает комплекс, содержащий вариант D1 SIRP–α, связанный с доменом IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, по меньшей мере в 10 раз большей, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47. В некоторых вариантах реализации антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации антитело связывает комплекс, содержащий вариант D1 SIRP–α, связанный с доменом IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, по меньшей мере в 10 раз большей, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывает по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела S130. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α, обезьяньего полипептида SIRP–α и по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела, выбранного из группы, состоящей из S8, S13, S14 и S121. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывается или связывается со сниженной аффинностью по меньшей мере с одним из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела S137. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывает мышиный полипептид SIRP–α; и при этом антитело не связывает по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела, выбранного из группы, состоящей из S128. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, обезьяньего полипептида SIRP–α и по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело не связывает мышиный полипептид SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела, выбранного из группы, состоящей из S9, S11, S119, S120, S122 и S135. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α и внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных обезьяньих вариантных полипептидов SIRP–α, и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR; последовательность вариабельного домена тяжелой цепи; и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи из антитела, выбранного из группы, состоящей из S115, S116, S117 и S118. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142.

[0010] В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 115 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 115 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 116 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 116 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 117 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 117 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 118 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 118 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 119 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 119 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 120 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 120 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 121 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 121 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 122 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 122 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 123 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 123 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 126 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 126 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 128 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 128 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 130 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 130 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 135 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 135 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 137 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 137 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 138 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 138 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 1 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 1 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 2 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 2 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 8 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 8 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 9 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 9 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 11 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 11 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 12 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 12 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 13 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 13 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 14 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 14 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VH–домену антитела 21, 25, 27 или 66 (например, приведенному в таблице 2), и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична VL–домену антитела 21, 25, 27 или 66 (например, приведенному в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 116, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 93. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:117, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:94. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 118, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:95. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 119, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:335, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:97. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 121, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:98. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 122, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 99. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 123, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 124, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:101. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 125, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 126, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 127, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 128, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 105. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 129, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 130, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 107. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 108, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:85. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 109, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 110, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:87. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 111, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:88. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 112, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:89. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 113, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 114, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 91. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:115, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO:92. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 135, 137, 139 или 141, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 136, 138, 140 или 142.

[0011] В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:227 или 230, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:228 или 231, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:229; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:232, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:233, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:234. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:219 или 235, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:236 или 238, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:237; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:239, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:240, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:241. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSFSX1X2AM3, где X1 представляет собой N или I; X2 представляет собой F или Y; и X3 представляет собой T или S (SEQ ID NO: 185); (b) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGX4X5DTYYADSVKG, где X4 представляет собой S или A, а X5 представляет собой G или D (SEQ ID NO: 186); (c) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVX6WSGDFFDY, где X6 представляет собой S или G (SEQ ID NO: 187); (d) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVX7X8DX9A, где X7 представляет собой K или R; X8 представляет собой N или S; и X9 представляет собой L или I (SEQ ID NO: 188); (e) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AAX10X11RX12T, где X10 представляет собой R или S; X11 представляет собой I или S; и X12 представляет собой E или D (SEQ ID NO: 189); и (f) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 119 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из последовательностей вариабельного домена SEQ ID NO:335 и 97 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 335 и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:97). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 135 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из последовательностей вариабельного домена SEQ ID NO:127 и 104 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 127 и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 104). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из последовательностей вариабельного домена SEQ ID NO:97, 104, 120, 335 и 127 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:335 и 127 и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:97 и 104). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 143–148 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 143–145, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 146–148). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:148–153 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 149–151, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 152, 153 и 148). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 136 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 155–160 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO:155–157, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 158–160). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 21 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:161–166 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO:161–163, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO:164–166). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 25 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 161, 163, 168 и 170–172 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 161, 168 и 163, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 170–172). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 27 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 163, 173, 174 и 176–178 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO:163, 173 и 174, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO:176–178). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 66 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 162, 163, 179 и 182–184 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 162, 163 и 179, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 182–184). В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143, 202, 204 или 205, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, 203 или 206, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145 или 207; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146 или 208, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147 или 209, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148 или 210. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:149, 211, 213 или 214, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:150, 212 или 215, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:151 или 216; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152 или 217, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:153 или 218, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155, 219, 221 или 222, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156 , 220, или 223, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:157 или 224; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158 или 225, HVR–12, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159 или 226, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:161, 191 или 194, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, 192 или 195, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163 или 193; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:161, 191 или 194, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:168, 196 или 197, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163 или 193; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:171, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:172. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, 198 или 200, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, 199 или 201, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163 или 193; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 177, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178. В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:170, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:171, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 177, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 3 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:242; и/или (b) VL–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:243. В некоторых вариантах реализации антитело содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из антитела 45 (например, приведенных в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) VH–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:244; и/или (b) VL–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:245. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:164, 170, 176 или 182; HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183; и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183, HVR–L3, и содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183; и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182; HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:165, 171, 177 или 183; и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации одна, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR определены по Kabat. В некоторых вариантах реализации одна, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR определены по Chothia. В некоторых вариантах реализации одна, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR определены по IMGT. В некоторых вариантах реализации антитело содержит последовательности HVR, определенные по двум или более из систем Kabat, Chothia и IMGT (например, антитело содержит одну или более последовательностей HVR, определенных согласно одному определению границ, и одну или более последовательностей HVR, определенных согласно другому определению границ).

[0012] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность NFAMT (SEQ ID NO: 175), NFAVT (SEQ ID NO:204) или NFALT (SEQ ID NO:305), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGSGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 144), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVSWSGDEFDY (SEQ ID NO: 145); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVKNDLA (SEQ ID NO: 146), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AAR1RET (SEQ ID NO: 147), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQY YDWPPFT (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120, 335, 246, 258 или 327; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:97 или 312. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:246, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:258, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:335, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:327, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:246, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:258, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:335, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3I2; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:327, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312.

[0013] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность IYAMS (SEQ ID NO:269), IYAVS (SEQ ID NO:213) или IYALS (SEQ ID NO:306), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 150), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVGWSGDFFDY (SEQ ID NO:151); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVRSDIA (SEQ ID NO: 152), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AASSRDT (SEQ ID NO: 153), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:341, 247, 259 или 328; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104 или 248. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:247, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:259, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:328, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:247, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:259, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:328, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248.

[0014] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий: (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность X1X2DX3N, где X1 представляет собой S или T; X2 представляет собой Y или S; а X3 представляет собой M, L или V (SEQ ID NO:307); (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность LISGSGETX1YYADSVKG, где X1 представляет собой I или T (SEQ ID NO:308); и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность EX1X2X3YRFFDX4, где Х1 представляет собой N или D; X2 представляет собой N или D; X3 представляет собой R или M; а X4 представляет собой D или Y (SEQ ID NO:309); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) содержащий: (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RAX1QSVYX2YLA, где X1 представляет собой S или D; а X2 представляет собой T или S (SEQ ID NO:310); (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность X1 AX2X3RAX4, где X1 представляет собой G, A или D; X2 представляет собой S или R; X3 представляет собой S, N или T; а X4 представляет собой T или A (SEQ ID NO:311); и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SYDMN (SEQ ID NO:270), SYDVN (SEQ ID NO:221) или SYDLN (SEQ ID NO:313), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность L1SGSGE1IYY ADSVKG (SEQ ID NO: 156), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ENNRYRFFDD (SEQ ID NO: 157); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQSVYTYLA (SEQ ID NO: 158), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность GASSRAT (SEQ ID NO: 159), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 249, 133, 260 или 329; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, 250 или 251. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134: VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 251.

[0015] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело содержит: вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность X1X2AX3S, где X1 представляет собой S или T; X2 представляет собой N, Y, H или D; а X3 представляет собой M, L или V (SEQ ID NO:297); последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, где X1 представляет собой A или S; X2 представляет собой G, S или отсутствует; X3 представляет собой S, D или G; X4 представляет собой G или S; X5 представляет собой D, S или G; X6 представляет собой T или A; X7 представляет собой P, G, V, I, A или S; X8 представляет собой A, D или G; а X9 представляет собой V или M (SEQ ID NO:298); и последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий: последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGX1X2 X3SX4YYX5, где X1 представляет собой D, G, S, I или отсутствует; X2 представляет собой S, W, G, Y, D или отсутствует; X3 представляет собой S, Y, T или D; X4 представляет собой Η, T, S, или Y; а X5 представляет собой G или A (SEQ ID NO:299); последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDX1X2RPX3, где X1 представляет собой D или N; X2 представляет собой E, K или Q; а X3 представляет собой S или P (SEQ ID NO:300); и последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность X1X2YDX3X4X5YX6NX7, где X1 представляет собой G или A; X2 представляет собой G или A; X3 представляет собой G, Y, Q, S или A; X4 представляет собой S, R или T; X5 представляет собой T или S; X6 представляет собой A, I, V, L или T; а X7 представляет собой T, A, D или P (SEQ ID NO:301). В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело содержит: вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий: последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SX1AX2S, где X1 представляет собой N или Y; и где X2 представляет собой M, L, или V (SEQ ID NO:302); последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, где X1 представляет собой A или S; X2 представляет собой G или отсутствует; X3 представляет собой S или G; X4 представляет собой P, G, или V; а X5 представляет собой A или D (SEQ ID NO:303); и последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий: последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGX1YSSYYYA, где X1 представляет собой S или A (SEQ ID NO:304); последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336); и последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSS YTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271) или SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISAGGSDTY YPASVKG (SEQ ID NO: 195), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 135, 263, 264 или 330. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SNAMS (SEQ ID NO:194), SNAVS (SEQ ID NO:271) или SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO: 197), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 137, 265, 266 или 331. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO:272) или SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISSGGDTY YVDSVKG (SEQ ID NO:201), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:139, 267, 268 или 332. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит последовательность FW1–HVR–L1–FW2–HVR– L2–FW3–HVR–L3–FW4 (от N–конца к C–концу), где FW1 содержит аминокислотную последовательность SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO:314), FW2 содержит аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPVTLTY (SEQ ID NO:315), FW3 содержит аминокислотную последовательность NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO:316), а FW4 содержит аминокислотную последовательность FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:317). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 252. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:262. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:268, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:268, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262.

[0016] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 и K96 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 и K96 в соответствии с SEQ ID NO: 296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 и R95 в соответствии с SEQ ID NO: 296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 и R95 в соответствии с SEQ ID NO:296.

[0017] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в K11, A42, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в I7, P9, D10, K11, S12, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO: 296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 и A116 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в L14, T88, Y90, S106, S113 и A116 и человеческого SIRP–α v1 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в L14, T26 и T28 в соответствии с SEQ ID NO:296.

[0018] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из E47, L48, P58, R59, T82 и A84 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в E47, L48, P58, R59, T82 и A84 в соответствии с SEQ ID NO: 296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 и P83 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 и P83 человеческого SIRP–α v1 в соответствии с SEQ ID NO: 296.

[0019] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2 и домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен полипептида SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен мышиного полипептида SIRP–α.

[0020] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ и/или связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v1 и домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен полипептида SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен мышиного полипептида SIRP–α.

[0021] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 119, 120, 121, 122, 21, 25, 27, 66 и 135. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; (b) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:98; (c) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107; (d) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:99; (e) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; (f) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (g) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (h) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; или (i) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.

[0022] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 136 и 137. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; или (b) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105.

[0023] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 3, 213, 173 и 209. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:242, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:243; (b) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276; (c) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279; или (d) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281.

[0024] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 115, 116, 117, 118 и 132. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:116, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:93; (b) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94; (c) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95; (d) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:96; или (e) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:282, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:283.

[0025] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, выбранного из группы, состоящей из антител 218, 123, 149, 161, 162 и 194. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285; (b) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100; (c) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287; (d) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289; (e) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291; или (f) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293.

[0026] В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела 45. В других аспектах в данном документе предложено выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α (например, домен D1), при этом антитело конкурирует за связывание внеклеточного домена человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:244, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:245.

[0027] В некоторых вариантах реализации любого из вышеприведенных вариантов реализации антитело усиливает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело усиливает активацию дендритной клетки, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело ингибирует in vivo рост опухоли, которая экспрессирует CD47. В некоторых вариантах реализации антитело не предотвращает взаимодействия между CD47–экспрессирующей клеткой и Т–клеткой.

[0028] В некоторых вариантах реализации любого из вышеприведенных вариантов реализации антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой scFv–Fc, однодоменное антитело, антитело из одной тяжелой цепи или антитело из одной легкой цепи. В некоторых вариантах реализации антитело содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, 326 или 426. В некоторых вариантах реализации антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 320–324. В некоторых вариантах реализации антитело содержит Fc–область. В некоторых вариантах реализации Fc–область представляет собой человеческую Fc–область, выбранную из группы, состоящей из Fc–области IgG1, Fc–области IgG2 и Fc–области IgG4. В некоторых вариантах реализации Fc–область содержит Fc–область человеческого IgG1, содержащую одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из L234A, L235A, L235E, G237A и N297A в соответствии с нумерацией EU. В некоторых вариантах реализации Fc–область содержит Fc–область человеческого IgG2, содержащую одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из A330S, P331S и N297A в соответствии с нумерацией EU. В некоторых вариантах реализации Fc–область содержит Fc–область человеческого IgG4, содержащую одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S228P, E233P, F234V, L235A, L235E, delG236 и N297A в соответствии с нумерацией EU. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из фрагментов Fab, F(ab')2, Fab'–SH, Fv и scFv. В некоторых вариантах реализации антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом или меткой.

[0029] В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, и второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, экспрессируемый раковой клеткой. В некоторых вариантах реализации антиген, экспрессируемый раковой клеткой, выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop–2, 5T4, EphA4, BCMA, муцина 1, муцина 16, PD–L1, PTK7, STEAP1, рецептора эндотелина B, мезотелина, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, нектина 4, NaPi2b, LIV–1A, гуанилил циклазы C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, интегрина αVβ3, интегрина α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, тенасцина, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, муцина, CAIX, EPHA3, фолатного рецептора α, GD2, GD3 и ГКГС/пептидного комплекса, содержащего пептид из NY–ESO–1/LAGE, SSX–2, белка семейства MAGE, MAGE–A3, gp100/pmel17, Melan–A/MART–1, gp75/TRP1, тирозиназы, TRP2, CEA, PSA, TAG–72, незрелого рецептора ламинина, MOK/RAGE–1, WT–1, SAP–1, BING–4, EpCAM, MUC1, PRAME, сурвивина, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART–2, p53, Ras, β–катенина, TGF–βRII, HPV E6 или HPV E7. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой куриное, гуманизированное, химерное или человеческое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело вырабатывается в организме курицы или получено из него.

[0030] Дополнительно в данном документе предложены полинуклеотиды, содержащие антитело в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации. Дополнительно в данном документе предложены векторы, содержащие полинуклеотид в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации. Дополнительно в данном документе предложены клетки–хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации. Дополнительно в данном документе предложены способы получения антитела, включающие культивирование клетки–хозяина в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации так, чтобы она вырабатывала антитело. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают выделение антитела из клетки–хозяина.

[0031] Дополнительно в данном документе предложены способы лечения или замедления прогрессирования рака у индивида, включающие введение индивиду эффективного количества антитела в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают введение индивиду эффективного количества второго антитела, в некоторых вариантах реализации второе антитело связывает антиген, экспрессируемый раковой клеткой. В некоторых вариантах реализации антиген, экспрессируемый раковой клеткой, выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop–2, 5T4, EphA4, BCMA, муцина 1, муцина 16, PTK7, STEAP1, рецептора эндотелина B, мезотелина, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, нектина 4, NaPi2b, LIV–1A, гуанилил циклазы C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, интегрина αVβ3, интегрина α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, тенасцина, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, муцина, CAIX, EPHA3, фолатного рецептора α, GD2, GD3 и ГКГС/пептидного комплекса, содержащего пептид из NY–ESO–1/LAGE, SSX–2, белка семейства MAGE, MAGE–A3, gp100/pmel17, Melan–A/MART–1, gp75/TRP1, тирозиназы, TRP2, CEA, PSA, TAG–72, незрелого рецептора ламинина, MOK/RAGE–1, WT–1, SAP–1, BING–4, EpCAM, MUC1, PRAME, сурвивина, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART–2, p53, Ras, β–катенина, TGF–βRII, HPV E6 или HPV E7. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают введение индивиду эффективного количества иммунотерапевтического агента. В некоторых вариантах реализации иммунотерапевтический агент содержит второе антитело. В некоторых вариантах реализации второе антитело связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из PD–1, PD–L1, OX40, CTLA–4, GD137/4–1BB, TNFR2, B7–H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM–3, LAG–3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, аргиназы, TDO и PVRIG. В некоторых вариантах реализации первое антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v2 или внеклеточные домены как человеческого полипептида SIRP–α v1, так и человеческого полипептида SIRP–α v2 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ, при этом первое антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, а второе антитело связывается с PD–1. В некоторых вариантах реализации первое антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α, при этом первое антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, а второе антитело связывается с PD–1. В некоторых вариантах реализации первое антитело связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ, при этом первое антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, а второе антитело связывается PD–L1. В некоторых вариантах реализации первое антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α, при этом первое антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, а второе антитело связывается с PD–L1.

В некоторых вариантах реализации индивид является человеком.

[0032] Дополнительно в данном документе предложены способы лечения или замедления прогрессирования аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания у индивида, включающие введение индивиду эффективного количества антитела в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации. В некоторых вариантах реализации аутоиммунное заболевание или воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из множественного склероза, ревматоидного артрита, спондилоартропатии, системной красной волчанки, антителоопосредованного воспалительного или аутоиммунного заболевания, болезни «трансплантат против хозяина», сепсиса, диабета, псориаза, псориатического артрита, атеросклероза, синдрома Шегрена, прогрессирующего системного склероза, склеродермы, острого коронарного синдрома, ишемической реперфузии, болезни Крона, язвенного колита, эндометриоза, гломерулонефрита, нефропатии IgA–типа, поликистозной болезни почек, миастении гравис, идиопатического легочного фиброза, астмы, атопического дерматита, острого респираторного дистресс–синдрома (ОРДС), васкулита и воспалительного аутоиммунного миозита. В некоторых вариантах реализации индивид является человеком.

[0033] Дополнительно в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α, включающие (a) обеспечение антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α; (b) получение комплекса, содержащего вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; (с) приведение в контакт антигенсвязывающего домена с полученным комплексом; и (d) выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем связывание антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. Дополнительно в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α, включающие приведение в контакт антитела или антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; и выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем связывание антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. Дополнительно в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α, включающие (a) обеспечение антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α; (b) получение комплекса, содержащего вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; (с) приведение в контакт антигенсвязывающего домена с полученным комплексом; и (d) выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем отсутствие связывания антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. Дополнительно в данном документе предложены способы идентификации антитела или антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α, включающие приведение в контакт антитела или антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; и (d) выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем отсутствие связывания антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В некоторых вариантах реализации вариант D1 SIRP–α содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17–52. В некоторых вариантах реализации домен IgSF CD47 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах реализации полипептид, содержащий домен IgSF CD47, содержит внеклеточный домен человеческого CD47. В некоторых вариантах реализации полипептид, содержащий домен IgSF CD47, дополнительно содержит Fc–область антитела.

[0034] Дополнительно в данном документе предложены способы получения анти–SIRP–α антитела, которое связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, включающие: (a) иммунизацию курицы пептидом, содержащим по меньшей мере часть внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого SIRP–α; (b) получение антитела из вырабатывающей антитело клетки от иммунизированной курицы; и (c) выявление связывания между антителом, полученным из клетки, и внеклеточными доменами (например, доменами D1) человеческого полипептида SIRP–α, при этом связывание между антителом и внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α указывает на то, что антитело является анти–SIRP–α антителом, которое связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого вариантного полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой куриное, гуманизированное, химерное или человеческое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHF PRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:5). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFP RVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHF

PRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:5), и связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLTPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFP RVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRA KPS (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации каждый из трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α содержит внеклеточный домен (например, домен D1), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6 и 76–83. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают выявление связывания между антителом, полученным из клетки, и внеклеточным доменом (например, доменом D1) одного или более полипептидов SIRP–α, выбранных из группы, состоящей из обезьяньего полипептида SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α, человеческого полипептида SIRP–β и человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации обезьяний полипептид SIRP–α представляет собой полипептид SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) по меньшей мере двух разных обезьяньих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных мышиных вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) одного или более мышиных полипептидов SIRP–α, и при этом каждый из одного или более мышиных полипептидов SIRP–α содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7–10. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ, в некоторых вариантах реализации антитело не связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело не связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или их оба. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают выявление связывания или отсутствия связывания между антителом, полученным из клетки, и комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α, связанный с доменом IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает комплекс, содержащий вариант D1 SIRP–α, связанный с доменом IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47. В некоторых вариантах реализации антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации антитело не связывает комплекс, содержащий вариант D1 SIRP–α, связанный с доменом IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47. В некоторых вариантах реализации антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки. В некоторых вариантах реализации антитело модулирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой лейкоцит, выбранный из группы, состоящей из макрофага, дендритной клетки, нейтрофила, эозинофила и миелоидной супрессорной клетки (МСК). В некоторых вариантах реализации антитело ингибирует сигнализацию SIRP–α в макрофаге, экспрессирующем человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело усиливает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α.

[0035] Следует понимать, что одно, некоторые или все свойства различных вариантов реализации, описанных в данном документе, можно комбинировать, чтобы получить другие варианты реализации настоящего изобретения. Эти и другие аспекты изобретения станут понятны специалисту в данной области техники. Эти и другие варианты реализации изобретения дополнительно описаны в нижеприведенном подробном описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0036] Фиг. 1A иллюстрирует выравнивание доменов D1 10 разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α. Приведенные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 5, 6 и 76–83 (сверху вниз). Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0037] Фиг. 1B иллюстрирует выравнивание между доменами D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, яванского макака и мышей 129. Приведенные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 5, 6, 11 и 7 (сверху вниз). Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0038] Фиг. 1C иллюстрирует выравнивание между различными человеческими и мышиными доменами D1 SIRP–α с указанием петель R1, R2 и R3. Показано выравнивание между доменами D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей 129, мышей NOD, мышей C57BL/6 и мышей BALB/c. Приведенные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 5–10 (сверху вниз). Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0039] Фиг. 2 иллюстрирует выравнивание между доменами D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, яванского макака, мышей 129 и кур. Приведенные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 5, 6, 11, 7 и 84 (сверху вниз). Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0040] Фиг. 3A и 3B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S130 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 3A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса из высокоаффинных вариантов SIRP–α, связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO: 16). Преформированный комплекс создавали, смешивая два высокоаффинных человеческих полипептида SIRP–α v1 и v2 (SEQ ID NO: 17 и 19) в соотношении 1:1 и комбинируя смесь с CD47 для создания комплекса SIRP–α: CD47. Преформированный комплекс SIRP–α: CD47 на Фиг. 4A–9B готовили аналогично. Фиг. 3B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0041] Фиг. 4A и 4B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S121 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 4A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса из высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO:17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO:16). Фиг. 4B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0042] Фиг. 5A и 5B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела SI37 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 5A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO:15) и преформированного комплекса из высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO: 17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO: 16). Фиг. 5B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0043] Фиг. 6A и 6B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S128 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 6A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса из высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO:17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO:16). Фиг. 6B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0044] Фиг. 7A и 7B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S135 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 7A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса из высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO:17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO:16). Фиг. 7B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0045] Фиг. 8A и 8B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S126 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 8A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO: 17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO: 16). Фиг. 8B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0046] Фиг. 9A и 9B иллюстрируют специфичность связывания клона антитела S138 в отношении различных пептидов SIRP. Фиг. 9A иллюстрирует кривые связывания ELISA для антитела против доменов D1 SIRP–α v1 человека, v2 человека, мышей и яванского макака, а также человеческого SIRPγ (SEQ ID NO: 15) и преформированного комплекса высокоаффинных вариантов SIRP–α (SEQ ID NO: 17 и 19), связанных с доменом IgSF CD47 (SEQ ID NO:16). Фиг. 9B обобщает данные по специфичности связывания для клона против каждой из этих мишеней («+» указывает на связывание; «–» указывает на отсутствие связывания).

[0047] Фиг. 10A иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов scFv–Fc, полученных от кур дикого типа. Приведены SEQ ID NO:53–60 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности CDR и линкеров указаны линиями. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0048] Фиг. 10B иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов scFv–Fc, полученных от кур, вырабатывающих человеческие антитела. Приведены SEQ ID NO:61–74 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности CDR и линкеров указаны линиями. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0049] Фиг. 11A иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов семейства 2. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372 и 378 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361 и 373 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0050] Фиг. 11B иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов семейства 3. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394 и 400 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393,и 401 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0051] Фиг. 11С иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов семейства 4. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0052] Фиг. 11D иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL семейства 5, клонов группы 4. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 278 и 412 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 279 и 413 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0053] Фиг. 11E иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL дополнительных клонов группы 4 семейства 5. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 275 и 414 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 276 и 415 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR и линкеров указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat.

Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0054] Фиг. 11F иллюстрирует последовательности доменов VH и VL (SEQ ID NO: 280 и 281, соответственно, семейство 5, клон S209 группы 4. Последовательности HVR подчеркнуты.

[0055] Фиг. 11G иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL семейства 5, клонов группы 5. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 123 и 292 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 100 и 293 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0056] Фиг. 11H иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL дополнительных клонов группы 5 семейства 5. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0057] Фиг. 11I иллюстрирует последовательности доменов VH и VL клона 149 (SEQ ID NO: 286 и 287, соответственно) и клона 218 (SEQ ID NO: 284 и 285, соответственно). Последовательности HVR подчеркнуты.

[0058] Фиг. 11J иллюстрирует выравнивание доменов VH и VL клонов семейства 1. Аминокислотные последовательности доменов VH представлены SEQ ID NO: 120, 121, 130 и 122 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Аминокислотные последовательности доменов VL представлены SEQ ID NO: 97, 98, 107 и 99 (в порядке сверху вниз на выравнивании). Последовательности HVR указаны линиями. HVR приведены в соответствии с Kabat. Аминокислотные различия указаны звездочками.

[0059] Фиг. 12A–12C иллюстрируют профили связывания, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), репрезентативных клонов антител, связывающих преформированный комплекс из высокоаффинного варианта SIRP–α (SEQ ID NO: 18), смешанного с возрастающими концентрациями домена IgSF CD47 (SEQ ID NO:16). Фиг. 12A иллюстрирует кривую связывания клона антитела (S123), которое не блокирует связывание CD47 с SIRP–α (например, неблокирующего антитела). Фиг. 12B иллюстрирует кривую связывания клона антитела (S119), которое блокирует связывание CD47 с SIRP–α (например, блокирующего антитела). Фиг. 12C иллюстрирует кривую связывания клона антитела (S118), которое связывает SIRP–α и снижает его аффинность в отношении связывания CD47 (например, «отталкивающего» антитела).

[0060] Фиг. 13A–13G иллюстрируют результаты in vitro анализа фагоцитоза опухолевых клеток с применением макрофагов, обработанных анти–SIRP–α антителом (в указанном ряде концентраций), цетуксимабом или трастузумабом, анти–SIRP–α антителом плюс цетуксимабом или трастузумабом или контрольным антителом (IgG1, κ), как указано. Макрофаги, осуществлявшие фагоцитоз опухолевых клеток, были определены как клетки, положительные в отношении CD33, CD206 и CFSE, методом проточной цитометрии. В этом анализе опухолевые клетки представляли собой клетки DLD–1 (Фиг. 13A–13D и 13G) или OE19 (Фиг. 13E и 13F). Исследуемые анти–SIRP–α антитела представляли собой AB3a (Фиг. 13A и 13B), AB45a (Фиг. 13C и 13D), AB119a (Фиг. 13E), AB135a (Фиг. 13F) и AB136c (Фиг. 13G).

[0061] Фиг. 14 иллюстрирует результаты in vivo анализа активации дендритных клеток для дендритных клеток, выделенных из селезенки мышей Balb/c, обработанных анти–SIRP–α антителом AB136b, контрольным крысиным антимышиным анти–SIRP–α антагонистическим антителом (клон p84), крысиным контрольным IgG или мышиным контрольным IgG, как указано. Мышей внутривенно инъецировали указанным антителом при 10 мг/кг, а селезенки вырезали через пять часов после инъекции. Измерения маркера активации CD86 на дендритных клетках проводили методом проточной цитометрии.

[0062] Фиг. 15 иллюстрирует результаты in vivo сингенной модели карциномы толстой кишки мышей для оценки активности отдельного агента. Клетки MC38 подкожно имплантировали мышам C57BL/6 и рандомизировали животных по группам (8 мышей/группа). Мышей обрабатывали базовым раствором (ФСБ), CD47–блокирующим анти–SIRP–α антителом AB25b, CD47–блокирующим анти–SIRP–α антителом AB25c, CD47–блокирующим анти–SIRP–α антителом AB27b, не блокирующим CD47 анти–SIRP–α антителом AB3b или не блокирующим CD47 анти–SIRP–α антителом 136b. Обработку начинали, когда опухоли достигали в среднем 60 мм3, на 7 сутки после имплантации. Мышей внутрибрюшинно (В/Б) дозировали дозой 10 мг/кг анти–SIRP–α антител дважды в неделю в течение трех недель. Животных умерщвляли, когда опухоли достигали объема ~2000 мм3.

[0063] Фиг. 16 иллюстрирует результаты in vivo сингенной модели карциномы толстой кишки мышей для оценки активности отдельного агента. Клетки CT26 подкожно имплантировали мышам BALB/c (использовали 8–9 мышей на группу), которых обрабатывали AB136b или базовым раствором (ФСБ), как указано. Обработку начинали, когда опухоли достигали в среднем 80 мм3, на 7 сутки после имплантации. Мышей внутрибрюшинно (В/Б) дозировали дозой 3 мг/кг или 10 мг/кг анти–SIRP–α антител дважды в неделю в течение трех недель. Животных умерщвляли, когда опухоли достигали объема ~2000 мм3.

[0064] Фиг. 17A иллюстрирует сравнение связывания CD47 и Fab клона анти–SIRP–α антитела 119 с SIRP–α, определенного методом рентгеновской кристаллографии.

[0065] Фиг. 17B иллюстрирует участок взаимодействия между Fab клона анти–SIRP–α антитела 119 и SIRP–α, определенный методом анализа площади погруженной поверхности. Остатки SIRP–α, входящие в состав эпитопа связывания Fab антитела 119, затенены в соответствии с изменениями площади погруженной поверхности. Указаны ключевые остатки антитела в паратопе SIRP–α: (H) = остаток тяжелой цепи; (L) = остаток легкой цепи.

[0066] Фиг. 18A иллюстрирует сравнение связывания CD47 и Fab клона анти–SIRP–α антитела 136 с SIRP–α, определенного методом рентгеновской кристаллографии.

[0067] Фиг. 18B иллюстрирует участок взаимодействия между Fab клона анти–SIRP–α антитела 136 и SIRP–α, определенный методом анализа площади погруженной поверхности. Остатки SIRP–α, входящие в состав эпитопа связывания Fab антитела 136, затенены в соответствии с изменениями площади погруженной поверхности. Указаны ключевые остатки антитела в паратопе SIRP–α: (H) = остаток тяжелой цепи; (L) = остаток легкой цепи.

[0068] Фиг. 19A иллюстрирует сравнение связывания CD47 и Fab клона анти–SIRP–α антитела 3 с SIRP–α, определенного методом рентгеновской кристаллографии.

[0069] Фиг. 19B иллюстрирует участок взаимодействия между Fab клона анти–SIRP–α антитела 3 и SIRP–α, определенный методом анализа площади погруженной поверхности. Остатки SIRP–α, входящие в состав эпитопа связывания Fab антитела 3, затенены в соответствии с изменениями площади погруженной поверхности. Указаны ключевые остатки антитела в паратопе SIRP–α: (H) = остаток тяжелой цепи; (L) = остаток легкой цепи.

[0070] Фиг. 19C иллюстрирует сравнение связывания CD47 и Fab клона анти–SIRP–α антитела 115 с SIRP–α, определенного методом рентгеновской кристаллографии.

[0071] Фиг. 19D иллюстрирует участок взаимодействия между Fab клона анти–SIRP–α антитела 115 и SIRP–α, определенный методом анализа замаскированной поверхности. Остатки SIRP–α, входящие в состав эпитопа связывания Fab антитела 115, затенены в соответствии с изменениями площади погруженной поверхности. Указаны ключевые остатки антитела в паратопе SIRP–α: (H) = остаток тяжелой цепи; (L) = остаток легкой цепи.

[0072] Фиг. 20A иллюстрирует сравнение связывания CD47, клона анти–SIRP–α антитела 119 Fab, клона анти–SIRP–α антитела 136 Fab, клона анти–SIRP–α антитела 3 Fab, клона анти–SIRP–α антитела 115 Fab с SIRP–α, определяемого методом рентгеновской кристаллографии.

[0073] Фиг. 20B иллюстрирует эпитопы связывания CD47, Fab клона анти–SIRP–α антитела 119, Fab клона анти–SIRP–α антитела 136, Fab клона анти–SIRP–α антитела 3 и Fab клона анти–SIRP–α антитела 115 с SIRP–α, определенные методом рентгеновской кристаллографии. Значения указывают разницу между доступной площадью поверхности каждого атома остатка в Fab/CD47 при анализе в отдельности и в комплексе с SIRP–α, выраженную в виде площади погруженной поверхности (Å2). Нумерация остатков приведена в соответствии с SEQ ID NO: 296.

[0074] Фиг. 21A иллюстрирует блок–схему эпитоп–специфической сортировки анти–SIRP–α антител.

[0075] Фиг. 21B иллюстрирует результаты типового анализа для эпитоп–специфической сортировки анти–SIRP–α антител A, B, C, D, E и F.

[0076] Фиг. 22A и 22B иллюстрируют результаты эпитоп–специфической сортировки указанных анти–SIRP–α антител. Номер клона для лиганда (анти–SIRPα), связанного с чипом, указан в строке, а номер клона для аналитов (анти–SIRPα), проводимых через чип, указан в колонке. Белые клетки соответствуют антителам, которые образуют сандвич–структуры (и считается, что они связывают разные эпитопы). Серые клетки соответствуют антителам, которые не образуют сандвич–структуры (и считается, что они связывают один эпитоп). «Х» указаны случаи, когда данные для одной ориентации не согласуются с данными для другой.

[0077] Фиг. 23 представляет модель связывания анти–SIRP–α антитела и CD47 с доменом D1 SIRP–α на основании эпитоп–специфической сортировки. Представлены (и помечены номером) репрезентативные клоны антител для каждой группы.

[0078] Фиг. 24A иллюстрирует выравнивание между тяжелой цепью родительского 119 («119_VH_Wt»), тяжелой цепью варианта 119 с 4 мутациями (3 обратные мутации до последовательности зародышевой линии в каркасной области и одна мутация в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления; «VH_MutALL»), тяжелой цепью варианта 119 с 3 мутациями (3 обратные мутации до последовательности зародышевой линии только в каркасной области; «VH_MutAll_V34M») и тяжелой цепью варианта 119 с 3 мутациями и мутацией M34L (3 обратные мутации до последовательности зародышевой линии в каркасной области; «VH_MulAll_V34L»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO:335 для 119_VH_Wt, SEQ ID NO:246 для VH_MutALL, SEQ ID NO:258 для VH_MutAll_V34M и SEQ ID NO:327 для VH_MutAlL_V34L. Последовательности CDR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0079] Фиг. 24B иллюстрирует выравнивание между легкой цепью родительского 119 («119_VL_Wt») и легкой цепью варианта 119 с 4 мутациями (4 обратные мутации до последовательности зародышевой линии в каркасной области; «VL_mutAll»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO: 97 для 119_VL_Wt и SEQ ID NO:312 для VL_mutAll, последовательности CDR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0080] Фиг. 25A иллюстрирует выравнивание между легкой цепью родительского 135 («VL_wt») и легкой цепью варианта 135 с 2 мутациями (2 обратные мутации до последовательности зародышевой линии в каркасной области; «VL_mutAll»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO: 104 для 135 VL_wt и SEQ ID NO:248 для 135 VL_MutALL. Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0081] Фиг. 25B иллюстрирует выравнивание между тяжелой цепью родительского 135 («VH_wt»), тяжелой цепью варианта 135 с 6 мутациями (5 обратных мутаций до последовательности зародышевой линии в каркасной области и одна мутация в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления; «VH_MutAII»), тяжелой цепью варианта 135 с 5 обратными мутациями до последовательности зародышевой линии в каркасной области («VH_MutAll_V34M») и тяжелой цепью варианта 135 с 5 обратными мутациями до последовательности зародышевой линии в каркасной области и мутацией M34L («VH_MutALL_V34L»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO:341 для VH_wt, SEQ ID NO:247 для VH_MutAll и SEQ ID NO:259 для VH_MutAll_V34M и SEQ ID NO: 328 для VH_MutAll_V34L. Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0082] Фиг. 26A иллюстрирует выравнивание между легкой цепью родительского 136 («VL_wt»), легкой цепью варианта 136 с 4 мутациями (4 обратные мутации до последовательности зародышевой линии в каркасной области; «VL_mutaLL»), легкой цепью варианта 136 с одной обратной мутацией I2T до последовательности дикого типа в полностью мутированном («all mut») окружении («VL_Mutall_I2T»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO: 134 для VL_wt, SEQ ID NO:250 для VL_mutall и SEQ ID NO:251 для VL_Mutall_I2T. Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0083] Фиг. 26B иллюстрирует выравнивание между тяжелой цепью родительского 136 («VH_wt»), тяжелой цепью варианта 136 с 6 мутациями (5 обратных мутаций до последовательности зародышевой линии в каркасной области и одна мутация в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления; «VH_mutall»), тяжелой цепью варианта 136 с 5 обратными мутациями до последовательности зародышевой линии в каркасной области («VH_Mutall_V34M») и тяжелой цепью варианта 136 с 5 обратными мутациями до последовательности зародышевой линии в каркасной области и мутацией M34L («VH_Mutall_V34L»). Приведенные последовательности представляют собой: SEQ ID NO: 133 для VH_wt, SEQ ID NO:249 для VH_mutall, SEQ ID NO:260 для VH_Mutall_V34M, и SEQ ID NO:329 для VH_Mutall_V34L. Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0084] Фиг. 27A иллюстрирует аффинность связывания вариантов антитела 136 с шестью белками SIRP–α: человеческим SIRP–α v1 (SEQ ID NO:5), человеческим SIRP–α v2 (SEQ ID NO:6), SIRP–α яванского макака (SEQ ID NO: 11), SIRP–α мышей NOD (SEQ ID NO:8), SIRP–α мышей BL/6 (SEQ ID NO:9) и SIRP–α мышей BALB/c (SEQ ID NO: 10). Варианты антител имели мутантные («мут» или «mut») или родительские («дт» или «wt») легкие цепи и мутантные или родительские тяжелые цепи, как указано в порядке легкая цепь/тяжелая цепь. На графике по оси y указано соотношение KД mut/KД wt. Соотношение 1 указывает на то, что антитело имеет эквивалентную KД с антителом wt/wt (дт/дт) (указано пунктирной линией); соотношение >1 указывает на меньшую аффинность, чем у wt/wt; а соотношение <1 указывает на большую аффинность, чем у wt/wt.

[0085] Фиг. 27B иллюстрирует аффинность связывания вариантов антитела 136 с семью белками SIRP–α: SIRP–α мышей BL/6 (SEQ ID NO:9), SIRP–α мышей NOD (SEQ ID NO:8), SIRP–α мышей BALB/c (SEQ ID NO: 10), человеческим SIRP–α v1 (SEQ ID NO:5), человеческим SIRP–α v2 (SEQ ID NO:6), SIRP–α яванского макака (SEQ ID NO: 11) и человеческим SIRP–γ v1 (SEQ ID NO: 15). Кроме исследования wt 136 (дикого типа) и all mutant 136 (вариант, содержащий все мутации) конструировали варианты с удалением каждой отдельной мутации в содержащем все мутации окружении легкой цепи. На графике по оси y указано соотношение KД mut/KД wt. Соотношение 1 означает, что антитело имеет эквивалентную KД с антителом wt/wt (указано пунктирной линией); соотношение >1 указывает на меньшую аффинность, чем у wt/wt; а соотношение <1 указывает на большую аффинность, чем у wt/wt.

[0086] Фиг. 28 иллюстрирует сравнение результатов экспрессии и аффинности связывания антител, имеющих указанные человеческие тяжелые цепи и гуманизированные легкие цепи, в клетках 293–FS FreeStyle™ (Thermo Fisher).

[0087] Фиг. 29 иллюстрирует выравнивание между VL–доменами Hum1, Hum 8 и Hum9. Hum 8 был создан на основе Hum1, но с 5 аминокислотными заменами вблизи или в HVR–L1 и –L2, которые повышают человекоподобность. Hum 9 был создан на основе Hum1, но с 4 аминокислотными заменами вблизи или в HVR–L1 и –L2, которые повышают человекоподобность. Представлены SEQ ID NO: 252 (Huml), 416 (Hum 8) и 262 (Hum9). Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0088] Фиг. 30 иллюстрирует выравнивание между вариантом антитела 21 с обратными мутациями до зародышевой линии («HC_MutAll»), вариантом антитела 21 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления M34V («HC_MutAll_M34V»), вариантом антитела 21 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией M34L («HC_MutAll_M34L»), вариантом антитела 25 с обратными мутациями до зародышевой линии («HC_MutAll»), вариантом антитела 25 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления M34V («HC_MutAll_M34V»), вариантом антитела 25 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией M34L («HC_MutAll_M34L»), вариантом антитела 27 с обратными мутациями до зародышевой линии («HC_MutAll»), вариантом антитела 27 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией в CDR–H1 с удалением потенциальной горячей точки окисления M34V («HC_MutAll_M34V») и вариантом антитела 27 с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией M34L («HC_MutAll_M34L»). Приведенные последовательности представляют собой SEQ ID NO: 263, 264, 330, 267, 268, 332, 265, 266 и 331 (сверху вниз). Последовательности HVR указаны линиями; аминокислотные различия указаны звездочками.

[0089] Фиг. 31 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток HER2(+) OE19 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. «Отталкивающие» анти–SIRP–α антитела исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–HER2 антителом трастузумабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0090] Фиг. 32 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Неблокирующие анти–SIRP–α антитела исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0091] Фиг. 33A–33C иллюстрируют результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Анти–SIRP–α антитела исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0092] Фиг. 34 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Каждое из неблокирующих анти–SIRP–α антител 27 и 136 исследовали в виде полноразмерного антитела (с Fc–областью) или фрагмента F(ab)2 в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0093] Фиг. 35 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Блокирующие варианты анти–SIRP–α антитела 119 исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0094] Фиг. 36 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Блокирующие варианты анти–SIRP–α антитела 135 исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0095] Фиг. 37 иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Неблокирующие анти–SIRP–α антитела исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0096] Фиг. 38A–38B иллюстрируют результаты in vivo анализа активации дендритных клеток указанными анти–SIRP–α антителами. Мышей внутривенно инъецировали указанным антителом при 10 мг/кг, а селезенки вырезали через пять часов после инъекции. Измерения маркеров активации CD86, ГКГСII и CCR7 на дендритных клетках CD4+ проводили методом проточной цитометрии.

[0097] Фиг. 39A иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Варианты анти–SIRP–α антител 218a и 218 исследовали в указанных концентрациях в комбинации с анти–EGFR антителом цетуксимабом. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0098] Фиг. 39B иллюстрирует результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Типовые блокирующие анти–SIRP–α антитела 119a, 120a и 122a исследовали в указанных концентрациях. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0099] Фиг. 39C иллюстрируют результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Типовые неблокирующие анти–SIRP–α антитела 136a и 137a исследовали в указанных концентрациях. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0100] Фиг. 39D иллюстрируют результаты in vitro анализа фагоцитоза с применением клеток EGFR(+) DLD–1 в качестве мишени и макрофагов M2 в качестве клеток, осуществляющих фагоцитоз. Типовые отталкивающие анти–SIRP–α антитела 115a, 116a, 117a, 118a и 132a исследовали в указанных концентрациях. Фагоцитоз определяли по процентному содержанию клеток CFSE+.

[0101] Фиг. 40 иллюстрируют результаты in vivo сингенной модели карциномы толстой кишки мышей для оценки активности комбинирования обработки анти–SIRP–α с ингибированием пути PD–L1/PD–1. Клетки CT26 подкожно имплантировали мышам C57BL/6 и рандомизировали животных по группам (8 мышей/группа). Мышей обрабатывали базовым раствором (ФСБ), анти–PD–L1 антителом, CD47–блокирующим анти–SIRP–α антителом AB25b или AB25b и PD–L1. Обработку начинали, когда опухоли достигали в среднем 60 мм3, на 7 сутки после имплантации. Мышей дозировали внутрибрюшинно (В/Б) дозой 10 мг/кг дважды в неделю в течение трех недель и умерщвляли, когда опухоли достигали объема ~2000 мм3.

[0102] Фиг. 41 иллюстрируют результаты in vivo сингенной модели карциномы толстой кишки мышей для оценки активности комбинирования обработки анти–SIRP–α с ингибированием пути PD–L1/PD–1. Клетки MC38 подкожно имплантировали мышам C57BL/6 и рандомизировали животных по группам (8 мышей/группа). Мышей обрабатывали базовым раствором (ФСБ), анти–PD–1 антителом, CD47–блокирующим анти–SIRP–α антителом AB25b, AB25b и анти–PD–1, CD47–неблокирующим анти–SIRP–α антителом AB136b или AB136b и анти–PD–1. Обработку начинали, когда опухоли достигали в среднем 60 мм3, на 7 сутки после имплантации. Мышей дозировали внутрибрюшинно (В/Б) дозой 10 мг/кг дважды в неделю в течение трех недель и умерщвляли, когда опухоли достигали объема ~2000 мм3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0103] В настоящем изобретении описаны антитела, которые связывают внеклеточные домены (например, домены D1) одного или более человеческих полипептидов SIRP–α и имеют различные представляющие потенциальный интерес профили связывания SIRP–α. Эти уникальные профили связывания SIRP–α включают одну или более из следующих связывающих способностей, которые можно комбинировать многофакториальным образом для получения ряда вариантов с уникальной специфичностью. Например, антитело может связывать внеклеточные домены (например, домены D1) человеческого SIRP–α v1, человеческого SIRP–α v2 или их оба; антитело может связывать внеклеточные домены (например, домены D1) одного или более обезьяньих полипептидов SIRP–α или оно может не связываться с ними; антитело может связывать внеклеточные домены (например, домены D1) одного или более мышиных полипептидов SIRP–α или оно может не связываться с ними; антитело может связывать внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β или оно может не связываться с ним; и/или антитело может связывать внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ или оно может не связываться с ним. Кроме того, в настоящем изобретении описаны антитела, которые блокируют связывание CD47 с SIRP–α, антитела, которые не блокируют связывание CD47 с SIRP–α, и антитела, которые не блокируют связывание CD47 с SIRP–α, но снижают аффинность SIRP–α в отношении CD47, что приводит к более быстрой диссоциации комплекса CD47/SIRP–α. Кроме того, в настоящем изобретении описаны анти–SIRP–α антитела с одним или более in vitro и/или in vivo биологическими свойствами, представляющими интерес, такими как способность усиливать фагоцитоз макрофагами, усиливать активацию дендритных клеток, ингибировать in vivo рост опухоли, которая экспрессирует CD47, и/или способность осуществлять один или более из этих видов активности, не предотвращая взаимодействия между CD47–экспрессирующей клеткой и Т–клеткой.

[0104] Описанные в данном документе способы можно применять для идентификации антител с уникальными комбинациями вышеуказанных вариантов специфичности связывания. Не ограничиваясь теорией считается, что возможность идентифицировать уникальные анти–SIRP–α антитела с разными профилями связывания, описанными выше, позволяет идентифицировать антитела (например, описанные в данном документе) с необходимыми клиническими свойствами и преимуществами для доклинических исследований.

[0105] В одном аспекте в данном документе предложены выделенные антитела, которые связывают внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба. Дополнительно в данном документе предложены полинуклеотиды и векторы, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению, а также связанные с ними способы получения антител.

[0106] В другом аспекте в данном документе предложены способы лечения или замедления прогрессирования рака у индивида, включающие введение индивиду эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению.

[0107] В другом аспекте в данном документе предложены способы лечения или замедления прогрессирования аутоиммунного или воспалительного заболевания у индивида, включающие введение индивиду эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению.

[0108] В другом аспекте в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В некоторых вариантах реализации способы включают (a) обеспечение антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α; (b) получение комплекса, содержащего вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; (с) приведение в контакт антигенсвязывающего домена с полученным комплексом; и (d) выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем связывание антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В другом аспекте в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В некоторых вариантах реализации способы включают приведение в контакт антигенсвязывающего домена или антитела, которое связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, причем вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; и выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем связывание антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен не блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α.

[0109] В другом аспекте в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В некоторых вариантах реализации способ включает (a) обеспечение антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α; (b) получение комплекса, содержащего вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; (с) приведение в контакт антигенсвязывающего домена с полученным комплексом; и (d) выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем отсутствие связывания антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В другом аспекте в данном документе предложены способы идентификации антигенсвязывающего домена, который связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α и блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α. В некоторых вариантах реализации способ включает приведение в контакт антигенсвязывающего домена или антитела, которое связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α, с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α, связанный с полипептидом, содержащим домен IgSF CD47, при этом вариант D1 SIRP–α представляет собой высокоаффинный домен D1 SIRP–α искусственного происхождения и при этом вариант D1 SIRP–α связывается с человеческим CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз больше, чем аффинность связывания домена D1 SIRP–α природного происхождения с человеческим CD47; и выявление связывания антигенсвязывающего домена с комплексом, причем отсутствие связывания антигенсвязывающего домена с комплексом указывает на то, что антигенсвязывающий домен блокирует связывание между человеческим CD47 и человеческим полипептидом SIRP–α.

[0110] В другом аспекте в данном документе предложены способы получения анти–SIRP–α антитела, которое связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации способы включают (а) иммунизацию курицы пептидом, содержащим по меньшей мере часть внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого SIRP–α; (b) получение антитела из вырабатывающей антитело клетки от иммунизированной курицы; и (c) выявление связывания между антителом, полученным из клетки, и внеклеточными доменами (например, доменами D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, при этом связывание между антителом и внеклеточными доменами (например, доменами D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α указывает на то, что антитело является анти–SIRP–α антителом, которое связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α.

Определения

[0111] Перед подробным описанием представленных вариантов реализации следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными композициями или биологическими системами, которые, конечно, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации и не подразумевает ограничения.

[0112] В контексте этого описания и прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если иное четко не следует из контекста. Таким образом, например, ссылка на «молекулу», необязательно, включает комбинацию из двух или более таких молекул, и т. д.

[0113] В контексте данного документа термин «около» относится к обычному диапазону погрешности для соответствующей величины, как известно специалисту в данной области техники. В данном документе употребление «около» в отношении величины или параметра включает (и описывает) варианты реализации, которые непосредственно относятся к этой величине или параметру.

[0114] Следует понимать, что аспекты и варианты реализации настоящего изобретения включают «содержащие», «состоящие» и «преимущественно состоящие» из этих аспектов и вариантов реализации.

[0115] В контексте данного документа «полипептид SIRP–α» может относиться к любому эндогенному или природному полипептиду SIRP–α, кодируемому геномом любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как люди, обезьяны, грызуны (например, мыши или крысы), и птиц, таких как куры. Этот термин также включает варианты природного происхождения, например, варианты с альтернативным сплайсингом, аллельные варианты или полиморфизмы (например, описанные в данном документе). Этот термин может дополнительно относиться к полноразмерным, не подвергнутым процессингу полипептидам SIRP–α, а также к полипептидам SIRP–α, полученным в результате клеточного процессинга, например, удаления сигнальной последовательности и т. д. Типовые последовательности полипептидов SIRP–α описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации человеческий полипептид SIRP–α кодируется человеческим геном SIRPΑ, например, описанным NCBI Gene ID № 140885. Как описано в данном документе, полипептиды SIRP–α отличаются высокой степенью полиморфизма в пределах и среди видов. Например, было идентифицировано по меньшей мере 10 человеческих вариантов с аминокислотным полиморфизмом во внеклеточном домене.

[0116] Полипептиды SIRP–α содержат внеклеточный домен, который связывается с лигандами/партнерами, например, CD47. Полипептиды SIRP–α содержат 3 высокогомологичных внеклеточных (Ig)–подобные домена иммуноглобулина – D1, D2 и D3. Домен D1 SIRP–α («домен D1») относится к удаленному от мембраны внеклеточному домену SIRP–α и опосредует связывание SIRP–α с CD47 (смотрите, например, Hatherley, D. et al. (2008) Mol. Cell 31:266–77; Hatherley. D, et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:14567–75; Hatherley, D. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26613–9; и Lee, W. Y. et al. (2010) J. Biol Chem. 285:37953–63). Внеклеточный домен в общем случае относится ко всей внеклеточной части SIRP–α, например, экспрессируемой на поверхности клетки, и может включать разные домены SIRP–α, такие как домен D1. Домен D1 содержит остатки, являющиеся критическими для опосредования связывания CD47 (смотрите, например, Lee, W.Y. et al. (2007) J. Immunol. 179:7741–50). В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывает внеклеточный домен полипептида SIRP–α, связывает один или более остатков домена D1. Типовые последовательности домена D1 человеческого SIRP–α описаны в тексте настоящего изобретения и включают, без ограничений, SEQ ID NO:5, 6 и 76–83. Последовательности доменов D2 и D3 человеческого SIRP–α также известны и включают, без ограничений,

APWSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVS YSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIR (SEQ ID NO: 131) для домена D2 и VPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKD

GTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVS (SEQ ID NO: 132) для домена D3.

[0117] В контексте данного документа «CD47» (также известный как ассоциированный с интегрином белок (TAP), MER6 и OA3) относится к полипептиду, который, помимо прочего, выступает в качестве партнера по связыванию для полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации CD47 относится к человеческому полипептиду CD47, например, полипептиду, кодируемому человеческим геном CD47, таким как описан NCBI Ref Seq ID No. 961. Известны типовые аминокислотные последовательности человеческого CD47 (смотрите, например, эталонную последовательность с номером доступа NCBI NP_001768). В частности, домен IgSF CD47 относится к N–концевому внеклеточному домену CD47, который, как известно, является критическим для связывания SIRP–α (смотрите, например, Barclay, A.N. and Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457–64 и Hatherley, D. et al, (2009) J. Biol. Chem. 284:26613–9). В некоторых вариантах реализации домен IgSF CD47 содержит аминокислотную последовательность

QLLFNKTKSVEFTFSNDTWIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDTYTFDGALNKS

TVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS (SEQ ID NO: 16). Термин «CD47» также может включать модифицированные полипептиды CD47, которые не способны связывать SIRP–α, например, полипептид, содержащий домен IgSF CD47, конъюгированный с другим полипептидом или соединением, например, Fc–областью Ig.

[0118] В контексте данного документа «эпитоп SIRP–α» может относиться к аминокислотам полипептида SIRP–α, которые образуют участок связывания для анти–SIRP–α антитела согласно настоящему изобретению и/или партнера по связыванию SIRP–α, включая, без ограничений, CD47. Можно получать характеристики связывания антитела или других полипептидов с эпитопом и/или проводить их картирование, используя различные методы анализа, известные в данной области техники, включая, без ограничений, анализ перекрестного блокирования (смотрите Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)), картирование эпитопов (смотрите Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388–1394 (1995)), рентгеновскую совместную кристаллографию, эпитоп–специфическую сортировку, сайт–направленный мутагенез, олигопептидное сканирование, высокопроизводительное картирование с мутагенезом, водородно–дейтериевый обмен, ограниченный протеолиз и т. д.

[0119] В контексте данного документа «модуляция сигнализации SIRP–α» может относиться к осуществлению антагонизма, агонизма или какого–либо иного вмешательства в отношении одного или более аспектов сигнализации SIRP–α в клетке, экспрессирующей полипептид SIRP–α. Сигнализация SIRP–α может относиться к одному или более внутриклеточным событиям сигнализации, опосредованным активацией полипептида SIRP–α, включая, без ограничений, фосфорилирование тирозина внутриклеточной области SIRP–α, связывание фосфатазы (например, SHP1), связывание адаптерного белка (например, SCAP2, FYB и/или GRB2), выработку цитокинов (например, IL–10, IL–1β, IFN или TNF) и выработку оксида азота; и/или к одному или более межклеточным фенотипам, включая, без ограничений, фагоцитоз макрофагами и другие активирующие или супрессивные фенотипы макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, дендритных клеток и миелоидных супрессорных клеток (МСК).

[0120] В контексте данного документа термин «антитело» может относиться к интактным антителам; фрагментам антител (включая, без ограничений Fab, F(ab’)2, Fab’–SH, Fv, диатела, scFv, scFv–Fc, однодоменные антитела, антитела из одной тяжелой цепи и антитела из одной легкой цепи) при условии, что они демонстрируют необходимую биологическую активность (например, связывание эпитопа); моноклональным антителам; поликлональным антителам; моноспецифическим антителам; мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам); и антитело–подобным белкам.

[0121] В контексте данного документа термин «биспецифический», употребляемый в отношении антитела или фрагмента антитела, включает антитело или фрагмент антитела, которые характеризуются двумя разными специфичностями связывания. Например, каждая специфичность связывания может приводить к распознаванию отличного антигена или же каждая специфичность связывания может приводить к распознаванию одного антигена с разной аффинностью и/или конкретного эпитопа. В некоторых вариантах реализации каждая отдельная специфичность связывания соответствует одному или более разным антигенсвязывающим доменам антитела (например, вариабельным доменам) так, что биспецифическое антитело или фрагмент антитела содержит по меньшей мере первый антигенсвязывающий домен с первой специфичностью связывания и второй антигенсвязывающий домен со второй специфичностью связывания. Различные типовые форматы биспецифических антител описаны в данном документе и известны в данной области техники.

[0122] «Выделенное» антитело может относиться к антителу, которое было отделено и/или отъединено от компонента своего природного окружения, например, клетки–хозяина или организма. В некоторых вариантах реализации антитело очищено до необходимой степени чистоты по массе (например, по меньшей мере 95%); и/или гомогенности методом ДСН–ПААГ с применением, например, окрашивания серебром, кумасси и т. д. В некоторых вариантах реализации выделенное антитело получают, проводя один или более этапов очистки.

[0123] Как известно в данной области техники, «нативные» антитела относятся к, как правило, гетеродимерным комплексам, содержащим две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Две тяжелые цепи соединяет различное число дисульфидных связей, и одна соединяет каждую легкую цепь с тяжелой цепью в дополнение к внутрицепочечным дисульфидным мостикам. Тяжелые цепи содержат вариабельный домен (VH), за которым следуют (от N–конца к С–концу) три или четыре константных домена. Легкие цепи содержат вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL). Как правило, легкие цепи млекопитающих относятся к одной или двум категориям на основании аминокислотной последовательности: каппа и лямбда.

[0124] «Константный домен» может относиться к более консервативной части антитела или фрагмента, например, за пределами вариабельных доменов. Этот термин может включать домен CL, а также константные домены тяжелой цепи CH1, CH2, CH3 и, необязательно, CH4.

[0125] Константные домены тяжелой цепи можно отнести к 5 основным типам:

IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В рамках некоторых из этих основных типов существует несколько подтипов. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны и в целом описаны, например, в Abbas et al. Cellular and Mol. immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000).

[0126] В контексте данного документа термин «вариабельный домен антитела» относится к частям легких и тяжелых цепей антитела, которые содержат определяющие комплементарность области (CDR, например, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 и CDR H3) и каркасные области (FR).

[0127] Термин «вариабельный» относится к тому факту, что подпоследовательности вариабельных доменов существенно отличаются по последовательности между антителами и являются определяющими для специфичности связывания конкретного антитела с его антигеном. Вариабельность сконцентрирована в трех гипервариабельных областях (HVR) в доменах VH и VL. Более консервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями (FR), которые перемежаются HVR. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR–области, соединенные тремя HVR, которые образуют петли (смотрите Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological interest, Fifth Edition, National institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0128] Термин «гипервариабельная область (HVR)» может относиться к подобласти доменов VH и VL, характеризуемой повышенной вариабельностью последовательности и/или образованием определенных петель. Они включают три HVR в домене VH (H1, H2 и H3) и три HVR в домене VL (L1, L2 и L3). Считается, что H3 является критической в определении точной специфичности связывания, при этом L3 и H3 демонстрируют наибольший уровень разнообразия. Смотрите Johnson and Wu, в Methods in Molecular Biology 248:1–25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003).

[0129] Известно некоторое количество вариантов определения границ HVR. Определяющие комплементарность области по Kabat (CDR) основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее применяемыми (Kabat et at, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia, напротив, относится расположению структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol Biol 196:901–917 (1987)). HVR по AbM представляют компромиссный вариант между HVR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и используются в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's AbM. «Контактные» HVR определяют в анализе доступных кристаллических структур комплексов. Остатки из каждой из этих HVR приведены ниже. Остатки «каркасной области» или «FR» представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков HVR.

Петля Kabat AbM Chothia Контакт
L1 L24–L34 L24–L34 L26–L32 L30–L36
L2 L50–L56 L50–L56 L50–L52 L46–L55
L3 L89–L97 L89–L97 L91–L96 L89–L96
H1 H26–H35B H31–H35B H26–H32 H30–H35B (нумерация Kabat)
H1 H31–H35 H26–H35 H26–H32 H30–H35 (нумерация Chothia)
H2 H50–H65 H50–H58 H53–H55 H47–H58
H3 H95–H102 H95–H102 H96–H101 H93–H101

[0130] Также известны «удлиненные» HVR: 24–36 или 24–34 (L1), 46–56 или 50–56 (L2) и 89–97 или 89–96 (L3) в VL и 26–35 (H1), 50–65 или 49–65 (H2) и 93–102, 94–102, или 95–102 (H3) в VH (нумерация Kabat).

[0131] «Нумерация в соответствии с Kabat» может относиться к системе нумерации, применяемой в отношении вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи при составлении антител в Kabat et al., выше. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или дополнительное количество аминокислот, что соответствует укорочению FR или HVR вариабельного домена или вставке в них. Нумерация остатков по Kabat для данного антитела может быть определена путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Kabat последовательностью. Как правило, нумерацию Kabat используют в отношении остатков в вариабельных доменах (приблизительно остатки 1–107 легкой цепи и остатки 1–113 тяжелой цепи), тогда как систему нумерации или индекс EU (например, индекс EU по Kabat, нумерация в соответствии с EU IgG1) в общем случае используют в отношении остатков в константной области тяжелой цепи.

[0132] «Полноразмерные» или «интактные» антитела, как правило, содержат тяжелые цепи с Fc–областью, например, в отличие от фрагмента антитела. Антигенсвязывающие фрагменты «Fab» с одним антигенсвязывающим участком можно отделять от остаточного Fc–фрагмента путем расщепления папаином. Фрагменты F(ab’)2 содержат два антигенсвязывающих участка, получаемых при обработке антитела пепсином. При этом фрагменты антител содержат одну или более вариабельных областей антитела.

[0133] Фрагмент «Fv» содержит полный антигенсвязывающий участок. Одноцепочечный Fv (scFv) может содержать домены VH и VL, связанные пептидным линкером с ассоциацией доменов VH и VL, например, как в случае антитела или фрагмента Fab, таким образом, чтобы HVR образовывали антигенсвязывающий участок. Смотрите Pluckthiin, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer–Verlag, New York, 1994), pp. 269–315. В некоторых вариантах реализации scFv слит с Fc–доменом антитела (например, scFv–Fc). Несмотря на то, что антигенсвязывающий участок составляют шесть HVR, один вариабельный домен с тремя HVR все равно способен связывать антиген, хоть и с меньшей аффинностью. Смотрите Hamers–Casterman et al., Nature 363:446–448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733–736 (1996). Однодоменныеантитела (например, антитела верблюжьих), как правило, содержат один мономерный вариабельный домен для связывания антигена. Также известны антитела из одной тяжелой цепи (VHH) и одной легкой цепи. Фрагмент Fab’, как правило, содержит несколько дополнительных остатков в С–конце по сравнению с фрагментом Fab. Fab’–SH содержит остатки цистеина со свободным тиолом. В данной области техники известны различные варианты химического сопряжения фрагментов антител.

[0134] «Диатело» содержит фрагменты антитела с двумя антигенсвязывающими участками. Они включают домены VH и VL, соединенные линкером, который, как правило, является слишком коротким для облегчения спаривания доменов из одной цепи. Диатела могут быть бивалентными или биспецифическими. Известны также триатела и тетратела или антитела с другим числом доменов VH/VL. Смотрите Hudson et ah, Nat. Med. 9:129–134 (2003).

[0135] В контексте данного документа «моноклональное» антитело относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, например, по существу идентичных, но допускающих незначительные уровни фоновых мутаций и/или модификаций. Выражение «моноклональное» указывает на по существу гомогенный характер антител и не требует получения антитела каким–либо конкретным способом. В некоторых вариантах реализации моноклональное антитело выбирают по его последовательностям HVR, VH и/или VL и/или свойствам связывания, например, выбирают из пула клонов (например, полученных рекомбинантным способом, из гибридомы или с помощью фага). Моноклональное антитело может быть сконструировано так, чтобы оно содержало одну или более мутаций, например, для изменения аффинности связывания или других свойств антитела, создания гуманизированного или химерного антитела, улучшения выработки и/или гомогенности антител, конструирования мультиспецифического антитела, при этом получаемые в результате антитела считаются моноклональными по своей природе. Популяцию моноклональных антител можно отличить от поликлональных антител, так как отдельные моноклональные антитела в популяции распознают один и тот же антигенный участок. Известны различные методики получения моноклональных антител; смотрите, например, гибридомный способ (например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495–97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253–260 (1995), Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T–Cell Hybridomas 563–681 (Elsevier, N.Y., 1981)), методы рекомбинантных ДНК (смотрите, например, патент США № 4816567), технологии фагового дисплея (смотрите, например, Clackson et al, Nature, 352: 624–628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581–597 (1992); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299–310 (2004); Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073–1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467–12472 (2004); и Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1–2): 119–132 (2004), а также технологии получения человеческих и подобных человеческим антител у животных, которые содержат часть локусов или все локусы человеческого иммуноглобулина или гены, кодирующие последовательности человеческого иммуноглобулина (смотрите, например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255–258 (1993); Bruggemann et al. Year in Immunol 7:33 (1993); патенты США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856–859 (1994); Morrison, Nature 368: 812–813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845–851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65–93 (1995).

[0136] «Химерные» антитела могут относиться к антителу с одной частью тяжелой и/или легкой цепи от конкретного изотипа, класса или организма и другой частью от другого изотипа, класса или организма. В некоторых вариантах реализации вариабельная область получена из одного источника или организма, а константная область – из другого.

[0137] «Гуманизированные» антитела могут относиться к антителам с преимущественно человеческой последовательностью и минимальным количеством отличной от человеческой (например, мышиной или куриной) последовательности. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело содержит одну или более последовательностей HVR (обеспечивающих представляющую интерес специфичность связывания) из антитела, полученного из отличного от человеческого (например, мышиного или куриного) организма, привитых в каркасную область (FR) реципиентного человеческого антитела. В некоторых вариантах реализации нечеловеческие остатки дополнительно привиты в человеческую каркасную область (не присутствующую ни в одном из исходных или реципиентных антител), например, для улучшения свойств антитела. В общем случае гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли представлены областями нечеловеческого иммуноглобулина, а все или практически все FR представлены последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина. Смотрите Jones et al., Nature 321:522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323–329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593–596 (1992).

[0138] «Человеческое» антитело может относиться к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, вырабатываемого человеком и/или была получена любым из способов получения человеческих антител, описанных в данном документе. Человеческие антитела можно получать различными способами, известными в данной обрасти техники, включая библиотеки фагового дисплея; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581 (1991); получение моноклональных человеческих антител, как описано в Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R, Liss, p. 77 (1985); Boerner et al, J. Immunol, 147(1):86–95 (1991); и путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано так, чтобы вырабатывать такие антитела в ответ на антигенную стимуляцию, но чьи эндогенные локусы были инактивированы, например, иммунизированным ксеномышам (смотрите, например, патенты США № 6075181 и 6150584 в отношении технологии XENOMOUSE™) или курам с последовательностью (–ями) человеческого иммуноглобулина (смотрите, например, WO2012162422, WO2011019844 и WO2013059159).

[0139] В контексте данного документа «линкер» относится к связи между двумя элементами, например, белковыми доменами. В некоторых вариантах реализации линкер может представлять собой ковалентную связь или спейсер. Термин «спейсер» относится к соединению (например, полимеру полиэтиленгликоля (ПЭГ)) или аминокислотной последовательности (например, последовательности из 1–200 аминокислот), находящимся между двумя полипептидами или полипептидными доменами и обеспечивающему пространство или гибкость (или как пространство, так и гибкость) между двумя полипептидами или полипептидными доменами. В некоторых вариантах реализации аминокислотный спейсер является частью первичной последовательности полипептида (например, соединен с разнесенными полипептидами или полипептидными доменами посредством полипептидного остова).

[0140] В контексте данного документа термин «цитотоксический агент» может относиться к любому агенту, который ингибирует клеточную пролиферацию или индуцирует гибель клеток. Цитотоксические агенты включают, но не ограничиваются этим, химиотерапевтические агенты; радиоактивные изотопы; агенты, ингибирующие рост; и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, включая их фрагменты и/или варианты. Типовые цитотоксические агенты включают, без ограничений, ингибиторы метаболизма, агенты против микротрубочек, содержащие платину соединения, алкилирующие агенты, ингибиторы протеасом, ингибиторы топоизомеразы II, антиметаболиты, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы путей сигнальной трансдукции, ингибиторы ангиогенеза нерецепторной тирозинкиназы, гормоны и аналоги гормонов, проапоптотические агенты, ингибиторы LDH–A, ингибиторы клеточного цикла, ингибиторы HDAC и антибиотики.

[0141] В контексте данного документа «метка» может включать любое соединение, которое служит агентом для выявления, например, связывания между меченым антителом согласно настоящему изобретению и макромолекулой или клеткой. Типовые метки включают, без ограничений, флуоресцентные (например, соединения или белки), радиоактивные или ферментные соединения, а также метки для аффинной очистки.

[0142] В контексте данного документа можно говорить, что антитело «связывает» антиген с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело было применимо для in vitro и/или in vivo манипуляций с антигеном. В некоторых вариантах реализации антитело, которое «связывает» антиген, характеризуется константой диссоциации (KД) в отношении антигена, меньшей или равной 1 мкМ при 25°C.

[0143] В контексте данного документа термин «аффинность» или «аффинность связывания» относится к силе связывающего взаимодействия между двумя молекулами. В общем случае аффинность связывания относится к силе общих нековалентных взаимодействий между молекулой и ее партнером по связыванию, например, высокоаффинным вариантом D1 SIRP–α и CD47. Если не указано иное, аффинность связывания относится к характерной аффинности связывания, которая отображает 1:1 взаимодействие между представителями связывающейся пары. Аффинность связывания между двумя молекулами обычно описывается константой диссоциации (KД) или константой ассоциации (KА). Две молекулы, имеющие низкую аффинность связывания в отношении друг друга в общем случае связываются медленно с тенденцией к быстрой диссоциации и демонстрируют большое значение KД. Две молекулы, имеющие высокую аффинность связывания в отношении друг друга в общем случае связываются легко с тенденцией к тому, чтобы дольше оставаться связанными, и демонстрируют небольшое значение KД. В некоторых вариантах реализации KД двух взаимодействующих молекул определяют, используя известные способы и технологии, например, метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР). KД можно рассчитать как соотношение kдисс./kасс..

[0144] В контексте данного документа термин «KД меньше чем» относится к численно меньшему значению KД и повышению аффинности связывания по отношению к указанному значению KД. В контексте данного документа термин «KД больше чем» относится к численно большему значению KД и снижению аффинности связывания по отношению к указанному значению KД.

[0145] В контексте данного документа термин «лечение» может относиться к терапевтическому введению молекулы, соединения, состава, композиции и т. д. с целью изменения одного или более патологических симптомов у подлежащего лечению индивида или в клетке. Желаемое действие лечения может включать, без ограничений, замедление прогрессирования заболевания, уменьшение или облегчение патологического симптома или состояния заболевания, улучшение прогноза и/или достижение ремиссии заболевания. Например, «лечение» рака у индивида считается успешным при уменьшении или устранении одного или более симптомов, связанных с раком, таких как, без ограничений, снижение пролиферации раковых клеток, элиминация раковых клеток или опухолевой нагрузки, уменьшение симптомов, связанных с раком, повышение качества жизни индивида, снижение дозы других лекарственных средств и/или продление жизни индивида. В качестве другого примера «лечение» аутоиммунного или воспалительного заболевания может считаться успешным при уменьшении или устранении одного или более симптомов, связанных с аутоиммунным или воспалительным заболеванием, таких как, без ограничений, снижение числа аутореактивных иммунных клеток и/или воспалительных иммунных клеток или цитокинов, снижение иммунной активации и/или воспаления, замедление или уменьшение повреждения органов в результате заболевания, снижение симптомов, связанных с заболеванием, повышение качества жизни индивида, снижение дозы других лекарственных средств и/или продление жизни индивида.

[0146] В контексте данного документа «замедление прогрессирования» заболевания может относиться к замедлению, задержке, отсрочке, отложению развития, стабилизации или какому–либо иному торможению патологического течения заболевания. В некоторых вариантах реализации этот термин может относиться к замедлению, достаточному для эффективного предотвращения, например, предотвращения развития заболевания у индивида. В некоторых вариантах реализации, например, замедление прогрессирования распространенного рака может включать замедление появления метастазов. Специалисту в данной области техники понятно, что точная величина замедления может зависеть, например, от конкретного заболевания, состояния индивида и т. д.

[0147] Термины «рак» и «раковый» могут описывать нарушение регуляции или отсутствие регуляции роста/пролиферации клеток со стороны клетки или клеток млекопитающего. Может быть включен любой известный в данной области техники тип рака, такой как, без ограничений, карцинома, саркома, лимфома, лейкоз, лимфома и бластома. Более конкретные примеры таких видов рака включают, но не ограничиваются этим, рак легкого, плоскоклеточный рак, опухоли головного мозга, глиобластому, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, колоректальный рак (например, рак толстой или прямой кишки), рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак мочевыводящих путей, рак молочной железы, перитонеальный рак, рак матки, рак слюнных желез, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному анального канала, карциному полового члена, меланому, множественную миелому и B–кеточную лимфому (включая неходжкинскую лимфому (НХЛ)); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый миелоидный лейкоз (ОМЛ); карциному из клеток Меркеля; волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз (ХМЛ); и связанные с ними метастазы.

[0148] В контексте данного документа термин «эффективное количество» может относиться к количеству антитела согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно настоящему изобретению, являющемуся достаточным и эффективным для обеспечения необходимого терапевтического действия при лечении или замедлении прогрессирования пациента, имеющего заболевание, такое как рак, например, солидную опухоль или рак крови. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество позволяет избежать нежелательных побочных явлений, и/или благоприятное действие превосходит такие побочные явления. Эффективное количество может зависеть от подлежащего лечению индивида, например, возраста, массы, пола, состояния заболевания, а также от способности агента вызывать необходимый ответ. Эффективное количество можно вводить за одно или более введений. В клиническом контексте эффективное количество лекарства, соединения или фармацевтической композиции может быть или не быть обеспечено в сочетании с другим лекарством, соединением или фармацевтической композицией, например, другим терапевтическим агентом. Таким образом, «эффективное количество» также можно рассматривать в контексте введения одного или более других терапевтических агентов, при этом считается, что отдельный агент применяется в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими агентами может быть обеспечен или обеспечивается необходимый результат.

[0149] В контексте данного документа термин «фармацевтическая композиция» может относиться к медицинскому или фармацевтическому составу, который содержит активный ингредиент, а также вспомогательные вещества или разбавители (или как вспомогательные вещества, так и разбавители), и обеспечивает возможность введения активного ингредиента удобными способами введения. В некоторых вариантах реализации описанные в данном документе фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемые компоненты, которые совместимы с одним или более антителами согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция находится в форме таблетки или капсулы для перорального приема или в водной форме для внутривенного или подкожного введения, например, посредством инъекции.

[0150] В контексте данного документа термины «субъект», «индивид» и «пациент» используются взаимозаменяемо и относятся к позвоночному, например, млекопитающему. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, мышей, обезьян, людей, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных.

[0151] В контексте данного документа выражения «в сочетании с» или «в комбинации с» могут относиться к введению одного терапевтического средства в дополнение к (например, до, во время и/или после) другому терапевтическому средству.

Антитела

[0152] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к антителам, которые связывают внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба. Как продемонстрировано в данном документе, были получены характеристики антител, которые специфически связываются с v1 или v2, а также антител, которые связываются с обоими белками. У людей было идентифицировано по меньшей мере 10 разных аллелей гена SIRPΑ (смотрите Фиг. 1A; также смотрите Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313–23). Описанные в данном документе антитела, которые связывают один или более человеческих полипептидов SIRP–α и обладают одной или более другими специфичностями связывания, являются полезным открытием настоящего изобретения. Кроме того, в настоящем изобретении продемонстрированы способы получения и идентификации антител, представляющих удивительное разнообразие новых профилей специфичности связывания SIRP–α.

[0153] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность

EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFP

RVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGN1TPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:5). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPTQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, содержащий аминокислотную последовательность

EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFP

RVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:5), и внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELiYNQKEGHFPR

VTTVSESTKRENMDESISISNiTP AD AGTY YC VKFRKGSPDTEFKSG AGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:6).

[0154] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α. В контексте данного документа выражение «человеческий вариантный полипептид SIRP–α» может относиться к человеческому вариантному полипептиду SIRP–α природного происхождения или полиморфизму, экспрессируемому у людей, например, в отличие от варианта, несущего одну или более сконструированных мутаций. Например, в некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) одного или более человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, содержащих последовательность, приведенную в таблице 1. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1 и/или внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 и связывается с внеклеточным доменом (например, доменом D1) одного или более человеческих полипептидов SIRP–α, выбранных из v3, v4, v5, v6, v7, v8, v9 и v10.

Таблица 1. Последовательности человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, соответствующие домену D1.

Вариант SEQ ID NO Последовательность
v1 5
v2 6

v3 76
v4 77
v5 78
v6 79
v7 80
v8 81
v9 82
v10 83

[0155] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α (например, домен D1 обезьяньего полипептида SIRP–α). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака (например, встречающийся в организме Macaca fascicularis). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) по меньшей мере двух разных обезьяньих вариантных полипептидов SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) по меньшей мере двух разных вариантных полипептидов SIRP–α яванского макака. Например, в некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPEKSVSVAAGESATLNCTATSLIPVGPIQWFRGVGPGRELIYHQKEGHFP RVTPVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 11, внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность EEELQVIQPEKSVSVAAGDSATLNCTVSSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNLKEGHFPRVTAVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 12), или их оба.

[0156] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен мышиного полипептида SIRP–α (например, встречающийся в организме Mus musculus; например, домен D1 мышиного полипептида SIRP–α). В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных мышиных вариантных полипептидов SIRP–α. Известно множество мышиных вариантных полипептидов SIRP–α от разных линий мышей. В некоторых вариантах реализации мышиный вариантный полипептид SIRP–α сдержит аминокислотную последовательность, выбранную из

KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIKWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRVTNVSDATKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQKGPSEPDTEIQSGGGTEVYVLAKPS (SEQ ID NO: 7; из линии мышей 129),

TEVKVIQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGQSRQLIYSFTTEHFPRVTNVSDATKRSNLDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO:8; из линии мышей NOD),

KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGPSRLLIYSFAGEYVPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPADAGIYYCVKFQKGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLA K (SEQ ID NO:9; из линии мышей C57BL/6) и

TEVKVTQPEKSVSVAAGDSTILNCTVTSLLPVGPIRWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO: 10; из линии мышей BALB/c).

[0157] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) белка человеческого семейства SIRP. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации человеческий полипептид SIRP–β относится к полипептиду, кодируемому человеческим геном SIRPB1, например, описываемым NCBI Ref Seq ID No. 10326. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β содержит аминокислотную последовательность EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13) или EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYN QKEGHEPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 14).

[0158] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации человеческий полипептид SIRP–γ относится к полипептиду, кодируемому человеческим геном SIRPG, например, описываемым NCBI Ref Seq ID No. 55423. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ содержит аминокислотную последовательность EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 15).

[0159] Кроме антител, которые связывают один или более из описанных выше полипептидов, в настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые не связывают один или более из описанных выше полипептидов. Иными словами, профиль связывания антитела согласно настоящему изобретению может быть охарактеризован путем положительного или отрицательного перечисления любых вариантов специфичности связывания и/или свойств, описанных в данном документе.

[0160] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению модулирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению антагонизирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению препятствует сигнализации SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению агонизирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α. В некоторых вариантах реализации сигнализация SIRP–α включает одно или более внутриклеточных сигнальных событий, опосредованных активацией полипептида SIRP–α, включая, без ограничений, фосфорилирование тирозина внутриклеточной области SIRP–α, связывание фосфатазы (например, SHP1), связывание адаптерного белка (например, SCAP2, FYB и/или GRB2) и выработку оксида азота. Различные методы анализа для определения сигнализации SIRP–α в клетке включают, без ограничений, фосфорилирование SIRP–α, совместную иммунопреципитацию SHP1 и SHP2, сигнализацию PI3–киназы, выработку цитокинов (как воспалительных IL–12, IL–23, TNFα, IFN, так и супрессивных цитокинов IL–10, IL–4, IL–13, уровней маркеров клеточной поверхности для маркеров макрофагов M1 и M2) или активацию и функцию дендритных клеток; Kharitonenkov, A. et al. (1997) Nature 386: 181–6; Ochi, F. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:483–7; Kim, E.J. et al. (2013) Inflammation Research 62:377–86; Yi. T. et al. (2015) Immunity 43:764–75.

[0161] В некоторых вариантах реализации клетка, экспрессирующая человеческий полипептид SIRP–α, представляет собой лейкоцит. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой макрофаг, дендритную клетку, нейтрофил, эозинофил или миелоидную супрессорную клетку (МСК). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению снижает или антагонизирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, например, при применении одного или более методов анализа сигнализации SIRP–α, описанных в данном документе или известных в данной области техники. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению повышает или агонизирует сигнализацию SIRP–α в клетке, экспрессирующей человеческий полипептид SIRP–α, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, например, при применении одного или более методов анализа сигнализации SIRP–α, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

[0162] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению модулирует межклеточный фенотип, опосредованный SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению усиливает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α. Например, фагоцитарную активность макрофага, обработанного или приведенного в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, можно сравнивать с фагоцитарной активностью макрофага, не обработанного или не приведенного в контакт с антителом, или же фагоцитарную активность макрофага, который экспрессирует человеческий полипептид SIRP–α и обрабатывается или приводится в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, можно сравнивать с фагоцитарной активностью макрофага, который не экспрессирует человеческий полипептид SIRP–α и обрабатывается или приводится в контакт с антителом. Типовые методы анализа фагоцитоза можно найти, например, в Wieskopf, K. et al (2013) Science 341: 88 и Willingham, S.B. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:6662–7. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению повышает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, например, при применении одного или более методов анализа фагоцитоза, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

[0163] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению усиливает активацию дендритной (–ых) клетки (–ок), экспрессирующей (–их) человеческий полипептид SIRP–α (например, повышает уровень активации отдельных дендритных клеток или повышает долю активированных дендритных клеток в популяции образца). Например, активацию дендритных клеток, обработанных или приведенных в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, можно сравнивать с активацией дендритных клеток, не обработанных или не приведенных в контакт с антителом, или же активацию дендритных клеток, которые экспрессируют человеческий полипептид SIRP–α и обрабатываются или приводятся в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, можно сравнивать с активацией дендритных клеток, которые не экспрессируют человеческий полипептид SIRP–α и обрабатываются или приводятся в контакт с антителом. Типовые методы анализа активации дендритных клеток описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению повышает активацию дендритных клеток (например, экспрессирующих человеческий полипептид SIRP–α), по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, например, при применении одного или более методов анализа активации дендритных клеток, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

[0164] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению ингибирует in vivo рост опухоли, которая экспрессирует CD47. Например, in vivo рост опухоли, которая экспрессирует CD47 и обрабатывается антителом согласно настоящему изобретению, можно сравнивать с in vivo ростом опухоли, которая экспрессирует CD47 и не обрабатывается антителом согласно настоящему изобретению. Типовые методы анализа in vivo роста опухоли описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению ингибирует in vivo рост опухоли, которая экспрессирует CD47, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, например, при применении одного или более методов анализа in vivo роста опухоли, описанных в данном документе или известных в данной области техники.

[0165] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (например, «блокирующее антитело»). Например, антитело и полипептид CD47 могут «конкурировать» за один и тот же эпитоп SIRP–α и/или связывание антитела с SIRP–α может быть взаимно исключающим со связыванием CD47 с SIRP–α. Область связывания между SIRP–α и CD47, а также остатки обоих белков, которые участвуют в связывании, являются известными: смотрите Hatherley, D. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:14567–75 и Nakaishi, A. et al. (2008) J. Mol. Biol. 375:650–60. Типовые методы анализа для определения того, блокирует ли антитело связывание CD47 с SIRP–α, описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 в in vitro анализе, например, с применением очищенных полипептидов SIRP–α и/или CD47. Например, в данном документе описаны методы in vitro анализа ELISA и ППР, хотя это не подразумевает ограничения, так как можно использовать также другие методы in vitro анализа связывания. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α (например, связывание высокоаффинного домена D1 SIRP–α искусственного происхождения с CD47 с более высокой аффинностью, чем в случае одного или более вариантов природного происхождения, как описано в данном документе), связанным с доменом IgSF CD47, используют для скрининга в отношении блокирующих, неблокирующих и/или отталкивающих антител. В некоторых вариантах реализации «блокирующие» и/или «неблокирующие» антитела можно исследовать методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР; например, как описано в примере 1). Например, может происходить образование комплекса между доменом IgSF CD47 и вариантом D1 SIRP–α (например, связывание высокоаффинного домена D1 SIRP–α искусственного происхождения с CD47 с более высокой аффинностью, чем в случае одного или более вариантов природного происхождения, как описано в данном документе), а затем можно определять связывание исследуемого антитела с комплексом. В случае антитела, которое блокирует связывание SIRP–α с CD47, при повышении концентрации CD47 можно было бы ожидать, что меньше молекул SIRP–α будет доступно для связывания с антителом, так как антитело конкурирует за один и тот же участок связывания, что и CD47, а большинство/весь SIRP–α находится в комплексе CD47. Следовательно, можно ожидать снижение резонанса (РЕ) при повышении концентрации CD47 в смеси. В некоторых вариантах реализации «блокирующее» анти–SIRP–α антитело согласно настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом полипептида SIRP–α (например, доменом D1) в одном или более остатках области связывания между CD47 и SIRP–α, т. е. блокирующее антитело и CD47 используют частично или полностью перекрывающиеся эпитопы. В некоторых вариантах реализации «блокирующее» анти–SIRP–α антитело согласно настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом полипептида SIRP–α (например, доменом D1) в одной или более позициях, которые также связываются CD47 в комплексе CD47: SIRP–α. Области связывания между SIRP–α и типовыми анти–SIRP–α антителами или CD47 описаны в примере 4. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, например, при применении in vivo анализа связывания между полипептидами, экспрессируемыми на поверхности клеток. В некоторых вариантах реализации in vivo анализ может позволить оценить связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, посредством анализа одного или более аспектов сигнализации SIRP–α, например, одного или более внутриклеточных событий сигнализации, опосредованных активацией полипептида SIRP–α, включая, без ограничений, фосфорилирование тирозина внутриклеточной области SIRP–α, связывание фосфатазы (например, SHP1), связывание адаптерного белка (например, SCAP2, FYB и/или GRB2), выработку цитокинов (например IL–10, IL–1β, IFN или TNF) и выработку оксида азота; и/или одного или более межклеточных фенотипов, включая, без ограничений, фагоцитоз макрофагами и другие активирующие или супрессивные фенотипы макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, дендритных клеток и миелоидных супрессорных клеток (МСК).

[0166] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (например, «неблокирующее антитело»). Например, антитело и полипептид CD47 могут связывать различные и/или не перекрывающиеся эпитопы SIRP–α. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 в in vitro анализе, например, с применением очищенных полипептидов SIRP–α и/или CD47. Например, в данном документе описаны методы in vitro анализа ELISA и ППР, хотя это не подразумевает ограничения, так как можно использовать также другие методы in vitro анализа связывания. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α (например, связывание высокоаффинного домена D1 SIRP–α искусственного происхождения с CD47 с более высокой аффинностью, чем в случае одного или более вариантов природного происхождения, как описано в данном документе), связанный с доменом IgSF CD47, используют для скрининга в отношении блокирующих, неблокирующих и/или отталкивающих антител. В некоторых вариантах реализации «блокирующие» и/или «неблокирующие» антитела можно исследовать методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР; например, как описано в примере 1). Например, может происходить образование комплекса между доменом IgSF CD47 и вариантом D1 SIRP–α (например, связывание высокоаффинного домена D1 SIRP–α искусственного происхождения с CD47 с более высокой аффинностью, чем в случае одного или более вариантов природного происхождения, как описано в данном документе), а затем можно определять связывание исследуемого антитела с комплексом. В случае антитела, которое не блокирует связывание SIRP–α с CD47, можно ожидать, что антитело будет связывать комплекс SIRP–α /CD47 и образовывать сандвич–структуру. Следовательно, при повышении концентрации CD47 будет возрастать резонанс вследствие повышения образования сандвич–структур. В некоторых вариантах реализации «неблокирующее» анти–SIRP–α антитело согласно настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом полипептида SIRP–α (например, доменом D1) в одном или более остатках, отличных от области связывания между CD47 и SIRP–α, т. е. неблокирующее антитело и CD47 используют полностью не перекрывающиеся эпитопы. Области связывания между SIRP–α и типовыми анти–SIRP–α антителами или CD47 описаны в примере 4. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, например, при применении in vivo анализа связывания между полипептидами, экспрессируемыми на поверхности клеток. В некоторых вариантах реализации in vivo анализ может позволить оценить связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, посредством анализа одного или более аспектов сигнализации SIRP–α, например, одного или более внутриклеточных событий сигнализации, опосредованных активацией полипептида SIRP–α, включая, без ограничений, фосфорилирование тирозина внутриклеточной области SIRP–α, связывание фосфатазы (например, SHP1), связывание адаптерного белка (например, SCAP2, FYB и/или GRB2), выработку цитокинов (например IL–10, IL–1β, IFN или TNF) и выработку оксида азота; и/или одного или более межклеточных фенотипов, включая, без ограничений, фагоцитоз макрофагами и другие активирующие или супрессивные фенотипы макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, дендритных клеток и миелоидных супрессорных клеток (МСК). Удивительным открытием настоящего изобретения стало то, что антитела, которые не блокируют взаимодействие SIRP–α с CD47, способны повышать фагоцитоз и блокировать in vivo рост опухоли. Не ограничиваясь теорией считается, что неблокирующие анти–SIRP–α антитела могут модулировать одну или более функций SIRP–α независимо от связывания CD47.

[0167] В некоторых вариантах реализации связывание антитела согласно настоящему изобретению с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47 (например, «отталкивающее» антитело). В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого высокоаффинного полипептида SIRP–α (например, описанного в данном документе) повышает kдисс. человеческого высокоаффинного полипептида SIRP–α (например, описанного в данном документе) в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47 до более чем около 1×10–3 1/с. Например, антитело и полипептид CD47 могут использовать смежные или частично перекрывающиеся эпитопы SIRP–α так, чтобы антитело было способно связывать SIRP–α, когда оно связано с CD47, но антитело: SIRP–α стимулирует диссоциацию SIRP–α: CD47. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению снижает аффинность внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47 в in vitro анализе, например, с применением очищенных полипептидов SIRP–α и/или CD47. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47 в in vitro анализе, например, с применением очищенных полипептидов SIRP–α и/или CD47. Например, в данном документе описаны методы in vitro анализа ELISA и ППР, хотя это не подразумевает ограничения, так как можно использовать также другие методы in vitro анализа связывания. В некоторых вариантах реализации связывание антитела с комплексом, содержащим вариант D1 SIRP–α (например, связывание высокоаффинного домена D1 SIRP–α искусственного происхождения с CD47 с более высокой аффинностью, чем в случае одного или более вариантов природного происхождения, как описано в данном документе), связанный с доменом IgSF CD47, используют для скрининга в отношении блокирующих, неблокирующих и/или отталкивающих антител. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению снижает аффинность внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, например, при применении in vivo анализа связывания между полипептидами, экспрессируемыми на поверхности клеток. В некоторых вариантах реализации «отталкивающее» анти–SIRP–α антитело согласно настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом (например, доменом D1) полипептида SIRP–α в одном или более остатках области связывания между CD47 и SIRP–α, т. е. отталкивающее антитело и CD47 используют частично перекрывающиеся эпитопы. В некоторых вариантах реализации «отталкивающее» анти–SIRP–α антитело согласно настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом (например, доменом D1) полипептида SIRP–α в 1 или более остатках, которые также связываются CD47 в комплексе CD47:SIRP–α. Например, «отталкивающее» анти–SIRP–α антитело может связываться с внеклеточным доменом (например, доменом D1) полипептида SIRP–α в 2 или более остатках, которые также связываются CD47 в комплексе CD47:SIRP–α и находятся на периферии эпитопа связывания CD47 на SIRP–α. Области связывания между SIRP–α и типовыми анти–SIRP–α антителами или CD47 описаны в примере 4. В некоторых вариантах реализации связывание антитела согласно настоящему изобретению с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, повышает kдисс. человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, например, при применении in vivo анализа связывания между полипептидами, экспрессируемыми на поверхности клеток. В некоторых вариантах реализации in vivo анализ может позволить оценить связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α, экспрессируемого на поверхности первой клетки, и доменом IgSF человеческого полипептида CD47, экспрессируемого на поверхности второй клетки, посредством анализа одного или более аспектов сигнализации SIRP–α, например, одного или более внутриклеточных событий сигнализации, опосредованных активацией полипептида SIRP–α, включая, без ограничений, фосфорилирование тирозина внутриклеточной области SIRP–α, связывание фосфатазы (например, SHP1), связывание адаптерного белка (например, SCAP2, FYB и/или GRB2), выработку цитокинов (например, IL–10, IL–1β, IFN или TNF) и выработку оксида азота; и/или одного или более межклеточных фенотипов, включая, без ограничений, фагоцитоз макрофагами и другие активирующие или супрессивные фенотипы макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, дендритных клеток и миелоидных супрессорных клеток (МСК).

[0168] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению модулирует одну или более иммунных функций посредством связывания с двумя или более (или всеми тремя) из SIRP–α, SIRP–β и SIRPγ.

[0169] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0170] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0171] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47.

[0172] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0173] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0174] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47.

[0175] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего (например, яванского макака) полипептида SIRP–α; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0176] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего (например, яванского макака) полипептида SIRP–α; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47.

[0177] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1, внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v2 или их оба; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) обезьяньего (например, яванского макака) полипептида SIRP–α; связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α; и при этом связывание антитела с внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α снижает аффинность человеческого полипептида SIRP–α в отношении связывания домена IgSF человеческого полипептида CD47.

[0178] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывает по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (смотрите, например, Фиг. 3A и 3B).

[0179] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α, обезьяньего полипептида SIRP–α и по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (смотрите, например, Фиг. 4A и 4B).

[0180] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, мышиного полипептида SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывает по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (смотрите, например, Фиг. 5A и 5B).

[0181] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α и обезьяньего полипептида SIRP–α; при этом антитело не связывает мышиный полипептид SIRP–α; при этом антитело не связывает по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (смотрите, например, Фиг. 6A и 6B).

[0182] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточные домены (например, домены D1) двух или более разных человеческих вариантных полипептидов SIRP–α, обезьяньего полипептида SIRP–α и по меньшей мере один из внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–β и внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–γ; при этом антитело не связывает мышиный полипептид SIRP–α; и при этом антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 (смотрите, например, Фиг. 7A и 7B).

[0183] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит три CDR из VH–домена, содержащего последовательность, приведенную в таблице 2, и/или три CDR из VL–домена, содержащего последовательность, приведенную в таблице 2 (последовательности VH и VL с выделенными CDR приведены на Фиг. 10A–10B и 11A–11J). Например, в некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит три CDR из VH–домена, содержащего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 280, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130 и 122, и/или три CDR из VL–домена, содержащего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105,387,389,395,397,399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107 и 99. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий последовательность, приведенную в таблице 2, и/или VL–домен, содержащий последовательность, приведенную в таблице 2 (смотрите Фиг. 10A–10B и 11A–11J). Например, в некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 2,80, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130 и 122, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107 и 99. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит шесть последовательностей CDR из антитела, приведенного в таблице 2 (смотрите Фиг. 10A–10B и 11A–11J). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий последовательность VL–доменов Hum1–Hum9, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен и/или VL–домен из антитела, приведенного в таблице 2. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий остаток D или E, за которым следует (например, в направлении от N–конца к C–концу) последовательность VH–домена, выбранная из SEQ ID NO: 116–130.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности клонов антител, описанных в данном документе.

Клон/Антитело Каркасная область Домен SEQ ID NO Последовательность
S1 Куриная VL 85
S2 Куриная VL 86
S8 Куриная VL 87
S9 Куриная VL 88
S11 Куриная VL 89
S12 Куриная VL 90

S13 Куриная VL 91
S14 Куриная VL 92
S115 Человеческая VL 93
S116 Человеческая VL 94
S117 Человеческая VL 95
S118 Человеческая VL 96
S119 Человеческая VL 97
S120 Человеческая VL 98
S122 Человеческая VL 99
S123 Человеческая VL 100
S126 Человеческая VL 101
S128 Человеческая VL 102
S130 Человеческая VL 103
S135 Человеческая VL 104

S137 Человеческая VL 105
S138 Человеческая VL 106
S121 Человеческая VL 107
S1 Куриная VH 108
S2 Куриная VH 109
S8 Куриная VH 110
S9 Куриная VH 111
S11 Куриная VH 112
S12 Куриная VH 113
S13 Куриная VH 114
S14 Куриная VH 115

S115 Человеческая VH 116
S116 Человеческая VH 117
S117 Человеческая VH 118
S118 Человеческая VH 119
S119 Человеческая VH 120
S120 Человеческая VH 121
S122 Человеческая VH 122
S123 Человеческая VH 123
S126 Человеческая VH 124
S128 Человеческая VH 125
S130 Человеческая VH 126

S135 Человеческая VH 127
S137 Человеческая VH 12,8
S138 Человеческая VH 129
S121 Человеческая VH 130
AB136 Человеческая VH 133
AB136 Человеческая VL 134
AB21 Человеческая VH 135
AB21 Куриная VL 136
AB25 Человеческая VH 137
AB25 Куриная VL 138
AB27 Человеческая VH 139

AB27 Куриная VL 140 ALTQPASVSADLGETVKITCSGGDSSSHY
YGWYQQKSPGSAPVTVIYSDDERPSDIPS
RFSGSASGSTATLTITGVRVEDEAIYYCG
AYDGSTYANTFGAGTTLTVL
AB66 Человеческая VH 141 DVQLVESGGGVVRPGESLRLSCAASGFT FSSYAMSWVRQAPGKGLEWLAGISAGG SDTYYIDSVKGRFTTSRDNPKNSLYLQMS SLTAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGLG TLVTVSS
AB66 Куриная VL 142 ALTQPASVSANPGETVKITCSGGDYYSTY YAWYQQKSPGSAPVTVIHSDDKRPSDI PSRESGSASGSAATLHTGVRVEDEAVYY CGGYDGRTYINTFGAGTTLTVL
AB119 Человеческая HVR–H1 143 GFSFSNFAMT
AB119 Человеческая HVR–H2 144 TIGSGDTYYADSVKG
AB119 Человеческая HVR–H3 145 DSTVSWSGDFFDY
AB119 Человеческая HVR–L1 146 RASQNVKNDLA
AB119 Человеческая HVR–L2 147 AARIRET
AB119 Человеческая HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB135 Человеческая HVR–H1 149 GFSFSIYAMS
AB135 Человеческая HVR–H2 150 TIGADDTYYADSVKG
AB135 Человеческая HVR–H3 151 DSTVGWSGDFFDY
AB135 Человеческая HVR–L1 152 RASQNVRSDIA
AB135 Человеческая HVR–L2 153 AASSRDT
AB135 Человеческая HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB136 Человеческая HVR–H1 155 GFTFSSYDMN
AB136 Человеческая HVR–H2 156 LISGSGEHYYADSVKG
AB136 Человеческая HVR–H3 157 ENNRYRFFDD
AB136 Человеческая HVR–L1 158 RASQSVYTYLA
AB136 Человеческая HVR–L2 159 GASSRAT
AB136 Человеческая HVR–L3 160 QQYYDRPPLT
AB21 Человеческая HVR–H1 161 GFTFSSNA
AB21 Человеческая HVR–H2 162 ISAGGSDT
AB21 Человеческая HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB21 Куриная HVR–L1 164 SGGDYYSYYYG
AB21 Куриная HVR–L2 165 TVIYSDDKRPSD
AB21 Куриная HVR–L3 166 GGYDYSTYANA
AB25 Человеческая HVR–H1 161 GFTFSSNA
AB25 Человеческая HVR–H2 168 ISSGSDT
AB25 Человеческая HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB25 Куриная HVR–L1 170 SGGSYSSYYYA
AB25 Куриная HVR–L2 171 TLIYSDDKRPSN
AB25 Куриная HVR–L3 172 GGYDQSSYTNP
AB27 Человеческая HVR–H1 173 GFRFSSYA
AB27 Человеческая HVR–H2 174 ISSGGDT
AB27 Человеческая HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB27 Куриная HVR–L1 176 SGGDSSSHYYG
AB27 Куриная HVR–L2 177 TVLYSDDERPSD
AB27 Куриная HVR–L3 178 GAYDGSTYANT
AB66 Человеческая HVR–H1 179 GFTFSSYA
AB66 Человеческая HVR–H2 162 ISAGGSDT
AB66 Человеческая HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB66 Куриная HVR–L1 182 SGGDYYSTYYA

AB66 Куриная HVR–L2 183
AB66 Куриная HVR–L3 184
AB3 Куриная VH 242
AB3 Куриная VL 243
AB45 Куриная VH 244
AB45 Куриная VL 245
AB119 mut Человеческая с мутациями D1E, E43K, L112Q и M34V VH 246
AB135 mut Человеческая с мутациями D1E, R13Q, E16G, E43K, L112Q и M34V VH 247
AB136 mut all Человеческая с мутациями D1E, R13Q, E16R, E43K, L111Q и M34V VH 249
AB136 mut all Человеческая с мутациями T2I, T12S, T22S и E38Q VL 250
AB136 mut all_I2T Человеческая с мутациями T12S, T22S и E38Q VL 251
Hum1 Гуманизированная VL 252
Hum2 Гуманизированная VL 253

Hum3 Гуманизированная VL 254
Hum4 Гуманизированная VL 255
Hum5 Гуманизированная VL 256
Hum6 Гуманизированная VL 257
119 VH MutAll_
V34M
Человеческая с мутациями D1E, E43K и L112Q VH 258
135 VH MutAll_V34M Человеческая с мутациями D1E, R13Q, E16G, E43K и L112Q VH 259
136 VH MutAll_V34M Человеческая с мутациями D1E, R13Q, E16R, E43K и L111Q VH 260
Hum 8 Гуманизированная VL 416
Hum9 Гуманизированная HVR–L1 261
Hum 9 Гуманизированная VL 262
AB21 Mut All Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии VH 263
AB21 Mut All M34V Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 264
AB25 Mut All Человеческая с обратными VH 265

мутациями до зародышевой линии
AB25 Mut All M34V Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 266
AB27 Mut All Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии VH 267
AB27 Mut All M34V Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 268
135 V34M Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 269
136 V34M Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 270
21/25 M34V Человеческая HVR–H1 271
27 M34V Человеческая HVR–H1 272
115 Человеческая VH 273
115 Человеческая VL 274
213 Человеческая VH 275
213 Куриная VL 276
173 Человеческая VH 278
173 Человеческая VL 279

209 Человеческая VH 280
209 Куриная VL 281
132 Человеческая VH 282
132 Человеческая VL 283
218 Человеческая VH 284
218 Куриная VL 285
149 Человеческая VH 286
149 Человеческая VL 287
161 Человеческая VH 288
161 Человеческая VL 289
162 Человеческая VH 290
162 Человеческая VL 291

194 Человеческая VH 292
194 Человеческая VL 293
119
M34L
Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 305
135
M34L
Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 306
119 mut all Человеческая с мутациями F21L, R39K, E60A и T76S VL 312
136
M34L
Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 313
21/25
M34L
Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 318
27
M34L
Человеческая с мутацией подверженности HVR–H1 319
119_VH _MutAll _V34L Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 327
135_VH
_MutAll
_V34L
Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 328
136_VH
_Mutall
_V34L
Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 329
AB21_HC_
MutAl_M34L
Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 330
AB25_HC_Mut Человеческая с обратными VH 331

Αll_Μ3
4L
мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности
AB27_ HC_Mut All_M34L Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии и мутацией подверженности VH 332
218_Hum13 (218 VL с IGLV2 человека) Гуманизированная VL 333
218_Hu
m14 (218 VL с IGLV3 человека)
Гуманизированная VL 334
119 Человеческая VH 335
135 Человеческая VH 341
16 Человеческая VH 294
16 Куриная VL 295
17 Человеческая VH 342
17 Куриная VL 343
22 Человеческая VH 344
22 Куриная VL 345
23 Человеческая VH 346

23 Куриная VL 347
24 Человеческая VH 348
24 Куриная VL 349
26 Человеческая VH 350
26 Куриная VL 351
28 Человеческая VH 352
28 Куриная VL 353
29 Человеческая VH 354
29 Куриная VL 355
30 Человеческая VH 356
30 Куриная VL 357
55 Человеческая VH 358
55 Куриная VL 359
56 Человеческая VH 360
56 Куриная VL 361

59 Человеческая VH 362
59 Куриная VL 363
60 Человеческая VH 364
60 Куриная VL 365
65 Человеческая VH 366
65 Куриная VL 367
69 Человеческая VH 368
69 Куриная VL 369
70 Человеческая VH 370
70 Куриная VL 371
71 Человеческая VH 372
71 Куриная VL 373
73 Человеческая VH 374
73 Куриная VL 375

74 Человеческая VH 376
74 Куриная VL 377
76 Человеческая VH 378
76 Куриная VL 379
201 Человеческая VH 380
201 Куриная VL 381
202 Человеческая VH 382
202 Куриная VL 383
206 Человеческая VH 384
206 Куриная VL 385
175 Человеческая VH 386
175 Человеческая VL 387
177 Человеческая VH 388
177 Человеческая VL 389
178 Человеческая VH 390

178 Человеческая VL 391
180 Человеческая VH 392
180 Человеческая VL 393
184 Человеческая VH 394
184 Человеческая VL 395
185 Человеческая VH 396
185 Человеческая VL 397
189 Человеческая VH 398
189 Человеческая VL 399
190 Человеческая VH 400
190 Человеческая VL 401
193 Человеческая VH 402
193 Человеческая VL 403
191 Человеческая VH 404

191 Человеческая VL 405
198 Человеческая VH 406
198 Человеческая VL 407
163 Человеческая VH 408
163 Человеческая VL 409
164 Человеческая VH 410
164 Человеческая VL 411
174 Человеческая VH 412
174 Человеческая VL 413
214 Человеческая VH 414
214 Куриная VL 415
Hum8 Гуманизированная VL 416
136_MutAll(легкая цепь)_S12T Человеческая с мутациями D1E, R13Q, E16R, E43K и L111Q VL 417
136_MutAll(легкая цепь)_S22T Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии VL 418

136_Mut AH(легкая цепь)_Q38E Человеческая с обратными мутациями до зародышевой линии VL 419
119_wt_M34L Человеческая с мутацией подверженности VII 420
U9_wt_
M34V
Человеческая с мутацией подверженности VH 421
135_w7_
M34L
Человеческая с мутацией подверженности VH 422
135_wt_
M34V
Человеческая с мутацией подверженности VH 423
136_wt_
M34L
Человеческая с мутацией подверженности VH 424
136_wt_
M34V
Человеческая с мутацией подверженности VH 425
119
HVR–H1
Человеческая HVR–H1 175

[0184] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим полипептидом SIRP–α в одном или более остатках. Следует понимать, что остатки полипептида SIRP–α, которые связывает антитело согласно настоящему изобретению, могут быть описаны по отношению к эталонному полипептиду SIRP–α, но такое описание не ограничено единственным полипептидом SIRP–α (т. е. эталонным полипептидом SIRP–α). Скорее конкретные аминокислотные остатки эталонного полипептида SIRP–α описаны, чтобы идентифицировать соответствующие аминокислотные позиции, которые можно идентифицировать в различных полипептидах SIRP–α. Например, конкретные остатки, которые соответствуют одной или более аминокислотным позициям SEQ ID NO: 296, можно идентифицировать для различных человеческих полипептидов SIRP–α, таких как v1 и/или v2. Так как аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 296 и SEQ ID NO:5 отличаются только в позиции N80 (за исключением небольшого числа C–концевых остатков SEQ ID NO:296, полезных для выработки и очистки белка), специалисту в данной области техники будет понятно, что ссылки на аминокислотные позиции в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO:296 будут соответствовать таким же позициям в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5. Способы определения остатков полипептида SIRP–α, связываемых антителом, известны в данной области техники; типовые и неограничивающие описания приведены в примере 4.

[0185] SEQ ID NО: 296

[0186] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 и K96 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 и R95 в соответствии с SEQ ID NO: 296.

[0187] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в K11, A42, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в I7, P9, D10, K11, S12, A108 и E111 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 и A116 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в L14, T88, Y90, S106, S113 и Al16 человеческого SIRP–α v1 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в L14, T26 и T28 в соответствии с SEQ ID NO:296.

[0188] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из E47, L48, P58, R59, T82 и A84 в соответствии с SEQ ID NO:296. В некоторых вариантах реализации антитело дополнительно связывается с человеческим полипептидом SIRP–α v1 в одной или более аминокислотных позициях, выбранных из A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 и P83 в соответствии с SEQ ID NO: 296.

[0189] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ, менее 50 нМ или менее 30 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47 и при этом антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1 с a константой диссоциации (KД) менее 100 нМ, менее 50 нМ или менее 30 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v1 и домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–γ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α.

[0190] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α и не блокирует связывание между внеклеточным доменом (например, доменом D1) человеческого полипептида SIRP–α и доменом IgSF человеческого полипептида CD47. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–α v1 с константой диссоциации (KД) менее 100 нМ, менее 50 нМ или менее 30 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v1. В некоторых вариантах реализации антитело связывает домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v1 и домен D1 человеческого полипептида SIRP–α v2. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) полипептида SIRP–α яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) человеческого полипептида SIRP–β. В некоторых вариантах реализации антитело связывает внеклеточный домен (например, домен D1) мышиного полипептида SIRP–α.

[0191] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом. Способы определения того, конкурирует ли антитело за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом, известны в данной области техники; типовые и неограничивающие описания приведены в примере 5.

[0192] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более эталонными анти–SIRP–α антителами, выбранными из 119, 120, 121, 122, 21, 25, 27, 66 и 135. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более из следующих эталонных анти–SIRP–α антител: (a) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; (b) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:98; (c) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (d) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:99; (e) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, (f) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138, (g) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140, (h) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и (i) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.

[0193] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более эталонными анти–SIRP–α антителами, выбранными из 136 и 137. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более из следующих эталонных анти–SIRP–α антител: (a) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134, и (b) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105.

[0194] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более эталонными анти–SIRP–α антителами, выбранными из 3, 213, 173 и 209. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более из следующих эталонных анти–SIRP–α антител: (a) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:242, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:243, (b) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276, (c) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279, и (d) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281.

[0195] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более эталонными анти–SIRP–α антителами, выбранными из 115, 116, 117, 118 и 132. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более из следующих эталонных анти–SIRP–α антител: (a) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:93; (b) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94; (c) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95, (d) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:96, и (e) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:282, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283.

[0196] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более эталонными анти–SIRP–α антителами, выбранными из 218, 123, 149, 161, 162 и 194. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с одним или более из следующих эталонных анти–SIRP–α антител: (a) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285, (b) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, (c) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287, (d) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289, (e) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291, и (f) антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293.

[0197] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с эталонным анти–SIRP–α антителом 45. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению конкурирует за связывание внеклеточного домена (например, домена D1) человеческого полипептида SIRP–α с антителом, содержащим VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:244, и VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:245.

[0198] В настоящем изобретении предложено некоторое количество семейств анти–SIRP–α антител, при этом каждое семейство содержит некоторое количество антител. Как продемонстрировано в данном документе, антитела в рамках заданного семейства могут обладать некоторыми общими структурными свойствами (например, сходными или идентичными последовательностями HVR или CDR), а также одним или более функциональными свойствами, включая, но не ограничиваясь этим, аффинность связывания с человеческим, обезьяньим и/или мышиным полипептидом (–ами) SIRP–α, аффинность связывания с полипептидами SIRP–β, аффинность связывания с полипептидами SIRP–γ, характер связывания с SIRP–α (например, блокирование CD47, отсутствие блокирования CD47 или «отталкивающее» связывание), индукцию фагоцитоза (например, в in vitro анализе), активацию дендритных клеток, противоопухолевую эффективность, остатки или «группу» связывания эпитопа SIRP–α (например, определенные в анализе сортировки) и т. д. (смотрите, например, таблицы P–T). По причине этих общих свойств подразумевается, что последовательности HVR и/или VH или VL, принадлежащие одному семейству, можно менять или перемешивать между собой, вследствие чего анти–SIRP–α антитело может содержать HVR и/или VH или VL, полученные из более чем одного конкретного анти–SIRP–α антитела, описанного в данном документе. Как более подробно обсуждается в данном документе, в данной области техники известны различные методики определения последовательностей HVR или CDR вариабельных доменов антител, которые можно взаимозаменяемо использовать в контексте данного документа, включая, без ограничений, определения Kabat, Chothia и IMGT, а также их комбинации.

[0199] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:97, 98, 107, 99, 104 и 312; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328.В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99,104 и 312; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 и 328; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312: HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 и 312.

[0200] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373,375, 377, 379, 381, 383 и 385; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384: HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 и 384; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 и 385.

[0201] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 32,9, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 и 402; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 и 403.

[0202] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; и HVR– H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 и 406; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407: HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 и 407.

[0203] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 242; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 243.

[0204] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 278 и 412; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 279 и 413.

[0205] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 275 и 414; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 276 и 415.

[0206] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 280; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 281.

[0207] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 123 и 292; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 100 и 293.

[0208] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–H2 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 291, 408 и 410; HVR–H3 из последовательности VH–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 288, 290, 408 и 410; HVR–L1 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; HVR–L2 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 289, 291, 409 и 411.

[0209] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 286; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 287.

[0210] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 284; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 285.

[0211] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO:244; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 244; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 244; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 245; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 245; и/или HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 245. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 244; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 244; и HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO: 244. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO:245; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO:245; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO:245. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR–H1 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO:244; HVR–H2 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO:244; HVR–H3 из последовательности VH–домена, приведенной в SEQ ID NO:244; HVR–L1 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO:245; HVR–L2 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 245; и HVR–L3 из последовательности VL–домена, приведенной в SEQ ID NO: 245.

[0212] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:242, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:243. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:242, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:243. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:244, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:245. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:244, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:245. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:282, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:283. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:282, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:283. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293.

[0213] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:278, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:279. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:275, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:276. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:414, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:415. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:414, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:415. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:292, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:293. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:291. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из VH–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из VL–домена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285, 333 или 334. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 285, 333 или 334.

[0214] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность NFAMT (SEQ ID NO: 175), NFAVT (SEQ ID NO:204) или NFALT (SEQ ID NO:305), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGSGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 144), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVSWSGDFFDY (SEQ ID NO: 145); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVKNDLA (SEQ ID NO: 146), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AARIRET (SEQ ID NO: 147), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDWPPFT (SEQ ID NO:148). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120, 246, 258 или 327; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:97 или 312. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:246, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:258, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NО:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:327, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:246, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:258, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:327, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:312.

[0215] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность IYAMS (SEQ ID NO:269), IYAVS (SEQ ID NO:313) или IYALS (SEQ ID NO:306), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 150), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVGWSGDFFDY (SEQ ID NO:151); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVRSDIA (SEQ ID NO: 152), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AASSRDT (SEQ ID NO: 153), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:341, 127, 247, 259 или 328; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104 или 248. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:341, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:247, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:259, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:328, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:104; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:341 а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:247, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:259, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID 140:328, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:248.

[0216] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий: (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность X1X2DX3N, где X1 представляет собой S или T; X2 представляет собой Y или S; и X3 представляет собой M, L или V (SEQ ID NO:307); (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность LISGSGEIX1YYADSVKG, где X1 представляет собой I или T (SEQ ID NO:308); и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность EX1X2X3YRFFDX4, где X1 представляет собой N или D; X2 представляет собой N или D; X3 представляет собой R или M; и X4 представляет собой D или Y (SEQ ID NO:309); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий: (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RAX1QSVYX2YLA, где X1 представляет собой S или D; и X2 представляет собой T или S (SEQ ID NO: 10); (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность X1AX2X3RAX4, где X1 представляет собой G, A или D; X2 представляет собой S или R; X3 представляет собой S, N или T; и X4 представляет собой T или A (SEQ ID NO:311); и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SYDMN (SEQ ID NO:270), SYDVN (SEQ ID NO: 221) или SYDLN (SEQ ID NO:313), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность LISGSGEIIYYADSVKG (SEQ ID NO: 156), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ENNRYRFFDD (SEQ ID NO: 157); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQSVYTYLA (SEQ ID NO: 158), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность GASSRAT (SEQ ID NO: 159), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 133, 260, 329 или 249; и/или VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:134, 250, 251, 417, 418 или 419. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:417; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:417; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:417; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:417; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:418; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:418; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:418; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:418; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:419; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:419; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:419; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:419; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:260, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:329, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:250; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:249, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251.

[0217] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий: (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность X1X2AX3S, где X1 представляет собой S или T; X2 представляет собой N, Y, H или D; и X3 представляет собой M, L или V (SEQ ID NO:297); (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG. где X1 представляет собой A или S; X2 представляет собой G, S или отсутствует; X3 представляет собой S, D или G; X4 представляет собой G или S; X5 представляет собой D, S или G; X6 представляет собой T или A; X7 представляет собой P, G, V, I, A или S; X8 представляет собой A, D или G; и X9 представляет собой V или M (SEQ ID NO:298); и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193): и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий: (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGX1X2X3SX4YYX5, где X1 представляет собой D, G, S, I или отсутствует; X2 представляет собой S, W, G, Y, D или отсутствует; X3 представляет собой S, Y, T или D; X4 представляет собой Η, T, S или Y; и X5 представляет собой G или A (SEQ ID NO:299); (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDX1X2RPX3, где X1 представляет собой D или N; X2 представляет собой E, K, или Q; и X3 представляет собой S или P (SEQ ID NO:300); и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность X1X2YDX3X4X5ΥΧ6ΝΧ7, где X1 представляет собой G или A; X2 представляет собой G или A; X3 представляет собой G, Y, Q, S или A; X4 представляет собой S, R или T; X5 представляет собой T или S; X6, представляет собой A, I, V, L или T; и X7 представляет собой T, A, D или P (SEQ ID NO:301). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий: (1) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SX1AX2S, где X1 представляет собой N или Y; и где X2 представляет собой M, L или V (SEQ ID NG:302); (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, где X1 представляет собой A или S; X2 представляет собой G или отсутствует; X3 представляет собой S или G; X4 представляет собой P, G или V; и X5 представляет собой A или D (SEQ ID NO:303); и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193): и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий: (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGX1YSSYYYA, где X1 представляет собой S или A (SEQ ID NO:304); (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336); и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271) или SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO: 195), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 135, 263, 264 или 330. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271) или SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO: 197), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 137, 265, 266 или 331. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит (i) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272) или SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), и (iii) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 139, 267, 268 или 332. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит одну или более человеческих каркасных последовательностей IGLV3. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит четыре человеческие каркасные последовательности IGLV3. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит последовательность FW1–HVR–L1–FW2–HVR–L2–FW3–HVR–L3–FW4 (от N–конца к C–концу), при этом FW1 содержит аминокислотную последовательность SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO:314), FW2 содержит аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPVTLTY (SEQ ID NO:315), FW3 содержит аминокислотную последовательность NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 316) и FW4 содержит аминокислотную последовательность FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:317). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:252. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:254. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:416. В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит (i) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (ii) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SDDKRPS (SEQ ID NO:336), и (iii) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). В некоторых вариантах реализации VL–домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:262. В некоторых вариантах реализации VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:268, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:252; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:268, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:268, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:264, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:330, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:265, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:266, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:331, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:368, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 416, VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:416; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:254; VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:416; или VH–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:139, а VL–домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:262.

[0218] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:135, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142.

[0219] В некоторых вариантах реализации антитело содержит (a) последовательность HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSFSX1X2AMX3, где X1 представляет собой N или I; X2 представляет собой F или Y; и X3 представляет собой T или S (SEQ ID NO: 185); (b) последовательность HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность TIGX4X5DTYYADSVKG, где X4 представляет собой S или A и X5 представляет собой G или D (SEQ ID NO: 186); (c) последовательность HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность DSTVX6WSGDFFDY, где X6 представляет собой S или G (SEQ ID NO: 187); (d) последовательность HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQNVX7X8DX9A, где X7 представляет собой K или R; X8 представляет собой N или S; и X9 представляет собой L или I (SEQ ID NO: 188); (e) последовательность HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность AAX10X11RX12T, где X10 представляет собой R или S; X11 представляет собой I или S; и X12 представляет собой E или D (SEQ ID NO: 189); и (f) последовательность HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148).

[0220] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 143–148 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO:143–145, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO:146–148). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 148–153 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 149–151, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 152, 153 и 148). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:155–160 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 155–157, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 158–160). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:161–166 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 161–163, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 164–166). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 161–166 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO:161–163, и/или одну, две или три последовательности HVR вариабельного домена легкой цепи, приведенного в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 161, 163, 168 и 170–172 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 161, 168 и 163, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 170–172). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 161, 163, 168 и 170–172 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 161, 168 и 163, и/или одну, две или три последовательности HVR вариабельного домена легкой цепи, приведенного в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 163, 173, 174 и 176–178 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 163, 173 и 174, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 176–178). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 162, 163, 179 и 182–184 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 162, 163 и 179, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 182–184). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 162, 163, 179 и 182–184 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 162, 163 и 179, и/или одну, две или три последовательности HVR вариабельного домена легкой цепи, приведенного в таблице 2). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 120 и 97 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 120 и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:97). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из последовательностей вариабельного домена SEQ ID NO: 127 и 104 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 127 и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 104). В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей HVR из последовательностей вариабельного домена SEQ ID NO:97, 104, 120 и 127 (например, одну, две или три последовательности HVR тяжелой цепи из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 120 и 127, и/или одну, две или три последовательности HVR легкой цепи из последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:97 и 104).

[0221] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:149, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:150, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 151; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143 или 149, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144 или 150, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145 или 151, и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146 или 152, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147 или 153, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163, и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:168, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:171, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 177, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184.

[0222] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 171, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:139, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 177, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184.

[0223] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:165, 171, 177 или 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (а) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:165, 171, 177 или 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183; и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183, HVR–L3, и содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183; и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:166, 172, 178 или 184. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, и/или VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, 170, 176 или 182, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, 171, 177 или 183, HVR–L3, и содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, 172, 178 или 184.

[0224] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:242; и/или (b) VL–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:243. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:244; и/или (b) VL–домен, содержащий одну, две или три последовательности HVR из SEQ ID NO:245.

[0225] Как описано выше, в данной области техники известны различные способы определения границ гипервариабельных областей (HVR) или определяющих комплементарность областей (CDR), которые можно применять в отношении описанных в данном документе последовательностей вариабельных доменов. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит HVR по определению Chothia, Kabat, IMGT или их комбинации (например, одну или более HVR по определению согласно одному варианту определения границ и одну или более HVR по определению согласно другому варианту определения границ). Последовательности HVR антител согласно настоящему изобретению, определенные согласно трем известным вариантам определения границ (Chothia, Kabat и IMGT), приведены в таблице 5. В контексте данного документа, если не указано иное, нумерация остатков HVR определена по нумерации Kabat.

Таблица 5. Варианты определения границ HVR.

Hum 1 (Chothia) HVR–L1 170 SGGSYSSYYYA
HVR–L2 336 SDDKRPS
HVR–L3 172 GGYDQSSYTNP
Hum 1 (Kabat) HVR–L1 170 SGGSYSSYYYA
HVR–L2 336 SDDKRPS
HVR–L3 172 GGYDQSSYTNP
Hum 1 (IMGT) HVR–L1 337 GSYSS
HVR–L2 338 IYS
HVR–L3 339 GGYDQSSYT
Hum 7 (Chothia) HVR–L1 164 SGGDYYSYYYG
HVR–L2 336 SDDKRPS
HVR–L3 166 GGYDYSTYANA
Hum 7 (Kabat) HVR–L1 164 SGGDYYSYYYG
HVR–L2 336 SDDKRPS
HVR–L3 166 GGYDYSTYANA
Hum 7 (IMGT) HVR–L1 340 GDYYS
HVR–L2 338 IYS
HVR–L3 190 GGYDYSTYA
AB21
(Chothia)
HVR–H1 191 GFTFSSN
HVR–H2 192 SAGGSD
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB21
(Kabat)
HVR–H1 194 SNAMS
HVR–H2 195 GISAGGSDTYYPASVKG
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB21
(IMGT)
HVR–H1 161 GFTFSSNA
HVR–H2 162 ISAGGSDT
HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB25
(Chothia)
HVR–H1 191 GFTFSSN
HVR–H2 196 SSGSD
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB25
(Kabat)
HVR–H1 194 SNAMS
HVR–H2 197 GISSGSDTYYGDSVKG
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB25
(IMGT)
HVR–H1 161 GFTFSSNA
HVR–H2 168 ISSGSDT
HVR– H3 163 ARETWNHLFDY
AB27
(Chothia)
HVR–H1 198 GFRFSSY
HVR–H2 199 SSGGD
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB27
(Kabat)
HVR–H1 200 SYAMS
HVR–H2 201 GISSGGDTYYVDSVKG
HVR–H3 193 ETWNHLFDY
AB27
(IMGT)
HVR–H1 173 GFRFSSYA
HVR–H2 174 ISSGGDT
HVR–H3 163 ARETWNHLFDY
AB119
(Chothia)
HVR–H1 202 GFSFSNF
HVR–H2 203 GSGD
HVR–H3 145 DST V S W SGDFFD Y
AB119
(Kabat)
HVR–H1 204 NFAVT
HVR–H2 144 TIGSGDTYYADSVKG
HVR–H3 145 DST V S WSGDFFD Y
AB119
(IMGT)
HVR–H1 205 GFSFSNFA
HVR–H2 206 IGSGDT
HVR–H3 207 AKDSTVSWSGDFFDY
AB119
(Chothia)
HVR–L1 146 RASQNVKNDLA
HVR–L2 147 AARIRET
HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB119
(Kabat)
HVR–L1 146 RASQNVKNDLA
HVR–L2 147 AARIRET
HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB119
(IMGT)
HVR–L1 208 QNVKND
HVR–L2 209 AAR
HVR–L3 210 QQYYDWP
AB135
(Chothia)
HVR–H1 211 GFSFSIY
HVR–H2 212 GADD
HVR–H3 151 DSTVG WSGDFFD Y
AB135
(Kabat)
HVR–H1 213 IYAVS
HVR–H2 150 TIGADDTYYADSVKG
HVR–H3 151 DSTVGWSGDFFDY
AB135
(IMGT)
HVR–H1 214 GFSFSIYA
HVR–H2 215 IGADDT
HVR–H3 216 AKDSTV G WSGDFFD Y
AB135
(Chothia)
HVR–L1 152 RASQNVRSDIA
HVR–L2 153 AASSRDT
HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB135
(Kabat)
HVR–L1 152 RASQNVRSDIA
HVR–L2 153 AASSRDT
HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB135
(IMGT)
HVR–L1 217 QNVRSD
HVR–L2 218 AAS
HVR–L3 148 QQYYDWPPFT
AB136
(Chothia)
HVR–H1 219 GFTFSSY
HVR–H2 220 SGSGEI
HVR–H3 157 ENNRYRFFDD
AB136
(Kabat)
HVR–H1 221 SYDVN
HVR–H2 156 LISGSGEIIYY ADS V KG
HVR–H3 157 ENNRYRFFDD
AB136
(IMGT)
HVR–H1 222 GFTFSSYD
HVR–H2 223 ISGSGEII
HVR–H3 224 AKENNRYR FFDD
AB136
(Chothia)
HVR–L1 158 RASQSVYTYLA
HVR 4.2 159 GASSRAT
HVR–L3 160 QQYYDRPPLT
AB136
(Kabat)
HVR–L1 158 RASQSVYTYLA
HVR–L2 159 GASSRAT
HVR–L3 160 QQYYDRPPLT
AB136
(IMGT)
HVR–L1 225 QSVYTY
HVR–L2 226 GAS
HVR–L3 160 QQYYDRPPLT
AB3
(Kabat)
HVR–H1 227 DYGMN
HVR–H2 228 QITSGSRT YY GAAVKG
HVR–H3 229 DFGSGVGSIDA
AB3
(Chothia)
HVR–H1 230 GFIFSDY
HVR–H2 231 TSGSR
HVR–H3 229 DFGSGVGSIDA
AB3
(Chothia)
HVR–L1 232 SGSRGRYG
HVR–L2 233 RDNQRPS
HVR–L3 234 GSYDGSIDI
AB3
(Kabat)
HVR–L1 232 SGSRGRYG
HVR–L2 233 RDNQRPS
HVR–L3 234 GSYDGSIDI
AB45
(Kabat)
HVR–H1 235 SYAMG
HVR–H2 236 GIDDDGST ANYGPAVKG
HVR–H3 237 ASVTGWSAHISGRLDT
AB45
(Chothia)
HVR–H1 219 GFTFSSY
HVR–H2 238 DDGST
HVR–H3 237 ASVTGWSAHISGRLDT
AB45
(Chothia)
HVR–L1 239 SGGGIYYYG
HVR–L2 240 ENDKRPS
HVR–L3 241 GGYDSNTTSGI
AB45
(Kabat)
HVR–L1 239 SGGGIYYYG
HVR–L2 240 ENDKRPS
HVR–L3 241 GGYDSNTTSGI

[0226] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 HVR, перечисленных в таблице 5 (например, VL–домен, содержащий 1, 2 или 3 HVR легкой цепи, перечисленных в таблице 5, и/или VH–домен, содержащий 1, 2 или 3 HVR тяжелой цепи, перечисленных в таблице 5).

[0227] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 191, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 191, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 196, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 199, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 191 или 198, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, 196 или 199, HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:232, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:233, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:234, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:230, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:231, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:232.В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:239, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:240, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:241, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:219, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:238, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:237.

[0228] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 194, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 194, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 200, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 194, 198 или 200, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195, 197 или 201, HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:232, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:233, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:234, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:227, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:228, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:230. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:239, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:240, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:241, и/или VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:235, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:236, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:237.

[0229] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:168, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:163. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163.

[0230] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 203, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 212, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 151; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 219, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 220, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:158, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160.

[0231] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 204, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 150, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 151; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 221, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:158, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160.

[0232] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 207; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 208, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 216; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 217, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 218, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит (a) VH–домен, содержащий HVR–H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 222, HVR–H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223, и HVR–H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 224; и/или (b) VL–домен, содержащий HVR–L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 225, HVR–L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 226, и HVR–L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160.

[0233] В некоторых вариантах реализации любого из вышеприведенных вариантов реализации антитело усиливает фагоцитоз макрофагом, экспрессирующим человеческий полипептид SIRP–α, усиливает активацию дендритных клеток, экспрессирующих человеческий полипептид SIRP–α, ингибирует in vivo рост опухоли или опухолевых клеток, экспрессирующих CD47, и/или не предотвращает взаимодействие между CD47–экспрессирующей клеткой и Т–клеткой. Типовые методы анализа для определения фагоцитоза, активации дендритных клеток, ингибирования роста опухоли и взаимодействия между CD47–экспрессирующими клетками и Т–клетками (например, анализа адгезии) описаны в данном документе и известны в данной области техники.

Получение антител и другие свойства антител

[0234] Антитело согласно настоящему изобретению можно получать любыми способами, известными в данной области техники. Типовые методики получения антител описаны ниже; однако эти типовые методики приведены исключительно в иллюстративных целях и не подразумевают ограничения. Кроме того, дополнительно описаны свойства типовых антител, подразумеваемые в случае применения описанных в данном документе антител.

[0235] В некоторых вариантах реализации антитело, которое «связывает» антиген, имеет константу диссоциации (KД) в отношении антигена, меньшую или равную 1 мкМ при 25°C. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению имеет константу диссоциации (KД) в отношении человеческих полипептидов SIRP–α v1 и/или v2, меньшую или равную 1 мкМ при 25°C, меньшую или равную 500 нМ при 25°C, меньшую или равную 400 нМ при 25°C, меньшую или равную 300 нМ при 25°C, меньшую или равную 250 нМ при 25°C, меньшую или равную 200 нМ при 25°C, меньшую или равную 200 нМ при 25°C, меньшую или равную 100 нМ при 25°C или меньшую или равную 50 нМ при 25°C. В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывает человеческий полипептид SIRP–α и один или более нечеловеческих полипептидов SIRP–α, связывает человеческий полипептид SIRP–α с большей аффинностью (например, в 10 или в 100 раз большей), чем нечеловеческий полипептид SIRP–α, хотя все еще считается, что оно «связывает» оба полипептида. В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывает нечеловеческий полипептид SIRP–α и один или более человеческих полипептидов SIRP–α, связывает нечеловеческий полипептид SIRP–α с большей аффинностью (например, в 10 или в 100 раз большей), чем человеческий полипептид SIRP–α, хотя все еще считается, что оно «связывает» оба полипептида. Аналитические методы для определения аффинности связывания известны в данной области техники и включают, без ограничений, метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР), например, описанный в данном документе; анализ связывания радиоактивно меченого антигена (РИА), например, с применением Fab–версии антитела и его антигена; и т. д. Другие типовые методы анализа связывания описаны в данном документе.

[0236] Чтобы получить антиген, его можно очистить или каким–либо другим способом получить из природного источника, или же его можно экспрессировать, используя рекомбинантные технологии. В некоторых вариантах реализации антиген можно использовать в виде растворимого белка. В некоторых вариантах реализации антиген может быть конъюгирован с другим полипептидом или другим соединением, например, для повышения его иммуногенности. Например, описанный в данном документе антиген может быть сопряжен с Fc–областью. В некоторых вариантах реализации клетку, экспрессирующую антиген на своей поверхности, можно использовать в качестве антигена.

[0237] Поликлональные антитела можно получать в организме животного посредством нескольких подкожных (П/К) или внутрибрюшинных (В/Б) инъекций антигена и адъюванта. Например, в данном документе приведены описания иммунизации кур. В некоторых вариантах реализации антиген конъюгирован с иммуногенным белком, например, гемоцианином фиссуреллы, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором соевого трипсина, с помощью бифункционального дериватизирующего агента. В данном документе приведены типовые способы иммунизации кур. Релевантные способы, подходящие для ряда других организмов, хорошо известны в данной области техники.

[0238] Как описано выше, моноклональные антитела можно получать рядом способов. В некоторых вариантах реализации моноклональное антитело согласно настоящему изобретению получают, используя гибридомный способ, впервые описанный в Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), и дополнительно описанный в Hongo et al, Hybridoma, 14(3): 253–260 (1995); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manned, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); и Hammerling et al, в: Monoclonal Antibodies and T–Cell Hybridomas 563–681 (Elsevier, N.Y., 1981). Технология человеческой гибридомы (технология триомы) описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927–937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185–91 (2005). Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, можно исследовать в отношении наличия представляющего интерес антитела, например, методом in vitro анализа связывания, иммунопреципитации, ELISA, РИА и т. д.; а аффинность связывания можно определить, например, в анализе Скэтчарда. Гибридому, которая вырабатывает антитела с необходимыми связывающими свойствами можно субклонировать и выращивать, используя известные способы культивирования, выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животного и т. д.

[0239] В некоторых вариантах реализации моноклональное антитело получают, используя такой метод, как применение библиотеки фагового дисплея. Смотрите, например, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1–37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.T. 2001). В некоторых вариантах реализации гены VH и VL клонируют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем исследуют в отношении антигенсвязывающего фага, например, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433–455 (1994). Фаг, как правило, представляет фрагменты антител, как в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv), так и в виде фрагментов Fab. В альтернативном варианте можно клонировать наивный репертуар (например, от человека), чтобы получить единый источник антител к широкому диапазону несобственных и также собственных антигенов без какой–либо иммунизации, как описано в Griffiths et al., EMBO J, 12: 725–734 (1993). И наконец, наивные библиотеки также можно получать синтетически, клонируя неперестроенные V–генные сегменты из стволовых клеток и используя ПЦР–праймеры, содержащие случайную последовательность, для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и для осуществления перестройки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381–388 (1992).

[0240] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой куриное антитело. Куриные антитела можно получать различными способами, известными в данной обрасти техники; смотрите, например, патенты США № 6143559; 8592644; и 9380769.

[0241] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой химерное антитело. Смотрите, например, патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851–6855 (1984). В некоторых вариантах реализации химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область, полученную от курицы, мыши, крысы, хомяка, кролика или отличного от человека примата, такого как обезьяна) и человеческую константную область. В некоторых вариантах реализации химерное антитело представляет собой антитело «с переключенным классом», в котором был изменен класс или подкласс по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

[0242] В некоторых вариантах реализации химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Нечеловеческое антитело можно гуманизировать, чтобы снизить его иммуногенность для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. В общем случае гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части) получены из нечеловеческого антитела (например, куриного антитела), а FR (или их части) получены из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело также необязательно будет содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах реализации некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. Обзор гуманизированных антител и способов их получения приведен например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619–1633 (2008). Также были описаны способы гуманизации куриных антител, например, в WO2005014653.

[0243] Человеческие каркасные области, подходящие для гуманизации, включают, но не ограничиваются этим: каркасные области, выбранные методом «наилучшего соответствия»; каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей тяжелой или легкой цепи; человеческие соматически мутированные каркасные области или каркасные области человеческой зародышевой линии; и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR. Смотрите, например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); Carter et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol, 151:2623 (1993); Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619–1633 (2008); и Baca et al., J. Biol Chem. 272:10678–10684 (1997).

[0244] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными способами, известными в данной обрасти техники. В некоторых вариантах реализации человеческое антитело вырабатывается отличным от человека животным, таким как генетически измененные куры (смотрите, например, патенты США № 8592644; и 9380769) и/или мыши, описанные в данном документе. Вцелом, человеческие антитела описаны в Lonberg, Cun. Opin. Immunol. 20:450–459 (2008).

[0245] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению вырабатывается в организме курицы или получено из него, например, с помощью описанных в данном документе способов.

[0246] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, включая, без ограничений, фрагмент Fab, F(ab’)2, Fab’–SH, Fv или scFv, или однодоменное, состоящее из одной тяжелой цепи или состоящее из одной легкой цепи антитело. Фрагменты антител можно получать, например, путем ферментативного расщепления или рекомбинантными способами. В некоторых вариантах реализации для создания фрагмента антитела используют протеолитическое расщепление интактного антитела, например, как описано в Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107–117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела получают с помощью рекомбинантной клетки–хозяина. Например, фрагменты антител Fab, Fv и ScFv экспрессируются и секретируются E. coli. В альтернативном варианте фрагменты антител можно выделять из фаговой библиотеки антител.

[0247] Фрагменты Fab'–SH можно непосредственно выделять из E. coli и проводить их химическое сопряжение с образованием фрагментов F(ab')2. Смотрите Carter et al., Bio/Technology 10:163–167 (1992). Фрагменты F(ab')2 также можно непосредственно выделять из культуры рекомбинантных клеток–хозяев. Фрагменты Fab и F(ab')2 с повышенным in vivo временем полужизни, содержащие остатки связывания эпитопа рецептора реутилизации, описаны в патенте США № 5869046.

[0248] В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). Смотрите WO 93/16185 и патенты США № 5571894 и 5587458. Можно конструировать слитые белки scFv с получением слияния эффекторного белка в амино– или карбокси–конце scFv. Фрагмент антитела также может представлять собой «линейное антитело», например, описанное в патенте США № 5641870. Такие линейные антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

[0249] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой мультиспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела обладают специфичностью связывания в отношении более чем одного антигена (например, обладают двумя, тремя или более специфичностями связывания). В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет две разные специфичности связывания в отношении одного антигена (например, характеризующихся разной аффинностью связывания и/или разными конкретными эпитопами одного антигена). В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело характеризуется специфичностью связывания в отношении двух разных антигенов. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой полноразмерное или интактное антитело. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой фрагмент антитела согласно настоящему изобретению.

[0250] В данном документе предусмотрены биспецифические или мультиспецифические антитела с рядом комбинаций вариантов специфичности связывания. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет первую специфичность связывания в отношении одного или более полипептидов SIRP–α, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет вторую специфичность связывания в отношении антигена, экспрессируемого раковой клеткой, например, на клеточной поверхности. Примеры таких антигенов включают, без ограничений, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop–2, 5T4, EphA4, BCMA, муцин 1, муцин 16, PTK7, PD–L1, STEAP1, рецептор эндотелина B, мезотелин, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, нектин 4, NaPi2b, LIV–1A, гуанилил циклазу C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, интегрин αVβ3, интегрин α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, тенасцин, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, муцин, CAIX, EPHA3, фолатный рецептор α, GD2, GD3 и ГКГС/пептидного комплекса, содержащего пептид из NY–ESO–1/LAGE, SSX–2, белок семейства MAGE, MAGE–A3, gp100/pmel17, Melan–A/MART–1, gp75/TRP1, тирозиназу, TRP2, CEA, PSA, TAG–72, незрелый рецептор ламинина, MOK/RAGE–1, WT–1, SAP–1, BING–4, EpCAM, MUC1, PRAME, сурвивин, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART–2, p53, Ras, β–катенин, TGF–βRII, HPV E6 или HPV E7. Не ограничиваясь теорией, считается, что комбинация такой специфичности связывания со специфичностью связывания против SIRP–α обеспечивает исключительное преимущество,например, для направления FcR–экспрессирующих лейкоцитов для нацеливания на опухолевую клетку со второй специфичность связывания, в то же время ингибируя восприимчивость SIRP–α, экспрессируемого лейкоцитом, к любому CD47, экспрессируемому опухолевой клеткой с первой специфичностью связывания.

[0251] В данной области техники известны различные способы создания и очистки биспецифических антител. Было описано множество подходов. Одним из подходов является подход «выступ–во–впадину» или «выпуклость–в–углубление» (смотрите, например, патент США № 5731168). В некоторых вариантах реализации гетеродимеризацию мономеров Fc–домена стимулируют, внося разные, но совместимые замены в два мономера Fc–домена, такие как пары остатков «выступ–во–впадину» и заряженные пары остатков. Взаимодействие типа выступ–во–впадину способствует образованию гетеродимера, тогда как взаимодействие «выступ–выступ» и «впадина–впадина» препятствует образованию гетеродимера вследствие стерического несоответствия и устранения благоприятных взаимодействий. Впадиной называется пространство, создаваемое при замещении оригинальной аминокислоты в белке другой аминокислотой, имеющей меньший объем боковой цепи. Выступом называется выпуклость, создаваемая при замещении оригинальной аминокислоты в белке другой аминокислотой, имеющей больший объем боковой цепи. Например, в некоторых вариантах реализации замещаемая аминокислота находится в CH3 константного домена антитела мономера Fc–домена и вовлечена в димеризацию двух мономеров Fc–домена. В некоторых вариантах реализации в CH3 константного домена антитела создается впадина, соответствующая выступу в другом CH3 константного домена антитела, так, что аминокислоты выступа и впадины стимулируют или способствуют гетеродимеризации двух мономеров Fc–домена. В некоторых вариантах реализации впадина в CH3 константного домена антитела создается, чтобы лучше соответствовать оригинальной аминокислоте в другом CH3 константного домена антитела. В некоторых вариантах реализации выступ в CH3 константного домена антитела создается для образования дополнительных взаимодействий с оригинальными аминокислотами в другом CH3 константного домена антитела.

[0252] В некоторых вариантах реализации впадину создают путем замещения аминокислот, имеющих большие боковые цепи, таких как тирозин или триптофан, аминокислотами, имеющими меньшие боковые цепи, такими как аланин, валин или треонин, например, как в случае мутации Y407V в CH3 константного домена антитела. Аналогично, в некоторых вариантах реализации выступ создают путем замещения аминокислот, имеющих меньшие боковые цепи, аминокислотами, имеющими большие боковые цепи, например, как в случае мутации T366W в CH3 константного домена антитела. В некоторых вариантах реализации один мономер Fc–домена содержит мутацию типа «выступа» T366W, а другой мономер Fc–домена содержит мутации типа «впадины» T366S, L358A и Y407V. В некоторых вариантах реализации полипептид согласно изобретению, включая высокоаффинный вариант D1 SIRP–α, слит с мономером Fc–домена, содержащим мутацию типа «выступ» T366W, для ограничения нежелательного образования гомодимера «выступ–выступ». Примеры аминокислотных пар типа «выступ–во–впадину» включены, без ограничений, в таблицу 3.

Таблица 3. Аминокислотные пары типа «выступ–во–впадину».

Мономер
Fc–
Домена 1
Y407T Y407A F405A T394S T366S
L358A
Y407V
T394W
Y407T
T394S
Y407A
T366W
T394S
Мономер Fc–домена 2 T366Y T366W T394W F405W T366W T366Y
F405A
T366W
F405W
F405W
Y407A

[0253] В другом подходе используются вариабельные домены антитела с необходимой специфичностью связывания (участки связывания антитело–антиген), слитые с последовательностями константного домена иммуноглобулина, например, с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, а также областей CH2 и CH3. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет гибридную тяжелую цепь иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и гибридную пару тяжелая цепь – легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающую вторую специфичность связывания) в другом плече. Смотрите WO 94/04690. В другом подходе используется перекрестное сшивание (смотрите, например, патент США № 4676980) для получения гетероконъюгированного антитела. В некоторых вариантах реализации биспецифические антитела можно получать, используя химическую связь (смотрите, например, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)) для протеолитического расщепления интактного антитела на фрагменты F(ab')2, которые восстанавливаются в присутствии дитиолового комплексирующего агента и превращаются в производные тионитробензоата (ТНБ), одно из которых повторно преобразуется в Fab’–посредством восстановления и смешивается с другим Fab'–ТНБ производным с образованием биспецифического антитела. В некоторых вариантах реализации фрагменты Fab'–SH химически сопряжены. В некоторых вариантах реализации фрагменты биспецифических антител получают в клеточной культуре, используя лейциновые молнии, как описано в Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547– 1553 (1992). Информацию о других форматах биспецифических антител смотрите, например, в Spiess, C. et al. (2015) Mol. Immunol. 67:95–106.

[0254] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой диатело. Смотрите, например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444–6448 (1993). В диателе домены VH и VL одного фрагмента спарены с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, образуя, таким образом, два антигенсвязывающих участка. Сообщалось о другой стратегии получения фрагментов биспецифических антител путем использования димеров из одноцепочечных Fv (sFv). Смотрите Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

[0255] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой однодоменное антитело. Однодоменным антителом называется одиночная полипептидная цепь, содержащая весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах реализации однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (смотрите, например, патент США № 6248516 B1). В одном варианте реализации однодоменное антитело содержит весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи антитела. Также известны антитела верблюжьих.

[0256] Антитела можно получать рекомбинантными способами. Для рекомбинантного получения антитела против антигена выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и вставляют в способный к репликации вектор для дополнительного клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую антитело, легко можно выделять и секвенировать, используя традиционные процедуры (например, путем применения олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Доступно большое количество векторов. Компоненты вектора в общем случае включают, но не ограничиваются этим, один или более из следующих компонентов: сигнальная последовательность, точка начала репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.

[0257] Антитело согласно настоящему изобретению можно получать рекомбинантным способом в виде полипептида, слитого с гетерологичным полипептидом, например, сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический участок расщепления в N–конце зрелого белка или полипептида. Выбранной гетерологичной сигнальной последовательностью может быть последовательность, которая распознается и процессируется (например, расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой–хозяином. В случае прокариотических клеток–хозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность, сигнальную последовательность замещают прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. В случае дрожжевой секреции нативную сигнальную последовательность можно замещать, например, лидерной последовательностью дрожжевой инвертазы, лидерной последовательностью фактора (включая лидерные последовательности α–фактора Saccharomyces и Kluyveromyces ) или лидерной последовательностью кислой фосфатазы, лидерной последовательностью глюкоамилазы C. albicans и т. д. В случае экспрессии в клетках млекопитающих доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, gD–сигнал вируса простого герпеса.

[0258] Как экспрессионные, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает возможность репликации вектора в одной или более выбранных клетках–хозяевах, например, возможность репликации вектора независимо от хромосомной ДНК хозяина. Эта последовательность может содержать точки начала репликации или последовательности автономной репликации. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. В общем случае компонент точки начала репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих (можно использовать точку SV40, так как она содержит ранний промотор).

[0259] Экспрессионные и клонирующие векторы могут содержать селективный ген или селективный маркер. Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) восполняют ауксотрофный дефицит клетки или (c) обеспечивают важные питательные вещества, не доступные в комплексных средах. Примеры доминантной селекции включают применение таких препаратов как неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин. Другими примерами подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, обеспечивающие возможность идентификации клеток, способных поглощать кодирующую антитело нуклеиновую кислоту, такие как DHFR, глутаминсинтетаза (GS), тимидинкинада, металлотионеин–I и –II, предпочтительно гены металлотионеина приматов, аденозиндезаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т. д. Например, линию клеток яичника китайского хомяка (CHO) с дефицитом активности эндогенного DHFR, трансформированную геном DHFR, идентифицируют, культивируя трансформантов в культуральной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR.

[0260] В альтернативном варианте отбор клеток–хозяев (в частности, хозяев дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR), трансформированных или совместно трансформированных последовательностями ДНК, кодирующими представляющее интерес антитело, ген DHFR дикого типа и другой селективный маркер, такой как аминогликозид–3'–фосфотрансфераза (APH), можно проводить по росту клеток в среде, содержащей селективный агент для селективного маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин или G418.

[0261] Экспрессионные и клонирующие векторы в общем случае содержат промотор, который распознается организмом–хозяином и который функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело. Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают промотор phoA, промоторные системы β–лактамазы и лактозы, промотор щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. При этом подходят и другие известные бактериальные промоторы. Промоторные последовательности известны также для эукариот. Дрожжевые промоторы хорошо известны в данной области техники и могут включать индуцибельные промоторы/энхансеры, регулируемые условиями роста. Практически все эукариотические гены имеют AT–богатую область, расположенную приблизительно на 25–30 оснований выше сайта инициации транскрипции. Примеры включают, без ограничений, промоторы 3–фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо–6–фосфат изомераза, 3–фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Транскрипцию антитела из векторов в клетках–хозяевах млекопитающих можно регулировать, например, промоторами, полученными из геномов вирусов. Ранний и поздний промоторы вируса SV40 удобно получать в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит вирусную точку начала репликации SV40. Немедленно–ранний промотор человеческого цитомегаловируса удобно получать в виде рестрикционного фрагмента HindIII E. В альтернативном варианте в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.

[0262] Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело согласно этому изобретению, высшими эукариотами часто повышают, вставляя в вектор последовательность энхансера. На сегодняшний день известно много последовательностей энхансеров из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α–фетопротеина и инсулина). Однако, как правило, используют энхансер из вируса эукариотической клетки.

[0263] Экспрессионные векторы, применяемые в эукариотических клетках–хозяевах (дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, людей или ядросодержащих клетках других многоклеточных организмов) также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК.

[0264] Клетки–хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии ДНК в векторах согласно данному документу являются клетками прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанными выше. Подходящие для данной цели прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobactehaceae, такие как Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например. Salmonella typhirnurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, и т. д. Кроме прокариот эукариотические микроорганизмы, такие как нитевидные грибы или дрожжи, являются подходящими для клонирования или экспрессии хозяевами для антиген–кодирующих векторов. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи наиболее часто используются среди низших эукариотических микроорганизмов–хозяев. Можно отбирать определенные штаммы грибов и дрожжей, в которых пути гликозилирования были «гуманизированы», что приводит к выработке антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. Смотрите, например, Li et al., Nat. Biotech. 24:210–215 (2006).

[0265] Культуры клеток растений, например, хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов, ряски (Leninaceae), люцерны (M. truncatula) и табака, также можно использовать в качестве хозяев.

[0266] Подходящие для экспрессии гликозилированного антитела клетки–хозяева также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие пермиссивные клетки–хозяева насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (москит), Aedes albopictus (москит), Drosophila melanogaster (фруктовая муха) и Bombyx mori.

[0267] Клетки позвоночных можно использовать в качестве хозяев, а размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) стало рутинной процедурой. Примерами применимых линий клеток–хозяев млекопитающих являются линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS–7, ATCC CRL 1651); линия почки эмбриона человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки сертоли мышей (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243–251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO–76, ATCC CRL–1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3 A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мышей (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44–68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2). Другие применимые линии клеток–хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), включая DHFR–клетки CHO (Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и линии клеток миеломы, такие как NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток–хозяев млекопитающих, подходящих для выработки антител, смотрите, например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255–268.

[0268] Клетки–хозяев согласно настоящему изобретению можно культивировать в различных средах. Коммерчески доступные среды, такие как среда Ham F10 (Sigma), минимальная питательная среда ((MEM), (Sigma), RPMi–1640 (Sigma) и среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко ((DMEM), Sigma), подходят для культивирования клеток–хозяев. Кроме того, среды, описанные в Ham et al, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et αl., Anal Biockem. 102:255 (1980), патентах США № 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США Re. 30985, можно использовать в качестве культуральной среды для клеток–хозяев. Любые из этих сред можно в случае необходимости дополнять гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как ГЭПЭС), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как препарат ГЕНТАМИЦИН™), следовыми элементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в подходящих концентрациях, как известно специалистам в данной области техники. Культуральные условия, такие как температура, pH и т. д., представляют условия, применяемые ранее с клетками–хозяевами, отобранными для экспрессии, и известны для специалиста в данной области техники.

[0269] При применении рекомбинантных технологий антитело можно получать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или оно может напрямую секретироваться в среду. Если антитело вырабатывается внутриклеточно, на первом этапе удаляют дебрис из частиц, как клеток–хозяев, так и лизированных фрагментов, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В Carter et al, Bio/Technology 10:163–167 (1992) описана процедура выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство E. coli.

[0270] Композицию антител, полученную из клеток, можно очищать, используя, например, хроматографию с гидроксиапатитом, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, гель–электрофорез, диализ и аффинную хроматографию, при этом аффинная хроматография является одним из обычно предпочитаемых этапов очистки.

[0271] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит константную область каппа или лямбда легкой цепи. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:325, 326 или 426. Типовые и неограничивающие последовательности константной области легкой цепи приведены в таблице 6. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит константную область лямбда легкой цепи IGLC3 или константную область IGLC7.

[0272] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc–область. Например, в некоторых вариантах реализации Fc–область представляет собой человеческую Fc–область, например, IgG1, IgG2 или IgG4 и их подтипов. Типовые и неограничивающие Fc–области приведены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:320–324, показанных в таблице 6. В некоторых вариантах реализации Fc–область в одной или более аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:320–324 содержит одну или более мутаций, описанных в данном документе, например, выше.

Таблица 6. Типовые последовательности константной области

Название SEQ ID NO Последовательность
IgG1 дикого типа 320
IgG1_AAA_N297A 321
IgG2 322
IgG2Da 323
IgG4_S228P 324
Человеческая каппа 325
Человеческая лямбда IGLC1 326
Человеческая лямбда IGLC2 426

[0273] В некоторых вариантах реализации Fc–область содержит одну или более мутаций, которые влияют на одно или более свойств антитела, таких как стабильность, профиль гликозилирования или другие модификации, эффекторная клеточная функция, фармакокинетика и т. д. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению характеризуется сниженным или минимальным гликозилированием. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению имеет устраненную или сниженную эффекторную функцию. Типовые Fc–мутации включают, без ограничений, (i) мутации Fc–области IgG1 человека L234A, L235A, G237A и N297A; (ii) мутации Fc–области IgG2 человека A330S, P331S и N297A; и (iii) мутации Fc–области IgG4 человека S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 и N297A (нумерация EU). В некоторых вариантах реализации Fc–область IgG2 человека содержит мутации A330S и P331S. В некоторых вариантах реализации Fc–область IgG4 человека содержит мутацию S288P. В некоторых вариантах реализации Fc–область IgG4 человека содержит мутации S288P и L235E.

[0274] Антитела, нацеленные на антигены клеточной поверхности, могут запускать иммуностимулирующие и эффекторные функции, которые связаны с привлечением Fc–рецептора (FcR) на иммунных клетках. Существует некоторое количество Fc–рецепторов, специфических для конкретных классов антител, включая IgG (гамма–рецепторы), IgE (эпсилон–рецепторы), IgA (альфа–рецепторы) и IgM (мю–рецепторы). Связывание Fc–области с Fc–рецепторами на клеточной поверхности может запускать многочисленные биологические реакции, включая фагоцитоз покрытых антителами частиц (антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз или АЗКФ), клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток клетками–киллерами (антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или АЗКЦ) и высвобождение воспалительных медиаторов, перенос через плаценту и регуляция выработки иммуноглобулина. Кроме того, связывание компонента C1 комплемента с антителами может активировать систему комплемента. Активация комплемента может быть важной для лизиса клеточных патогенов. Однако активация комплемента также может стимулировать воспалительный ответ и также может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность или другие иммунологические нарушения. Вариантные Fc–области со сниженной или устраненной способностью связывать определенные Fc–рецепторы применимы для разработки терапевтических антител и Fc–слитых полипептидных конструкций, действие которых состоит в нацеливании, активации или нейтрализации функций лигандов, и в то же время не приводит к повреждению или разрушению локальных клеток или тканей.

[0275] В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена относится к полипептидной цепи, которая содержит второй и третий константные домены антитела (например, CH2 и CH3). В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена также содержит шарнирный домен. В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена принадлежит антителу любого изотипа иммуноглобулина, включая IgG, IgE, IgM, IgA и IgD. Кроме того, в некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена принадлежит любому подтипу IgG (например, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 и IgG4). В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена содержит до десяти изменений по сравнению с последовательностью мономера Fc–домена дикого типа (например, 1–10, 1–8, 1–6, 1–4 аминокислотных замен, добавлений или вставок, делеций или их комбинаций), которые изменяют взаимодействие между Fc–доменом и Fc–рецептором.

[0276] В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена иммуноглобулина или фрагмент мономера Fc–домена способен образовывать Fc–домен с другим мономером Fc–домена. В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена иммуноглобулина или фрагмент мономера Fc–домена не способен образовывать Fc–домен с другим мономером Fc–домена. В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена или фрагмент Fc–домена слит с полипептидом согласно изобретению для повышения сывороточного времени полужизни полипептида. В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена или фрагмент мономера Fc–домена, слитый с полипептидом согласно изобретению, димеризуется со вторым мономером Fc–домена с образованием Fc–домена, который связывает Fc–рецептор, или, в альтернативном варианте, мономер Fc–домена связывается с Fc–рецептором. В некоторых вариантах реализации Fc–домен или фрагмент Fc–домена, слитый с полипептидом для повышения сывороточного времени полужизни полипептида, не индуцирует ответ со стороны иммунной системы. Fc–домен содержит два мономера Fc–домена, которые димеризуются посредством взаимодействия между константными доменами CH3 антитела.

[0277] Fc–домен дикого типа образует минимальную структуру, которая связывается с Fc–рецептором, например, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb и FcγRIV. В некоторых вариантах реализации Fc–домен в антителе согласно настоящему изобретению содержит одну или более аминокислотных замен, добавок или вставок, делеций или любые их комбинации, которые приводят к снижению эффекторной функции, например, снижению антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), снижению комплементзависимого цитолиза (КЗЦ), снижению антителозависимого клеточноопосредованного фагоцитоза (АЗКФ) или любым их комбинациям. Например, антитело согласно настоящему изобретению может демонстрировать сниженное связывание (например, минимальное связывание или отсутствие связывания) с человеческим Fc–рецептором сниженное связывание (например, минимальное связывание или отсутствие связывания) с белком комплемента C1q; сниженное связывание (например, минимальное связывание или отсутствие связывания) с человеческим FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB или любыми их комбинациями и C1q; измененную или сниженную антителозависимую эффекторную функцию, такую как АЗКЦ, КЗЦ, АЗКФ или любые их комбинации; и т. д. Типовые мутации включают, без ограничений, одну или более аминокислотных замен в E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 или P329 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[0278] В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению характеризуется сниженным или аблированным связыванием с Fcγ–рецепторами CD16a, CD32a, CD32b, CD32c и CD64. В некоторых вариантах реализации антитело с ненативной Fc–областью, описанное данном документе, демонстрирует по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или большее снижение в связывании C1q по сравнению с антителом, содержащим Fc–область дикого типа. В некоторых вариантах реализации антитело с ненативной Fc–областью, описанное данном документе, демонстрирует по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или большее снижение в КЗЦ по сравнению с антителом, содержащим Fc–область дикого типа.

[0279] В некоторых вариантах реализации Fc–варианты согласно данному документу характеризуются минимальным гликозилированием или сниженным гликозилированием по сравнению с последовательностью дикого типа. В некоторых вариантах реализации дегликозилирование осуществляют с помощью мутации N297A или посредством мутации N297 на любую аминокислоту, отличную от N.

[0280] В некоторых вариантах реализации варианты константных областей антитела IgG (например, Fc–варианты) обладают сниженной способностью специфически связывать Fcγ–рецепторы или обладают сниженной способностью индуцировать фагоцитоз. В некоторых вариантах реализации варианты константных областей антитела IgG (например, Fc–варианты) обладают сниженной способностью специфически связывать Fcγ–рецепторы и обладают сниженной способностью индуцировать фагоцитоз. Например, в некоторых вариантах реализации Fc–домен мутирован так, чтобы у него отсутствовали эффекторные функции, что типично для «мертвого» Fc–домена. Например, в некоторых вариантах реализации Fc–домен содержит конкретные аминокислотные замены, которые, как известно, минимизируют взаимодействие между Fc–доменом и Fcγ–рецептором. В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена получен из антитела IgG1 и содержит одну или более аминокислотных замен L234A, L235A, G237A и N297A (обозначенных в соответствии с системой нумерации EU по Kabat et al., 1991). В некоторых вариантах реализации в такой Fc–вариант IgG1 включены одна или более дополнительных мутаций. Неограничивающие примеры таких дополнительных мутаций для Fc–вариантов человеческого IgG1 включают E318A и K322A. В некоторых случаях Fc–вариант человеческого IgG1 содержит всего до 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 или менее мутаций по сравнению с последовательностью человеческого IgG1 дикого типа. В некоторых вариантах реализации в такой Fc–вариант IgG1 включены одна или более дополнительных делеций. Например, в некоторых вариантах реализации удален С–концевой лизин константной области тяжелой цепи Fc IgG1, например, для повышения гомогенности полипептида, когда полипептид вырабатывается в клетках бактерий или млекопитающих В некоторых случаях Fc–вариант человеческого IgG1 содержит всего до 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 или менее делеций по сравнению с последовательностью человеческого IgG1 дикого типа.

[0281] В некоторых вариантах реализации мономер Fc–домена получен из антитела IgG2 и содержит аминокислотные замены A330S, P331S или как A330S, так и P331S. Вышеуказанные аминокислотные позиции определены в соответствии с Kabat, et al. (1991). Нумерация аминокислотных остатков по Kabat для данного антитела может быть определена путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Kabat последовательностью. В некоторых вариантах реализации Fc–вариант содержит последовательность Fc человеческого IgG2, содержащую одну или более аминокислотных замен A330S, P331S и N297A (по определению в соответствии с системой нумерации EU по Kabat et al. (1991). В некоторых вариантах реализации в такие Fc–варианты IgG2 включены одна или более дополнительных мутаций. Неограничивающие примеры таких дополнительных мутаций для Fc–варианта человеческого IgG2 включают V234A, G237A, P238S, V309L и H268A (обозначенных в соответствии с системой нумерации EU по Kabat et al. (1991)). В некоторых случаях Fc–вариант человеческого IgG2 содержит всего до 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или менее мутаций по сравнению с последовательностью человеческого IgG2 дикого типа. В некоторых вариантах реализации в такой Fc–вариант IgG2 включены одна или более дополнительных делеций.

[0282] Если Fc–вариант представляет собой Fc–вариант IgG4, в некоторых вариантах реализации такой Fc–вариант содержит мутацию S228P, E233P, F234V, L235A, L235E или delG236 (обозначенную в соответствии с Kabat, et al. (1991)). В некоторых случаях Fc–вариант человеческого IgG4 содержит всего до 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мутации (–ий) по сравнению с последовательностью человеческого IgG4 дикого типа.

[0283] В некоторых вариантах реализации Fc–вариант демонстрирует сниженное связывание с Fc–рецептором субъекта по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа. В некоторых вариантах реализации Fc–вариант демонстрирует аблированное связывание с Fc–рецептором субъекта по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа. В некоторых вариантах реализации Fc–вариант демонстрирует снижение фагоцитоза по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа. В некоторых вариантах реализации Fc–вариант демонстрирует аблированный фагоцитоз по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа.

[0284] Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, которая также называется в данном документе АЗКЦ, относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc–рецепторами (FcR), присутствует на некоторых цитотоксических клетках (например, естественных клетках–киллерах (NK) и нейтрофилах), позволяя этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с антиген–несущей клеткой–мишенью и впоследствии уничтожать клетку–мишень. Антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз, который также называется в данном документе АЗКФ, относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc–рецепторами (FcR), присутствует на некоторых фагоцитарных клетках (например, макрофагах), позволяя этим фагоцитарным эффекторным клеткам специфически связываться с антиген–несущей клеткой–мишенью и впоследствии поглощать и расщеплять клетку–мишень. Лиганд–специфические высокоаффинные антитела IgG, направляемые к поверхности клетки, могут стимулировать цитотоксические или фагоцитарные клетки и могут применяться для подобного уничтожения. В некоторых вариантах реализации полипептидные конструкции, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют сниженную АЗКЦ или АЗКФ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа. В некоторых вариантах реализации полипептидные конструкции, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или большее снижение АЗКЦ или АЗКФ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа. В некоторых вариантах реализации антитела, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют аблированную АЗКЦ или АЗКФ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа.

[0285] Комплементзависимая цитотоксичность, которая также называется в данном документе КЗЦ, относится к форме цитотоксичности, при которой происходит активация каскада комплемента посредством связывания компонента комплемента C1q с Fc антитела. В некоторых вариантах реализации полипептидные конструкции, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или большее снижение в связывании C1q по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа. В некоторых случаях полипептидные конструкции, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют сниженную КЗЦ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа. В некоторых вариантах реализации полипептидные конструкции, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или большее снижение в КЗЦ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа. В некоторых случаях антитела, содержащие описанный в данном документе Fc–вариант, демонстрируют незначительную КЗЦ по сравнению с полипептидной конструкцией, содержащей Fc–область дикого типа.

[0286] Fc–варианты согласно данному документу включают те, которые демонстрируют сниженное связывание с Fcγ–рецептором по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа. Например, в некоторых вариантах реализации Fc–вариант демонстрирует связывание с Fcγ–рецептором, меньшее, чем связывание с Fcγ–рецептором, демонстрируемое Fc–областью человеческого IgG дикого типа. В некоторых случаях Fc–вариант характеризуется связыванием с Fcγ–рецептором, сниженным на 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (полностью аблированная эффекторная функция). В некоторых вариантах реализации снижение связывания наблюдается в отношении одного или более Fcγ–рецепторов, например, CD16a, CD32a, CD32b, CD32c или CD64.

[0287] В некоторых случаях описанные в данном документе Fc–варианты демонстрируют снижение фагоцитоза по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа. Такие Fc–варианты демонстрируют снижение фагоцитоза по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа, при этом снижение фагоцитарной активности составляется, например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В некоторых случаях Fc–вариант демонстрирует аблированный фагоцитоз по сравнению с Fc–областью человеческого IgG дикого типа.

[0288] В некоторых вариантах реализации описанные в данном документе Fc–варианты сопряжены с одним или более партнерами по слиянию. В некоторых случаях партнер по слиянию представляет собой терапевтическое соединение, такое как цитотоксический агент согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях партнера по слиянию выбирают, чтобы обеспечить возможность нацеливания экспрессируемого белка, очистки, скрининга, представления и т. д. В некоторых вариантах реализации партнер по слиянию также влияет на степень связывания с Fc–рецепторами или на степень снижения фагоцитоза.

[0289] В некоторых вариантах реализации партнеры по слиянию связаны с последовательностью Fc–варианта посредством линкерной последовательности. В некоторых вариантах реализации линкерная последовательность в общем случае содержит небольшое число аминокислот, например, менее десяти аминокислот, хотя применяются также более длинные линкеры. В некоторых случаях длина линкера составляет менее 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот или меньше. В некоторых случаях длина линкера составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 или 35 аминокислот или больше. Необязательно, в некоторых вариантах реализации используется отщепляемый линкер.

[0290] В некоторых вариантах реализации партнер по слиянию представляет собой нацеливающую или сигнальную последовательность, которая направляет белок Fc–варианта и любых связанных с ним партнеров по слиянию в необходимую клеточную локацию или во внеклеточную среду. В некоторых вариантах реализации определенные сигнальные последовательности направляют белок для секреции в среду для роста или в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и внешней мембраной клетки. В некоторых вариантах реализации партнер по слиянию представляет собой последовательность, которая кодирует пептид или белок, которые обеспечивают возможность очистки или скрининга. Такие партнеры по слиянию включают, но не ограничиваются этим, полигистидиновые метки (His–м