Пробоотборник крови с гепариновой основой без активации тромбоцитов
Группа изобретений относится к диагностическому анализу пробы крови. Раскрыт способ определения показателя(ей) газов крови, показателя(ей) основной метаболической панели (ВМР) и количества тромбоцитов в единственной пробе крови in vitro, включающий стадии предоставления пробоотборника крови, содержащего гепарин и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество, выбранное из аналогов простагландина, где пробоотборник крови не содержит любого из MgSO4, EDTA и цитрата; подачи крови к пробоотборнику крови для получения единственной пробы крови; перемешивания единственной пробы крови в пробоотборнике крови и определения показателя(ей) газов крови, показателя(ей) основной метаболической панели (ВМР) и количества тромбоцитов в единственной пробе крови. Также раскрыт пробоотборник крови в виде шприца. Группа изобретений обеспечивает анализ «3 в 1», а именно определение показателя(ей) газов крови, показателя(ей) основной метаболической панели (ВМР) и количества тромбоцитов в единственной пробе. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл., 5 пр.
Область техники
Настоящее изобретение относится к диагностическому анализу пробы крови.
Уровень изобретения
Быстрое получение анализов крови является основополагающим для диагностики и лечения острого заболевания. Определение кислотно-щелочного баланса и степени оксигенации лежит в основе современных алгоритмов лечения неотложных состояний, для чего применяют анализ газов артериальной крови (BG). Кроме того, устройства, предназначенные для проведения анализов при неотложных состояниях, позволяют получить данные, например, об электролитах, сердечных биомаркерах, функции почек (креатинин) и о воспалении (С-реактивный белок).
Определение показателей основной метаболической панели (BMP) применяется у людей для анализа почечных электролитов и состояния почек и кислотно-щелочного баланса, а также для определения уровня глюкозы в крови, при этом все эти показатели связаны с метаболизмом человека. Основная метаболическая панель может также применяться для мониторинга состояния больных в стационаре и у людей с некоторыми диагностированными состояниями, например, с гипертонией и гипокалиемией.
Дополнительно, при некоторых заболеваниях количество лейкоцитов крови (WBC) является важным биомаркером. Можно проводить дифференциальный подсчет лейкоцитов и выделять пять разных типов клеток крови (анализ 5-диф или частичный 5-диф), а именно, нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы. Альтернативно, лейкоциты можно подразделять на гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы, определяемые как единая группа), лимфоциты и моноциты (анализ 3-диф или частичный 3-диф). Количество клеток каждой группы указывается в процентах. Сдвиг показателей процентного содержания может свидетельствовать о патологическом состоянии.
Дополнительно, еще одним показателем является количество тромбоцитов (также называемых кровяными пластинками). Тромбоциты представляют собой небольшую группу клеток, необходимых для нормального свертывания крови. Данные о количестве тромбоцитов можно использовать для скрининга или диагностики различных заболеваний и состояний, при которых могут возникать проблемы с образованием тромбов. Этот показатель, наряду с другими, можно использовать, например, при лечении патологического кровотечения, болезни костного мозга или при такой патологии, как избыточное свертывание крови.
Этот анализ можно использовать в качестве инструмента контроля для людей, имеющих указанные состояния или получающих лечение лекарственными средствами, которые оказывают достоверное влияние на тромбоциты. Этот анализ можно также использовать для контроля состояния пациентов в ходе их лечения по поводу тромбоцитарных нарушений, для определения эффективности лечения.
Вместе с тем, обычно отбор проб крови с целью диагностического измерения указанных выше показателей необходимо осуществлять по отдельности. Например, для анализа показателей BG и BMP стандартным антикоагулянтом является гепарин. Гепарин препятствует коагуляции крови, но при этом он не предотвращает активацию и агрегацию тромбоцитов (кровяных пластинок), что приводит к образованию тромбоцитарных сгустков. Поэтому в настоящее время гепарин не используется для общего клинического анализа крови (СВС/ОАК), в который входит определение количества лейкоцитов, тромбоцитов, 3-диф или 5-диф, концентрации эритроцитов (RBC), гематокрита, концентрации гемоглобина и описательные параметры эритроцитов. Определение количества тромбоцитов в гепаринизированной крови можно проводить, в частности, с помощью известных автоматизированных гематологических анализаторов, которые не способны отличать одиночные тромбоциты от агрегированных сгустков тромбоцитов. При этом гематологические анализаторы могут неправильно классифицировать сгустки тромбоцитов, принимая их за лейкоциты, и, следовательно, можно получить ложные данные о большом количестве лейкоцитов, что может привести к ошибочной диагностике или сообщениям об ошибках и с пометками, что делает результаты исследования неприемлемыми.
Другие стандартные антикоагулянты, обычно применяемые в гематологии, представляют собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), а также двунатриевую, двукалиевую и трикалиевую соли. Использование ЭДТА является общепринятым для безопасного и надежного выполнения общего клинического анализа крови (ОАК). Дополнительно, соли ЭДТА совместимы со стандартными протоколами окрашивания мазков крови, то есть не влияют на окрашивание. Если возникают проблемы с ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопенией, в качестве альтернативного антикоагулянта используется соль лимонной кислоты. Вместе с тем, ЭДТА или соль лимонной кислоты нельзя использовать для анализа показателей BG и BMP, поскольку эти антикоагулянты серьезно влияют на определение уровня электролитов. Например, ЭДТА и соль лимонной кислоты образуют комплекс с Ca2+ и таким образом влияют на показатели уровня Ca2+, при этом указанные антикоагулянты даже способны повредить датчики кальция в автоматизированных анализаторах.
В настоящее время анализы крови, и, конкретно, общий клинический анализ крови (ОАК) выполняют на пробах крови с антикоагулянтами ЭДТА или солью лимонной кислоты, а не на гепаринизированных пробах крови. Следовательно, всесторонний анализ параметров ОАК, BG и BMP в настоящее время приходится выполнять в отдельных пробах крови с дифференцированной антикоагуляцией, и на отдельных устройствах.
Авторы Schnuff-Wernet et al. (Br. J. Haematol. 162, 684, 2013) описывают возможность использования MgSO4 для анализа крови пациентов с псевдотромбоцитопенией в качестве антикоагулянта, как альтернативы ЭДТА или соли лимонной кислоты.
В документе US 2010/0280412 раскрыты ингибиторы фактора свертывания крови Xa и способ антикоагуляции человеческой крови, в котором концентрация кальция в крови остается постоянной, не происходит образование тромбина, и не затронута функция тромбоцитов.
В документе US 6880384 B2 описан автоматизированный анализатор крови для измерения показателей газов крови, показателей метаболизма и электролитов, а также пробоотборник крови, содержащее образец крови и перемешивающий элемент.
В свете вышеупомянутого существует потребность в методике получения единственного образца крови, который можно использовать для определения BG, BMP, количества тромбоцитов и лейкоцитов, и в методике определения всех показателей с помощью единственного автоматизированного анализатора крови и единственного образца крови. Это позволит уменьшить нагрузку на пациента, связанную с необходимостью отбора нескольких проб крови для определения разных показателей крови, описанных выше.
Таким образом, целью настоящего изобретения являются способы подготовки пробы крови к анализу, которые можно применять для "3-в-1" анализа BG, BMP и определения количества тромбоцитов, и необязательно, количества лейкоцитов (или общего клинического анализа крови (ОАК)).
Дополнительной целью настоящего изобретения является получение подходящих средств для подготовки указанной пробы крови к анализу, которые можно применять для "3-в-1" анализа BG, BMP и определения количества тромбоцитов, и необязательно, количества лейкоцитов (или ОАК).
Сущность изобретения
Цели изобретения достигнуты способом подготовки пробы крови in vitro, при этом кровь объединяли:
a) по меньшей мере с одним антикоагулянтом для определения показателей газов крови и основной метаболической панели; и
b) по меньшей мере с одним антитромбоцитарным веществом.
Цели изобретения также достигнуты способом подготовки пробы к анализу крови, и указанный способ включает стадию
a) отбора крови у пациента в пробоотборник крови; при этом пробоотборник крови содержит по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей газов крови и BMP и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество.
Дополнительно, цели достигнуты способом определения показателей газов крови и BMP и количества тромбоцитов в образце крови in vitro, и указанный способ включает стадию
a) определения показателей газов крови, BMP и/или количества тромбоцитов в пробе крови, полученной, как описано выше.
Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию по меньшей мере одного антикоагулянта для определения показателей газов крови и BMP и по меньшей мере одного антитромбоцитарного вещества для подготовки пробы крови к анализу показателей BG и BMP и количества тромбоцитов, предпочтительно в пробоотборнике крови.
В другом аспекте цели достигнуты путем применения пробоотборника крови, и указанное устройство содержит кровь, по меньшей мере, один антикоагулянт для определения BG и показателей BMP, и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество для определения BG, показателей BMP и/или количества тромбоцитов.
Кроме того, цели изобретения достигнуты с помощью пробоотборника крови, содержащего
a) по меньшей мере один антикоагулянт для определения BG и показателей BMP; и
b) по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к способу подготовки пробы крови in vitro, при этом кровь объединяют: a) по меньшей мере с одним антикоагулянтом для определения показателей газов крови и BMP; и b) по меньшей мере с одним антитромбоцитарным веществом. Неожиданно было выявлено, что проба крови, подготовленная согласно способу по изобретению, подходит для анализа показателей BG и BMP, а также для определения количества тромбоцитов. Таким образом, одно из преимуществ способа настоящего изобретения состоит в том, что он позволяет выполнять "3-в-1" анализ в единственной пробе крови. В предпочтительном варианте осуществления проба крови дополнительно подходит для определения количества лейкоцитов. Таким образом, проба крови, полученная способом по изобретению, предпочтительно подходит для анализа показателей BG и BMP, а так же для выполнения ОАК.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу подготовки пробы к анализу крови, и указанный способ включает стадию
a) отбора крови у пациента в пробоотборник крови;
при этом пробоотборник крови содержит по меньшей мере один антикоагулянт для анализа показателей газов крови и BMP, и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество. Образец крови для анализа предпочтительно имеет относительно низкий (то есть, маленький) объем крови, например, по сравнению с отбором крови при донорской сдаче, объем которой может составлять приблизительно 450 мл. В предпочтительном варианте осуществления объем крови для анализа, забираемый у пациента, составляет приблизительно от 20 мкл приблизительно до 10 мл, предпочтительно приблизительно от 35 мкл приблизительно до 10 мл, более предпочтительно от 50 мкл приблизительно до 5 мл, и еще более предпочтительно приблизительно от 0,5 приблизительно до 2 мл.
Дополнительно, настоящее изобретение также относится способу in vitro для определения показателей газов крови и BMP и количества тромбоцитов в образце крови, и указанный способ включает стадию a), в ходе которой определяют показатели BG, BMP и/или количество тромбоцитов в пробе крови, полученной описанными выше способами. Одно из преимуществ способа по изобретению состоит в том, что измерение всех описанных выше показателей можно проводить в единственной пробе крови. В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию определения количества лейкоцитов.
В предпочтительном варианте осуществления определение показателей BG и BMP, а также количества тромбоцитов выполняют с помощью автоматизированного анализатора крови. Подходящие анализаторы крови описаны, например, в патентах США US 5564419 или US 6880384.
Проба крови обычно представляет собой цельную кровь. Кровь может быть венозного или артериального происхождения. Предпочтительно, кровь является артериальной. Вместе с тем, может быть предпочтительным использование венозной крови, если способ по изобретению применяется для отбора проб крови в условиях отделения неотложной помощи.
В одном варианте осуществления кровь может быть капиллярной. Это вариант осуществления особенно предпочтителен в случае получения пробы крови от новорожденных.
В предпочтительном варианте осуществления кровь в пробе не является очищенной фракцией конкретного типа клеток крови, например, популяцией промытых тромбоцитов.
В предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутых способов по изобретению по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP выбран из группы, состоящей из непрямых ингибиторов фактора Xa или прямых ингибиторов фактора Xa, или их комбинации.
В предпочтительном варианте осуществления антикоагулянт выбран из группы гепаринатов или гепариноидов, или из их комбинаций. В предпочтительных вариантах осуществления гепаринаты представляют собой гепарин, такой как нефракционированый высокомолекулярный гепарин (HMWH), низкомолекулярный гепарин (LMWH), включающий бемипарин, цертопарин, дальтепарин, эноксипарин, надропарин, памапарин, ревипарин, тинзапарин; и олигосахариды, такие как фондапаринакс, идрапаринакс. В предпочтительных вариантах осуществления гепариноиды включают данапароид, дерматан сульфат и сулодексид.
В предпочтительных вариантах осуществления прямые ингибиторы фактора Xa включают апиксабан, бнтриксабан, дарексабан, эдоксабан, отамиксабан и ривароксабан.
В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один антикоагулянт, подходящий для анализа показателей BG и BMP, включает гепарин. Как описано выше, гепарин является стандартным антикоагулянтом для анализа показателей BG и BMP. Гепарин представляет собой полисахарид природного происхождения, который ингибирует коагуляцию, то есть, механизм, приводящий к тромбозу. Природный гепарин состоит из молекулярных цепей с вариабельными значениями длины или молекулярной массы. Он также применяется в качестве антикоагулянтного лекарственного средства (для разжижения крови). Гепарин связывается с ингибитором фермента антитромбином III (АТ), вызывая конформационное изменение, которое приводит к его активации посредством увеличения гибкости петли его реакционноспособного участка. Активизированный АТ затем инактивирует тромбин, фактор Xa и другие протеазы.
В предпочтительном варианте осуществления антикоагулянт представляет собой сбалансированный по электролитам гепарин, (также называемый сбалансированным гепарином). Известно, что гепарин связывается с положительно заряженными электролитами, и это может влиять на измерения содержания электролитов. В предпочтительном варианте композиции сбалансированного по электролитам гепарина включают гепарин в форме соли лития, цинка, натрия, калия или соли аммония. В предпочтительном варианте осуществления композиция сбалансированного по электролитам гепарина включает лития гепарин и натрия гепарин.
В другом варианте осуществления антикоагулянт гепарин представляет собой человеческий гепарин, свиной гепарин или синтетический гепарин. В предпочтительном варианте осуществления антикоагулянтом является свиной гепарин.
В другом предпочтительном варианте осуществления антикоагулянтом является нефракционированный гепарин.
В предпочтительном варианте осуществления конечная концентрация антикоагулянта, например, гепарина, составляет приблизительно от 10 МЕ/мл приблизительно до 200 МЕ/мл, предпочтительно приблизительно от 20 МЕ/мл приблизительно до 100 МЕ/мл. В особенно предпочтительном варианте осуществления конечная концентрация антикоагулянта, например, гепарина, составляет приблизительно 60 МЕ/мл.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP, используемый согласно настоящему изобретению, может быть в жидкой форме, также называемый “жидкий гепарин”, или в сухой форме, например, в форме сухого сбалансированного гепарина, при объединении его с кровью. Одним из примеров сухой формы по меньшей мере одного антикоагулянта является лиофилизированный антикоагулянт, например, лиофилизированный гепарин, или лиофилизированный сбалансированный гепарин.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один антикоагулянт, вводимый в кровь для определения показателей BG и BMP, находится в лиофилизированной форме.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество выбрано из группы, состоящей из ингибиторов гликопротеина Ilb/IIIa, ингибиторов рецепторов АДФ/P2Y12, аналогов простагландина, ингибиторов ЦОГ, ингибиторов тромбоксана, ингибиторов фосфодиэстеразы, клорикромена, дитазола, ворапаксара или их комбинации.
Гликопротеин Ilb/IIIa, также известный как интегрин αIIbβ3, представляет собой интегриновый комплекс, расположенный на тромбоцитах. Он является рецептором для фибриногена и фактора Виллебранда и способствует активации тромбоцитов. Ингибиторы гликопротеина Ilb/IIIa можно применять для предотвращения образования тромбов в крови, с целью уменьшения риска сердечного приступа или инсульта. Примеры ингибиторов гликопротеина Ilb/IIIa включают без ограничения абциксимаб, эптифибатид (другое наименование - интегриллин), орбофибан, лотрафибан, роксифибан, сибрафибан и тирофибан (другое наименование - агграстат) или их соль. Предпочтительным ингибитором гликопротеина Ilb/IIIa является эптифибатид и тирофибан, или их соль.
Ингибиторы рецепторов аденозиндифосфата (АДФ) / P2Y12) относятся к классу антитромбоцитарных веществ, применяемых для лечения острого коронарного синдрома или для профилактики у пациентов, имеющих риск развития тромбоэмболии, инфаркта миокарда или инсульта. Механизм их действия заключается в антагонизме по отношению к белку P2Y12 и таким образом предотвращается связывание АДФ с рецептором P2Y12. Это приводит к уменьшению агрегации тромбоцитов и препятствует образованию тромба. Рецептор P2Y12 представляет собой связанный поверхностный белок, расположенный на тромбоцитах. Такие рецепторы относятся к ассоциированным с G-белками пуринэргическим рецепторам (GPCR) и являются хеморецепторами для АДФ. Примеры ингибиторов рецепторов АДФ/P2Y12 включают без ограничения тиенопиридины, такие как клопидогрел, прасугрел и тиклопидин, или их соль; и нуклеотидные/нуклеозидные аналоги/антагонисты рецепторов, такие как кангрелор, элиногрел, тикагрелор, сурамин натрий и 2-MeSAMP. Тиенопиридины являются менее предпочтительными ингибиторами рецепторов АДФ/P2Y12 согласно настоящему изобретению, поскольку они представляют собой пролекарства, которые не обладают действием ингибирования рецепторов АДФ/P2Y12 in vitro. Следовательно, нуклеотидные/нуклеозидные аналоги/антагонисты рецепторов, такие как кангрелор, элиногрел, тикагрелор или их соль, сурамин натрий и 2-MeSAMP, являются предпочтительными ингибиторами рецепторов АДФ/P2Y12 согласно настоящему изобретению.
Простагландины могут индуцировать или ингибировать агрегацию тромбоцитов и влияют на вазоконстрикцию, для расширения кровеносных сосудов. Аналоги простагландина представляют собой класс лекарственных средств, которые связываются с простагландиновым рецептором. Примеры включают без ограничения берапрост, илопрост (также известный как ZK36374), простациклин, эпопростенол и трепростинил.
Циклооксигеназа (ЦОГ), официально называемая простагландин-эндопероксид синтаза (PTGS), представляет собой фермент, отвечающий за образование простаноидов, включающих тромбоксаны и простагландины. Примеры ингибиторов ЦОГ включают без ограничения ацетилсалициловую кислоту, алоксипирин, карбасалат кальция, ибупрофен, трифлузал, сульфинпиразон и нитроаспирин (NCX-4016).
Тромбоксан является членом семейства липидов, называемых эйкозаноидами. Два основных тромбоксана представляют собой тромбоксан A2 и тромбоксан B2. Отличительным признаком тромбоксанов является 6-членное эфир-содержащее кольцо. Тромбоксан так назван в связи со своим значением в образовании тромба. Находящийся в тромбоцитах фермент тромбоксан-A-синтетаза превращает производное арахидоновой кислоты простагландин H2 в тромбоксан. Ингибиторы тромбоксана включают ингибиторы тромбоксансинтетазы, такие как дипиридамол, пикотамид, тербогрел, далтробан, сератродаст, SQ-29548 и раматробан; и антагонисты тромбоксанового рецептора, такие как тербогрел и терутробан.
Фосфодиэстераза представляет собой фермент, разрушающий фосфодиэфирные связи. Ферменты группы фосфодиэстераз (ФДЭ) часто являются мишенями для фармакологического ингибирования благодаря их уникальному распределению в тканях, структурным и функциональным свойствам. Ингибиторы фосфодиэстераз способны продлевать или увеличивать эффекты физиологических механизмов, опосредуемых цАМФ или цГМФ путем ингибирования их разрушения фосфодиэстеразами. Ингибиторы ФДЭ были выделены в качестве новых потенциальных лекарственных средств лечения таких патологий, как легочная артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, деменция, депрессия, шизофрения, астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), протозойные инфекции, в том числе малярия. Дополнительно, циклический аденозин 3',5'-монофосфат (цАМФ) и циклический гуанозин 3',5'-монофосфат (цГМФ) являются двумя важнейшими внутриклеточными вторичными мессенджерами, обладающими мощным ингибирующим действием на основные функции тромбоцитов. Катализируя гидролиз цАМФ и цГМФ, фосфодиэстеразы лимитируют внутриклеточные уровни циклических нуклеотидов, тем самым регулируя функции тромбоцитов. В этой связи, ингибирование ФДЭ может проявлять значительное ингибирующее действие на тромбоциты (Gresele et al. Br. J. Clin. Pharmacol. 2011 Oct;72(4):634-46). Примеры ФДЭ включают без ограничения Цилостазол, Дипиридамол, Трифлузал, Милринон, Анагрелид и Теофиллин.
Антитромбоцитарные лекарственные средства, которые не относятся к одной из вышеупомянутых групп, включают без ограничения клорикромен, дитазол, ворапаксар и L-аргинин, или их соли.
Клорикромен представляет собой антитромбоцитарное лекарственное средство с сосудорасширяющим действием, которое применяется при лечении тромбоэмболических состояний.
Дитазол представляет собой нестероидное противовоспалительное средство с болеутоляющим и жаропонижающим действием, сходное с фенилбутазоном. Дополнительно, дитазол является ингибитором агрегации тромбоцитов, и продается в Испании и Португалии под торговым наименованием Агероплас (Ageroplas®).
Ворапаксар, ранее известный под наименованием SCH 530348, является антагонистом тромбинового рецептора (активируемого протеазой рецептора PAR-1), и создан на основе природного продукта гимбацина.
Было показано, что пероральная форма L-аргинина ингибирует аггрецацию тромбоцитов посредством нитрат-оксидного пути (Adams et al., J. Am. Coll.Cardiol. 1995 Oct;26(4):1054-61).
Предпочтительно, если по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество выбрано из группы, состоящей из ингибиторов гликопротеина Ilb/IIIa, ингибиторов рецепторов АДФ/P2Y12, аналогов простагландина, клорикромена, дитазола, ворапаксара или их комбинации.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество выбрано из группы, состоящей из ингибиторов гликопротеина Ilb/IIIa, аналогов простагландина, клорикромена, дитазола, ворапаксара или их комбинации.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество выбрано из группы, состоящей из ингибиторов гликопротеина Ilb/IIIa и аналогов простагландина.
В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество включает аналог простагландина.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество представляет собой ингибитор гликопротеина Ilb/IIIa, выбранный из группы, состоящей из абциксимаба, эптифибатида, орбофибана, лотрафибана, роксифибана, сибрафибана и тирофибана, или их соли. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество включает эптифибатид и/или тирофибан или их соль. В предпочтительном варианте осуществления эптифибатид применяется в форме ацетатной соли эптифибатида. Также предпочтительно применять тирофибан в форме хлористоводородной соли тирофибана, и более предпочтительно, в форме моногидрата хлористоводородной соли тирофибана.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество представляет собой аналог простагландина, выбранный из группы, состоящей из берапроста, илопроста, простациклона, эпопростенола, трепростинила или их соли.
В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество содержит эптифибатид, тирофибан, илопрост, их соль или их комбинацию.
Особенно предпочтительно, если по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество содержит илопрост. Илопрост является особенно предпочтительным в качестве антитромбоцитарного вещества, поскольку он не только подходит для подготовки пробы крови к анализу на BG, BMP и количество тромбоцитов, но также было неожиданно обнаружено, что он ингибирует активацию лейкоцитов, и таким образом значительное снижает агрегацию лейкоцитов в пробе крови.
В другом варианте осуществления по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество включает ингибиторы рецепторов АДФ/ P2Y12, при этом ингибиторы рецепторов АДФ/ P2Y12 представляют собой нуклеотидный/нуклеозидный аналог/антагонист рецептора. Предпочтительные ингибиторы рецепторов АДФ/ P2Y12 выбраны из группы, состоящей из кангрелора, элиногрела, тикагрелора или их соли, сурамина натрий, 2-MeSAMP.
В другом предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению не включает стадию объединения MgSO4, ЭДТА или соли лимонной кислоты с кровью в пробе крови. Эти антикоагулянты не подходят для подготовки пробы крови к анализу показателей BG и BMP.
В другом предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению дополнительно включает стадию перемешивания пробы крови. Преимущество этой стадии состоит в том, что без перемешивания в пробе крови происходит коагуляция или образование осадка, или кровь до анализа может реагировать с воздухом, находящимся в пробе. Перемешивание можно выполнять, например, путем взбалтывания. Перемешивание можно выполнять вручную путем неоднократного переворачивания пробы крови или перекатывания ее в горизонтальной плоскости. В пробу крови можно также добавлять перемешивающий элемент. Также пробу крови можно перемешивать с помощью подвижных элементов, например, как описано в патенте США 6880384 B2. Перемешивание пробы крови облегчает растворение антикоагулянта, например, гепарина, и тем самым предотвращает появление осадка. Недостаточное растворение антикоагулянта может приводить к образованию микросгустков, что может влиять на результаты и/или повредить анализатор. При образовании осадка проба крови может стать негомогенной, и результаты анализа будут вводить специалистов в заблуждение.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к пробоотборнику крови, и указанный пробоотборник содержит:
a) по меньшей мере один антикоагулянт для анализа показателей BG и BMP, описанное выше; и
b) по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество, описанное выше.
Пробоотборник крови может использоваться для осуществления описанного выше способа по изобретению. По меньшей мере один антикоагулянт для анализа показателей BG и BMP может присутствовать в пробоотборнике крови в жидкой форме, или оно может присутствовать в виде сухой композиции.
В одном варианте осуществления пробоотборник крови содержит дополнительный элемент, включающий по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP и/или по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество. Например, дополнительный элемент может представлять собой "брикет", например, так называемый "гепариновый брикет". В данном контексте использование "брикета" означает, что по меньшей мере один антикоагулянт находится на "подушке" из инертного материала-наполнителя, при этом при растворении "подушки" гепарин распределяется по всему объему пробы с надлежащим перемешиванием, и такие "подушки" можно вводить в устройства в ходе производства с целью доставки повторяемого количества гепарина в каждую пробу. Одним из примеров такого "брикета", например, является кусочек целлюлозы, пропитанной по меньшей мере одним антикоагулянтом для определения показателей BG и BMP и/или по меньшей мере одним антитромбоцитарным веществом. Вместе с тем, можно использовать также другие дополнительные элементы, которые при контакте с кровью могут высвобождать по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP и/или по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество, например, использовать матрицу, покрывающую стенки пробоотборника крови, которую наносят распылением на внутреннюю поверхность этого устройства.
В одном варианте осуществления пробоотборник крови состоит из пластмассы или стекла.
В другом предпочтительном варианте осуществления пробоотборник крови имеет колпачок. Колпачок пробоотборника представляет собой крышку, присоединяемую к открытому концу пробоотборника крови, например, к наконечнику шприца или к открытому концу капиллярной трубки или пробирки. Колпачок на пробоотборнике крови позволяет избежать газообмена с окружающей средой, что может влиять на результаты анализа газов крови. Подходящие колпачкипробоотборников, описаны, например, в WO 2004/000412.
В другом предпочтительном варианте осуществления пробоотборник крови содержит перемешивающий элемент. Предпочтительный перемешивающий элемент представляет собой сферический элемент или цилиндрический элемент с округленными концами. Особенно предпочтительный перемешивающий элемент имеет шарообразную форму. Шарик может быть сделан, например, из стали или пластмассы.
В другом варианте осуществления перемешивающий элемент имеет покрытие из инертного материала. Инертный материал предпочтительно не влияет или по существу не влияет на исследование крови. Например, инертный материал может быть выбран из группы, состоящей из золота, платины, палладия или родия. В предпочтительном варианте осуществления инертным материалом является золото.
В особенно предпочтительном варианте осуществления перемешивающий элемент представляет собой шарик с золотым покрытием, предпочтительно, стальной шарик с золотым покрытием.
В одном варианте осуществления перемешивающий элемент представляет собой перемешивающий элемент, описанный в патенте США 6880384 B2.
Движение перемешивающего элемента также описано в патенте США 6880384 B2. Предпочтительно, чтобы перемещение такого перемешивающего элемента происходило с помощью движущих устройств, например, механических устройств. Движущие устройства могут представлять собой автоматизированный манипулятор или устройство для перемещения, например, покачивания или вращения, манипулятор и/или подставку для анализатора, таким образом, перемещение перемешивающего элемента, расположенного в какой-либо пробе, происходит посредством гравитационных сил.
В предпочтительном варианте осуществления пробоотборник крови может быть заполнено кровью объемом от 20 мкл приблизительно до 10 мл, предпочтительно приблизительно от 35 мкл приблизительно до 10 мл, более предпочтительно от 50 мкл приблизительно до 5 мл, и наиболее предпочтительно приблизительно от 0,5 приблизительно до 2 мл крови.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию по меньшей мере одного антикоагулянта для определения показателей газов крови и BMP и по меньшей мере одного антитромбоцитарного вещества для подготовки пробы крови к определению показателей газов крови, BMP и количества тромбоцитов. По меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество и по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP представляет собой описанные выше вещества. В предпочтительном варианте осуществления подготовка пробы крови проводится в пробоотборнике крови.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию пробоотборника крови, содержащего по меньшей мере один антикоагулянт для анализа показателей газов крови и BMP и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество для анализа показателей газов крови, BMP и/или количества тромбоцитов. Пробоотборник крови, по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество и по меньшей мере один антикоагулянт для определения показателей BG и BMP соответствуют вышеприведенному описанию. В предпочтительном варианте осуществления пробоотборник крови дополнительно содержит кровь.
Используемое в изобретении понятие "показатели" означает любую часть клинической информации о пробе крови.
Используемый в изобретении термин "газ крови", например, в контексте "показатели газов крови" относится к содержанию газообразных веществ в крови и включает количество определенных газов (например, кислорода и углекислого газа), растворенных в крови, обычно в артериальной крови. Показатели газов крови включают такие параметры, как уровень pH, pCO2, pO2, насыщение кислородом (sO2), концентрация общего гемоглобина (ctHb или tHb), фракция оксигемоглобина (FO2Hb или O2Hb), фракция карбоксигемоглобина (FCOHb или COHb), фракция метгемоглобина (FMetHb или MetHb), фракция деоксигемоглобина (FHHb или RHb) и фракция фетального гемоглобина (FHbF). Выражение "проба крови, подходящая для анализа газов крови" означает, что данный образец крови может использоваться для измерения по меньшей мере одного показателя газов крови, но предпочтительно подходит для измерения всех показателей газов крови, таких как уровень pH, pCO2, pO2, ctHb, FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb и FHbF. Может быть предпочтительным, что возможность измерения относится по меньшей мере к уровню pH, tHb, FCOHb и FMetHb.
Используемый в изобретении термин "основная метаболическая панель", например, в контексте "анализ показателей основной метаболической панели", относится к биохимическим показателям крови, в частности, к электролитам, а именно, к концентрации Na+, K+, Cl-, HCO3-, мочевины, креатинина, глюкозы (glu), Ca2+, лактата (lac) и общего билирубина (tBil). Таким образом, "образец крови, подходящий для анализа показателей BMP" представляет собой образец крови, который можно использовать для определения по меньшей мере одного, но предпочтительно, для определения всех вышеупомянутых показателей BMP. Предпочтительно, если возможность измерения относится по меньшей мере к показателям Na+, K+, Cl-, Ca2+, glu, lac и tBil.
Используемые в изобретении выражения "количество тромбоцитов" или "определение количества тромбоцитов" означают диагностическое исследование, в котором определяется количество тромбоцитов в крови пациента. Тромбоциты, которые также называют кровяными пластинками, представляют собой маленькие дискообразные клетки крови, образующиеся в костном мозге и вовлеченные в механизм свертывания крови. Обычно в каждом микролитре крови находится от 150000 до 450000 тромбоцитов. Малое количество тромбоцитов или наличие тромбоцитов неправильной формы связано с патологическим кровотечением. Большое количество тромбоцитов может свидетельствовать о болезнях костного мозга.
Используемое в изобретении выражение "по меньшей мере один", например, в контексте "по меньшей мере один антикоагулянт" или "по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество" означает, что в пробе может присутствовать только один тип вещества или разных веществ, например, разные антикоагулянты. В предпочтительном варианте осуществления "по меньшей мере один" означает "один" тип вещества, например, один тип антикоагулянта, например, гепарин.
Используемый в изобретении термин "антикоагулянт" означает вещество, которое предотвращает или уменьшает коагуляцию крови, то есть коагуляционный каскад, приводящий к полимеризации фибрина и, соответственно, к образованию фибринового сгустка. Таким образом, антикоагулянты увеличивают время свертывания путем ингибирования каскада коагуляции посредством факторов свертывания после начальной агрегации тромбоцитов.
Используемое в изобретении понятие "антикоагулянт для определения показателей BG и BMP" означает, что вещество является подходящим в качестве антикоагулянта для образца крови таким образом, что этот образец крови может использоваться для анализа показателей BG и BMP. Известно, что некоторые антикоагулянты, например, ЭДТА, не подходят для определения показателей BG и BMP, например, потому что они образуют комплекс с Ca2+, тем самым делая невозможным достоверное определение концентрации кальция в пробе крови. Таким образом, ЭДТА не является антикоагулянтом для определения показателей BG и BMP.
Используемое в изобретении понятие "антитромбоцитарное вещество" означает вещество, которое уменьшает агрегацию тромбоцитов и/или ингибирует образование тромба, то есть вещество, которое ингибирует начальную агрегацию тромбоцитов в механизме свертывания крови. Таким образом, антитромбоцитарное вещество препятствует каскаду активации тромбоцитов, приводящему к адгезии активированных тромбоцитов к фибриновым волокнам, другим компонентам внеклеточной матрицы или агрегации в сгустки тромбоцитов. Необходимо отметить, что каскад коагуляции и каскад агрегации тромбоцитов представляют собой два отдельных механизма, даже с учетом того, что некоторые белки, например, тромбин, могут быть вовлечены в оба каскада. Антитромбоцитарные средства могут обратимо или необратимо ингибировать механизм, связанный с активацией тромбоцитов, что приводит к уменьшению склонности тромбоцитов к адгезии друг с другом и с поврежденным эндотелием кровеносных сосудов, или с поверхностями инородных материалов, например, с материалом пробоотборника крови.
Используемые в изобретении понятия "проба крови" или "образец для анализа крови" относятся к образцу крови, который подходит для целей диагностики или анализа. Таким образом, проба крови имеет относительно низкий объем крови (от 20 мкл до 10 мл крови), то есть, не такой объем, который требуется, например, при донорской сдаче крови (приблизительно до 450 мл крови). Выражение "проба крови, подходящая для анализа показателей BG и BMP и количества тромбоцитов" означает, что такой образец крови подходит для использования с целью определения показателей BG, BMP, а также для подсчета тромбоцитов, при этом антикоагулянтное и/или антитромбоцитарное вещество не влияет или по меньшей мере по существу не влияет на определение какого-либо из показателей.
Используемое в изобретении понятие "пробоотборник крови" относится к устройству для отбора крови, такому как шприц, капиллярная трубка или пробирка, например, аспирационное устройство или самозаполняющееся устройство, такое как шприц PICO (Radimeter Medical ApS), вакуумная пробирка или подобное устройство, предназначенное для отбора пробы крови.
Используемый в изобретении термин "количество лейкоцитов" означает диагностический анализ подсчета лейкоцитов в пробе крови пациента. Средний нормальный диапазон составляет от 3500 до 10500 лейкоцитов в 1 мкл крови.
Используемый в изобретении термин "общий клинический анализ крови (ОАК)" означает диагностический анализ, включающий определение количества лейкоцитов, количества тромбоцитов и какой-либо из дифференцированных подсчетов: 3-диф (частичный 3-диф) или 5-диф (частичный 5-диф). В общий клинический анализ крови не входит количество эритроцитов в пробе крови пациента.
Используемое в изобретении выражение "по существу не влияет" означает, что доля максимального влияния составляет меньше 5, предпочтительно меньше 2,5 и более предпочтительно 1 или меньше.
Используемое в изобретении понятие "приблизительно" в отношении числовых значений в тексте настоящей заявки, например, "приблизительно 10 мл", означает, что значение, указанное непосредственно после "приблизительно", включает незначительные отклонения от точного числового значения, например, из-за ошибок измерения и т.д. В предпочтительном варианте осуществления понятие "приблизительно" относится к значению в диапазоне 15% (±15%) от значения, указанного непосредственно после понятия "приблизительно", включая любое числовое значение в пределах этого диапазона, значение, равное верхнему пределу (то есть, +15%) и значение, равное нижнему пределу (то есть, -15%) этого диапазона. Например, выражение "приблизительно 100" охватывает любое числовое значение, находящееся между 85 и 115, включая 85 и 115 (за исключением понятия "приблизительно 100%", которое всегда имеет верхний предел 100%). В одном аспекте "приблизительно" означает ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1% или меньше чем ±1%.
В целом, в настоящее изобретение предпочтительно включены все соли известных реактивов, например, по меньшей мере, одного антитромбоцитарного вещества или по меньшей мере одного антикоагулянта для определения показателей BG и BMP, при условии, что эти соли не влияют или по существу не влияют на выполнение анализа крови. Примеры солей включают неорганические и органические кислотно-аддитивные соли и основные соли. Соли включают без ограничения соли металлов, такие как соль цезия, щелочные соли, такие как соль лития, соль натрия, соль калия, соль кальция или соль магния, органические соли аминов, такие как соль триэтиламина, пиколиновая соль, соль пиридина, соль этаноламина, соль триэтаноламина, соль дициклогексиламина, соль N, N’дибензилэтилендиамина и т.п.; соли неорганических кислот, такие как цитрат, тартрат, малеат, фумарат, манделат, ацетат, дихлорацетат, трифторацетат, дихлорацетат, трифторацетат, оксалат, формиат и т.п., сульфонаты, такие как метансульфонат, бензолсульфонат, p-толуолсульфонат и т.п.; и соли аминокислот, такие как аргинат, глутамат и т.п.. Кислотно-аддитивные соли включают без ограничения соляную кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, янтарную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, виннокаменную кислоту, фосфорную кислоту, щавелевую кислоту, дихлоруксусную кислоту и тому подобное.
Краткое описание фигур
Фигура 1:
Подсчет количества одиночных тромбоцитов и количества сгустков тромбоцитов выполняли в крови, собранной с помощью пробоотборника PICO70, в котором содержится только жидкий гепарин (LiHep, отсутствует шарик с золотым покрытием (Au), аккуратное перемешивание вручную). Шприц PICO70 помещали в мешалку SAM (PicoSAM); антикоагулянт ЭДТА и жидкий гепарин или полный реагент PicoSAM использовали в комбинации с антитромбоцитарными препаратами: эптифибатид, тирофибан или илопрост, в двух разных концентрациях указанных препаратов. В пробах с тремя антитромбоцитарными препаратами подсчитывали одиночные тромбоциты и выявлено отсутствие или небольшое количество тромбоцитарных агрегатов, что сопоставимо со стандартным способом добавления в исследуемую кровь антикоагулянта ЭДТА.
Фигура 2:
Подсчет количества одиночных тромбоцитов и количества сгустков тромбоцитов выполняли в крови, собранной с помощью пробоотборника PICO70, в котором содержится только жидкий гепарин (LiHep, отсутствует золотой шарик, аккуратное перемешивание вручную). Шприц PICO70 помещали в мешалку SAM (PicoSAM); антикоагулянт ЭДТА и жидкий гепарин или полный реагент PicoSAM использовали в комбинации с антитромбоцитарным веществом MgSO4 в двух разных концентрациях.
Фигура 3:
Подсчет количества одиночных тромбоцитов и количества сгустков тромбоцитов выполняли в крови, собранной с помощью пробоотборника PICO70, в котором содержится только жидкий гепарин (LiHep, отсутствует золотой шарик, аккуратное перемешивание вручную). Шприц PICO70 помещали в мешалку SAM (PicoSAM); антикоагулянт ЭДТА и жидкий гепарин или полный реагент PicoSAM использовали в комбинации с антитромбоцитарным препаратом тиклопидин в двух разных концентрациях.
Фигура 4:
Подсчет количества одиночных тромбоцитов и количества сгустков тромбоцитов выполняли в крови, собранной с помощью пробоотборника PICO70, в котором содержится только жидкий гепарин (LiHep, отсутствует золотой шарик, аккуратное перемешивание вручную). Шприц PICO70 помещали в мешалку SAM (PicoSAM), добавляли антикоагулянт ЭДТА и жидкий гепарин или полный реагент PicoSAM в комбинации с антитромбоцитарным препаратом L-аргинин в двух разных концентрациях.
Фигура 5:
Подсчет количества одиночных тромбоцитов и количества сгустков тромбоцитов выполняли в крови, собранной с помощью пробоотборника PICO70, в котором содержится только жидкий гепарин (LiHep, отсутствует золотой шарик, аккуратное перемешивание вручную). Шприц PICO70 помещали в мешалку SAM (PicoSAM), добавляли антикоагулянт ЭДТА и жидкий гепарин или полный реагент PicoSAM в комбинации с антитромбоцитарным препаратом дипиридамол в двух разных концентрациях.
Фигура 6: Результаты микроскопического исследования проб крови после добавления антикоагулянтов (A) гепарина и (B) ЭДТА. ЭДТА предотвращает активацию тромбоцитов и способствует сохранению тромбоцитов в пробе крови в одиночном состоянии, а гепарин создает возможность или даже усиливает агрегацию тромбоцитов, индуцированную другими агонистами или инородными материалами. Согласно данным микроскопии (C), этот эффект гепарина не наблюдался при добавлении к гепарину 20 мкМ эптифибатида.
Фигура 7: Образец крови, смешанный вручную с окрашивающим/гемолизирующим реактивом. Окрашенные лейкоциты и тромбоциты, подготовленные в виде влажного препарата на покровном стекле, исследовали под микроскопом Leica, используя объектив 40x в режиме светлого поля.
(A) Пример лейкоцитов, показывающий взаимодействие с тромбоцитами. (B) Пример лейкоцитарных сгустков.
Примеры
Пример 1. Анализ агрегации тромбоцитов с использованием гепарина и разных антитромбоцитарных веществ
Каждый эксперимент проводился в отдельный день с кровью от одного добровольного донора, с тестированием одного исследуемого антитромбоцитарного препарата. Для каждого эксперимента непосредственно перед отбором крови были подготовлены пробоотборники в виде шприцов PICO70 (Radiometer Medical ApS). Для тестов в условиях “LiHep” (жидкий гепарин) из пробоотборника PICO70 удаляли золотой шарик и гепариновый брикет и добавляли 15 мкл водного жидкого сбалансированного гепарина, содержащего лития гепарин (Celsus Laboratories) и натрия гепарин (Celsus Laboratories) (конечная концентрация гепарина 60 МЕ/мл крови) и 15 мкл растворенного тестируемого препарата. Для условий “PicoSAM” использовали немодифицированные устройства для проб PICO70 (с золотым шариком и гепариновым брикетом) и добавляли 15 мкл растворенного тестируемого препарата. Для условий “LiHep xxx препарат” из пробоотборника PICO70 удаляли золотой шарик и гепариновый брикет, как описано для условий “LiHep”, и добавляли 15 мкл жидкого сбалансированного гепарина (конечная концентрация гепарина 60 МЕ/мл крови) и 15 мкл растворенного тестируемого препарата. Для условия “PicoSAM xxx препарат” использовали немодифицированные устройства для проб PICO70 (с золотым шариком и гепариновым брикетом) и добавляли 15 мкл растворенного тестируемого препарата. Тестировали следующие антитромбоцитарные препараты-кандидаты и соответствующие растворители: эптифибатид ацетат (Sigma, SML1042; разведенный в солевом растворе, конечная концентрация 5 и 20 мкМ), MgSO4 (Sigma, M7506; разведенный в солевом растворе, конечная концентрация 3 и 12 мМ), тирофибан гидрохлорид моногидрат (Sigma, SМL0246; разведенный в ДМСО 1:200 в солевом растворе, конечная концентрация 0,5 и 1 мкМ), илопрост (Sigma, SМL1651; разведенный в этаноле 1:1000 или 1:10000 в солевом растворе, конечная концентрация 10 и 100 нМ (позже также 1 мкМ)), тиклопидин гидрохлорид (разведенный в солевом растворе, конечная концентрация 60 и 600 мкМ), L-аргинин (Sigma, A5006; разведенный в солевом растворе, конечная концентрация 600 мкМ и 6 мМ) и дипиридамол (Sigma, D9766; разведенный в ДМСО 1:10 или 1:100 в солевом растворе, конечная концентрация 10 и 100 мкМ). В пробирку с ЭДТА (BD Vacutainer с напылением покрытия K2 ЭДТА, 10 мл) и в шприцы PICO70, по два пробоотборника с применением всех вышеуказанных условий, набирали венозную кровь через иглу-бабочку, закрывающуюся вентилируемым колпачком (VTC), заполняя самозаполняющиеся устройства для проб PICO70 венозной цельной кровью в объеме 1,5 мл. Сразу после отбора крови 8 раз переворачивали устройства для гарантированной надлежащей антикоагуляции проб. Образцы крови аккуратно перемешивали вручную (устройства без золотого шарика) или с помощью мешалки SAM (Radiometer Medical ApS) в течение 15 минут после отбора пробы. После перемешивания образцы немедленно фиксировали 10% раствором формалина (разведение крови в формалине 1:1) в течение по меньшей мере 10 минут и далее разводили 1:10 в растворе разведенных тромбоцитов с целью гемолиза эритроцитов для оценочного ручного подсчета количества тромбоцитов с помощью гемоцитометра. Ручной подсчет количества одиночных тромбоцитов (не агрегированных), сгустков тромбоцитов и, по возможности, определение размера сгустков (количество тромбоцитов в сгустке) проводили по два раза для каждой пробы, подсчитывая тромбоциты в гемоцитометре с помощью микроскопа Leica 750 с фазово-контрастными воздушными объективами 10х и 20x. Для вычисления концентрации одиночных тромбоцитов подбирали количество одиночных тромбоцитов для разведения жидким гепарином и/или раствором разведенного препарата.
При добавлении эптифибатида, тирофибана и илопроста уменьшалось образование сгустков тромбоцитов по сравнению с референс-условиями "LiHep" и "PicoSAM" (см. фигуру 1).
MgSO4 также уменьшал образование сгустков тромбоцитов (см. фигуру 2).
При условии "тиклопидин+LiHep" было показано сходное количество одиночных тромбоцитов по сравнению с референс-условием "ЭДТА", и небольшое уменьшение количества сгустков по сравнению с контрольными условиями "LiHep" и "PicoSAM" (см. фигуру 3). При добавлении L-аргинина выявлено снижение количества тромбоцитов и увеличение количества сгустков тромбоцитов по сравнению с контролем ЭДТА, но вместе с тем, более высокое количество тромбоцитов, чем в контрольных тестах с LiHep и PicoSAM (см. фигуру 4).
В тестах с дипиридамолом, ингибитором фосфодиэстеразы и ингибитором тромбоксана выявлено немного более высокое количество тромбоцитов по сравнению с контрольными тестами с LiHep и PicoSAM (см. фигуру 5).
Пример 2. Исследования агрегации тромбоцитов в гепаринизированной крови и при обработке крови ЭДТА
Выполняли отбор проб венозной крови, перемешивали и фиксировали 10% раствором формалина, как описано выше в Примере 1, затем готовили влажные препараты на предметном стекле и накрывали покровным стеклом. После этого влажные препараты фиксированных клеток крови проб исследовали с помощью микроскопа Leica 750 с фазово-контрастным воздушным объективом 40x. В гепаринизированной крови среди множества эритроцитов были обнаружены агрегированные тромбоциты в отличие от неагрегированных одиночных тромбоцитов в крови с антикоагулянтом ЭДТА и в гепаринизированной крови с добавлением, например, эптифибатида.
Результаты показаны в фигуре 6. В гепаринизированной крови обнаружены сгустки тромбоцитов, которые невозможно найти в пробах крови, обработанных ЭДТА, или в пробе крови, обработанной гепарином и антитромбоцитарным препаратом, например, эптифибатидом.
Пример 3. Микроскопия влажных препаратов окрашенных проб крови
Отбор проб венозной крови и перемешивание проводили, как описано выше в Примере 1, и указанные образцы использовали для подготовки окрашенных влажных препаратов к визуализации. Образцы крови смешивали с окрашивающим и гемолизирующим веществом (метиленовый синий и деоксихолевая кислота, соответственно) и инкубировали при 47°C в водяной бане в течение 30 секунд. Затем из окрашенных и гемолизированных проб крови получали влажные препараты на предметном стекле и накрывали покровным стеклом. Изображения окрашенных проб исследовали с помощью микроскопа Leica 750 с воздушным объективом 40x в режиме светлого поля. С помощью программного обеспечения для обработки изображений (FIJI, ImageJ) проводили отбор областей исследования (ROI) среди репрезентативных окрашенных лейкоцитов.
В пробах при условиях “PicoSAM“ (гепаринизированная кровь без антитромбоцитарного препарата) было выявлено много агрегированных тромбоцитов (маленькие округлые клетки).
В пробах PicoSAM с добавлением 1 мкМ тирофибана или 20 мкМ эптифибатида были обнаружены одиночные тромбоциты, а также явление сателлизма тромбоцитов, то есть прилипание тромбоцитов к лейкоцитам. Это, например, показано в фигуре 7A. Дополнительно, также выявлена агрегация лейкоцитов, что показано в фигуре 7B.
В пробах PicoSAM с добавлением 100 нМ илопроста (или в пробах с уравновешенным LiHep и илопростом в количестве 100 нМ) были обнаружены одиночные тромбоциты, и не выявлена агрегация лейкоцитов и сателлизм тромбоцитов. Такие же результаты были получены при исследовании крови с антикоагулянтом ЭДТА.
Пример 4. Показатели концентрации одиночных тромбоцитов в пробах с илопростом и гепарином по сравнению с референс-пробами с ЭДТА
Ручной подсчет количества тромбоцитов
Пробы крови были подготовлены аналогично, как в Примере 1.
Подсчет количества тромбоцитов в анализаторе ABX
Пробы крови после отбора и перемешивания 15 минут, как описано выше, были исследованы с помощью автоматизированного гематологического анализатора ABX (Horiba, ABX Pentra 60C +) с целью общего клинического анализа крови (ОАК) с определением 5 диф, включая концентрацию лейкоцитов, концентрацию тромбоцитов, средний объем тромбоцитов (MPV), концентрации и фракции нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов, концентрацию эритроцитов, гематокрит, концентрацию гемоглобина, описательные параметры эритроцитов (MCV - средний объем эритроцита, MCH - среднее содержание гемоглобина в эритроците, MCHC - средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе, RDW - ширина распределения эритроцитов). Были получены образцы от нескольких доноров. Использовали измеренную концентрацию тромбоцитов для сравнения с данными, полученными при ручном подсчете концентрации тромбоцитов в пробах с илопростом и гепарином (в устройствах для проб PICO70), и в пробах с антикоагулянтом ЭДТА. Анализатор ABX может недооценивать показатели концентрации тромбоцитов при их агрегации, хотя посредством силы сдвига в потоке некоторая часть слабо соединенных тромбоцитов может разъединяться. Для контроля использовали пробы крови с ЭДТА без тромбоцитарных сгустков в качестве референс-измерения для ABX-автоматизированной измеренной концентрации тромбоцитов.
Для одного донора при подсчете вручную средние показатели количества тромбоцитов в пробах PicoSAM с 100 нМ илопроста по сравнению с референс-пробами с ЭДТА составляли 97%.
Для восьми доноров при подсчете вручную средние показатели количества тромбоцитов в пробах PicoSAM с 1 мкМ илопроста по сравнению с референс-пробами с ЭДТА составляли 93%.
Напротив, при тестировании соответствующей пробы в условиях PicoSAM, то есть, без добавления илопроста, но с гепарином, показатели составили менее 40% по сравнению с референс-пробами с ЭДТА.
Для семи доноров при подсчете количества тромбоцитов с помощью ABX средние показатели количества тромбоцитов в пробах PicoSAM с 1 мкМ илопроста по сравнению с референс-пробами с ЭДТА составляла 97%.
В таблице 1 показаны результаты подсчета тромбоцитов в донорских пробах, при этом были выполнены оба типа измерения количества тромбоцитов (подсчет вручную и ABX-измерение количества тромбоцитов).
Таблица 1. Сравнительный подсчет количества тромбоцитов
| № донора | Среднее количество тромбоцитов, измерение в ABX (PLT/нл) | Среднее количество тромбоцитов, подсчет вручную (PLT/нл) | |
| 4 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
204 | 198 |
| ЭДТА | 200 | 200 | |
| 5 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
253 | 242 |
| ЭДТА | 259 | 242 | |
| 6 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
173 | 154 |
| ЭДТА | 185 | 189 | |
| 7 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
233 | 247 |
| ЭДТА | 240 | 249 | |
| 8 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
191 | 203 |
| ЭДТА | 202 | 207 | |
| 9 |
PicoSAM
Илопрост 1 мкМ |
216 | 202 |
| ЭДТА | 236 | 255 |
Пример 5. Анализ влияния антитромбоцитарного препарата на показатели анализатора ABL90
Каждый эксперимент проводился в отдельный день с кровью от одного добровольного донора. Для каждого эксперимента были подготовлены три устройства для проб в виде шприцев PICO70 (Radiometer Medical ApS) (не модифицированных, содержащих золотой шарик и гепариновый брикет). Один PICO70 использовался в качестве немодифицированного контроля (Контроль), один PICO70 был заполнен разведенным антитромбоцитарным препаратом в объеме 15 мкл, с достижением указанной конечной концентрации в пробе крови. Третий образец PICO70 был заполнен растворителем в объеме 15 мкл (определенный растворитель, который используется для разведения тестируемого антитромбоцитарного препарата: референс-проба). Отбор проб венозной крови производили в шприцы для проб PICO70 через иглу-бабочку и закупоривали вентилируемой крышкой (VTC), при этом в самозаполняющиеся пробоотборники PICO70 набирали цельную кровь в объеме 1,5 мл. Сразу после заполнения шприцев пробы крови восемь раз переворачивали, чтобы гарантировать надлежащую гепаринизацию крови. Пробы крови перемешивали с помощью мешалки SAM (Radiometer Medical ApS), при этом в образце крови стальной шарик с золотым покрытием перемещался для гарантированного гомогенного и повторяемого перемешивания в течение 15 минут после отбора крови. Почсле этого определяли показатели газов крови в анализаторе ABL90 (Radiometer Medical ApS). Измерения проводили также в альтернативных пробах (контроль, референс-проба, образец препарата) по пять раз в каждой пробе (5 повторных измерений), аккуратно переворачивая пробы крови вручную, чтобы в течение измерений поддерживать кровь в состоянии гомогенного перемешивания. Все измеренные значения указаны в Таблице 3. После этого пробы крови центрифугировали для отделения фракции плазмы. Плазму всех проб трижды поочередно исследовали с помощью анализатора ABL90 для оценки концентрации свободного гемоглобина в плазме, которая указывает на возможный нежелательный гемолиз эритроцитов в образцах цельной крови. В гемолизированных пробах показано влияние, например, на измеренную концентрацию K+.
Измеренные показатели описаны в Таблице 2.
Таблица 2. Показатели, измеренные в анализаторе газов крови ABL90
| Показатель | Описание |
| pH | уровень pH |
| tHb (г/дл) | концентрация общего гемоглобина |
| COHb (%) | карбоксигемоглобин (карбоксилированный гемоглобин) |
| MetHb (%) | метгемоглобин (метилированный гемоглобин) |
| K+ (моль/л) | концентрация калия |
| Na+ (моль/л) | концентрация натрия |
| Ca2+ (моль/л) | концентрация йонов кальция |
| Cl- (моль/л) | концентрация хлорида |
| Glu (глюкоза, моль/л) | концентрация глюкозы |
| Lac (лактат, моль/л) | концентрация лактата |
| tBil (общий билирубин, мкмоль/л) | концентрация билирубина |
Методика выполненных измерений описана в таблице 3, и описание проанализированных проб приведено в таблице 4.
Таблица 3. Измеренные значения
| Среднее значение | Среднее значение из 5 повторных измерений, выполненных в образце цельной крови, или из 3 повторных измерений гемоглобина, выполненных в пробе плазмы (данные не показаны) |
| SD | Стандартное отклонение, вычисленное в 5 повторных измерениях (данные не показаны) |
| Разность | Разница в измеренных показателях между определенными пробами (тестовая проба с препаратом - референс-проба только с растворителем) (данные не показаны) |
| Доля максимального влияния | Разность, разделенная на максимальное допустимое влияние для каждого параметра (значение >1 указывает на влияние, при этом приемлемым является значение <1) |
Таблица 4. Обозначения проб
| Контроль | Контрольная проба, набранная в немодифицированное устройство для отбора - шприц PICO70 |
| Солевой раствор | Референс-проба, содержащая солевой раствор - растворитель (физиологический раствор NaCl/физраствор) |
| ДМСО/физраствор (1:200) | Референс-проба, содержащая растворитель диметилсульфоксид в физиологическом растворе NaCl (разведение 1:200) |
| EtOH/ физраствор (1:1000) | Референс-проба, содержащая растворитель этанол в солевом растворе (разведение 1:1000) |
| EtOH/ физраствор (1:100) | Референс-проба, содержащая растворитель этанол в физиологическом растворе NaCl (разведение 1:100) |
| Эптифибатид 20 мкмоль в физрастворе | Эптифибатид, растворенный в физиологическом растворе NaCl до достижения конечной концентрации 20 мкмоль эптифибатида в пробе крови |
| Тирофибан 1 мкмоль в ДМСО/физрастворе | Тирофибан, растворенный в растворителе ДМСО/ физиологический раствор NaCl (1:200) до достижения конечной концентрации 1 мкМ тирофибана в пробе крови |
| Илопрост 100 нМ в EtOH/ физрастворе | Илопрост, растворенный в растворителе этанол/ физиологический раствор NaCl (1:1000) для достижения конечной концентрации 100 нМ илопроста в пробе крови |
| Илопрост 1 мкМ в EtOH/физрастворе | Илопрост, растворенный в растворителе этанол/ физиологический раствор NaCl (1:1000) для достижения конечной концентрации 1 мкМ илопроста в пробе крови |
| MgSO4 12 мМ в физрастворе | MgSO4, растворенный в физиологическом растворе NaCl до достижения конечной концентрации 12 мМ MgSO4 в пробе крови |
Допустимые в примерах значения референс-диапазонов для взрослых и максимального влияния показаны в таблице 5.
Результаты измерений (в виде доли максимального влияния) приведены в таблице 6.
Таблица 5. Референс-значения для определения максимально допустимого влияния
| pH | tHb (г/дл) |
COHb
(%) |
MetHb
(%) |
K+ (ммоль/л) | Na+ (ммоль/л) | |
| Референс-диапазон у взрослых | 7,32-7,43 | 11,4-17,5 | 2-3% (не курящие) 7-9% (курящие) |
1-2% | 3,4-4,5 | 136-145 |
| Максимально допустимое влияние | <0,010 | <0,5 | <1% | <1% | <0,1 | <1 |
| Ca2+ (ммоль/л) | Cl- (ммоль/л) | Glu (ммоль/л) | Lac (ммоль/л) | tBil (мкмоль/л) | ||
| Референс-диапазон у взрослых | 1,15-1,33 | 98-107 | 3,6-5,3 | 0,56-1,39 | 0-34 | |
| Максимально допустимое влияние | 0,02 | 1 | 0,1 | 0,1 | 30 |
Таблица 6. Показатели доли максимального влияния для антитромбоцитарных препаратов
| Эптифибатид | Тирофибан | Илопрост | MgSO4 | |
| pH | 0,18 | 0,18 | 0,32 | 5,56 |
| tHb (г/дл) | 0,04 | 0,12 | 0,12 | 0,08 |
| COHb (%) | 0,02 | 0,06 | 0,08 | 0,04 |
| MetHb (%) | 0,08 | 0,04 | 0,04 | 0,04 |
| K+ (ммоль/л) | 0 | 0 | 0,18 | 2,0 |
| Na+ (ммоль/л) | 0,4 | 0 | 0,14 | 5,6 |
| Ca2+ (ммоль/л) | 0,2 | 0,1 | 0,1 | 2,7 |
| Cl- (ммоль/л) | 0 | 0 | 0,06 | 8,6 |
| Glu (ммоль/л) | 0 | 0,8 | 0,86 | 0,2 |
| Lac (ммоль/л) | 0,6 | 0 | 0,62 | 4,6 |
| tBil (мкмоль/л) | 0,013 | 0,000 | 0,013 | 0,140 |
Эптифибатид, тирофибан и илопрост не влияли на оцениваемые в анализаторе ABL показатели, тогда как MgSО4 влияет на различные показатели (pH, N+, K+, Ca2+, Cl- и Lac) (различие доли максимального влияния >2).
Таким образом, эптифибатид, тирофибан и илопрост при исследованных концентрациях должны быть безопасными для добавления к гепаринизированной крови, используемой для измерения показателей газов крови и основной метаболической панели.
1. Способ определения показателя(ей) газов крови, показателя(ей) основной метаболической панели (ВМР) и количества тромбоцитов в единственной пробе крови in vitro, включающий стадии:
a) предоставления пробоотборника крови, содержащего гепарин и по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество, выбранное из аналогов простагландина, где пробоотборник крови не содержит любого из MgSO4, EDTA и цитрата;
b) подачи крови к пробоотборнику крови для получения единственной пробы крови;
c) перемешивания единственной пробы крови в пробоотборнике крови; и
d) определения показателя(ей) газов крови, показателя(ей) основной метаболической панели (ВМР) и количества тромбоцитов в единственной пробе крови.
2. Способ по п.1, в котором одно антитромбоцитарное вещество представляет собой аналог простагландина, выбранный из группы, включающей берапрост, илопрост, простациклин, эпопростенол, трепростинил или их соль.
3. Способ по п.1 или 2, в котором по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество содержит илопрост.
4. Пробоотборник крови в виде шприца для единственной пробы крови объемом от 20 мкл до 10 мл, где шприц содержит (a) гепарин и (b) по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество, выбранное из аналогов простагландина, где пробоотборник крови не содержит любого из MgSO4, EDTA и цитрата.
5. Пробоотборник крови по п.4, в котором по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество представляет собой аналог простагландина, выбранный из группы, состоящей из берапроста, илопроста, простациклина, эпопростенола, трепростинила или их соли.
6. Пробоотборник крови по п.4 или 5, в котором по меньшей мере одно антитромбоцитарное вещество содержит илопрост.
7. Пробоотборник крови по любому из пп.4-6, при этом указанный пробоотборник крови содержит перемешивающий элемент.
8. Пробоотборник крови по п.7, в котором перемешивающий элемент представляет собой сферический элемент или цилиндрический элемент с закругленными концами.
